WO2016171449A1 - 담즙울체성 간질환 동물 모델 및 이의 제조 방법 - Google Patents

담즙울체성 간질환 동물 모델 및 이의 제조 방법 Download PDF

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WO2016171449A1
WO2016171449A1 PCT/KR2016/004069 KR2016004069W WO2016171449A1 WO 2016171449 A1 WO2016171449 A1 WO 2016171449A1 KR 2016004069 W KR2016004069 W KR 2016004069W WO 2016171449 A1 WO2016171449 A1 WO 2016171449A1
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WO
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animal model
liver disease
branch
cholestatic
portal vein
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PCT/KR2016/004069
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English (en)
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Inventor
유제영
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삼성전자 주식회사
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates

Definitions

  • a cholestatic liver disease animal model and a method of making the same are provided.
  • Bile secreted by the liver helps the absorption of fats and vitamins in the intestine and removes body waste from the blood.
  • Cholestasis refers to biochemical, physiological, or clinical changes due to bile circulation disorders. Bile degeneration occurs when the function of the hepatobiliary system decreases due to genetic or acquired causes. Abnormalities of bile secretion can lead to accumulation of toxic substances in the liver or systemic, resulting in liver damage or jaundice.
  • cholestatic liver disease Complete treatment for cholestatic liver disease is currently unknown except liver transplantation. Treatment with pharmacotherapy only reduces the symptoms of the disease and prevents complications. Surgical and animal models have been developed for the study of the pathogenesis and treatment of cholestatic liver disease. Commonly used common bile duct ligation animal models have a short survival time, making them unsuitable for long-term experiments.
  • One aspect provides a cholestatic liver disease animal model in which bile duct branches and left portal veins branched toward the right lateral lobe are closed and have cholestatic liver disease.
  • Another aspect provides a method of preparing the cholestatic liver disease animal model.
  • Another aspect provides a method for screening a cholestatic liver disease therapeutic agent using the cholestatic liver disease animal model.
  • One aspect provides a cholestatic liver disease animal model in which bile duct branches and left portal veins branched toward the right lateral lobe are closed and have cholestatic liver disease.
  • bile branch branching toward the right mesenchyme means a bile duct branching from the common bile duct toward the right mesenchyme. Closure of the bile duct branch in the animal model may be performed by ligation or embolization of the branch.
  • the occlusion of the left portal vein is the ligation of the left portal vein between the branching point of the left and right portal veins and the branch where the branch closest to the branch point of the context branches branching from the left portal vein branches. It may be made by.
  • the fork means a point where the main portal vein splits into the left and right portal veins.
  • the closing of the left portal vein may be made by ligation of one or more portal branches branching toward the left mesenchyme or mesenchyme.
  • the occlusion of the left portal vein may be made by ligation of one or more, two or more, three or more, or four or more portal branches branching toward the left mesenchyme or mesenchyme.
  • the occlusion of the left portal vein may be made by ligation of all portal branches branching toward the left mesenchyme or mesenchyme.
  • cholestatic liver disease intrahepatic cholestatic jaundice, cholestatic hepatitis (cholestatic hepatitis), primary biliary cirrhosis, primary sclerosis (primary sclerosing cholangitis), cholelithiasis And at least one selected from the group consisting of bile tumors.
  • the animal may be a mammal other than a human.
  • the animal can be, for example, a mouse, hamster, rat, guinea pig, rabbit, pig, or dog.
  • the animal model may be an increased survival rate or survival compared to the animal model of the same type common bile duct-ligated. For example, if the animal is a mouse, the survival rate or survival of the animal may be significantly increased compared to the survival rate or survival of the total bile duct ligation mice.
  • the animal model may have a survival rate of at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85% after 50 days of closure of the bile duct and the left portal vein.
  • Another aspect includes closing a bile duct branch branched toward the right mesenchyme of a mammal; And it provides a method for producing a cholestatic liver disease animal model comprising the step of closing the left portal vein of the mammal.
  • the closure may be by ligation, insertion of the closure device, adhesion, administration of embolic agents, or a combination thereof.
  • the ligation may use sutures, clips, or forceps.
  • the ligation may include single ligation, double ligation, or a combination of double ligation and resection.
  • the closure device may comprise a closure device commonly used in the art.
  • closing the bile duct branch may include ligation or embolization of the branch.
  • the closing of the left vein may include ligation of the left vein between a branch point of the left and right veins and a branch branch closest to the branch point among the context branches branching from the left context. .
  • the branch point is as described above.
  • closing the left portal vein may include ligation of one or more portal branches that branch toward the left mesenchyme or mesenchyme.
  • Closing the left portal vein may include ligation of at least one, at least two, at least three, or at least four portal branches of the portal branches branching toward the left mesenchyme or mesenchyme.
  • Closing the left portal vein may include ligation of all portal branches branching toward the left mesenchyme or mesenchyme.
  • the animal may be a mammal other than a human.
  • the animal can be, for example, a mouse, hamster, rat, guinea pig, rabbit, pig, or dog.
  • the animal model obtained by the above method may have an increased survival rate or survival compared to the animal model of the same type in which the bile duct is ligated.
  • the survival rate or survival of the animal model may be significantly increased compared to the survival rate or survival of the total bile duct ligation mice.
  • the animal model may have a survival rate of at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85% after 50 days of closure of the bile duct and the left portal vein.
  • the mammal obtained by the method may have a cholestatic liver disease.
  • the cholestatic liver disease is as described above.
  • Another aspect includes administering a candidate agent for treatment of cholestatic liver disease to the aforementioned cholestatic liver disease animal model; And it provides a screening method of a cholestatic liver disease therapeutic agent comprising the step of confirming whether the symptoms of cholestatic liver disease of the animal model is alleviated.
  • Such administration may include oral or parenteral administration.
  • the parenteral administration can be intravenous, subcutaneous, intramuscular, or intrabody cavity (abdominal, joint, or intraocular) administration.
  • the checking may include measuring the concentration of a biliary congestive disease-related label in the blood of the animal model, measuring liver weight of the animal model, or measuring liver fibrosis degree of the animal model.
  • the blood may be serum or plasma.
  • the cholestatic liver disease related markers include total cholesterol (TCHO), alkaline phosphatase (ALP), aspartate transaminase (AST), and alanine aminotransferase (ALT). It may be one or more selected from.
  • the degree of liver fibrosis can be measured through conventional methods of measuring the degree of liver fibrosis, including liver tissue staining, measurement of blood liver fibrosis labels, and liver fibrosis scan.
  • the stain may be hematoxylin and eosin (H & E) staining, Masson-trichome staining, or sirius red staining.
  • the hepatic fibrosis label can be hyaluronic acid, procollagen III peptide, transforming growth factor- ⁇ , collagen type I, III, or IV, fibronectin, or laminin.
  • FIG. 1 illustrates a ligation site of a cholestatic liver disease animal model according to one aspect.
  • Figure 2 is a graph showing the change in survival rate over time after surgery of the bile duct ligation animal model and cholestatic liver disease animal model according to one aspect.
  • Figure 3a shows the results of sirius red staining of liver tissue derived from cholestatic liver disease animal model according to one aspect.
  • 3B is a graph showing the area showing positive for Sirius red staining.
  • FIG. 4A and 4B are graphs showing the amount of cholestatic liver disease related label measured in serum of a cholestatic liver disease animal model according to one aspect.
  • Total cholesterol (TCHO) and alkaline phosphatase (ALP) in FIG. 4A are biliary disease related labels
  • aspartate transaminase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) in FIG. 4B are liver disease related labels.
  • Figure 5a is a graph showing the weight ratio of the right liver to the total liver of the cholestatic liver disease animal model according to one aspect.
  • Figure 5b is a graph showing the weight ratio of the liver to the weight of the cholestatic liver disease animal model according to one aspect.
  • FIG. 1 illustrates a ligation site of a cholestatic liver disease animal model according to one aspect.
  • the bile ducts and portal veins are shown in gray and black, respectively, and the ligation sites are indicated by thick red solid lines.
  • the survival of 31 mice with cholestatic liver disease prepared by the method described above was measured.
  • the survival time of 24 total bile duct ligation mice of the same age prepared by anesthesia by the above-described anesthesia method, incision of the abdomen, and ligation of the total bile duct was measured.
  • Figure 2 is a graph showing the change in survival rate over time after surgery of the bile duct ligation animal model and cholestatic liver disease animal model according to one aspect.
  • the total bile duct ligation mice (labeled with BDL) had a rapid decrease in survival after about 15 days after surgery, and showed a survival rate of less than 50% at about 25 days after surgery, and after about 40 days. Almost all subjects died afterwards.
  • cholestatic liver disease mice (marked with SCC) prepared by the method described in 1. of Example 1 exhibited a high survival rate of 80% or more at 50 days after surgery, and thus produced by the preparation method. Survival of cholestatic liver disease animal model was found to be significantly improved.
  • Figure 3a shows the staining results of liver tissue derived from cholestatic liver disease animal model according to one aspect.
  • Sham represents mice without portal or biliary duct ligation
  • SCC represents mice prepared according to the method described in Example 1.
  • the SCC stained with Sirius red gradually increased over time, while Sham, the control group, did not show any significant change.
  • 3B is a graph showing the area showing positive for Sirius red staining. Sham and SCC are as described above.
  • PBL refers to mice ligated with the left portal vein
  • RBDL refers to mice ligated with bile duct branches branched toward the right mesenchyme.
  • the BDLL represents the right mesenchyme of the SCC or RBDL
  • the PBLL represents the left mesenchyme of the SCC or PBL
  • the NLL represents the mesenchyme linked to the bile duct or portal vein that is not ligated in the PBL or RBDL.
  • Blood was collected from the orbital vein or cardiac region of the animal model prepared by the method described in Example 1, one week, three weeks, seven weeks, or fifteen weeks after surgery, respectively.
  • One week after surgery blood was collected from the orbital vein.
  • inhaled anesthesia with 1 ⁇ 2% using a small animal inhalation anesthesia, and then opened, opened the diaphragm and cut the diaphragm.
  • ⁇ 600 ⁇ l of blood was collected.
  • the collected blood was placed in a capillary blood collection tube and allowed to stand at room temperature for 20 minutes, followed by centrifugation at 2000 g, 20 min, and 4 ° C to obtain serum from the supernatant.
  • TCHO total cholesterol
  • ALP alkaline phosphatase
  • AST aspartate transaminase
  • ALT alanine aminotransferase
  • FIGS. 4A and 4B are graphs showing the amount of cholestatic liver disease related label measured in serum of a cholestatic liver disease animal model according to one aspect.
  • SCC, PBL, RBDL and Sham are as described above.
  • BDL represents mice in which total bile ducts are ligated.
  • the amount of cholestatic liver disease related label in the serum of mice (SCC) prepared by the method described in Example 1 was maintained at a significantly higher level than the control except BDL. . In the case of BDL, most individuals died three weeks after surgery.
  • the animal model produced by the method described in Example 1 was opened 3 weeks, 7 weeks, or 15 weeks after the operation by inhalation anesthesia 1 to 2% isofluorine using a small animal inhalation anesthesia
  • the diaphragm was dissected and euthanized.
  • Figure 5a is a graph showing the weight ratio of the right liver to the total liver of the cholestatic liver disease animal model according to one aspect.
  • SCC, PBL, RBDL and Sham are as described above.
  • the weight ratio of right liver to total liver in the mouse (SCC) prepared by the method described in Example 1. showed a significantly higher value than the control except for PBL. Through this, it was confirmed that the regeneration of the right mesenchyme of the mouse produced by the method described in Example 1 proceeds after surgery.
  • Figure 5b is a graph showing the weight ratio of the liver to the weight of the cholestatic liver disease animal model according to one aspect.
  • SCC, PBL, RBDL and Sham are as described above.
  • the weight ratio of liver to body weight in mice (SCC) prepared by the method described in Example 1. showed a significantly higher value than the control. Through this, it was confirmed that the liver of the mouse prepared by the method described in Example 1 maintains an abnormal state for a long time after surgery.

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Abstract

간의 우엽을 향해 분기된 담관 가지 및 좌문맥이 폐쇄되어 있고 담즙울체성 간질환을 갖는, 담즙울체성 간질환 동물모델, 상기 동물모델의 제조방법, 및 상기 동물모델을 이용한 담즙울체성 간질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

담즙울체성 간질환 동물 모델 및 이의 제조 방법
담즙울체성 간질환 동물 모델 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
간에서 분비되는 담즙은 장에서 지방 및 비타민의 흡수를 돕고 혈액으로부터 체내 노폐물을 제거하는 역할을 한다. 담즙울체(cholestasis)는 담즙의 순환장애로 인한 생화학적, 생리적, 또는 임상적 변화를 의미한다. 유전적 또는 후천적 원인에 의해 간담도계(hepatobiliary system)의 기능이 저하되면 담즙울체가 발생한다. 담즙 분비의 이상은 간 내 또는 전신에 독성 물질의 축적을 유발하여 간 손상 또는 황달을 일으킬 수 있다.
담즙울체성 간질환을 완전하게 치료하는 방법은 현재 간이식술 외에는 알려져 있지 않다. 약물요법에 의한 치료는 질환의 증상을 감소시키고 합병증을 예방하는 수준에 그친다. 수술적 방법을 이용한 동물 모델 및 유전자 조작 방법을 이용한 동물 모델이 담즙울체성 간질환의 병인 및 치료 방법의 연구를 위해 개발되어 있다. 일반적으로 이용되는 총 담관 결찰(common bile duct ligation) 동물 모델은 생존 기간이 짧아 장기적인 실험에 부적합하다.
따라서, 종래의 기술에 의해서도 보다 정확하고 장기적인 담즙울체성 간질환 연구 또는 치료 약물의 스크리닝을 위한 담즙울체성 간질환 모델이 요구된다.
일 양상은 우측 간엽(right lateral lobe)을 향해 분기된 담관 가지 및 좌문맥(left portal vein)이 폐쇄되어 있고 담즙울체성 간질환을 갖는, 담즙울체성 간질환 동물모델을 제공한다.
다른 양상은 상기 담즙울체성 간질환 동물모델의 제조방법을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 담즙울체성 간질환 동물모델을 이용하는 담즙울체성 간질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
일 양상은 우측 간엽(right lateral lobe)을 향해 분기된 담관 가지 및 좌문맥(left portal vein)이 폐쇄되어 있고 담즙울체성 간질환을 갖는, 담즙울체성 간질환 동물모델을 제공한다.
용어 "우측 간엽을 향해 분기된 담관 가지"는 총 담관(common bile duct)으로부터 우측 간엽을 향해 분기된 담관을 의미한다. 상기 동물모델에서 담관 가지의 폐쇄는, 상기 가지의 결찰(ligation) 또는 색전술(embolization)에 의해 이루어진 것일 수 있다.
상기 동물모델에서 좌문맥의 폐쇄는, 좌문맥과 우문맥의 분기점(branching point)과, 상기 좌문맥으로부터 분기하는 문맥 가지 중 상기 분기점과 가장 가까운 가지가 분기하는 지점의 사이에서의 좌문맥의 결찰에 의해 이루어진 것일 수 있다. 상기 분기점은 주문맥(main portal vein)이 좌문맥 및 우문맥으로 갈라지는 지점을 의미한다.
또한, 상기 좌문맥의 폐쇄는 좌측 간엽 또는 중간엽을 향해 분기하는 하나 이상의 문맥 가지의 결찰에 의해 이루어진 것일 수 있다. 상기 좌문맥의 폐쇄는, 좌측 간엽 또는 중간엽을 향해 분기하는 문맥 가지 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 문맥 가지의 결찰에 의해 이루어진 것일 수 있다. 상기 좌문맥의 폐쇄는 좌측 간엽 또는 중간엽을 향해 분기하는 모든 문맥 가지의 결찰에 의해 이루어진 것일 수 있다.
상기 담즙울체성 간질환은, 간내 담즙울체성 황달(intrahepatic cholestatic jaundice), 담즙울체성 간염(cholestatic hepatitis), 일차성 담즙성 간경화증(primary biliary cirrhosis), 일차성 경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis), 담석증, 및 담종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 동물은 인간을 제외한 포유동물일 수 있다. 상기 동물은 예를 들면, 마우스, 햄스터, 랫트, 기니 피그, 토끼, 돼지, 또는 개일 수 있다.
상기 동물모델은 총담관이 결찰된(common bile duct-ligated) 동일 종류의 동물모델에 비해 생존율 또는 생존기간이 증가된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 동물이 마우스인 경우, 상기 동물의 생존율 또는 생존기간은 총 담관 결찰 마우스의 생존율 또는 생존기간에 비해 현저하게 증가된 것일 수 있다. 상기 동물모델은 상기 담관 가지 및 좌문맥의 폐쇄 50일 후 생존율이 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상일 수 있다.
다른 양상은, 포유동물의 우측 간엽을 향해 분기된 담관 가지를 폐쇄하는 단계; 및 포유동물의 좌문맥을 폐쇄하는 단계를 포함하는, 담즙울체성 간질환 동물모델의 제조방법을 제공한다.
상기 방법에서, 상기 폐쇄는 결찰, 폐쇄용 장치의 삽입, 접착, 색전제의 투여, 또는 그의 조합에 의해 이루어질 수 있다. 상기 결찰은 봉합사, 클립, 또는 집게를 이용할 수 있다. 또한, 상기 결찰은 단일 결찰(single ligation), 이중 결찰(double ligation) 또는 이중 결찰과 절제(resection)의 조합을 포함할 수 있다. 상기 폐쇄용 장치는 당해 분야에서 통상적으로 이용되는 폐쇄용 장치를 포함할 수 있다.
상기 방법에서, 상기 담관 가지를 폐쇄하는 단계는 상기 가지의 결찰 또는 색전술을 포함할 수 있다. 상기 좌문맥을 폐쇄하는 단계는, 좌문맥과 우문맥의 분기점과, 상기 좌문맥으로부터 분기하는 문맥 가지 중 상기 분기점과 가장 가까운 가지가 분기하는 지점의 사이에서의 좌문맥의 결찰을 포함할 수 있다. 상기 분기점에 대해서는 전술된 바와 같다. 또한, 상기 좌문맥을 폐쇄하는 단계는 좌측 간엽 또는 중간엽을 향해 분기하는 하나 이상의 문맥 가지의 결찰을 포함할 수 있다. 상기 좌문맥을 폐쇄하는 단계는, 좌측 간엽 또는 중간엽을 향해 분기하는 문맥 가지 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 문맥 가지의 결찰을 포함할 수 있다. 상기 좌문맥을 폐쇄하는 단계는 좌측 간엽 또는 중간엽을 향해 분기하는 모든 문맥 가지의 결찰을 포함할 수 있다.
상기 동물은 인간을 제외한 포유동물일 수 있다. 상기 동물은 예를 들면, 마우스, 햄스터, 랫트, 기니 피그, 토끼, 돼지, 또는 개일 수 있다. 상기 방법에 의해 얻어지는 동물모델은 총담관이 결찰된 동일 종류의 동물모델에 비해 생존율 또는 생존기간이 증가된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 동물이 마우스인 경우, 상기 동물모델의 생존율 또는 생존기간은 총 담관 결찰 마우스의 생존율 또는 생존기간에 비해 현저하게 증가된 것일 수 있다. 상기 동물모델은 상기 담관 가지 및 좌문맥의 폐쇄 50일 후 생존율이 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상일 수 있다.
상기 방법에 의해 얻어지는 포유동물은 담즙울체성 간질환을 갖는 것일 수 있다. 상기 담즙울체성 간질환에 대해서는 전술된 바와 같다.
또 다른 양상은, 전술된 담즙울체성 간질환 동물모델에 담즙울체성 간질환의 치료제 후보 물질을 투여하는 단계; 및 상기 동물모델의 담즙울체성 간질환 증상이 완화되는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 담즙울체성 간질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 투여는 경구 또는 비경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 비경구 투여는 정맥내, 피하, 근육내, 또는 체강내(복강, 관절, 또는 안강) 투여일 수 있다.
상기 확인하는 단계는, 상기 동물모델의 혈액 중 담즙울체성 간질환 관련 표지의 농도를 측정하거나, 상기 동물모델의 간 무게를 측정하거나, 또는 상기 동물모델의 간 섬유화 정도를 측정하는 것일 수 있다.
상기 혈액은 혈청 또는 혈장일 수 있다. 상기 담즙울체성 간질환 관련 표지는 총 콜레스테롤(total cholesterol: TCHO), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase: ALP), 아스파테이트 트랜스아미나제(aspartate transaminase: AST), 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase: ALT) 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 간 섬유화 정도는 간 조직 염색, 혈중 간 섬유화 표지의 측정, 및 간 섬유화 스캔을 포함하는 통상의 간 섬유화 정도 측정 방법을 통해 측정될 수 있다. 상기 염색은 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin: H&E) 염색, Masson-trichome 염색, 또는 시리우스 레드(sirius red) 염색일 수 있다. 상기 간 섬유화 표지는 히알루론산, 프로콜라겐 Ⅲ 펩티드, 변형성 성장 인자-베타(transforming growth factor-β), 콜라겐 타입 I, III, 또는 IV, 피브로넥틴(fibronectin), 또는 라미닌일 수 있다.
도 1은 일 양상에 따른 담즙울체성 간질환 동물모델의 결찰 부위를 나타낸다.
도 2는 총 담관 결찰 동물모델 및 일 양상에 따른 담즙울체성 간질환 동물모델의 수술 후 시간 경과에 따른 생존율 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 일 양상에 따른 담즙울체성 간질환 동물모델로부터 유래된 간 조직의 시리우스 레드 염색 결과를 나타낸다. 도 3b는 시리우스 레드 염색에 양성을 나타내는 면적을 산출한 그래프이다.
도 4a 및 4b는 일 양상에 따른 담즙울체성 간질환 동물모델의 혈청에서 측정된 담즙울체성 간질환 관련 표지의 양을 나타내는 그래프이다. 도 4a의 총 콜레스테롤(TCHO) 및 알칼라인 포스파타제(ALP)는 담즙울체성 질환 관련 표지이며, 도 4b의 아스파테이트 트랜스아미나제(AST) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)는 간질환 관련 표지이다.
도 5a는 일 양상에 따른 담즙울체성 간질환 동물모델의 전체 간 대비 우측 간엽의 중량비를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 일 양상에 따른 담즙울체성 간질환 동물모델의 체중 대비 간의 중량비를 나타내는 그래프이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 담즙울체성 간질환 동물모델의 제조 및 생존율 조사
1. 담즙울체성 간질환 동물모델의 제조
13주령의 BALB/c 수컷 마우스를 소동물용 흡입마취기를 이용하여 1~2% 아이소플루레인(isoflurane) 흡입 마취한 후, 복부를 절개하였다. 좌문맥(left portal vein)의 주변 결합조직을 수술용 핀셋으로 박리한 후 7-0 나일론 봉합사로 결찰하였다. 또한, 우측 간엽(right lateral lobe)으로 통하는 담관(간의 우엽을 향해 분기된 담관 가지)의 주변 결합조직을 수술용 핀셋으로 박리한 후 7-0 나일론 봉합사로 결찰하였다. 수술 후 동물은 SPF(specific pathogen free) 조건에서 사육하였다. 이러한 동물실험은 삼성생명과학연구소 실험동물윤리위원회에서 승인을 받아 수행되었다.
도 1은 일 양상에 따른 담즙울체성 간질환 동물모델의 결찰 부위를 나타낸다. 도 1에서 담관 및 문맥을 각각 회색 및 흑색으로 표시하고, 결찰된 부위를 굵은 붉은 실선으로 나타내었다.
2. 담즙울체성 간질환 동물모델의 생존율 조사
전술된 방법에 의해 제조된 담즙울체성 간질환 마우스 31개체의 생존기간을 측정하였다. 또한, 전술된 마취 방법으로 마취하고 복부를 절개한 뒤 총 담관을 결찰하여 제조된 동일 연령의 총 담관 결찰 마우스 24개체의 생존기간을 측정하였다.
도 2는 총 담관 결찰 동물모델 및 일 양상에 따른 담즙울체성 간질환 동물모델의 수술 후 시간 경과에 따른 생존율 변화를 나타내는 그래프이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 총 담관 결찰 마우스(BDL로 표시)는 수술 후 약 15일 경과 후 생존율이 급감하여, 수술 후 약 25일 경과 시점에 50% 미만의 생존율을 나타내었고, 약 40일 경과 후 거의 모든 개체가 사망하였다. 이에 비해, 실시예 1의 1.에 기재된 방법에 의해 제조된 담즙울체성 간질환 마우스(SCC로 표시)는 수술 후 50일 경과 시점에 80% 이상의 높은 생존율을 나타내어, 이 제조방법에 의해 제조된 담즙울체성 간질환 동물모델의 생존율이 현저하게 향상된다는 것을 확인하였다.
실시예 2. 담즙울체성 간질환 동물모델의 질환 상태 분석
1. 간 섬유화 정도 측정
실시예 1.에 기재된 방법에 의해 제조된 동물모델 중 수술 시행 3주, 7주, 또는 15주차의 개체를 소동물용 흡입마취기를 이용하여 1~2% 아이소플루레인 흡입 마취한 후, 개복하고 횡격막을 절개하여 안락사시켰다. 각 개체로부터 전체 간을 적출한 후, PBS용액으로 3회 세척 후, 간의 우엽과 좌엽의 일부(약 1cm3)를 채취하여 조직을 얻고 4% 파라포름알데히드 용액에 하루 동안 4℃ 냉장보관하여 조직을 고정한 후 파라핀 절편을 제작하였다. 각 조직 절편을 시리우스 레드로 염색한 후 정립현미경으로 관찰하였다.
도 3a는 일 양상에 따른 담즙울체성 간질환 동물모델로부터 유래된 간 조직의 염색 결과를 나타낸다. Sham은 문맥 또는 담관이 결찰되지 않은 마우스를 나타내고, SCC는 실시예 1.에 기재된 방법에 따라 제조된 마우스를 나타낸다. 그 결과, SCC는 시간경과에 따라 시리우스 레드에 의해 염색된 부분이 점차 증가된 반면, 대조군인 Sham에서는 뚜렷한 변화가 나타나지 않았다.
도 3b는 시리우스 레드 염색에 양성을 나타내는 면적을 산출한 그래프이다. Sham 및 SCC에 대해서는 전술된 바와 같다. PBL은 좌문맥이 결찰된 마우스를 나타내고, RBDL은 우측 간엽을 향해 분기된 담관 가지가 결찰된 마우스를 나타낸다. BDLL은 SCC 또는 RBDL의 우측 간엽을 나타내고, PBLL은 SCC 또는 PBL의 좌측 간엽을 나타내며, NLL은 PBL 또는 RBDL에서 결찰되지 않은 담관 또는 문맥과 연결된 간엽을 나타낸다.
도 3b에 나타낸 바와 같이, SCC의 우측 간엽은 수술 후 시간이 경과함에 따라 간 섬유화가 심화되었다. 하기 도 5a의 결과를 고려하면, 간 섬유화가 급격하게 진행된 RBDL의 우측 간엽에서는 담즙울체성 손상에 의한 파괴만 일어난 것에 비해, 간 섬유화가 mild하게 진행된 SCC의 우측 간엽은 재생과 담즙울체성 손상이 동시에 일어난 것으로 판단된다 (*:p<0.05). 또한, 하기 도 4a, 4b, 5a, 및 5b의 결과와 종합적으로 고려하면, RBDL은 담즙울체성 간질환 동물모델로서 적합하지 않으나, SCC는 담즙울체성 간질환 동물모델로서 적합한 것으로 판단된다.
2. 담즙울체성 간질환 관련 표지의 측정
실시예 1.에 기재된 방법에 의해 제조된 동물모델 중 수술 후 1주, 3주, 7주, 또는 15주 경과된 개체의 안와정맥 또는 심장부위로부터 각각 혈액을 채취하였다. 수술 후 1주 경과된 개체의 경우, 안와정맥으로부터 혈액을 채취하였다. 수술 후 3주 이상 경과된 개체의 경우, 소동물용 흡입마취기를 이용하여 1~2% 아이소플루레인 흡입 마취한 후, 개복하고 횡격막을 절개하여 안락사 후 심장이 멈추기 전 1 ml syringe를 이용하여 500~600 ㎕의 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액을 모세관채혈튜브에 넣어 상온에서 20분간 방치한 후, 2000 g, 20 min, 4℃에서 원심분리하여 상층액으로부터 혈청을 얻었다. 각 혈청 중 담즙울체성 간질환 관련 표지인 총 콜레스테롤(TCHO), 알칼라인 포스파타제(ALP), 아스파테이트 트랜스아미나제(AST), 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)의 농도를 Fujifilm Dri-chem 3000 장비를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다.
도 4a 및 4b는 일 양상에 따른 담즙울체성 간질환 동물모델의 혈청에서 측정된 담즙울체성 간질환 관련 표지의 양을 나타내는 그래프이다. SCC, PBL, RBDL, Sham에 대해서는 전술된 바와 같다. BDL은 총 담관이 결찰된 마우스를 나타낸다. 도 4a 및 4b에 나타낸 바와 같이, 실시예 1.에 기재된 방법에 의해 제조된 마우스(SCC)의 혈청 중 담즙울체성 간질환 관련 표지의 양은, BDL을 제외한 대조군에 비해 유의하게 높은 수준으로 유지되었다. BDL의 경우, 대부분의 개체가 수술 3주 후 사망하였다.
3. 간 무게의 측정
실시예 1.에 기재된 방법에 의해 제조된 동물모델 중 수술 후 3주, 7주, 또는 15주 경과된 개체를 소동물용 흡입마취기를 이용하여 1~2% 아이소플루레인 흡입 마취한 후, 개복하고 횡격막을 절개하여 안락사시켰다. 각 개체로부터 적출된 전체 간을 PBS 용액으로 3회 세척한 뒤 전체 간의 중량 및 그로부터 분리된 우측 간엽의 중량을 측정하였다 (d = 0.01g).
도 5a는 일 양상에 따른 담즙울체성 간질환 동물모델의 전체 간 대비 우측 간엽의 중량비를 나타내는 그래프이다. SCC, PBL, RBDL, Sham에 대해서는 전술된 바와 같다. 도 5a에 나타낸 바와 같이, 실시예 1.에 기재된 방법에 의해 제조된 마우스(SCC)에서의 전체 간 대비 우측 간엽의 중량비는, PBL을 제외한 대조군에 비해 유의하게 높은 수치를 나타내었다. 이를 통해, 실시예 1.에 기재된 방법에 의해 제조된 마우스의 우측 간엽은 수술 후 재생(regeneration)이 진행된다는 것이 확인되었다.
도 5b는 일 양상에 따른 담즙울체성 간질환 동물모델의 체중 대비 간의 중량비를 나타내는 그래프이다. SCC, PBL, RBDL, Sham에 대해서는 전술된 바와 같다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, 실시예 1.에 기재된 방법에 의해 제조된 마우스(SCC)에서의 체중 대비 간의 중량비는, 대조군에 비해 유의하게 높은 수치를 나타내었다. 이를 통해, 실시예 1.에 기재된 방법에 의해 제조된 마우스의 간은 수술 후 장기간 비정상적인 상태를 유지한다는 것을 확인하였다.

Claims (17)

  1. 우측 간엽(right lateral lobe)을 향해 분기된 담관 가지 및 좌문맥(left portal vein)이 폐쇄되어 있고 담즙울체성 간질환을 갖는, 담즙울체성 간질환 동물모델.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 담관 가지의 폐쇄는 상기 가지의 결찰 또는 색전술(embolization)에 의한 것인 동물모델.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 좌문맥의 폐쇄는, 좌문맥과 우문맥의 분기점과, 상기 좌문맥으로부터 분기하는 문맥 가지 중 상기 분기점과 가장 가까운 가지가 분기하는 지점의 사이에서의 좌문맥의 결찰, 또는 좌측 간엽 또는 중간엽을 향해 분기하는 하나 이상의 문맥 가지의 결찰에 의한 것인 동물모델.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 담즙울체성 간질환은 간내 담즙울체성 황달(intrahepatic cholestatic jaundice), 담즙울체성 간염(cholestatic hepatitis), 일차성 담즙성 간경화증(primary biliary cirrhosis), 일차성 경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis), 담석증, 및 담종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인 동물모델.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 동물은 인간을 제외한 포유동물인 것인 동물모델.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 동물은 마우스, 햄스터, 랫트, 기니 피그, 토끼, 돼지, 또는 개인 것인 동물모델.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 동물모델은 총 담관이 결찰된(common bile duct-ligated) 동일 종류의 동물모델에 비해 생존율이 증가된 것인 동물모델.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 동물모델은 상기 담관 가지 및 좌문맥의 폐쇄 50일 후 생존율이 75% 이상인 것인 동물모델.
  9. 포유동물의 우측 간엽을 향해 분기된 담관 가지를 폐쇄하는 단계; 및
    포유동물의 좌문맥을 폐쇄하는 단계를 포함하는, 담즙울체성 간질환 동물모델의 제조방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 폐쇄는 결찰, 폐쇄용 장치의 삽입, 접착, 색전제의 투여, 또는 그의 조합에 의해 이루어지는 것인 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 담관 가지를 폐쇄하는 단계는 상기 가지의 결찰 또는 색전술을 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 좌문맥을 폐쇄하는 단계는, 좌문맥과 우문맥의 분기점과, 상기 좌문맥으로부터 분기하는 문맥 가지 중 상기 분기점과 가장 가까운 가지가 분기하는 지점의 사이에서의 좌문맥의 결찰, 또는 좌측 간엽 또는 중간엽을 향해 분기하는 하나 이상의 문맥 가지의 결찰을 포함하는 것인 방법.
  13. 청구항 9에 있어서, 상기 동물은 인간을 제외한 포유동물인 것인 방법.
  14. 청구항 9에 있어서, 상기 동물모델은 상기 담관 가지 및 좌문맥의 폐쇄 50일 후 생존율이 75% 이상인 것인 방법.
  15. 청구항 9에 있어서, 상기 방법에 의해 얻어지는 포유동물은 담즙울체성 간질환을 갖는 것인 방법.
  16. 청구항 1의 담즙울체성 간질환 동물모델에 담즙울체성 간질환의 치료제 후보 물질을 투여하는 단계; 및
    상기 동물모델의 담즙울체성 간질환 증상이 완화되는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 담즙울체성 간질환 치료제의 스크리닝 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 확인하는 단계는 상기 동물모델의 혈액 중 담즙울체성 간질환 관련 표지의 농도를 측정하거나, 상기 동물모델의 간 무게를 측정하거나, 또는 상기 동물모델의 간 섬유화 정도를 측정하는 것인 방법.
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