KR20210153788A

KR20210153788A - 손상된 조직 부위에 주사 가능한 하이드로겔 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210153788A
Application number: KR1020200070191A
Authority: KR
Inventors: 손세일; 고완규; 김성준; 한공호; 이다예
Original assignee: 주식회사 셀진
Priority date: 2020-06-10
Filing date: 2020-06-10
Publication date: 2021-12-20
Also published as: KR102479259B1

Abstract

손상 부위에 직접 주사가 가능한 하이드로겔 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 하이드로겔은 적절한 특성을 가져 손상된 조직 부위에 생리활성 물질과 함께 직접 주사가 가능하므로, 손상된 조직을 회복시켜 척수 손상을 포함한 다양한 질환의 예방 또는 치료에 효과적이다.

Description

손상된 조직 부위에 주사 가능한 하이드로겔 및 이의 용도{Injectable Hydrogels into injured tissue sites and uses thereof}

손상된 조직 부위에 직접 주사가 가능한 하이드로겔 및 이의 용도에 관한 것이다.

척수 손상(Spinal cord injuries, SCI)은 일종의 기계적 외상(1차 손상)에 해당한다. 신경 염증 인자의 증가, 희돌기교세포(oligodendrocytes)의 아포토시스(apoptosis) 및 미엘린(myelin)의 손실과 같은 2차적인 손상을 유발하는 1차 손상은 특히 신경 염증 과정에서 손상되지 않은 이웃 조직과 병변을 악화시킨다. 한편, 메틸프레드니솔론(methylprednisolone, MP)은 치료에 사용하기 위해 유일하게 승인된 항-신경염 치료제로서, 상기 MP를 투여함으로써 신경 염증 과정에 의한 2차 손상을 억제할 수 있다. 그러나 MP는 혈액 순환 동안 반감기가 짧고 간이나 신장에 의해 빠르게 제거되며, MP 치료는 감염, 급성 코르티코스테로이드 근육 병증 및 폐렴을 포함한 다양한 유해한 영향을 미칠 수 있는 문제점이 있다.

하이드로겔은 수분 함량 매트릭스이며 약물 또는 세포를 캡슐화하는데 사용될 수 있다. 따라서 치료를 위해 하이드로겔을 병변에 주입하며, 직접 주입된 하이드로겔은 회수에 적합한 환경을 제공하는 수화된 구조를 생성하고 보존할 수 있다. 그러나 현재까지 하이드로겔을 직접 주사함으로써 SCI 후 신경 염증을 치료하는 방법에 관한 연구가 거의 없고, 하이드로겔을 직접 주사하는 경우, 잔류 물질로 인한 감염과 같은 위험을 수반한다는 문제점이 있다. 예를 들어, 척수에 주입된 하이드로겔이 부풀어 오르면 추가적인 손상이 발생할 수 있다는 문제점이 있다.

따라서, 상기와 같은 문제점이 개선된 손상된 부위에 직접 주사할 수 있는 하이드로겔에 관한 연구가 필요하다.

일 양상은 글리콜 키토산(glycol chitosan) 및 산화 히알루로니네이트(oxidized hualuroninate)를 포함하는 하이드로겔을 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 하이드로겔을 포함하는 척수 손상의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 히알루로니네이트 용액에 과요오드산 나트륨 용액을 혼합하여 산화 히알루로니네이트 용액을 제조하는 단계; 및 상기 산화 히알루로니네이트 용액과 글리콜 키토산 용액을 혼합하는 단계를 포함하는 하이드로겔을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 글리콜 키토산(glycol chitosan) 및 산화 히알루로니네이트(oxidized hualuroninate)를 포함하는 하이드로겔을 제공한다.

일 구체예에 있어서, 상기 하이드로겔은 금속 나노입자를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 금속은 금속 산화물일 수 있다. 또한, 상기 금속은 철족금속 원소(Fe, Ni, Co), 희토류 원소(La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu), 화폐금속 원소(Cu, Ag, Au), 아연족 원소(Zn, Cd, Hg), 알루미늄족원소(Al, Ga, In, Tl), 알칼리토금속 원소(Ca, Sr, Ba, Ra) 및 백금족 원소(Pt, Pd 등)에서 하나 이상 선택된 금속 또는 이들의 합금으로 이루어지는 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 하이드로겔은 생리활성 물질을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 생리활성 물질은 금속 나노입자의 표면에 결합된 것일 수 있다. 상기 생리활성 물질의 예는 항염증제, 항암제, 조영제, 호르몬제, 항호르몬제, 비타민제, 칼슘제, 무기질 제제, 당류제, 유기산 제제, 단백질 아미노산 제제, 해독제, 효소 제제, 대사성 제제, 당뇨 병용제, 조직 부활 용약, 클로로필 제제, 색소제제, 종양 용약, 종양 치료제, 방사성 의약품, 조직 세포 진단제, 조직 세포 치료제, 항생 물질 제제, 항바이러스제, 복합항생물질제제, 화학요법제, 백신, 독소, 톡소이드, 항독소, 렙토스피라혈청, 혈액 제제, 생물학적 제제, 진통제, 면역원성 분자, 항히스타민제, 알레르기 용약, 비특이성 면역원 제제, 마취제, 각성제, 정신 신경 용제, 등을 포함할 수 있다. 구체적인 실시예에 있어서, 상기 생리활성 물질은 척수 손상 치료제, 예를 들면, 항염증제, 더욱 구체적으로 우르소데옥시콜산일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 글리콜 키토산 및 산화 히알루로니네이트는 글리콜 키토산의 아미노기 및 산화 히알루로니네이트의 알데히드기가 시프 염기 (Schiff base) 반응에 의한 이민 결합을 형성하는 것일 수 있다. 상기 글리콜 키토산 및 산화 히알루로니네이트는 1 내지 10:1의 중량비로 혼합된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 글리콜 키토산 및 산화 히알루로니네이트는 1 내지 10:1, 1 내지 9:1, 1 내지 8:8, 1 내지 7:1, 2 내지 10:1, 2 내지 8:1, 3 내지 10:1, 3 내지 8:1, 3 내지 8:1, 4 내지 10:1, 4 내지 8:1, 5 내지 10:1, 5 내지 9:1, 6 내지 10:1, 또는 6 내지 8:1의 중량비로 혼합된 것일 수 있다. 이때, 글리콜 키토산 및 산화 히알루로리네이트의 혼합 비율이 상기 범위 미만이거나 또는 상기 범위를 초과하는 경우, 글리콜 키토산 및 산화 히알루로니네이트가 충분히 가교되지 않아 점도가 낮은 액체 상태의 유체를 형성하므로 고체 또는 반고체 상태의 겔이 형성되지 않는다는 문제점이 있다. 따라서, 상기 하이드로겔을 손상 부위에 주사하였을 때 생체로의 흡수 속도가 매우 빠르거나 생체 내에서 쉽게 용해되어 치료제로서의 효능이 발휘되지 않을 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 하이드로겔은 200 내지 3,000 Pa, 300 내지 3,000 Pa, 300 내지 1,800 Pa, 300 내지 800 Pa, 400 내지 1,200 Pa, 400 내지 1,000 Pa 또는 400 내지 800 Pa의 저장 모듈러스(G')를 갖는 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 하이드로겔은 10 내지 150 Pa, 10 내지 100 Pa, 10 내지 40 Pa, 15 내지 40 Pa, 15 내지 30 Pa 또는 20 내지 30 Pa의 손실 모듈러스(G")를 갖는 것일 수 있다.

상기 탄성률은 8.1 변형률%에 도달할 때까지 2㎜/분의 압축률로 점도계(예를 들면, Rotating rheometer)로 측정한 것일 수 있다.

다른 양상은 상기 하이드로겔; 및 척수 손상 치료제를 포함하는 척수 손상의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또 다른 양상은 상기 하이드로겔; 및 척수 손상 치료제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 척수 손상을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 일 구체예에 있어서, 상기 방법은 하이드로겔을 개체에 투여하는 단계 후, 근적외선을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 하이드로겔의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

본 명세서에서 “척수 손상(Spinal cord injury, SCI)”은 척수의 압박, 탈구에 의한 손상일 수 있다. 척수 손상은 예를 들어, 외상성 척수 손상, 척추 퇴행성 질환(척추증 등), 척추 염증성 질환(척추염, 만성 류마티스 관절염 등), 종양(척수 종양, 척추 종양 등), 혈관성 질환(척수 출혈, 뇌졸중, 골수 외 혈관 장애에 의한 척수 마비 등), 척수염(거미 막염, 바이러스성 척수염, 세균성 척수염 등), 다발성 경화증, 근위축성 측색경화증 등을 포함할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 급성 척수 손상뿐만 아니라, 만성 척수 손상에도 치료 효과를 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 척수 손상 치료로 인하여 야기되는 척수 2차 손상을 억제하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따른 조성물은 광열 치료를 위한 것일 수 있다.

본 명세서에서 “광열치료”는 손상 부위에 빛을 흡수하여 열을 발생하는 광반응물질을 지닌 약물을 주사하여 고열 요법이 필요한 위치에 축적시키고 레이저를 쪼여 광반응 물질의 열 발생을 유도함으로써 주변의 악성 세포를 사멸시키는 치료 방법이다.

본 명세서에서 “근적외선(Near-infrared)”은 피부와 조직에 의해 흡수되며, 비 침투 방식으로 깊은 곳에 존재하는 조직까지 침투할 수 있는 능력이 빛으로, 열 전달이 뛰어나 질병 치료에 이용된다. 특히, 병에 걸린 조직의 효율적인 열 제거술을 위해 금 나노소재에 의해 열로 변환될 수 있다. 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 손상 부위에 주사 후 근적외선 조사에 의한 운동기능 회복, 신경염증 억제 또는 손상된 조직 회복 효과가 증대되는 것을 확인하였다. 또한, 상기 조성물은 MAPKs의 경로의 ERK, JNK 또는 p38의 인산화를 억제하거나 또는 염증성 사이토카인 예를 들어, TNF-α, IL-1β을 억제하는 것일 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 하이드로겔은 금 나노입자를 포함함으로써 근적외선 조사시 금 나노입자에 의해 열 발생이 유도되는 바 척수 손상 후 활성화된 대식세포에 의한 신경 염증을 억제할 수 있다.

일 구체예 따른 상기 조성물의 투여 용량은 0.01㎎ 내지 10,000㎎, 0.1㎎ 내지 1000㎎, 1㎎ 내지 100㎎, 0.01㎎ 내지 1000㎎, 0.01㎎ 내지 100㎎, 0.01㎎ 내지 10㎎, 또는 0.01㎎ 내지 1㎎일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반 응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, ㎏당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 가능한 투여 경로에는 경구, 설하, 비경구 (예를 들어, 피하, 근육내, 동맥내, 복강내, 경막내, 또는 정맥내), 직장, 국소 (경피 포함), 흡입, 및 주사, 또는 이 식성 장치 또는 물질의 삽입을 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 랫트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.

일 구체예에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 포함할 수 있다.

일 구체예에 따른 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방 지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유 화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.

다른 양상은 히알루로니네이트를 포함하는 용액에 과요오드산 나트륨을 포함하는 용액을 혼합하여 산화 히알루로니네이트 용액을 제조하는 단계; 및 상기 산화 히알루로니네이트을 포함하는 용액과 글리콜 키토산을 포함하는 용액을 혼합하는 단계를 포함하는 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.

일 구체예에 따른 방법은 상기 글리콜 키토산을 포함하는 용액과 금속 나노입자를 혼합하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 금속 나노입자는 머캅토 베타시클로덱스트린 및 폴리에틸렌글리콜-SH와 결합하여 PEG-s-GNP-s-CD을 형성하는 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 글리콜 키토산을 포함하는 용액 및 산화 히알루로니네이트 용액은 1:10 내지 10:1의 부피비로 혼합된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 글리콜 키토산을 포함하는 용액 및 산화 히알루로니네이트를 포함하는 용액은 1:10 내지 10:1, 1:9 내지 9:1, 2:8 내지 8:2, 3:7 내지 7:3, 4:6 내지 6:4 또는 5:5의 부피비로 혼합된 것일 수 있다. 이때, 글리콜 키토산을 포함하는 용액 및 산화 히알루로리네이트를 포함하는 용액의 혼합 비율이 상기 범위 미만 미만이거나 또는 상기 범위를 초과하는 경우, 글리콜 키토산 및 산화 히알루로니네이트가 충분히 가교되지 않아 점도가 낮은 액체 상의 유체를 형성하므로 고체 또는 반고체 상태의 겔이 형성되지 않는다는 문제점이 있다. 따라서, 상기 하이드로겔을 손상 부위에 주사하였을 때 생체로의 흡수 속도가 매우 빠르거나 생체 내에서 쉽게 용해되어 치료제로서의 효능이 발휘되지 않을 수 있다.

일 구체예에 따른 방법은 상기 산화 히알루로니네이트의 알데히드기와 상기 글리콜 키토산의 아미노기 사이에 이민 결합이 형성되는 것일 수 있다. 상기 이민 결합은 알데히드기와 아미노기 사이에 시프 염기(Schiff base) 반응에 의해 형성되는 것일 수 있다.

상기 방법에 의해 제조된 하이드로겔은 척추손상 환자가 치료를 위하여 손상 부위에 직접 주사할 수 있으며, 잔류 물질로 인한 감염 또는 하이드로겔의 종창(swelling)에 의한 추가적인 손상이 발생하지 않는 바 척수 손상 후 신경 염증의 치료에 효과적이다.

일 양상에 따른 하이드로겔은 적절한 특성을 가져 손상된 조직 부위에 생리활성 물질과 함께 직접 주사가 가능한 효과가 있다.

도 1a은 우르소데옥시콜산을 함유하는 글리콜 키토산의 제조방법을 도식화한 것이다.
도 1b는 일 양상에 따른 하이드로겔의 제조방법을 도식화한 것이다.
도 1c는 일 양상에 따른 하이드로겔을 척수 손상을 유도한 랫트에 주사한 후 근적외선을 조사하는 과정을 도식화한 것이다.
도 1c는 일 양상에 따른 하이드로겔의 근적외선 조사에 의한 광열 치료 효과를 도식화한 것이다.
도 2는 일 양상에 따른 하이드로겔을 SEM으로 확인한 사진이다.
도 3은 일 양상에 따른 하이드로겔의 유변학적 특성을 확인한 그래프이다.
도 4는 일 양상에 따른 하이드로겔의 부피 변화를 확인한 그래프이다.
도 5a는 세포 내에 함입된 하이드로겔을 24시간 또는 48시간 동안 형광 이미지로 관찰한 사진이다.
도 5b는 일 양상에 따른 하이드로겔의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 6a는 척수 손상(SCI) 랫트에 일 양상에 따른 하이드로겔을 주사하고 NIR을 조사한 후, 병변 부위의 온도를 적외선 카메라로 촬영한 사진이다.
도 6b는 척수 손상(SCI) 랫트에 일 양상에 따른 하이드로겔을 주사하고 NIR을 조사한 후, 병변 부위의 온도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 척수 손상(SCI) 랫트에 일 양상에 따른 하이드로겔을 주사한 후 운동 기능 회복 여부를 Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) 척도로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8a는 손상된 척수에 일 양상에 따른 하이드로겔을 주사한 후 JNK, ERK 및 p38의 인산화를 확인한 결과이다.
도 8b는 손상된 척수에 일 양상에 따른 하이드로겔을 주사한 후 TNK-α 및 IL-1β의 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 9는 손상된 척수에 일 양상에 따른 하이드로겔을 주사한 후 H&E 염색 결과를 나타낸 사진이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[제조예]

제조예 1. 산화 히알루로네이트와 글리콜 키토산의 제조

히알루로네이트(hyaluronate, HA) (분자량(MW)= 1,000 kDa)(Humedix (한국)를 과요오드산 나트륨(Sodium periodate) (Sigma-Aldrich, 미국)으로 산화하여 산화 히알루로네이트(oxidized hyaluronate, oHA)를 합성하였다. 구체적으로, HA 3.8g을 초순수(Ultrapure) 탈이온수(DW, 18.2 MΩ) 360 ㎖에 용해하였다. 과요오드산 나트륨 1.068g은 별도의 DW 40 ㎖에 용해하였다. 용해된 과요오드산 나트륨을 암조건에서 HA에 천천히 첨가하여 혼합하였다. 이후, 혼합물을 24시간 동안 교반하고 1 ㎖의 에틸렌 글리콜(ethylene glycol) (Sigma-Aldrich, 미국)을 혼합물에 첨가하여 HA와 반응하지 않은 과요오드산 나트륨을 중화하였다. 그런 다음, 상기 용액을 투석막(Spectrum Spectra, 분자량 컷오프(molecular weight cut off, MWCO): 12-14K)을 사용하여 7일 동안 투석하고, 동결 건조하였다. 이후, ¹H-NMR 분광계 (AVANCE-400 MHz, Bruker, Germany)를 사용하여 HA로부터 oHA의 합성 여부를 확인하였다. 그 결과, ¹H-NMR 스펙트럼에서 5.0 ppm에서 3개의 피크가 관찰되었으며, 이는 oHA의 알데히드기를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 또한, oHA 내 알데히드기의 양을 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산(Trinitrobenzene sulfonate, TNBS)을 이용하여 정량화하였다. 그 결과, oHA가 약 30%(29.3±2.3%)를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 분자량 1,000 kDa의 HA를 산화하였을 때, 분자량 300 kDa의 oHA가 형성됨을 알 수 있다.

글리콜 키토산(glycol chitosan, gC) (Sigma-Aldrich, 미국) 0.2g을 DW 10 ㎖에 용해하고 상기와 같은 방법으로 정제하여 gC 2%(w/v) 용액을 제조하였다. 한편, 구입한 gC의 중합도 2,000이므로, gC 중합체의 분자량은 중합도(=2,000) x gC 단일 유닛의 분자량(=173)이므로, 346,000이다. 이를 2% (w/v)로 사용하였으므로, 사용된 gC 중합체의 분자량은 6,920 Da 이다.

따라서, 1000 mL의 겔을 만든다 가정했을 때, 2%(w/v) gC와 3%(w/v) oHA를 9:1의 비율로 혼합한다고 하면, gC 분자량은 0.02 x 346,000 x 900 = 6,228,000 Da이고, oHA 분자량은 0.03 x 100 x 300,000 = 900,000 Da이다.

제조예 2. 우르소데옥시콜산을 포함하는 금 나노입자의 제조

염화금산(Chloroauric acid, HAuCl₄) 분말(Sigma-Aldrich, 미국) 136 ㎎을 DW 800 mL에 용해하고, 트리소듐 시트레이트(trisodium citrate) 분말 (Sigma-Aldrich, 미국) 300 ㎎을 DW 15 mL에 용해하였다. 이후, HAuCl₄ 용액을 110 ℃에서 환류하고, 트리소듐 시트레이트 용액을 빠르게 첨가하여 금 나노입자(gold nanoparticle, GNP) 용액을 제조하였다. 이후, 금 나노입자 용액 500mL에 모노 머캅토 베타시클로덱스트린(Mono mercapto beta cyclodextrin, SH-β-CD) (Zhiyuan Biotechnology, 중국) 9.2mg를 첨가하고 24시간 동안 격렬하게 교반하여 GNP-S 결합(GNP-s-CD)을 형성하였다. GNP-s-CD 용액에 폴리에틸렌글리콜-SH (Polyethylene glycol, PEG)-SH (MW: 2000 g/mol) (SunBio, 한국) 9.5mg를 첨가하고 24시간 동안 격렬하게 교반하여 PEG-s-GNP-s-CD를 형성하였다. 이후, PEG-s-GNP-s-CD 용액을 원심 분리하고 침전물을 DW로 3회 세척하였다. 이어서, 셀룰로오스 막으로 투석하여 7일 동안 비공액 SH-β-CD 및 PEG-SH를 제거하였다. 이후, 우르소데옥시콜산 (ursodeoxycholic acid, UDCA) (MW: 392.58 g/mol) (Tokyo Chemical Industry Co., 일본) 40 mg을 DMSO 50.9 mL에 용해시켜 2 mM의 UDCA 용액을 형성하였다. UDCA 용액 100 μL을 PEG-s-GNP-s-CD 900 μL 용액에 첨가한 후, 5 분 동안 초음파 처리하고 15 분 동안 13,000 rpm에서 원심분리 하였다. 침전물을 새로운 DW로 3회 세척하고 UDCA 침전물을 함유한 GNP(1.45 nM)를 4℃에서 보관하였다.

[실시예]

실시예 1. 금 나노입자를 함유하는 하이드로겔의 제조

상기 제조예 1에서 제조한 gC 2%(w/v) 및 oHA 3%(w/v)를 DPBS(Gibco, 미국)에 용해시키고 13,000 rpm에서 30초 동안 원심 분리하여 기포를 제거한 후 하이드로겔(CHA 겔)을 제조하여 -20℃에서 보관하였다. 푸리에 변형 적외선 분광법을 이용하여 하이드로겔 내 가교 결합의 형성을 확인하였다. 그 결과, 1456 ㎝^-1에서 흡수 피크가 관찰되어 oHA의 알데히드기 및 gC의 아미노기가 아민 결합을 형성함을 알 수 있었다. 이후, 상기 제조예 2에서 제조한 GNP를 gC 2%(w/v)와 혼합한 후, oHA 3%(w/v)와 가교 결합하여 금 나노입자를 함유하는 하이드로겔(CHA-GNP 겔)을 형성하였다.

실시예 2. 점도, 유변학적 및 생분해 특성 확인

2-1. 점도 특성

일 양상에 따른 하이드로겔의 점도를 최적화하기 위한 GNP를 포함하거나 포함하지 않는 gC 2%(w/v) 및 oHA 3%(w/v)의 부피비를 조사하였다. 구체적으로, 상기 gC 2%(w/v) 및 oHA 3%(w/v)를 7:3, 8:2 또는 9:1의 부피비로 혼합하여 총 부피가 300 μL가 되도록 하이드로겔(CHA 겔 및 CHA-GNP 겔)을 제조하였다. 이후, 제조된 하이드로겔을 28 게이지(G) 바늘에 통과시킨 뒤 페트리 접시에 부드럽게 떼어 내었다. 하이드로겔을 -80℃에서 24시간 동안 동결시키고 2일 동안 감압 하에 동결 건조하고, 10K 배율로 SEM 이미지를 획득하였다.

도 2는 주사제로 적합한 하이드로겔의 형성 여부를 SEM으로 확인한 사진이다. 도 2에 나타난 바와 같이, 모든 부피비의 하이드로겔은 혼합 후 1분 이내에 용액으로부터 겔이 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, GNP를 포함하지 않는 gC 및 oHA가 각각 7:3 또는 8:2로 혼합된 CHA 겔의 경우, 기공의 크기가 비교적 불규칙하며, 점도가 1,500 Pa를 초과하여 28G 바늘을 통과할 수 없었다. 반면, GNP를 포함하지 않는 gC 및 oHA가 각각 9:1로 혼합된 CHA-GNP 겔의 경우, 28G 바늘을 통과하는 것을 확인할 수 있었다.

2-2. 유변학적 특성

일 양상에 따른 하이드로겔의 유변학적 특성을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2-1과 동일한 gC 및 oHA의 부피비로 하여, 직경 12㎜, 높이 55㎜의 실린터 형태의 하이드로겔(CHA 겔 및 CHA-GNP 겔) 300μL을 제조하였다. 이후, 8.1 변형률%에 도달할 때까지 2㎜/분의 압축률로 Rotating rheometer (AR-G2, TA Instruments, 미국)를 사용하여 변형-의존 저장 모듈러스(G') 및 손실 모듈러스(G")를 측정하였다.

도 3은 일 양상에 따른 하이드로겔의 유변학적 특성을 확인한 그래프이다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, gC 및 oHA가 각각 7:3, 8:2 및 9:1의 부피비로 혼합된 CHA 겔의 경우, G'는 2841.6±105.3 Pa, 1570.7±45.0 Pa 및 493.9±28.1 Pa의 순서로 감소하였다. 반면, GNP를 함유한 gC 및 oHA가 9:1의 부피비로 혼합된 CHA-GNP 겔의 경우, 576.5±5.4 Pa를 나타내어 CHA 겔과 비교하여 G'가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, gC 및 oHA가 각각 7:3, 8:2 및 9:1의 부피비로 혼합된 CHA 겔의 경우, G˝는 116.4±11.7 Pa, 56.6±3.3 Pa 및 25.4 Pa의 순서로 감소하였다. 또한, GNP를 함유한 gC 및 oHA가 9:1의 부피비로 혼합된 CHA-GNP 겔의 경우, 20.4±1.7 Pa를 나타내었다.

2-3. 생분해 특성

하이드로겔의 가수분해율을 측정함으로써 생분해성을 확인하였다. 구체적으로, GNP를 포함하거나 포함하지 않는 gC 및 oHA를 각각 9:1의 부피비로 하여 하이드로겔(CHA 겔 및 CHA-GNP 겔) 400μL을 제조한 후 각각의 하이드로겔을 DPBS(pH 7.4 또는 pH 6.4) 3mL에 담갔다(n=3). 이후, 37℃에서 14일 동안 상기 하이드로겔을 100RPM 인큐베이터에서 배양하면서, DPBS를 이틀마다 교체하였다. 미리 결정된 시점(1h, 1d, 3d, 7d 또는 14d)에서, 각 하이드로겔의 무게를 재고, 남아있는 하이드로겔의 무게를 하기 수학식을 사용하여 각 시점에서 계산하였다.

[수학식]

남은 젤의 % = (W_p / W_o) × 100,

여기서 W_p는 미리 결정된 시점에서의 가중치이고 W_o는 초기 가중치이다.

도 4는 일 양상에 따른 하이드로겔의 부피 변화를 확인한 그래프이다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, CHA 및 CHA-GNP 겔은 초기 질량에 비해 거의 부풀어오르지 않는 것을 확인할 수 있었다. CHA 겔의 경우, 1시간 동안 각각 103.6±0.8%(pH 7.4) 및 102.7±0.4%(pH 6.4)로 약간 증가하였고, CHA-GNP 겔의 경우, pH 7.4 및 pH 6.4에서 각각 103.1±0.6%, 102.5±0.7%로 약간 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그 후, 각 하이드로겔의 질량%는 14일 동안 지속적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

즉, 일 양상에 따른 하이드로겔은 생체 내에서 가수분해됨에 따라 손상 부위의 치료를 위한 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.

실시예 3. 세포 생존율

일 양상에 따른 하이드로겔의 세포독성을 평가하였다. 먼저, NIH-3T3 세포(ATCC, 미국) 10% 태아 소 혈청 (FBS, GIBCO) 및 1% 페니실린-스트렙토 마이신이 보충된 DMEM(Invitrogen, USA)로 구성된 성장 배지(GM)에서 배양하였다. 이후, NIH-3T3 세포(2 x 10⁵)를 GNP를 포함하거나 포함하지 않는 gC 2%(w/v)용액 90μL에 분주하고 oHA 3%(w/v) 10μL과 혼합하여 하이드로겔(CHA 및 CHA-GNP 겔)을 형성하였다(n = 5). 이후, 48-웰 배양 플레이트에 상기 세포를 함유하는 하이드로겔을 분주하고, 1-2일 동안 성장배지와 함께 인큐베이션 하였다. 상기 하이드로겔(n = 4)을 세포 생존력 분석 키트(EZ-Cytox, Daeil Labservice, Korea)를 이용하여 세포 독성을 시험하였으며, 상기 하이드로겔을 Alexa Fluor 488 phalloidin으로 염색하여 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM 880, 독일)으로 관찰하였다.

도 5a는 세포 내에 함입된 하이드로겔을 24시간 내지 48시간 동안 형광 이미지로 관찰한 사진이고, 도 5b는 일 양상에 따른 하이드로겔에서의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.

그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, CHA 겔 및 CHA-GNP 겔 내 세포수는 24시간에 비하여 48시간에 증가하였다. 또한, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 24시간 및 48시간에서 계산한 CHA 겔 그룹에서의 세포 생존율은 각각 100±9.8% 및 146.7±12.8%이고, CHA-GNP 겔 그룹에서의 세포 생존율은 각각 113.3±3.9% 및 161.7±9.3%를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

즉, 일 양상에 따른 하이드로겔은 세포 독성을 나타내지 않는 바, 생체적합성이 뛰어난 것을 알 수 있다.

실시예 4. In vivo 실험

4-1. 실험동물의 준비

다 자란 암컷 Sprague-Dawley (SD) 랫트(210-240g) (Orient Bio Inc., 한국) 81 마리를 습도 55-65% 및 온도 24±3℃에서 12시간의 명/암 주기로 수용하였다. 랫트는 물/음식에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다. 이후, 상기 랫트의 복강 내 Rompun®㎎/㎏, Bayer, 한국)/Zoletil®(50 mg/㎏, Virbac Laboratories, 프랑스) 용액를 투여하여 마취시키고 마취된 랫트의 아홉 번째 흉부(T9) 척수 분절을 라미노 절제술에 의해 노출시켰다. 공지된 방법으로 T7 및 T11 극돌기(spinous process)에서 척추를 Allis 클램프로 지지하여 안정화하였다. 이후, 50g의 금속 임파운더(impounder)를 5분 동안 T9 경막(dura) 상에 부드럽게 도포하여 적당한 중량 압축을 유도하여 손상시켰다.

모든 외과적 개입과 수술 후 동물 관리 절차는 CHA University (IACUC180146)의 기관 동물 관리 및 사용위원회(IACUC)에서 제공한 설치류 생존 수술에 대한 지침 및 정책과 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드(National Institutes of Health (NIH), 미국)에 따라 수행되었다.

4-2. 근적외선 조사 후 병변의 온도 확인

근적외선(Near-infrared, NIR) 조사를 이용한 열 요법은 주로 종양을 치료하는 데 널리 사용되어 왔다. 따라서, 일 양상에 따른 하이드로겔의 NIR에 의한 치료 효과를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 4-1에서 척수를 손상시킨 랫트 9 마리에 대하여 손상 후 1분 이내에, 손상된 척수의 병변 중심의 경막에서 2.5㎜의 깊이로 28G 바늘을 삽입하고 10초 동안 그대로 두었다. 그런 다음, 바늘을 경막으로부터 0.5㎜까지 수축시키고 DPBS(n=3), 상기 실시예 2-1과 동일하게 GNP를 포함하거나 포함하지 않은 gC 및 oHA를 9:1의 부피비로 혼합한 CHA 겔(n=3) 또는 CHA-GNP 겔(n=3) 8 ㎕을 각각 120초 동안 주사한 후, 누출을 방지하기 위해 바늘을 20초 동안 제자리에 그대로 두었다. 이후, 수술 부위를 봉합하고, NIR 레이저(분말 밀도: 2 W/㎠, 모델: FC-W-808㎚, Changchun New Industries Optoelectronics Technology, 중국)로 5분간 조사하고, 하루에 한 번씩 5일 동안 수행하였다. 손상 후 1, 3 및 5일(the day after injury, DPI)에 적외선 카메라(FLIR ONE PRO, FLIR Systems, Inc., OR, 미국)로 열 영상을 획득하고, 병변의 온도를 측정하였다.

도 6a는 척수 손상(SCI) 랫트에 하이드로겔을 주사하고 NIR을 조사한 후, 병변 부위의 온도를 적외선 카메라로 촬영한 사진이고, 도 6b는 척수 손상(SCI) 랫트에 하이드로겔을 주사하고 NIR을 조사한 후, 병변 부위의 온도 변화를 나타낸 그래프이다.

그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, DPBS를 주사한 그룹의 온도는 5 일째에 37.3±1.5를 나타내었고, CHA 겔을 주사한 그룹의 온도는 37.2±1.3℃(1 DPI), 39.8±1.6℃(3 DPI), 39.1±1.4℃(5 DPI)를 나타냈으며, CHA-GNP 겔을 주사한 그룹의 온도는 44.5±1.7℃(1 DPI), 48.7±1.3℃(3 DPI) 및 47.5±1.8℃(5 DPI)를 나타냈다. 한편, 적외선 조사 전 병변의 온도는 30.4±0.3℃로, 세 그룹 중 CHA-GNP 겔을 주사한 그룹에서 병변의 온도가 가장 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다.

4-3. 운동기능 회복 평가

일 양상에 따른 하이드로겔이 손상된 척수의 운동기능을 회복시키는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 4-1에서 척수를 손상시킨 랫트 72 마리를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 4-2와 동일한 방법으로 DPBS(n=18), 상기 실시예 2-1과 동일하게 GNP를 포함하거나 포함하지 않은 gC 및 oHA를 9:1의 부피비로 혼합한 CHA 겔(n=18) 또는 CHA-GNP 겔(n=36) 8 ㎕을 각각 주사하였다. 이후, CHA-GNP 겔을 주입한 18마리에 대하여 상기 실시예 4-2와 동일한 방법으로 NIR 레이저를 조사한 후, 그룹당 3 마리의 랫트를 무작위로 선정하여 손상 후 1, 2, 4, 7, 10 및 14일 째에 뒷다리 운동 기능 회복 여부를 평가하였다. 구체적으로, 실험 조건을 모르는 2명의 숙련된 조사관이 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB) 척도로 행동 점수를 평가하였다.

도 7은 척수 손상(SCI) 랫트에 하이드로겔을 주사한 후 운동 기능 회복 여부를 Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) 척도로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 4개의 그룹에서 평균 점수는 14일 동안 증가하는 양상을 나타냈다. 구체적으로, CHA-GNP 겔을 주사한 후 NIR를 조사한 그룹은 7, 10 및 14일 째에 각각 9.6±1.4, 14.2±1.2 및 16.2±0.8을 나타냈고 NIR을 조사하지 않은 그룹은 각각 6.7±1.5, 9.2±1.9 및 10.8±1.7을 나타냈다. 즉, NIR을 조사함으로써 CHA-GNP 겔의 운동기능 회복이 개선된 것을 알 수 있다.

4-4. 신경 염증 억제 효과

일 양상에 따른 하이드로겔이 손상된 척수에서 신경 염증을 억제할 수 있는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 4-3의 랫트에 대하여 각 그룹당 3 마리의 랫트를 손상 후 1, 4, 및 14일에 희생하였다. 이후, 병변 진원지를 포함하여 척수 세그먼트(10㎜)를 수집하고, DPBS로 세척한 후 4℃에서 보관하였다. 이어서, 1x RIPA 용해 완충제(Sigma)에서 완전히 균질화 시켰다. 이를 4 ℃, 13,000 rpm에서 15분 동안 원심 분리하고 상청액을 제거하였다. 이 세정 공정을 4회 반복했다. 조직 용해물의 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Thermo Scientific, IL)에 의해 보정되었다. 이후, 웨스턴 블랏으로 JNK, ERK 및 p38의 인산화 여부를 확인하고, ELISA로 TNF-α 및 IL-1β의 발현 수준을 측정하였다.

도 8a는 손상된 척수에 하이드로겔을 주사한 후 JNK, ERK 및 p38의 인산화를 확인한 결과이다.

그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이, CHA 겔 또는 CHA-GNP 겔의 주사에 의해 손상된 척수에서 JNK, ERK 및 p38의 인산화가 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

도 8b는 손상된 척수에 하이드로겔을 조사한 후 TNF-α 및 IL-1β의 발현 수준을 나타낸 그래프이다.

그 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이, TNF-α와 IL-1β의 발현 수준은 DPBS을 주사한 그룹과 비교하여 CHA-GNP 겔을 주사한 후, NIR을 조사한 그룹에서 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 일 양사에 따른 하이드로겔은 손상된 척수에서 JNK, ERK, p38의 인산화를 억제하고 염증성 사이토카인, 예를 들어, TNF-α 및 IL-1β의 수준을 감소시키는 바 손상된 척수에서의 신경 염증을 억제할 수 있다.

4-5. 손상된 조직의 회복 효과

일 양상에 따른 하이드로겔이 손상된 조직의 회복을 촉진하는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 4-4와 동일한 방법으로 그룹당 3 마리의 랫트를 희생하였다. 이후, 4% PFA에 이어 식염수를 랫트에 심근 관류하고 병변 진원지를 포함하여 주둥이 부분에서 꼬리 부분까지 세그먼트(10㎜)를 수집한 후, 4% PFA로 밤새 사후 고정하고, 파라핀으로 포매(embedded)한 뒤, 조직학적 분석을 위해 탈랍시켰다. 척수의 배측 축을 통한 일련의 종단면(두께 5㎛)을 랫트 당 150㎛(30일) 및 155㎛(31일) 길이로 수집하였다. 각 랫트에 대한 30 번째 섹션을 H&E 용액 (BBC Biochemical, 미국)으로 염색하고 분석하였다. 각 섹션에서 가장 심각하게 손상된 척수 부위를 관심 영역(ROI, 1500×1000 ㎛²)으로 지정하였다. H&E 염색된 조직의 형태 학적 변화는 광학 현미경 (Olympus IX71, 일본)을 사용하여 ×4(스케일 바: 500 ㎛) 및 ×10(스케일 바: 200 ㎛) 배율에서 관찰되었다. ROI로 지정된 사각형 영역은 100%를 나타낸다. 공동 조직 부피를 계산하고 ImageJ 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 정량화 하였다.

도 9는 손상된 척수의 H&E 염색 결과를 나타낸 사진이다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 4개의 그룹에서 공동(cavity)의 크기가 점차적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, CHA-GNP 겔을 주사한 후 NIR을 조사한 그룹에서 공동의 손상이 유의하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 손상 후 4일 째에 CHA-GNP 겔을 주사한 후 NIR을 조사한 그룹에서 현저한 회복을 보여주었다.

따라서, 일 양상에 따른 하이드로겔은 손상된 척수 조직의 회복을 촉진시키는 것을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

글리콜 키토산(glycol chitosan) 및 산화 히알루로네이트(oxidized hualuroninate)를 포함하고, 상기 글리콜 키토산 및 산화 히알루로네이트는 1 내지 10:1의 중량비로 혼합된 것인 하이드로겔.
청구항 1에 있어서, 상기 중량비는 3 내지 10: 1인 것인 하이드로겔.
청구항 1에 있어서, 금속 나노입자; 또는 금속 나노입자 및 상기 금속나노입자의 표면에 결합된 생리활성 물질을 더 포함하는 것인 하이드로겔.
청구항 1에 있어서, 상기 글리콜 키토산을 포함하는 용액 및 산화 상기 히알루로니네이트를 포함하는 용액은 1:10 내지 10:1의 부피비로 혼합된 것인 하이드로겔.
청구항 1에 있어서, 상기 하이드로겔은 300 내지 800 Pa의 저장 모듈러스(G') 또는 10 내지 40 Pa의 손실 모듈러스(G")를 갖는 것인 하이드로겔.
청구항 1에 있어서, 상기 글리콜 키토산 및 산화 히알루로네이트는 이민 결합을 형성하는 것인 하이드로겔.
청구항 1에 있어서, 상기 하이드로겔은 손상된 조직 부위에 직접 주사 가능한 것인 하이드로겔.
글리콜 키토산(glycol chitosan) 및 산화 히알루로네이트(oxidized hualuroninate)를 포함하고, 상기 글리콜 키토산 및 산화 히알루로네이트는 1 내지 10:1의 중량비로 혼합된 것인 하이드로겔; 및
생리활성 물질을 포함하는 손상된 조직 부위에 약물 전달을 위한 약물 전달체.
청구항 8에 있어서, 금속 나노입자를 더 포함하고, 상기 생리활성 물질은 금속 나노입자의 표면에 결합된 것인 약물 전달체.
청구항 1의 하이드로겔; 및 척수손상 치료제를 유효성분으로 포함하는 척수 손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 10에 있어서, 상기 척수 손상은 외상성 척수 손상, 척추 퇴행성 질환, 척추 염증성 질환, 척수 종양, 척추 종양, 척수 출혈, 뇌졸중, 골수 외 혈관 장애에 의한 척수 마비, 척수염, 다발성 경화증, 근위축성 측색경화증으로부터 선택된 것인 척수 손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 10에 있어서, 광열 치료를 위한 것인 척수 손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 10에 있어서, 금속 나노입자를 더 포함하고, 상기 척수손상 치료제는 금속 나노입자의 표면에 결합된 것인 척수 손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 10에 있어서, 상기 금속 나노입자는 금 나노입자이고, 상기 척수 손상 치료제는 우르소데옥시콜산인 것인 척수 손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.