KR101435261B1 - 항암제-링커-알부민 결합체, 이의 제조방법 및 상기 결합체를 포함하는 약물 전달용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 친수성 알부민과, 하이드록시기를 갖는 소수성 항암제가 링커를 통해 결합되며, 수용액에서 자기 집합체(self-aggregate)를 형성하는 항암제-링커-알부민 결합체, 이의 약물전달 용도 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항암제-링커-알부민 결합체는 수계에서 자기집합체를 형성하여 암조직에 대한 선택성이 높을 뿐만 아니라, 약물을 장기간 지속적으로 방출할 수 있고, 또한 자기집합체의 내부에 항암제를 추가적으로 첨가하여 화학적 결합으로 제한되어 있는 약물 함유량을 늘릴 수 있기 때문에 암에 대한 항암화학요법에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항암제-링커-알부민 결합체, 이의 제조방법 및 상기 결합체를 포함하는 약물 전달용 조성물{Anticancer Agent-Linker-Albumin Conjugate, Preparation Method Thereof and Drug Delivery Composition Comprising the Conjugate}

본 발명은 친수성 알부민과, 하이드록시기를 갖는 소수성 항암제가 링커를 통해 결합되며, 수용액에서 자기 집합체(self-aggregate)를 형성하는 항암제-링커-알부민 결합체, 이의 약물전달 용도 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

알부민(albumin)은 혈액 내에서 20일 이상을 순환하는 매우 안정한 단백질로서 기존 저분자 화학약물, 단백질 또는 항체 등을 화학적으로 알부민에 결합시켜 다양한 약물의 생체내 안정성을 향상시키는 약물전달시스템(Drug Delivery System)으로 사용되고 있다. 대표적으로 소수성 항암제인 독소루비신(doxorubicin)(Clin. Cancer Res. 6, 120 suppl. 2000) 메토트렉사트(methotrexate)(MTX)(Anticancer Drugs 8, 835-844, 1997) 등이 화학적으로 알부민에 결합하여, 암 표적성을 향상시키고, 약물의 혈액내 안정성을 향상 시키는 연구가 진행되었다.

알부민을 이용한 약물 전달체는 알부민이 암 조직에 높은 표적성을 갖는 특성을 이용한 것이다. 알부민에 형광체를 붙이거나 방사선 동위원소를 붙여 암 조직을 갖는 소동물을 영상화하며, 많은 양의 알부민이 암 조직에 선택적으로 축적되는 것을 알 수가 있으며(Cancer Research 46, 6387-6392, 1986), 이는 암 조직 주변의 느슨한 혈관에서 발생하는 증진된 투과성 및 정체성(the enhanced permeability and retention; EPR) 효과에 의해서 나타나는 것을 알 수가 있다. 그러므로, 다양한 항암제, 단백질 또는 항체를 알부민에 화학적으로 결합하는 경우, 순수한 약물보다 혈액내에서 순환 시간이 증가하고, 특히 암 조직에서의 축적 효율이 우수한 결과들이 보고 되었다(Journal of Controlled Release, 132, 171-183, 2008).

그러나, 알부민에 항암제를 화학적으로 결합할 때, 항암제가 화학적으로 결합되어 항암제의 항암 효과가 감소하거나 알부민에서 항암제가 분해되는 메커니즘이 확실하게 규명되지 않기 때문에 다양한 항암제의 유도체가 발생하는 문제가 있으며, 알부민의 고유한 특성을 유지하기 위해서는 화학적으로 결합하는 항암제의 수가 알부민 분자당 1 ~ 3개로 제한되는 문제점이 있다(Journal of Controlled Release, 132, 171-183, 2008).

따라서 본 발명은 알부민을 이용한 약물 전달체로서, 링커를 통해 알부민 및 항암제를 화학적 결합시킨 연결된 알부민-링커-항암제 결합체, 이의 제조방법 및 이의 약물전달용 용도를 제공하고자 한다.

상기 과제의 해결을 위하여, 본 발명은 친수성 알부민과, 하이드록시기를 갖는 소수성 항암제가 링커를 통해 결합되며, 수용액에서 자기 집합체(self-aggregate)를 형성하는 항암제-링커-알부민 결합체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 항암제-링커-알부민 결합체를 포함하는 약물전달용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 하이드록시기를 갖는 소수성 항암제를 유기용매에 용해시킨 후 링커와 혼합하여 링커가 연결된 항암제 용액을 제조하는 단계; 상기 용액을 동결건조하여 링커가 연결된 항암제 분말을 수득하는 단계; 친수성 알부민을 수용성 용매에 용해시켜 알부민 용액을 제조하는 단계; 상기 링커가 연결된 항암제 분말을 상기 알부민 용액과 혼합 후 교반하여 반응액을 제조하는 단계; 및 상기 반응액의 미반응 항암제를 제거한 후 동결건조하는 단계를 포함하는 항암제-링커-알부민 결합체 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 항암제-링커-알부민 결합체는 수계에서 자기집합체를 형성하여 암조직에 대한 선택성이 높을 뿐만 아니라, 약물을 장기간 지속적으로 방출할 수 있고, 또한 자기집합체의 내부에 항암제를 추가적으로 첨가하여 화학적 결합으로 제한되어 있는 약물 함유량을 늘릴 수 있기 때문에 암에 대한 항암화학요법에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 크로스링커인 PMPI와 이리노테칸의 결합 여부를 확인하기 위한 FT-IR 측정 결과이다.
도 2는 이리노테칸-PMPI-알부민 결합체의 FT-IR 측정 결과이다.
도 3은 이리노테칸-PMPI-알부민 결합체가 수계에서 형성한 자기집합체의 TEM 사진이다.

본 발명은 친수성 알부민과, 하이드록시기를 갖는 소수성 항암제가 링커를 통해 결합되며, 수용액에서 자기 집합체(self-aggregate)를 형성하는 항암제-링커-알부민 결합체를 제공한다.

본 발명의 발명자들은 기존의 알부민을 이용한 약물 전달체가 가지고 있는 부작용들을 극복하기 위한 방법을 연구한 결과, 알부민에 링커를 이용하여 항암제를 화학적으로 결합한 결합체를 개발하였고, 이는 자기집합체를 형성하여, 10 ~ 300nm의 입자크기를 갖는 항암제-링커-알부민 나노입자를 형성함을 확인하였다. 상기 개발한 항암제-링커-알부민 나노입자가 기존 알부민(2 ~ 5 nm) 보다 입자도가 10 ~ 100배 정도 증가된 나노입자로서 암 조직에 대한 표적성이 크게 향상되고, 나노입자를 형성하며, 상기 자기집합체 내부에 소수성 항암제를 물리적으로 포함할 수 있는 신규 나노입자 약물전달시스템으로 활용이 가능한 것을 확인 후, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 결합체는 알부민의 시스테인기의 티올기와 항암제의 하이드록시기가 링커를 통해 결합하는 것일 수 있으며,

보다 구체적으로, 상기 링커는 N-[p-말레이미도페닐]이소시아네이트(PMPI)이며, 상기 링커의 이소시아네이트 작용기와 항암제의 하이드록시기가 결합하며, 알부민의 시스테인기의 티올기와 링커의 말레이미드 고리가 결합할 수 있다.

상기 링커 N-[p-말레이미도페닐]이소시아네이트(PMPI)의 구조는 아래 화학식 1과 같다.

[화학식 1]

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 알부민은 인간 알부민(human albumin), 소 혈청 알부민, 이의 단편 또는 이의 변이체일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 알부민은 인체 내에서 존재하고 생체적합성이 우수하며, 생체내의 안정성이 우수하여 혈액내에서의 생체 분포도가 높아서 충분한 시간동안 암 조직에 계속적으로 축적이 되는 특성을 가진다. 특히, 알부민은 단백질 내에 많은 라이신기를 함유하고 있어, 다양한 항암제, 형광제 또는 방사성 동위원소 등의 화학적 개질이 용이하다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 하이드록시기를 갖는 소수성 항암제는 도세탁셀(Docetaxel), 캠토세신(camptothecin), 파클리탁셀(paclitaxel), 플록슈리딘(Floxuridine), 류프로리드(Leuprolide), 졸레드로네이트(Zoledronate), 독소루비신(Doxorubicin), 빈크리스틴(Vincristine), 젬시타빈(Gemcitabine), 스트렙토조토신(Streptozocin), 토포테칸(Topotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 비노렐빈(Vinorelbine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 발루비신(Valrubicin), 독시플루리딘(Doxifluridine), 빈블라스틴(Vinblastin), 프레드니손(Prednisone), 테스토스테론(Testosterone), 미토산트론(Mitoxantrone), 살리실레이트(salicylates), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 코르티손(cortisone) 및 코르티코스테로이드(corticosteroid)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 이하의 실시예에서는 이리노테칸을 사용하여 겹합체를 제조하였다.

본 발명의 항암제-링커-알부민 결합체는 알부민의 친수성 기와 항암제의 소수성 기에 의한 양친성으로 인하여 수용액에서 마이셀과 유사한 구형 자기집합체(self-aggregates)를 형성할 수 있다.

상기 항암제-링커-알부민 결합체는 항암제의 중량부에 비례하여 입자크기가 증가하고, 직경이 10 내지 300nm일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 항암제-링커-알부민 결합체의 내부에 추가적으로 소수성 항암제가 봉입될 수 있어, 이를 통해 화학적 결합으로 제한되어 있는 약물 함유량을 늘릴 수 있으며, 상기 결합체를 구성하는 내부 소수성 항암제와 추가로 봉입되는 항암제의 성질이 소수성으로 매우 유사하므로 약물 봉입 효율 및 전달 효과가 다른 전달체보다 매우 우수하다.

상기 결합체의 내부에 추가적으로 봉입될 수 있는 소수성 항암제로는 하이드록시기를 갖는 항암제 외에도 모든 종류의 소수성 항암제가 사용될 수 있으며, 구체적인 예로는 도세탁셀(Docetaxel), 시스플라틴(cis-platin), 캠토세신(camptothecin), 파클리탁셀(paclitaxel), 타목시펜(Tamoxifen), 아나스테로졸(Anasterozole), 글리벡(Gleevec), 5-플루오로우라실(5-FU), 플록슈리딘(Floxuridine), 류프로리드(Leuprolide), 플로타미드(Flutamide), 졸레드로네이트(Zoledronate), 독소루비신(Doxorubicin), 빈크리스틴(Vincristine), 젬시타빈(Gemcitabine), 스트렙토조토신(Streptozotocin), 카보플라틴(Carboplatin), 토포테칸(Topotecan), 벨로테칸(Belotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 비노렐빈(Vinorelbine), 히도록시우레아(hydroxyurea), 발루비신(Valrubicin), 레티노익산(retinoic acid) 계열, 메소트렉세이트(Methotrexate), 메클로레타민(Mechlorethamine), 클로람부실(Chlorambucil), 부술판(Busulfan), 독시플루리딘(Doxifluridine), 빈블라스틴(Vinblastin), 마이토마이신(Mitomycin), 프레드니손(Prednisone), 테스토스테론(Testosterone), 미토산트론(Mitoxantrone), 아스피린(aspirin), 살리실레이트(salicylates), 이부프로펜(ibuprofen), 나프로센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 페닐부타존(phenylbutazone), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 메클로에타민(mechlorethamine), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 셀레콕시브(celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 니메슐리드(nimesulide), 코르티손(cortisone) 및 코르티코스테로이드(corticosteroid)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항암제-링커-알부민 결합체는 수계에서 자기집합체를 형성하여 암조직에 대한 선택성이 높을 뿐만 아니라, 약물을 장기간 지속적으로 방출할 수 있고, 또한 자기집합체의 내부에 항암제를 추가적으로 첨가하여 화학적 결합으로 제한되어 있는 약물 함유량을 늘릴 수 있기 때문에 암에 대한 항암화학요법에 약물전달체로서 유용하게 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 항암제-링커-알부민 결합체를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약물 전달용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 생리활성성분을 추가로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 상기 생리활성성분이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 상기 약학적으로 유효한 양은 투여 대상의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

상기 “생리활성성분”은 동물 또는 사람의 체내에서 생리적인 기능을 촉진 또는 억제하여 목적하는 생물학적 또는 약리학적 효과를 유도할 수 있는 물질로서, 동물 또는 사람에게 투여하기 적합한 화학적 또는 생물학적 물질 또는 화합물을 의미하며, (1) 감염 예방과 같은 원하지 않은 생물학적 효과를 예방하여 유기물에 대한 예방효과를 가지고, (2) 질병으로 생기는 컨디션을 경감시키며, 예를 들어 질병의 결과로 생기는 고통 또는 감염을 완화시키며, (3) 유기물로부터 질병을 완화, 감소 또는 완전히 제거할 수 있는 역할을 수행할 수 있다. 또한, 상기 “생리활성성분”은 “약물” 또는 “치료제”의 용어와도 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

상기 생리활성성분으로는 이에 제한되지는 않으나, 펩타이드, 단백질, 항암제, 소염진통제, 항생제, 항균제, 호르몬제, 유전자 및 백신으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으며, 보다 구체적으로, 소수성 항암제가 이에 해당할 수 있다.

또한, 상기에서 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있으며, 특히, 경구, 경비, 눈, 피하, 정맥내, 근육내 또는 복강내 경로를 통해 투여될 수 있도록 주사용, 경피용 또는 경구용으로 제형화될 수 있다. 상기 제형은 이에 제한되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용 액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한 본 발명에 따른 약물 전달용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 약물 전달용 조성물은 상기 생리활성물질의 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.

또한 본 발명은 하이드록시기를 갖는 소수성 항암제를 유기용매에 용해시킨 후 링커와 혼합하여 링커가 연결된 항암제 용액을 제조하는 단계; 상기 용액을 동결건조하여 링커가 연결된 항암제 분말을 수득하는 단계; 친수성 알부민을 수용성 용매에 용해시켜 알부민 용액을 제조하는 단계; 상기 링커가 연결된 항암제 분말을 상기 알부민 용액과 혼합 후 교반하여 반응액을 제조하는 단계; 및 상기 반응액의 미반응 항암제를 제거한 후 동결건조하는 단계를 포함하는 항암제-링커-알부민 결합체 제조방법을 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 상기 하이드록시기를 갖는 소수성 항암제는 도세탁셀(Docetaxel), 캠토세신(camptothecin), 파클리탁셀(paclitaxel), 플록슈리딘(Floxuridine), 류프로리드(Leuprolide), 졸레드로네이트(Zoledronate), 독소루비신(Doxorubicin), 빈크리스틴(Vincristine), 젬시타빈(Gemcitabine), 스트렙토조토신(Streptozocin), 토포테칸(Topotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 비노렐빈(Vinorelbine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 발루비신(Valrubicin), 독시플루리딘(Doxifluridine), 빈블라스틴(Vinblastin), 프레드니손(Prednisone), 테스토스테론(Testosterone), 미토산트론(Mitoxantrone), 살리실레이트(salicylates), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 코르티손(cortisone) 및 코르티코스테로이드(corticosteroid)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으며, 바람직하게는 이리노테칸을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 링커는 N-[p-말레이미도페닐]이소시아네이트(PMPI)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 알부민은 인간 알부민(human albumin), 소 혈청 알부민, 이들의 단편 또는 이들의 변이체일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 하이드록시기를 갖는 소수성 항암제를 유기용매에 용해시킨 후 링커와 혼합하여 링커가 연결된 항암제 용액을 제조하는 단계에서의 유기용매는 하이드록시기를 지닌 항암제 및 링커가 모두 녹으면서, 반응을 저해하지 않는 임의의 용매가 이용될 수 있으며, 구체적으로 이에 제한되는 것은 아니나, 디메틸설폭사이드(DMSO)가 이용될 수 있다.

상기 하이드록시기를 갖는 소수성 항암제 및 링커의 반응비율은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 하이드록실기를 지닌 항암제에 대하여 크로스링커를 3-7 : 1의 몰 비율로 반응시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 친수성 알부민을 수용성 용매에 용해시켜 알부민 용액을 제조하는 단계의 수용성 용매는 링커가 연결된 항암제 및 알부민이 모두 녹으면서, 반응을 저해하지 않는 임의의 용매가 이용될 수 있으며, 보다 구체적으로 pH 7 내지 8인 PBS 버퍼 용매가 이용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 링커가 연결된 항암제 및 알부민을 반응시키는 비율은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 하이드록시기를 지닌 항암제에 대하여 알부민을 1-2 : 1 몰 비율로 반응시킬 수 있다.

또한 상기 미반응 항암제의 제거를 위해서는 탈염 컬럼을 통해 반응액을 여과시키는 과정이 수행될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 항암제-알부민 나노입자 제조

단계 1. 크로스링커가 결합된 이리노테칸 제조

이리노테칸 200mg(0.2g)을 10ml DMSO에 용해시켰다. 이리노테칸에 대하여 PMPI를 5:1 몰 비율로 상기 완성된 용액과 혼합하고, PMPI 12.7mg(0.0127g)를 상기 완성된 용액에 첨가하였다. 상기 용액을 25℃에서 400rpm으로 3.5hr 동안 교반시켜 크로스링커인 PMPI가 결합된 이리노테칸을 제조하였다.

상기 반응을 이하의 반응식 1에 나타내었다.

[반응식 1]

단계 2. 링커가 결합된 이리노테칸 수득

상기 단계에서 제조한 크로스링커가 결합된 이리노테칸을 수득하기 위하여 반응이 끝난 용액을 냉동에서 1~2일 동안 동결 시킨 후 동결된 상기 결합체 용액을 동결건조기를 사용하여 2~3일 동안 동결건조를 실시한 후 상기 결합체 분말을 수득하였다.

단계 3. 항암제-알부민 나노입자의 제조

상기 단계에서 수득된 크로스링커가 결합된 이리노테칸을 알부민(소혈청알부민, BSA)과 1.5:1 몰 비율로 PBS-EDTA (phosphate 0.1, NaCl 0.15M, EDTA 10mM, PH 7.3)용매 상에서 혼합하여 25℃에서 2hr 교반하였다. 상기 과정 후 결합되지 않고 남아있을 이리노테칸을 제거하기 위하여 탈염 컬럼을 이용하였다.

상기 이리노테칸-PMPI-알부민 결합체의 반응을 이하의 반응식 2에 나타내었다.

[반응식 2]

단계 4. 항암제-알부민 나노입자 수득

상기 단계에서 제조된 이리노테칸-PMPI-알부민 나노입자를 수득하기 위하여 반응이 끝난 용액을 냉동에서 1~2일 동안 동결 시킨 후 동결된 상기 결합체 용액을 동결건조기를 사용하여 2~3일 동안 동결건조를 실시한 후 상기 결합체 분말을 수득하였다.

< 실험예 1> 크로스링커 ( PMPI )가 결합된 이리노테칸의 합성 검증

크로스링커인 PMPI와 이리노테칸의 결합 여부를 확인하기 위하여 FT-IR을 이용하여 확인하였다. 상기 실시예 1의 2단계에서 제조된 크로스링커가 결합된 이리노테칸을 KBr과 함께 나노입자 : KBr = 1 : 5의 비율로 막자사발에 섞은 후 막자를 사용하여 갈아, 고체형태의 펠렛으로 만들고, 고체형태의 펠렛을 기기에 넣고 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, FT-IR에서 IRT 피크가 1746.37, 1685.85, 1660.84로 측정되었다. 1746.37 피크는 IRT 락톤 고리의C=O peak이며, 1685.85 피크는 IRT 카바메이트의 C=O 피크이다. 1660.84 피크는 IRT 피리돈의 C=O 피크이다. 위의 FT-IR에서 PMPI 피크는 2275, 1755.12로 측정되었다. 2275 피크는 PMPI의 이소시아네이트(R-N=C=O)의 피크이며, 1755.12 피크는 PMPI의 말레이미드(C=O)의 피크이다. 위의 FT-IR에서 IRT-PMPI 피크가 1714.66, 1655.97, 1592.80로 측정되었다. 1714.66 피크는 카바메이트(-O-CO-NH₂)의 C=O 피크로 IRT와 PMPI의 결합으로 카바메이트(-O-CO-NH₂)구조가 생성되는데, 이 피크가 측정된 것으로 보아 IRT-PMPI 결합이 이루어졌음을 알 수 있었다.

< 실험예 2> 이리노테칸 - PMPI -알부민 나노입자의 합성 검증

크로스링커(PMPI)가 결합된 이리노테칸 및 알부민이 결합되었는지를 확인하기 위하여 FT-IR을 이용하여 확인하였다. 상기 실시예 1의 단계 4에서 제조된 항암제-알부민 나노입자를 KBr과 함께 나노입자 : KBr = 1 : 5의 비율로 막자사발에 섞은 후 막자를 사용하여 분쇄하여 고체형태의 펠렛으로 만들고, 고체형태의 펠렛을 기기에 넣고 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 알 수 있는 바와 같이, FT-IR에서 BSA 피크가 1652.68, 1521.24로 측정되었다. BSA 피크는 아마이드 I 피크와 아마이드 II 피크가 있는데 아마이드 I 피크는 1600~1700cm^-1, 아마이드 II 피크는 ~1548cm^?1이다. FT-IR에서 BSA와 IRT-PMPI-BSA의 FT-IR을 비교시 아마이드 I 피크가 1659.22cm^-1에서 1661.25cm^-1로 변화하며, 아마이드 II 피크는 1563.71cm^-1에서 1561.67cm^-1로 변화한 것으로 보아, BSA와 IRT-PMPI의 상호작용에 의한 결합이 이루어졌음을 확인 할 수 있었다.

< 실험예 3> 나노입자의 특성분석

상기 실시예 1의 단계 2 및 단계 4에서 수득한 크로스링커(PMPI)가 결합된 이리노테칸(IRT-PMPI) 및 이리노테칸-PMPI-알부민(IRT-PMPI-BSA)을 탈이온수에 1mg/ml의 농도로 분산시킨 다음 DLS(Dynamic Light Scattering)를 이용하여 입자크기 및 PDI값을 측정하였다. 그 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.

샘플	입자 크기( nm )		평균( nm )	PDI		평균
	1	2		1	2
BSA	181.20	173.50	177.35	0.271	0.278	0.2745
IRT	3600.10	5357.50	4478.8	0.328	0.446	0.387
IRT-PMPI	1512.90	1610.30	1561.6	0.256	0.229	0.2423
IRT-PMPI-BSA	16.60	15.80	16.2	0.342	0.326	0.3338

표 1을 참조하면, 이리노테칸-PMPI-알부민(IRT-PMPI-BSA) 결합체는 수계에서 자기집합체를 형성하여 입자 크기가 감소하며, 입자 크기는 평균 16.2 nm임을 알 수 있었다.

< 실험예 4> 나노입자의 약물 결합률 분석

나노입자의 약물 결합률을 확인하기 위해 HPLC(Waters^TM, USA)를 이용하여 255 nm 파장에서 이리노테칸의 양을 측정하였다. 결합률은 투입한 약물의 중량 대비 나노입자에 결합된 약물의 중량을 퍼센트화한 지표이다. 나노입자에 결합시킨 약물인 이리노테칸을 μ/mL의 농도 100, 50, 25, 10, 1 농도로 희석하여 측정하여 표준검량선을 얻었고, 실시예 1에서 얻어진 이리노테칸이 링커를 통해 결합된 알부민 나노입자의 약물의 농도를 HPLC를 이용하여 구한 다음 표준검량선에 기초하여 결합된 약물양을 계산하여 약물의 결합률을 계산하였다. 결과를 이하의 표 2에 나타내었다.

	AREA	샘플농도	Loading efficiency %
IRT-PMPI-BSA 1	84807	1379.78	6.899
IRT-PMPI-BSA 2	93695	1534.60	7.673
IRT-PMPI-BSA 3	85756	1396.31	6.982

표 2를 참조하면, 약물 결합률은 6 내지 8%임을 알 수 있었다.

이러한 알부민과 결합한 소수성 항암제가 자기집합체를 형성한 제형은 일반 저분자량의 항암제보다 EPR(Enhanced Permeation and Retention) 효과에 의하여 암조직에 대한 선택성이 높아 더 많은 양이 암조직에 축적되어 효과적으로 항암 작용을 발휘할 수 있으며, 따라서 이는 표적 지향적이며, 지속적 약물 방출이 가능한 높은 항암 효과를 발휘할 수 있는 약제로 사용될 수 있다.

< 실험예 5> 나노입자의 입자형태 분석

상기 실시예 1에서 제조된 이리노테칸이 링커를 통해 결합된 알부민 나노입자를 탈이온수에 1mg/ml의 농도로 분산시켜 자기집합체를 형성시킨 다음 TEM를 이용하여 입자형태를 분석하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3을 참조하면, 실시예 1에서 제조된 결합체의 자기집합체는 직경 200nm 내외의 구형으로 존재함을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

1. 알부민과, 이리노테칸(Irinotecan)이 N-[p-말레이미도페닐]이소시아네이트(PMPI)를 통해 결합되며, 수용액에서 자기 집합체(self-aggregate)를 형성하는 이리노테칸-PMPI-알부민 결합체.
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3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 알부민은 인간 알부민(human albumin) 또는 소 혈청 알부민인 것인 이리노테칸-PMPI-알부민 결합체.
5. 삭제
6. 제1항에 있어서,
   상기 이리노테칸-PMPI-알부민 결합체는 이리노테칸의 중량부에 비례하여 입자크기가 증가하고, 직경이 10 내지 300nm 인 것인 이리노테칸-PMPI-알부민 결합체.
7. 제1항에 있어서,
   상기 이리노테칸-PMPI-알부민 결합체의 내부에 추가적으로 소수성 항암제가 봉입되는 것인 이리노테칸-PMPI-알부민 결합체.
8. 제1항의 이리노테칸-PMPI-알부민 결합체를 포함하는 항암제 전달용 조성물.
9. 제8항에 있어서,
   상기 조성물은 경구, 경비, 눈, 피하, 정맥내, 근육내 또는 복강내 경로를 통해 투여될 수 있도록 주사용, 경피용 또는 경구용으로 제형화되는 것인 항암제 전달용 조성물.
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