JP2010529150A - 薬剤の局所導出を対象とした注射可能なポリマー／脂質ブレンド - Google Patents

Abstract

【構成】薬学活性剤の薬剤局所導出システムとして、注射可能なポリマー／脂質ブレンドを提供する。このブレンドは、キトサン系医材、脂肪酸およびリン脂質から構成することができる。キトサン系医材としては、水溶性キトサン誘導体を利用することができる。脂肪酸としては、脂肪酸やアシル鎖長がＣ８〜Ｃ１６のラウリンアルデヒドなどの脂肪酸アルデヒドを使用することができる。ブレンドのレオロジー特性は、成分比および脂肪酸のアシル鎖長に関係している。本発明の注射可能なシステムは、癌や、薬剤の局所導出が必要な他の疾患を治療するさいの薬学活性剤の遅延放出に特に好適である。
【選択図】図１

Description

本発明は、全体としては、薬剤の局所導出を対象とする生物分解性および生体適合性を示すシステムに関する。より具体的には、薬剤の局所導出を対象とした注射用ポリマー／脂質ブレンドシステムに関する。

標準的な静脈投与製剤または経口投与製剤の形で投与された場合、多くの薬剤は、有効濃度で対象器官に到達することがないか、直ちに排除されるため有効性を失う。薬剤のこの有効性喪失には、多くのファクターが関与している。即ち、酸加水分解または消化器官からの不完全な吸収、薬剤の血液脳関門などの生理学的膜を横断する能力の欠如、作用部位への不十分な分布、対象器官への到達前の肝臓または血管中における化合物の酵素による不活性化、および薬剤の胆汁、尿または糞便への急速な分泌などのファクターである。

局所導出システムを利用して薬剤を作用部位へ直接導出すると、薬剤の全身的暴露を抑制した状態で、薬剤を高濃度で作用部位へ投与できる利点がある。事実、近年、各種の癌の治療において、局所導出が、抗新生物薬の効果を強め、その毒性を低く抑えることが証明されている。

医材ブレンドの場合、賦形剤の好ましい特性を結合して特性を強化したハイブリッド複合体を製造することによって、改良薬剤導出システムが製造されている。近年、標的部位への直接投与が容易な上に、全身投与により生じる毒性の全身分布を防ぐことができるペーストおよびゲルとしての注射用ブレンドが製造されている。さらに、ブレンド体から薬剤が長期間にわたって持続的に放出されると、以下のいくつかの手段によって薬剤の全体的な効果が強くなる。即ち、治療部位における薬剤濃度を高める手段、細胞サイクル特異性薬剤の暴露時間を長くする手段、腫瘍透過性を強くする手段、薬剤耐性を低くする手段、および患者コンプライアンスを高める手段である。

研究の示すところによれば、注射可能なブレンドシステムは、抗癌剤、成長ファクター、タンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチド類、およびスキャホルドの局所導出に有効である。

液状のまま投与でき、長時間にわたって半固体蓄積システムとして残る生体適合性および生物分解性を示す注射可能なシステムの開発は、臨床的に望ましいものである。半固体インプラントを生成できると、従来の治療法よりも効果のある、標的を定めた局所導出システムを確立できる。例えば、標的を定めた局所導出装置の場合、薬剤が特異的な部位に放出され、従って全身的な副作用の広がりを抑えている間、治療濃度を実現するために投与量を低く抑える必要がある。さらに、シリンジ注射が容易なため、治療装置を埋め込むための外科的措置が必要ない。癌患者、特に固形癌患者、糖尿病患者、薬物依存症患者および創傷患者などが、この薬物治療の理想的な患者である。

現在のところ、４つの特徴群：限局沈殿、熱可塑性ペースト、限局架橋システムおよび限局凝固オルガノゲルに分けることができる注射可能な半固体蓄積システムを開発するために、多くの合成ポリマーが利用されている。限局沈殿は、温度、ｐＨや溶剤除去などの環境変化による沈殿により注射可能なシステムが体内で凝固する方法である。例えば、ポリ(ラクチド)（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コグリコリド）（ＰＬＧＡ）やポリ(ラクチド−コポリ（カプロラクトン）（ＰＬＡ−ｃｏ−ＰＣＬ）などの水溶性ポリマーを、生理学的に相溶性を示す水混和性溶剤に溶解し、水性環境に注入してポリマーを沈殿させることができる。ポリマー濃度、分子量、ポリマーおよび溶剤の種類、表面活性剤の添加などが、沈殿速度およびこれらシステムからの薬剤放出の両者に影響することがわかっている。熱可塑性ペーストの場合は、ＰＬＡ、ＰＣＬやＰＬＧＡなどのポリエステルを体内にメルトとして注射することができ、３７℃の体温まで低下すると、凝固する。また、これらポリマーは、２２ゲージシリンジで簡単に注射できるようにするために、固有粘度が０．８ｄｌ／ｇ未満と低く抑えられている。ところが、熱可塑性ペーストの場合、注射のさいに高温が必要なことが多く、ポリエステル系医材が分解すると、インプラントの生体適合性を犠牲にする恐れのある酸副産物を生成する。従って、インプラント可能な薬剤導出システムの製造には、新規な生体適合物質を利用することが必要である。

キトサン系ポリマーブレンドについては、均一に分解して、非突然変異性、非細胞毒性、かつ非炎症性である非毒性細胞になるため、制御された薬剤導出において有効であることが知られている。キトサンは、以前は創傷治癒の促進剤として記述されていた生物分解性のカチオン系天然多糖類である。キトサンは、菌類、甲殻類の外殻および海藻類から抽出される天然物質である、キチンの接触Ｎ−デアセチル化を通じて生成するＤ−グルコサミンを主成分とする、低価格で市販されているポリマーである。キトサンは、すぐれた組織適合性および生物分解性を示し、注射に理想的な物質である。

乳酸、酢酸や塩酸などの各種の酸を利用して、キトサンを溶解すると、各種の薬剤導出システムを製造することができるが、製造後、薬剤中に酸が残留することがあり、投与システムの生体適合性または非毒性が低下するだけでなく、一部の薬剤の分解を促進することがある。

水溶性のキトサンを合成すると、酸の使用を避けることができる。公知の一つの方法によれば、キトサンを塩化グリシジルトリメチルアンモニウム（ＧＴＭＡＣ）と共役化すると、バイオポリマーの水溶性を高くすることができる（Ｃｈｏ、Ｊ．、ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２００６、７（１０）、２８４５−２８５５）。このキトサン誘導体は、酸を使用なくても、水溶性が高く、最大で２５ｇ／ｄＬである。水溶性キトサン（ＷＳＣ）は、殺菌活性を示すことが知られ、ＧＴＭＡＣ中の第４級アンモニウム基もまた各種癌細胞系の増殖を抑制する。ＷＳＣの水溶性および生物学的特性がこれをすぐれたポリマー候補にするもので、これを利用すると、薬剤導出システムを製剤化でき、またこれが、放出の制御された薬剤導出システムを確保する薬剤のポリマーマトリックスとして作用する。さらに、この生物分解性により、導出システムが生体内で完全に分解する。

脂肪酸（ＦＡ）については、代謝、エネルギー蓄積、免疫反応、凝血、血圧調整、膜などの生物学的構造体の生成やプロスタグランジン類の生体内生成を始めとする数多くの生物学的プロセスを関与していることが知られている。現在、脂肪酸は、フィルム、カプセル、スプレー、軟膏、エマルジョンやクリームの形で舌下薬、経口薬、局所薬、膣薬の不活性賦形剤としての使用が認可されている。Ｎ−アセチル化キトサン誘導体は、脂肪酸塩化物を使用して製造され、アセトアミノフェンを持続的に放出する疎水性錠剤を製造するために利用されている（Ｌｅ Ｔｉｅｎ、Ｃ．、ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、２００３、９３（１）：ｐ.１−１３）。ところが、従来例では、最初のキトサン成分を酢酸に溶解して、キトサン誘導体の全体的な溶解性を確保し、次に脂肪酸塩化物を利用してこれを変性している。キトサン誘導体を製造するために酸性溶液を利用すると、毒性およびブレンド中の薬剤分解の原因になる。

最近、研究者は、キトサンポリマー鎖の非共有架橋、即ち物理的架橋を利用して、静電水素結合を実現し、ヒドロゲルの安定性および生体適合性を強くしている。例えば、オリゴヌクレオチドＤＮＡおよびＲＮＡなどの負電荷分子をキトサンと静電相互作用させて、最長１５日間安定な付加化合物を製造している（Ｓｐｒｉｎｇａｔｅなどを発明者とするＵＳ特許出願第２００３／０１３４８１０号明細書）。さらに、Ｈｏｆｆｍａｎなどは、グリコプロテインを粘膜投与する架橋キトサン−グリセロールフィルムを開発している(Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ.（２００１）７２：３５−４６)。

また、Ｍｕｌｌｅｒを発明者とするＵＳＰ７，０６０，２８５（Ｍｕｌｌｅｒ）には、難溶性活性剤を対象とする水中油形エマルジョンが記載されている。Ｍｕｌｌｅｒの発明は、主に静脈投与用エマルジョンに焦点をあわせている。ここに開示されている方法の場合、具体的な活性剤のエマルジョンへの溶解性が比較的小さいため、薬物濃度の点で限界がある。さらに、Ｍｕｌｌｅｒの発明の場合、エマルジョンを製造する際の均質化に比較的高いエネルギーまたは高い圧力を必要とし、複雑であり、また時間のかかるものである。加えて、エマルジョンは一般的に安定性にかけることが知られている。

リン脂質の場合、生体適合性がすぐれているため、リポソーム、エマルジョンやフィルムとして薬剤導出システムを製造するさいによく利用されている。ホスファチジルコリン脂質は、真核生物細胞に存在する主要な膜リン脂質である。卵のホスファチジルコリン（ｅＰＣ）は、長さが異なり、また飽和度が異なる炭化水素鎖を有するホスファチジルコリン脂質の混合物からなる。純粋なｅＰＣは、３４％（ｗ／ｗ）のジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ、１６：０、Ｔ_Ｍ＝４１℃）、６５％の(ｗ／ｗ)のジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ、１８：１、Ｔ_Ｍ＝−２０℃）、１８％（ｗ／ｗ）のジリノエオイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ、１８：２、Ｔ_Ｍ＝−５３℃）、１１％（ｗ／ｗ）のジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ、１８：０、Ｔ_Ｍ＝５５℃）および少量のジアラキドノイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ、２０：４、Ｔ_Ｍ＝７０℃）を有する。

Ａｌｌｅｎなどを発明者とする米国特許出願第２００５／０２０８１２２号明細書には、薬剤の局所導出を対象とする移植埋設可能なフィルムとして使用される２つの顕著な特性を示す材料、即ちバイポリマーキトサンおよび脂質ｅＰＣ（ＰｏＬｉ）が開示されている。このインプラントは、生理学的溶液および生体内において長期間にわたって疎水性薬剤を持続的に放出するものである。ＰｏＬｉシステムにおいては、酸はキトサンを溶解するために使用される。ＰｏＬｉインプラントシステムは、生体外および生体内において生体適合性および効力の両者を示すが、抗癌剤または他の薬剤の制御された放出を確保するためには、腫瘍切除部位において長時間の処置時間および外科的移植埋設が必要である。

ＵＳ特許出願第２００３／０１３４８１０号 ＵＳＰ７，０６０，２８５ 米国特許出願第２００５／０２０８１２２号

Ｃｈｏ、Ｊ．、ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２００６、７（１０）、２８４５−２８５５ Ｌｅ Ｔｉｅｎ、Ｃ．、ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、２００３、９３（１）：ｐ.１−１３ Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ.（２００１）７２：３５−４６ Ｃｈｏ， Ｊ．、ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２００６．７（１０）：ｐ．２８４５−２８５５；Ｓｅｏｎｇ，Ｈ．Ｓ．、Ｈ．Ｓ． Ｗｈａｎｇ、 ａｎｄ Ｓ．Ｗ．Ｋｏ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＡｐｐｌｉｅｄＰｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００．７６（１４）：ｐ. ２００９−２０１５

以上の点を踏まえれば、脂肪酸およびｅＰＣと併用したキトサン系医材からなる生物分解性および生体適合性を示す、注射可能な、制御された薬剤導出システム、および薬学活性剤の投与にこのシステムを使用することが望まれている。また、酸を使用せずに、キトサン系医材を溶解する上記の注射可能なシステムを製造できるようにすることも望まれている。

本発明の一態様によると、本発明の一実施態様は、薬学活性剤を制御放出する注射可能な薬剤導出組成物であって、薬剤導出に好ましい特性をもつ少なくとも３種の担体医材からなる半固体ブレンド、キトサン系医材、アシル鎖長がＣ８〜Ｃ１６、好ましくはＣ１０〜Ｃ１４、最適にはＣ１２の脂肪酸１種かそれ以上、および少なくとも１種の薬学活性剤を担持した１種かそれ以上の脂質からなる注射可能な薬剤導出組成物である。脂肪酸としては、脂肪酸塩化物または脂肪酸アルデヒド、好ましくはラウリンアルデヒドを使用することができる。本組成物は、哺乳動物の標的部位に投与された場合に、少なくとも１種の薬学活性剤の導出が制御放出を確保するものである。

本発明の一実施態様の別な態様によれば、上記ブレンドは、水溶性キトサンであるキトサン誘導体を有する。この水溶性キトサンは、例えば、キトサン医材をＧＴＭＡＣと共役化すると製造することができる。他の形態の水溶性キトサンも本発明の範囲内にある。

本発明の一実施態様のさらに別な態様によれば、薬剤導出ブレンドの粘度は、選択した脂肪酸および薬学活性剤に関係する。従って、脂肪酸のアシル鎖長については、注射可能な適正な粘度を実現できるように選択する。

本発明の一実施態様のさらに別な態様によれば、脂質としては、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン、卵ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールからなる群から選択することができる。薬学活性剤としては、カルマスティン、メトトレキサート、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル、５−フルオロウリジン、シタラビン、ロイプロリドアセテート、シクロホスファミド、ビノレルビン、ピロカルビン、パクリタキセル、ミトマイシン、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシンおよびドシタキセルからなる群から選択することができる。あるいは、オリゴヌクレオチド、ペプチドまたはタンパク質を薬学活性剤として使用してもよい。

本発明の一つの実施態様のさらに別な態様によれば、本発明の注射可能な薬剤導出組成物は、シリンジ針によって注射できるように製剤化することができる。

本発明のさらに別な態様によれば、本発明の一実施態様は、薬学活性剤を担持し、投与し、かつ制御放出する薬剤導出プラットホームであって、水溶性キトサン、アシル鎖長がＣ１２の脂肪酸、およびホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ｅＰＣおよびホスファチジルグリカンからなる群から選択したリン脂質からなる薬剤導出プラットホームである。

本発明の別な実施態様は、哺乳動物において制御された放出を確保する薬剤導出組成物を製造する方法であって、キトサン系医材から水溶性キトサンを調製し、この水溶性キトサンと脂肪酸およびリン脂質との錯体を生成し、少なくとも１種の薬学活性剤の制御可能な放出を確保する注射可能な医材を生成することからなる方法である。水溶性キトサンは、例えば、キトサン系医材をＧＴＭＡＣと共役化すると製造することができる。

本発明のさらに別な実施態様によれば、本発明は、疾患を治療、予防または抑制する方法であって、薬学活性剤の制御された放出を確保する、治療上有効量の注射可能な薬剤導出組成物を投与することからなる方法を提供するものである。疾患とは、身体の局所部位で治療可能な疾患、例えば、癌を意味する。

本発明のさらに別な実施態様によれば、本発明は、疾患を治療する薬剤導出システムを製造するさいに、キトサン系医材、脂肪酸、リン脂質、および少なくとも１種の薬学活性剤を使用することを含むものである。

本発明の一実施態様の一つの態様の目的は、個々の薬剤または薬剤複合体の持続的な局部導出を確保する方法として、薬学活性剤の、改良された注射可能なポリマー／脂質ブレンドを提供することである。

本発明の作用効果には、薬剤の分解防止、薬剤の有効濃度の維持、薬剤投与回数の減少、患者に投与される治療薬の投与量の減少、薬剤の全身投与後に生じる恐れの毒性または副作用の減少がある。

以下、例示のみを目的として、本発明を添付図面について詳細に説明する。
本発明の一実施態様に従って考えられる薬剤導出ブレンドの成分の化学構造を示す図である。図中、ｍはＣ１０〜Ｃ１６のアシル鎖長を表す。ＸがＣｌの場合、脂肪酸は脂肪酸塩化物であり、またＸがＨの場合、脂肪酸は脂肪酸アルデヒドである。 ＦＡアシル鎖長が異なる１：４：１（ｗ／ｗ／ｗ）ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンド製剤の濁度（ｎ＝３、０．０１ＭＰＢＳ中、ｐＨ＝７．４）を示す図である。 ＤＳＣサーモグラム、即ちＷＳＣ、ｅＰＣおよびＣ１２ＦＡのサーモグラムを示す図である。 ＤＳＣサーモグラム、即ちＦＡアシル鎖長が異なるＷＳＣ−ＦＡブレンド（１：１、ｗ／ｗ）のサーモグラムを示す図である。 ＤＳＣサーモグラム、即ちＦＡアシル鎖長が異なるＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンド（１：４：１、ｗ／ｗ／ｗ）のサーモグラムを示す図である。 フーリエ変換赤外線スペクトル、即ちＷＳＣ、塩化ラウロイル（Ｃ１２ＦＡ）、ＷＳＣ−ＦＡ（Ｃ１２）ブレンド、ＷＳＣ−ｅＰＣブレンドおよび１：４：１（ｗ／ｗ／ｗ）ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣ、のフーリエ変換赤外線スペクトルを示す図である。 フーリエ変換赤外線スペクトル、即ちＦＡアシル鎖長がＣ１０〜Ｃ１６の間で変化する１：４：１（ｗ／ｗ／ｗ）ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドのフーリエ変換赤外線スペクトルを示す図である。 ＷＳＣ：ＦＡ（Ｃ１２）：ｅＰＣブレンドの１：０：１（ｗ／ｗ／ｗ）における光学顕微鏡写真である。 ＷＳＣ：ＦＡ（Ｃ１２）：ｅＰＣブレンドの１：４：０（ｗ／ｗ／ｗ）における光学顕微鏡写真である。 ＷＳＣ：ＦＡ（Ｃ１２）：ｅＰＣブレンドの１：４：１（ｗ／ｗ／ｗ）における光学顕微鏡写真である。 Ｃ１０ＦＡ、を含む１：４：１（ｗ／ｗ／ｗ）ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの蛍光共焦点顕微鏡写真である。なお、脂質および／または脂肪酸の領域は上部左側画像にあり、ＷＳＣは上部右側画像にあり、そしてＦＡ−ＥｅＰＣの重なり領域は下部左側画像にある。 Ｃ１２ＦＡ、を含む１：４：１（ｗ／ｗ／ｗ）ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの蛍光共焦点顕微鏡写真である。なお、脂質および／または脂肪酸の領域は上部左側画像にあり、ＷＳＣは上部右側画像にあり、そしてＦＡ−ＥｅＰＣの重なり領域は下部左側画像にある。 Ｃ１６ＦＡを含む１：４：１（ｗ／ｗ／ｗ）ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの蛍光共焦点顕微鏡写真である。なお、脂質および／または脂肪酸の領域は上部左側画像にあり、ＷＳＣは上部右側画像にあり、そしてＦＡ−ＥｅＰＣの重なり領域は下部左側画像にある。 ＦＡアシル鎖長が異なるＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの、ブレンド比ＷＳＣ：ＦＡ：ｅＰＣ＝１：２：１（ｗ／ｗ／ｗ）におけるせん断応力の関数としての粘度比較図である。 ＦＡアシル鎖長が異なるＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの、ブレンド比ＷＳＣ：ＦＡ：ｅＰＣ＝１：４：１（ｗ／ｗ／ｗ）におけるせん断応力の関数としての粘度比較図である。 （０．２％リゾチームを含有する０．０１Ｍのリン酸緩衝液中、３７℃、ｐＨ＝７．４、ｎ＝３での１：４：１（ｗ／ｗ／ｗ）ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンド製剤からの炭素−１４標識化パクリタキセルの累積放出率を示す図である。 異なる反応速度モデルに従ってモデル化したＷＳＣ−ＦＡＣ１２−ｅＰＣ１：４：１（ｗ／ｗ／ｗ）の薬剤放出プロファイルを示す図である。 ＦＡアシル鎖長が異なり、Ｐｅｐｐａｓ−Ｓａｈｌｉｎの式に従ってモデル化した１：４：１（ｗ／ｗ／ｗ）ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの薬剤放出プロファイルを示す図である。 ＦＡアシル鎖長が異なる１：４：１（ｗ／ｗ／ｗ）ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドに関する放出時間の関数としてのＦｉｃｋｉａｎ拡散係数（Ｋ_{Ｐ_Ｓ，２}ｔ^ｍ／Ｋ_{Ｐ_Ｓ，１}）に対するケースＩＩ輸送の比を示す図である。 ＦＡが塩化ラウロイルであるブレンド組成物の細胞生存可能性を示す図である。 ＦＡがラウリンアルデヒドであるブレンド組成物の濁度データを示す図である。 ＦＡがラウリンアルデヒドである別なブレンド組成物の濁度データを示す図である。 高分子量キトサン組成物および低分子量キトサン組成物の分配係数を示す図である。 ブレンド組成物からのパクリタキセルの累積放出率を示す図である。 パクリタキセル放出に関する実験データ、およびＲｉｔｇｅｒ−ＰｅｐｐａｓモデルおよびＰｅｐｐａｓ−Ｓａｈｌｉｎモデルによって予測されたデータを示す図である。 ラウリンアルデヒドを含むブレンド組成物に関する細胞生存可能性を示す図である。 脂肪酸塩化物ブレンド組成物およびラウリンアルデヒドブレンド組成物からのドセタキセル放出に関する比較図である。 ラウリンアルデヒドブレンド組成物からの、異なる担持量のドセタキセルの放出を示す図である。 ラウリンアルデヒドブレンド組成物からの、異なる担持量のドセタキセルの放出を示す図である。 ドセタキセルを担持した、および担持しないブレンド組成物の注射２日〜４週間後のＣＤ−１マウスの血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを示す図である。 ドセタキセル担持ブレンド組成物の注射２日後〜７週間後の各時点におけるＣＤ−１マウスのドセタキセル（μｇ／ｍＬ）の平均血漿濃度レベルを示す図である。

それぞれの図には、本発明の好適な実施態様を例示のみを目的として図示してある。即ち、本発明の開示および各図は、説明のみを目的とし、また理解の一助になることを目的とし、発明の範囲を制限するものではない。

以下に、本明細書で使用する各用語の定義を示す。特別に断らない限り、以下に具体的に言及するすべての用語は、通常の意味で使用するものとする。また、特許請求の範囲を除いて、特に断らない限り、“あるいは”は“そして”を含むものとし、その逆もあり得る。非制限的用語については、特に断らない限り、あるいは文脈から明らかに別なことが読み取られない限り、制限的に解釈しないものとする。例えば、“含む”、“有する”および“からなる”は、“制限なしに含む”を意味する。定冠詞や不定冠詞などの特許請求の範囲にある単数形は、特に断らない限り、あるいは文脈から明らかに別なことが読み取られない限り、複数形を含むものとする。

「ポリマー」は多数の同一の繰り返し単位からなる分子を指す。
「キトサン」はキチンの誘導体または類似体である任意の化合物または組成物を指す。また、この用語には、キチン、およびカルボキシメチルキトサン、オレオイルキトサンやペギル化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）キトサン（Ｃａｒｂｏｍｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、Ｍａｓｓ．）などのキトサンの様々な誘導体も含まれる。
「組成物」は本明細書で使用する“組成物”については、複数の物質が結合されて、凝集混合物または混合体になったものと理解すべきである。
「制御（された）放出」治療活性剤または薬学活性剤が長期間にわたって周囲の媒体や生体中に放出されることを指す。放出時間（期間）は、およそ数時間〜数ヶ月であればよい。
「薬剤、治療剤、治療」はいずれも生体に意味のある作用をして症状または疾患を治療または予防する任意の分子を指す。
「脂肪酸ＦＡ」は制限なしに、脂肪酸塩化物または任意のアシル鎖長をもつ脂肪酸アルデヒドを指す。
「薬学活性剤」は任意の薬剤、治療剤、プロドラッグまたは診断薬を指す。
「疎水性薬剤」は２５℃での水への溶解度が５０ｍｇ／Ｌ未満の任意の薬学活性剤を指す。
「抗増殖剤」は増殖作用を抑制する作用をもつ分子を指す。実例を挙げれば、制限する意図はないが、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチンである。

標的器官に近接して具体的な薬剤の遅延放出および有効な持続的濃度を実現するためには、生体適合性および生物分解性である担体やビヒクルに薬剤を結合すればよい。薬剤を担持する適当な担体の大きさは、小さな分子サイズから、高分子量ポリマーを始めとするマクロ分子サイズである。ポリマー系装置を利用すれば、長期間にわたって薬剤を制御された放出速度で具体的な部位に放出できる。最適な薬剤導出ポリマー系手段は、コストが低く、生体適合性および生物分解性を示し、かつ水性環境中に薬剤を均一かつ制御された形で放出できるポリマー系手段である。

本発明のポリマー／脂質ブレンドは、標的部位に導かれ、数日間から数ヶ月間の長期間にわたって薬剤または他の活性剤を持続かつ制御された形で放出する局部薬剤導出装置である。このブレンドは、各種の方法で投与できるが、特に、注射可能な薬剤導出手段とするのが好ましい。

本発明の一態様によると、本発明の一実施態様は、薬学活性剤を制御放出する注射可能な薬剤導出組成物であって、薬剤導出に好ましい特性をもつ少なくとも３種の担体医材からなる半固体ブレンド、キトサン系医材、アシル鎖長がＣ８〜Ｃ１６、好ましくはＣ１０〜Ｃ１４、最適にはＣ１２の脂肪酸１種かそれ以上、および少なくとも１種の薬学活性剤を担持した１種かそれ以上の脂質からなる注射可能な薬剤導出組成物である。脂肪酸としては、脂肪酸塩化物または脂肪酸アルデヒド、好ましくはラウリンアルデヒドを使用することができる。本組成物は、哺乳動物の標的部位に投与された場合に、少なくとも１種の薬学活性剤の導出が制御放出を確保するものである。この特徴のある製剤は、親水性薬剤、疎水性薬剤あるいは親水性／疎水性薬剤複合体の制御放出を確保するものである。

キトサンは、グリコシド結合によって結合された２つの単糖類からなる線形多糖類であり、キチンの脱アシル化により製造される。粘膜粘着性および生体適合性を示すポリマーであるキトサンは、広い範囲の分子量および脱アシル化度をもつ市販品の形で利用することができる。分子の側鎖にプロトンを付与できる第１級アミンをもつため、キトサンは、弱カチオン性を呈する。キトサンは、傷の処置用品、縫合糸、人工皮膚、組織工学および薬剤導出を始めとする各種の生体臨床医学への適用が検討されてきた、生物分解性および生体適合性を示す天然多糖類である。

例えば、キトサンは水に不溶であるが、２％酢酸溶液などの弱酸には溶解することができ、またキトサンはリゾチームなどの酵素の作用を受けて生体内で分解する。キトサンを溶解して、各種の薬剤導出システムを製剤化するため、各種の酸（即ち、乳酸、酢酸および塩酸）が通常利用されている。ただし、残念なことに、製剤化後、酸が製剤に残留し、導出システムの生体適合性または非毒性を低下せしめるだけでなく、一部の薬剤の分解を促進する。

本発明の一つの具体的な態様によれば、キトサンを塩化グリシジルトリメチルアンモニウム（ＧＴＭＡＣ）と共役化すると、バイオポリマーの水溶性を高くでき、酸の使用を避けることができる。本明細書で水溶性キトサン（ＷＳＣ）と呼ぶこのキトサン誘導体は、酸を使用しなくても、水溶性が高く、最大２５ｇ／ｄＬである。ＷＳＣは、また、殺菌活性をもつことが知られ、ＧＴＭＡＣの第４級アンモニウム基が各種癌細胞系の増殖を抑制することがわかっている。また、ＷＳＣは、脂肪酸が蒸留水と接触したさいに生じる相分離を防止している間、脂肪酸成分の表面活性剤として作用する。さらに、ＷＳＣの生物分解性のため、導出システムが生体内で完全に分解する。

脂肪酸については、数多くの生物学的プロセスに関与し、また生体内における生物学的構造体および化合物の生成に関与していることが知られている。本発明の一つの具体的態様によれば、脂肪酸をＷＳＣおよびリン脂質と混合すると、薬剤導出のための安定な注射可能なブレンドを生成することができる。このブレンドに使用する脂肪酸としては、制限するわけではないが、脂肪酸塩化物またはラウリンアルデヒドなどの脂肪酸アルデヒドがある。脂肪酸アシル鎖長は、例えば、Ｃ８〜Ｃ１６であればよい。

リン脂質または脂質成分としては、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルセリン類、ホスファチジルリノストール類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルグリセロール類、およびこれらの混合物が挙げられる。リン脂質源としては、ホスファチジルコリン（＞６０％）および他のリン脂質（４０％）を主成分とする市販の卵黄エキスが挙げられる。ホスファチジルコリンは、ヒトや動物の細胞に存在する主要膜リン脂質であり、薬学リポソーム製剤に通常利用されている。

本発明の薬学活性剤は、一般に頻度高く投与して、薬学活性剤の有効な血中濃度またはそれ自体の有効濃度を維持することが必要な薬学活性剤である。

薬学活性剤には、例えば、各種の抗癌剤または抗増殖剤がある。制限するわけではないが、例示すれば、カルマスティン、メトトレキサート、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル、５−フルオロウリジン、シタラビン、ロイプロリドアセテート、シクロホスファミド、ビノレルビン、ピロカルビン、パクリタキセル、ミトマイシン、カンプトテシン、ドキソルビシン、およびダウノルビシンである。薬学活性剤の他の例は、オリゴヌクレオチド類、ペプチド類、およびタンパク質である。

ＷＳＣとｅＰＣとを結合すると、部分的混和性のブレンドが生成し、これは、ＦＡを添加すると、安定化する。本発明の別な態様によれば、ポリマー／脂質ブレンドの安定性は、各成分と、用いる脂肪酸のアシル鎖長との比に関係があることがわかっている。特に、Ｃ６〜Ｃ１６の範囲にある脂肪酸アシル鎖長は、最終ブレンドの粘度を変える作用をもつ。一般的にいえば、脂肪酸の炭化水素鎖長が長くなると、粘度値および降伏応力値が大きくなる。製剤化では、注射可能なシステムのレオロジー特性が重要である。というのは、低粘度のブレンドの場合には、制御された薬剤放出プロファイルを示さないことがあるからである。ところが、ブレンドの粘度があまりにも高すぎると、製剤の注射が困難になる。また、一般的にいって、絡み合い、物理的相互作用(即ち、ファンデルワール、疎水水素相互作用)および架橋などのマクロ分子間の相互作用がより強くなると、ポリマー系システムの粘度が高くなる。この相互作用を利用すると、薬剤をポリマーマトリックスに取り込むことができる。即ち、ポリマーシステムに存在する相互作用が強くなるほど、薬剤放出速度が小さくなる。

また、製剤における薬剤の溶解性は、薬剤放出性能に大きな影響をもつ。従って、必要な具体的な治療に応じて、使用する脂肪酸のタイプを変えるか、あるいは個々の成分のブレンド中の具体的な濃度を変えることによって、薬剤放出を制御できる。

このように、３種類の成分の濃度および用いる脂肪酸アシル鎖長は、注射可能なブレンド製剤の開発に大きな影響を与える。パクリタキセル（ＰＴＸ）を対象とする安定かつ注射可能な半固体ブレンドのシステムの製造に最適な鎖長は、Ｃ１２脂肪酸ブレンドである。さらに、ブレンドシステムからのＰＴＸ放出は、Ｃ１２ＦＡブレンドおよびＣ１４ＦＡブレンドについては、Ｆｉｃｋｉａｎ拡散を示すが、Ｃ１６ＡＦブレンドの場合には、ＣａｓｅＩＩ−輸送機序が関与する。

下記の表１（○は安定であることを、△は部分的な相分離があることを、そして×は完全な相分離が生じることを示す）に示すように、ブレンド中において脂肪酸、ｅＰＣまたはキトサンのいずれかの割合が増すと、あるいはキトサンの分子量が大きくなると、安定性が強くなる。
表１：０．０１ＭＰＢＳにおけるＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの安定性

本発明組成物の場合、腹腔内導出、関節内導出、眼球内導出、腫瘍内導出、血管周囲導出、皮下導出、頭蓋内導出、筋肉内導出、静脈内導出、眼球周囲導出、まぶた内導出、口腔内導出、鼻腔内導出、膀胱内導出、膣内導出、尿管内導出または直腸内導出を対象とした注射可能な薬剤導出システムとして製剤化するのが便利である。シリンジ針を通して注射できるように本発明組成物を製剤化するのも好ましいが、投与方法は注射に限らない。対象動物または患者は、ヒトでもよく、哺乳動物でもよい。

本発明の作用効果には、治療薬の分解防止、治療薬の有効濃度の全身的または局所的維持、薬剤投与回数の減少、患者に投与される治療薬の投与量の減少、薬剤の全身投与後に通常生じる恐れの毒性または副作用の減少がある。

本発明の別な実施態様は、キトサン系医材、脂肪酸、少なくとも１種のリン脂質成分および少なくとも１種の薬学活性剤からなり、哺乳動物や患者に投与された場合に、上記少なくとも１種の薬学活性剤の制御可能な放出を確保する制御放出薬剤導出組成物の製造方法である。この製造方法によれば、安定かつ注射可能な半固体ブレンドとして使用するのに望ましい粘度をもつ溶液を製造することができる。

一つの実施態様によれば、ブレンドを製造する第１工程で、ＧＴＭＡＣを利用して、キトサン、キチンまたはこれらの混合物をＷＳＣ誘導体に変性する。このさい、３：１モル／モル比でＧＴＭＡＣおよびキトサンを混合してから、適当な精製処理を行う。次に、ＷＳＣ誘導体を秤量し、蒸留水に溶解する。次に、ｅＰＣを（異なるアシル鎖長をもつ）脂肪酸で可溶化し、ＷＳＣ溶液に特定重量比で加える。ＷＳＣは、ＦＡが蒸留水に接触したさいに生じる相分離を防止している間、ＦＡの表面活性剤として作用する。最後に、例えば２分間ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドをボルテックス処理し、室温で保存する。

本発明のさらに別な実施態様は、患者に本発明組成物の治療上有効な量を投与することからなる、疾患の治療または抑制方法である。本発明の注射可能な導出系は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、脳腫瘍、肝臓癌、消化器官癌、頭部癌、頚部癌を始めとする各種の疾患の治療法を設定するために有利である。

本発明の薬剤導出組成物によれば、少なくとも１種の薬学活性剤を制御放出することかなる導出方法を実現できる。上記にまとめたように、本発明を利用できる各種の癌がある。本発明は、また、局所的な薬剤導出方法が健康状態に有利に作用する場合には、癌以外の疾患の治療における薬剤導出システムとして利用できる。

以下の非制限的な実施例によって、本発明をさらに詳しく説明する。

［注射可能なシステムの製造および分析］
実験に際して、鎖長がＣ８〜Ｃ１６のＦＡをＷＳＣおよびｅＰＣと混合し、薬剤導出を対象とする安定かつ注射可能なブレンドを生成した。熱分析を利用して、ブレンド成分の体温での安定性を求めた。ＦＴＩＲ測定法を用いて、成分間に存在する相互作用を検討し、ブレンドの安定性を最適化した。形態学的に調べて、製剤内の各成分のミクロスケールでの機能性を求めた。また、注射可能な製剤として使用する最適なブレンドを実現するためには、レオロジー特性および安定性を求める必要があった。最後に、生理学的溶液中で、抗癌剤ＰＴＸのＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣからの放出を評価した。ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの組成とその特性との間の関係を確認し、薬学用途に向けてブレンドの効能を最適化した。

［医材］
キトサン（９０％）は、Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．（Ｒｉｖｉｅｒｅ−ａｕ−Ｒｅｎａｒｄ、ＱＣ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。ｅＰＣ（＞９９％）は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）から入手した。未標識ＰＴＸ（＞９９％）およびＣ^１４−ＰＴＸは、それぞれ、Ｈａｎｄｅ Ｔｅｃｈ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）およびＭｏｒａｖｅｋ （Ｂｒｅａ、ＣＡ）から購入した。蛍光プローブ３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（７−ニトロ−２−１,３−ベンズオキサゾール−４−イル（ＮＢＤ−ＤＰＰＥ）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）から購入した。塩化グリシジルトリメチルアンモニウム（ＧＴＭＡＣ）、アセトン、エタノール、メタノール、酢酸（ＡｃＯＨ）、脂肪酸塩化物（即ち、塩化カプリロイル（Ｃ８）、塩化デカノイル（Ｃ１０）、塩化ラウロイル（Ｃ１２）、塩化ミリストイル（Ｃ１４）および塩化パルミトイル（Ｃ１６））およびその他の化学医材は全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。全ての化学医材は、試薬級で、さらに変性することなくそのまま使用した。

［ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの製造および安定性］
既に確立された方法(Ｃｈｏ， Ｊ．、ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２００６．７（１０）：ｐ．２８４５−２８５５；Ｓｅｏｎｇ，Ｈ．Ｓ．、Ｈ．Ｓ． Ｗｈａｎｇ、 ａｎｄ Ｓ．Ｗ．Ｋｏ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＡｐｐｌｉｅｄＰｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００．７６（１４）：ｐ. ２００９−２０１５)に準拠して、３：１モル／モル比でＧＴＭＡＣおよびキトサンからなるＷＳＣ誘導体を合成した。

精製後、ＷＳＣ誘導体を秤量し、次に蒸留水に溶解した。異なるアシル鎖長のＦＡで脂質ｅＰＣを可溶化し、特定比でＷＳＣ溶液に加えた。最後に、ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドを２分間ボルテックス処理し、室温で保存した。薬剤担持ブレンドを製造するために、酢酸エチル中５μＣｉのＣ^１４−ＰＴＸを１０ｍｇのＰＴＸに加え、窒素下で乾燥し、薄いフィルム形状の薬剤を生成した。Ｃ１２、Ｃ１４またはＣ１６ＦＡおよびｅＰＣを含有したＦＡ／脂質溶液を使用して、ＷＳＣと混合する前に、ＰＴＸフィルムを再懸濁処理し、ＷＳＣ：ＦＡ：ｅＰＣ：ＰＴＸ（１：４：１：０．２５ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）ブレンドを得た。

サンプルが散乱する光の量である濁度の関数として、サンプルの安定性を求めた。キトサンは生体内でリゾチームの存在下では分解するため、およそ３００μＬのＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドを０．０１ＭのＰＢＳおよび０．２％のリゾチームを含有するバイアルに注入した。特定の各時点で、溶液の一部をキュベットに加え、７００ｎｍで分光法（Ｃａｒｙ^ＴＭ ５０ＵＶ−ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｃ．、 Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して分析した。この波長では、ブレンドについて吸収は認められなかった。次に、上記溶液の一部を、ブレンドを含有するバイアルに戻し、さらに分析を行った。またＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの安定性については、サンプル調製時、および０．０１ＭのＰＢＳへの注入後３７℃で７２時間にわたって目視観察した。

酸性溶液の不在下でキトサンを溶解するために、ＧＴＭＡＣを使用して、キトサンをＷＳＣ誘導体に変性した。予め、ＦＴＩＲ分析によって、キトサン鎖へのＧＴＭＡＣの置換度が低くなるほど、ｅＰＣとＷＳＣのＮＨ_２基との相互作用が強くなることを確認しておいた。合成した一連のＷＳＣから、５６％ＤＳ ＷＳＣがブレンド製剤を製造するための最適なポリマーであることが判明した。異なる濃度、異なる鎖長のＦＡをＷＳＣおよびｅＰＣと混合し、全体の疎水性を強くし、従って製剤の水性環境中の安定性を強くした。さらに、ＷＳＣは、ＦＡが蒸留水と接触したさいに生じる相分離を防止している間、ＦＡの表面活性剤として作用する。図１に、ブレンド内の各成分、即ちＷＳＣ、ＦＡおよびｅＰＣの化学構造を示す。

全医材の混合時、ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの安定性は、用いたＦＡのアシル鎖長および３種類の成分の比に依存することがわかった。具体的には、Ｃ１２ＦＡを含有するＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドは、ＷＳＣ量が１：４：１（ｗ／ｗ／ｗ）未満で、１．５：４：１（ｗ／ｗ／ｗ）以上の場合、緩衝溶液中で安定性をかく。ＷＳＣ濃度が低いと、ブレンドを安定化する反応性基が不十分になり、ＷＳＣ濃度が高くなると、ブレンドの粘度が高くなり、成分の混和性が低くなった。また、ブレンドの安定性は、ＷＳＣとＦＡの混合物が緩衝液の存在下で溶解している間、ｅＰＣの量に依存することもわかった。緩衝液中７２時間のインキュベーション後も変性せずに安定なブレンドを生成するためには、最少量（例えば、１：４：０．５）のｅＰＣが必要である。さらに、上記したように、ＷＳＣ−ｅＰＣのみを含有する製剤は、水性環境中で直ちに溶解すると考えられるため、ブレンドの安定性にとってＦＡの量は重要である。なお、１：４：１（ＷＳＣ：ＦＡ：ｅＰＣ、ｗ／ｗ／ｗ）比未満でＦＡを含有するブレンドは、インキュベーション後に不安定になる。

Ｃ６〜Ｃ１６のＦＡのアシル鎖長の効果を、１：４：１（ｗ／ｗ／ｗ）のＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドについて調べた。サンプル調製時、Ｃ６ＦＡかＣ８ＦＡのいずれかを含有するブレンドはｅＰＣを簡単に可溶化したにもかかわらず、ＷＳＣの存在下で溶液が相分離した。鎖長がＣ１０〜Ｃ１６のＦＡを含有するブレンドは、安定な製剤を生成したが、機械的特性が異なっていた。具体的には、Ｃ１０〜Ｃ１２のＦＡを含有するブレンドは、半固体状態であり、Ｃ１４〜Ｃ１６のＦＡブレンドは混合時に凝固した。なお、室温で２４時間後、Ｃ１４〜Ｃ１６のＦＡを含有するブレンドは粘稠な溶液を生成し、この機械的特性は低かった。即ち、安定な半固体状の注射可能なブレンドを生成するために最適な鎖長は、Ｃ１２のＦＡと考えられる。この結果は、生理学的溶液中における鎖長の関数としてＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの濁度を分析することによって確認した(図２)。この結果により、Ｃ１０のＦＡブレンドは、注射時分解して緩衝液になった（データは示していない）。ところが、Ｃ１２〜Ｃ１６ブレンド製剤の場合は、１時間後に濁度が０．１未満になるため、安定であった。Ｃ１２のＦＡが、濁度が２月間０．０５を超えないため、最も安定な製剤であった。Ｃ１４のＦＡブレンドも、実験期間中濁度が低く（＜０．５）、安定であった。ところが、Ｃ１６のＦＡブレンドの場合は、インキュベーション３日後に濁度がほぼ１にまで上昇した結果、不安定になった。

［ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの熱分析］
ＤＳＣ^ＴＭＱ１００（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ、ＤＥ）を使用して、ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの熱遷移を求めた。サンプル５〜７ｍｇを気密パン内に準備し、その遷移温度について、窒素をパージしながら、１分間につき５℃の温度刻みで−４０℃〜８０℃の間の遷移温度を分析した。ＴＡユニバーサル分析ソフトを使用して、全サンプルについて第２加熱サイクルを分析した。

ＷＳＣ、ＦＡおよび／またはｅＰＣを含有するブレンドの熱挙動を評価し、３種類の成分の混和性を調べるとともに、ブレンドの体温における安定性を求めた（図３）。ＷＳＣ単独の場合には、水分を表す吸熱ピークが、ほぼ０℃に存在していた（図３ａ）。ＷＳＣ含有各サンプルについてこのピークが現れたが、ｅＰＣおよびＦＡの融解遷移に干渉するものではなかった。ｅＰＣ単独の場合については、図３ａに示すように、ほぼ２６℃において、単一の広い融解遷移（Ｔｍ）が認められた。この脂質の（長さおよび飽和度が異なる炭化水素鎖をもつ）不均一性が理由である。ＷＳＣ−ｅＰＣブレンドを調製するために、脂質をエタノールに溶解し、ＷＳＣと混合した。ＷＳＣ−ｅＰＣブレンド（４：１、ｗ／ｗ）の場合、ｅＰＣについて熱遷移は認められなかった（データは示していない）。

ところが、脂肪酸の場合、一般に、アシル鎖長に依存して２℃から６４℃に変化できる鋭い遷移を示す（表１）。Ｃ１２のＦＡ単独の場合、塩化物イオンを理由とする融解遷移が−１８℃に認められた（図３ａ）。ＦＡにＷＳＣを加えると、塩化物イオンが解離し、Ｃ１０〜Ｃ１６のＦＡの融解遷移が１８℃から５９℃にそれぞれ上昇した（図３ｂ）。上述したように、ＷＳＣ−ＦＡブレンドは、緩衝液中で不安定なゲルを生成したため、ｅＰＣを加え、製剤の安定性を強くした。ＦＡアシル鎖長に応じて変化するＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの熱挙動を図３ｃに示す。ＦＡ成分およびｅＰＣ成分は、試験温度範囲においてこれら医材について唯一のピークが認められた場合に、混和性を呈するものと考えられた。ＷＳＣ−ＦＡブレンドの場合と同様に、ピーク位置が、ＦＡアシル鎖長が長くなるとともに、２８℃から５８℃までの温度において高くなることがわかった。ところが、ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドのピーク位置は、Ｃ１０〜Ｃ１４脂肪酸について文献に示されている値に匹敵するものである（表２）。Ｃ１６ブレンド(即ち、ＷＳＣ−ＦＡおよびＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣ)については、融解遷移に意味のある変化は認められなかった。即ち、アシル鎖長がＣ１０以上のＦＡを含有するＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドは、体温以上の熱遷移をもっていた。なお、ｅＰＣは、より長いアシル鎖長のＦＡとの相互作用が小さく、Ｃ１６のＦＡを含有するＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドについて観察された不安定性をこれによって説明することができる（図２）。

表２：各種脂肪酸塩化物の物性

［ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドのＦＴＩＲ分析］
ユニバーサルＡＴＲスペクトルワン分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）を使用して、ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドおよびこれらの各成分のＦＴＩＲスペクトルを求めた。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒのスペクトルソフトを用いて、サンプルから空気の背景スペクトルを差し引いた。スペクトル全ては、２ｃｍ^−１の解像度で平均１６回走査したもので、これを３回繰り返した。

ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドを安定化する相互作用を求めるため、これらブレンドおよびブレンドを構成する個々の成分のＦＴＩＲスペクトルを分析した（図４ａおよび図４ｂ）。ＷＳＣ（５６％ＤＳ）の場合、ＧＴＭＡＣとキトサンとの共役化が、ＧＴＭＡＣのメチルバンドを表す１４７５ｃｍ^−１におけるピークの出現およびキトサンの第１級アミン基に対応する１５６４ｃｍ^−１におけるピークの出現によって確認された。予め、ＦＴＩＲ分析によって、ＷＳＣのＮＨ_２基に対応するピークが、ｅＰＣを加えることにより、１５６４ｃｍ^−１から１５７５ｃｍ^−１にシフトしていることから、ＷＳＣ（５６％ＤＣ）とｅＰＣとの間に相互作用が存在することは確認済みである。Ｃ１２のＦＡのスペクトルは、それぞれ、酸塩化物（ＣＯＣｌ）を表す１８００ｃｍ^−１に鋭いピーク、およびＣ−ＯおよびＣ−Ｃｌ結合に対応する１２９１ｃｍ^−１および７１７ｃｍ^−１にピークをもっていた（図４ａ）。

ＷＳＣ−Ｃ１２ＦＡブレンドの場合、ＦＡからの１８００ｃｍ^−１におけるピークの面積がかなり小さくなり、新たなピークがほぼ１７００ｃｍ^−１に出現していた（図４ａ）。この新たなピーク、即ち塩化物イオンの解離時に生成したカルボン酸基を表すと考えられるピークが、ＷＳＣ−ＦＡブレンドへのｅＰＣ添加によりいっそう顕著になった。塩化物イオンの変位については、７１７ｃｍ^−１におけるＣ−Ｃｌピーク面積のかなりの減少によっても確認できた。ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの場合、ＷＳＣのＮＨ_２基の検出は難しかった。ＷＳＣ−ＦＡブレンドおよびＷＳＣ−ｅＰＣブレンドと比較した場合、３３００ｃｍ^−１におけるＯＨ基を表すピークの面積は、ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドについては最小であった。さらに、各ＦＡからのＣ−Ｏ結合だけでなく脂質からのコリンヘッド基に起因すると考えられる多くのピークが１２００ｃｍ^−１〜１４００ｃｍ^−１に認められた。なお、本発明では、ＷＳＣのＮＨ_２基、ＦＡのＣＯおよびＣＨ_２基、およびｅＰＣのホスファチジルコリンヘッド基のすべてがブレンド製剤の安定化に関与していると考えられる。

ブレンド内部の相互作用についても、ＦＴＩＲによってＦＡ鎖長の関数として調べた（図４ｂ）。Ｃ１０〜Ｃ１６のＦＡのスペクトルの場合、ＦＡスペクトルそれぞれのピーク位置は、ほぼ同じであった（データは示していない）。同様に、ＦＡ鎖長の異なるＷＳＣ−ＦＡブレンドのスペクトルに自明な差は認められなかった（ＷＳＣ−Ｃ１２ＦＡのスペクトルを図４ａに示してある）。ところが、ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの場合、１２００ｃｍ−１と１４００ｃｍ^−１との間にあるピークの数は、ＦＡ鎖長が長くなるとともに増えていた（図４ｂ）。さらに、Ｃ１２ＦＡブレンド、Ｃ１４ＦＡブレンドおよびＣ１６ＦＡブレンドの１７００ｃｍ^−１におけるピークは、Ｃ１０ブレンドの場合には、１７０８ｃｍ^−１にシフトしていることがわかった。加えて、１７００ｃｍ^−１におけるピーク面積は、Ｃ１２ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドおよびＣ１４ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドのみについては、かなり小さくなっていた。即ち、Ｃ１２ＦＡおよびＣ１４ＦＡを含有するＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドに認められた安定性は、ＦＡのカルボン酸基に存在する相互作用に関係があると考えられる。

［ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの光学顕微鏡測定および蛍光顕微鏡測定］
Ｚｅｉｓｓ^ＴＭ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １３５ＴＶ光顕微鏡を使用して、ＷＳＣ−ＦＡブレンド、ＷＳＣ−ｅＰＣブレンドおよびＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドを撮像した。倒立式２光子共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ^ＴＭ ＬＳＭ５１０ ＭＥＴＡ ＮＬＯ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１６のＦＡを含有するＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンド中のキトサンおよび脂質領域を同定した。簡単に説明すると、１ｍｏｌ％の蛍光脂質ＮＢＤ−ＤＰＰＥ(λ_ｅｘ＝４６０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３４ｎｍ)をエタノールに溶解し、窒素を使用して乾燥し、フィルムを得た。純粋なｅＰＣをＦＡに溶解し、蛍光脂質フィルムと混合した。蛍光測定により、ＷＳＣ溶液は、強い自己蛍光信号(λ_ｅｘ＝４００ｎｍ、λ_ｅｍ＝８００ｎｍ)をもつことがわかった。即ち、脂肪酸／脂質溶液をＷＳＣと混合し、ガラススライド上に流した。溶液上にカバースリップを載せ、光学的反射を防ぎ、暗い環境中で一夜製剤を乾燥した。

図５に示すように、光顕微鏡によって各種の重量比のＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの形態を可視化処理した。画像からわかるように、ＷＳＣとｅＰＣのブレンドが部分混和ブレンドを生成し、脂質ドメインがキトサンマトリックス全体に存在している（図５ａ）。従来では、キトサンマトリックス内の脂質ドメインのサイズが、ＥｅＰＣの量が増えるに従って、大きくなると報告されていた。図５ｂに示すように、ＷＳＣ−ＦＡＣ１２ブレンドの場合、明瞭な構造秩序がなく、また明瞭なミクロ相の分離もない。ところが、ＷＳＣ、ＦＡおよびｅＰＣを１：４：１（ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣ、ｗ／ｗ／ｗ）比で結合した場合、成分の組織は強固なっていた(図５ｃ)。このように、画像からは、ブレンドの生成および安定化には、３種類の成分（ＷＳＣ、ＦＡおよびｅＰＣ）すべてが必要であったことがわかる。

レーザー走査蛍光顕微鏡測定を利用して、脂質およびＷＳＣ領域を同定するとともに、ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンド内のＦＡアシル鎖長を長くする効果を求めた（図６）。画像において、赤色領域は、フィルムのＷＳＣ成分を表し、明るい緑色蛍光領域は、脂質および／またはＦＡに対応する。黄色領域は、ブレンドの成分間の配列、即ち相互作用の領域を表し、一方黒色領域は、未標識ＦＡまたはブレンドの不均一表面に対応すると考えられる。Ｃ１０のＦＡを含有するＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣ（１：４：１、ｗ／ｗ／ｗ）ブレンドの場合、図６ａに示すように、ブレンド全体にわたってＷＳＣおよびＦＡ−ｅＰＣ両者のドメインが小さくかつ分散し、相互作用面積が最小になっている。この形態は、このブレンドについて濁度測定によって認められた不安定性の指標になる。ところが、Ｃ１２のＦＡを含有するブレンドは、ＷＳＣおよびＦＡ−ｅＰＣ両者のドメインが大きいだけでなく、大きな黄色領域によって示されるように、成分間の相互作用度が高い(図６ｂ)。より大きなドメインは、ブレンド内に使用されたＦＡの疎水性が強くなったためと考えられる。この形態によって、より長いＦＡ鎖をもつブレンドのレオロジー特性および安定性の向上を説明することができる。ところが、脂質−ＦＡドメインが分離し、空間配置が顕著になるため、Ｃ１６のＦＡを含有するＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドについては、明らかに相分離度が高くなる(図６Ｃ)。従って、ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンド内に利用されているＦＡのアシル鎖長が、分子の分子配列に意味のある効果をもつ。

［ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドのレオロジー測定］
ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドのレオロジー特性を、２ｃｍのコーンおよび角度４°のプレートを備えた応力制御式レオメーター（ＡＲ−２０００、ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ^ＴＭ）によって特性化した。レオメーターを校正し、計器仕様に従って回転マッピングを行った。せん断応力を１から５００Ｐａまで強くした状態で、連続段階式流動モードを使用して粘度を測定した。機械的にテストを行う前に、ブレンド製剤を２４時間保存した。各サンプルの注射液２００μＬをレオメータープレートに載せ、機械的試験を実施した。

粘度の低いブレンドの場合、持続された薬剤放出プロファイルを示さないことがあるため、注射可能なシステムのレオロジー特性は薬剤製剤にとって重要である。ところが、ブレンドの粘度があまりにも高すぎると、製剤の注射が困難になる。注射可能なシステムのレオロジー特性を求めるために、定常せん断試験を利用して、ＦＡ鎖長の関数としてＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンド（１：２：１および１：４：１）の粘度を測定した(図７)。結果から、ＦＡの炭化水素鎖長がブレンド内で長くなると、粘度値および降伏応力値が大きくなることがわかった。１：２：１ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの場合、Ｃ１０のＦＡを含有するブレンドは、粘度値および降伏応力値が最小で、Ｃ１２のＦＡを含有するブレンドは、粘度が僅かに高くなる（〜１×１０^２Ｐａ）ことがわかった（図７ａ）。Ｃ１４ＦＡおよびＣ１６ＦＡを含有するブレンドの場合、測定された粘度はかなり高くなり、ほぼ１×１０^４Ｐａになった。ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンド内でＦＡの量が１：４：１まで高くなると、より高い粘度およびより大きな応力値で同様な傾向が認められた（図７ｂ）。具体的には、Ｃ１４のＦＡおよびＣ１６のＦＡを含有するブレンドは、粘度がほぼ１×１０^５Ｐａで、一方Ｃ１２のＦＡおよびＣ１０のＦＡを含有するブレンドは、粘度がほぼ１×１０^４Ｐａであった。なお、多くの注射可能なシステムは２２ゲージ未満サイズの針を使用し、それ以外は特殊な、油圧シリンジなどの装置を利用していることは公知である。これらの結果から、２２ゲージ針の場合には、Ｃ１０のＦＡおよびＣ１２のＦＡを含有するＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣ（１：４：１）ブレンドのみが注射可能であり、Ｃ１４のＦＡおよびＣ１６のＦＡブレンドは、粘度があまりにも高くすぎることがわかる。従って、安定性分析およびレオロジー分析から、最適な製剤は、Ｃ１２のＦＡを含有する１：４：１（ｗ／ｗ／ｗ）ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣであることがわかった。

［ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドから^１４Ｃ−ＰＴＸの放出］
^１４Ｃ−ＰＴＸ(０．１４μＣｉ)と低温ＰＴＸ（１０ｍｇ）との混合物を含有するＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドほぼ３００μＬを、０．２％リゾチームを含有する０．０１ＭのＰＢＳの５ｍＬに注入し、３７℃でインキュベーションした。特定の時点で、バイアルから２ｍＬの溶液を取り出し、次に２ｍＬの新たなＰＢＳ／リゾチーム溶液で置き換えた。Ｒｅａｄｙ Ｓａｆｅ^ＴＭ 液体シンチレーションカクテル（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）４ｍＬを各サンプルアリコットに加え、ボルテックス処理し、シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ^ＴＭ ＬＳ５０００ＴＤ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａ）によって分析した。

図８に、ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣ（１：４：１、ｗ／ｗ／ｗ）ブレンドからの^１４Ｃ−ＰＴＸの放出をリゾチーム含有０．０１ＰＢＳにおけるＦＡアシル鎖長の関数として示す。分析開始から２４時間、Ｃ１２〜Ｃ１６のＦＡから調製したＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドの場合、ＰＴＸの初期放出率は１９％〜２８％であった。７日後、Ｃ１２のＦＡブレンドからの放出率は、ほぼ７０％であり、これに対しＣ１４のＦＡブレンドに対してはほぼ５０％、そしてＣ１６のＦＡブレンドに対しては１００％であった。Ｃ１２のＦＡブレンドからのＰＴＸの１００％放出は、２１日目であった。これは、卵巣癌患者、ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ型肺癌患者、および乳がん患者に現在適用されている治療処方計画として最適な薬剤放出期間と考えられる。というのは、これら患者には、三週間毎に行われる化学療法の一環として、Ｔａｘｏｌ（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標） ＥＬ（ポリオキシエチル化ひまし油）および脱水アルコール溶液としてのパクリタキセル）を静脈投与しているからである。Ｃ１４のＦＡブレンドの場合、３５日後に、放出率がほぼ７０％に達し、その後３ヵ月間０．２％／日の持続放出率で放出を続けた。別な実験でも同様な傾向が認められた。

注射可能なＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドからのＰＴＸ放出の反応速度を、異なる３つのモデル(式)を使用して特性化した。
樋口モデル：Ｍ（ｔ）／Ｍ（０）＝Ｋ_Ｈｔ^０．５ （１）
Ｒｉｔｇｅｒ−Ｐｅｐｐａｓモデル：Ｍ（ｔ）／Ｍ（０）＝Ｋ_{Ｒ_Ｐ}ｔ^ｎ （２）
Ｐｅｐｐａｓ−Ｓａｈｌｉｎモデル：Ｍ（ｔ）／Ｍ（０）＝Ｋ_{Ｐ_Ｓ，１}ｔ^ｍ＋Ｋ_{Ｐ_Ｓ，２}ｔ^２ｍ （３）
なお、Ｋ_Ｈ、Ｋ_{Ｒ_Ｐ}、Ｋ_{Ｐ_Ｓ，１}、およびＫ_{Ｐ_Ｓ，２}は、放出率に関する実験定数である、Ｍ（ｔ）／Ｍ（０）は、薬剤放出率の分数であり、ｔは放出時間である。モデル（２）のｎは、薬剤放出の主機序を示す拡散指数である。モデル３の第１項は、Ｆｉｃｋｉａｎ拡散分配を表し、そして第２項は、薬剤放出へのＣａｓｅＩＩ−輸送の作用を表す。

Ｃ１２のＦＡブレンドからのＰＴＸの放出は、図９に示すように、それぞれの反応速度モデル（樋口、Ｒｉｔｇｅｒ−ＰｅｐｐａｓおよびＰｅｐｐａｓ−Ｓａｈｌｉｎの各モデル）に適合した。樋口モデルは、薬剤放出率の最大５０％までに適合したが、良好な相関関係をもつ（ｒ^２＝０．９５）。ＰＴＸの放出プロファイルも、放出がほとんど認められない領域を除いて、Ｐｅｐｐａｓ−ＳａｈｌｉｎモデルおよびＲｉｔｇｅｒ−Ｐｅｐｐａｓモデルによく適合した（ｒ^２＝０．９８〜０．９９）。

表３に、３つの薬剤放出反応速度モデルのパラメータそれぞれの値を示す。放出モデルに関係なく、薬剤放出率に関するＫの値は、Ｃ１６の場合に最も高く、そしてＣ１４の場合に最も低かった。Ｐｅｐｐａｓ−Ｓａｈｌｉｎのモデルの場合、ｎの計算値は、Ｃ１２ＦＡブレンドについては０．４３未満（即ちｎ＝０．３７）で、Ｃ１４ＦＡブレンドについても０．４３未満（即ちｎ＝０．３６）であり、いずれもポリマー系マトリックス全体にＦｉｃｋｉａｎ拡散によって生じた放出を示す。Ｃ１６ＦＡブレンドの場合、ｎは０．５８であり、非Ｆｉｃｋｉａｎ放出挙動に対応していた。薬剤放出に寄与するパラメータは２つあり、Ｆｉｃｋｉａｎ拡散とＣａｓｅＩＩ−輸送である。図１０に示すように、具体的な寄与パラメータは、時間の関数としてＫ_{Ｐ_Ｓ，２}ｔ^ｍ／Ｋ_{Ｐ_Ｓ，１}の値をプロットすることによって決定できる。モデル適合時の偏差が大きいため、２８日以上の放出データは、プロットに含めなかった。Ｋ_{Ｐ_Ｓ，２}ｔ^ｍ／Ｋ_{Ｐ_Ｓ，１}＜１の場合、Ｆｉｃｋｉａｎ拡散が支配的になるが、Ｋ_{Ｐ_Ｓ，２}ｔ^ｍ／Ｋ_{Ｐ_Ｓ，１}＞１．^３６の場合に支配的になるのは、ＣａｓｅＩＩ−輸送である。図１０から、Ｋ_{Ｐ_Ｓ，２}ｔ^ｍ／Ｋ_{Ｐ_Ｓ，１}は１未満のままであった。これは、ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンドシステムでは、薬剤放出を支配するのはＦｉｃｋｉａｎ拡散であることを示しているように考えられる。ところが、Ｃ１６ＦＡブレンドの場合、比Ｋ_{Ｐ_Ｓ，２}ｔ^ｍ／Ｋ_{Ｐ_Ｓ，１}が、Ｃ１２ＦＡブレンドおよびＣ１４ＦＡブレンドに比較して、急激に高くなった。即ち、これは、Ｃ１６ＦＡブレンドからのＰＴＸ薬剤放出にＣａｓｅＩＩ−輸送が影響することを含意している。

表３：アシル鎖長の異なる１：４：１（ｗ／ｗ／ｗ）ＷＳＣ−ＦＡ−ｅＰＣブレンド
それぞれの反応速度モデルから求めた放出パラメータの値
サンプル 樋口 Ｒｉｔｇｅｒ−Ｐｅｐｐａｓ
Ｋ _Ｈ Ｋ _{Ｒ_Ｐ} ｎ
Ｃ１２ＦＡ ０．３０ ０．３５ ０．３７
Ｃ１４ＦＡ ０．２１ ０．２４ ０．３６
Ｃ１６ＦＡ ０．４１ ０．３７ ０．５９

サンプル Ｐｅｐｐａｓ−Ｓａｈｌｉｎ
Ｋ _{Ｐ_Ｓ、１} Ｋ _{Ｐ_Ｓ，２} ｍ
Ｃ１２ＦＡ ３．２３×１０^−１ ３．２４×１０^−２ ０．３１
Ｃ１４ＦＡ ２．２０×１０^−１ ２．４４×１０^−２ ０．３０
Ｃ１６ＦＡ ３．３５×１０ ^−１ ３．６９×１０ ^−２ ０．５０

Ｃ１６ＦＡブレンドについて求められた放出率は高く（Ｋの値が大きく）、これは、共焦点画像および濁度結果(図２、図６)から求められた不混和性が強かったことが理由と考えられる。ＦＡの鎖長が長いと、ブレンドの全疎水性も強くなった。より長い脂肪酸が親水性環境（即ち、ＷＳＣ水溶液）中で凝集すると、ブレンドの相が分離する。相分離が生じると、ブレンド容積（またはサイズ）が小さくなり、次に、薬剤の表面積が広くなり、そして拡散長さが短くなる。

Ｃ１６ブレンドからのパクリタキセルの放出率が高くなったことも、ブレンドのレオロジー特性から説明することができると考えられる。より長いＦＡを使用してブレンドシステムを製剤化した場合（即ち、Ｃ１４およびＣ１６それぞれについてη〜１００Ｐａｓおよびη〜１０^５）、レオロジー特性は強くなった。一般的にいって、絡み合い、物理的相互作用（ファンデルワース、疎水性水素結合相互作用）や架橋などのポリマー系システムのマクロ分子間の相互作用が強くなると、粘度が大きくなる。マクロ分子間のこれら相互作用を使用すると、薬剤をポリマー系マトリックス内に取り込むことができる。即ち、ポリマーシステムに存在する相互作用が強くなると、薬剤放出率が下がる。全体的にいえば、３種類のブレンドのなかで、Ｃ１２ＦＡが最も粘度が低かった。即ち、結合性が最も低く、ＰＴＸ放出の促進が生じた。

ある製剤における薬剤の溶解度も、薬剤放出性能に強く影響することが知られている。ＰＴＸが、より短いＦＡアシル鎖により多く可溶するため、Ｃ１２ＦＡからの薬剤放出がＣ１４ＦＡの場合よりも速かった。Ｃ１４ＦＡブレンドが示す遅い薬剤放出も、高い粘度（高い結合性）が理由であり、またマトリックス中の親水性成分と疎水性成分との間の最小の相分離が理由であると考えられる。必要な具体的な治療に応じて、使用するＦＡのタイプか、あるいはブレンド中の個々の成分の具体的濃度のいずれかを変えることによって薬剤放出を制御できる。

［塩化ラウロイルとの組成物］
細胞生存可能性を評価するため、塩化ラウロイルを含有する注射可能なポリマー／脂質ブレンドを調製した。この組成物は、低分子量ＷＳＣ、Ｃ１２ＣｌおよびｅＰＣを１：３：１および１：４：１の比で含有していた。ｅＰＣを塩化ラウロイル（Ｃ１２Ｃｌ）に溶解し、ボルテックス処理して溶解した。次に、水溶性キトサン（ＷＳＣ）を加え、ブレンドをさらにボルテックス処理して、１ｃｃシリンジに移した。次に、シリンジ中の組成物をＵＶ殺菌により２４時間殺菌処理した。図１１に示すように、ブレンド（１：３：１、１：４：１）の存在下で２４時間定温放置後、Ｌ９２９細胞の生体外生体適合性を評価した。誤差バーは、標準誤差として示す（ｎ＝１２）。

［ラウリンアルデヒドとの組成物］
（低分子量）ＷＳＣ、ラウリンアルデヒドおよびｅＰＣを１：２：１、１：２：３、２：２：３、１：３：１および１：４：１の比で含有する組成物を調製した。即ち、ｅＰＣをラウリンアルデヒドに溶解し、ボルテックス処理し、ＷＳＣを添加してから、さらにボルテックス処理して成分をブレンドし、次に１ｃｃシリンジに移した。０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）中３７℃で２ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含有するインキュベーションしたブレンド製剤の安定性および濁度を指標として図１２および図１３に示す。

１０ｍｇのパクリタキセルとともに、(低分子量および高分子量)ＷＳＣ、ラウリンアルデヒドおよびｅＰＣを１：３：１および１：４：１の比で含有する組成物を調製した。パクリタキセルは、エタノール溶液として加え、溶剤を完全に蒸発処理した。１ｃｃシリンジに移す前に成分をいくつかの段階でボルテックス処理した。式：
Ｋ_Ｖ＝ＰＴＸ濃度（ブレンド）／ＰＴＸ濃度(溶液)
に従って算出した、３７℃で７日間０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）１５ｍＬ中でインキュベーションした各種のブレンド製剤におけるパクリタキセルの分配係数（Ｋ_Ｖ）を図１４に示す。

１０ｍｇのパクリタキセルおよび１４Ｃ−パクリタキセルとともに、（高分子量）ＷＳＣ、ラウリンアルデヒドおよびｅＰＣを１：４：１の比で含有する組成物も調製した。１４Ｃ−パクリタキセル（１４Ｃ−ＰＴＸ）およびパクリタキセルは、エタノール溶液として加え、溶剤を完全に蒸発処理した。ラウリンアルデヒドを使用して、ｅＰＣを溶解した。成分をいくつかの段階でボルテックス処理し、１ｃｃシリンジに移した。２ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含有する０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）中３７℃でインキュベーションした各種のブレンド製剤からの１４Ｃ−ＰＴＸパクリタキセルの累積放出率を図１５に示す。また、ＷＳＣ／Ｃ１２ＣＨＯ／ｅＰＣブレンド製剤からの１４Ｃ−ＰＴＸ／ＰＴＸの累積放出に適合するＲｉｔｇｅｒ−Ｐｅｐｐａｓ放出モデルおよびＰｅｐｐａｓ−Ｓａｈｌｉｎ放出モデルを図１６に示す。

１：３：１および１：４：１の比で（低分子量）ＷＳＣ、ラウリンアルデヒドおよびｅＰＣからなる別な組成物を調製した。ｅＰＣおよびラウリンアルデヒドをボルテックス処理し、次にＷＳＣを加えた。ブレンドをさらにボルテックス処理してから、１ｃｃシリンジに移し、２４時間ＵＶ殺菌により殺菌処理した。２４時間のインキュベーション後、ブレンド（１：３：１および１：４：１）の存在下で求めたＬ９２９細胞の生体外生体適合性を図１７に示す。

１：４：１の比で（低分子量）ＷＳＣ、ラウリンアルデヒドおよびｅＰＣからなるさらに別な組成物を調製した。ｅＰＣおよびラウリンアルデヒドをボルテックス処理し、次にＷＳＣを加えた。ブレンドをさらにボルテックス処理してから、１ｃｃシリンジに移し、２４時間ＵＶ殺菌により殺菌処理した。４週間を上限として、雌のＣＤ−１マウス腹腔に注射した後のブレンド（１：４：１）の生体内生体適合性を求めた（ｎ＝３）。結果を表に示す。４週間後に、血漿中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性を求めた（ｎ＝３）。許容可能なＡＬＴレベルは、１０〜３５Ｕ／Ｌと考えられる。

表４：各種脂肪酸の物性

［ドセタキセル（ＤＴＸ）の生体外放出プロファイルおよびＣＤ−１マウスにおけるブレンド（薬剤未担持／担持）の生体内生体適合性］
５〜４５ｍｇのＤＴＸとともに、１：４：１の比で（高分子量）ＷＳＣ、Ｃ１２ＣｌまたはＣ１２−ＣＨＯおよびｅＰＣからなる組成物を調製した。２種類の異なる製剤１０ｍｇの^３Ｈ−ＤＴＸの薬剤放出プロファイルを図１８に示す。Ｃ１２−ＣＨＯおよびＤＴＸからなる別な製剤の生体外薬剤放出プロファイルは、図１９Ａおよび１９Ｂに示すように、ＣＨＯ製剤に担持されたＨ−ＤＴＸの異なる量による濃度作用を説明するものである。

０．０１Ｍのリン酸緩衝液および２ｍｇ／ｍＬのリゾチームを使用してブレンド製剤（１：８ｗ／ｗ、薬剤／製剤）をインキュベーションすることによってこれからの^３Ｈ−ＤＴＸの生体外放出特性を求めた。特定の時点で、液体シンチレーションカウンターによって製剤の一部を分析した。雌のＣＤ−１マウスの腹腔に薬剤未担持およびＤＴＸ担持（８ｍｇ／ｋｇ）ブレンド製剤を注射した。７週間にわたり毎週解剖し、腸に炎症があったか、あるいはキャプシドの生成があったかどうかについて目視観察した。定常状態ＤＴＸ結晶濃度をＨＰＬＣ分析によって求め、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを測定することによって肝臓毒性を評価した。

３週間にわたり、^３Ｈ−ＤＴＸの生体外放出は、４．６％／日（ｎ＝３）であることがわかった。マウスにおける薬剤未担持および薬剤担持ブレンドの生体内生体適合性を確認した。いずれも健康状態を維持し、体重減少は認められなかった。解剖検査は、局所腹膜炎を示さなかった。最小のキャプシド生成も認められなかった。最長４週間を上限として、検出された持続ＤＴＸ血漿晶レベルは、０．０３３±０．０１μｇ／ｍＬであった。これまで報告されているマウスＤＴＸ浄化値によれば、これらの定常状態血漿濃度は、ほぼ５％／日（１．３ｍｇ／ｋｇ／日）の生体内放出に対応し、上記の生体外結果と一致するものである。ＤＴＸ担持製剤を注射したマウスのＡＬＴレベルは、許容範囲内にあり、４週間で１２．８〜３０．８Ｕ／Ｌであった（ｎ＝１１）であった。薬剤未担持製剤を注射したマウスの平均ＡＬＴレベルは、７週間にわたって１７．１±５．２Ｕ／Ｌであった（ｎ＝１１）。

本実施例の新規な注射可能なシステムによって、生体外および生体内でＤＴＸの持続放出を確保でき、生体内生体適合性も確保できた。これらの検討により、注射可能な本ブレンドは、ＤＴＸの局所持続腹腔内放出に潜在的に利用でき、進行した卵巣癌などの疾患の治療に利用できることがわかる。

［薬剤未担持および薬剤担持ブレンド製剤の成分］
薬剤未担持ブレンド製剤は、水溶性高分子量キトサン、卵ホスファチジルコリンおよびラウリンアルデヒドを１：４：１重量比で製剤化したものである。薬剤担持ブレンド製剤は、ブレンド製剤１ｇに対して３０ｍｇのＤＴＸを製剤化したもので、薬剤／マトリックス比は１：８（ｗ／ｗ）であった。

［ブレンド製剤からのドセタキセルの生体外放出］
ブレンド製剤からのＤＴＸの放出プロファイルを確認するために、生体外放出試験を行った。生体内試験と同じ製剤を使用した。０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）および２ｍｇ／ｍＬのリゾチームを使用して、ＤＴＸ担持ブレンド製剤（１：８の薬剤：マトリックス比、ｎ＝６）０．５μＬ（０．４５０ｇ）を３７℃でインキュベーションした。特定の時点で、２ｍＬを取り出し、ＨＰＣＬによってＤＴＸについて分析した。薬剤未担持ブレンド製剤についてもＰＢＳ／リゾチームを用いてインキュベーションし、対照として使用した。

対照グループおよび治療グループからの血漿をＨＰＬＣによってＤＴＸについて分析し、ブレンド製剤からの薬剤の生体内放出率を求めた。２１日間にわたって、^３Ｈ−ＤＴＸの生体外放出は、４．６％／日(対照グループｎ＝１；治療グループｎ＝３)であった。

［生体内試験］
６〜８週齢の健康なＣＤ−１雌マウスの腹腔に、３０μＬの薬剤未担持ブレンド製剤（対照グループ、ｎ＝１）あるいは３０μＬのＤＴＸ−担持ブレンド製剤（１：８の薬剤：マトリックス比、治療グループ、ｎ＝３）を投与した。治療グループのマウスのＤＴＸ投与量は、８ｍｇ／ｋｇであった。

マウスを以下の生体適合性について評価した。即ち、体重減少、局部炎症およびキャプシド生成に関する解剖検査、肝臓毒性の指標である血漿ＡＬＴレベル、および腎臓、脾臓、肝臓、腸に対するヘマトキリンおよびエロシン汚染について評価した。

薬剤未担持ブレンドおよび薬剤担持ブレンドの生体内生体適合性をマウスで確認した。解剖検査前、マウスの健康状態は良好で、意味のある体重減少はなかった。解剖検査は、局所腹膜炎を示さなかった。最小のキャプシド生成も認められなかった。

［ＣＤ−１マウスのＡＬＴレベル］
図２０に示すように、ＤＴＸ−担持製剤を注射した治療マウスのＡＬＴレベルは、４週間にわたり、許容範囲（１０〜３５単位／Ｌ）で、１２．８〜３０．８Ｕ／Ｌであった。治療マウスの平均ＡＬＴレベルは、２０．６±７．７Ｕ／Ｌ（ｎ＝１１）であった。薬剤を担持しなかった製剤を注射した対照マウスの平均ＡＬＴレベルは、７週間にわたり、１７．１±５．２Ｕ／Ｌ（ｎ＝１１）であった。

［マウスのドセタキセルの血漿濃度レベル］
図２１は、ＤＴＸ血漿レベルを示す図である。最長４週間を上限として、検出されたＤＴＸ血漿レベルは、０．０３３±０．０１μｇ／ｍＬであった。これまで報告されているマウスＤＴＸ浄化値によれば、これらの定常状態血漿濃度は、ほぼ５％／日（１．３ｍｇ／ｋｇ／日）の生体内放出に対応し、上記の生体外結果と一致するものである。２日目および７週間目に解剖したマウスには、検出量のドセタキセルは認められなかった（ｎ＝３）。

Claims (20)

1. 薬学活性剤を制御放出する注射可能な薬剤導出組成物であって、
   （ａ）キトサン誘導体、
   （ｂ）アシル鎖長がＣ８〜Ｃ１６の脂肪酸、
   （ｃ）リン脂質、および
   （ｄ）薬学活性剤、
   からなることを特徴とする注射可能な薬剤導出組成物。
   
2. 前記キトサン誘導体が、水溶性キトサンである請求項１に記載の注射可能な薬剤導出組成物。
   
3. 前記水溶性キトサンを、キトサン系医材とＧＴＭＡＣとを共役化することよって製造した請求項２に記載の注射可能な薬剤導出組成物。
   
4. 前記脂肪酸のアシル鎖長が、Ｃ１０〜Ｃ１４である請求項１に記載の注射可能な薬剤導出組成物。
   
5. 前記脂肪酸のアシル鎖長が、Ｃ１２である請求項１に記載の注射可能な薬剤導出組成物。
   
6. 前記脂肪酸が、脂肪酸塩化物である請求項１に記載の注射可能な薬剤導出組成物。
   
7. 前記脂肪酸が、ラウリンアルデヒドである請求項１に記載の注射可能な薬剤導出組成物。
   
8. 前記リン脂質を、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン、ｅＰＣおよびホスファチジルグリセロールからなる群から選択した請求項１に記載の注射可能な薬剤導出組成物。
   
9. 前記薬学活性剤を、カルマスティン、メトトレキサート、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル、５−フルオロウリジン、シタラビン、ロイプロリドアセテート、シクロホスファミド、ビノレルビン、ピロカルピン、パクリタキセル、ミトマイシン、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシンおよびドセタキセルからなる群から選択した請求項１に記載の注射可能な薬剤導出組成物。
   
10. 前記薬学活性剤を、オリゴヌクレオチド、ペプチドおよびタンパク質からなる群から選択した請求項１に記載の注射可能な薬剤導出組成物。
    
11. シリンジ針によって注射できるように製剤化した請求項１に記載の注射可能な薬剤導出組成物。
    
12. 前記キトサン誘導体が水溶性キトサンであり、前記脂肪酸がＣ１２のアシル鎖長をもち、前記リン脂質が、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン、ｅＰＣおよびホスファチジルグリセロールからなる群から選択され、そして前記薬学活性剤が、カルマスティン、メトトレキサート、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル、５−フルオロウリジン、シタラビン、ロイプロリドアセテート、シクロホスファミド、ビノレルビン、ピロカルピン、パクリタキセル、ミトマイシン、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシンおよびドセタキセルからなる群から選択された請求項１に記載の注射可能な薬剤導出組成物。
    
13. 前記脂肪酸が、ラウリンアルデヒドである請求項１２に記載の注射可能な薬剤導出組成物。
    
14. シリンジ針によって注射できるように製剤化した請求項１２に記載の注射可能な薬剤導出組成物。
    
15. 薬学活性剤を担持し、導出し、かつ制御放出するための注射可能な薬剤導出プラットホームであって、
    （ａ）水溶性キトサン、
    （ｂ）アシル鎖長がＣ８〜Ｃ１６の脂肪酸、および
    （ｃ）ホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン、ｅＰＣおよびホスファチジルグリセロールからなる群から選択したリン脂質のブレンド
    からなることを特徴とする薬剤導出プラットホーム。
    
16. （ａ）キトサン系医材から水溶性キトサンを製造し、そして
    （ｂ）前記水溶性キトサンと、脂肪酸およびリン脂質との複合体を生成して、少なくとも１種の薬学活性剤の制御放出を確保する注射可能な医材を生成する工程
    からなる請求項２に記載の注射可能な薬剤導出組成物を製造する方法。
    
17. 前記水溶性キトサンを、前記キトサン系医材とＧＴＭＡＣとの共役化によって製造する請求項１６に記載の注射可能な薬剤導出組成物を製造する方法。
    
18. 請求項１に記載の組成物を治療上有効な量で投与することからなる哺乳動物における疾患を治療、予防または抑制する方法。
    
19. 前記疾患が、癌である請求項１８に記載の、疾患を治療、予防または抑制する方法。
    
20. 疾患を治療する注射可能な薬剤導出システムの製造への、キトサン系医材、脂肪酸、リン脂質および少なくとも１種の薬学活性剤の適用。

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