WO2016093321A1 - 細胞培養方法及び細胞培養装置 - Google Patents

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liquid
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鈴木　順
忠孝 上山
孝仁 小此木
徹 夏目
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株式会社アイカムス・ラボ
国立研究開発法人産業技術総合研究所
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Definitions

  • the present invention relates to a cell culture method and a cell culture apparatus capable of performing long-term culture without causing stress or injury to cells.
  • stem cells for example, treatment of cirrhosis or blood disease, treatment of myocardial infarction, construction of blood vessels, regeneration of bone or cornea, securing of skin for transplantation, etc. are considered.
  • target cells and organs are grown from stem cells or the like in a culture dish and transplanted to a person.
  • angiogenesis from bone marrow-derived stem cells has been successfully performed to treat angina pectoris and myocardial infarction.
  • the culture solution in the culture dish is periodically replaced to grow the cultured cells.
  • the cells are greatly stimulated with the replacement of the culture solution, and wastes are discharged into the culture solution with the metabolic activity of the cells, causing stress and injury to the cells. There was a problem that.
  • Patent Literature 1 discloses a cell culture device that monitors a cell growth rate, predicts a decrease in nutrients in the culture solution based on the monitored growth rate, and adds consumed nutrients to the culture solution. Are listed.
  • Patent Document 2 describes a cell culture method in which a culture solution is circulated through a culture tank using a filter module made of hollow fibers to add nutrients in the culture solution and remove waste products.
  • the cell culture device described in Patent Document 1 continuously feeds nutrients to the culture tank, it is a system in which the culture liquid is stored in the culture tank, so that it is discharged by the metabolic activity of the cells in the culture liquid.
  • the culture solution in the culture tank must be exchanged at a time, as in the conventional cell culture device, at an arbitrary timing. If the frequency of this whole culture medium exchange is performed once a day, as a result, stress and injury are given to the cells as in the conventional cell culture apparatus.
  • Patent Document 2 a very small amount of culture solution is continuously fed and drained. However, when the culture period becomes long, the filter module is clogged with waste products, which is long. Not suitable for period culture. In particular, since the culture period until a cell required in recent regenerative medicine or the like is obtained is a long period of about one month, it is impossible to culture for a long period of time. Means that it cannot be cultured.
  • the present invention has been made in view of the above, and an object of the present invention is to provide a cell culture method and a cell culture apparatus that can perform long-term culture without causing stress or injury to cells.
  • the cell culture method includes arranging cultured cells in a culture dish, and providing a liquid necessary for the growth or maintenance of the cultured cells in the culture dish.
  • the liquid discharge port is provided at the other end of the culture dish, and the linear movement speed of the liquid from the supply port toward the discharge port is less than the maximum speed at which no shear stress is applied to the cultured cells. The liquid is discharged while being supplied to the culture dish.
  • the cell culture method according to the present invention is characterized in that, in the above-mentioned invention, the linear velocity of movement of the liquid is equal to or less than a diffusion rate due to molecular motion of the liquid.
  • the cell culture device arranges cultured cells in a culture dish, supplies liquid necessary for the growth or maintenance of the cultured cells into the culture dish and discharges the liquid in the culture dish.
  • a reservoir tank for storing the liquid to be supplied to the culture dish, a waste liquid tank for storing the liquid discharged from the culture dish, and the supply port
  • a supply-side micro flow pump for supplying the liquid in the reservoir tank to the culture dish, a discharge-side micro flow pump for discharging the liquid from the culture dish via the discharge port, and the discharge from the supply port.
  • a flow rate controller that controls the flow rate of the supply side micro flow rate pump and the discharge side micro flow rate pump so that the linear velocity of movement of the liquid is less than the maximum rate that does not apply shear stress to the cultured cells. It is characterized by that.
  • the cell culture device is characterized in that, in the above invention, the linear velocity of movement of the liquid is equal to or less than a diffusion velocity due to molecular motion of the liquid.
  • the surface free energy on the side surface of the culture dish is smaller than the surface free energy on the bottom surface of the culture dish.
  • the cell culture device is characterized in that, in the above-mentioned invention, a horizontal adjustment mechanism for adjusting a bottom surface of the culture dish horizontally is provided.
  • the cell culture device is characterized in that, in the above-mentioned invention, an inclination adjustment mechanism for adjusting the bottom surface of the culture dish obliquely is provided.
  • the cell culture device is characterized in that, in the above-mentioned invention, the supply port and the discharge port are plural, and each is arranged in a linear manner.
  • the cell culture device is the above invention, wherein between the outlet of the supply-side micro flow pump and the supply port, and between the outlet and the inlet of the discharge-side micro flow pump. Are connected by a flexible tube, and the opening of the flexible tube is provided between the supply side micro flow pump and the supply port and between the discharge side micro flow pump and the discharge port, respectively.
  • An aperture adjustment mechanism for reducing the aperture is provided.
  • the cell culture device is the above invention, between the reservoir tank and the inlet of the supply side micro flow pump, between the outlet and the supply port of the supply side micro flow pump, The discharge port and the inflow port of the discharge side micro flow rate pump, and the outflow port of the discharge side micro flow rate pump and the waste liquid tank are directly and detachably connected.
  • the cell culture device is the above-mentioned invention, wherein one end of a multi-stage arrangement in which the reservoir tank is provided on an upper part of a supply-side flow path connecting the supply port and an outlet of the supply-side micro flow rate pump. From the other end, the inlet of the supply-side micro flow pump is detachably connected to the reservoir tank, and the outlet of the supply-side micro flow pump is connected to the supply side.
  • a second flow path, a third flow path between the culture dish and the discharge micro flow pump, and a fourth flow path between the discharge micro flow pump and the waste liquid tank are embedded inside.
  • the cell culture device includes a liquid level detection sensor that detects a liquid level in the culture dish in the above invention, and the flow rate control unit detects a liquid level detected by the liquid level detection sensor.
  • the flow rate is controlled so as to be constant.
  • the supply-side drive source for driving the supply-side micro flow pump is attachable to and detachable from the supply-side micro flow pump.
  • the discharge-side drive source for driving is detachable from the discharge-side micro flow rate pump.
  • the cell culture device includes, in the above invention, a substrate on which at least the culture dish is arranged, and the substrate has a hole or the culture dish in a region where the culture state of the cultured cell is observed. It is characterized in that a colorless and transparent recess having an opening on the opposite side is formed.
  • the transparent conductive film heater provided at the bottom of the culture dish, a temperature sensor for detecting the temperature of the liquid in the culture dish, and the temperature sensor in the above invention And a temperature control unit that controls to keep the temperature of the liquid in the culture dish within a predetermined temperature range by energizing the transparent conductive film heater based on the detection result.
  • a liquid supply port necessary for the growth or maintenance of the cultured cells is provided at one end of the culture dish so as to sandwich the cultured cells, and the liquid discharge port is provided at the other end of the culture dish, Since the linear velocity of movement of the liquid from the supply port toward the discharge port is less than the maximum speed at which no shear stress is applied to the cultured cells, the liquid is discharged while being supplied to the culture dish.
  • the culture can be performed for a long time without causing stress or injury to the cells, and consumption of the liquid can be suppressed.
  • FIG. 1 is a perspective view showing an external configuration of a cell culture device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a block diagram showing a configuration of the cell culture apparatus shown in FIG.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view showing the structure of holes formed in the substrate in the region where the culture dish is arranged.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view showing the configuration of holes formed in the substrate in the region where the reservoir tank is arranged.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram for explaining the function of the aperture adjustment mechanism.
  • FIG. 6 is a diagram showing the expression rate of shear stress-affected cells appearing in cultured cells with respect to the linear velocity of the culture solution moving from the supply port to the discharge port.
  • FIG. 1 is a perspective view showing an external configuration of a cell culture device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a block diagram showing a configuration of the cell culture apparatus shown in FIG.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view showing the structure of holes formed
  • FIG. 7 is a diagram showing a state image of the culture solution flowing from the supply port side surface toward the discharge port side surface.
  • FIG. 8 is a diagram showing the movement of the culture solution over time as the relative concentration changes.
  • FIG. 9 is a flowchart showing the flow rate control processing procedure of the culture solution by the flow rate control unit.
  • FIG. 10 is a diagram illustrating an example of the arrangement configuration of the supply port openings.
  • FIG. 11 is a diagram illustrating an example of the arrangement configuration of the supply port openings.
  • FIG. 12 is a diagram showing a state image of the culture solution flowing from the supply port side surface toward the discharge port side surface when a fluorine-based water repellent is applied to the side surface of the culture dish.
  • FIG. 10 is a diagram illustrating an example of the arrangement configuration of the supply port openings.
  • FIG. 11 is a diagram illustrating an example of the arrangement configuration of the supply port openings.
  • FIG. 12 is a diagram showing a state image of the culture solution flowing from the supply
  • FIG. 13 is a front view showing a configuration in the vicinity of a culture dish of a cell culture device provided with a horizontal adjustment mechanism.
  • FIG. 14 is a partially broken front view showing a specific configuration of the horizontal adjustment mechanism.
  • FIG. 15 is a diagram illustrating an example of an arrangement configuration and a connection configuration of a liquid feeding unit and a liquid discharging unit.
  • FIG. 16 is a diagram illustrating an example of an arrangement configuration and a connection configuration of the liquid feeding unit and the liquid discharging unit.
  • FIG. 17 is a perspective view showing an arrangement configuration of the cell culture device in the transport box.
  • FIG. 1 is a perspective view showing an external configuration of a cell culture device 1 according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a block diagram showing the configuration of the cell culture device 1 shown in FIG.
  • the cell culture apparatus 1 is provided with a culture dish 3 in the upper center of the substrate 2, and the culture solution is placed in the culture dish 3 so as to sandwich the culture dish 3 from both ends of the culture dish 3.
  • a liquid supply unit 10 to be supplied and a drainage unit 20 for discharging the culture solution from the culture dish 3 are provided on the substrate 2.
  • a culture solution supply port 4 is provided on the supply port side surface 3 a that is one end side of the culture dish 3 so as to sandwich the cultured cells 6, and the discharge port side surface that is the other end side of the culture dish 3.
  • the culture medium outlet 5 is provided in 3b.
  • Six supply ports 4 and six discharge ports 5 are provided, and each of them is discretely arranged linearly along the supply port side surface 3a and the discharge port side surface 3b.
  • the opening of the supply port 4 and the discharge port 5 is arrange
  • the liquid delivery unit 10 includes a reservoir tank 11, a supply-side minute flow rate pump 12, and a throttle adjustment mechanism 13.
  • the reservoir tank 11 stores a culture solution.
  • the supply-side micro flow rate pump 12 supplies the culture solution in the reservoir tank 11 to the supply port 4 of the culture dish 3.
  • the throttle adjustment mechanism 13 has a variable throttle function for readjusting the flow rate of the culture solution supplied from the supply-side micro flow rate pump 12.
  • the culture fluid outlet of the reservoir tank 11 and the culture fluid inlet of the supply-side micro flow rate pump 12 are connected by a flow path L11 composed of six flexible tubes. Further, the culture solution outlet of the supply-side micro flow pump 12 and the supply port 4 are connected by a flow path L12 made up of six flexible tubes.
  • the aperture adjustment mechanism 13 can perform variable aperture for each of the six flexible tubes of the flow path L12.
  • the supply side micro flow pump 12 has a pump group 12a composed of six peristaltic pumps, a speed reducer 12b, and a motor 12c. Each peristaltic pump can be connected in multiple stages along the rotation axis.
  • the speed reducer 12b decelerates the rotation of the motor 12c in multiple stages and transmits the decelerated rotation to the pump group 12a.
  • the motor 12c can be attached to and detached from the speed reducer 12b.
  • a flange 2 a that stands on the substrate 2 is formed on the substrate 2 on the liquid feeding unit 10 side.
  • the pump group 12a is attached to one end face side of the flange 2a
  • the speed reducer 12b is attached to the other end face side of the flange 2a
  • the speed reducer 12b and the pump group 12a are connected.
  • the speed reducer 12b is configured to be detachable from the flange 2a and the pump group 12a.
  • the drainage unit 20 includes a waste liquid tank 21, a discharge-side minute flow rate pump 22, and a throttle adjustment mechanism 23.
  • the discharge side micro flow rate pump 22 discharges the culture solution in the culture dish 3 from the discharge port 5 of the culture dish 3.
  • the waste liquid tank 21 stores the culture liquid discharged by the discharge side micro flow rate pump 22.
  • the throttling adjustment mechanism 23 has a variable throttling function for readjusting the flow rate of the culture medium discharged from the discharge side micro flow rate pump 22.
  • the discharge port 5 and the culture solution inlet of the discharge-side micro flow rate pump 22 are connected by a flow path L22 composed of six flexible tubes.
  • the culture fluid outlet of the discharge side micro flow pump 22 and the culture fluid inlet of the waste tank 21 are connected by a flow path L21 made of six flexible tubes.
  • the diaphragm adjusting mechanism 23 can perform variable diaphragm on each of the six flexible tubes of the flow path L22.
  • the discharge-side micro flow pump 22 has a pump group 22a composed of six peristaltic pumps, a speed reducer 22b, and a motor 22c. Each peristaltic pump can be connected in multiple stages along the rotation axis.
  • the speed reducer 22b decelerates the rotation of the motor 22c in multiple stages and transmits the decelerated rotation to the pump group 22a.
  • the motor 22c can be attached to and detached from the speed reducer 22b.
  • the substrate 2 on the drainage unit 20 side is formed with a flange 2 b that stands on the substrate 2.
  • the pump group 22a is attached to one end face side of the flange 2b, the speed reducer 22b is attached to the other end face side of the flange 2b, and the speed reducer 22b and the pump group 22a are connected.
  • the speed reducer 22b is configured to be detachable from the flange 2b and the pump group 22a.
  • the culture dish 3 is attached to the board
  • the reservoir tank 11 is attached to the substrate 2 by pressing members 111a and 111b.
  • the waste liquid tank 21 is attached to the substrate 2 by pressing members 121a and 121b.
  • the motors 12c and 22c and the speed reducers 12b and 22b are detachable and can be removed during autoclaving.
  • the culture dish 3 is normally formed with polycarbonate, it is replaced every time autoclaving is performed.
  • the motor 12 c and the motor 22 c are driven by the flow rate control unit 30.
  • the pump groups 12 a and 22 a perform flow rate control of the culture solution by the flow rate control unit 30.
  • a transparent conductive film heater 41 and a temperature sensor 42 are provided at the bottom of the culture dish 3.
  • the reservoir tank 11 is provided with a Peltier element 43 and a temperature sensor 44.
  • the temperature control unit 40 performs energization control of the transparent conductive film heater 41 based on the detection result of the temperature sensor 42 to control the temperature of the culture solution in the culture dish 3 to a desired temperature, for example, 37 ° C.
  • the energization control of the Peltier element 43 is performed based on the detection result of the temperature sensor 44, and the temperature control is performed so that the culture solution in the reservoir tank 11 becomes a desired temperature, for example, 5 to 20 ° C.
  • the power supply 50 supplies power to the flow rate control unit 30 and the temperature control unit 40.
  • the culture solution in the culture dish 3 needs to be set to a temperature suitable for cell growth, and the culture solution in the reservoir tank 11 needs to be set to a temperature at which long-term storage is possible.
  • the culture solution in the reservoir tank 11 is set to a temperature lower than the temperature of the culture solution in the culture dish 3, but the culture solution that has flowed out of the reservoir tank 11 reaches the supply port of the culture dish 3. By passing through the flow paths L11 and L12, the temperature becomes close to normal temperature.
  • the substrate 2 is provided with, for example, a circular hole 2c in a region where the culture dish 3 is arranged.
  • the reason for providing the hole 2c is to shorten the length of the culture dish 3 in the height direction so that the state of the cells in the cell culture can be observed with an optical microscope. Therefore, it is good also as a recessed part which hollowed out the board
  • the bottom of the recess is preferably colorless and transparent.
  • the substrate 2 is provided with, for example, a circular hole 2d in a region where the reservoir tank 11 is disposed. This is so that the state of the culture solution in the reservoir tank 11 can be visually observed through the hole 2d. When the state of the culture solution in the reservoir tank 11 deteriorates, turbidity and discoloration occur. Similarly, it is preferable to provide a hole in the region where the waste liquid tank 21 is disposed.
  • the diaphragm adjusting mechanism 13 can form a diaphragm that narrows the opening of the flow path by pressing the flexible tube as the flow path L12.
  • the throttle adjusting mechanism 13 individually adjusts the flow rate of each flexible tube in the flow path L12. By forming this throttle in the flow path L12, the pressure on the upstream side of the throttle is adjusted. P1 is larger than the downstream pressure P2. As a result, bubbles or the like are less likely to be generated in the culture medium when the pump group 12a disposed upstream of the throttle is sucked and discharged, and the flow rate can be controlled with high accuracy.
  • the culture medium is moved so that the linear velocity V of the culture solution from the supply port 4 toward the discharge port 5 is less than the maximum speed at which no shear stress is applied to the cultured cells 6 in the culture dish 3.
  • the liquid is discharged while being supplied to the culture dish 3.
  • FIG. 6 is a diagram showing the expression rate of the shear stress-affected cells appearing in the cultured cells 6 with respect to the linear velocity V of the culture solution from the supply port 4 toward the discharge port 5.
  • the expression rate of shear stress-affected cells is defined as the area ratio of cells in which cell death or cell mutation has occurred relative to normal cells.
  • the expression rate of the shear stress-affected cells becomes 0 at less than the maximum speed Vmax. Therefore, it is possible to prevent the cultured cells 6 from being affected by shear stress by discharging the culture solution while supplying it to the culture dish 3 at a moving linear velocity V less than the maximum velocity Vmax.
  • the specific maximum speed Vmax is about 0.3 m / min when the cultured cells 6 are mouse ES cells.
  • the culture solution is continuously supplied to and discharged from the culture dish 3, it is not necessary to exchange the culture solution over a long period of time, so that the cell area is large. And an appropriate cell can be obtained.
  • the opening of the supply port 4 and the discharge port 5 is large and at least larger than the size that does not allow clogging by passing waste products. Therefore, since clogging by a filter or the like does not occur, it is not necessary to replace the culture solution over a long period of time from this point of view, so that appropriate cells can be obtained with a large cell area.
  • the culture solution In order to ensure that the cultured cells 6 are not affected by shear stress, it is preferable to discharge the culture solution while supplying the culture solution to the culture dish 3 so that the diffusion rate V1 due to the molecular motion of the culture solution is lower than V1. Unlike the artificial diffusion, the diffusion due to the molecular motion of the culture solution does not apply shear stress to the cultured cells 6 due to the flow of the culture solution. As a result, it is possible to obtain appropriate cells that are not damaged and have no stress.
  • the diffusion rate V1 is an extremely small value compared to the maximum rate Vmax, and the amount of the culture solution supplied and discharged can be reduced. Therefore, the cultured cells 6 can be grown at a low cost.
  • the minimum moving linear velocity is a velocity at which a necessary nutrient can be obtained without causing the cultured cell 6 to die, and is different for each cultured cell 6. Therefore, it is preferable that the set moving linear velocity is the same as or similar to the diffusion velocity.
  • the general minimum moving linear velocity is about 1/3 of the diffusion velocity.
  • the moving linear velocity V of the culture solution from the supply port 4 to the discharge port 5 is considered to be a diffusion rate V1 or less.
  • the cross-sectional area from the supply port 4 to the discharge port 5 in the culture dish 3 is 129 mm ⁇ 2 when the depth of the culture solution is 1.5 mm and the width is 86 mm. Therefore, when the flow rate of the culture solution is set to 42 ⁇ L / min, the moving linear velocity V is a value obtained by dividing the flow rate by the cross-sectional area, which is 0.379 mm / min. In this case, the moving linear velocity V is smaller than the diffusion velocity V1.
  • FIG. 7 is a diagram showing a state image of the culture solution flowing from the supply port side surface 3a toward the discharge port side surface 3b when the flow rate of the culture solution is set as described above.
  • methylene blue is added to the supplied culture medium to color it.
  • the supplied culture solution is supplied from the six supply ports 4, six peaks are formed.
  • the tip areas E1 of these six peaks it can be seen that the supplied culture medium has diffused into the existing culture liquid. And this front-end
  • the supplied culture medium becomes dominant on the supply port side surface 3a side.
  • the diffusion speed is increased by the meniscus.
  • the supplied culture solution is supplied at a flow rate that does not exceed this diffusion state, and the flow rate is controlled so as to be discharged. That is, the supply amount of the culture solution is a flow rate that supplements the flow rate of the culture solution diffused from the supply port 4.
  • FIG. 8 shows a change in relative density over time on the straight line C shown in FIG.
  • the distance R starts from the position of the supply port side surface 3a.
  • the tip region E1 in which the relative concentration D is inclined in a bell shape moves toward the discharge port side surface 3b at the diffusion speed V1.
  • the relative concentration becomes constant, and the supplied culture solution is dominant.
  • FIG. 9 is a flowchart showing the flow rate control processing procedure of the culture solution by the flow rate control unit 30.
  • the cultured cells 6 are adhered to the bottom of the culture dish 3, and then, the supply-side micro flow pump 12 is driven while the discharge-side micro flow pump 22 is stopped to enter the culture dish 3.
  • the culture solution is supplied so that the culture solution is filled (step S101).
  • the supply-side minute flow pump 12 is stopped, the discharge-side minute flow pump 22 is driven to discharge the culture solution, and the culture solution is set to have a predetermined depth (step S102).
  • the diffusion rate of the culture solution is preferably set so that the linear velocity of the culture solution moving from the supply port 4 to the discharge port 5 at this predetermined depth is less than the maximum rate at which no shear stress is applied to the cultured cells 6.
  • the flow control of the supply side micro flow pump 12 and the discharge side micro flow pump 22 is performed so that the culture solution is supplied and discharged at a constant flow rate (step S103).
  • A549 cells human alveolar basal epithelial adenocarcinoma cells
  • the culture solution was supplied and discharged at a diffusion rate or lower for 5 days and cultured.
  • shear stress was applied to the cells. Whether or not shear stress is applied can be determined by examining the phosphorylation state in the NO pathway and the PKC pathway.
  • no eNOS phosphate peptide was identified in the NO pathway.
  • no phosphorylated peptide of KRTS (S73) was identified, and phosphorylation of KRTS (S73) was unchanged. From these results, it can be presumed that the cells are not subjected to shear stress.
  • the opening positions of the supply ports 4 are arranged at regular intervals in a line form in the horizontal direction in the culture liquid surface with respect to the supply port side surface 3a.
  • the opening position of the supply port 4 may be shifted to the center side. In this case, the influence of the meniscus is reduced, and the tip region E1 can be moved further linearly.
  • the opening position of the discharge port 5 is the same.
  • a fluorine-based water repellent agent to the flow direction side surfaces 3c and 3d, the supply port side surface 3a, and the discharge port side surface 3b, generation of meniscus can be suppressed and the linear movement speed of the culture solution can be made uniform.
  • a fluorine-type water repellent should just be apply
  • the water repellent is not limited to fluorine, and any material having water repellency may be used.
  • the above-described application of the water repellent is such that the surface free energy of the flow direction side surfaces 3 c and 3 d, the supply port side surface 3 a and the discharge port side surface 3 b is smaller than the bottom surface of the culture dish 3. Therefore, the surface free energy of the surface material of the culture dish 3 on the flow direction side surfaces 3c and 3d, the supply port side surface 3a, and the discharge port side surface 3b is smaller than the surface free energy on the bottom surface. Anything is acceptable.
  • Leveling mechanism of culture dish Note that the tip of the culture fluid flow shown in FIG. 12 is inclined with respect to the flow direction. This is because the culture dish 3 was not arranged horizontally, but inclined in the width direction and the depth of the culture solution was different. Therefore, as shown in FIG. 13, a culture dish substrate 2 e to which the culture dish 3 is fixed is provided on the substrate 2, and between the substrate 2 and the culture dish substrate 2 e and at the four corners of the culture dish 3.
  • Four horizontal adjustment mechanisms 51 51a, 51b, 51c, 51d
  • two levels 52 for detecting the horizontality in the X direction and the Y direction are attached to the upper part of the culture dish substrate 2e. Note that one level may be used as long as the horizontality of the XY plane can be detected.
  • FIG. 14 is a diagram showing a specific configuration of the horizontal adjustment mechanism 51c.
  • the horizontal adjustment mechanism 51 c rotates the screw portion 53 a formed on the tip side of the adjustment dial 53.
  • the inclined member 54 screwed into the screw portion 53a moves in the Y direction according to the rotation of the screw portion 53a.
  • An elevating member 55 is disposed above the inclined member 54.
  • the inclined portion 54a at the upper portion of the inclined member 54 and the inclined portion 55a at the lower portion of the elevating member 55 are in contact with each other so as to be slidable. Therefore, according to the movement of the inclined member 54 in the Y direction, the elevating member 55 moves in the Z direction, which is the height direction.
  • the operator refers to the horizontal state indicated by the level 52 and adjusts the position of the four horizontal adjustment mechanisms 51a, 51b, 51c, 51d in the Z direction to adjust the culture dish substrate 2e horizontally. Can do. As a result, the bottom surface 3e of the culture dish 3 can be adjusted horizontally.
  • the depth of the culture solution supplied to and discharged from the culture dish 3 can be made constant.
  • the moving linear velocity in the culture fluid flow direction (X direction) can be made uniform.
  • the leveling mechanism 51 described above is a manual type, but is preferably an automatic leveling mechanism.
  • the position image of the bubble indicated by the level 52 may be acquired by the imaging device, and the adjustment dial driven by the motor may be controlled to rotate so that the bubble moves to a horizontal position. If this leveling is automated, the horizontal state can always be maintained automatically even during the cultivation of the cultured cells 6.
  • a connecting portion 61 between the reservoir tank 11 and the inlet of the supply-side micro flow pump 12, a connecting portion 62 between the outlet of the supply-side micro flow pump 12 and the supply port 4, A connection part 63 between the outlet 5 and the inlet of the discharge-side micro flow pump 22 and a connection part 64 between the outlet of the discharge-side micro flow pump 22 and the waste liquid tank 21 are sockets with built-in automatic open / close valves. In addition, it may be directly connected by a plug, and may be detachably and one-touch connected.
  • one end of the multistage arrangement in which the reservoir tank 11 is provided on the upper part of the supply-side flow path 75 that connects the supply port 4 and the outlet of the supply-side micro flow rate pump 12 is connected to the culture dish 3.
  • the inlet of the micro flow pump 12 on the supply side is detachably connected to the reservoir tank 11 from the other side, and the outlet of the micro micro flow pump 12 on the supply side is connected to the flow of the supply channel 75 from the other end. It may be configured to be detachably connected to the inlet.
  • connection part 71 between the inlet of the supply-side micro flow pump 12 and the reservoir tank 11, and the connection part 72 that connects the outlet of the supply-side micro flow pump 12 and the inlet of the supply-side flow path 75 are automatic. It is directly connected by a socket and a plug with a built-in on-off valve, and is configured to be detachable and capable of one-touch connection.
  • one end of the multi-stage arrangement in which the waste liquid tank 21 is provided above the discharge side flow path 76 that connects the discharge port 5 and the inlet of the discharge side micro flow rate pump 22 is connected to the discharge port 5 side of the culture dish 3.
  • the outlet of the discharge side micro flow pump 22 is detachably connected to the waste tank 21 and the inlet of the discharge side micro flow pump 22 is detachable from the outlet of the discharge side flow path 76. It is good also as a structure to connect.
  • connection part 74 between the outlet of the discharge side minute flow pump 22 and the waste liquid tank 21 and the connection part 73 that connects the outlet of the discharge side minute flow pump 22 and the outlet of the discharge side flow path 76 are automatically set. It is directly connected by a socket and a plug with a built-in on-off valve, and is configured to be detachable and capable of one-touch connection.
  • the cell culture device 1 can be stacked in multiple stages. Therefore, for example, as shown in FIG. 17, the cell culture device 1 can be stacked and transported in a multi-stage with a transport box 80 capable of keeping heat.
  • the power connector 81 of each cell culture device 1 is connected to a power connector 82 connected to the battery 83.
  • the power connector 82 is connected to the battery 83 in a daisy chain. Therefore, for example, even if the third-stage cell culture device 1 is removed from the upper side, the other cell culture devices 1 can be connected continuously only by removing the power connector 81 and the power connector 82 of the detached cell culture device 1. And continue to culture.
  • the culture dish 3 is covered with a lid and the space in the culture dish 3 is filled with a culture solution. As a result, the influence of shear stress on the cultured cells in the culture dish 3 can be reduced, and continuous culture can be performed until the transport destination is reached.
  • FIG. 18 is a plan view showing a configuration of a cell culture device 200 using a closed perfusion system flow path.
  • FIG. 19 is a cross-sectional view taken along line AA of the cell culture device 200 shown in FIG.
  • culture dishes 203 a and 203 b, a reservoir tank 211, a waste liquid tank 223, and motors 213 a and 213 b are arranged on a substrate 201.
  • a flow path plate 220 is disposed above the culture dishes 203a and 203b, the reservoir tank 211, and the waste liquid tank 223.
  • supply-side minute flow rate pumps 212a and 212b are arranged on the motors 213a and 213b, respectively.
  • the substrate 201 is provided with a recess in which the culture dishes 203a and 203b, the reservoir tank 211, and the waste liquid tank 223 are disposed. An opening is formed at the bottom of the recess.
  • a flow path is embedded in the flow path plate 220.
  • the flow path plate 220 forms a flow path groove on the facing surface between the upper plate 221 and the lower plate 222, and forms a flow path inside by joining the facing surfaces of the upper plate 221 and the lower plate 222. ing.
  • the flow path includes a first flow path L231 between the reservoir tank 211 and the supply-side micro flow pump 212a, a second flow path L232 between the supply-side micro flow pump 212a and the culture dishes 203a and 203b, and a culture dish.
  • a third flow path L233 between 203a, 203b and the discharge side micro flow pump 212b, and a fourth flow path L234 between the discharge side micro flow pump 212b and the waste liquid tank 223 are provided.
  • the inlet 251 between the first flow path L231 and the inflow pipe L241 of the supply side micro flow pump 212a is pin-port connected, and the second flow path L232 and the outflow pipe L242 of the supply side micro flow pump 212a are connected to each other.
  • the outlet 252 between them is pin-port connected.
  • the inflow port 255 between the third flow path L233 and the inflow pipe L243 of the discharge side small flow pump 212b is pin-port connected, and the fourth flow path L234 and the outflow pipe L244 of the discharge side micro flow pump 212b are connected to each other. Between the outlets 256 are pin-port connected.
  • the culture solution in the reservoir tank 211 flows in the closed perfusion system channel until it is collected in the waste solution tank 223. Therefore, it is possible to prevent contamination of the culture solution by the operator when the cell culture device 200 is assembled.
  • the pin port connection is preferably set in advance to prevent contamination. As a result, the operator does not have the work for forming the flow path when the cell culture apparatus 200 is assembled.
  • a lower engagement portion 251 for positioning the flow path plate 220 by being inserted into the openings of the culture dishes 203a and 203b, the reservoir tank 211, and the waste liquid tank 223 disposed on the substrate 201 is disposed below the flow path plate 220. Is formed.
  • an upper engagement portion 252 that prevents the displacement of the lids 261 that block the culture dishes 203a and 203b, the reservoir tank 211, and the waste liquid tank 223 is formed on the upper part of the flow path plate 220.
  • An opening 301 is formed in the region of the flow path plate 220 corresponding to each opening of the culture dishes 203a and 203b, the reservoir tank 211, and the waste liquid tank 223.
  • the flow path plate 220 is provided with a nozzle to form a flow path into the culture dishes 203a and 203b, the reservoir tank 211, and the waste liquid tank 223.
  • one culture dish 203a, 203b is provided with one supply port 253 and one discharge port 254, respectively. This is because, when a culture solution is supplied at a low flow rate, if a plurality of supply ports branched from one flow path are provided in one culture dish, it may be difficult to evenly divide the flow rate for each supply port. .
  • a liquid level detection sensor SD for detecting the liquid level of the culture medium in the culture dishes 203a and 203b is provided on the flow path plate 220.
  • a flow rate control unit (not shown) corresponding to the flow path control unit 30 in FIG. 2 performs flow rate control so that the liquid level detected by the liquid level detection sensor SD is constant. Thereby, the moving speed of the culture solution can be kept constant.
  • an inclination adjusting mechanism for adjusting the bottom surfaces of the culture dishes 203a and 203b obliquely is provided in the A part of the substrate 201 shown in FIG.
  • This inclination adjusting mechanism can be realized by the same configuration as the horizontal adjusting mechanism 51 shown in FIGS.
  • the inclination by the inclination adjusting mechanism is set so that the outlet 254 side at the bottom of the culture dishes 203a and 203b is lowered. Thereby, dead cells generated during the culture can be efficiently removed from the outlet 254. Therefore, it is preferable to match the position of the discharge port 254 with the tilt direction of the tilt adjusting mechanism.
  • the supply port 253 is provided at a position facing the discharge port 254.
  • the supply port 253 is provided at a higher position than the discharge port 254 in a state of being tilted by the tilt adjustment mechanism. It should be noted that, similarly to the discharge port 254, the discharge port of the reservoir tank 211 is preferably provided at a position that is lowered when tilted.
  • connection of the pump 212a and the motor 213a it has the mechanism which can be connected, rotating the input shaft of the motor 213a with respect to the pump 212a.
  • the input shaft of the motor 213a can be moved up and down by a spring, and when the fitting hole of the pump 212a and the input shaft of the motor 213a are aligned, the input shaft can be pushed in and connected.
  • the connection between the pump 212b and the motor 213b has a mechanism capable of connecting to the pump 212b while the input shaft of the motor 213b rotates.
  • the flow rate of the culture solution supplied and discharged is extremely small, the consumption of the culture solution can be reduced even when cells having a large cell area are cultured. Moreover, even if the culture period until a cell required in recent regenerative medicine is obtained is about 1 month, a large amount of culture solution is not consumed, and the cost of cell culture is reduced. Can do.
  • the culture solution described above is a liquid medium.
  • Liquid media include synthetic media and natural media.
  • a synthetic medium is a mixture of a physiological salt solution (salt solution) and chemical substances such as sugars and vitamins.
  • the synthetic medium is required to have a salt solution composition that is optimal in osmotic pressure, pH, ionic composition, and the like for tissues and cells of specific mammals, reptiles, fish, insects, plants, and the like. .
  • the cell culture device of the present embodiment can be used.
  • an optimal salt solution composition can be found by supplying and discharging a salt solution containing no nutrients to and from the cell culture apparatus and observing the survival state of the cells in the cell culture apparatus.
  • waste from cells can be removed continuously and for a long time, and other factors such as stress and injury related to cell survival can be eliminated.
  • the optimal salt solution composition can be determined.
  • what is necessary is just to change the composition of various nutrients and to observe the survival state of a cell.
  • the cell culture device of the present embodiment is provided with a liquid such as a culture solution containing nutrients necessary for the growth of the cultured cells and a salt solution not containing nutrients necessary for maintaining the life of the cultured cells for a short period of time. It is supplied to the culture dish 3 and discharged.

Abstract

　細胞にストレスや傷害を与えずに長期間培養を行うことができる細胞培養方法及び細胞培養装置を提供することを目的とする。このため、培養皿３の一端に設けられた供給口４と、供給口４との間で培養細胞６を挟むように培養皿３の他端に設けられた排出口５と、培養皿３に供給する培養液を蓄えるリザーバタンク１１と、培養皿から排出された培養液を蓄える廃液タンク２１と、供給口４を介してリザーバタンク１１内の培養液を培養皿３に供給する供給側微小流量ポンプ１２と、排出口５を介して培養皿３から培養液を排出する排出側微小流量ポンプ２２と、供給口４から排出口５に向かう培養液の移動線速度が、前記培養細胞にせん断応力を与えない最大速度未満となるように供給側微小流量ポンプ１２及び排出側微小流量ポンプ２２の流量制御を行う流量制御部３０と、を備える。

Description

細胞培養方法及び細胞培養装置
　本発明は、細胞にストレスや傷害を与えずに長期間培養を行うことができる細胞培養方法及び細胞培養装置に関する。
　近年における幹細胞を利用した再生医療としては、例えば、肝硬変や血液疾患、心筋梗塞の治療、血管の構築、骨や角膜の再生、移植用皮膚の確保、などが考えられている。再生医療では、培養皿内で幹細胞などから目的とする細胞や臓器を増殖させ、人に移植するようにしている。最近では、骨髄由来の幹細胞から血管新生を行い、狭心症、心筋梗塞などの治療に成功している。
　ここで、従来の細胞培養装置は、培養皿内の培養液を定期的に入れ替えて培養細胞の増殖を行っていた。この細胞培養装置は、培養液の入れ替えに伴って細胞に大きな刺激が与えられ、また、細胞の代謝活動に伴って培養液中に老廃物が排出されることから、細胞にストレスや傷害を与えてしまうという問題があった。
　これに対して、培養液の入れ替えを行わず、培養皿に培養液を送液して細胞培養を行うものがある。例えば、特許文献１には、細胞の増殖速度をモニタリングし、このモニタリングした増殖速度をもとに培養液中の栄養分の減少を予測し、消費された栄養素を培養液に追加する細胞培養装置が記載されている。
　また、培養液の入れ替えを行わず、培養液の送液及び排液を行って細胞培養を行うものがある。例えば、特許文献２には、中空繊維からなるフィルタモジュールによって培養液を培養槽に循環させ、培養液中の栄養分の追加と老廃物の除去を行う細胞培養方法が記載されている。
特開２０１２－１７０３６６号公報 特開２０１２－０９０６３２号公報
　しかしながら、特許文献１に記載された細胞培養装置は、連続的に栄養素を培養槽に送液するが、培養槽に培養液を溜める方式であるため、培養液中の細胞の代謝活動により排出された老廃物の濃度が高まると、任意のタイミングで従来の細胞培養装置と同様に、培養槽内の培養液を一度に交換せざるを得ない。この培養液の全体交換の頻度が１日に１回で行われると、結果的に従来の細胞培養装置と同様に、細胞にストレスや傷害を与えてしまうことになる。
　一方、特許文献２では、極微量の培養液を連続的に送液及び排液を行うようにしているが、培養期間が長期間になると、老廃物によってフィルタモジュールが目詰まりしてしまい、長期間培養には適しない。特に、近年の再生医療等で求められる細胞が得られるまでの培養期間は、１か月程度の長期間であるため、長期間培養ができないことは、再生医療等で求められる細胞面積の大きな細胞を培養することができないことを意味する。
　本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、細胞にストレスや傷害を与えずに長期間培養を行うことができる細胞培養方法及び細胞培養装置を提供することを目的とする。
　上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる細胞培養方法は、培養細胞を培養皿内に配置し、前記培養皿内に前記培養細胞の増殖あるいは維持に必要な液体を供給するとともに前記培養皿内の前記液体を排出して前記培養細胞を連続して培養する細胞培養方法であって、前記培養細胞を挟むように前記培養皿の一端に前記液体の供給口を設けるとともに前記培養皿の他端に前記液体の排出口を設け、前記供給口から前記排出口に向かう前記液体の移動線速度が、前記培養細胞にせん断応力を与えない最大速度未満となるように前記液体を前記培養皿に供給しつつ排出することを特徴とする。
　また、本発明にかかる細胞培養方法は、上記の発明において、前記液体の移動線速度は、前記液体の分子運動による拡散速度以下であることを特徴とする。
　また、本発明にかかる細胞培養装置は、培養細胞を培養皿内に配置し、前記培養皿内に前記培養細胞の増殖あるいは維持に必要な液体を供給するとともに前記培養皿内の前記液体を排出して前記培養細胞を連続して培養する細胞培養装置であって、前記培養皿の一端に設けられた前記液体の供給口と、前記供給口との間で前記培養細胞を挟むように前記培養皿の他端に設けられた前記培養皿の排出口と、前記培養皿に供給する前記液体を蓄えるリザーバタンクと、前記培養皿から排出された前記液体を蓄える廃液タンクと、前記供給口を介して前記リザーバタンク内の前記液体を前記培養皿に供給する供給側微小流量ポンプと、前記排出口を介して前記培養皿から前記液体を排出する排出側微小流量ポンプと、前記供給口から前記排出口に向かう前記液体の移動線速度が、前記培養細胞にせん断応力を与えない最大速度未満となるように前記供給側微小流量ポンプ及び前記排出側微小流量ポンプの流量制御を行う流量制御部と、を備えたことを特徴とする。
　また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記液体の移動線速度は、前記液体の分子運動による拡散速度以下であることを特徴とする。
　また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記培養皿の側面の表面自由エネルギーは、前記培養皿の底面の表面自由エネルギーに比して小さいことを特徴とする。
　また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記培養皿の底面を水平に調整する水平調整機構を備えたことを特徴とする。
　また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記培養皿の底面を斜めに調整する傾斜調整機構を備えたことを特徴とする。
　また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記供給口及び前記排出口は、複数であり、それぞれ線状に離散配置されることを特徴とする。
　また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記供給側微小流量ポンプの流出口と前記供給口との間、及び、前記排出口と前記排出側微小流量ポンプの流入口との間は、可撓性チューブで接続され、前記供給側微小流量ポンプと前記供給口との間、及び前記排出側微小流量ポンプと前記排出口との間に、それぞれ前記可撓性チューブの開口を絞る絞り調整機構を設けたことを特徴とする。
　また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記リザーバタンクと前記供給側微小流量ポンプの流入口との間、前記供給側微小流量ポンプの流出口と前記供給口との間、前記排出口と前記排出側微小流量ポンプの流入口との間、及び、前記排出側微小流量ポンプの流出口と前記廃液タンクとの間は、着脱自在に直接接続されることを特徴とする。
　また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記供給口と前記供給側微小流量ポンプの流出口とを結ぶ供給側流路の上部に前記リザーバタンクを設けた多段配置構成の一端を前記培養皿の供給口側に横置きし、他端から、前記供給側微小流量ポンプの流入口を前記リザーバタンクに着脱自在に接続するとともに前記供給側微小流量ポンプの流出口を前記供給側流路の流入口に着脱自在に接続し、前記排出口と前記排出側微小流量ポンプの流入口とを結ぶ排出側流路の上部に前記廃液タンクを設けた多段配置構成の一端を前記培養皿の排出口側に横置きし、他端から、前記排出側微小流量ポンプの流出口を前記廃液タンクに着脱自在に接続するとともに前記排出側微小流量ポンプの流入口を前記排出側流路の流出口に着脱自在に接続したことを特徴とする。
　また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記リザーバタンクと前記供給側微小流量ポンプとの間の第１の流路、前記供給側微小流量ポンプと前記培養皿との間の第２の流路、前記培養皿と前記排出側微小流量ポンプとの間の第３の流路、前記排出側微小流量ポンプと前記廃液タンクとの間の第４の流路とを内部に埋め込み形成し、前記リザーバタンク、前記培養皿、前記廃液タンクの上部に配置される流路プレートを備え、前記第１の流路と前記供給側微小流量ポンプの流入口との間、および前記第２の流路と前記供給側微小流量ポンプの流出口との間がピンポート接続され、前記第３の流路と前記排出側微小流量ポンプの流入口との間、および前記第４の流路と前記排出側微小流量ポンプの流出口との間がピンポート接続されることを特徴とする。
　また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記培養皿内の液位を検出する液位検出センサを備え、前記流量制御部は、前記液位検出センサが検出する液位が一定となるように流量制御を行うことを特徴とする。
　また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記供給側微小流量ポンプを駆動する供給側駆動源は前記供給側微小流量ポンプに対して着脱可能であり、前記排出側微小流量ポンプを駆動する排出側駆動源は前記排出側微小流量ポンプに対して着脱可能であることを特徴とする。
　また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、少なくとも前記培養皿を配置する基板を備え、前記基板は、前記培養細胞の培養状態を観察する領域に、穴、または前記培養皿が配置される反対側が開口した無色透明の凹部を形成していることを特徴とする。
　また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記培養皿の底部に設けられた透明導電膜ヒータと、前記培養皿内の前記液体の温度を検出する温度センサと、前記温度センサの検出結果をもとに前記透明導電膜ヒータを通電して前記培養皿内の前記液体の温度を所定温度範囲内に保つ制御を行う温度制御部と、を備えたことを特徴とする。
　本発明によれば、培養細胞を挟むように培養皿の一端に前記培養細胞の増殖あるいは維持に必要な液体の供給口を設けるとともに前記培養皿の他端に前記液体の排出口を設け、前記供給口から前記排出口に向かう前記液体の移動線速度が、前記培養細胞にせん断応力を与えない最大速度未満となるように前記液体を前記培養皿に供給しつつ排出するようにしているので、細胞にストレスや傷害を与えずに長期間培養を行うことができるとともに、前記液体の消費を抑えることができる。
図１は、本発明の実施の形態である細胞培養装置の外観構成を示す斜視図である。 図２は、図１に示した細胞培養装置の構成を示すブロック図である。 図３は、培養皿が配置される領域の基板に形成される穴の構成を示す断面図である。 図４は、リザーバタンクが配置される領域の基板に形成される穴の構成を示す断面図である。 図５は、絞り調整機構の機能を説明する説明図である。 図６は、供給口から排出口に向かう培養液の移動線速度に対する、培養細胞内に現れるせん断応力影響細胞の発現率を示す図である。 図７は、供給口側面から排出口側面に向かって流れる培養液の状態画像を示す図である。 図８は、時間経過に伴う培養液の移動を相対濃度変化で示した図である。 図９は、流量制御部による培養液の流量制御処理手順を示すフローチャートである。 図１０は、供給口開口の配置構成の一例を示す図である。 図１１は、供給口開口の配置構成の一例を示す図である。 図１２は、培養皿の側面にフッ素系の撥水剤を塗布した場合における供給口側面から排出口側面に向かって流れる培養液の状態画像を示す図である。 図１３は、水平調整機構を設けた細胞培養装置の培養皿近傍の構成を示す正面図である。 図１４は、水平調整機構の具体的な構成を示す一部破断した正面図である。 図１５は、送液部及び排液部の配置構成及び接続構成の一例を示す図である。 図１６は、送液部及び排液部の配置構成及び接続構成の一例を示す図である。 図１７は、運搬箱内での細胞培養装置の配置構成を示す斜視図である。 図１８は、閉鎖かん流系流路を用いた細胞培養装置の構成を示す平面図である。 図１９は、図１８に示した細胞培養装置のＡ－Ａ線断面図である。
　以下、添付図面を参照してこの発明を実施するための形態について説明する。
（全体構成）
　図１は、本発明の実施の形態である細胞培養装置１の外観構成を示す斜視図である。また、図２は、図１に示した細胞培養装置１の構成を示すブロック図である。図１及び図２に示すように、細胞培養装置１は、基板２の上部中央に培養皿３が設けられ、培養皿３の両端から培養皿３を挟むように、培養液を培養皿３に供給する送液部１０及び培養皿３から培養液を排出する排液部２０が基板２上に設けられる。
　培養皿３には、培養細胞６を挟むように、培養皿３の一端側である供給口側面３ａに培養液の供給口４が設けられるとともに、培養皿３の他端側である排出口側面３ｂに培養液の排出口５が設けられる。供給口４及び排出口５は、それぞれ６つ設けられ、それぞれが供給口側面３ａ及び排出口側面３ｂに沿って線状に離散配置されている。なお、供給口４及び排出口５の開口は、培養皿３内の培養液の深さ未満の位置に配置される。
　送液部１０は、リザーバタンク１１、供給側微小流量ポンプ１２、及び絞り調整機構１３を有する。リザーバタンク１１には、培養液が蓄えられる。供給側微小流量ポンプ１２は、リザーバタンク１１内の培養液を培養皿３の供給口４に供給する。絞り調整機構１３は、供給側微小流量ポンプ１２から供給される培養液の流量を再調整する可変絞り機能を有する。
　リザーバタンク１１の培養液流出口と供給側微小流量ポンプ１２の培養液流入口との間は、６本の可撓性チューブからなる流路Ｌ１１によって接続される。また、供給側微小流量ポンプ１２の培養液流出口と供給口４との間は、６本の可撓性チューブからなる流路Ｌ１２によって接続される。絞り調整機構１３は、流路Ｌ１２の６本の可撓性チューブのそれぞれに対して可変絞りを行うことができる。
　供給側微小流量ポンプ１２は、６つのペリスタルティックポンプからなるポンプ群１２ａと、減速機１２ｂと、モータ１２ｃとを有する。各ペリスタルティックポンプは、回転軸に沿って多段に連結可能である。減速機１２ｂは、モータ１２ｃの回転を多段で減速し、この減速した回転をポンプ群１２ａに伝達する。モータ１２ｃは、減速機１２ｂに対して着脱可能である。送液部１０側の基板２には、基板２上に立設するフランジ２ａが形成されている。フランジ２ａの一端面側にポンプ群１２ａが取り付けられ、フランジ２ａの他端面側に減速機１２ｂが取り付けられ、減速機１２ｂとポンプ群１２ａとが連結される。減速機１２ｂは、フランジ２ａ及びポンプ群１２ａに対して着脱可能に構成されている。
　一方、排液部２０は、廃液タンク２１、排出側微小流量ポンプ２２、及び絞り調整機構２３を有する。排出側微小流量ポンプ２２は、培養皿３内の培養液を培養皿３の排出口５から排出する。廃液タンク２１は、排出側微小流量ポンプ２２が排出した培養液を蓄える。絞り調整機構２３は、排出側微小流量ポンプ２２から排出される培養液の流量を再調整する可変絞り機能を有する。
　排出口５と排出側微小流量ポンプ２２の培養液流入口との間は、６本の可撓性チューブからなる流路Ｌ２２によって接続される。また、排出側微小流量ポンプ２２の培養液流出口と廃液タンク２１の培養液流入口との間は、６本の可撓性チューブからなる流路Ｌ２１によって接続される。また、絞り調整機構２３は、流路Ｌ２２の６本の可撓性チューブのそれぞれに対して可変絞りを行うことができる。
　排出側微小流量ポンプ２２は、６つのペリスタルティックポンプからなるポンプ群２２ａと、減速機２２ｂと、モータ２２ｃとを有する。各ペリスタルティックポンプは、回転軸に沿って多段に連結可能である。減速機２２ｂは、モータ２２ｃの回転を多段で減速し、この減速した回転をポンプ群２２ａに伝達する。モータ２２ｃは、減速機２２ｂに対して着脱可能である。排液部２０側の基板２には、基板２上に立設するフランジ２ｂが形成されている。フランジ２ｂの一端面側にポンプ群２２ａが取り付けられ、フランジ２ｂの他端面側に減速機２２ｂが取り付けられ、減速機２２ｂとポンプ群２２ａとが連結される。減速機２２ｂは、フランジ２ｂ及びポンプ群２２ａに対して着脱可能に構成されている。
　なお、図１に示すように、培養皿３は、押さえ部材１０３ａ，１０３ｂによって基板２に取り付けられる。また、リザーバタンク１１は、押さえ部材１１１ａ，１１１ｂによって基板２に取り付けられる。さらに、廃液タンク２１は、押さえ部材１２１ａ，１２１ｂによって基板２に取り付けられる。
　上述したように、モータ１２ｃ，２２ｃ及び減速機１２ｂ，２２ｂは、着脱可能であり、オートクレーブ時に取り外すことができる。なお、培養皿３は、通常、ポリカーボネイトで形成されているため、オートクレーブが行われる毎に交換される。
　図２に示すように、モータ１２ｃ及びモータ２２ｃは、流量制御部３０によって駆動される。そして、ポンプ群１２ａ，２２ａは、流量制御部３０によって培養液の流量制御を行う。培養皿３の底部には、透明導電膜ヒータ４１及び温度センサ４２が設けられる。また、リザーバタンク１１には、ペルチェ素子４３及び温度センサ４４が設けられる。温度制御部４０は、温度センサ４２の検出結果をもとに透明導電膜ヒータ４１の通電制御を行って、培養皿３内の培養液が所望温度、例えば３７℃となるように温度制御するとともに、温度センサ４４の検出結果をもとにペルチェ素子４３の通電制御を行って、リザーバタンク１１内の培養液が所望温度、例えば５～２０℃となるように温度制御を行う。電源５０は、流量制御部３０及び温度制御部４０に対して電力供給を行う。培養皿３内の培養液は、細胞が増殖するのに適した温度に設定する必要があり、リザーバタンク１１内の培養液は、長期保存が可能である温度に設定する必要がある。なお、リザーバタンク１１内の培養液は、培養皿３内の培養液の温度よりも低い温度に設定されるが、リザーバタンク１１から流出した培養液は、培養皿３の供給口に到達するまでの流路Ｌ１１，Ｌ１２を通過することによって常温に近い温度となる。
　なお、図３に示すように、基板２には、培養皿３が配置される領域に、例えば円形の穴２ｃが設けられる。この穴２ｃを設けるのは、培養皿３の高さ方向の長さを短くして、細胞培養中の細胞の状態を光学顕微鏡で観察できるようにするためである。したがって、培養皿３が配置される部分の基板２を下方からくり抜いた凹部としてもよい。ただし、この凹部の底部は、無色透明であることが好ましい。
　また、図４に示すように、基板２には、リザーバタンク１１が配置される領域に、例えば円形の穴２ｄが設けられる。これは、穴２ｄを介してリザーバタンク１１内の培養液の状態を目視観察できるようにするためである。リザーバタンク１１内の培養液の状態が悪化すると、濁りや変色が生じる。なお、同様にして、廃液タンク２１が配置される領域にも穴を設けるようにすることが好ましい。
　図５に示すように、絞り調整機構１３は、流路Ｌ１２である可撓性チューブを挟むように押圧して、流路開口を狭める絞りを形成することができる。上述したように絞り調整機構１３は、流路Ｌ１２の各可撓性チューブの流量を個別に再調整するものであるが、この絞りを流路Ｌ１２に形成することによって、絞りの上流側の圧力Ｐ１は、下流側の圧力Ｐ２に比して大きくなる。この結果、絞りの上流側に配置されるポンプ群１２ａが吸引及び吐出する際の培養液内に気泡等が発生しにくくなり、流量制御を精度高く行うことができる。
（培養皿内の培養液の流れ）
　ここで、本実施の形態では、培養皿３内で、供給口４から排出口５に向かう培養液の移動線速度Ｖが、培養細胞６にせん断応力を与えない最大速度未満となるように培養液を培養皿３に供給しつつ排出するようにしている。
　図６は、供給口４から排出口５に向かう培養液の移動線速度Ｖに対する、培養細胞６内に現れるせん断応力影響細胞の発現率を示す図である。なお、せん断応力影響細胞の発現率は、正常細胞に対する細胞死や細胞変異が生じた細胞の面積率としている。図６に示すように、せん断応力影響細胞の発現率は、最大速度Ｖｍａｘ未満で０となる。したがって、最大速度Ｖｍａｘ未満の移動線速度Ｖで培養液を培養皿３に供給しつつ排出することによって、培養細胞６にせん断応力による影響を与えないようにすることができる。具体的な最大速度Ｖｍａｘは、培養細胞６をマウスのＥＳ細胞とした場合、０．３ｍ／ｍｉｎ程度である。
　しかも、本実施の形態では、培養皿３に対して連続的に培養液を供給し、かつ、排出するようにしているので、培養液を長期間にわたって交換する必要がないため、細胞面積が大きく、かつ、適正な細胞を得ることができる。さらに、供給口４及び排出口５の開口は大きく、少なくとも老廃物を通過させて詰まらせない大きさ以上である。したがって、フィルタなどによる根詰まりが生じないので、この観点からも、培養液を長期間にわたって交換する必要がないため、細胞面積が大きく、かつ、適正な細胞を得ることができる。
　なお、確実に培養細胞６にせん断応力の影響を与えないようにする場合、培養液の分子運動による拡散速度Ｖ１以下となるように培養液を培養皿３に供給しつつ排出することが好ましい。培養液の分子運動による拡散は、人為的な拡散と異なり、培養液の流れによって培養細胞６にせん断応力を与えない。この結果、細胞が傷つかず、ストレスをもたない適正な細胞を得ることができる。
　拡散速度Ｖ１は、最大速度Ｖｍａｘに比べて極めて小さい値であり、培養液の供給及び排出の量を少なくすることができるため、低コストで培養細胞６を増殖することができる。なお、最小の移動線速度は、培養細胞６が細胞死せずに、必要な栄養素を得ることができる速度であり、培養細胞６ごとに異なる。したがって、設定される移動線速度は、拡散速度と同じか同程度にすることが好ましい。なお、一般的な最小の移動線速度は、拡散速度の１／３程度である。
　ここで、上述した拡散現象は、時間ｔ［ｓ］内に分子が移動する平均距離ｘ［ｃｍ］とすると、
　ｘ＝（４Ｄｔ）＾（１／２）
として表すことができる。ここで、Ｄは、拡散係数であり、室温では、Ｄ＝（１～２）×１０＾（－５）［ｃｍ＾２／ｓ］程度である。
　したがって、培養液の分子が１分間に移動する平均距離ｘは、０．４～０．７ｍｍとなり、拡散速度Ｖ１は、０．４～０．７ｍｍ／ｍｉｎ　となる。
　一方、供給口４から排出口５に向かう培養液の移動線速度Ｖは、拡散速度Ｖ１以下にすることを考える。培養皿３における供給口４から排出口５に向かう断面積は、培養液の深さを１．５ｍｍ、幅を８６ｍｍとすると、１２９ｍｍ＾２となる。そこで、培養液の流量を４２μＬ／ｍｉｎと設定すると、移動線速度Ｖは、流量を断面積で除算した値となり、０．３７９ｍｍ／ｍｉｎとなる。この場合、移動線速度Ｖは、拡散速度Ｖ１よりも小さくなる。
　図７は、上述した培養液の流量に設定した場合での供給口側面３ａから排出口側面３ｂに向かって流れる培養液の状態画像を示す図である。なお、図７では、供給される培養液にメチレンブルーを加えて着色している。図７に示すように、供給された培養液は、６つの供給口４から供給されるため、６つの山が形成されている。これら６つの山の先端領域Ｅ１では、供給された培養液が既存の培養液に拡散していることがわかる。そして、この先端領域Ｅ１が時間の経過とともに、排出口側面３ｂに向かって移動する。また、時間の経過に伴って、供給口側面３ａ側は、供給された培養液が支配的となる。なお、排出口側面３ｂに向かう方向に平行な培養皿３の流れ方向側面３ｃ，３ｄでは、メニスカスによって拡散速度が速くなっている。
　供給される培養液は、この拡散状態を超えない流量で供給し、かつ、排出するように流量制御される。すなわち、培養液の供給量は、供給口４から拡散される培養液の流量を補充する流量としている。
　図８は、図７に示した直線Ｃ上における、時間経過に伴う相対濃度変化を示している。なお、距離Ｒは、供給口側面３ａの位置を起点としている。図８に示すように、時間経過に伴って、相対濃度Ｄが釣鐘型に傾斜している先端領域Ｅ１が拡散速度Ｖ１で排出口側面３ｂに向かって移動する。一方、先端領域Ｅ１から供給口側面３ａでは、拡散速度Ｖ１以下の移動線速度Ｖで移動し、相対濃度が一定となり、供給された培養液が支配的となっている。
（培養液の流量制御処理）
　図９は、流量制御部３０による培養液の流量制御処理手順を示すフローチャートである。図９に示すように、まず、培養細胞６を培養皿３の底部に接着させ、その後、排出側微小流量ポンプ２２を停止したまま、供給側微小流量ポンプ１２を駆動し、培養皿３内に培養液が満ちるように培養液を供給する（ステップＳ１０１）。その後、供給側微小流量ポンプ１２を停止し、排出側微小流量ポンプ２２を駆動して培養液を排出し、培養液の深さが所定深さとなるように設定する（ステップＳ１０２）。その後、この所定深さで、供給口４から排出口５に向かう培養液の移動線速度が、培養細胞６にせん断応力を与えない最大速度未満となるように、好ましくは、培養液の拡散速度以下となるように、培養液を一定流量で供給し、かつ、排出するように、供給側微小流量ポンプ１２及び排出側微小流量ポンプ２２の流量制御を行う（ステップＳ１０３）。
（実験結果）
　上述した細胞培養装置１を用いて、Ａ５４９細胞（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞）を培養皿３に播種し、５日間、培養液を拡散速度以下で供給、かつ、排出して培養した。そして、細胞にせん断応力がかかっていたか否かを調べた。せん断応力がかかったか否かは、ＮＯの経路、ＰＫＣの経路でのリン酸化状態を調べることによってわかる。実験結果では、ＮＯの経路には、ｅＮＯＳのリン酸ペプチドが一度も同定されなかった。また、ＰＫＣの経路では、ＫＲＴＳ（Ｓ７３）のリン酸化ペプチドは同定されず、ＫＲＴＳ（Ｓ７３）のリン酸化は変化がなかった。これらの結果から、細胞には、せん断応力がかかっていないものと推定できる。
（供給口及び排出口の配置）
　上述した実施の形態では、図１０の上部に示したように、供給口４の開口位置は、供給口側面３ａに対して培養液面内で水平方向に線状で等間隔に配置されていたが、図１０の下部に示すように、供給口４の開口位置を中央側にずらした配置としてもよい。この場合、メニスカスによる影響が軽減され、先端領域Ｅ１を一層、直線状に移動させることができる。なお、排出口５の開口位置も同様である。
　なお、培養液の深さが深い場合には、図１１に示すように、供給口４の開口位置を、深さ方向にも分散した面的配置としてもよい。なお、排出口５の開口位置も同様である。
（メニスカス発生の抑制）
　ところで、図７では、流れ方向側面３ｃ，３ｄにおける培養液の移動線速度がメニスカスによって速くなっていた。そこで、メニスカスの発生を抑制するために、流れ方向側面３ｃ，３ｄ、供給口側面３ａ、排出口側面３ｂに、フッ素系の撥水剤を塗布した。その結果、図１０の上部に示した供給口４の開口配置であっても、図１２に示すように、流れ方向側面３ｃ，３ｄにおける培養液の移動線速度を抑えることができた。すなわち、流れ方向側面３ｃ，３ｄ、供給口側面３ａ、排出口側面３ｂにフッ素系の撥水剤を塗布することによってメニスカスの発生が抑制され、培養液の移動線速度を均一にすることができる。なお、メニスカスの発生を抑制すればよいので、少なくとも流れ方向側面３ｃ，３ｄにフッ素系の撥水剤が塗布されればよい。また、撥水剤はフッ素系に限らず、撥水性を有する材料であればよい。
　上述した撥水剤の塗布は、流れ方向側面３ｃ，３ｄ、供給口側面３ａ、排出口側面３ｂの表面自由エネルギーを培養皿３の底面に比して小さくしたものである。したがって、撥水剤の塗布に限らず、培養皿３の流れ方向側面３ｃ，３ｄ、供給口側面３ａ、排出口側面３ｂの表面材質の表面自由エネルギーが、底面の表面自由エネルギーに比して小さいものであればよい。
（培養皿の水平調整機構）
　なお、図１２に示した培養液の流れの先端は、流れ方向に対して斜めになっている。これは、培養皿３が水平に配置されず、幅方向に傾斜して培養液の深さが異なっていたからである。そこで、図１３に示すように、培養皿３が固定される培養皿用基板２ｅを基板２上に設けるとともに、基板２と培養皿用基板２ｅとの間であって、培養皿３の四隅に対応する部分に、４つの水平調整機構５１（５１ａ，５１ｂ，５１ｃ，５１ｄ）を設ける。さらに、培養皿用基板２ｅの上部に、Ｘ方向とＹ方向との水平性を検知する２つの水準器５２を取り付ける。なお、ＸＹ平面の水平性を検知できるものであれば、１つの水準器であってもよい。
　図１４は、具体的な水平調整機構５１ｃの構成を示す図である。水平調整機構５１ｃは、調整ダイヤル５３を回動すると、調整ダイヤル５３の先端側に形成されたネジ部５３ａが回動する。このネジ部５３ａに螺合する傾斜部材５４は、ネジ部５３ａの回動に応じてＹ方向に移動する。傾斜部材５４の上部には、昇降部材５５が配置される。傾斜部材５４上部の傾斜部５４ａと昇降部材５５下部の傾斜部５５ａとは、摺動可能に当接している。したがって、傾斜部材５４のＹ方向の移動に応じて昇降部材５５は高さ方向であるＺ方向に移動する。そして、操作者は、水準器５２が示す水平状態を参照して、４つの水平調整機構５１ａ，５１ｂ，５１ｃ，５１ｄのＺ方向の位置を調整し、培養皿用基板２ｅを水平に調整することができる。結果的に、培養皿３の底面３ｅを水平に調整することができる。
　この水平調整機構５１によって培養皿３の底面３ｅが水平に調整されると、培養皿３に供給及び排出される培養液の深さを一定にすることができる。この結果、培養液の流れ方向（Ｘ方向）の移動線速度を均一にすることができる。
　なお、上述した水平調整機構５１は、手動式であるが、自動水平調整機構であることが好ましい。例えば、水準器５２が示す気泡の位置画像を撮像装置によって取得し、この気泡が水平状態の位置に移動するように、モータで駆動する調整ダイヤルを回動制御すればよい。この水平調整の自動化が行われると、培養細胞６の培養中であっても水平状態を常に自動的に維持することができる。
（送液部及び排液部の接続）
　図１５に示すように、リザーバタンク１１と供給側微小流量ポンプ１２の流入口との間の接続部６１、供給側微小流量ポンプ１２の流出口と供給口４との間の接続部６２、排出口５と排出側微小流量ポンプ２２の流入口との間の接続部６３、及び、排出側微小流量ポンプ２２の流出口と廃液タンク２１との間の接続部６４は、自動開閉弁内蔵のソケット及びプラグによって直接接続され、かつ、着脱自在でワンタッチ接続できるようにしてもよい。
　また、図１６に示すように、供給口４と供給側微小流量ポンプ１２の流出口とを結ぶ供給側流路７５の上部にリザーバタンク１１を設けた多段配置構成の一端を、培養皿３の供給口４側に横置きし、他端から、供給側微小流量ポンプ１２の流入口をリザーバタンク１１に着脱自在に接続するとともに供給側微小流量ポンプ１２の流出口を供給側流路７５の流入口に着脱自在に接続する構成としてもよい。
　すなわち、供給側微小流量ポンプ１２の流入口とリザーバタンク１１との接続部７１、及び供給側微小流量ポンプ１２の流出口と供給側流路７５の流入口とを接続する接続部７２は、自動開閉弁内蔵のソケット及びプラグによって直接接続され、かつ、着脱自在でワンタッチ接続できるように構成されている。
　同様にして、排出口５と排出側微小流量ポンプ２２の流入口とを結ぶ排出側流路７６の上部に廃液タンク２１を設けた多段配置構成の一端を、培養皿３の排出口５側に横置きし、他端から、排出側微小流量ポンプ２２の流出口を廃液タンク２１に着脱自在に接続するとともに排出側微小流量ポンプ２２の流入口を排出側流路７６の流出口に着脱自在に接続する構成としてもよい。
　すなわち、排出側微小流量ポンプ２２の流出口と廃液タンク２１との接続部７４、及び排出側微小流量ポンプ２２の流出口と排出側流路７６の流出口とを接続する接続部７３は、自動開閉弁内蔵のソケット及びプラグによって直接接続され、かつ、着脱自在でワンタッチ接続できるように構成されている。
（細胞培養装置の運搬形態）
　上述した細胞培養装置は、平板状であるため、多段に積み重ねることができる。したがって、例えば、図１７に示すように、保温が可能な運搬箱８０で細胞培養装置１を多段に積み重ねて運搬することができる。各細胞培養装置１の電源コネクタ８１は、バッテリ８３に接続される電源コネクタ８２にそれぞれ接続される。電源コネクタ８２は、バッテリ８３に対して数珠つなぎに接続されている。したがって、例えば、上側から３段目の細胞培養装置１が取り外されても、この取り外された細胞培養装置１の電源コネクタ８１と電源コネクタ８２とを取り外すのみで、他の細胞培養装置１を連続して培養し続けることができる。
　なお、運搬箱８０などで細胞培養装置１を運搬する場合、培養皿３は蓋で覆われ、培養皿３内の空間を培養液で満たしておくことが好ましい。これによって、培養皿３内の培養細胞に対するせん断応力の影響を軽減することができるとともに、運搬先に到達するまで連続培養することができる。
（閉鎖かん流系流路の適用）
　上述した実施の形態では、培養皿３と排出側微小流量ポンプ２２との流路は、可撓性チューブを用い、この可撓性チューブと排出側微小流量ポンプ２２との流出口とはユーザが接続するようにしていた。この実施の形態の変形例では、すべての流路に開放部を設けない閉鎖かん流系流路を形成している。
　図１８は、閉鎖かん流系流路を用いた細胞培養装置２００の構成を示す平面図である。また、図１９は、図１８に示した細胞培養装置２００のＡ－Ａ線断面図である。図１８および図１９に示すように、細胞培養装置２００は、基板２０１上に、培養皿２０３ａ，２０３ｂ、リザーバタンク２１１、廃液タンク２２３、および、モータ２１３ａ，２１３ｂが配置される。培養皿２０３ａ，２０３ｂ、リザーバタンク２１１、および、廃液タンク２２３の上部には、流路プレート２２０が配置される。また、モータ２１３ａ，２１３ｂ上には、それぞれ供給側微小流量ポンプ２１２ａ，２１２ｂが配置される。なお、基板２０１には、培養皿２０３ａ，２０３ｂ、リザーバタンク２１１、廃液タンク２２３が配置される凹部が形成されている。この凹部の底部には、開口が形成されている。
　流路プレート２２０には、流路が埋め込み形成されている。流路プレート２２０は、上部プレート２２１と下部プレート２２２との対向面に流路となる溝を形成し、上部プレート２２１と下部プレート２２２との対向面を接合することによって内部に流路を形成している。流路は、リザーバタンク２１１と供給側微小流量ポンプ２１２ａとの間の第１の流路Ｌ２３１、供給側微小流量ポンプ２１２ａと培養皿２０３ａ，２０３ｂとの間の第２の流路Ｌ２３２、培養皿２０３ａ，２０３ｂと排出側微小流量ポンプ２１２ｂとの間の第３の流路Ｌ２３３、排出側微小流量ポンプ２１２ｂと廃液タンク２２３との間の第４の流路Ｌ２３４を有する。
　また、第１の流路Ｌ２３１と供給側微小流量ポンプ２１２ａの流入管Ｌ２４１との間の流入口２５１はピンポート接続され、第２の流路Ｌ２３２と供給側微小流量ポンプ２１２ａの流出管Ｌ２４２との間の流出口２５２はピンポート接続される。また、第３の流路Ｌ２３３と排出側小流量ポンプ２１２ｂの流入管Ｌ２４３との間の流入口２５５はピンポート接続され、第４の流路Ｌ２３４と排出側微小流量ポンプ２１２ｂの流出管Ｌ２４４との間の流出口２５６はピンポート接続される。これにより、リザーバタンク２１１内の培養液は、廃液タンク２２３に回収されるまでの間、閉鎖かん流系流路内を流れる。したがって、細胞培養装置２００の組立時に作業者による培養液へのコンタミネーションを防止することができる。なお、ピンポート接続は、コンタミネーション防止のため、予め接続状態としておくことが好ましい。これによって、作業者は、細胞培養装置２００の組立時に流路形成のための作業がなくなる。
　なお、流路プレート２２０の下部には、基板２０１上に配置された培養皿２０３ａ，２０３ｂ、リザーバタンク２１１、廃液タンク２２３の各開口に挿入されて流路プレート２２０を位置決めする下部係合部２５１が形成されている。また、流路プレート２２０の上部には、培養皿２０３ａ，２０３ｂ、リザーバタンク２１１、廃液タンク２２３を塞ぐ各蓋２６１の位置ずれを防止する上部係合部２５２が形成されている。また、培養皿２０３ａ，２０３ｂ、リザーバタンク２１１、廃液タンク２２３の各開口に対応する流路プレート２２０の領域には開口３０１が形成されている。また、流路プレート２２０は、ノズルを設けて培養皿２０３ａ，２０３ｂ、リザーバタンク２１１、廃液タンク２２３内への流路を形成している。
　また、上述した細胞培養装置２００では、１つの培養皿２０３ａ，２０３ｂにそれぞれ１つの供給口２５３と１つの排出口２５４とを設けるようにしている。これは、培養液を低流量で供給する際、１つの培養皿に、１つの流路から分岐した複数の供給口を設けると各供給口に対する流量の均等分岐が難しくなる場合があるからである。
　さらに、この変形例では、流路プレート２２０に培養皿２０３ａ，２０３ｂ内の培養液の液位を検出する液位検出センサＳＤを設けている。図２の流路制御部３０に対応する、図示しない流量制御部は、液位検出センサＳＤが検出する液位が一定となるように流量制御を行う。これによって、培養液の移動速度を一定に保つことができる。
　また、この変形例では、図１９に示した基板２０１のＡ部に、培養皿２０３ａ，２０３ｂの底面を斜めに調整する傾斜調整機構が設けられている。この傾斜調整機構は、図１３、図１４に示した水平調整機構５１と同様な構成によって実現できる。この傾斜調整機構による傾斜は、培養皿２０３ａ，２０３ｂの底部における排出口２５４側が低くなるようにする。これによって、培養中に発生した死細胞を排出口２５４から効率よく除去することができる。したがって、排出口２５４の位置と傾斜調整機構の傾き方向とを合致させることが好ましい。なお、供給口２５３は、排出口２５４に対向する位置に設けられる。したがって、傾斜調整機構によって傾いている状態では、供給口２５３は排出口２５４に比して高い位置に設けられる。なお、リザーバタンク２１１の排出口も排出口２５４と同様に、傾斜時に低くなる位置に設けることが好ましい。
　なお、ポンプ２１２ａとモータ２１３ａの接続において、ポンプ２１２ａに対してモータ２１３ａの入力軸が回転しながら接続できる機構を持っている。具体的には、モータ２１３ａの入力軸がバネによって上下することができ、ポンプ２１２ａの嵌合穴とモータ２１３ａの入力軸の位置が合わさったときにバネによって押し込まれ接続できるようになっている。ポンプ２１２ｂとモータ２１３ｂとの接続も同様にポンプ２１２ｂに対してモータ２１３ｂの入力軸が回転しながら接続できる機構を持っている。
　上述した実施の形態では、供給及び排出される培養液の流量が極めて少ないため、細胞面積の大きな細胞を培養する場合であっても、培養液の消費量を低減することができる。また、近年の再生医療等で求められる細胞が得られるまでの培養期間が１か月程度の長期間であっても、大量の培養液を消費することはなく、細胞培養のコスト低下を図ることができる。
　ところで、上述した培養液は、液体培地である。液体培地には、合成培地と天然培地とがある。合成培地は、天然培地と異なり、生理的塩類溶液（塩類溶液）に糖類やビタミン類などの化学物質を混ぜ合わせたものである。そして、合成培地は、特定の哺乳動物、爬虫類、魚類、昆虫、植物などの組織や細胞に、それぞれ、浸透圧、ｐＨ、イオン組成などが至適な塩類溶液の組成であることが要求される。この塩類溶液の組成が最適化された塩類溶液を見い出すために、本実施の形態の細胞培養装置を用いることができる。すなわち、栄養素を含まない塩類溶液を細胞培養装置に供給及び排出して、細胞培養装置内の細胞の生存状態を観察することによって、最適な塩類溶液の組成を見い出すことができる。この場合、本実施の形態の細胞培養装置では、細胞からの老廃物を連続的で長期に排除することができ、かつ、細胞の生存に関するストレスや傷害という他の要因を排除することができるので、最適な塩類溶液の組成を決定することができる。なお、最適な合成培地を見い出す場合、さらに各種栄養素の組成を変えて細胞の生存状態を観察すればよい。
　すなわち、本実施の形態の細胞培養装置は、培養細胞の増殖のために必要な栄養素を含む培養液や、培養細胞の短期間の生命維持に必要な、栄養素を含まない塩類溶液などの液体を培養皿３内に供給し、かつ、排出するものである。
　　１，２００　細胞培養装置
　　２，２０１　基板
　　２ａ，２ｂ　フランジ
　　２ｃ，２ｄ　穴
　　２ｅ　培養皿用基板
　　３，２０３ａ，２０３ｂ　培養皿
　　３ａ　供給口側面
　　３ｂ　排出口側面
　　３ｃ，３ｄ　流れ方向側面
　　３ｅ　底面
　　４，２５３　供給口
　　５，２５４　排出口
　　６　培養細胞
　　１０　送液部
　　１１，２１１　リザーバタンク
　　１２，２１２ａ，２１２ｂ　供給側微小流量ポンプ
　　１２ａ，２２ａ　ポンプ群
　　１２ｂ，２２ｂ　減速機
　　１２ｃ，２２ｃ，２１３ａ，２１３ｂ　モータ
　　１３，２３　絞り調整機構
　　２０　排液部
　　２１，２２３　廃液タンク
　　２２　排出側微小流量ポンプ
　　３０　流量制御部
　　４０　温度制御部
　　４１　透明導電膜ヒータ
　　４２，４４　温度センサ
　　４３　ペルチェ素子
　　５０　電源
　　５１（５１ａ，５１ｂ，５１ｃ，５１ｄ）　水平調整機構
　　５２　水準器
　　５３　調整ダイヤル
　　５３ａ　ネジ部
　　５４　傾斜部材
　　５４ａ，５５ａ　傾斜部
　　５５　昇降部材
　　６１～６４，７１～７４　接続部
　　７５　供給側流路
　　７６　排出側流路
　　８０　運搬箱
　　８１，８２　電源コネクタ
　　８３　バッテリ
　　１０３ａ，１０３ｂ，１１１ａ，１１１ｂ，１２１ａ，１２１ｂ　押さえ部材
　　２２０　流路プレート
　　Ｃ　直線
　　Ｄ　相対濃度
　　Ｅ１　先端領域
　　Ｌ１１，Ｌ１２，Ｌ２１，Ｌ２２　流路
　　Ｌ２３１　第１の流路
　　Ｌ２３２　第２の流路
　　Ｌ２３３　第３の流路
　　Ｌ２３４　第４の流路
　　Ｐ１，Ｐ２　圧力
　　Ｒ　距離
　　ＳＤ　液位検出センサ
　　Ｖ　移動線速度
　　Ｖ１　拡散速度
　　Ｖｍａｘ　最大速度

Claims (16)

  1. 　培養細胞を培養皿内に配置し、前記培養皿内に前記培養細胞の増殖あるいは維持に必要な液体を供給するとともに前記培養皿内の前記液体を排出して前記培養細胞を連続して培養する細胞培養方法であって、
    　前記培養細胞を挟むように前記培養皿の一端に前記液体の供給口を設けるとともに前記培養皿の他端に前記液体の排出口を設け、前記供給口から前記排出口に向かう前記液体の移動線速度が、前記培養細胞にせん断応力を与えない最大速度未満となるように前記液体を前記培養皿に供給しつつ排出することを特徴とする細胞培養方法。
  2. 　前記液体の移動線速度は、前記液体の分子運動による拡散速度以下であることを特徴とする細胞培養方法。
  3. 　培養細胞を培養皿内に配置し、前記培養皿内に前記培養細胞の増殖あるいは維持に必要な液体を供給するとともに前記培養皿内の前記液体を排出して前記培養細胞を連続して培養する細胞培養装置であって、
    　前記培養皿の一端に設けられた前記液体の供給口と、
    　前記供給口との間で前記培養細胞を挟むように前記培養皿の他端に設けられた前記培養皿の排出口と、
    　前記培養皿に供給する前記液体を蓄えるリザーバタンクと、
    　前記培養皿から排出された前記液体を蓄える廃液タンクと、
    　前記供給口を介して前記リザーバタンク内の前記液体を前記培養皿に供給する供給側微小流量ポンプと、
    　前記排出口を介して前記培養皿から前記液体を排出する排出側微小流量ポンプと、
    　前記供給口から前記排出口に向かう前記液体の移動線速度が、前記培養細胞にせん断応力を与えない最大速度未満となるように前記供給側微小流量ポンプ及び前記排出側微小流量ポンプの流量制御を行う流量制御部と、
    　を備えたことを特徴とする細胞培養装置。
  4. 　前記液体の移動線速度は、前記液体の分子運動による拡散速度以下であることを特徴とする請求項３に記載の細胞培養装置。
  5. 　前記培養皿の側面の表面自由エネルギーは、前記培養皿の底面の表面自由エネルギーに比して小さいことを特徴とする請求項３または４に記載の細胞培養装置。
  6. 　前記培養皿の底面を水平に調整する水平調整機構を備えたことを特徴とする請求項３～５のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
  7. 　前記培養皿の底面を斜めに調整する傾斜調整機構を備えたことを特徴とする請求項３～６のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
  8. 　前記供給口及び前記排出口は、複数であり、それぞれ線状に離散配置されることを特徴とする請求項３～７のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
  9. 　前記供給側微小流量ポンプの流出口と前記供給口との間、及び、前記排出口と前記排出側微小流量ポンプの流入口との間は、可撓性チューブで接続され、
    　前記供給側微小流量ポンプと前記供給口との間、及び前記排出側微小流量ポンプと前記排出口との間に、それぞれ前記可撓性チューブの開口を絞る絞り調整機構を設けたことを特徴とする請求項３～７のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
  10. 　前記リザーバタンクと前記供給側微小流量ポンプの流入口との間、前記供給側微小流量ポンプの流出口と前記供給口との間、前記排出口と前記排出側微小流量ポンプの流入口との間、及び、前記排出側微小流量ポンプの流出口と前記廃液タンクとの間は、着脱自在に直接接続されることを特徴とする請求項３～７のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
  11. 　前記供給口と前記供給側微小流量ポンプの流出口とを結ぶ供給側流路の上部に前記リザーバタンクを設けた多段配置構成の一端を前記培養皿の供給口側に横置きし、他端から、前記供給側微小流量ポンプの流入口を前記リザーバタンクに着脱自在に接続するとともに前記供給側微小流量ポンプの流出口を前記供給側流路の流入口に着脱自在に接続し、
    　前記排出口と前記排出側微小流量ポンプの流入口とを結ぶ排出側流路の上部に前記廃液タンクを設けた多段配置構成の一端を前記培養皿の排出口側に横置きし、他端から、前記排出側微小流量ポンプの流出口を前記廃液タンクに着脱自在に接続するとともに前記排出側微小流量ポンプの流入口を前記排出側流路の流出口に着脱自在に接続したことを特徴とする請求項１０に記載の細胞培養装置。
  12. 　前記リザーバタンクと前記供給側微小流量ポンプとの間の第１の流路、前記供給側微小流量ポンプと前記培養皿との間の第２の流路、前記培養皿と前記排出側微小流量ポンプとの間の第３の流路、前記排出側微小流量ポンプと前記廃液タンクとの間の第４の流路とを内部に埋め込み形成し、前記リザーバタンク、前記培養皿、前記廃液タンクの上部に配置される流路プレートを備え、
    　前記第１の流路と前記供給側微小流量ポンプの流入口との間、および前記第２の流路と前記供給側微小流量ポンプの流出口との間がピンポート接続され、前記第３の流路と前記排出側微小流量ポンプの流入口との間、および前記第４の流路と前記排出側微小流量ポンプの流出口との間がピンポート接続されることを特徴とする請求項３～７のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
  13. 　前記培養皿内の液位を検出する液位検出センサを備え、
    　前記流量制御部は、前記液位検出センサが検出する液位が一定となるように流量制御を行うことを特徴とする請求項３～１２のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
  14. 　前記供給側微小流量ポンプを駆動する供給側駆動源は前記供給側微小流量ポンプに対して着脱可能であり、前記排出側微小流量ポンプを駆動する排出側駆動源は前記排出側微小流量ポンプに対して着脱可能であることを特徴とする請求項３～１３のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
  15. 　少なくとも前記培養皿を配置する基板を備え、前記基板は、前記培養細胞の培養状態を観察する領域に、穴、または前記培養皿が配置される反対側が開口した無色透明の凹部を形成していることを特徴とする請求項３～１４のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
  16. 　前記培養皿の底部に設けられた透明導電膜ヒータと、
    　前記培養皿内の前記液体の温度を検出する温度センサと、
    　前記温度センサの検出結果をもとに前記透明導電膜ヒータを通電して前記培養皿内の前記液体の温度を所定温度範囲内に保つ制御を行う温度制御部と、
    　を備えたことを特徴とする請求項３～１５のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
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