CN115957180A - 一种包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的制备方法，包括以下步骤：第一步，将聚乙二醇400和聚乙二醇4000混合，加热至50‑80℃持续10‑30min，待自然冷却至40‑50℃时维持温度，向已经完全溶解的上述溶液中加入壳聚糖溶液，继续搅拌15～30min后停止加热，待溶液完全冷却至室温，超声；第二步，加入纳米金溶液搅拌；第三步，加入透明质酸钠溶液搅拌，获得所述包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶；该方法制备的凝胶是抗菌与组织修复一体化的软膏，制备工艺简单，原料廉价易得，不但具有优异的广谱抗菌性能，还具有显著的促组织修复功能。

Description

一种包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的制备方法与应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体地说，涉及一种包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的制备方法与应用。

背景技术

抗生素作为临床药物，促进了大范围抗生素抗性基因(ARG)的动员和水平转移到其它细菌物种中，特别是那些引起疾病的细菌(NatRevMicrobiol,2015,13,310-317)，这种不断的演变和积累增加了预防和治疗细菌感染的难度(NatRevMicrobiol,2021,20,257-269)，同时滋生了更多耐药菌和多药耐药菌的出现，极大的提高病患的发病率和死亡率，这使得抗生素治疗更具限制性。面对微生物耐药性的全球传播，以及新型抗生素研发成本的提高，使得非抗生素型抗菌剂成为治疗多重耐药(MDR)微生物引起的感染的一种有吸引力和有前途的替代方案(IntJAntimicrobAgents,2021,58,106380-106400)。

壳聚糖是一种天然聚合物，具有良好的生物降解性、生物相容性、无毒、抗菌活性、抗肿瘤、免疫增强、低成本等独特特性(Molecules,2021,26(12),3694-3710)，已被广泛研究用于许多领域。充分利用溶剂(甲酸、醋酸等有机酸溶液以及稀磷酸、稀盐酸等无机酸)使壳聚糖氨基质子化，和带负电荷的细菌细胞壁结合，导致细胞破裂，从而改变膜通透性，然后附着在DNA上，DNA复制受到抑制并随后导致细胞死亡的广谱抗菌机制(FunctionalChitosan,2020,457-489)，壳聚糖也成为非抗生素型的新型抗菌剂(Polymers(Basel),2021,13(6),904-924)。

金纳米粒子(AuNPs)具有尺寸可控、易于化学合成和修饰，对人类和动物细胞无毒等特性，当这种纳米材料被糖分子或多糖功能化时，它们被称为糖纳米颗粒，具有高效的抗菌活性(MaterialsScienceandEngineeringC,2016,69,366-372)；纳米金的使用避免了耐药性的产生，能有效且安全对抗多种病原微生物。此外，纳米金可以作为药物载体，有效增强化学稳定性以及对不同微生物的生物活性(MaterialsScience&EngineeringC,2019,96,693-707)。

多糖透明质酸(HA)是一种多功能、多态的糖胺聚糖，具有广泛的生物学功能。HA遍布全身，主要存在于皮肤中，因此在伤口愈合中起重要作用(IntWoundJ,2014,11(2),159-163)。透明质酸又叫做玻尿酸，而透明质酸的钠盐形式叫做透明质酸钠，属于一种功能化的化妆品原料，广泛应用于各类护肤品中。

公开号为CN114097788A的专利申请公开了一种类芬顿缓释抑菌水凝胶的制备方法，包括以下步骤：将天然高分子材料溶于溶剂中，先加入纳米金属氧化物并分散均匀，再加入过氧化物并分散均匀，最后加入铵盐和/或弱酸，搅拌混合，得到类芬顿缓释抑菌水凝胶；其中天然高分子材料、溶剂、纳米金属氧化物、过氧化物以及铵盐和/或弱酸的比例为0.1～1g：10～25mL：0.1～0.5g：0.01～0.5g：0.01g。优选的，所述天然高分子材料、溶剂、纳米金属氧化物、过氧化物以及铵盐和/或弱酸的比例为0.3g：20mL：0.25g：0.01～0.5g：0.01g。优选的，所述天然高分子材料为羧甲基纤维素钠、羧甲基壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸钠、琼脂糖和壳聚糖中至少一种。优选的，所述纳米金属氧化物为纳米氧化锌、纳米氧化钙、纳米氧化镁和纳米氧化铝中至少一种。优选的，所述过氧化物为过碳酸钠、过氧化脲、过氧化钙和过氧化氢中至少一种。优选的，所述铵盐为氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、过硫酸铵、柠檬酸铵和单宁酸铵中的至少一种。优选的，所述弱酸为硅酸、氢氰酸、次氯酸、酒石酸、柠檬酸、单宁酸、苹果酸、水杨酸、乙酸和松香中的一种。优选的，所述溶剂为水、乙醇和二甲基亚砜中的至少一种；更优选为水。优选的，所述纳米金属氧化物先加入溶剂中并于20～40Hz下超声分散2～3h，再将分散液加入到天然高分子材料溶液中，其中纳米金属氧化物和溶剂的比例为0.1～0.5g：5mL，所述溶剂与高分子溶液中的溶剂相同。

目前，针对细菌感染性的治疗，已经开发出各类单元或者多元复合体系，一般为壳聚糖抗菌凝胶类，纳米银抗菌喷雾类，阳离子抗菌剂类，抗生素类等这些传统的抗菌凝胶，一方面只是简单的物理混合，而且效果单一，易引起耐药性产生，很难有效针对细菌感染性疾病带来的难以愈合问题，另一方面，其广谱抗菌性能差，不能有效针对临床耐药性病原微生物，不能缓解老年患者的痛苦等方面的不足。

因此，业内亟需一种广谱抗菌性能强、温和无刺激，促愈合能力强的非抗生素型的抗菌愈合软膏。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的制备方法，该方法制备的凝胶是抗菌与组织修复一体化的软膏，制备工艺简单，原料廉价易得，不但具有优异的广谱抗菌性能，还具有显著的促组织修复功能，加快伤口感染创面的愈合，具有良好的生物相容性和水溶性，无皮肤刺激性和毒性，安全有效。

本发明的第二目的是提供一种所述方法制备的复合凝胶在制备抗菌的药物、促组织修复的药物、促伤口愈合的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一方面提供了一种包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的制备方法，包括以下步骤：

第一步，将质量比为1:(0.1～10)的聚乙二醇400和聚乙二醇4000混合，加热至50-80℃持续10-30min，待自然冷却至40-50℃时维持温度，向已经完全溶解的上述溶液中加入壳聚糖溶液，继续搅拌15～30min后停止加热，待溶液完全冷却至室温，超声10～30min；

第二步，加入纳米金溶液搅拌10～30min；

第三步，加入透明质酸钠溶液搅拌10～30min，获得所述包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶。

所述壳聚糖的脱乙酰度>50％、>80％、>85％、>90％、>95％；所述壳聚糖的分子量选自1000Da、＞3000Da、>10000Da、>10²KDa、>10³KDa，>10⁴Kda；所述壳聚糖的黏度选自50-800Pa·s(优选为50-100Pa·s、100-200Pa·s、200-400Pa·s、400-800Pa·s)；所述壳聚糖溶液的浓度选自0.125-10mg/mL(优选为0.125、0.25、0.5、1、2、2.5、3、5、10mg/mL)。

所述壳聚糖是以蟹壳、虾壳、昆虫或微生物等生物资源提取的至少一种。

所述壳聚糖溶液是将壳聚糖溶解在pH＝3-5(优选为3、4、5)的酸性溶液中获得。

所述酸性溶液是将酸溶解于无菌水中配置获得，所述酸选自甲酸、乙酸、柠檬酸中的至少一种。

所述纳米金溶液的浓度为0.001-1mg/mL(优选为0.001、0.01、0.02、0.03、0.04、0.1、0.5、1mg/mL)。

所述纳米金的粒径选自1-10nm。

所述透明质酸钠溶液(使用无菌水配置)的浓度选自0.0001-5mg/mL(优选为0.0001、0.001、0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5mg/mL)。

所述壳聚糖、纳米金、透明质酸钠的质量比为(250～50000):(1～200):1(优选为2500:100:1)。

所述壳聚糖和聚乙二醇400质量比为(0.001-1):1(优选为0.0035:1、0.007:1、0.014:1)。

所述聚乙二醇400和聚乙二醇4000的配比可以调节体系的粘度。

所述包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶中，各成分的浓度为：壳聚糖溶液的浓度选自0.125-10mg/mL(优选为0.125、0.25、0.5、1、2、5、10mg/mL)，纳米金溶液的浓度为0.001-1mg/mL(优选为0.001、0.01、0.02、0.03、0.04、0.08、0.1、0.5、1)，透明质酸钠溶液的浓度选自0.0001-5mg/mL(优选为0.0001、0.0002、0.0004、0.0008、0.001、0.01、0.1、0.5、1、2、3、4、5mg/mL)。

本发明的第二方面提供了一种所述方法制备的复合凝胶在制备抗菌的药物、促组织修复的药物、促伤口愈合的药物中的应用。

所述抗菌的药物中的细菌选耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(ATCC43300)、绿脓杆菌(ATCC27853)、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA,CMCC26003)、大肠杆菌(ATCC25922)、耐万古霉素粪肠球菌VRE(ATCC51299)、肺炎克雷伯菌(ATCC13883)、万古霉素敏感粪肠球菌VSE(ATCC21922)、表皮葡萄球菌(CMCC26069)、氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA,ATCC25923)、丙型溶血性链球菌(CMCC32206)，临床株选自：鲍曼不动杆菌(Ab1617)、铜绿假单胞菌(3887)。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明的方法将纳米金颗粒与壳聚糖通过静电作用结合产生协同抗菌效果，辅之以透明质酸进行多级自组装促进伤口愈合，形成三元复合体系，加入聚乙二醇辅料，成功构建了一款新的非抗生素型抗菌修复一体化材料，该产品巧妙地借助纳米材料协同天然聚糖分子实现了抗菌和促进组织修复功能，最大抑菌率超过90％，可使金黄色葡萄球菌感染的小鼠创伤缺口在14天内达到高于60％的愈合率，为临床细菌感染伤口的治疗提供了一款安全有效的产品，具有广阔的应用前景。

本发明方法制备的包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶，原料廉价易得，操作简便，对设备和反应条件要求不高，能满足日后的规模化生产需求，临床实用性强，促进伤口表皮细胞的增殖分化，协同作用，效果更佳。

本发明的抗菌机理在于脱乙酰化的壳聚糖和羧基修饰的纳米金，通过静电作用结合的复合体系具有正电性，纳米金作为载体有效提高了壳聚糖与细菌表面的接触，促使复合材料吸附在细菌表面阻碍细菌与外界的物质交换，同时部分复合材料渗透进细菌体内，并在细胞质内发生絮凝作用，扰乱正常的生理活动从而杀灭细菌。

本发明产品经过抗菌实验和动物实验以及安全性评价验证，抗菌性能评价结果表示该产品具有广谱抗菌性能，最大抑菌率超过90％，动物实验表明，本发明的凝胶可使金黄色葡萄球菌感染的小鼠创伤缺口在14天内达到高于60％的愈合率。此外，对上述三元复配的凝胶进行了包括体外细胞毒性、皮下刺激、皮肤致敏、组织病理学和血液毒的系统性安全性评价，结果均符合医疗器械生物学安全评价标准(GB/T16886)，证明本发明构建的凝胶安全有效，可以被用于细菌感染性伤口，糖尿病足等促愈合，抗菌的病情。

附图说明

图1为包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的Zeta电势、TEM、DLS表征示意图。

图2为包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的伤口创面愈合效果示意图。

图3为包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的体外细胞毒性示意图。

图4为包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的皮肤刺激与致敏性实验示意图。

图5为不同粘度壳聚糖抗菌活性以及随浓度变化的抗菌性能示意图。

图6为不同浓度纳米金对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的抗菌性能示意图。

图7为包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶体系构建的示意图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

本发明实施例涉及到的原料均为商业购买，均为化妆品级别和医药级别。

本发明实施例中壳聚糖是以蟹壳、虾壳、昆虫或微生物等生物资源提取的至少一种。

实施例1

制备总体积约50mL的包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶，采用脱乙酰度>95％，分子量＞10²KDa，黏度200-400Pa·s的壳聚糖。如图7所示，图7为包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶体系构建的示意图。

1)将0.32mL医用级乙酸加入100mL无菌水中，得到pH＝3的乙酸溶液。使用该乙酸溶液为溶剂，配制浓度为5mg/mL的壳聚糖溶液，磁子搅拌一夜，使其充分溶解。

2)使用无菌水配制10mL浓度为0.1mg/mL的透明质酸钠溶液备用。购买的纳米金(1-10nm)(溶剂是柠檬酸溶液)的浓度为1mg/mL；

3)将质量比为1：3(m/m)的PEG400(7g)和PEG4000(21g)加入锥形瓶中，机械搅拌，水浴加热至65℃持续15min；

4)待自然冷却至50℃时维持温度，向已经完全溶解的上述溶液中加入浓度为5mg/mL的壳聚糖溶液10mL，继续搅拌15min后停止加热，待溶液完全冷却至室温，超声30min；

5)加入浓度为1mg/mL的纳米金2mL，机械搅拌30min；

6)缓慢加入浓度为0.1mg/mL的透明质酸钠溶液0.2mL，机械搅拌30min，获得所述包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶，红色粘稠状液体，其中各成分的浓度为：壳聚糖1mg/mL，纳米金0.04mg/mL，透明质酸钠0.0004mg/mL。总质量约40g，总体积约50mL。

实施例2

制备总体积约50mL的包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶，采用脱乙酰度>95％，分子量＞10²KDa，黏度200-400Pa·s的壳聚糖。

1)将0.32mL医用级乙酸加入100mL无菌水中，得到pH＝3的乙酸溶液。使用该乙酸溶液为溶剂，配制浓度为10mg/mL的壳聚糖溶液，磁子搅拌一夜，使其充分溶解。

2)使用无菌水配制10mL浓度为0.1mg/mL的透明质酸钠溶液备用。购买的纳米金(1-10nm)(溶剂是柠檬酸溶液)的浓度为1mg/mL；

3)将质量比为1：3(m/m)的PEG400(7g)和PEG4000(21g)加入锥形瓶中，机械搅拌，水浴加热至65℃持续15min；

4)待自然冷却至50℃时维持温度，向已经完全溶解的上述溶液中加入浓度为10mg/mL的壳聚糖溶液10mL，继续搅拌15min后停止加热，待溶液完全冷却至室温，超声30min；

5)加入浓度为1mg/mL的纳米金4mL，机械搅拌30min；

6)缓慢加入浓度为0.1mg/mL的透明质酸钠溶液0.4mL，机械搅拌30min，获得所述包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶，红色粘稠状液体，其中各成分的浓度为：壳聚糖2mg/mL，纳米金0.08mg/mL，透明质酸钠0.0008mg/mL。总质量约40g，总体积约50mL。

实施例3

制备总体积约50mL的包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶，采用脱乙酰度>95％，分子量＞10²KDa，黏度200-400Pa·s的壳聚糖。

1)将0.32mL医用级乙酸加入100mL无菌水中，得到pH＝3的乙酸溶液。使用该乙酸溶液为溶剂，配制浓度为2.5mg/mL的壳聚糖溶液，磁子搅拌一夜，使其充分溶解。

2)使用无菌水配制10mL浓度为0.1mg/mL的透明质酸钠溶液备用。购买的纳米金(1-10nm)(溶剂是柠檬酸溶液)的浓度为1mg/mL；

3)将质量比为1：3(m/m)的PEG400(7g)和PEG4000(21g)加入锥形瓶中，机械搅拌，水浴加热至65℃持续15min；

4)待自然冷却至50℃时维持温度，向已经完全溶解的上述溶液中加入浓度为2.5mg/mL的壳聚糖溶液10mL，继续搅拌15min后停止加热，待溶液完全冷却至室温，超声30min；

5)加入浓度为1mg/mL的纳米金1mL，机械搅拌30min；

6)缓慢加入浓度为0.1mg/mL的透明质酸钠溶液0.1mL，机械搅拌30min，获得所述包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶，红色粘稠状液体，其中各成分的浓度为：壳聚糖0.5mg/mL，纳米金0.02mg/mL，透明质酸钠0.0002mg/mL。总质量约40g，总体积约50mL。

实施例4

未调节聚乙二醇400和聚乙二醇4000的比例之前，以低于产品中各有效成分4倍的浓度(0.25mg/mL壳聚糖，0.01mg/mL纳米金，0.0001mg/mL透明质酸钠)制备成三元复合体系，做Zeta电势、TEM和DLS表征，如图1所示。图1为包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的Zeta电势、TEM、DLS表征示意图。

从图1中可以看出，a.zeta电势，b.TEM形貌变化，c.动态光散射测粒径；a图Zeta电势的结果表明，羧基修饰的金纳米颗粒带负电荷，而脱乙酰化的壳聚糖为正电，金纳米颗粒与壳聚糖组装后，会抵消掉一部分负电荷，最终显示正电性，这更有利于其在细菌表面的吸附。b图用透射电镜(TEM)进行的形貌表征表明，金纳米颗粒与壳聚糖之间存在明显的吸附关系，因为金纳米颗粒和壳聚糖总是同时重叠出现在视野中。尝试用动态光散射(DLS)测试组装前后的粒径变化，c中动态光散射测粒径结果可知，购置的纳米金直径在1-10nm，而经过多级组装后，复合物的粒径分布并不均匀，从0-1000nm不等，但是粒径普遍大于500nm，说明三元体系进行了成功地组装，同时也为后期抗菌机理的阐释提供了理论基础。

实施例5

将实施例1制备的包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶进行MRSA感染伤口的组织修复实验，具体方法：将实验小鼠适应环境饲养一周后，当日实验小鼠禁食，给小鼠背部剃毛，称重。以300mg/kg的比例腹腔注射10％水合氯醛麻醉。10min后小鼠进入麻醉状态，将脱毛膏均匀涂于小鼠背部，5min后用酒精棉球擦拭干净并消毒。无菌条件下，用记号笔在小鼠背部脊柱两侧点出边长为2cm的正方形痕迹，沿着痕迹减去全层皮肤，制得全层皮肤的损伤创面。随后在窗口表面包裹一层与创面面积相当的纱布，用胶带缠上，分组往纱布表面上滴加MRSA菌液(10⁸CFU/mL，100μL)。1h后细菌与创口接触充分，重新麻醉小鼠，分组添加材料，进行后续评价或治疗。

将25-27g的BALB-C雄鼠分成10组，每组一笼，每组3只。一般按体重的0.5％注射质量分数为5％的水合氯醛进行麻醉，每只小鼠腹腔注射180μL水合氯醛，约10min后小鼠进入麻醉状态。使用剃毛器对小鼠背部进行剃毛处理，然后均匀涂抹一层脱毛膏，稍等片刻后，用干湿纸巾交替擦拭背部，去除脱毛膏和残余的被毛。使用面积为1cm²的圆形模具在小鼠背部做好标记，再用手术刀和镊子剪下标记区域的皮肤，尽量得到面积相同的皮肤缺损创面。

第二天，重新麻醉，第1-10组小鼠创面涂布10⁸CFU/mL的金黄色葡萄球菌ATCC43300，使细菌与创伤面充分接触。第三天取材，用蘸有PBS的棉签均匀接触小鼠创面，将棉棒部分折断一起放入装有1mLPBS的PC管中，振摇均匀，稀释50倍后，取100μL在无菌超净台上进行涂板，涂板结束后晾干倒置，37℃孵育12h观察菌落数。取材结束后，除第1组空白对照外，将其余9组分别在小鼠创伤面涂布9种不同样品(分别是乙酸溶剂，阳性对照抗生素，透明质酸，纳米金，壳聚糖，透明质酸钠和纳米金复合体系，纳米金和壳聚糖复合体系，壳聚糖和透明质酸钠复合体系，实施例1制备的包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶)，分别在第3，5，8，11，14天取材、涂抹样品治疗，记录伤口处细菌数量变化和缺损创面面积变化，观察治疗效果。

结果如图2所示，图2为包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的伤口创面愈合效果示意图；上图为不同时间小鼠的愈合效果以及表皮菌落的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌效果示意图，下图是伤口愈合率的示意图。图2中上图是不同组分处理后的小鼠创口，在1-14天的大体照，以及对应的伤口表面的菌落数，实验结果证明，包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶具有较好的协同愈合能力以及较好的抗菌性能，多组分的协同效果，不仅提高了抗菌能力，也增加了愈合的效果；下图是使用imageJ软件对小鼠创口的愈合率统计分析结果示意图，证明包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶对伤口愈合能力达到60％，比空白组提高了30％，包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶具有较好的愈合能力。从第1天至第14天，小鼠伤口经过实施例1制备的包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的持续治疗，伤口愈合率超过60％，远超空白对照组和其余实验组，作为一种廉价、简便易制的良好抗菌与修复一体化的材料，具有广阔的临床应用前景。

实施例6

将实施例1制备的包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶进行体外细胞毒性实验，结果如图3所示，图3为包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的体外细胞毒性示意图。

小鼠成纤维细胞(L-929)接板密度为12w/mL，不同浓度材料与细胞孵育48h，先测一下加CellCountingKit-8(CCK-8)细胞计数试剂CCK-8之前的本底，再加入CCK-8，10μL/孔，孵育1.5h后读450nm处吸光度(处理数据时用终值减去本底，所得OD值与细胞活力成正比)。实验结果如图3中左图所示，对于单一壳聚糖组分而言，细胞毒性随其浓度的增大而增大，其浓度为1.25mg/mL时，细胞存活率50％，而当浓度大于1.25mg/mL时，细胞毒性显著增强，到达不可接受范围。从图3右图中1、2、3分别代表复合体系稀释32倍、16倍、8倍，不同浓度的复合材料CS/AuNPs/HA(0.625，1.25，2.5mg/mL/；25，50，100μg/mL；0.00025，0.0005，0.001mg/mL)，可以看出，当复合体系稀释16倍(CS1.25mg/mL，AuNPs50μg/mL，HA0.0005mg/mL)时，细胞存活率超过50％。根据《GB/T14233.2-2005》，供试品的细胞毒性等级应不大于2级才合格，即细胞存活率在50％以上，因此，实施例1制备的包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶中各成分浓度为CS0.25mg/mL，AuNPs10μg/mL，HA0.0001mg/mL，既能保证良好的抗菌愈合效果，又能使细胞毒性在可接受的范围。

实施例7

将实施例1制备的包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶进行皮肤刺激和致敏性实验，结果如图4所示。图4为包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的皮肤刺激与致敏性实验示意图。

将190-210gSD系雄性大鼠分为4组，皮下注射阳性对照(弗氏完全佐剂)设置3只大鼠，分别命名1、2、3号，皮下注射刺激实验设置3只大鼠，分别命名4号(低浓度：CS0.25mg/mL，AuNPs10μg/mL，HA0.0001mg/mL)、5号(中浓度：CS1mg/mL，AuNPs40μg/mL，HA0.0004mg/mL)、6号(高浓度：CS2mg/mL，AuNPs80μg/mL，HA0.0008mg/mL)，产品涂抹致敏实验设置为7号大鼠，产品涂抹阳性对照(2,4-二硝基氟苯)设置2只大鼠，分别命名8、9号。

根据《GB/T16886.10-2017》中的“皮肤反应记分系统”和“皮内反应记分系统”，无红斑时刺激记分0分，极轻微红斑(勉强可见)记分1分，清晰红斑记分2分，中度红斑记分3分，重度红斑(紫红色)至无法进行红斑分级的焦痂形成记分4分。1、2、3号阳性对照组的大鼠背部脊柱两侧皮肤均出现中度或重度红斑(大于2分)，这可能因为在脊柱右侧3个刺激区域注射弗氏完全佐剂后，该刺激物进入大鼠内环境，参与了背部的血液循环，导致背部刺激的扩散，引起整片红斑。凡是经皮下注射的大鼠，在注射点周围约2mm²区域均会出现小鼓包，但是第二天会随代谢而消失，属于正常现象，第一天由于大鼠脱毛会对背部皮肤产生轻微影响，因此第一天的皮肤可能会出现发红现象，不作为红斑考量和评分。

实验组中皮下注射3种不同浓度产品的大鼠皮肤4-5天中均无红斑产生，同样地，7号涂抹实验组的大鼠皮肤无红斑产生，脊柱左右两侧皮肤状况一致，记分不大于1分，符合要求。从8、9号皮肤涂抹的阳性对照组可以看出，其脊柱右侧区域产生清晰红斑、中度红斑和重度红斑，发生了明显的致敏反应，而脊柱左侧区域正常。4、5、9号大鼠第1天数据缺失是因为首次注射10％水合氯醛时，麻药剂量过大导致大鼠死亡，第2天采用其它健康大鼠进行同步实验，该实验时间、过程和结果均符合医疗器械生物学评价的国家标准。

实施例8

文献报道，壳聚糖的乙酰化程度越高，裸漏的氨基水平高，在酸性环境中，氨基质子化，抗菌性能高，采购市面上相对高的脱乙酰度的壳聚糖，商业化的壳聚糖，一般不测分子量，以粘度为单位，其粘度高，其分子量越大，但粘度过高，溶解性降低，选择不同粘度的壳聚糖的抗菌性能，壳聚糖浓度越高，抗菌性能越好，可以做协同优化。

图5为不同粘度壳聚糖抗菌活性以及随浓度变化的抗菌性能示意图。图5中，上面两个图是不同粘度壳聚糖对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的抗菌效果示意图，下面两个图是CS3随浓度变化对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的抗菌性能示意图。从上面两个图中可以看出，不同壳聚糖分别为CS1粘度50-100Pa.s，CS2粘度100-200Pa.s，CS3粘度200-400Pa.s，CS4粘度400-800Pa.s，CS5分子量小于3000Da，实验证明CS3的性能较好，这可能是由于粘度高分子量大，裸漏的氨基更多，抗菌性能高，而粘度再增大，限制了其溶解的含量，导致活性减弱。从下面两个图中可以看出，抗菌性能随CS3的浓度不断增加，CS3可以作为活性抗菌的优选体系。

本发明中采用不同溶剂溶解情况不同，抗菌性能不同，具体表现，柠檬酸酸性弱，溶解能力差，调节较高pH才能溶解壳聚糖，酸性过高，影响壳聚糖生物应用，甲酸酸性强，可以作为溶剂参与壳聚糖应用，但甲酸不如乙酸温和，不利于后期临床前的生物应用。

本发明中采用纳米金作为体系的唯一纳米载体，具有新的抗菌机制，如图6所示，图6为不同浓度纳米金对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的抗菌性能示意图，但纳米金本身抗菌性能弱，实验证明，纳米金浓度增大，没有浓度依赖的抗菌性能，基于此，选择低浓度下的抗菌浓度，作为复合材料的组装体系，验证发挥协同增效的性能。

本发明中采用透明质酸钠的浓度如果偏高，会影响整体体系的状态，两种聚电解质在溶液中形成凝胶，本发明中采用的浓度可以使体系均匀，其余浓度能较好的应用，而且会增加伤口愈合的能力。

本发明中壳聚糖、纳米金、透明质酸钠的质量比，壳聚糖、纳米金、透明质酸钠的配比按照抗菌性能逐一优选，最后证明具有协同能力，实验证明，壳聚糖、纳米金、透明质酸钠的浓度配比能促进其协同抗菌性能，透明质酸钠浓度是降低体系出现的凝胶化而选取的最优浓度，本发明制备的凝胶是具有抗菌和愈合性能的凝胶，采取体外浓度为0.25mg/mL壳聚糖，0.01mg/mL纳米金，0.0001mg/mL透明质酸钠复合组分，表皮创口研究将扩大四倍体系，因为体外体内研究存在差异。

本发明中聚乙二醇400和聚乙二醇4000的不同比例会影响体系的粘度，本发明选择的聚乙二醇400和聚乙二醇4000的配比，能使产品较好的吸附在伤口之上，而聚乙二醇4000比例下降，浓度过稀，不利于凝胶产品的应用；增大聚乙二醇4000的比例，体系冷却后粘度会增加。

对比例1

申请号为202111249587.6的专利申请，发明名称为一种莫匹罗星软膏及其制备方法，以该发明的实施例1作为本发明的对比例1，具体如下：

将1g的柠檬酸溶解于391g的聚乙二醇400中，再加入98g的聚乙二醇4000，在60℃的水浴中加热至熔融，再加入10g的莫匹罗星，在60℃的水浴中搅拌使莫匹罗星溶解，均匀混合，冷却至室温，即得莫匹罗星软膏。

制备的产品具有抗菌效果好，涂抹方便等优点，然而涉及抗生素的使用，抗生素的过度使用会诱发细菌耐药性，尤其是多重耐药菌的产生。

对比例2

以公开号CN114097788A的专利申请中实施例3作为本发明的对比例2，具体方法步骤如下：

(1)量取10ml二甲基亚砜，将0.5g壳聚糖溶于其中。

(2)将0.3g纳米氧化铝超声分散于5ml水中，再将纳米氧化铝分散液加入(1)溶液中。

(3)将0.01g过氧化脲超声分散于(2)溶液中。

(4)将0.01g硝酸铵溶于(3)溶液中。

(5)以500r/min的转速搅拌以上溶液，得到一种类芬顿缓释水凝胶。

本发明制备的是新型的抗菌凝胶，该复合体系具有较高的协同抑菌效果，不仅测试了对多种不同革兰氏阳性菌和阴性菌的抗菌性能，展现出广谱抗菌能力，而且生物相容性和有效性均被验证，通过小鼠表皮的治疗以及产品敏感性和刺激性测试，均验证该复合凝胶具有较高的生物相容性和有效性，可以有效被应用于临床研究。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (10)

1.一种包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，将质量比为1:(0.1～10)的聚乙二醇400和聚乙二醇4000混合，加热至50-80℃持续10-30min，待自然冷却至40-50℃时维持温度，向已经完全溶解的上述溶液中加入壳聚糖溶液，继续搅拌15～30min后停止加热，待溶液完全冷却至室温，超声10～30min；

第二步，加入纳米金溶液搅拌10～30min；

第三步，加入透明质酸钠溶液搅拌10～30min，获得所述包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶；

所述壳聚糖溶液的浓度选自0.125-10mg/mL；

所述纳米金溶液的浓度为0.001-1mg/mL；

所述透明质酸钠溶液的浓度选自0.0001-5mg/mL；

所述壳聚糖、纳米金、透明质酸钠的质量比为(250～50000):(1～200):1。

2.根据权利要求1所述的包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖和聚乙二醇400质量比为(0.001-1):1。

3.根据权利要求1所述的包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖的脱乙酰度>50％、>80％、>85％、>90％、>95％。

4.根据权利要求1所述的包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖的分子量选自1000Da、＞3000Da、>10000Da、>10²KDa、>10³KDa，>10⁴Kda。

5.根据权利要求1所述的包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖的黏度选自50-800Pa·s。

6.根据权利要求1所述的包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液是将壳聚糖溶解在pH＝3-5的酸性溶液中获得。

7.根据权利要求6所述的包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述酸性溶液是将酸溶解于无菌水中配置获得，所述酸选自甲酸、乙酸、柠檬酸中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述纳米金的粒径选自1-10nm。

9.根据权利要求1所述的包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述包含壳聚糖、纳米金和透明质酸钠的复合凝胶中，各成分的浓度为：壳聚糖溶液的浓度选自0.125-10mg/mL，纳米金溶液的浓度为0.001-1mg/mL，透明质酸钠溶液的浓度选自0.0001-5mg/mL。

10.一种权利要求1至9任一项所述的方法制备的复合凝胶在制备抗菌的药物、促组织修复的药物、促伤口愈合的药物中的应用。

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