WO2016158707A1 - 薬剤担持ハイドロゲル製剤及びその製造方法 - Google Patents

薬剤担持ハイドロゲル製剤及びその製造方法 Download PDF

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biodegradable polymer
gelatin
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角田　茂
義治 坂井
田畑　泰彦
周太郎 郡司
幸大 山下
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国立大学法人京都大学
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    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein

Definitions

  • the present invention relates to a drug-carrying hydrogel preparation and a method for producing the same.
  • the present invention particularly relates to a drug-carrying hydrogel preparation used for the treatment of peritoneal dissemination and a method for producing the same.
  • Peritoneal dissemination is a disease that occurs when gastric cancer, colon cancer, etc. progress, and cancer cells are exposed to the serosal surface of the organ, spread within the abdominal cavity (seeding), adhere to the peritoneum, and form lesions. Once cancer cells are seeded in the abdominal cavity, excision of the entire lesion is difficult, and it is often outside the indication for surgery. Therefore, at present, systemic chemotherapy by intravenous administration or oral administration of an anticancer agent is regarded as a standard treatment, but a satisfactory effect has not been obtained.
  • the peritoneal dissemination site has poor blood flow, and anti-cancer drugs administered intravenously or orally as systemic chemotherapy are difficult to migrate to the peritoneal dissemination site.
  • Systemic chemotherapy also has strong side effects due to high blood levels. In many patients with peritoneal dissemination, the general condition has already deteriorated, and systemic chemotherapy cannot often be performed from the viewpoint of QOL.
  • Non-Patent Document 1 Therapeutic methods of alleviation have been studied, and animal experiments have been conducted (for example, Non-Patent Document 1).
  • a conventional biodegradable polymer hydrogel preparation impregnated with a drug releases a drug called an initial burst at the time of administration, and the ratio reaches about 20 to 30% of the loaded drug. For this reason, there exists a problem that a test subject is exposed to a high concentration chemical
  • biodegradable polymer hydrogel preparations are administered to humans, organic solvents such as acetone and hexane are often used in their preparation, but they can be prepared without using organic solvents. desirable.
  • the present inventors diligently searched for a method for producing a drug-carrying preparation without using an organic solvent, and also worked on reducing the initial burst, thereby completing the present invention.
  • the present invention includes the following inventions.
  • the drug-carrying hydrogel preparation of the present invention Since the drug-carrying hydrogel preparation of the present invention has few initial bursts, there is very little adverse effect on the patient by the carried drug immediately after administration. According to the method for producing a drug-carrying hydrogel preparation of the present invention, it is possible to produce a drug-carrying hydrogel preparation that can reduce the initial burst of the drug and that can be gradually released in vivo without using an organic solvent. Become. Since the method for producing the drug-carrying hydrogel preparation of the present invention does not require the use of an organic solvent, a highly safe drug-carrying hydrogel preparation can be obtained.
  • FIG. 5 is a graph showing the degradation rate of the biodegradable polymer gel prepared in Preliminary Test Example 1-5.
  • 2 is a graph showing the results of conducting a cisplatin release test on the cisplatin-loaded hydrogel preparation of Example 1.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of a cisplatin release test performed on the cisplatin-supported hydrogel preparation of Example 2. It is a graph which shows the result of having performed the release test with respect to the carboplatin carrying hydrogel formulation of Examples 3 and 4, and the oxaliplatin carrying hydrogel formulation of Examples 5 and 6.
  • FIG. 6 is a graph showing results (Examples 8 and 9, Comparative Examples 4 to 6) of a toxicity test performed on healthy mice.
  • 6 is a graph showing the results (Examples 10 and 11, Comparative Examples 7 to 10) of a toxicity test performed on human gastric cancer peritoneal seeding model mice. It is the graph and image which show the result of having performed the IVIS measurement about the human stomach cancer peritoneum seeding model mouse used in Example 10, Example 11, Comparative example 7, and Comparative example 8.
  • the method for producing a drug-carrying hydrogel preparation of the present invention (hereinafter also referred to as the production method of the present invention) is as follows: (a) A biodegradable polymer gel is obtained by crosslinking reaction in an aqueous solution. A step; (b) a step of finely granulating the biodegradable polymer gel; and (c) a step of bringing the finely divided biodegradable polymer gel into contact with a solution containing the drug to obtain a drug-carrying hydrogel. Including.
  • the cross-linking reaction is performed in order to cross-link the biodegradable polymer and form a three-dimensional network structure to form a biodegradable polymer gel.
  • the cross-linking reaction is performed in order to cross-link the biodegradable polymer and form a three-dimensional network structure to form a biodegradable polymer gel.
  • the cross-linking reaction in the step (a) includes, for example, a method of allowing a cross-linking agent to act on the biodegradable polymer, a method of cross-linking biodegradable polymers with heat, ultraviolet rays, and the like, and is not particularly limited.
  • the concentration of the biodegradable polymer in the aqueous solution during the crosslinking reaction is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for the crosslinking reaction. For example, it is 1 to 10% by mass, and more preferably 2 to 8% by mass. Those skilled in the art can make appropriate adjustments.
  • the biodegradable polymer used in the above step (a) is not particularly limited as long as it can support a drug as a substrate and has a function of being degraded in vivo and gradually releasing the drug.
  • Specific examples include polylactic acid, casein, gelatin, collagen, keratin, starch, cellulose, hyaluronic acid, polyvinyl alcohol (PVA), and polyethylene glycol (PEG).
  • gelatin is preferably used because it is not immunogenic and can be easily chemically modified. It is preferable to use gelatin whose safety against living bodies has been confirmed.
  • Biodegradable polymers include those derived from animals, those derived from genetically modified microorganisms such as genetically modified yeast or genetically modified Escherichia coli, and those chemically synthesized. From the viewpoint of safety to living bodies, it is preferable to use those derived from genetically modified microorganisms and those chemically synthesized.
  • crosslinking agent used in the step (a) examples include enzymes such as transglutaminase, and chemical crosslinking agents such as formaldehyde, glutaraldehyde, and carbodiimide.
  • enzymes such as transglutaminase
  • chemical crosslinking agents such as formaldehyde, glutaraldehyde, and carbodiimide.
  • glutaraldehyde is preferably used as a crosslinking agent. After crosslinking with glutaraldehyde, the unreacted glutaraldehyde can be easily inactivated by adding the reaction product to the glycine aqueous solution and stirring. Moreover, after inactivating glutaraldehyde, glutaraldehyde can be easily removed by washing with pure water. Cleaning with pure water is preferably performed twice or more.
  • a crosslinking agent 0.1 mass part or more with respect to 100 mass parts of biodegradable polymers for example, It is more preferable to use 0.5 mass part or more, It is more preferable to use 1 part by mass or more.
  • a crosslinking agent for 8.5 mass parts or less with respect to 100 mass parts of biodegradable polymers for example, and it is more preferable to use 5 mass parts or less, It is more preferable to use 3 parts by mass or less, and it is particularly preferable to use 1.5 parts by mass or less.
  • cross-linking agent such as glutaraldehyde
  • the proportion of the cross-linking agent increases, the degree of cross-linking increases, and when the hydrogel preparation is made, the degradation rate in vivo decreases, and the release rate of the supported drug becomes slow. For this reason, what is necessary is just to adjust the quantity of the crosslinking agent to be used suitably according to a desired chemical
  • the degree of crosslinking of the biodegradable polymer in the biodegradable polymer gel obtained in the above step (a) is the concentration of the crosslinking agent in the solution, the concentration of the biodegradable polymer, the crosslinking agent and the biodegradable polymer.
  • a person skilled in the art can appropriately adjust the mass ratio or molar ratio with the above, the time of the crosslinking reaction, the temperature of the crosslinking reaction, and the like.
  • the gel having a large molecular weight can be removed and the properties of the gel can be homogenized.
  • a method for refining the biodegradable polymer gel it may be ground with a homogenizer or a mortar, or two or more means may be used in combination.
  • the finely divided biodegradable polymer gel is added after the step (b) and before the step (c). It is preferable to further include a step (b ′) of fractionation according to molecular weight and / or particle size. And it is preferable to fractionate only the fraction containing the biodegradable polymer gel having a specific molecular weight and particle size and use it in the next step.
  • the fractionation method based on the particle diameter include a method in which a cross-linked biodegradable polymer gel is passed through a plurality of sieves having different openings.
  • the crosslinked biodegradable polymer gel is passed through the sieves having an opening of 180 ⁇ m, 106 ⁇ m, and 53 ⁇ m in this order, and the fraction remaining on the 53 ⁇ m sieve is collected, so that the particle size in the swollen state is reduced. A gel of 53 ⁇ m to 106 ⁇ m can be obtained.
  • the degradation rate of the resulting hydrogel preparation and the drug release rate can be homogenized.
  • the finely divided biodegradable polymer gel is brought into contact with the solution containing the drug.
  • a method for impregnating a biodegradable polymer with a drug specifically, a method of mixing a finely divided biodegradable polymer gel and a solution containing a drug, a biodegradable polymer in a solution containing a drug The method of adding gel and leaving still is mentioned.
  • the drug used in the step (c) is not particularly limited, but is preferably a water-soluble drug.
  • the kind and use of the drug used in the step (c) are not particularly limited.
  • the drug it is preferable to use an anticancer drug from the viewpoint that the biodegradable polymer as a substrate is gradually decomposed in the living body to take advantage of the sustained release action of sustained release of the drug.
  • the anticancer agent specifically, alkylating agents; platinum preparations such as cisplatin, carboplatin, nedaplatin and oxaliplatin; antimetabolites; topoisomerase inhibitors and the like can be preferably used.
  • the concentration of the drug in the solution, the concentration of the biodegradable polymer gel, the concentration of the drug and the biodegradable polymer when the finely divided biodegradable polymer gel is brought into contact with the solution containing the drug is not particularly limited, and can be appropriately adjusted by those skilled in the art depending on the type of drug or biodegradable polymer.
  • a ratio of the biodegradable polymer gel and the drug for example, 5 to 20 parts by mass of the drug can be used with respect to 100 parts by mass of the biodegradable polymer gel.
  • the drug-carrying hydrogel obtained by the method including the above steps may be used as a hydrogel preparation as it is, or freeze-dried and stored, and phosphate buffered saline (PBS) or the like is added just before use. And may be used as a hydrogel preparation.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the production method of the present invention preferably further includes a step (c ′) of centrifuging the drug-loaded hydrogel and then removing the supernatant after the step (c).
  • the resulting drug-loaded hydrogel is lyophilized to remove the solvent, and then a physiological saline such as PBS is added to prepare a hydrogel. After centrifugation, the supernatant is removed and lyophilized.
  • a hydrogel preparation may be prepared by adding PBS again to the product.
  • the centrifugation is preferably performed, for example, in physiological saline at 3000-15000 rpm for 3-5 minutes, and further preferably performed at 4000-13000 rpm for 3-5 minutes. It is preferable to carry out at 5000 to 10000 rpm for 3 to 5 minutes.
  • the conditions for the centrifugation may be that the hydrogel is not suspended in the supernatant macroscopically and the supernatant becomes transparent.
  • the production method of the present invention preferably further includes a step (c ′′) of freeze-drying the drug-carrying hydrogel after the step (c) and before the step (c ′).
  • a step (c ′′) of freeze-drying the drug-carrying hydrogel after the step (c) and before the step (c ′).
  • the present invention also relates to a drug-carrying hydrogel preparation (hereinafter also referred to as the preparation of the present invention) obtained by a production method including the above-described steps.
  • the preferable aspects and embodiments described in the above-described steps can be applied to the preparation of the present invention.
  • the preparation of the present invention is biodegraded in vivo, it can be suitably used for the purpose of administering a drug to a lesion in the body. For example, it is known that many tumor cells secrete gelatinase which degrades gelatin and matrix metalloproteinase (MMP) which is a collagenase.
  • MMP matrix metalloproteinase
  • the preparation of the present invention when the preparation of the present invention is administered to tumor cells, the biodegradable polymer gel as a substrate is decomposed, and the carried drug can be exposed to the tumor cells. Therefore, the preparation of the present invention can be suitably used as a preparation for treating tumors. Examples of applicable tumors include gastrointestinal cancer, ovarian cancer, bladder cancer, cervical cancer, and the like, and can also be suitably used for peritoneal dissemination in which the tumor is disseminated on the peritoneum.
  • the preparation of the present invention preferably contains 5 to 20 parts by mass, more preferably 5 to 15 parts by mass of the drug with respect to 100 parts by mass of the biodegradable polymer gel.
  • the preparation of the present invention preferably exhibits a release profile described later.
  • the formulations of the present invention may further comprise one or more pharmaceutically acceptable and / or non-toxic physiologically acceptable carriers, adjuvants or excipients.
  • the formulations of the present invention may be formulated for administration in solid or semi-solid dosage forms.
  • the formulations of the present invention may include one or more binders, fillers, lubricants, suspending agents, sweeteners, flavoring agents, preservatives, buffering agents, wetting agents, disintegrating agents, foaming agents, and other excipients.
  • An agent may be included. The above excipients are known to those skilled in the art.
  • the preparation of the present invention is for administration selected from the group consisting of intraperitoneal, oral, rectal, intravaginal, buccal and topical administration, preferably selected from the group consisting of intraperitoneal, rectal, intravaginal and topical administration. It may be formulated for administration, particularly preferably for intraperitoneal administration.
  • the preparation of the present invention is an agent selected from the group consisting of a fast-acting preparation, a controlled-release preparation, a rapid oral disintegration preparation, a delayed-release preparation, a sustained-release preparation, a pulse-release preparation, and a mixed-type preparation with a fast-acting and controlled release It may be formulated into a form.
  • the preparation of the present invention can be used in combination with a plurality of drugs for the purpose of complementing or enhancing the therapeutic or preventive effect.
  • a plurality of drugs for the purpose of complementing or enhancing the therapeutic or preventive effect.
  • the preparation of the present invention may be used in combination with other drugs not supported on the hydrogel in order to supplement or enhance the therapeutic or preventive effect.
  • other drugs in this case include tegafur / gimeracil / oteracil potassium (TS-1), camptothecin 11 (CPT-11), fluorouracil, and paclitaxel.
  • the formulation of the present invention preferably exhibits a reduced initial burst in the release profile for the drug as measured using an atomic absorptiometer in phosphate buffered saline.
  • the release profile can be measured with an atomic absorption meter in phosphate buffered saline. Specifically, it can be determined by the method described in “Cisplatin release test” described later in Example 1.
  • the preparation of the present invention exhibits an initial burst of preferably 15% or less, more preferably 10% or less, and particularly preferably 5% or less due to a small amount of unbound drug to gelatin.
  • the release rate of the drug released when collagenase is acted is preferably 50%. More preferably, it is 70% or more, more preferably 80% or more, and particularly preferably 90% or more.
  • the present invention comprises a reduced initial burst, preferably in a release profile for a drug containing a cross-linked biodegradable polymer gel and drug, measured using an atomic absorptiometer in phosphate buffered saline. It also relates to a drug-carrying hydrogel formulation (hereinafter also referred to as the drug-carrying hydrogel formulation of the present invention) showing an initial burst of 15% or less.
  • the production method of the present invention described above is suitable for the production of the drug-carrying hydrogel preparation of the present invention.
  • the preferred aspects and embodiments described above for the production method of the present invention and the preparation of the present invention can be applied to the drug-carrying hydrogel preparation of the present invention.
  • the release profile can be measured with an atomic absorption meter in phosphate buffered saline. Specifically, it can be determined by the method described in “Cisplatin release test” described later in Example 1.
  • the drug-loaded hydrogel preparation shows an initial burst of preferably 15% or less, more preferably 10% or less, and particularly preferably 5% or less, because there are few unbound drugs to gelatin.
  • the release rate of the drug released when collagenase is acted is preferably 50. % Or more, more preferably 70% or more, further preferably 80% or more, and particularly preferably 90% or more.
  • the gelatin hydrogel was peeled off from the dish with a spatula, placed in a 0.1% by mass glycine aqueous solution and allowed to stand to block the aldehyde group of unreacted glutaraldehyde. After 1 hour, the aqueous glycine solution was discarded, and the gel was washed twice with ultrapure water. Thereafter, the gel was collected, cut into approximately 5 mm squares with a scalpel, and homogenized with a polytron homogenizer (manufactured by Kinematica). The obtained homogenate is passed through sieves with openings of 180 ⁇ m, 106 ⁇ m and 53 ⁇ m (manufactured by Iida Seisakusho). Fine particles of 53 to 106 ⁇ m are collected and lyophilized, then sterilized with ethylene oxide gas at 40 ° C. for 6 hours, and crosslinked. Gelatin fine particles were obtained.
  • the amount of glutaraldehyde used per 1 g of the crosslinked gelatin fine particles is 5 mg.
  • ⁇ Degradability test> To an Eppendorf tube containing 500 ⁇ L of ultrapure water, 5 mg of crosslinked gelatin fine particles obtained by the above procedure was added, and the mixture was allowed to swell for 12 hours at 35 ° C. Next, 500 ⁇ L of 2N hydrochloric acid was added to start the gelatin decomposition, and the absorbance (260 nm, 280 nm) of the supernatant was measured to confirm the progress of the decomposition. The progress of decomposition when the degree of decomposition after 48 hours is taken as 100% is shown in FIG.
  • the amount of glutaraldehyde used is small, and even in Preliminary Test Example 5 that is used most, it is 80 mg per 1 g of crosslinked gelatin fine particles.
  • the method for preparing the crosslinked gelatin fine particles of Preliminary Test Example 1-5 can reduce the amount of the crosslinking agent used. Is excellent.
  • the preparation method of Preliminary Test Example 1-5 is also excellent in that no organic solvent such as oil or acetone is used.
  • FIG. 2 is a graph plotting the ratio of cisplatin released into the supernatant after 1 hour and 24 hours, with the amount of cisplatin in the supernatant 25 hours after the start of the experiment being 100%.
  • the gelatin hydrogel of the present invention has an extremely low cisplatin initial burst of about 2%. Moreover, even after 24 hours from the start of the experiment, the amount of cisplatin released was almost the same as that after 1 hour, indicating that the ability to stably hold cisplatin was very high.
  • Example 2 In the preparation of the cisplatin-impregnated gelatin hydrogel of Example 1, the cisplatin release test was conducted in the same manner as in Example 1 except that the step (2) was not performed and the gelatin hydrogel solution prepared in (1) was used. Further, the amount of cisplatin released into the supernatant was measured 26 hours after the start of the experiment.
  • FIG. 3 is a graph plotting the ratio of cisplatin released into the supernatant after 1 hour, 24 hours, 25 hours and 26 hours after the start of the experiment, with the amount of cisplatin impregnated in gelatin being 100%.
  • Example 3 ⁇ Preparation of carboplatin-impregnated gelatin hydrogel> (1) Place 100 ⁇ L of a 2 mg / mL carboplatin aqueous solution in an Eppendorf tube, add 2 mg of crosslinked gelatin fine particles prepared in Preliminary Test Example 2, and allow to stand at 4 ° C. for 24 hours to impregnate gelatin with carboplatin. A carboplatin-impregnated gelatin hydrogel solution was prepared.
  • Example 4 A graph plotting the percentage of carboplatin released into the supernatant from 1 hour, 24 hours and 25 hours after the start of the experiment, with the amount of carboplatin released into the supernatant up to 25 hours after the start of the experiment as 100% Is shown in FIG. [Example 4]
  • a carboplatin release test was performed in the same manner as in Example 3 except that a 1 mg / mL carboplatin aqueous solution was used in (1) of the preparation of the carboplatin-impregnated gelatin hydrogel of Example 3.
  • Example 6 An oxaliplatin release test was conducted in the same manner as in Example 3 except that a 1 mg / mL oxaliplatin aqueous solution was used in (1) in the preparation of the oxaliplatin-impregnated gelatin hydrogel of Example 5.
  • the abdominal midline incision was performed to sacrifice the mouse, and PBS was added to the abdominal cavity and washed, and the washing solution was collected. Further, after removing the intraperitoneal organs were excised abdominal belly film. The intraperitoneal washing solution and the abdominal peritoneum were measured with a beta counter, and the values at the start of the experiment were obtained.
  • Example 8 A cisplatin-impregnated gelatin hydrogel was obtained by the same procedure as in Example 1, and was administered to the abdominal cavity of healthy Balb / c nu / nu mice so that the amount of cisplatin was 5 mg / kg. The same administration was performed again one week after the first administration. At the start of the experiment, mice were weighed 4 days later, 1 week later, 9 days later, 12 days later, 2 weeks later, 18 days later, 3 weeks later, 4 weeks later, 5 weeks later and 6 weeks later. The time-dependent change in body weight when the weight at the start of the experiment is taken as 100% is shown by black circles in FIG.
  • Example 9 The body weight of the mice was measured in the same manner as in Example 8 except that the amount of cisplatin was 10 mg / kg. The results are shown in FIG. [Comparative Examples 4 to 6] Implemented except that instead of cisplatin-impregnated gelatin hydrogel, gelatin hydrogel not containing cisplatin (Comparative Example 4), PBS alone (Comparative Example 5) and 3 mg / kg cisplatin alone (Comparative Example 6) were used. The mouse body weight was measured in the same manner as in Example 8. The results are shown in FIG. 6 as black squares (Comparative Example 4), black triangles (Comparative Example 5), and white circles (Comparative Example 6).
  • human gastric cancer peritoneal dissemination model mice were prepared by applying 500 ⁇ L of a luciferase-expressing human poorly differentiated adenocarcinoma cell line MKN45Luc (1 ⁇ 10 7 cells / mL) into the abdominal cavity of a 6-week-old female Balb / c nu / nu mouse. The mice were administered by injection, and mice 5 days after administration were used. [Examples 10 and 11] As described above, human gastric cancer peritoneal seeding model mice were used, and except that the body weight measurement time was different, the cisplatin amount was 5 mg / kg as in Example 8, and the cisplatin amount was 10 mg / kg as in Example 9.
  • Example 11 was performed and the body weight of the mice was measured. The results are shown in FIG. 7 by black circles (Example 10) and X (Example 11).
  • [Comparative Examples 7 to 10] A human gastric cancer peritoneal seeding model mouse was used, except that the weight measurement timing was different, gelatin hydrogel not containing cisplatin was administered as in Comparative Example 4, and Comparative Example 7 was administered, and PBS was administered only as in Comparative Example 5.
  • Comparative Example 8 was carried out in the same manner as Comparative Example 9 except that 3 mg / kg of cisplatin alone was administered in the same manner as in Comparative Example 6 to give 5 mg / kg of cisplatin alone. Mice were weighed. The results are shown in FIG. 7 as black squares (Comparative Example 7), black triangles (Comparative Example 8), white circles (Comparative Example 9), and white squares (Comparative Example 10).
  • the cisplatin-impregnated hydrogel of the present invention can reduce side effects as compared with the case where the same amount of cisplatin alone is administered, It is clear that the dose of cisplatin can be increased. 10. Toxicity test (blood test) In order to confirm the safety of the cisplatin-impregnated gelatin hydrogel of the present invention, gelatin hydrogels and controls having different cisplatin loadings were administered to healthy mice, blood tests were performed, and white blood cell count (WBC), platelet count (PLT) ), Urea nitrogen (BUN) concentration and creatinine (Cre) concentration were measured.
  • WBC white blood cell count
  • PHT platelet count
  • BUN Urea nitrogen
  • Cre creatinine
  • Example 12 A cisplatin-impregnated gelatin hydrogel was obtained by the same procedure as in Example 1, and was intraperitoneally administered to 4-week-old female ddY mice under isoflurane anesthesia so that the amount of cisplatin was 5 mg / kg. Moreover, the same administration was performed again one week after the first administration. Fourteen days after the first administration, heart chamber blood was collected under isoflurane anesthesia, and the mice were sacrificed. The white blood cell count and platelet count were measured by an automated method with heparin added to whole blood. The results are shown in FIGS. 10 and 11, respectively. Urea nitrogen concentration and creatinine concentration were used for measurement by collecting serum after blood coagulation.

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Abstract

　少ない初期バーストで放出することが可能な薬剤担持製剤、及びその製造方法を提供する。　以下：（ａ）生分解性高分子を水溶液中で架橋反応させて生分解性高分子ゲルを得る工程；（ｂ）生分解性高分子ゲルを細粒化する工程；及び（ｃ）細粒化した生分解性高分子ゲルと薬剤を含む溶液とを接触させて薬剤担持ハイドロゲルを得る工程を含む、薬剤担持ハイドロゲル製剤の製造方法。

Description

薬剤担持ハイドロゲル製剤及びその製造方法
　本発明は、薬剤担持ハイドロゲル製剤及びその製造方法に関する。本発明は、特には腹膜播種の治療に用いる薬剤担持ハイドロゲル製剤及びその製造方法の製造方法に関する。
　腹膜播種は、胃癌や大腸癌等が進行し、癌細胞が臓器の漿膜面へ露出することで、腹腔内にばらまかれ（播種）、腹膜に付着、病巣形成して起こる疾患である。一度腹腔内にがん細胞が播種すると、全病巣の切除は難しく、手術適応外となることが多い。従って、現在では抗癌剤の経静脈的投与、経口投与等による全身化学療法が標準治療とされているが、満足のいく効果は得られていない。
　腹膜播種巣は血流に乏しく、全身化学療法として、経静脈、経口投与された抗癌剤は腹膜播種巣へ移行しがたい。また、全身化学療法は、高い血中濃度により強い副作用を伴う。腹膜播種を伴う患者の多くは既に全身状態が悪化しており、ＱＯＬの観点からも全身化学療法が施行不可能であることも少なくない。
　抗癌剤の副作用は血中濃度に関連があるとされているため、抗癌剤の血中濃度を抑えながら、腹膜播種病巣に適切な濃度の抗癌剤を暴露させるため、抗癌剤を腹腔内に直接投与する試みがこれまでになされてきた。しかし、胃癌等に効果があるとされているシスプラチン等の水溶性の抗癌剤は、腹膜から早期に吸収されることから、腹腔内投与によって、十分な結果を得るには至っていない。そこで、ゼラチン等の生体分解性高分子に抗癌剤を結合させた状態で、腹腔内に投与し、抗癌剤を徐放することで治療効果を促進し、かつ適切な血中濃度を保つことにより副作用を軽減させるという治療法が研究され、動物実験も行われている（例えば非特許文献１）。
　従来の、薬剤を含浸させた生分解性高分子ハイドロゲル製剤は、投与時に初期バーストと呼ばれる薬剤の放出があり、その割合は担持させた薬剤の２割から３割程度に達している。このため、薬剤の損失があり、製剤の調製コストが増加することに加え、製剤の投与時に被験者が高濃度の薬剤に暴露されるという問題がある。また、生分解性高分子ハイドロゲル製剤はヒトに投与するもののため、その調製においては、多くの場合、アセトンやヘキサン等の有機溶媒を用いているが、有機溶媒を使用しないで調製することが望ましい。
　したがって、薬剤の初期バーストが少ない薬剤担持製剤、及び、そのような製剤を有機溶剤を用いることなく製造する方法が求められていた。
郡司ら、Ｓｕｒｇｅｒｙ、２０１３年１１月１日、第１５４巻、第５号、ｐ．９９１－９９９
　本発明は、薬剤の初期バーストが少なく、かつ、生体内で薬剤を徐放できる薬剤担持製剤、及びその製造方法を提供することを目的とする。また本発明は、薬剤の初期バーストが少なく、かつ、生体内で薬剤を徐放できる薬剤担持製剤を有機溶剤を用いることなく製造する方法を提供することも目的とする。
　本発明者らは、有機溶媒を用いずに薬剤担持製剤を製造する方法を鋭意探索し、併せて初期バーストの低減にも取り組んだ結果、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下：
（ａ）生分解性高分子を水溶液中で架橋反応させて生分解性高分子ゲルを得る工程；
（ｂ）生分解性高分子ゲルを細粒化する工程；及び
（ｃ）細粒化した生分解性高分子ゲルと薬剤を含む溶液とを接触させて薬剤担持ハイドロゲルを得る工程
を含む、薬剤担持ハイドロゲル製剤の製造方法。
（２）工程（ｃ）の後に、薬剤担持ハイドロゲルを遠心分離し、次いで上清を除去する工程（ｃ’）をさらに含む、（１）に記載の製造方法。
（３）工程（ｃ）の後かつ工程（ｃ’）の前に、薬剤担持ハイドロゲルを凍結乾燥する工程（ｃ’’）をさらに含む、（２）に記載の製造方法。
（４）工程（ｂ）の後かつ工程（ｃ）の前に、細粒化した生分解性高分子ゲルを分子量及び／又は粒子径により分画する工程（ｂ’）をさらに含む、（１）～（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）薬剤が、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン及びオキサリプラチンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、（１）～（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）生分解性高分子がゼラチンである、（１）～（５）のいずれかに記載の製造方法。
（７）（１）～（６）のいずれかに記載の製造方法により得られる、薬剤担持ハイドロゲル製剤。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2015-073019号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
　本発明の薬剤担持ハイドロゲル製剤は、初期バーストが少ないため、投与直後における、担持させた薬剤による患者への悪影響が極めて少ない。本発明の薬剤担持ハイドロゲル製剤の製造方法によれば、薬剤の初期バーストが少なく、かつ、生体内で薬剤を徐放できる薬剤担持ハイドロゲル製剤を有機溶媒を用いることなく製造することが可能となる。本発明の薬剤担持ハイドロゲル製剤の製造方法は、有機溶媒を使用する必要がないため、安全性の高い薬剤担持ハイドロゲル製剤が得られる。
予備試験例１－５において調製した生分解性高分子ゲルの分解速度を示すグラフである。 実施例１のシスプラチン担持ハイドロゲル製剤に対してシスプラチン放出性試験を行った結果を示すグラフである。 実施例２のシスプラチン担持ハイドロゲル製剤に対してシスプラチン放出性試験を行った結果を示すグラフである。 実施例３及び４のカルボプラチン担持ハイドロゲル製剤、実施例５及び６のオキサリプラチン担持ハイドロゲル製剤に対して放出性試験を行った結果を示すグラフである。 実施例１のシスプラチン（ＣＤＤＰ）担持ハイドロゲル製剤を用い、健康なマウスに対して腹腔内分解性試験を行った結果（実施例７）を示すグラフである。 健康なマウスに対して毒性試験を行った結果（実施例８及び９、比較例４～６）を示すグラフである。 ヒト胃癌腹膜播種モデルマウスに対して毒性試験を行った結果（実施例１０及び１１、比較例７～１０）を示すグラフである。 実施例１０、実施例１１、比較例７及び比較例８で用いたヒト胃癌腹膜播種モデルマウスについてＩＶＩＳ測定を行った結果を示すグラフ及び画像である。 実施例１０、実施例１１、比較例７、比較例８及び比較例１０におけるヒト胃癌腹膜播種モデルマウスの投与後の生存割合を示すグラフである。 健康なマウスに対して毒性試験（血液検査）を行い、白血球数（ＷＢＣ）を測定した結果（実施例１２、実施例１３、比較例１１及び比較例１２）を示すグラフである。 健康なマウスに対して毒性試験（血液検査）を行い、血小板数（ＰＬＴ）を測定した結果（実施例１２、実施例１３、比較例１１及び比較例１２）を示すグラフである。 健康なマウスに対して毒性試験（血液検査）を行い、尿素窒素（ＢＵＮ）濃度を測定した結果（実施例１２、実施例１３、比較例１１及び比較例１２）を示すグラフである。 健康なマウスに対して毒性試験（血液検査）を行い、クレアチニン（Ｃｒｅ）濃度を測定した結果（実施例１２、実施例１３、比較例１１及び比較例１２）を示すグラフである。
　次に、本発明を実施するための形態を具体的に説明する。
　本発明の薬剤担持ハイドロゲル製剤の製造方法（以下、本発明の製造方法ともいう）は、以下：（ａ）生分解性高分子を水溶液中で架橋反応させて生分解性高分子ゲルを得る工程；（ｂ）生分解性高分子ゲルを細粒化する工程；及び（ｃ）細粒化した生分解性高分子ゲルと薬剤を含む溶液とを接触させて薬剤担持ハイドロゲルを得る工程を含む。
　上記工程（ａ）において、架橋反応は生分解性高分子を分子間架橋し、三次元の網目構造を形成させて生分解性高分子ゲルを形成させるために行う。生分解性高分子に三次元の網目構造を形成させることにより、薬剤を適切に担持し、徐放することが可能となる。
　上記工程（ａ）における架橋反応としては、生分解性高分子に架橋剤を作用させる方法、熱や紫外線等により生分解性高分子同士を架橋する方法等が挙げられ、特に制限されない。架橋反応を行う際の水溶液中の生分解性高分子の濃度は、架橋反応に好適な濃度であれば特に制限はなく、例えば、１～１０質量％、より好ましい範囲として２～８質量％とすることができ、当業者であれば適宜調整することが可能である。
　上記工程（ａ）において使用する生分解性高分子としては、基質として薬剤を担持でき、生体内で分解されて薬剤を徐放する機能を有するものであれば特に制限されない。具体的には、ポリ乳酸、カゼイン、ゼラチン、コラーゲン、ケラチン、デンプン、セルロース、ヒアルロン酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等が挙げられる。これらの中で、免疫原性がなく化学修飾が容易な点で、ゼラチンを用いることが好ましい。ゼラチンは、生体に対する安全性が確認されたものを用いることが好ましい。また、生分解性高分子には、動物由来のもの、遺伝子組み換え酵母又は遺伝子組み換え大腸菌等の遺伝子組み換え微生物に由来するもの、及び化学合成したもの等がある。生体に対する安全性の観点から、遺伝子組み換え微生物に由来するもの、及び化学合成したものを用いることが好ましい。
　上記工程（ａ）において使用する架橋剤の例としては、トランスグルタミナーゼ等の酵素、ホルムアルデヒドやグルタルアルデヒド、カルボジイミド等の化学架橋剤が挙げられる。生分解性高分子がゼラチンの場合、架橋剤としてグルタルアルデヒドを用いることが好ましい。グルタルアルデヒドによる架橋後、反応物をグリシン水溶液に添加して撹拌することにより、未反応のグルタルアルデヒドを容易に不活化することができる。また、グルタルアルデヒドを不活化した後、純水で洗浄することによりグルタルアルデヒドを容易に除去することができる。純水による洗浄は２度以上行うことが好ましい。
　上記工程（ａ）における架橋反応について、架橋剤は、例えば、生分解性高分子１００質量部に対して０．１質量部以上用いることが好ましく、０．５質量部以上用いることがより好ましく、１質量部以上用いることがさらに好ましい。また上記工程（ａ）における架橋反応について、架橋剤は、例えば、生分解性高分子１００質量部に対して８．５質量部以下用いることがより好ましく、５質量部以下用いることがより好ましく、３質量部以下用いることがさらに好ましく、１．５質量部以下用いることが特に好ましい。特に架橋剤としてグルタルアルデヒド等の化学架橋剤を用いる場合には、生分解性高分子に対して上記の割合で架橋剤を用いることが好ましい。架橋剤の割合を増やすほど架橋の程度が増し、ハイドロゲル製剤としたときに生体内での分解速度が低下し、担持した薬剤の放出速度が遅くなる。このため、用いる架橋剤の量は、所望の薬剤放出速度に応じて適宜調整すればよい。
　上記工程（ａ）において得られる生分解性高分子ゲルにおける生分解性高分子の架橋の程度は、溶液中の架橋剤の濃度、生分解性高分子の濃度、架橋剤と生分解性高分子との質量比又はモル比、架橋反応の時間、架橋反応の温度等によって当業者であれば適宜調整することができる。
　上記工程（ｂ）において架橋した生分解性高分子ゲルを細粒化することにより、分子量が大きいゲルを除去し、ゲルの性質の均質化を図ることができる。生分解性高分子ゲルの細粒化する方法としては、ホモジナイザーや乳鉢等ですり潰してもよく、２種以上の手段を併用してもよい。
　本発明の製造方法は、生分解性高分子ゲルをより均質なものとするために、工程（ｂ）の後かつ上記工程（ｃ）の前に、細粒化した生分解性高分子ゲルを分子量及び／又は粒子径により分画する工程（ｂ’）をさらに含むことが好ましい。そして特定の分子量や粒子径を有する生分解性高分子ゲルを含む分画のみを分取して、次の工程に用いることが好ましい。粒子径による分画の方法としては、目開きの異なる複数のふるいに、架橋した生分解性高分子ゲルを通し分画する方法が挙げられる。具体的には、架橋した生分解性高分子ゲルを、目開き１８０μｍ、１０６μｍ及び５３μｍのふるいにこの順に通し、５３μｍのふるいに残った分画を分取することにより、膨潤状態で粒径が５３μｍ～１０６μｍのゲルを得ることができる。このように粒径や分子量で均一な生分解性高分子ゲルを用いることにより、得られるハイドロゲル製剤の分解速度や薬剤の放出速度を均質化することができる。
　上記工程（ｃ）において、細粒化した生分解性高分子ゲルと薬剤を含む溶液とを接触させる。生分解性高分子に薬剤を含浸させる方法としては、具体的には、細粒化した生分解性高分子ゲルと薬剤を含む溶液とを混合する方法、薬剤を含む溶液に生分解性高分子ゲルを添加して静置する方法等が挙げられる。
　上記工程（ｃ）において用いる薬剤は、特に制限はないが、水溶性の薬剤であることが好ましい。上記工程（ｃ）において用いる薬剤は、その種類や用途も特に制限されない。薬剤としては、基質である生分解性高分子が生体内で徐々に分解されて薬剤を徐放する徐放作用の利点を生かせるという観点から、抗がん剤を用いることが好ましい。抗がん剤としては、具体的には、アルキル化剤；シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン及びオキサリプラチン等の白金製剤；代謝拮抗剤；トポイソメラーゼ阻害剤等を好ましく用いることができる。
　上記工程（ｃ）において、細粒化した生分解性高分子ゲルと薬剤を含む溶液とを接触させる際の溶液中の薬剤の濃度、生分解性高分子ゲルの濃度、薬剤と生分解性高分子ゲルの質量比等は、特に制限はなく、薬剤や生分解性高分子の種類に応じて当業者であれば適宜調整することが可能である。生分解性高分子ゲルと薬剤の比率としては、例えば、生分解性高分子ゲル１００質量部に対し、薬剤５～２０質量部を用いることができる。
　上記工程を含む方法により得られた薬剤担持ハイドロゲルは、そのままハイドロゲル製剤として使用してもよく、或いは凍結乾燥して保存し、使用直前にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等を添加してハイドロゲル製剤として使用してもよい。
　本発明の製造方法は、工程（ｃ）の後に、薬剤担持ハイドロゲルを遠心分離し、次いで上清を除去する工程（ｃ’）をさらに含むことが好ましい。例えば、得られた薬剤担持ハイドロゲルを凍結乾燥して溶媒を除去し、これにＰＢＳ等の生理食塩水を添加してハイドロゲルを調製し、遠心分離後、上清を除去して、凍結乾燥したものに再びＰＢＳを添加してハイドロゲル製剤を調製してもよい。このように、遠心分離し、上清を除去することにより、ハイドロゲルとの結合が弱く解離速度の速い薬剤を除去することができ、生体内での分解によってのみ薬剤を放出する優れたハイドロゲル製剤を製造することができる。生体内での分解によってのみ薬剤を放出させる観点から、遠心分離は、例えば、生理食塩水中で、３０００～１５０００ｒｐｍで３～５分間行うことが好ましく、４０００～１３０００ｒｐｍで３～５分間行うことがさらに好ましく、５０００～１００００ｒｐｍで３～５分間行うことが特に好ましい。遠心分離の条件は、具体的には、肉眼的に上清にハイドロゲルが浮遊しておらず、上清が透明な状態となることを目安とすればよい。
　本発明の製造方法は、工程（ｃ）の後かつ工程（ｃ’）の前に、薬剤担持ハイドロゲルを凍結乾燥する工程（ｃ’’）をさらに含むことが好ましい。遠心分離の前に凍結乾燥を行って溶媒を除去することにより、基質である生分解性高分子と薬剤との分子間距離を縮め、結合力を増大させることができる。
　本発明は、上述した工程を含む製造方法により得られる薬剤担持ハイドロゲル製剤（以下、本発明の製剤ともいう）にも関する。上述した工程において説明した好ましい態様や実施形態は、本発明の製剤に適用することができる。本発明の製剤は、生体内で生分解されるため、体内の病巣に薬剤を投与する目的で好適に使用することができる。例えば、多くの腫瘍細胞ではゼラチンを分解するゼラチナーゼや、コラゲナーゼであるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を分泌することが知られている。このため、本発明の製剤は、腫瘍細胞に投与されると、基質である生分解性高分子ゲルが分解され、担持されている薬剤を腫瘍細胞に暴露させることができる。よって、本発明の製剤は、腫瘍を治療するための製剤として好適に用いることができる。適用対象の腫瘍としては、消化器がん卵巣がん、膀胱がん及び子宮頸がん等を挙げることができ、腫瘍が腹膜に播種した腹膜播種にも好適に用いることができる。
　本発明の製剤は、生分解性高分子ゲル１００質量部に対し、好ましくは５～２０質量部、さらに好ましくは５～１５質量部の薬剤を含む。
　また本発明の製剤は、後述する放出プロファイルを示すことが好ましい。
　本発明の製剤は、１つ以上の薬学的に許容される及び／又は毒性のない生理的に許容される担体、佐剤、又は賦形剤をさらに含んでいてもよい。本発明の製剤は固体又は半固体の剤形で投与されるように製剤化されていてもよい。
　本発明の製剤は、１つ以上の結合剤、充填剤、滑沢剤、懸濁剤、甘味料、香味料、保存料、緩衝剤、湿潤剤、崩壊剤、発泡剤、及び他の賦形剤を含んでいてもよい。上記の賦形剤は当業者に公知である。
　本発明の製剤は、腹腔内、経口、直腸、腟内、口腔内、及び局所投与からなる群より選択される投与用、好ましくは腹腔内、直腸、腟内及び局所投与からなる群より選択される投与用、特に好ましくは腹腔内投与用に製剤化されたものであってよい。
　本発明の製剤は、速効性製剤、制御放出製剤、口腔内即崩壊製剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、ならびに速効性及び制御放出の混合型製剤からなる群より選択される剤形に製剤化されていてもよい。
　本発明の製剤によれば、適切な放出プロファイルを有することにより副作用を軽減することができるため、薬剤の投与量を適宜増量することができる。
　また、本発明の製剤は、治療若しくは予防効果の補完又は増強等の目的で、複数の薬剤を併用することもできる。所望する放出時の各薬剤の形態、各薬剤の放出プロファイルに応じて、上記本発明の製造方法における各工程の条件を適宜調整することにより、効果的に複数の薬剤の効果を発揮させることが可能となる。
　本発明の製剤は、治療若しくは予防効果の補完又は増強のために、ハイドロゲルに担持されていない他の薬剤と併用してもよい。この場合の他の薬剤としては、例えば、テガフール／ギメラシル／オテラシルカリウム（ＴＳ－１）、カンプトテシン１１（ＣＰＴ－１１）、フルオロウラシル、及びパクリタキセルが挙げられる。
　本発明の製剤は、リン酸塩緩衝生理食塩水中、原子吸光度計を用いて測定した薬剤についての放出プロファイルにおいて、低減された初期バーストを示すことが好ましい。
　上記放出プロファイルは、リン酸塩緩衝生理食塩水中、原子吸光度計を用いて測定することができる。具体的には、実施例１について後述する「シスプラチン放出性試験」に記載される方法により決定することができる。
　上記放出プロファイルにおいて、本発明の製剤は、ゼラチンへの未結合薬剤が少ないために、好ましくは１５％以下、さらに好ましくは１０％以下、特に好ましくは５％以下の初期バーストを示す。
　また上記放出プロファイルにおいて、本発明の製剤は、ゼラチン分解に伴う薬剤放出により生体内で薬剤を徐放できるために、コラゲナーゼを作用させたときに放出される薬剤の放出率が、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上である。
　本発明は、架橋された生分解性高分子ゲル及び薬剤を含有し、リン酸塩緩衝生理食塩水中、原子吸光度計を用いて測定した薬剤についての放出プロファイルにおいて、低減された初期バースト、好ましくは１５％以下の初期バーストを示す、薬剤担持ハイドロゲル製剤（以下、本発明の薬剤担持ハイドロゲル製剤ともいう）にも関する。上述した本発明の製造方法は、本発明の薬剤担持ハイドロゲル製剤の製造に適している。本発明の製造方法及び本発明の製剤に関して上に説明した好ましい態様や実施形態は、本発明の薬剤担持ハイドロゲル製剤に適用することができる。
　上記放出プロファイルは、リン酸塩緩衝生理食塩水中、原子吸光度計を用いて測定することができる。具体的には、実施例１について後述する「シスプラチン放出性試験」に記載される方法により決定することができる。
　上記放出プロファイルにおいて、薬剤担持ハイドロゲル製剤は、ゼラチンへの未結合薬剤が少ないために、好ましくは１５％以下、さらに好ましくは１０％以下、特に好ましくは５％以下の初期バーストを示す。
　また上記放出プロファイルにおいて、薬剤担持ハイドロゲル製剤は、ゼラチン分解に伴う薬剤放出により生体内で薬剤を徐放できるために、コラゲナーゼを作用させたときに放出される薬剤の放出率が、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上である。
　次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
１．架橋ゼラチン微粒子の分解性試験
［予備試験例１］
＜架橋ゼラチン微粒子の調製＞
　ゼラチン（新田ゼラチン社製ｂｅＭａｔｒｉｘ　ＬＳ－Ｈ）の５質量％水溶液を４０ｍＬ調製し、４０℃で保温した。この溶液に２５質量％グルタルアルデヒド水溶液を４０μＬ添加し、転倒混和してよく撹拌した。次いでこの溶液１５ｍＬをバランスディッシュに流延し、このバランスディッシュを４℃の冷蔵庫に１２時間静置し、ゼラチンを化学架橋させた。
　１２時間後、ディッシュからゼラチンハイドロゲルをへらではがし、それを０．１質量％グリシン水溶液に入れて静置し、未反応のグルタルアルデヒドのアルデヒド基をブロッキングした。１時間後、グリシン水溶液を捨て、ゲルを超純水で２回洗浄した。その後、ゲルを回収し、メスで約５ｍｍ角に刻み、それをポリトロンホモジナイザー（キネマチカ社製）でホモジナイズした。得られたホモジネートを目開き１８０μｍ、１０６μｍ及び５３μｍのふるい（飯田製作所社製）にかけ、５３～１０６μｍの細粒を回収して凍結乾燥し、次いで４０℃にて６時間エチレンオキサイドガス滅菌し、架橋ゼラチン微粒子を得た。
　なお、この調製方法では、架橋ゼラチン微粒子１ｇあたりのグルタルアルデヒドの使用量は５ｍｇである。
＜分解性試験＞
　超純水５００μＬを入れたエッペンドルフチューブに上記の手順で得た架橋ゼラチン微粒子５ｍｇを添加し、３５℃にて１２時間保ち膨潤させた。次いで２規定の塩酸を５００μＬ添加し、ゼラチンの分解を開始し、上清の吸光度（２６０ｎｍ、２８０ｎｍ）を測定して分解の進行度を確認した。４８時間後の分解度を１００％としたときの分解の進行度を図１にバツで示す。
［予備試験例２－５］
　架橋ゼラチン微粒子の調製において２５質量％グルタルアルデヒド水溶液の添加量をそれぞれ８０μＬ、１６０μＬ、３２０μＬ、６４０μＬとしたこと以外は予備試験例１と同様にして架橋ゼラチン微粒子を調製し、分解性試験を行った。結果を図１にそれぞれ黒丸、黒三角、黒四角、黒ひし形で示す。
＜予備試験例１－５の架橋ゼラチン微粒子の分解性試験結果についての考察＞
　図１に示す結果から、架橋剤（グルタルアルデヒド）の使用量が少ない予備試験例１、２では短時間でゼラチンの分解が進行すること、架橋剤の使用量が多い予備試験例４、５では初期の分解が少なく、ゆっくりと分解することが示された。
　また、予備試験例１－５の調製方法では、下記表１にまとめて示す通り、グルタルアルデヒドの使用量が少なく、最も多く使用した予備試験例５でも、架橋ゼラチン微粒子１ｇ当たり８０ｍｇである。図１に示すように、予備試験例１－５の架橋ゼラチン微粒子は分解が遅いことから、予備試験例１－５の架橋ゼラチン微粒子の調製方法は、架橋剤の使用量を減らすことができる点で優れている。また、予備試験例１－５の調製方法は、油やアセトン等の有機溶剤を使用しない点でも優れている。
２．シスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルの放出プロファイル
［実施例１］
＜シスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルの調製＞
　（１）２ｍｇ／ｍＬのシスプラチン水溶液１００μＬをエッペンドルフチューブに入れ、これに予備試験例２で調製した架橋ゼラチン微粒子２ｍｇを添加し、４℃にて２４時間静置し、ゼラチンにシスプラチンを含浸させて、シスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲル溶液を調製した。
　（２）このゲル溶液を凍結乾燥し、次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加してハイドロゲルを撹拌し、振盪した。次に、このチューブを１００００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を除去した後、再度凍結乾燥してシスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルを調製した。
＜シスプラチン放出性試験＞
　上述の方法で調製したゼラチンハイドロゲルを、ＰＢＳ１０ｍＬを入れたファルコンチューブに投入し、このチューブを３７℃にて６０ｒ／分で往復振盪して試験を開始した。振盪開始から１時間後及び２４時間後にチューブからサンプルを採取し、遠心して上清を回収し、原子吸光度計（島津製作所社製）を用いてプラチナ濃度を測定し、ゼラチンハイドロゲルから解離して上清中に放出されたシスプラチンの量を求めた。
　実験開始から２４時間後、チューブに５μｇ／ｍＬのコラゲナーゼＬ（新田ゼラチン社製）水溶液５００μＬを添加して引き続き振盪した。その１時間後（実験開始から２５時間後）、上清中に放出されたシスプラチンの量を上述の手順で求めた。
　実験開始から２５時間後の上清中のシスプラチン量を１００％として、１時間後及び２４時間後において上清に放出されたシスプラチンの割合をプロットしたグラフを図２に示す。
　図２から、本発明のゼラチンハイドロゲルは、シスプラチンの初期バーストが２％程度と極めて低いことが明らかである。また実験開始から２４時間を経過してもシスプラチンの放出量は１時間後とほとんど同じことから、シスプラチンを安定に保持する能力が非常に高いことが示された。
［実施例２］
　実施例１のシスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルの調製において（２）の工程を行わず、（１）で調製したゼラチンハイドロゲル溶液を用いたこと以外は実施例１と同様にして、シスプラチン放出性試験を行い、さらに実験開始から２６時間後にも上清中に放出されたシスプラチン量を測定した。
　ゼラチンに含浸させたシスプラチン量を１００％として、実験開始から１時間後、２４時間後、２５時間後及び２６時間後において上清に放出されたシスプラチンの割合をプロットしたグラフを図３に示す。
　１時間後の値から、実施例２で調製したゼラチンハイドロゲルは使用したシスプラチンのうち３分の２程度を保持し、３分の１程度を初期段階で放出することが分かる。また、コラゲナーゼを作用させたときに放出されるシスプラチンは、使用したシスプラチンの３分の１程度であった。
３．カルボプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルの放出プロファイル
［実施例３］
＜カルボプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルの調製＞
　（１）２ｍｇ／ｍＬのカルボプラチン水溶液１００μＬをエッペンドルフチューブに入れ、これに予備試験例２で調製した架橋ゼラチン微粒子２ｍｇを添加し、４℃にて２４時間静置し、ゼラチンにカルボプラチンを含浸させて、カルボプラチン含浸ゼラチンハイドロゲル溶液を調製した。
　（２）このゲル溶液を凍結乾燥し、次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加してハイドロゲルを撹拌し、振盪した。次に、このチューブを１００００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を除去した後、再度凍結乾燥してカルボプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルを調製した。
＜カルボプラチン放出性試験＞
　上述の方法で調製したゼラチンハイドロゲルを、ＰＢＳ１０ｍＬを入れたファルコンチューブに投入し、このチューブを３７℃にて６０ｒ／分で往復振盪して試験を開始した。振盪開始から１時間後及び２４時間後にチューブからサンプルを採取し、遠心して上清を回収し、原子吸光度計（島津製作所社製）を用いてプラチナ濃度を測定し、ゼラチンハイドロゲルから解離して上清中に放出されたカルボプラチンの量を求めた。
　実験開始から２４時間後、チューブに５μｇ／ｍＬのコラゲナーゼＬ（新田ゼラチン社製）水溶液５００μＬを添加して引き続き振盪した。その１時間後（実験開始から２５時間後）、上清中に放出されたカルボプラチンの量を上述の手順で求めた。
　実験開始から２５時間後までに上清に放出されたカルボプラチン量を１００％として、実験開始から１時間後、２４時間後及び２５時間後までに上清に放出されたカルボプラチンの割合をプロットしたグラフを図４に示す。
［実施例４］
　実施例３のカルボプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルの調製の（１）において１ｍｇ／ｍＬのカルボプラチン水溶液を使用したこと以外は実施例３と同様にして、カルボプラチン放出性試験を行った。
　実験開始から２５時間後までに上清に放出されたカルボプラチン量を１００％として、実験開始から１時間後、２４時間後及び２５時間後までに上清に放出されたカルボプラチンの割合をプロットしたグラフを図４に示す。
４．オキサリプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルの放出プロファイル
［実施例５］
＜オキサリプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルの調製＞
　（１）２ｍｇ／ｍＬのオキサリプラチン水溶液１００μＬをエッペンドルフチューブに入れ、これに予備試験例２で調製した架橋ゼラチン微粒子２ｍｇを添加し、４℃にて２４時間静置し、ゼラチンにオキサリプラチンを含浸させて、オキサリプラチン含浸ゼラチンハイドロゲル溶液を調製した。
　（２）このゲル溶液を凍結乾燥し、次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加してハイドロゲルを撹拌し、振盪した。次に、このチューブを１００００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を除去した後、再度凍結乾燥してオキサリプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルを調製した。
＜オキサリプラチン放出性試験＞
　上述の方法で調製したゼラチンハイドロゲルを、ＰＢＳ１０ｍＬを入れたファルコンチューブに投入し、このチューブを３７℃にて６０ｒ／分で往復振盪して試験を開始した。振盪開始から１時間後及び２４時間後にチューブからサンプルを採取し、遠心して上清を回収し、原子吸光度計（島津製作所社製）を用いてプラチナ濃度を測定し、ゼラチンハイドロゲルから解離して上清中に放出されたオキサリプラチンの量を求めた。
　実験開始から２４時間後、チューブに５μｇ／ｍＬのコラゲナーゼＬ（新田ゼラチン社製）水溶液５００μＬを添加して引き続き振盪した。その１時間後（実験開始から２５時間後）、上清中に放出されたオキサリプラチンの量を上述の手順で求めた。
　実験開始から２５時間後までに上清に放出されたオキサリプラチン量を１００％として、実験開始から１時間後、２４時間後及び２５時間後までに上清に放出されたオキサリプラチンの割合をプロットしたグラフを図４に示す。
［実施例６］
　実施例５のオキサリプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルの調製の（１）において１ｍｇ／ｍＬのオキサリプラチン水溶液を使用したこと以外は実施例３と同様にして、オキサリプラチン放出性試験を行った。
　実験開始から２５時間後までに上清に放出されたオキサリプラチン量を１００％として、実験開始から１時間後、２４時間後及び２５時間後までに上清に放出されたオキサリプラチンの割合をプロットしたグラフを図４に示す。
　図４から、シスプラチン以外の薬剤含浸ゼラチンハイドロゲルにおいても、実験開始から２４時間を経過しても放出量は１時間後とほとんど同じことから、薬剤を安定に保持する能力が非常に高いことが示された。
５．腹腔内分解性試験
［実施例７］
　実施例１で調製したシスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲル２．５ｍｇに８０倍希釈ボルトン－ハンター試薬２５μLを添加し、４℃にて一晩静置した後、ＰＢＳ１ｍＬを添加してゼラチンハイドロゲルを沈殿させ、上清を除去した。次いで、ＰＢＳ１ｍＬを加え再び４℃にて一晩静置した後上清を除去する操作を計５回行い、未結合のボルトン－ハンター試薬を除去し、１２５Ｉ標識したシスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルを得た。このゼラチンハイドロゲルにＰＢＳ０．５ｍＬを添加して膨潤させた後、全量をメスｄｄＹ４週齢マウスへイソフルラン麻酔下に腹腔内投与し、腹腔内分解性試験を開始した。
　投与直後に腹部正中切開により開腹しマウスを犠死させ、腹腔内にＰＢＳを添加、洗浄し、洗浄液を回収した。また、腹腔内臓器を除去した後、腹部腹膜を摘出した。上記腹腔内洗浄液と腹部腹膜をベータカウンターにより測定し、実験開始時の値を得た。
　開腹を、ゼラチンハイドロゲルの投与から２日後、４日後、７日後及び２１日後（Ｎ＝５）に行ったこと以外は同様の測定を行った。上記実験開始時の値を１００％とし、測定値の推移を図５に示す。図５に示す結果から、投与から４日後まではゼラチンハイドロゲルが急速に分解するものの、その後はゆっくりと分解し、投与７日後でも腹腔内に約３０％のゼラチンハイドロゲルが残存することが明らかになった。
６．投与後体重変化測定（１）
　本発明のシスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルの安全性を確認するため、シスプラチンの担持量が異なるゼラチンハイドロゲルを健康なマウスに投与し、マウスの体重の変化を測定した。
［実施例８］
　実施例１と同様の手順でシスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルを得、それをシスプラチンの量が５ｍｇ／ｋｇとなるように健康なＢａｌｂ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウスの腹腔に投与した。また１回目の投与の１週間後に、再度同様の投与を行った。実験開始時、４日後、１週間後、９日後、１２日後、２週間後、１８日後、３週間後、４週間後、５週間後及び６週間後にマウスの体重を測定した。実験開始時の体重を１００％としたときの体重の経時変化を図６に黒丸で示す。
［実施例９］
　シスプラチンの量を１０ｍｇ／ｋｇとしたこと以外は実施例８と同様にしてマウスの体重を測定した。結果を図６にバツで示す。
［比較例４～６］
　シスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルに代えて、それぞれ、シスプラチンを含まないゼラチンハイドロゲル（比較例４）、ＰＢＳのみ（比較例５）及び３ｍｇ／ｋｇのシスプラチンのみ（比較例６）を用いたこと以外は実施例８と同様にしてマウスの体重を測定した。それぞれ結果を図６に黒四角（比較例４）、黒三角（比較例５）及び白丸（比較例６）で示す。
　実施例８、９、比較例４～６の結果から、シスプラチンの単体投与では３ｍｇ／ｋｇであっても投与から数日後に死亡するものの、本発明のシスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルを投与する場合、シスプラチン量が１０ｍｇ／ｋｇであっても耐用量の範囲に収まることが明らかである。
７．投与後体重変化測定（２）
　がん患者への投与に近い条件で本発明のシスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルの安全性や副作用としての体重減少軽減効果を確認するため、健康なマウスに代えて、ヒト胃癌腹膜播種モデルマウスを用い、マウスの体重測定を実験開始時、４日後、１週間後、１０日後、２週間後、１８日後及び３週間後に行ったこと以外は上記投与後体重変化測定（１）と同様の手順、方法で、マウスの体重の変化を測定した。なお、ヒト胃癌腹膜播種モデルマウスは、ルシフェラーゼ発現ヒト低分化腺癌細胞株ＭＫＮ４５Ｌｕｃの懸濁液（１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）５００μＬをＢａｌｂ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウス６週齢メスの腹腔内に注射で投与し、投与から５日後のマウスを用いた。
［実施例１０及び１１］
　上記の通り、ヒト胃癌腹膜播種モデルマウスを用い、体重測定時期が異なること以外は実施例８と同様にシスプラチン量５ｍｇ／ｋｇとして実施例１０を、実施例９と同様にシスプラチン量１０ｍｇ／ｋｇとして実施例１１を行い、マウスの体重を測定した。結果を図７に黒丸（実施例１０）とバツ（実施例１１）で示す。
［比較例７～１０］
　ヒト胃癌腹膜播種モデルマウスを用い、体重測定時期が異なること以外は比較例４と同様にシスプラチンを含まないゼラチンハイドロゲルを投与して比較例７を、比較例５と同様にＰＢＳのみを投与して比較例８を、比較例６と同様にシスプラチン単体を３ｍｇ／ｋｇ投与し比較例９を、シスプラチン単体を５ｍｇ／ｋｇとしたこと以外は比較例９と同様にして比較例１０を行い、それぞれマウスの体重を測定した。結果を図７に黒四角（比較例７）、黒三角（比較例８）、白丸（比較例９）および白四角（比較例１０）で示す。
　図７に示す結果から、シスプラチンの単体投与では、低用量（３ｍｇ／ｋｇ）の場合でも投与から２週間以内にすべての個体が死亡したものの、本発明のシスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルを投与する場合、シスプラチン量が１０ｍｇ／ｋｇであっても耐用量の範囲に収まることが明らかである。
８．腫瘍体積の測定
　実施例１０、実施例１１、比較例７及び比較例８で用いたヒト胃癌腹膜播種モデルマウスについて、１回目の投与から３週間後にＩＶＩＳ測定（パーキンエルマー社製）を行った。カウント値を図８のグラフに、測定画像をグラフの下側に示す。
　図８に示す結果から、本発明のシスプラチン含浸ハイドロゲルを投与したマウスでは腫瘍の増殖を顕著に抑制できることが明らかである。
９．生存期間の評価
　実施例１０、実施例１１、比較例７、比較例８及び比較例１０で用いたヒト胃癌腹膜播種モデルマウスについて、１回目の投与から５０日後までのその生存割合を図９に示す。
　図９に示す結果から、ＰＢＳのみを投与した比較例８と比べ、本発明のシスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルを投与した実施例１０と１１の個体の生存期間が有意に延長した（ｌｏｇ ｒａｎｋ ｔｅｓｔによりＰ値０．０５未満を有意として検定）ことが明らかである。なお、ゼラチンのみを投与した比較例７とＰＢＳのみを投与した比較例８とでは生存期間に差はなかった。５ｍｇ／ｋｇのシスプラチンのみを投与した比較例１０では、薬剤投与後２週間ですべてのマウスが死亡した。薬剤による治療関連死と考えられる。
　また、本発明のシスプラチン含浸ハイドロゲルを投与した個体群では早期死亡の個体がなかったことから、本発明のシスプラチン含浸ハイドロゲルは、同量のシスプラチン単体を投与する場合よりも副作用を軽減でき、シスプラチンの投与量を増量できることが明らかである。
１０．毒性試験（血液検査）
　本発明のシスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルの安全性を確認するため、シスプラチンの担持量が異なるゼラチンハイドロゲル及びコントロールを健康なマウスに投与し、血液検査を行い、白血球数（ＷＢＣ）、血小板数（ＰＬＴ）、尿素窒素（ＢＵＮ）濃度及びクレアチニン（Ｃｒｅ）濃度を測定した。
［実施例１２］
　実施例１と同様の手順でシスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルを得、それをシスプラチンの量が５ｍｇ／ｋｇとなるように４週齢メスｄｄＹマウスへイソフルラン麻酔下に腹腔内投与した。また、１回目の投与の１週間後に、再度同様の投与を行った。１回目の投与から１４日後にイソフルラン麻酔下、心腔採血し、マウスを犠死させた。白血球数及び血小板数は、全血にヘパリンを添加し、自動化法にて測定した。結果をそれぞれ図１０及び図１１に示す。尿素窒素濃度及びクレアチニン濃度は、血液凝固後に血清を回収して測定に用いた。尿素窒素濃度はウレアーゼＧＬＤＨ法で測定し、クレアチニン濃度は酵素法で測定した。結果をそれぞれ図１２及び図１３に示す。
［実施例１３］
　シスプラチンの量を１０ｍｇ／ｋｇとしたこと以外は実施例１２と同様にしてマウスの血液検査を行った。結果をそれぞれ図１０～１３に示す。
［比較例１１及び１２］
　シスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルに代えて、それぞれ、ＰＢＳのみ（比較例１１）及び５ｍｇ／ｋｇのシスプラチンのみ（比較例１２）を用いたこと以外は実施例１２と同様にしてマウスの血液検査を行った。結果をそれぞれ図１０～１３に示す。
　図１０に示す結果から、本発明のシスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルを投与したマウスでは、シスプラチンの担持量が多いほど白血球数が減少するものの、１０ｍｇ／ｋｇであっても生命に危険な水準である２５×１０２個／μＬを上回っており、毒性に問題のないことが示された。
　図１１に示す結果から、本発明のシスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルを投与したマウスでは、シスプラチンの担持量が多いと血小板数が減少するものの、５ｍｇ／ｋｇの場合、ＰＢＳのみを投与したマウスと同程度であり血小板数に及ぼす影響は少ないことが示された。また、投与量が１０ｍｇ／ｋｇであっても生命に危険な水準である３０×１０４個／μＬを上回っており、毒性に問題のないことが示された。
　図１２に示す結果から、本発明のシスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルは尿素窒素濃度に悪影響を及ぼさないことが明らかである。
　図１３に示す結果から、本発明のシスプラチン含浸ゼラチンハイドロゲルはクレアチニン濃度に悪影響を及ぼさないことが明らかである。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (7)

  1. 　以下：
    （ａ）生分解性高分子を水溶液中で架橋反応させて生分解性高分子ゲルを得る工程；
    （ｂ）生分解性高分子ゲルを細粒化する工程；及び
    （ｃ）細粒化した生分解性高分子ゲルと薬剤を含む溶液とを接触させて薬剤担持ハイドロゲルを得る工程
    を含む、薬剤担持ハイドロゲル製剤の製造方法。
  2. 　工程（ｃ）の後に、薬剤担持ハイドロゲルを遠心分離し、次いで上清を除去する工程（ｃ’）をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　工程（ｃ）の後かつ工程（ｃ’）の前に、薬剤担持ハイドロゲルを凍結乾燥する工程（ｃ’’）をさらに含む、請求項２に記載の製造方法。
  4. 　工程（ｂ）の後かつ工程（ｃ）の前に、細粒化した生分解性高分子ゲルを分子量及び／又は粒子径により分画する工程（ｂ’）をさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. 　薬剤が、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン及びオキサリプラチンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 　生分解性高分子がゼラチンである、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の製造方法により得られる、薬剤担持ハイドロゲル製剤。
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