KR20100131130A

KR20100131130A - 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20100131130A
Application number: KR1020090049866A
Authority: KR
Inventors: 안형준; 권익찬; 최귀원; 김광명; 윤인찬; 김세훈
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2009-06-05
Filing date: 2009-06-05
Publication date: 2010-12-15
Also published as: KR101286721B1; US20100310468A1; US8541378B2

Abstract

본 발명은 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 알부민의 N-말단과 C-말단에 약물 결합에 이용될 수 있는 시스테인의 갯수가 증폭되어 있는 재조합 알부민 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 알부민은 약물 전달체용으로 사용시에 알부민-약물 컨쥬게이션 효율을 향상시키므로 다량의 약물을 표적 조직에 효과적으로 전달할 수 있고, 융합된 시스테인의 갯수를 조절함으로써 알부민 단일 개체당 결합되는 약물의 갯수를 조절할 수 있으므로 기존 알부민 전달체의 부작용을 개선한 우수한 약물 전달체로 사용될 수 있으며, 또한, 이러한 재조합 알부민을 분자 영상용 형광체 및 조영제 등과 결합시켜 비침습적으로 실시간 질병 진단 및 치료와 신약의 스크리닝에 활용할 수 있다.

폴리-시스테인 펩티드, 재조합 알부민, 약물 결합, 약물 전달, 분자 영상

Description

폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민 및 이의 제조방법{Recombinant albumins fused with poly-cysteine peptide and the methods for preparing the same}

본 발명은 폴리-시스테인 펩티드가 융합된 재조합 알부민 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

알부민은 생체 내에서 효과적인 약물 전달체로서의 그 효용성이 널리 알려져 있다. 특히, 암 또는 루마티스 관절염(Rheumatoid arthritis)과 같은 질환에 있어서, 표적 조직에서의 높은 축적성, 정상 조직에서의 낮은 침투력, 낮은 독성, 다양한 약물과의 결합 용이성, 표적 조직에서의 약물 방출, 생분해 시간에 있어서의 장점, 결합된 약물의 용해도를 비롯한 물리 화학적 성질 개선의 용이성 등으로 인해 알부민은 다양한 약물의 전달체로서의 기능을 수행해 왔다.

또한, 암조직에서는 알부민을 대사시켜서 질소와 에너지 공급원으로 사용하는 것을 선호하고, 암조직의 신생 혈관에서는 증가된 투과성으로 인하여 알부민이 암조직에 선택적으로 축적되는 EPR 효과(enhanced permeability and retention effect)가 있으며, 암조직에서 림프계의 이상은 알부민의 암조직에서의 축적성을 더욱 증가시킨다. 따라서, 알부민을 이용한 약물 전달은 신약개발의 주요 표적이며 전 세계적으로도 높은 관심도를 보여 왔다.

기존의 질환 치료 방법 중 화학치료법(chemotherapy)은 적용되는 약물의 생물리화학적 특성에서 유래하는 임상 적용의 한계를 지니고 있다. 즉, 물에 잘 녹지 않는 소수성 약물의 경우에는 폴리에톡실레이티드 카스터 오일(polyethoxylated castor oil, CrEL), 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80)과 같은 유기용매를 사용하여 약물 전달체를 제조하는데, 이러한 경우에는 약물 자체의 독성 이외에도 약물 전달체에서 유래된 독성으로 인하여 과민반응, 심각한 정도의 신경질환 등을 야기할 수 있으므로, 이러한 독성을 조절하기 위한 추가의 의료 조치를 필요로 한다는 단점이 있다. 따라서, 이러한 유기용매와 같은 약물 전달체에 의존할 경우에는 약물 전달체에 의한 독성으로 인해 인체에 주입할 수 있는 약의 용량이 제한을 받는 투여 제한성(dose-limiting)의 문제가 발생할 수도 있다.

또한, 인체내로의 약물 전달에 있어서는 약물의 생체 내에서의 안정성 (biostability) 역시 중요한 인자이므로, 효과적인 약물 전달체의 선택에 의하여 안정성과 반감기(half-life)가 조절될 수 있다.

상기와 같은 약물 전달체의 독성 문제와 약물 자체의 생체내 안정성 문제를 개선하기 위하여 알부민 단백질을 약물 전달체로 사용하는 방법이 꾸준히 진행되고 있다.

약물 전달체의 독성 문제를 해결하기 위한 방법으로서, 메토트렉세이트 알부 민 결합체(methotrexate-albumin conjugate), 독소루비신의 알부민 결합 약물전구체(albumin-binding prodrug of doxorubicin, DOXO-EMCH), 파클리탁셀의 알부민-안정화된 나노파티클 제제(paclitaxel albumin-stabilized nanoparticle formulation, 상품명 Abraxane™, 아브락산) 등은 임상적으로 효과적인 알부민 기반 약물 전달체로 인정을 받고 있다.

아브락산은 2005년 1월에 미국 FDA에서 전이성 유방암 재발환자를 대상으로 승인된 것으로서, 알부민에 의한 약물 전달 효과의 우수성을 잘 보여주고 있다. 아메리칸 바이오사이언스(American Bioscience. Inc.) 제약회사는 nab-기술(nab-technology)라는 알부민 기반 나노파티클 제조 기술을 개발하여 지용성 약물을 나노파티클에 봉입시켰다. 수용액상에 존재하는 알부민에 약물을 섞은 후 높은 압력으로 제트기류를 통과시키면 100-200 나노미터의 알부민 나노파티클이 형성이 되는데, 이런 방법으로 항암제 파클리탁셀을 알부민 나노파티클에 봉입하여 아브락산이라는 상품명으로 전이성 유방암 환자에 임상적용을 하고 있다. 아브락산 투여시에는 파클리탁셀의 단독 투여시보다 백혈구 수치 감소, 심신 나약, 감염, 근육통 같은 부작용이 더 적으며 질병의 진행 속도가 훨씬 감소된 것으로 알려졌다.

또한, 루마티스 관절염 치료제로 널리 알려진 메토트렉세이트의 경우에는 알부민이 루마티스 관절염 부위에서 과잉 축적되면서 대사되어지는 기능을 이용한 것으로서, 동물 모델에 메토트렉세이트를 단독으로 투여한 경우보다 메토트렉세이트의 알부민 약물 전달체를 투여하였을 경우에는 향상된 치료 효과를 보여주고 있다.

약물 자체의 생체내 안정성을 개선하기 위한 방법으로서는 알부민에 약물을 결합시켜 약물동력학적 프로파일을 향상시키려는 방법이 시도되고 있다. 그 예로서, Albumin Fusion Technology(Human Genome Sciences), Drug Affinity Complex(DAM^TM, ConjuChem. Inc.), Performed Conjugated-Drug Affinity complex technology platform(PC-DAM^TM, ConjuChem. Inc.) 및 노보 노르디스크(Novo Nordisk) 제약회사의 펩티드 지방산 유도체를 물리적으로 인체 내의 순환하는 알부민에 부착시키는 방법 등이 있다.

휴먼 지놈 사이언스 회사의 알부민 융합 기술은 인터페론이나 인터루킨과 같은 싸이토카인 단백질에 알부민을 유전자 재조합 방법을 이용하여 융합시키는 것으로서, 단백질의 페길레이션(pegylation)과 유사한 효과를 나타내며 생체내에서 반감기의 증가, 프로테아제에 의한 분해 감소, 면역 반응 감소 등의 효과를 보여 준다.

컨쥬켐 제약회사는 알부민에서 디설피드(disulfide) 결합에 관여하지 않으면서 자유로운 34번째 시스테인 잔기에 N-히드록시숙신이미드 에스터(N-hydroxysuccinimide ester), 이소시아네이트(isocyanate), 말레이미드(maleimide), 살리실산 그룹(salicylate group)과 같은 반응기를 이용하여 약물을 결합시키는 기술을 보유하고 있다. 이러한 방법으로 다양한 펩티드 약물을 알부민에 결합시키고 있는데, 그 예로서 엑센딘-4(exendin-4)의 알부민 복합체인 CJC-1134-PC가 제2형 당뇨 치료제로 개발되고 있다.

상기와 같은 약물 전달체에서 알부민과의 컨쥬게이션을 통한 약물 결합 방법은 크게 두가지로 요약될 수 있는데, 알부민의 시스테인 34번 잔기를 이용하는 방법과 알부민 표면의 라이신 잔기들을 이용하는 방법이다.

첫번째 방법으로서 알부민에 존재하는 시스테인 34번 잔기를 이용하는 약물 결합 방법에 있어서는, 상업적으로 시판하는 알부민의 경우 시스테인(cysteine), 호모시스테인(homocysteine), 글루타치온(glutathione)과 같은 설프히드릴(sulfhydryl) 화합물에 의하여 시스테인 34번 잔기가 블로킹되어 있어서 34번 잔기의 20-60%만이 약물 결합이 가능하다는 단점이 있다. 따라서, 효과적으로 약물을 결합시키기 위해서는 상업적으로 시판되는 알부민의 34번 시스테인의 블로킹을 제거하는 것이 중요하다.

생체내에서 순환하는 알부민의 34번 시스테인 잔기를 타겟으로 하여 약물전구체(prodrug)를 제조하는 방법도 시도되고 있다. 독소루비신의 (4-말레이미도페닐아세틸) 히드라존 유도체((4-maleimidophenylacetyl)hydrazone derivative of doxorubicin)와 독소루비신의 (6-말레이미도페닐아세틸) 히드라존 유도체((6-maleimidophenylacetyl)hydrazone derivative of doxorubicin, DOXO-EMCH)의 경우에는 수분내에 생체내 순환하는 알부민의 34번 시스테인 잔기 자리에 결합을 한다. 이 경우, 알부민 결합체인 DOXO-EMCH는 독소루비신 단독 투여시보다 약 4.5배 높은 최대 허용 용량(maximum tolerated dose)을 보이며 더 높은 약물 치료 효과를 보인다.

그러나, 생체내에서 순환하는 알부민에 약물을 결합시키는 경우에도 역시 70% 정도의 알부민만이 자유로운 34번 시스테인 잔기 자리를 보유하여 약물의 결합이 가능한 머캅트알부민(mercaptalbumin) 형태로 존재한다고 알려져 있으므로 약물결합 효율은 높지 않은 것이 사실이다.

두번째 방법으로서 알부민 표면의 라이신 잔기들을 이용하는 약물 결합 방법에 있어서는, 임상 I/II 단계까지 평가되었던 최초의 알부민 결합체인 메토트렉세이트-알부민 결합체(methotrexate-albumin conjugate, MTX-HSA)가 있으며, 이것은 알부민의 라이신 잔기에 메토트렉세이트를 직접 결합시킨 복합체이다. 그러나, 메토트렉세이트-알부민 결합체는 알부민에 결합할 수 있는 약물의 개수가 일정하지 않아서 화학적으로 결합체(컨쥬게이트)를 정확하게 정의할 수 없다는 단점을 가지고 있다. 또한, 일종의 약물전구체인 메토트렉세이트-알부민 결합체의 성질이 분해율(cleavage rate)이나 분해산물(cleavage product)이 불분명하다는 한계를 지니고 있어서 현재 임상 평가가 중단된 상태이다.

따라서, 알부민 표면의 라이신 잔기들을 이용하는 약물 결합 방법에서는 알부민당 결합되는 약물의 개수가 일정하지 않아서 화학적으로 알부민-약물 컨쥬게이트를 정의할 수 없다는 단점과 알부민에 결합되는 약물의 개수를 조절하기 어렵다는 한계를 지니고 있다.

따라서, 상기와 같은 알부민에 약물을 결합시키는 방법에 있어서의 단점으로 인해, 알부민에 약물을 효과적으로 결합시켜 알부민-약물 컨쥬게이션 효율을 향상시킬 수 있는 방법, 알부민 단일 개체당 결합되는 약물의 갯수를 증가시키는 방법 및 알부민 단일 개체당 결합되는 약물의 갯수를 조절하는 방법이 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 기존의 알부민을 이용한 약물 전달체가 가지고 있는 부작용들을 극복하기 위한 방법을 연구한 결과, 유전자 재조합 방식으로 알부민과 다수의 약물 결합 부위를 가지는 폴리-시스테인 펩티드를 결합시킨 재조합 알부민을 개발하였다. 상기 개발한 재조합 알부민은 기존 알부민의 시스테인 34번 잔기뿐만 아니라 N-말단과 C-말단에 약물 결합에 이용될 수 있는 시스테인의 갯수가 증폭되어 있어 알부민-약물 컨쥬게이션 효율을 향상시키므로 다량의 약물을 표적 조직에 효과적으로 전달할 수 있고, 융합된 시스테인의 갯수를 조절함으로써 알부민 단일 개체당 결합되는 약물의 갯수를 조절할 수 있으므로 기존 알부민 전달체의 부작용을 개선한 우수한 약물 전달체로 사용될 수 있음을 확인하였으며, 또한, 이러한 재조합 알부민을 분자 영상용 형광체 및 조영제 등과 결합시켜 비침습적으로 실시간 질병 진단 및 치료에 활용이 가능함을 확임함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 다량의 약물을 표적 조직에 효과적으로 전달할 수 있고, 알부민 단일 개체당 결합되는 약물의 갯수를 조절할 수 있는 재조합 알부민, 이를 이용한 실시간 분자 영상용 비침습적 질병 진단 및 치료 방법과 질병 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알부민에 폴리-시스테인 펩티드가 융합된 재조합 알부민을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 알부민에 약물체를 결합시킨 재조합 알부민-약물체 결합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 알부민-약물체 결합체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 알부민에 분자 영상용 형광체를 결합시킨 재조합 알부민-분자 영상용 형광체 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 알부민-분자 영상용 형광체 복합체를 포함하는 질병 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 알부민을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제 공한다.

또한, 본 발명은

1) 상기 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 제조된 발현벡터로 숙주 세포를 형질전환시켜 상기 형질전환체를 제조하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)에서 제조된 형질전환체로부터 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민을 얻는 단계를 포함하는 상기 재조합 알부민의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단계 3)에서 제조된 재조합 알부민과 약물체를 결합시켜 재조합 알부민-약물체 결합체를 얻는 단계 4)를 추가적으로 포함하는 재조합 알부민-약물체 결합체 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단계 3)에서 제조된 재조합 알부민과 분자 영상용 형광체를 결합시켜 재조합 알부민-분자 영상용 형광체 복합체를 얻는 단계 4)를 추가적으로 포함하는재조합 알부민-분자 영상용 형광체 복합체 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 알부민-약물체 결합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질병 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 상기 재조합 알부민-분자 영상용 형광체 복합체를 개체에 투여하는 단계; 및

2) 형광을 조사하여 질병 조직을 영상화하는 단계를 포함하는 질명 진단 방 법을 제공한다.

본 발명의 재조합 알부민은 기존 알부민의 시스테인 34번 잔기뿐만 아니라 N-말단과 C-말단에 약물 결합에 이용될 수 있는 시스테인의 갯수가 증폭되어 있어 약물 전달체용으로 사용시에 알부민-약물 컨쥬게이션 효율을 향상시키므로 다량의 약물을 표적 조직에 효과적으로 전달할 수 있고, 융합된 시스테인의 갯수를 조절함으로써 알부민 단일 개체당 결합되는 약물의 갯수를 조절할 수 있으므로 기존 알부민 전달체의 부작용을 개선한 우수한 약물 전달체로 사용될 수 있으며, 또한, 이러한 재조합 알부민을 분자 영상용 형광체 및 조영제 등과 결합시켜 비침습적으로 실시간 질병 진단 및 치료와 신약의 스크리닝에 활용할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 알부민에 폴리-시스테인 펩티드가 융합된 재조합 알부민을 제공한다.

상기 알부민은 인간 알부민(human albumin), 이의 단편 또는 이의 변이체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

알부민은 인체 내에서 존재하고 생체 적합성이 우수하며, 생체내의 안정성이 우수하여 혈액내에서의 생체분포도가 높아서 충분한 시간동안 암 조직에 계속적으로 축적이 되는 특성을 가진다.

상기 폴리-시스테인 펩티드는 알부민의 양 말단 중 어느 한 쪽 또는 양 말단에 융합된 구조를 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 폴리-시스테인 펩티드는 시스테인 잔기를 1 내지 100개로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 폴리-시스테인 펩티드의 서열은 특정 서열로 한정되는 것은 아니며, 시스테인/펩티드 비율도 특정한 값으로 한정되는 것은 아니고, 하기의 서열번호1 또는 서열번호2로 기재되는 서열인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

서열번호1: [ CGCGCGCGCGCGCGCGCGCG ]

서열번호2: [ CGCGCGCGCG ]

상기의 폴리-시스테인 펩티드는 시스테인의 싸이올(thiol) 그룹이 약물이나 형광체 등에 존재하는 말레이미드(maleimide) 반응기와 쉽게 반응하여 안정한 탄소-황(carbon-sulfur) 결합을 이루도록 한다.

본 발명의 재조합 알부민은 링커 펩티드를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 링커 펩티드는 알부민의 양 말단과 폴리-시스테인 펩티드 사이에 삽입되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 링커 펩티드는 1 이상 100이하의 아미노산으로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 링커 펩티드는 특정 서열의 펩티드로 한정되는 것은 아니며, 바람직하 게는 아미노산 잔기(side chain)의 길이가 짧거나 없는 단순한 구조의 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 글라이신(glycine), 세린(serine), 알라닌(alanine)이나 이에 한정되지 아니하며, 하기의 서열번호3으로 기재되는 서열인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

서열번호3: [ GSGAGSGA ]

상기 링커 펩티드는 폴리-시스테인 펩티드와 알부민을 유전자 재조합 방법으로 융합시킬 때 연결시켜 주는 링커 역할을 한다.

본 발명의 재조합 알부민은 추가적으로 표적 조직 인식 리간드를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 표적 조직 인식 리간드는 유전자 재조합 기술을 이용하여 폴리-시스테인 펩티드 양 쪽 말단 중 어느 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 단백질 사슬 결합 또는 공유 결합되거나, 폴리-시스테인 펩티드의 잔기에 결합된 구조를 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기의 표적 조직 인식 리간드는 암세포를 비롯한 특정 표적 조직에 과량으로 발현되어 있는 수용체에 선택적으로 결합하는 성질을 가짐으로써, 본 발명의 재조합 알부민이 암세포 등 특정 조직에 표적 지향적으로 기능하도록 하는 역할을 부여한다. 본 발명에 사용되는 표적 인식 리간드는 표적 조직에 특이적으로 인식될 수 있는 모든 물질을 말한다.

상기 표적 조직 인식 리간드는 RGD(Arginine-Glycine-Aspartic acid)를 포함하는 펩티드, 앱타머(aptamer), 엽산(folate)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

표적 인식 리간드로서 사용된 RGC를 포함하는 펩티드는 암세포에서 과량 발현되는 혈관 내피 세포 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 수용체에 결합하는 하나 이상의 반복 모티프를 가지는 펩티드로서, 암세포로의 표적 지향성을 부여할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 알부민에 약물체를 결합시킨 재조합 알부민-약물체 결합체 및 상기 재조합 알부민-약물체 결합체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

상기 약물체는 폴리-시스테인 펩티드의 싸이올 그룹과 결합되어서 표적 조직까지 전달될 수 있는 모든 약물을 말한다. 바람직하게는 항암제, siRNA 또는 난치성 질환 치료제이고, 더욱 바람직하게는 도세탁셀(Docetaxel), 시스플라틴(cis-platin), 캠토세신(camptothecin), 파클리탁셀(paclitaxel), 타목시펜(Tamoxifen), 아나스테로졸(Anasterozole), 글리벡(Gleevec), 5-플루오로우라실(5-FU), 플록슈리딘(Floxuridine), 류프로리드(Leuprolide), 플로타미드(Flutamide), 졸레드로네이트(Zoledronate), 독소루비신(Doxorubicin), 빈크리스틴(Vincristine), 젬시타빈(Gemcitabine), 스트렙토조토신(Streptozocin), 카보플라틴(Carboplatin), 토포테칸(Topotecan), 벨로테칸(Belotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 비노렐빈(Vinorelbine), 히도록시우레아(hydroxyurea), 발루비신(Valrubicin), 레티노익산(retinoic acid) 계열, 메소트렉세이트(Methotrexate), 메클로레타 민(Meclorethamine), 클로람부실(Chlorambucil), 부술판(Busulfan), 독시플루리딘(Doxifluridine), 빈블라스틴(Vinblastin), 마이토마이신(Mitomycin), 프레드니손(Prednisone), 테스토스테론(Testosterone), 미토산트론(Mitoxantron), 아스피린(aspirin), 살리실레이트(salicylates), 이부프로펜(ibuprofen), 나프로센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 페닐부타존(phenyltazone), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 메클로에타민(mechlorethamine), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 셀레콕시브(celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 니메슐리드(nimesulide), 코르티손(cortisone) 및 코르티코스테로이드(corticosteroid)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 약물체가 폴리-시스테인 펩티드의 싸이올 그룹과 결합하는 방식은 말레이미드(maleimide) 반응기를 이용하는 결합, 요오드아세틸(iodoacetyl) 반응기를 이용하는 결합 또는 피리딜 디설피드(pyridyl disulfide) 반응기를 이용하는 결합 등이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 재조합 알부민-약물체 결합체를 사용할 경우에는, 폴리-시스테인 펩티드와 알부민 사이의 링커 펩티드의 길이를 조절하여 폴리-시스테인 펩티드에 결합된 약물체와 알부민의 상호작용에 의한 안정성을 조절할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 알부민에 분자 영상용 형광체를 결합시킨 재조합 알부민-분자 영상용 형광체 복합체 및 상기 재조합 알부민-분자 영상용 형광체 복합체를 포함하는 질병 진단용 조성물을 제공한다.

상기 분자 영상용 형광체는 유전자 재조합 기술을 이용하여 폴리-시스테인 펩티드 양 쪽 말단 중 어느 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 단백질 사슬 결합 또는 공유 결합되거나, 폴리-시스테인 펩티드의 잔기에 결합된 구조를 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 분자 영상용 형광체는 형광을 발생시키는 모든 물질을 말하며, 적색이나 근적외선(near-infrared)의 형광을 발광하는 것이 바람직하며, 양자 수득량(quantaum yield)이 높은 형광체가 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 분자 영상용 형광체는 폴리-시스테인 펩티드의 싸이올 그룹과 말레이미드(maleimide) 반응기 사이의 결합을 통해 이루어지는 형광체, 형광 단백질 또는 기타 영상용 물질이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 싸이올 그룹과 말레이미드 반응기 사이의 결합을 통해 이루어지는 형광체는 플루오레신(fluorescein), 보디피(BODYPY), 테트라메틸로드아민(Trtramethylrhodamine), 알렉사(Alexa), 시아닌(Cyanine), 알로피코시아닌(allopicocyanine) 또는 이들의 유도체가 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 형광체 중 시아닌계, 알렉사계는 근적외선 빛을 방출 및 흡수하므로 세포, 혈액 및 생체 조직 등과 간섭 또는 흡수가 최소화되므로 더욱 바람직하다.

상기 형광 단백질은 Dronpa 단백질, 형광 발색 유전자 (EGFP), 적색 형광 프로테인(red fluorescent protein, DsRFP), 근적외선 형광을 나타내는 시아닌 형광체인 Cy5.5 또는 기타 형광 단백질이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

기타 영상용 물질은 산화철, 방사성 동위원소 등이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, MR, PET과 같은 영상 장비에 응용될 수 있다.

본 발명의 재조합 알부민은 세포나 생체내 특정 조직에 약물이나 분자 영상용 형광체를 효과적으로 전달할 수 있어서 약물 전달체, 세포 영상, 특정 조직 영상 등의 다양한 목적으로 사용될 수 있으며, 생체 내(in vivo) 및 생체 외(in vitro) 모두 적용이 가능하다.

본 발명의 재조합 알부민은 하기의 <구조식 1> 내지 <구조식 4> 중 어느 하나의 구조로 이루어지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

<구조식 1>

<구조식 2>

<구조식 3>

<구조식 4>

상기 식에 있어서, T는 표적 조직 인식 리간드를 표시하는 것이고, C는 폴리-시스테인 펩티드를 표시하는 것이며, L은 링커 펩티드를 표시하는 것이고, A는 알 부민을 표시하는 것이며, D는 약물체를 표시하는 것이고, P는 분자 영상용 형광체를 표시하는 것이다.

본 발명의 재조합 알부민은 도 1에 나타난 바와 같이, RGD 펩티드 유전자, 폴리-시스테인 펩티드 유전자, 링커 펩티드 유전자, 알부민 유전자가 재조합된 유전자를 이용하여 제조될 수 있으며, 이로부터 하나의 아미노산 사슬로 발현된 재조합 알부민을 얻을 수 있다.

이렇게 얻은 재조합 알부민은 도 2a 및 도 2b에서 보는 바와 같이, 약물체가 결합할 수 있는 자리인 시스테인을 다수 포함하고 있어, 알부민-약물 컨쥬게이션 효율을 향상시키므로 다량의 약물을 표적 조직에 효과적으로 전달할 수 있으며, 재조합 유전자 제조시에 시스테인의 갯수를 조절함으로써 알부민 단일 개체당 결합되는 약물의 갯수를 조절할 수 있다는 장점이 있다.

얻어진 재조합 알부민은 이온 교환 크로마토그래피와 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion gel filtration chromatography)를 이용하여 분리 정제하였고, 변성 SDS-PAGE 전기영동과 질량분석 결과를 통해 분자량을 확인하였다(도 3).

또한, 도 4에서 보는 바와 같이 폴리-시스테인 펩티드가 알부민의 N-말단 또는 C-말단에 단독으로 융합하거나 양쪽 말단에 동시에 융합된 여러 형태의 재조합 알부민이 피치아 파스토리스에서 발현될 수 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 질량 분석을 실시한 결과, 인간 혈청 알부민과 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민은 각각 67.2KDa, 74.8KDa의 분자량을 나타내서 약 7.6KDa의 차 이를 보이는 것을 알 수 있었으며(도 5a 및 도 5b), 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민은 인간 혈청 알부민과 단백질 접힘이 동일하게 나타나는 것을 알 수 있었다(도 6).

이로써 본 발명의 재조합 알부민은 수계에서 알부민의 3차원 구조와 기능에 영향을 주지 않으면서 기존 알부민의 고유한 물리화학적 성질을 유지하는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 기존 알부민의 장점인 암이나 루마티스 관절염같은 표적 조직에서의 높은 축적성, 정상조직에서의 낮은 침투력, 낮은 독성, 다양한 약물과의 결합 용이성, 표적 조직에서의 약물 방출, 생분해 시간의 장점으로 인한 안정성, 우수한 생체 적합성, 결합된 약물의 용해도를 비롯한 물리화학적 성질 개선 등의 우수한 약물 전달 기능을 유지할 것임을 시사하고 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 알부민은 기존 알부민의 우수한 약물 전달 기능은 유지하고, 기존 알부민의 부작용을 개선한 우수한 약물 전달체로 사용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 효모에서 발현된 재조합 알부민의 DNA 서열을 시퀀싱한 결과(도 7), 알부민 부위는 동일하며, RGD 리간드 펩티드와 폴리-시스테인 펩티드 모티프가 계획한 바와 같이 발현되었음을 확인할 수 있었다. 따라서, 유전자 재조합 방법에 의하여 융합되는 폴리-시스테인 펩티드의 구성 서열 및 그 길이를 조절할 수 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 재조합 알부민은 siRNA와 결합하여 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민-siRNA의 이황화 결합 복합체를 형성할 수 있음을 확인하였다.

이상과 같이, 본 발명의 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민은 폴리- 시스테인 펩티드, 링커 펩티드, 약물체, 분자 영상용 형광체, 표적인식 리간드를 용이하게 변경하고 제어할 수 있으므로, 특정 약물/알부민 비율, 특정 약물, 특정 파장대의 형광, 특정 표적조직 인식 리간드를 쉽게 제조할 수 있으며, 따라서 다양한 알부민 기반의 전달체를 설계할 수 있다는 우수성이 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 알부민을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 상기 발현벡터를 제조하는 단계;

상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 발현벡터는 알부민 유전자의 양 말단 중 어느 한 쪽 또는 양 말단에 폴리-시스테인 펩티드 유전자를 융합시킨 구조를 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 제조 방법에 있어서, 단계 2)의 숙주 세포는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 제조 방법에 있어서, 단계 3)에서 제조된 재조합 알부민을 분리, 정제또는 확인하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 암, 골 관절염, 류마티스 관절염, 치매, 자가면역 질환, 뇌졸중 등의 다양한 질병의 진단 및 치료에 사용될 수 있다.

상기 암은 편평 상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암 등을 포함하는 암 등이 바람직하나 이에 한정되지는 않는다.

또한, 본 발명은

2) 형광을 조사하여 질병 조직을 영상화하는 단계를 포함하는 질명 진단 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 재조합 알부민은 다양한 암 세포에 대하여 siRNA를 표적 유전자에 전달하여 표적 유전자의 과다 발현을 억제시키는 방법에 이용될 수 있으며, 이러한 작용을 하는 신약을 스크리닝하는 방법에 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민의 발현벡터 제조

알부민에 폴리-시스테인 펩티드와 링커 펩티드를 삽입하기 위하여 유전자 재조합 방법을 이용하였다. 발현벡터는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 효모의 발현벡터인 pUIC9를 사용하였고, 제한 효소를 이용하여 폴리-시스테인 펩티드와 링커 펩티드를 발현시키는 서열을 삽입하였다.

삽입된 폴리-시스테인 펩티드의 아미노산 서열은 서열번호1 또는 서열번호2와 같고, 이러한 폴리-시스테인 펩티드는 알부민의 N-말단 또는 C-말단에 단독으로 융합하거나 양쪽 말단에 동시에 융합될 수 있다.

서열번호1: [ CGCGCGCGCGCGCGCGCGCG ]

서열번호2: [ CGCGCGCGCG ]

링커 펩티드로는 서열번호3의 펩티드 등을 사용할 수 있으며, 글라이신, 세린, 알라닌 등을 주로 사용하였다.

서열번호3: [ GSGAGSGA ]

암세포로의 표적지향성을 부여하기 위하여 암세포에서 과량발현되는 수용체에 결합하는 RGD 펩티드 유전자를 폴리-시스테인 펩티드 서열 앞에 융합시켰다.

pUIC9 발현벡터에 폴리-시스테인 펩티드를 코딩하는 서열, 링커 펩티드를 코딩하는 서열 및 RGD 펩티드 유전자를 포함하는 부분을 도식화하여 도 1에 나타냈다.

<실시예 2> 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민의 대량 발현 및 분리 정제

RGD가 포함된 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민을 HIS4 부위로 삽입시키기 위하여 다음과 같이 실험하였다.

SalI 제한효소로 발현 벡터를 자른 뒤 컬럼으로 정제하였고, 얻어진 DNA 100ng을 전기충격법(electrophoration)으로 활성화 세포(competent cell) 40㎕에 형질전환시킨 후, 히스티딘이 없는 배지(HIS(-) media)에서 히스티딘을 생성하는 표현형(HIS+phenotype, HIS+표현형)을 선별(selection)하였다.

얻어진 형질전환체(transformant) 50개를 대조군(control strain, GS115 Albumin: HIS+Muts)과 함께 평판반복법(replica method)을 이용하여 MD, MM 배지에서 모두 잘 자라는 균주(Mut+ phenotype, Mut+표현형)을 선별하였다. 8개의 HIS+Mut+표현형 균주의 genomic DNA를 분리하여 PCR로 삽입된 것을 확인하였고, 이러한 3가지 확인 방법을 모두 만족하는 균주를 발현 시험(expression test)에 사용하였다.

BMGY 배양 플라스크(BMGY 20ml/250ml baffled flask)에 종균(seed culture, 30℃, 180-200rpm, 12시간)한 후 세포를 채취(harvest)하여 BMMY 배양 플라스크(BMMY 50ml/250ml baffled flask)에 접종하여 소규모 발현 시험(small scale expression test)을 진행하였다.

메탄올은 0.5%로 12시간마다 induction하였고, 0-96 시간까지 배양하여 최적의 배양 조건을 찾았고, 그 조건은 하기와 같다.

[HIS(-) 배지: YBB 6.7g, HIS DO supplement 0.77g, 포도당 20g, 한천 15g]

[MM 배지: YNB 13.4g, 비오틴(biotin) 4x10-5%, 메탄올 0.5%, 한천 15g]

[MD 배지: YNB 13.4g, 비오틴 4x10-5%, 포도당 20g, 한천 15g]

[BMGY 배지: 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 6.0), YNB 13.4g, 효모 추출액 10g, 박토펩톤(bactopeptone) 20g, 글리세롤(Glycerol) 10g, 비오틴 4x10-5%]

[BMMY 배지: 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 6.0), YNB 13.4g, 효모 추출액 10g, 박토펩톤 20g, 메탄올 0.5%, 비오틴 4x10-5%]

배지를 수거하여 농축한 후, 이온 교환 크로마토그래피와 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion gel filtration chromatography)를 이용하여 단백질을 분리 정제하였다. 정제된 단백질의 분자량을 변성 SDS-PAGE(denaturing SDS-PAGE) 전기영동과 질량분석기(MALD-TOF)를 통하여 확인하였고, 그 결과는 도 3 내지 도 5에 나타내었다.

도 3에서 보는 바와 같이, 폴리-시스테인 펩티드가 융합된 재조합 알부민은 변성 SDS-PAGE 전기영동과 질량분석 결과를 통해 분자량을 확인하였다.( M: 단백질 마커, m: 인간 혈청 알부민, before: injection하기 전 샘플, 8-14: eluted fractions )

도 4에서는 폴리-시스테인 펩티드가 알부민의 N-말단 또는 C-말단에 단독으로 융합하거나 양쪽 말단에 동시에 융합된 여러 형태의 재조합 알부민이 피치아 파스토리스에서 발현된 결과를 나타내고 있다.

또한, 기존의 인간 혈청 알부민과 RGD 리간드를 포함하는 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민의 분자량을 알아보기 위하여, MALDI-TOF 질량 분석기를 이용하여 질량 분석을 실시하였다(도 5a 및 도 5b). 도 5a 및 도 5b에서 보는 바와 같이, 인간 혈청 알부민은 67.2KDa의 분자량을 나타냈으며, 본 발명의 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민은 74.8KDa의 분자량을 나타내서 약 7.6KDa의 차이를 보였다.

또한, RGD 리간드를 포함하는 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민에 있어서 2차 구조(secondary structure)와 단백질 접힘에 영향이 있는지를 알아보기 위하여 원편광 이색성 분광 분석법(Circular Dichroism, CD)을 이용하여 단백질 접힘을 측정하였다(도 6). 도 6에서 보는 바와 같이, 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민은 인간 혈청 알부민과 단백질 접힘이 동일하게 나타나는 것을 알 수 있었다.

또한, 피치아 파스토리스 효모에서 발현된 재조합 알부민의 DNA 서열을 시퀀싱한 결과(도 7), 재조합 알부민의 알부민 부위는 기존의 알부민과 동일하며, RGD 리간드 펩티드와 폴리-시스테인 펩티드 모티프가 설계한 바와 같이 발현되었음을 확인할 수 있었다.

하기 서열번호4는 본 실시예에서 얻은 재조합 알부민의 아미노산 서열이고, 서열번호5는 인간 혈청 알부민의 아미노산 서열이며, 서열번호6은 재조합 알부민을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 서열이다.

서열번호4:

YVRGDGASAGSGEFCGCGCGCGCGCGCGCGCGCDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVA ASQAALGL

서열번호5:

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL

서열번호6:

tacgtaagaggtgatggtgcttctgctggttctggtgaattctgtggatgtggttgtggttgtggatgtggttgtggatgtggttgtggatgtggttgtgatgcacacaagagtgaggttgctcatcggtttaaagatttgggagaagaaaatttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagtgtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgcaaaaacatgtgttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttcataccctttttggagacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacctatggtgaaatggctgactgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaagatgacaacccaaacctcccccgattggtgagaccagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaagagacatttttgaaaaaatacttatatgaaattgccagaag acatccttacttttatgccccggaactccttttctttgctaaaaggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgataaagctgcctgcctgttgccaaagctcgatgaacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgccaaacagagactcaagtgtgccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaagcatgggcagtagctcgtctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcagaagtttccaagttagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatggagatctgcttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgtgaaaatcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctctgttggaaaaatcccactgcattgccgaagtggaaaatgatgagatgcctgctgacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaaaaactatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaatatgcaagaaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgccaagacatatgaaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctcatgaatgctatgccaaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagcctcagaatttaatcaaacaaaattgtgagctttttgagcagcttggagagtacaaattccagaatgcgctattagttcgttacaccaagaaagtaccccaagtgtcaactccaactcttgtagaggtctcaagaaacctaggaaaagtgggcagcaaatgttgtaaacatcctgaagcaaaaagaatgccctgtgcagaagactatctatccgtggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatgagaaaacgccagtaagtgacagagtcaccaaatgctgcacagaatccttggtgaacaggcgaccatgcttttcagctctggaagtcgatgaaacatacgttcccaaagagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagatatatgcacactttctgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgttgagctcgtgaaacacaagcccaaggcaacaaaagagcaactgaaagctgttatggatgatttcgcagcttttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataaggagacctgctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgctgcaagtcaagctgccttaggcttataa

<실시예 3> 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민과 약물체와의 결합 방법

약물체와 폴리-시스테인 융합 재조합 알부민을 화학적 결합에 의하여 재조합 알부민-약물체 결합체를 제조하였다. 약물체로서는 항암제, siRNA 또는 난치성 치료제를 사용하였다.

siRNA를 약물체로 사용하는 경우에는 siRNA의 5'-말단을 아민으로 수식하고 재조합 알부민의 N-말단과 C-말단에 존재하는 폴리-시스테인 잔기들과 싸이올(thiol) 결합하도록 하였다. 이 때, PBS-EDTA(pH7.4)에 녹아있는 아민으로 수식된 siRNA(250 ug)를 sulfo-LC-SPDP(sulfo-succinimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)-propionamido]hexanoate)와 실온에서 2시간 반응시켜 피리딘다이싸이올-활성화 siRNA(pyridyldithiol-activated siRNA)를 만들었다. 남은 SPDP와 반응 부산물은 탈염(desalting) 컬럼을 써서 제거하였다.

이렇게 만든 siRNA와 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민을 분자비를 조절하는 최적화과정을 통해 PBS-EDTA(pH7.4)에서 섞어 실온에서 12시간 반응시켜 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민-siRNA의 이황화 결합 복합체를 만들었다.

도 1은 유전자 재조합 방법에 의하여 RGD(Arginine-Glycine-Aspartic acid) 펩티드 유전자, 폴리-시스테인 펩티드 유전자, 링커 펩티드 유전자, 알부민 유전자가 재조합된 유전자 및 이로부터 하나의 아미노산 사슬로 발현된 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민을 도식화한 도이다.

도 2a는 본 발명의 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민의 3차 구조를 모델로 표현한 도이고, 도 2b는 34번 시스테인 잔기만을 약물 결합에 이용하는 기존 인간 혈청 알부민의 3차 구조를 모델로 표현한 도이다(N: N-말단, C: C-말단, 파란색 표면 모델: 표면 모델로 표현된 알부민 3차구조, 초록 써클: 결합가능한 약물체, 노란색 및 주황색 나선: 폴리-시스테인 잔기들).

도 3은 변성 SDS-PAGE 전기영동과 질량분석기(MALD-TOF)를 통하여 본 발명의 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민의 분자량을 확인한 도이다( M: 단백질의 분자량 마커, m: 인간 혈청 알부민, before: 주입(injection)하기 전 샘플, 8-14: 용출 분획(eluted fractions) )

도 4는 폴리-시스테인 펩티드가 알부민의 N-말단 또는 C-말단에 단독으로 융합하거나 양쪽 말단에 동시에 융합된 여러 형태의 재조합 알부민이 피치아 파스토리스에서 발현된 결과를 나타낸 도이다.

(1: C-말단에 서열번호1의 폴리-시스테인 펩티드가 융합된 재조합 알부민;

2; N-말단에 서열번호1의 폴리-시스테인 펩티드가 융합된 재조합 알부민;

3: N-말단에 RGD와 C-말단에 서열번호1의 폴리-시스테인 펩티드가 각각 융합 된 재조합 알부민;

4: N-말단에 RGD와 서열번호1의 폴리-시스테인 펩티드가 융합된 재조합 알부민;

5: N-말단과 C-말단에 서열번호1의 폴리-시스테인 펩티드가 각각 융합된 재조합 알부민;

6: N-말단에 RGD, 서열번호1의 폴리-시스테인 펩티드와 C-말단에 서열번호1의 폴리-시스테인 펩티드가 융합된 재조합 알부민;

7: C-말단에 서열번호2의 폴리-시스테인 펩티드가 융합된 재조합알부민;

c: 인간 혈청 알부민; 및

m: 단백질의 분자량 마커)

도 5a는 인간 혈청 알부민에 대하여 MALDI-TOF 질량 분석기를 이용한 질량 분석 결과를 나타내는 도이고, 도 5b는 RGD 리간드를 포함하는 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민에 대하여 MALDI-TOF 질량 분석기를 이용한 질량 분석 결과를 나타내는 도이다.

도 6는 인간 혈청 알부민과 RGD 리간드를 포함하는 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민에 대하여 CD (Circular Dichroism)을 이용해서 2차 구조(secondary structure)와 단백질 접힘이 일치함을 확인한 도이다.

도 7은 피치아 파스토리스 효모에서 발현된 RGD 리간드를 포함하는 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민의 DNA 시퀀싱 결과를 보여주는 도이다. (hsAlb: 인간 혈청 알부민, RGD-N10-hsA: RGD 리간드를 포함하는 폴리-시스테인 펩 티드 융합 재조합 알부민, 빨간색 테두리: RGD 리간드, 파란색 테두리: 폴리-시스테인 펩티드 모티프)

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Recombinant albumins fused with poly-cysteine peptide and the methods for preparing the same <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> poly-cysteine peptide <400> 1 Cys Gly Cys Gly Cys Gly Cys Gly Cys Gly Cys Gly Cys Gly Cys Gly 1 5 10 15 Cys Gly Cys Gly 20 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> poly-cysteine peptide <400> 2 Cys Gly Cys Gly Cys Gly Cys Gly Cys Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 3 Gly Ser Gly Ala Gly Ser Gly Ala 1 5 <210> 4 <211> 618 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant albumin fused with poly-cysteine peptide <400> 4 Tyr Val Arg Gly Asp Gly Ala Ser Ala Gly Ser Gly Glu Phe Cys Gly 1 5 10 15 Cys Gly Cys Gly Cys Gly Cys Gly Cys Gly Cys Gly Cys Gly Cys Gly 20 25 30 Cys Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly 35 40 45 Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu 50 55 60 Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr 65 70 75 80 Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp 85 90 95 Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr 100 105 110 Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu 115 120 125 Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn 130 135 140 Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe 145 150 155 160 His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala 165 170 175 Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys 180 185 190 Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala 195 200 205 Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala 210 215 220 Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly 225 230 235 240 Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe 245 250 255 Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr 260 265 270 Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp 275 280 285 Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile 290 295 300 Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser 305 310 315 320 His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro 325 330 335 Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr 340 345 350 Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala 355 360 365 Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys 370 375 380 Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His 385 390 395 400 Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu 405 410 415 Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly 420 425 430 Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val 435 440 445 Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly 450 455 460 Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro 465 470 475 480 Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu 485 490 495 His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu 500 505 510 Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu 515 520 525 Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala 530 535 540 Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr 545 550 555 560 Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln 565 570 575 Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys 580 585 590 Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu 595 600 605 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 610 615 <210> 5 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 585 <210> 6 <211> 1857 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding recombinant albumin fused with poly-cysteine peptide <400> 6 tacgtaagag gtgatggtgc ttctgctggt tctggtgaat tctgtggatg tggttgtggt 60 tgtggatgtg gttgtggatg tggttgtgga tgtggttgtg atgcacacaa gagtgaggtt 120 gctcatcggt ttaaagattt gggagaagaa aatttcaaag ccttggtgtt gattgccttt 180 gctcagtatc ttcagcagtg tccatttgaa gatcatgtaa aattagtgaa tgaagtaact 240 gaatttgcaa aaacatgtgt tgctgatgag tcagctgaaa attgtgacaa atcacttcat 300 accctttttg gagacaaatt atgcacagtt gcaactcttc gtgaaaccta tggtgaaatg 360 gctgactgct gtgcaaaaca agaacctgag agaaatgaat gcttcttgca acacaaagat 420 gacaacccaa acctcccccg attggtgaga ccagaggttg atgtgatgtg cactgctttt 480 catgacaatg aagagacatt tttgaaaaaa tacttatatg aaattgccag aagacatcct 540 tacttttatg ccccggaact ccttttcttt gctaaaaggt ataaagctgc ttttacagaa 600 tgttgccaag ctgctgataa agctgcctgc ctgttgccaa agctcgatga acttcgggat 660 gaagggaagg cttcgtctgc caaacagaga ctcaagtgtg ccagtctcca aaaatttgga 720 gaaagagctt tcaaagcatg ggcagtagct cgtctgagcc agagatttcc caaagctgag 780 tttgcagaag tttccaagtt agtgacagat cttaccaaag tccacacgga atgctgccat 840 ggagatctgc ttgaatgtgc tgatgacagg gcggaccttg ccaagtatat ctgtgaaaat 900 caagattcga tctccagtaa actgaaggaa tgctgtgaaa aacctctgtt ggaaaaatcc 960 cactgcattg ccgaagtgga aaatgatgag atgcctgctg acttgccttc attagctgct 1020 gattttgttg aaagtaagga tgtttgcaaa aactatgctg aggcaaagga tgtcttcctg 1080 ggcatgtttt tgtatgaata tgcaagaagg catcctgatt actctgtcgt gctgctgctg 1140 agacttgcca agacatatga aaccactcta gagaagtgct gtgccgctgc agatcctcat 1200 gaatgctatg ccaaagtgtt cgatgaattt aaacctcttg tggaagagcc tcagaattta 1260 atcaaacaaa attgtgagct ttttgagcag cttggagagt acaaattcca gaatgcgcta 1320 ttagttcgtt acaccaagaa agtaccccaa gtgtcaactc caactcttgt agaggtctca 1380 agaaacctag gaaaagtggg cagcaaatgt tgtaaacatc ctgaagcaaa aagaatgccc 1440 tgtgcagaag actatctatc cgtggtcctg aaccagttat gtgtgttgca tgagaaaacg 1500 ccagtaagtg acagagtcac caaatgctgc acagaatcct tggtgaacag gcgaccatgc 1560 ttttcagctc tggaagtcga tgaaacatac gttcccaaag agtttaatgc tgaaacattc 1620 accttccatg cagatatatg cacactttct gagaaggaga gacaaatcaa gaaacaaact 1680 gcacttgttg agctcgtgaa acacaagccc aaggcaacaa aagagcaact gaaagctgtt 1740 atggatgatt tcgcagcttt tgtagagaag tgctgcaagg ctgacgataa ggagacctgc 1800 tttgccgagg agggtaaaaa acttgttgct gcaagtcaag ctgccttagg cttataa 1857

Claims

알부민(albumin)에 폴리-시스테인(poly-cysteine) 펩티드가 융합된 재조합 알부민.
제1항에 있어서, 상기 알부민은 인간 알부민(human albumin), 이의 단편 또는 이의 변이체인 것을 특징으로 하는 재조합 알부민.
제1항에 있어서, 상기 폴리-시스테인 펩티드는 알부민의 양 말단 중 어느 한 쪽 또는 양 말단에 융합된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 알부민.
제1항에 있어서, 상기 폴리-시스테인 펩티드는 시스테인 잔기를 1 내지 100개로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 알부민.
제1항에 있어서, 상기 폴리-시스테인 펩티드는 서열번호1 또는 서열번호2로 기재되는 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 알부민.
제1항에 있어서, 알부민의 양 말단과 폴리-시스테인 펩티드 사이에 링커 펩티드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 알부민.
제6항에 있어서, 상기 링커 펩티드는 글라이신(glycine), 세린(serine) 또는 알라닌(alanine)으로 구성되는 것을 특징으로 하는 재조합 알부민.
제6항에 있어서, 상기 링커 펩티드는 서열번호3으로 기재되는 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 알부민.
제1항에 있어서, 표적 조직 인식 리간드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 알부민.
제9항에 있어서, 상기 표적 조직 인식 리간드는 유전자 재조합 기술을 이용하여 폴리-시스테인 펩티드 양 쪽 말단 중 어느 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 단백 질 사슬 결합 또는 공유 결합되거나, 폴리-시스테인 펩티드의 잔기에 결합된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 알부민.
제9항에 있어서, 상기 표적 조직 인식 리간드는 RGD(Arginine-Glycine-Aspartic acid)를 포함하는 펩티드, 앱타머(aptamer) 및 엽산(folate)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 재조합 알부민.
제1항의 재조합 알부민에 약물체를 결합시킨 재조합 알부민-약물체 결합체.
제12항에 있어서, 약물체는 항암제, siRNA 또는 난치성 질환 치료제인 것을 특징으로 하는 재조합 알부민-약물체 결합체.
제12항의 재조합 알부민-약물체 결합체를 포함하는 약학적 조성물.
제1항의 재조합 알부민에 분자 영상용 형광체를 결합시킨 재조합 알부민-분 자 영상용 형광체 복합체.
제15항에 있어서, 상기 분자 영상용 형광체는 유전자 재조합 기술을 이용하여 폴리-시스테인 펩티드 양 쪽 말단 중 어느 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 단백질 사슬 결합 또는 공유 결합되거나, 폴리-시스테인 펩티드의 잔기에 결합된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 알부민-분자 영상용 형광체 복합체.
제15항에 있어서, 상기 분자 영상용 형광체는 적색 또는 근적외선의 형광을 발광하는 형광체인 것을 특징으로 하는 재조합 알부민-분자 영상용 형광체 복합체.
제15항에 있어서, 상기 분자 영상용 형광체는 플루오레신(fluorescein), 보디피(BODYPY), 테트라메틸로드아민(Trtramethylrhodamine), 알렉사(Alexa), 시아닌(Cyanine), 알로피코시아닌(allopicocyanine), 형광 단백질(Dronpa), 형광 발색 유전자(EGFP), 적색 형광 프로테인(red fluorescent protein, DsRFP), 시아닌 형광체(Cy5.5), 산화철, 방사성 동위원소 및 이들의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 재조합 알부민-분자 영상용 형광체 복합체.
제15항의 재조합 알부민-분자 영상용 형광체 복합체를 포함하는 질병 진단용 조성물.
하기의 <구조식 1> 내지 <구조식 4> 중 어느 하나의 구조로 이루어지는 것을 특징으로 하는 재조합 알부민.

<구조식 1>

<구조식 2>

<구조식 3>

<구조식 4>

상기 식에서, T는 표적 조직 인식 리간드를 표시하는 것이고, C는 폴리-시스테인 펩티드를 표시하는 것이며, L은 링커 펩티드를 표시하는 것이고, A는 알부민을 표시하는 것이며, D는 약물체를 표시하는 것이고, P는 분자 영상용 형광체를 표시하는 것이다.
제1항에 있어서, 재조합 알부민은 서열번호4의 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 알부민.
제1항의 재조합 알부민을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
제22항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호6의 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제23항의 폴리뉴클레오티드가 도입된 발현벡터.
제24항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
1) 제24항의 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 제조된 발현벡터로 숙주 세포를 형질전환시켜 제25항의 형질전환체를 제조하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)에서 제조된 형질전환체로부터 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민을 얻는 단계를 포함하는 제1항의 재조합 알부민 제조 방법.
제26항에 있어서, 상기 단계 2)의 숙주 세포는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)인 것을 특징으로 하는 재조합 알부민 제조 방법.
제26항에 있어서, 상기 단계 3)에서 제조된 재조합 알부민을 분리, 정제 또는 확인하는 단계 4)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 알부민 제조 방법.
제26항의 단계 3)에서 제조된 재조합 알부민과 약물체를 결합시켜 재조합 알부민-약물체 결합체를 얻는 단계 4)를 추가적으로 포함하는 재조합 알부민-약물체 결합체 제조 방법.
제26항의 단계 3)에서 제조된 재조합 알부민과 분자 영상용 형광체를 결합시켜 재조합 알부민-분자 영상용 형광체 복합체를 얻는 단계 4)를 추가적으로 포함하는 재조합 알부민-분자 영상용 형광체 복합체 제조 방법.
제12항의 재조합 알부민-약물체 결합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질병 치료 방법.
제31항에 있어서, 상기 질병은 암, 골 관절염, 류마티스 관절염, 치매, 자가면역 질환 및 뇌졸중으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 질병 치료 방법.
제32항에 있어서, 상기 암은 편평 상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암 및 담낭암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 질병 치료 방법.
1) 제15항의 재조합 알부민-분자 영상용 형광체 복합체를 개체에 투여하는 단계; 및

2) 형광을 조사하여 질병 조직을 영상화하는 단계를 포함하는 질명 진단 방법.