JP5988962B2 - 細胞培養装置および細胞培養方法 - Google Patents

Description

本発明は粘着性細胞の培養、幹細胞または一次細胞の培養、哺乳類動物細胞の培養、およびヒトおよび/または動物の治療またはワクチンなどのために抗体またはウィルスを産生することを対象とする細胞培養装置、この培養装置の製造方法および操作方法、および装置の使用に関する

産業的に適切な真核生物細胞の細胞培養は、細胞系統（cell lines）と一次細胞または幹細胞（primary or stem cells）との２つのクラスに分類できる。細胞系統はワクチン（ウィルス）の製造に、そして抗体などの蛋白質の製造に適切である。細胞はバイオリアクターとして利用され、従って細胞はホスト以外のなにものでもない。細胞は遺伝子操作できる。即ち、細胞内に遺伝子産生物を細胞によって産生するのが望ましい遺伝子配列を導入できる。このクラスの細胞は固定床バイオリアクター内で成長させることができる。一例は、ＷＯ２００７/０３９６００Ａに記載され、この記載内容は本開示に援用するものとする。幹細胞に対処する場合には、細胞それ自体を収穫でき、従って産生物である。この産生物は、例えば、再生医療、および組織の遺伝子操作に利用できる。

実験によれば、幹細胞などのある種の細胞の培養は、いくつかの要因により、細胞系統の培養よりもはるかにデリケートな操作であることが明らかとなっている。また、細胞が機械的な応力やその他の外的影響に非常に敏感であることも明らかとなっている。バイオリアクターから細胞を膨張させ、かつ収穫するために細胞系統の産生に利用されている代表的な手法は、幹細胞については適切ではないことが多い。この手法は、幹細胞に簡単に損傷を与え、時にはこれらを死滅させる。

現在、幹細胞の代表的な成長は定常条件で、インキュベーター内に置かれた組織培養フラスコ内で行われている。ここで、簡潔を期すために“培養フラスコ（culture flasks）”を定義すると、これはＴフラスコ、ペトリ皿、細胞ファクトリー、細胞スタックなどのすべての定常培養装置を指す。ローラボトルも培養フラスコに関連がある。これら定常フラスコ（stationary flasks）には、ガス交換用フィルターを設ける。インキュベーターはそれぞれが十分な栄養の補給により細胞培養に好適になる基質（substrate）を構成する複数のＴフラスコからなる。このようなシステムには、単位容積当たりの利用面においてきわめて効率が悪い欠点がある。さらに、細胞成長の準備に時間がかかる。即ち、Ｔフラスコを満たすためには、成長すべき細胞および栄養素からなる専用の液体（例えば、分散液、懸濁液など）を挿入した後、Ｔフラスコを一回かそれ以上上下を逆にして細胞を利用できるレベルに分配する必要がある。加えて、治療に必要な十分な量の細胞を産生するために要求されるＴフラスコの個数に基づいて、バッチ毎に/患者毎にこの操作を数回繰り返す必要がある。

即ち、このような装置などの限界に対処できる装置が依然として求められている。

ＷＯ２００７/０３９６００Ａ

従って、本発明の目的は、代替的なバイオリアクターを提供することである。本発明の実施態様には、特に幹細胞および/または一次細胞などの細胞をより高い費用対効果で培養でき、にもかかわらず細胞の表面への付着、すぐれた二次元成長および/または望ましい品質レベルでの細胞の収穫を確保できる作用効果がある。

この本発明の目的は、本発明の第１態様の実施態様によって実現できる。本発明の第１態様は、細胞培養を対象としたバイオリアクターを提供するものである。

第１態様の一実施態様の場合、細胞培養装置に関する。この装置は、細胞付着および液体培地分配を目的とした複数の担体（carriers）からなる。これら担体を積層し、液体培地の流れに対して隣接担体間にレベルを画定する。各レベルが、担体中の一つかそれ以上の開放スペースにより流体連絡するため、液体培地が一つのレベルから隣接レベルに流動できる。第１レベルと、第１レベルに隣接する第２レベルとの間の一つかそれ以上の開放スペースは相互に重ならない。

本発明の第１態様の一つの実施態様は、細胞が付着する面であって、液体培地を分配できる面を備えたプレートまたは膜としての担体積層体からなる細胞培養バイオリアクターに関する。これら担体が液体培地の流れに対して隣接面間にレベルを画定し、各レベルが各表面内の一つかそれ以上の開放スペースにより相互接続するため、液体培地が一つのレベルから隣接レベルに流動できる。第２担体に垂直投影した場合、第１担体の一つかそれ以上の開放スペースは、隣接する第２担体の一つかそれ以上の開放スペースとは重ならない。換言すれば、第１担体の第１開放スペースを第２担体の第２開放スペースに垂直投影して見た場合、一つのレベルの両側にある第１担体および第２担体の第１開放スペースは、相互に横方向か回転方向に変位する。隣接担体間に画定されたレベルは、各担体の側縁部で気密封止するのが好ましい。このように構成すると、液体培地が担体内の開放スペースを利用して、一つのレベルから隣接レベルに強制移動する。

担体積層体の上部担体および/または下部担体は、隣接レベルに対しては共通ではないが、にもかかわらず本発明の第１態様の任意の実施態様がもつ任意の特徴を発揮することができる。例えば、これら担体は内部に複数の開放スペースをもつため、液体培地が上部担体または下部担体を横断して流れる（即ち担体積層体に出入りする）。下部担体の場合の隣接担体は、下部担体の上に位置し、上部担体の場合の隣接担体は、上部担体の下に位置する。上部または下部担体以外のその他の任意の担体の場合、隣接担体は、下か上にある担体である。隣接担体は、駆動手段によって駆動される流れ方向にあるのが好ましい（最も好ましいのは、上にあることである）。

一つの実施態様では、担体の少なくとも一つは独立した一つの固形担体（例えば、プレートまたは膜）によって与えることができ、この場合一つかそれ以上のスペースは、固形担体の開口である。担体はプレートまたは膜によって与えるのが好ましい。プレートまたは膜は非多孔質でもよく、あるいは（孔径が０．０５mm未満の）多孔質でもよく、従って担体材料を通過する流れが、孔ではなく開口スペース（例えば円形開口）を通る流れによって支配される。なお、剛性をもつプレートが好ましい。場合にもよるが、担体は、相互接続開放スペースから少なくとも離間した領域で非多孔質であってもよい。

あるいは、担体材料を通る流れが孔を通る流れではなく、開口を通る流れによって支配される限り、マクロな孔を使用することは可能である。例えば、不透過性の布地を利用できる。また、剛性をもつポリスチレンプレートなどのプラスチック材料を利用することも可能である。

一つの実施態様では、担体の少なくとも一つは、一つかそれ以上の開放スペースによって横方向に分離した一組の固形担体（例えばプレートおよび/または膜）によって与えることができる。一組の固形担体が一つかそれ以上の開放スペースによって横方向に分離している場合、固形担体は（各担体が主方向に対して垂直である限り）すべて同じ面内にあればよく、あるいは（各担体が主方向に対して非垂直的な方向にある限り）すべて同じ円錐面または角錐面部分のいずれかであればよい。開放スペースは、隣接レベル間の流体相互接続部として作用する。一つの実施態様では、各担体において開放スペースによってカバーされる全表面積と固形担体によってカバーされる全面積との比は１％〜２０％、好ましく１％〜１５％、より好ましくは１％〜１０％であればよい。この全表面積によって表わされる担体面積部分をできるだけ小さくして、細胞を担持するために利用できる表面をできるたけ大きく取ることが好ましい。なお、すぐれた酸素添加およびすぐれた栄養補給を担保するために十分高く、また十分均質な液体培地の流れの場合、担体面積のこの部分が十分に大きいことが必要である。本発明の実施態様の場合、細胞担体面積要件および酸素添加/栄養補給要件の２つを満足する。

一つの実施態様の場合、開放スペースの長さ/幅比であるアスペクト比は、１〜４、好ましく１〜２であればよい。

一つの実施態様の場合、開放スペースは円形であればよい。

一つの実施態様の場合、開放スペースの形状とは無関係に、開放スペースの幅は０．０５mm以上、０．１mm以上、０．２mm以上、０．５mm以上、２mm以下、１mm以下、０．５mm以下であればよい。細胞への液体培地の通過を許すためには、０．０５mmの幅が好ましい。

一つの実施態様の場合、開放スペースの大きさおよび形状とは無関係に、層状担体の単位面積当たりの開放スペースの個数については、流体相互接続のために全開放スペースによってカバーされる面積と細胞付着のための固形担体の表面積との比が好ましく２０％以下、より好ましくは１５％以下、最も好ましくは１０％以下になるように設定するのが好ましい。なお、下限は好ましくは１％以上である。

一つの実施態様の場合、層状担体（laminar carrier）の単位面積当たりの開放スペースの個数は、これら層状担体の全表面において一定であればよい。開放スペース（孔）の密度でいえば、例えば、０．００１〜１００開放スペース/平方ミリメートル、０．０３〜６０開放スペース/平方ミリメートル、あるいは０．１〜１０開放スペース/平方ミリメートルであればよい。

一つの実施態様の場合、第１層状担体に複数の開放スペースが存在し、これら開放スペースのそれぞれは、直径が第１層状担体の直径の１０分の１以下、好ましくは５０分の１以下、より好ましくは１００分の１以下、最適には１，０００分の１以下の円形孔として層状担体（例えばプレートまたは膜）に存在する。この実施態様の場合、開放スペースの個数は例えば開放スペース２個〜４×１０^７個、１０個〜１０^７個、１００個〜１０^６個、１，０００個〜１０^５個、あるいは５，０００個〜２０，０００個であればよい。開放スペースの個数はもちろん層状担体の大きさに大きく依存するものである。この実施態様の場合、層状担体当たりの開放スペースの個数は２５以上、好ましくは５０以上、より好ましく少なくとも１００以上、最適には少なくとも１，０００以上が好適である。また、開放スペースの直径は好ましく０．０５mm〜２mm、より好ましくは０．１mm〜１mm、さらに好ましくは０．２mm〜０．５mmである。この範囲にある限り、細胞が通過する。

別な実施態様の場合、開放スペースの形状は溝形である。担体当たりの溝形開放スペースの個数は好ましくは１〜３０、より好ましくは２〜２０、さらに好ましくは４〜２５、さらに好ましくは８〜２０、最適には１２〜１８（例えば１６）である。担体当たりの溝形開放スペースがｎ個存在する場合、２つの隣接担体の開放スペースは、相互に１/２ｎ回転だけ回転変位する。

溝幅は、好ましくは０．０５mm〜２mm、より好ましくは０．０５mm〜０．５mm、さらに好ましくは０．０５mm〜０．１mmであり、この範囲にある限り細胞が通過できる。溝が中心から層状担体の縁部に向かって広がっている場合には、溝のより大きな部分は０．０５mm〜１mm、より好ましくは０．０５mm〜０．５mm、さらに好ましくは０．０５mm〜０．１mmである。

一つの実施態様の場合、開放スペースの形状に関係なく、開放スペースの最少の大きさは０．０５mm、好ましくは０．１mm、より好ましくは０．５mm、最適には１mmである。

一つの実施態様の場合、開放スペースは、直径が０．０５mm、好ましく０．１mm、より好ましくは０．５mm、最適には１mmの球状物体が通過できる形状および寸法をもつ。

好ましくは、このような溝形開放スペースは、プレートまたは膜の主面（円形担体の半径の主要部分）の中心と周囲縁部との間の主要部分全体に広がる。図１５（担体は、開放スペースによって横方向に分離されている一組の固形担体からなる）について説明すると、図示の実施態様の場合、溝形開放スペースは担体の中心と周囲縁部との間の全体に広がる。溝は、液体培地を担体の実質的にすべての点に均等に分配するさい効率がよく、その分有利である。円形孔の場合、性質が不連続なため、液体の流れの分配の均質性はあまりよくない。いくつかの実施態様の場合、溝形開放スペースは、さらに小さく分割して一連の溝形トレンチにしてもよく、担体の剛性が強くなる。

例えば、リッジも溝によって分離された担体を架橋する形か、あるいは溝によって分離された同じ担体の部分として存在することが可能である。このような架橋リッジ（bridging ridges）は、担体の剛性を強くするため、装置の剛性も全体として強くなる。このような架橋リッジの場合、開放スペースに侵入しないことが好ましい。さらに、本発明のバイオリアクターの構成では、細胞の収穫を妨害しないことが好ましい。本発明の一実施態様では、開放スペースが培地と細胞の流れに適正化するように設計を行う。換言すると、これら開放スペースは収穫時にも利用でき、単なる循環作用だけのものではない。

一つの実施態様では、開放スペースの最少寸法は０．０５mm、好ましくは０．１mm、より好ましくは０．５mm、最適には１mmである。この範囲にある限り、細胞を損傷することなく細胞を通すことができる。

一つの実施態様では、開放スペースのうち少なくとも一つがより広く、担体の幾何学的中心から半径方向距離が長くなる。これは、特に溝の場合に有利であり、担体全面の流量の均一化に役立つ。

一つの実施態様では、担体内の開放スペースは、中心の周りで回転対称的に配列することが可能である。これは、個別レベルでの培地の分配が比較的均質化するため、有利に作用する。さらに、担体の形状が円形の場合には、積層体においてあるレベルが回転しても、担体の縁部が積層体からはみ出すことがないため、担体の積層が単純化する。ただし、楕円形や矩形担体などの他の形状の担体については該当しないが、本発明はこのような他の形状を排除するものではない。

いくつかの実施態様の場合、（担体中の開放スペースによってカバーされる表面を含む）担体の表面積は５０平方センチメートル〜１平方メートル、好ましくは７５平方センチメートル〜０．８平方メートルであればよい。

例えば、担体が円形の実施態様では、直径は１０〜１００cmであればよい。

担体厚については、できるだけ小さな容積により多数の担体を存在させるために、できるだけ薄いほうが好ましい。例えば、担体厚は０．４〜２mmまたは０．６〜１mmに設定できる。

一つの実施態様では、担体の少なくとも一つにおいて開放スペースによってカバーされる全表面積拡大速度は、担体の幾何学的中心に対する半径方向距離が長くなるにつれて速くなる。これは、担体の幾何学的中心に近い細胞および担体の幾何学的中心からより遠い位置にある細胞によって生じる流量差が小さくなるため、有利である。このため、最適化が生じ、担体の幾何学的中心からあらゆる距離において流量が実質的に等しくなる。開放スペースが所定の表面積をもち、そして開放スペースの全表面積が中心に対する半径方向距離が長くなるにつれて大きくなるように設計および/または分配するのが好ましい。このため、バイオリアクター全体の流量の均質性が向上する。なお、この大きな全表面積は、一つの開放スペースの幅を広げることによって実現可能である。これに代えて、あるいはこれに加えて、開放スペースの個数を増やしてもよい。表面積の拡大は連続的でもよく、あるいは不連続的、例えば段階的でもよい。バイオリアクターが好ましい円筒形の場合には、全表面積の拡大は、開放スペースの位置または位相に関係がない。バイオリアクターが別な形状の場合、例えば主方向に垂直な断面が楕円形または矩形の場合、表面積の拡大は、中心から離れる異なる方向で異なってくる。

一つの実施態様では、プレートまたは膜の少なくとも一つにおいて開放スペースによってカバーされる全表面積の拡大速度は、担体の幾何学的中心に対する半径方向距離が長くなるに従って速くなるため、担体の幾何学的中心からのあらゆる距離において流量が実質的に等しくなる。

すべての実施態様において、第１担体の一つかそれ以上の開放スペースは、隣接する第２担体に垂直に投影したときに、この第２担体の一つかそれ以上の開放スペースに重なることはない。これは、液体培地が隣接レベル間において直線状に移動することがなく、隣接レベル（例えば隣接する上レベル）に到達できる前に、液体培地の少なくとも一部が一つのレベル内で横方向に流動するため、有利である。液体培地の全体の流れは主方向にそう流れであるが（例えば、液体は全体として担体積層体（stack of carriers）の底部から積層体（stack）の上部に移動するが）、液体培地は、隣接レベル（例えば垂直に）を横断して流れるよりもあるレベル内で（例えば横方向に）流れる時間のほうが長い。このため、液体培地がある担体の各表面の全領域に到達でき、従ってバイオリアクター内のあらゆる場所において流れが実質的に同じになる。

換言すれば、第１担体の第１開放スペースを第２担体に垂直に投影してみたときに、一つのレベルの両側にある第１および第２担体の第１開放スペースは、相互に回転変位または横変位する。このような回転変位または横変位があると、一組の開放スペースがいくつかのレベルに広がる柱状チャネルを形成する恐れがなくなる。一つの実施例では、第１担体の少なくとも一つの開放スペースに下角度と上角度との間において第１位相を設ける。なお、この位相はレベルの中心の周りの位相または配向として定義できる。そして第２担体の開放スペースに下角度と上角度との間において第２位相を設ける。なお、第１位相はこの第２位相には重ならない。

本発明の第１態様の一つの実施態様は、細胞が付着し、液体培地を分配する層状担体積層体（a stack of laminar carriers）からなる細胞培養バイオリアクターに関する。これら層状担体は主方向に積層され、この積層体内の各対の隣接層状担体（adjacent laminar carriers）は相互に平均距離分離され、これら隣接層状担体間に液体培地が流れるレベルが画定される。前記隣接レベルは、これら隣接レベルに共通な層状担体において複数の開放スペースによって相互に流体接続するため、前記隣接レベル間に前記液体培地が流れる。ある一つの層状担体の前記開放スペースの幅は、前記層状担体を隣接する層状担体から分離する平均距離よりも少なくとも５倍小さく、好ましくは少なくとも１０倍小さく、そしてその幅は少なくとも０．０５mmである。驚くべきことに、開放スペースの幅が、平均距離よりも少なくとも５倍小さく、好ましくは少なくとも１０倍小さい場合、第１層状担体の開放スペースが、第２層状担体の開放スペースに垂直投影したときに、これに重なる時でさえ、液体培地が隣接レベル間で直線状に移動せず、液体培地の少なくとも一部が、あるレベル内で横方向に流れてから、隣接レベル（例えば隣接の上レベル）に到達することが認められた。液体培地の全体の流れは主方向にそう流れであるが（例えば、液体は全体として層状担体積層体の底部から層状担体積層体の上部に移動するが）、液体培地は、隣接レベル（例えば垂直に）を横断して流れるよりもあるレベル内で（例えば横方向に）流れる時間のほうが長い。このため、液体培地がある担体の各表面の全領域に到達でき、従ってバイオリアクター内のあらゆる場所において流れが実質的に同じになる。

層状担体の前記開放スペースが、前記層状担体を隣接する層状担体から分離する平均距離よりも少なくとも５倍小さく、好ましくは少なくとも１０倍小さく、そしてその幅は少なくとも０．０５mmである一つの実施態様では、これら開放スペースの（長/幅比である）アスペクト比は１〜４、好ましくは１〜２であればよい。

層状担体の前記開放スペースが、前記層状担体を隣接する層状担体から分離する平均距離よりも少なくとも５倍小さく、好ましくは少なくとも１０倍小さく、そしてその幅は少なくとも０．０５mmである一つの実施態様では、これら開放スペースは円形であればよい。

層状担体の前記開放スペースが、前記層状担体を隣接する層状担体から分離する平均距離よりも少なくとも５倍小さく、好ましくは少なくとも１０倍小さく、そしてその幅は少なくとも０．０５mmである一つの実施態様では、これら開放スペースの形状とは関係なく、開放スペース幅は０．０５mm以上、０．１mm以上、０．２mm以上、０．５mm以上、２mm以下、１mm以下、０．５mm以下であればよい。細胞の通過性からみて下限は０．０５mm以上が好ましい。

一つの実施態様の場合、層状担体の前記開放スペースが、前記層状担体を隣接する層状担体から分離する平均距離よりも少なくとも５倍小さく、好ましくは少なくとも１０倍小さく、そしてその幅は少なくとも０．０５mmである。

なお、留意しなければならない点は、隣接レベルに対しては共通ではないが、にもかかわらず、前記積層体の上部および/または下部層状担体は、本発明の任意の実施態様がもつ特徴を備えることができる点である。例えば、これら層状担体は、内部に複数の開放スペースを備えることができるため、前記液体培地が前記上部または下部層状担体を横断して流れる（即ち担体積層体に出入りする）が、この場合層状担体の前記開放スペースは、前記層状担体を隣接する層状担体から分離する平均距離よりも少なくとも５倍小さく、好ましくは少なくとも１０倍小さく、そしてその幅は少なくとも０．０５mmである。下部担体の場合の隣接担体は、下部担体の上に位置し、上部担体の場合の隣接担体は、上部担体の下に位置する。上部または下部層状担体以外のその他の任意の担体の場合、隣接層状担体は、下か上にある担体である。隣接担体は、駆動手段によって駆動される流れ方向にあるのが好ましく、また上にある層状担体であることが好ましい。

担体の積層体内で、層状担体は相互に平行であることが好ましく、この場合平均距離は固定された距離である。

２つの層状担体間の平均距離または固定距離は好ましくは０．５〜１０mm、より好ましくは１〜５mm、さらに好ましくは１〜３mm、それよりも好ましくは１．２〜２mmである。本発明の作用効果は、（細胞に対して）このような小さなレベル間距離を実現できることである。静的な細胞培養装置の場合、このようにレベル間距離が小さいと、細胞の上のスペースが十分でないため、細胞の十分な酸素添加が起きないと考えられる。また、スペース幅が前記平均距離の少なくとも５倍小さい、好ましくは少なくとも１０倍小さい複数の開放スペースが層状担体に存在すると、液体培地が層状担体の積層体の下部から上部に移動するために必要な時間を短くし、同時に細胞に作用する流量を小さくすることによってこのような小さなレベル間距離を利用できることになる。

さらに別な実施態様の場合、開放スペースの最少寸法は、２つの担体間の距離の１０分の１、好ましくは少なくとも５分の１である。

層状担体の前記開放スペースが、前記層状担体を隣接する層状担体から分離する平均距離よりも少なくとも５倍小さく、好ましくは少なくとも１０倍小さく、そしてその幅が少なくとも０．０５mmであるさらに別な実施態様の場合、開放スペースの最少寸法は、２つの層状担体間の距離の１０分の１、好ましくは少なくとも５分の１である。

さらに別な実施態様の場合、担体の少なくとも一部の少なくとも一つの側縁部に少なくとも一つのリッジを設ける。第１および第２の隣接担体のリッジが、側縁部において担体間の相互距離を設定する。この構成は構造的な安定性をもつ。リッジは、側縁部の第１（例えば上部）側および/または第２（例えば下部）側まで延長する。リッジは、側縁部にそって連続的であればよい。あるいは、リッジをブロック形状に構成し、スペースによって相互分離してもよい。隣接する担体のブロック形状リッジは、このようなスペースに延入することが可能であるため、相互に固定された位置を設定することができる。換言すれば、各担体の縁部にプレートを位置決めする雌/雄ノッチ（切り欠き）が存在することになる。また、リッジは縁部から外側に向かって突出していてもよい。

一つの実施態様の場合、隣接する担体間に画定されるレベルは、担体の側縁部で閉じておく。このように担体の側縁部を閉じると、バイオリアクターの側部外面が画定されることになる。一つの実施態様では、柱状チャネルの側壁を画定する機械的接続によって積層を行う。これら機械的接続を行うと、積層体内の各担体の配向が固定されることになるが、別な場合には各担体を独立して回転できる余地が残る。本発明では、柱状チャネルを含む担体積層体を例えば成型方法によって一体物として製造すること、および/または積層体部分を固定するために接着剤または機械的手段（ネジなど）を使用することを排除するものではないことは明らかである。担体を個別に製造することには、積層体がモジュラー式になるため、対象用途および必要条件に応じて大小を加減できる作用効果がある。

レベルを閉じるためにリッジを使用することが好ましい。ポリマー材料を用いてリッジ（例えば、縁部から外側に突き出るリッジ）を接続することによって、レベルを閉じることができる。このようなポリマーには接着剤、樹脂などがある。液体またはシート状剤としてポリマー材料を使用することができ、例えば乾燥処理、架橋処理などの処理を行うことも可能であり、あるいは溶融処理してから、放冷し、固化することも可能である。あるいは、例えばインサート成形またはトランスファー成形によって目的の形状にポリマー材料を成形することも可能である。

担体積層体は、５〜５００レベル数を画定する５〜５００の担体から構成することができる。２つの隣接する担体が一つのレベルを画定するため、レベル数は通常担体個数−１である。なお、積層体の上部担体も細胞培養に使用できる点を考えると、担体の個数はレベル数に等しくなる。

一つのバイオリアクター内のレベル数および／または担体数は、例えば、５〜５００の範囲、好ましくは８０〜２００の範囲、より好ましくは１３０〜１８０の範囲にある。

すべての担体が同じ構造であるのが好ましい。即ち、寸法が同じ、配向が同じ、開放スペース/担体比が同じ、そして開放スペースが同じ形状および同じ寸法であることが好ましく、各レベルでの流量が同じになる。また、前記の平均または固定距離が、層状担体の積層体内の各対の層状担体について同じであるのが好ましい。同様に、各レベルでの流量が同じになる。バイオリアクター内のあらゆる場所で培養条件が同じになることを担保するためには、本質的ではないが、（あるレベル内および/またはレベル間）の流量がこのように等しくなることが望ましい。

各担体間の分配を比較的一定にし、そして主な流れ方向を横方向にすると、細胞が担体に付着することができ、二次元培養に基づく細胞成長がすぐれたものになる。担体中の開放スペースは、孔または溝の形を取る開口として具体化するのが好適である。

本発明の好適な実施態様では、積層体の各担体は、少なくとも２つの開放スペースを有する。このような場合、本発明のバイオリアクターは直列および並列の２つで結合した複数の流体相互接続部からなると考えることができる。ある一つのレベルの有効な部分であるこの流体接続部の直列/並列結合の組み合わせは、流体接続の直列結合または並列結合単独の場合よりもすぐれたものになることがわかった。流体接続が単に直列結合の場合には、一つのレベルでの単なる横方向の接続に過ぎない。特に、第１レベルでは液体培地が第１開口から離れた第２開口に流れてから、次の第２レベルに戻るなどの流動経路を取ると考えられる。積層体の各担体が少なくとも２つの開放スペースを有する場合には、同じ循環時間を保った状態で、担体当たりただ一つの開放スペースが存在する場合よりも流量は小さくできる。このため、せん断応力を小さくできるか、あるいは循環時間を短くできる。担体当たりの開放スペース数が１のみでは、せん断応力を制限する流量（例えば、２mm/ｓ以下）でも循環時間は非常に長くなり、例えば数時間になることが当たり前である。

プレート当たりの開放スペース数が一つのみで有用な実施態様は、例えば、外部循環システムを使用し、積層体内の交代担体が交互に一つの中心開放スペースと一つの周辺開放スペースを有する実施態様である。この実施態様における担体は、２種類が交互に使用されている。例えば、第１種類の担体は、その縁部を外部壁に付着することによって所定の場所に保持され、そして中心開放スペースを有する。この例では、第２種類の担体は、中心軸に付着されることによって所定の場所に保持され、そして積層体を閉じる壁に到達しないことによって２つの隣接するレベルを相互に流体接続する開放スペースを確保する。この中心軸が、担体の積層体に対して同心でかつ内部にある流体チャネル（例えば、中空管）であることはもちろんである。この中空管が、担体の積層体から離れた流体チャネルを形成し、この流体チャネルが、担体積層体の第１端部の第１担体と担体積層体の第２端部の第２担体との間に流体接続を形成するとともに、液体培地の循環システムになる。

あるいは、流体接続部を単に並列結合する場合には、一つの流体接続部は他の流体接続部よりも短くなる傾向がある。このため、圧力低下がバイオリアクター内で不均一になり、システム内部に流量差が発生する。このような大きな流量差は望ましくない。というのは、乱流および/または不均一流が発生し、細胞および細胞成長がダメージを簡単に受けることになるからである。さらに、バイオリアクターの一部の流体接続部における流量が低下する場合もある。この結果、例えばデッドゾーン（混合が劣化するゾーン）が発生し、バイオリアクター全体にわたって細胞成長に差が生じる。最悪のシナリオでは、ある一部の流体接続部での細胞培養が十分に行われず、目的とする質の最終培養物が得られなくなることが考えられる。

さらに、流体接続部を直列/並列結合すると、流体接続部（例えば、開放スペースまたは開口）が単独で詰まっても、ほぼすべての流れが止まることはない。

一つの実施態様では、バイオリアクターに第１側および反対側の第２側（例えば上下部）を設け、そして本発明の第１態様の任意の実施態様において説明した担体積層体は、例えば、主方向に第１側（例えば、バイオリアクターの下部）から第２側（例えば、バイオリアクターの上部）に積層され、細胞を培養しかつ培地が流れる隣接担体間にレベルを画定する担体積層体を有する。なお、当業者ならば、バイオリアクターの第２側（例えば上部）を閉じ、ベストな物理的条件を維持することが好ましいことを理解できるはずである。本発明の実施態様では、バイオリアクターの上部および/または下部に入り口および/または出口を設けることができ（例えばガス出入口）、および/または各種の計測機器（ｐｒｏｂｅｓ）（例えば、温度計、ｐＨ計、溶存Ｏ_２計、溶存ＣＯ_２計、バイオマス計測計やその他の計測計）を設けることができる。また、上部および/または下部の少なくとも一部を透明化すると、顕微鏡により観測することができる。例えば、第１側および/または第２側に光学的に透明な窓を設けることができる。

一つの実施態様では、バイオリアクターは、液体培地のパラメーター（とりわけ温度、ｐＨ、Ｏ_２濃度、ＣＯ_２濃度、培地中の細胞密度（バイオマス）などの物理的、化学的または生物学的パラメーター）を測定する少なくとも一つの計測機器を備えることができる。さらに、バイオリアクターは計測機器に接続された制御素子を備えてもよく、計測機器から制御素子によって受け取られた入力の機能パラメーターを変更することができる。実施態様にもよるが、バイオリアクターはさらに、パラメーターを変更してもよい。実施態様において、該手段は制御素子に接続される。とりわけ加熱手段、冷却手段、ガス搬送手段や駆動手段などの各種手段を制御素子に接続する。

別な実施態様では、バイオリアクターにさらに、培地を主方向に循環するポンプや培地循環手段（例えばインペラー）を設ける。とりわけ通気性、伝熱性、制御性が向上する作用効果がある。さらに、本発明では、培地が収穫時にも循環できるように流体循環を実行できる。

このように、本発明は、ふさわしい培地が流動し、かつ収穫を行える細胞培養の二次元的な構造体を提供するものである。

この代わりに、あるいはこれに加えて、細胞および培地の不均一な分配（なお、これは開放スペース幅を２つの層状担体間の距離よりも少なくとも５倍小さくするか、あるいは隣接層状担体間に開放スペースを重ならないようにすることによって抑制できる）をもたらす、いくつかのレベルにわたる培地の完全な垂直流れを発生する恐れは、流体の相互接続部の形状および/または能動的な流れ刺激作用によって抑制することができる。後者の能動的な流れ刺激作用については、よく知られているように、循環手段（例えば機械的インペラーなどのインペラー、好まくは磁気インペラー）によって得るのが好適である。このインペラーの場合、層状担体積層体の上にある上部キャビティ内でこれに隣接して設けるか、あるいは（層状担体積層体の下にある）バイオリアクターの下部にある下部キャビティ内でこれに隣接して設けるのが好適である。あるいは、第１インペラーを下部キャビティ内に配置し、そして第２インペラーを上部キャビティに配置すると、上下を逆にしてバイオリアクターを操作できる。これらインペラーを位置決めするベアリングを下部および/または上部キャビティ内に設けるのが好適である。また、インペラーは流体チャネル内に存在さてもよい。例えば、中央の同心カラムに存在させると、第１層状担体と第２層状担体との間に流体接続を作り出すとともに、液体培地の循環システムを形成する。これは、特に下部キャビティが存在しない場合に有利である。

本発明の一つの実施態様の場合、バイオリアクターはさらに、担体積層体のそれぞれ第１端部および第２端部に隣接して上部ゾーンおよび下部ゾーンを相互にかつ中央の流体チャネルと流体連絡した状態で有することも可能である。

本発明の一つの実施態様では、バイオリアクターはさらに、上部ゾーンおよび/または下部ゾーンに対して入り口ポート/出口ポートを有していてもよい。

本発明の一つの実施態様の場合、少なくとも一つの入り口ポートを下部ゾーンに存在させ、そして少なくとも一つの出口ポートを上部ゾーンに存在させ、ポンプなどの外部循環手段をこれら入り口ポートと出口ポートとの間に結合してもよい。

さらに別な実施態様に言及すると、担体の少なくとも一部は、主方向に対して垂直ではない角度を有する方向に配向し、そして少なくとも一つの開放スペースを有する部分をもつ。このためには、中心軸を通る横断面視で担体を曲線状にすればよい。例えば、担体を円錐形に構成すればよく、あるいは角錐状に構成すればよい。実質的にすべての担体が同じか相似的な形状および配向をもつのが好適であるが、必ずしもこの限りではない。例えば、第１担体を、縁部がバイオリアクターの中心よりも第１側に近い、曲線状（例えば、円錐形または角錐形）に構成し、その一方で第２担体を曲線状にするとともに、縁部をバイオリアクターの中心よりも第２側部に接近（換言すれば、配向が逆向きである）させてもよい。さらに、第１担体を平坦構成にし、第２担体を別な形状（例えば、円錐形）に構成することも可能である。さらに、第１担体および第２担体を曲線形状に構成し、配向を同じにするが、第１担体の曲率を第２担体とは異なる曲率にしてもよい。このような実施態様の場合、レベルが高さにおいて異なるため、収穫を向上するために有利に作用する。さらに、積層体をさらに小さい第１積層体および第２積層体に分割し、これら積層体の間に流体および/または培地に対する入り口ポートおよび/または出口ポートを存在させてもよい。この場合には、これらポートを異なる高さのレベルに結合するのが好適である。

さらに別な一つの実施態様の場合、バイオリアクター内の物理的条件は、過不足なくモニター/制御することができる。これは、幹細胞/一時細胞がきわめて脆いため、有利に作用する。温度、バイオマス、ｐＨ、Ｏ_２濃度、ＣＯ_２濃度や機械的衝撃などの物理条件が少しでも変動すると、幹細胞の損傷が生じることがある。本発明のバイオリアクターの場合、担体積層体の上部で、担体積層体に隣接して上部キャビティを設けるのが好適である。センサーを少なくとも上部キャビティに存在させてもよい。

センサーをバイオリアクター内部に存在させてもよい。これに代えて、あるいはこれに加えて、外部循環システムを使用するさいにはこのシステムの組成および物理的条件については、例えばバイオリアクターの出口ポートと培地貯蔵タンクとの間においてモニターすることができる。あるいは、別なセンサー体を設けてもよい。測定すべき条件例には、培地のｐＨ、温度、バイオマス、酸素含量およびＣＯ_２含量、生物学的材料の量および/または実効流量がある。本発明のバイオリアクターは、担体積層体とは別に少なくとも一つの流体チャネルから構成し、第１側から第２側まで実質的に延長する流体接続を形成し、これとともに培地の内部循環システムを構築するのが好ましい。培地の内部循環システムは、外部循環システムよりも設置面積が小さい。さらに、外部構成部材数が外部循環システムよりも少なく、使用者側からみて使用しやすい。換言すると、一つの実施態様の場合、バイオリアクターはさらに担体積層体とは別な少なくとも一つの流体チャネルで構成し、担体積層体の第１端部の第１担体と担体積層体の第２端部の第２担体との間に流体接続を形成し、これとともに液体培地の循環システムを構築する。バイオリアクターの中心軸に位置する柱状チャネルとして流体チャネルを具体化するのが好ましい。一つの実施態様の場合、流体チャネルを担体積層体に対して同心構成するともとに、担体積層体の内部または外部に設けることができる。例えば、流体チャネルは、担体積層体の内部にある中心カラムとして構成することができる。

柱状チャネルについては、下部キャビティと上部キャビティとの間に設けるのが好適である。下部キャビティおよび/または上部キャビティとの間にインペラーを存在させてもよい。インペラーの回転軸は、中心軸を兼ねるのが好ましい。上述したように、例えば下部キャビティが存在しない場合には、インペラーは柱状チャネル内に配置できる。この場合、少なくとも一部のポートを存在させて、柱状チャネルを（好ましくは積層体の最下部レベルからなる）少なくとも一つのレベルと相互接続する必要がある。なお、下部キャビティは、一つかそれ以上の開口、即ち培地に対するアクセスポートを有する壁によって柱状チャネルから分離することができる。このように分離すると、柱状チャネル内の流れがバイオリアクターのレベル内より激しく流動する。即ち、細胞の混合が適正化するとともに、細胞の流れも適正化する。このような柱状チャネルとバイオリアクターの個々のレベルとの間にポートが存在していてもよいが、好ましくは存在しないほうがよい。ところが、上述したように、下部キャビティが存在せず、また循環手段またはポンプが柱状チャネル内のインペラーの場合、ポートは存在するのが好ましい。柱状チャネルにこのようなポートを設けない方が好適であるが、管などの手段を設けて培養成分を柱状チャネル内の培地に供給してもよい。このような培養成分の実例は、空気、酸素およびＣＯ_２などのガス状成分だけでなく、ｐＨを補正する酸または塩基、あるいは培養培地、あるいは他の栄養素または添加剤である。前記手段は管として具体化することができるが、固体成分としての培養成分を添加する手段として具体化してもよい。ガス調節および/またはガス交換および/または（酸素濃度または二酸化炭素濃度などの）ガスの制御および調節を行う管として前記手段を具体化する場合には、気泡を作り出す単純な管として具体化でき、あるいは閉じた多孔質シリコン管として具体化できる（この場合、気泡は発生せず、発泡もない）。この場合、柱状チャネルは相当な撹拌作用をもつか、あるいは少なくとも回転動作を行う。この結果として、酸素などの培養成分が培地に溶解し、培地を細胞が成長するレベルに設定する前に、混合が適正化する。さらに、気泡が発生しても、個々のレベルに供給される前に、気泡が培地から出ていく。気泡がレベルに侵入すると、細胞が損傷する恐れがあるため、これは望ましくない。

培養成分を培地に与えるこのような手段は他の場所（たとえば、上部キャビティ内）に設置することも可能であり、またガス交換フィルターを設けることも可能である。

さらに別な実施態様の場合、レベルは構造化した固定床からなり、キャビティの大きさは、膨張作用を受ける細胞のサイズに合わせる。さらに、収穫は、バイオリアクターを振動させることなく実施することができる。振動操作には、幹細胞や一次細胞の培養時に成長細胞が損傷する傾向が出てくる問題がある。

一つの実施態様の場合、バイオリアクターの担体は親水性である。このためには、表面処理を行えばよい。表面処理は、細胞培養に有利に作用する。基本的に、親水性化は、物理的処理（例えば、真空または大気プラズマ処理）によって、あるいは化学的処理（例えば、親水性シランによる官能性化）によって行うのが好適である。より精巧な他の処理（例えば物理的官能性化、化学的官能性化など）も実行可能である。

収穫は、（例えば、トリプシンなどの）酵素反応によって行えばよい。付着するためには、担体表面に固定点を存在させておけばよいが、平滑な表面が好ましい。

一つの実施態様の本発明バイオリアクターの場合、レベル内の培地の線状速度が２mm/ｓ以下（例えば１mm/ｓ）になるように設定すればよく、あるいは培地の循環時間が６０分以下（例えば３０分）になるように設定すればよい。これは、適正なレベル幅、適正な開放スペース密度、適正なインペラーまたはポンプ速度、適正な開放スペース形状および位置を選択することによって実現できる。

本発明バイオリアクターの場合、さらに、培地の線状速度を収穫工程で１０mm/ｓ〜２０mm/ｓの範囲まで高速化してもよい。これによって、細胞の担体からの乖離が容易になる。

本発明実施態様によるバイオリアクターは、動物細胞（例えば哺乳類動物細胞、昆虫細胞、魚類細胞、植物細胞など）、好ましくはヒト細胞を含むか含まない（ただし含むほうが好ましい）動物細胞の培養に使用するのが最適である。本発明実施態様によるバイオリアクターは、一次細胞および/または幹細胞の培養に使用できるが、これら以外の細胞の培養またはウィルス、バクテリアなどの他の生物学的物質の培養を排除するものではない。

本発明の第２態様は、細胞の培養方法に関する。第２態様の一つの実施態様は、以下のステップからなる。
液体培地の（ｐＨ、温度、Ｏ_２濃度、ＣＯ_２濃度などの）パラメーターの値を検出するステップ、および
このパラメーターの値が所定の値未満または以上である間、循環手段またはポンプの作動によって前記液体培地をバイオリアクター内に循環させるステップ。

本発明の第２態様の一つの具体的な実施態様は、以下のステップからなる培養方法に関する。
液体培地の（例えばＯ_２濃度）パラメーターの値を検出するステップ、および
このパラメーターの値が所定の値未満である間、循環手段またはポンプの作動によって前記液体培地をバイオリアクター内に循環させるステップ。

本発明の第２態様のさらに別な実施態様の培養方法は、本発明の第１態様の任意の実施態様に従って細胞をバイオリアクター内で成長させた後に以下の収穫ステップを行う。
液体（培養）培地の出口を開けることによってバイオリアクターから液体培地を取り出し、バイオリアクター内を空にするステップ、
放出剤（例えばトリプシン）からなる別な液体培地を導入するステップ、
循環手段またはポンプの作動によってバイオリアクター内にこの別な液体培地を循環させるステップ、および
バイオリアクター内を空にすることによって成長した細胞を収穫するステップ。

本発明の第２態様のさらに別な実施態様の方法は、以下のステップからなる。
本発明の第１態様の任意の実施態様によるバイオリアクターに細胞を有する第１液体培地を導入するステップ、
循環手段またはポンプを作動して、第１液体培地をバイオリアクター内で循環させるステップ、
循環手段またはポンプの作動を停止して、バイオリアクターの担体の第１側に細胞を沈着させるステップ、および
適宜行うステップであって、バイオリアクターから液体培地を取り出し、バイオリアクターに細胞を有する第２液体培地を導入し、循環手段またはポンプを作動して、バイオリアクター内で第１液体培地を循環させ、循環手段またはポンプの作動を停止し、バイオリアクターの上下を逆にし、そしてバイオリアクターの担体の第２側に細胞を沈着させるステップ。

本発明の第２態様のさらに別な実施態様の方法は、前記ステップを組み合わせて実施する方法である。例えば、以下のステップからなる方法である。
本発明の第１態様の任意の実施態様によるバイオリアクターに細胞を有する第１液体培地を導入するステップ、
循環手段またはポンプを作動して、第１液体培地をバイオリアクター内で循環させるステップ、
循環手段またはポンプの作動を停止して、バイオリアクターの担体の第１側に細胞を沈着させるステップ、および
適宜行うステップであって、バイオリアクターから液体培地を取り出し、バイオリアクターに細胞を有する第２液体培地を導入し、循環手段またはポンプを作動して、バイオリアクター内で第１液体培地を循環させ、循環手段またはポンプの作動を停止し、バイオリアクターの上下を逆にし、そしてバイオリアクターの担体の第２側に細胞を沈着させるステップ、
液体培地のパラメーター（例えば酸素濃度）の値を検出するステップ、
このパラメーターの値が所定の値未満である間、循環手段またはポンプの作動によって前記液体培地をバイオリアクター内に循環させるステップ、
細胞成長後、液体（培養）培地の出口を開けることによってバイオリアクターから液体培地を取り出し、バイオリアクター内を空にするステップ、
放出剤（例えばトリプシン）からなる別な液体培地を導入するステップ、
循環手段またはポンプの作動によってバイオリアクター内にこの別な液体培地を循環させるステップ、および
バイオリアクター内を空にすることによって成長した細胞を収穫するステップ。

本発明の別な態様は、多重積層した担体を有する細胞成長をモニターする装置および方法に関する。第２担体の上に位置する第１担体は、細胞の成長を阻止する領域または部分を有することができる。この領域または部分を下にある担体の成長領域に整合させる（is aligned with）と、観察線（line of sight）を外部からバイオリアクターに維持でき、かつ第１担体を介して成長領域に維持できる。

本発明のさらに別な態様は、バイオリアクター内で細胞を培養する担体に関する。この担体の表面は、細胞が付着する領域と細胞付着を阻止する領域を有する。細胞付着を阻止する表面は、一つの透明材料に対応させるか、あるいは疎水性化しておけばよい。

細胞を培養するバイオリアクターは、第１担体および第２担体を有することができ、それぞれは流体培地を導入する少なくとも一つの入り口を有する。第１担体は細胞が付着する第１部分を有し、そして第２担体は細胞の付着を阻止する第２部分を有する。第２担体の第２部分から、従って、第１および第２担体がアライメントしたときに、第１担体の第１部分を見ることができる。

第１部分および第２部分は、担体上の表面からなるのが好ましいが、開口を形成してもよい。第２部分は、第２担体と第１担体との間に光学的に透明な材料を有することができる。担体を受け取る単独のハウジングを設けてもよく、あるいは担体を積層可能なトレーまたはキューブで構成してもよい。

細胞が付着する第１部分および細胞付着を阻止する第３部分であって、使用時に第２担体の第２部分に対してアライメントする第３担体を設けてもよい。

本発明のさらに別な態様は、細胞培養バイオリアクターに関する。このバイオリアクターは、担体の積層体を有する。第２担体の上に位置する第１担体は、細胞付着を阻止する領域を有する。第１担体の細胞付着作用のない領域から、第１担体を介して第２担体の細胞成長領域を見ることができる。

細胞培養バイオリアクターは、Ｎ個の担体からなる積層体からなる。担体Ｎ−１は、細胞付着を阻止する少なくとも一つの領域を有する。担体Ｎ−１のこの領域から、担体Ｎ−１を介して担体Ｎ上の細胞成長領域を見ることができる。担体Ｎ−２は、細胞付着を阻止する少なくとも２つの領域を有するのが好ましく、第１阻止領域から、担体Ｎ−１上の第１細胞成長領域を見ることができ、そして担体Ｎ−１の阻止領域を通る観察線を利用して、第２阻止領域から、担体Ｎ上の第２細胞成長領域を見ることができる。

別な見方をすると、細胞培養バイオリアクターは、Ｎ個の担体からなる積層体からなる。担体Ｎ−Ｍは、細胞付着を阻止する少なくともＭ個の領域を有する。担体Ｎ−Ｍのこれら領域から、担体Ｎ−Ｍを介して担体Ｎ上の細胞成長領域を見ることができる。

本発明は、また、Ｎ個の担体の積層体からなり、外部の有利な点から担体Ｎ−１の表面上の細胞成長領域までの光学的に透明な観察線を有するバイオリアクターに関する。好ましくは、透明な材質の支柱が光学的に透明な観察線を形成する。

別な見方をすると、担体の積層体からなるバイオリアクターは、光学的に透明な固形物質が隣接担体間のスペースに位置するものである。

本発明のさらに別な態様は、担体の垂直積層体からなり、担体それぞれが流体培地を受け取る入り口を有し、この入り口ではなく、隣接する担体を介して一つの担体上の成長領域を見ることができる。

本発明のさらに別な態様は、担体からなる積層体からなる細胞培養バイオリアクターに関する。これら担体は、液体培地がバイオリアクターの入り口から出口に流れる、隣接担体間にレベルを画定するように積層する。隣接するレベルは、２つかそれ以上の開放スペースによって相互に流体接続するため、液体培地が一つのレベルから隣接するレベルに流れる。第１担体が形成する開放スペースのうち少なくとも一つは、第２の担体である隣接担体によって形成される開放スペースに少なくとも部分的に重なり、第３担体上の成長領域を見ることができる実質的に邪魔にならない光学的経路を画定する。さらに、これら担体が、主方向にそって投影したときに、第２レベルと隣接する第３レベルとの間の一つかそれ以上の開放スペースに重ならない第１レベルと隣接する第２レベルとの間に一つかそれ以上の開放スペースを有するのが好ましい。

また、本発明は、少なくとも３つの担体からなる積層体からなる細胞培養バイオリアクターに関する。第１担体が細胞付着作用のない少なくとも３つの開放スペースを画定し、第１担体上の少なくとも一つの開放スペースが第２担体上の少なくとも一つの開放スペースにアラインメントするため、第３担体上の細胞成長領域を見ることができる。第２担体が少なくとも２つの開放スペースを有することが好ましい。

添付図面を参照して、本発明のバイオリアクターをさらに詳細に説明する。

本発明の一実施態様に従って外部循環システムを設けたバイオリアクターを示す概略図である。 本発明の一実施態様によるバイオリアクターに組み込んだ循環システムからなるバイオリアクターを示す概略横断面図である。 本発明の一実施態様によるバイオリアクターに使用できる設計の担体を示す概略上面図である。 本発明の一実施態様によるバイオリアクターに使用できる設計の担体を示す概略上面図である。 本発明の一実施態様によるバイオリアクターに使用できる設計の担体を示す概略上面図であって（左）、担体の開放スペースによってカバーされる全表面積（Ａ）の拡大速度が、担体の幾何学的中心に対する半径方向距離（Ｄ）が長くなるにつれて速くなることを示すグラフでもある。 本発明の一実施態様によるバイオリアクターに使用できる設計の担体を示す概略上面図である。 本発明の一実施態様によるバイオリアクターに使用できる設計の担体を示す概略上面図である。 本発明の実施態様によるバイオリアクターにおける流れを説明する図である。 バイオリアクターが、バイオリアクターにおける主方向に対して垂直ではない角度をもつ担体からなる、本発明の別な実施態様を示す概略横断面図である。 バイオリアクターが、バイオリアクターにおける主方向に対して垂直ではない角度をもつ担体からなる、本発明の別な実施態様を示す概略横断面図である。 本発明の第２態様の一実施態様による方法を第１ステップから第７ステップまでの各ステップ毎に示す図である。 本発明の一実施態様によるバイオリアクターに使用できる設計の担体を示す概略横断面図である。 本発明の一実施態様によるバイオリアクターに使用できる設計の担体を示す概略上面図である。 本発明の一実施態様によるバイオリアクターに使用できる設計の担体を示す斜視図である。 本発明の一実施態様によるバイオリアクターに使用できる設計の担体を示す概略上面図であって（左）、担体の開放スペースによってカバーされる全表面積（Ａ）の拡大速度が、担体の幾何学的中心に対する半径方向距離（Ｄ）が長くなるにつれて速くなることを示すグラフでもある。 本発明のリアクターの一実施態様に使用する担体積層体の縁部を示す横断面図である。 本発明の一実施態様による担体積層体を示す斜視図である。 本発明の一実施態様によるバイオリアクターに関する。

以下、具体的な実施態様および図面について本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されず、特許請求の範囲の記載によってのみ本発明は制限されるものである。図面は概略図に過ぎず、非制限的である。図面では、構成要素の一部のサイズについては、説明のために誇張してあり、縮尺に従っていない。寸法および相対的寸法も本発明の実施態様に対応していない。なお、本発明の例示的実施態様の説明では、本発明の各種特徴を単独の実施態様、図面または説明にまとめているが、いずれも本開示をスリム化し、かつ本発明の一つかそれ以上の態様の理解の一助になることを目的としている。また、本発明の方法については、特許請求の範囲に記載されている発明が、各項に明示的に記載されている以上の特徴を必要とするという意図を反映するものと解釈すべきではない。むしろ、特許請求の範囲が反映しているように、本発明の態様は、単独の開示実施態様のすべての特徴を包摂するものではない。即ち、本明細書冒頭の特許請求の範囲の記載は、発明の詳細な説明に援用され、各請求項は、本発明の一つの別な実施態様として自立している。

さらに、本明細書に記載した一部の実施態様は、他の実施態様に包含されるすべてではないが一部の特徴を有しているが、異なる実施態様の特徴の組み合わせは、当業者ならば理解できるように、いずれも本発明の範囲内にあり、異なる実施態様を構成するものである。例えば、特許請求の範囲において、記載されている実施態様の任意のものは、任意の組み合わせで応用できる。

さらに、一部の実施態様については、方法として、あるいはコンピュータシステムのプロセッサーによって、あるいは機能を実行する他の手段によって実施できる方法の構成要素の組み合わせとして記載されている。即ち、このような方法または方法の構成要素を実施する必要な指示を備えたプロセッサーが、当該方法または方法の構成要素を形成する。さらに、装置実施態様の、ここに記載した構成要素は、本発明を実施するための構成要素によって実行される機能を実施する手段の一例である。

本明細書では、数多くの具体的な細部に言及しているが、これら具体的な細部なしでも、本発明の実施態様は実施可能である。他の場合には、本明細書の理解の障害にならないように、公知方法、公知構造および公知技術については詳しく触れていない。

図１は、本発明に従って構成したバイオリアクターの第１実施態様を示す概略図である。バイオリアクター１には、第１側１１および反対側の第２側１２を設ける。バイオリアクター１には担体７からなる積層体が存在する。これら担体は、第１側１１から第２側１２に走る主方向Ｐにそって積層する。担体７には（図示しない）開放スペースを設ける。この実施態様のバイオリアクター１には、外部循環システム３０を付設する。この外部循環システム３０は、管３６によってバイオリアクター１に結合した培地貯蔵タンク３２からなる。培地をバイオリアクター１に循環させるための外部ポンプ３３がある。管から培地が、バイオリアクター１の第１側１１において入り口ポート２１からバイオリアクター１に流入する。培地は、バイオリアクター１内の開放スペースを介して各担体７を通り、バイオリアクター１の第２側１２においてバイオリアクターの出口ポート２２から流れ出る。この実施例では、培地貯蔵タンク３２にガス交換用のフィルター３４および培養成分を添加配合するための手段または輸送手段３５を設ける。この手段３５は管として具体化してもよいが、あるいは固形の培養成分を添加配合する手段として具体化することも可能である。図示の培地貯蔵タンク３２は典型的な実験室規模のもので、例えばガラスビーカーであるが、本発明は、それよりも規模の大きいものを排除するものではない。また、図示の培地貯蔵タンク３２は単独のバイオリアクター１に結合しているが、好適には並列構成の複数のバイオリアクター１に結合することを排除するものではない。図示していないが、バイオリアクター１の組成および物理的条件はモニターするのが好ましい。本実施例では、センサーはバイオリアクターの内部に存在させてもよい。あるいは、外部循環システムの組成および物理的条件は、例えばバイオリアクター１の出口ポート２２と培地貯蔵タンク３２との間においてモニターすることも可能である。あるいは、別なセンサー体を考慮してもよい。測定対象の代表的な条件を挙げると、ｐＨ、温度、培地の酸素含量およびＣＯ_２含量、生物学的物質の量、および/または実効的な流量である。

図２は、バイオリアクター１の第２実施態様を示す概略横断面図である。図２に示す実施態様は、循環システムを組み込んだバイオリアクターである。この実施例では、バイオリアクターにバイオリアクター１の主方向Ｐにそって下部キャビティ３、上部キャビティ４およびこれらキャビティ３、４間の流体チャネル５を設ける。この実施例における流体チャネル５は、バイオリアクター１の中心に設けられた柱状チャネルであり、形状は好ましくは円筒形である。担体７は、同じ方向に積層する。一つの実施態様では、柱状チャネル５の側壁を画定する機械的接続部によって積層を行う。これら機械的接続部によって積層体内の各担体の配向を固定することができるが、各担体が独立して回転できる余地を残してもよい。なお、柱状チャネルを含む担体積層体を、例えば成形方法によって一体物として製造することを排除するものではなく、および/または接着剤や機械的固定手段（ネジなど）を使用して積層体の部分を固定することを排除するものではない。なお、担体を個別に製造すると、積層体がモジュラー式になるため、目的の用途および必要条件に応じて大きさを加減できる作用効果が得られる。

好ましくは、図２に示すように、柱状チャネル５は、バイオリアクター１内の隣接担体７間の個々のレベル６に接続しないほうがよい。このため、柱状チャネル５を混合/溶解容器として使用することができる作用効果が得られる。この実施例ではバイオリアクター１に、いくつかのポート１３、１４、１５、例えばガス交換用のフィルター１３、液体培養成分、特に溶剤、溶液、懸濁液、分散液を添加配合するポート１４、ガス状成分、例えば空気、酸素またはＣＯ_２を添加配合するポート１５を設ける。特にガス状成分から発生する気泡１６がある場合には、担体７間のレベル６への侵入を阻止するのがよい。また、バイオリアクター１には、培地を撹拌するインペラー９を設ける。このインペラーとしては、本バイオリアクター１の実験室規模のものがよく、例えば磁気インペラーがある。なお、機械駆動式インペラーを排除するものではない。

このインペラー９は、さらに培地をバイオリアクター内で循環させる作用を提供する。ただし、望ましい場合には、別なポンプを使用して、このような流れを制御駆動することが可能である。インペラー９は、柱状チャネル５の端部にある下部キャビティ３内に設けることができる。なお、一つかそれ以上の開口、即ち培地のアクセスポートをもつ壁によって下部キャビティ３は柱状チャネルから分離することができる。このような分離を行うと、柱状チャネル５内の流れが、バイオリアクター１のレベル６よりも激しくなる。従って、適正な混合および細胞への適正な流量の両者を実現することが可能になる。

この実施態様のバイオリアクター１には、第１側において少なくとも一つの入り口ポート２１を設ける。この入り口ポート２１の主な目的は、バイオリアクターを充填し、かつ空にすることである。ただし、この入り口ポート２１が、内部循環システムに加えて使用する外部循環システムに対するポートを形成することを排除するものではない。このような場合、例えば、少なくとも一つの出口ポートをバイオリアクターの第２側１２に存在させる。望ましい場合には、入り口ポート２１およびこの出口ポートは逆にすることができる。

図２に示すように、入り口ポート１３、１４、１５は上部キャビティ４内に存在させるのが好適である。このキャビティ４には、センサー２３を設ける余地が残されている。当業者ならば、バイオリアクター１の第２側１２を閉じて、物理的条件をできるだけベストに維持することが好適であることを理解できるはずである。

図３〜図７は、本発明に従って構成した担体７の異なる実施態様を示す複数の概略上面図である。これらすべての実施態様の場合、担体７は円形であり、開放スペース２が担体７の中心１７からその縁部１８まで走るいくつかのラインにそって存在し、回転対称になっている。なお、担体７がこれ以外の形状をもつことを排除するものではなく、また開放スペース２が半径方向ライン上ではなく、中心１７の周りに円状に配向することを排除するものではない。ここで、担体は開放スペース２と固形担体２７からなる。

図３および図５は、開放スペース２が孔状である実施態様を示す。図４、図６および図７は、開放スペース２が溝状であって、溝が実質的に中心１７から側縁部１８まで走る実施態様を示す。図示していないが、溝状開放スペースおよび孔状開放スペースは単独の担体７構成になるように一体化することも可能である。また、図示していないが、溝状開放スペースをさらに分割して一連のトレンチ状開放スペースにすることも可能であり、また孔状開放スペースをさらに広げて前記のようなトレンチ状開放スペースにすることも可能である。

図３及び図４に、開放スペース２の表面積を中心１７までの距離から無関係に設定した実施態様を示す。図５および図６に、担体７の少なくとも一つにおいて開放スペース２によってカバーされる全表面積の拡大速度が、担体７の幾何学的中心に対する半径方向距離が長くなるにつれて速くなる実施態様を示す。図６に、開放スペース２の表面積が中心１７から離れるに従って大きくなる好ましい実施態様を示す。

図５に、例えば個々の開放スペース２間の間隔が小さくなることによって、それぞれ大きさが均一な開放スペース２の密度が、中心に対する半径方向距離が長くなるにつれて高くなる一つの実施態様を示す。

図６に、開放スペース２の幅が、中心１７に対する距離が長くなるにつれて広くなる実施態様を示す。

図７に、バイオリアクター１内にポンプ作用システムによって発生された培地の回転運動に従動するように流体相互接続部２が画定された具体的な実施態様を示す。

図８ａ〜図８ｃに、本発明の一実施態様におけるバイオリアクター内の流れを説明する図示を掲げる。図示を簡単にするために、第１担体７の開放スペース２が、隣接する第２担体７の開放スペース２に対して横変位、例えば回転変位している状態を示す。図８ａはミクロスケールの流れを、そして図８ｃはマクロスケールの流れを示す。また、図８ｂにミクロスケールの流れをさらに詳細に示す。図示から明らかなように、マクロスケールの流れがバイオリアクター１の主方向Ｐにそっていたとしても、ミクロスケールでは主成分１０は横方向に流動する。図８ｂに、流れが主に垂直ではなく、主に横方向にあることが有効であることを明らかにする詳細な図を示す。これは、例えばレベル６の幅、開放スペース２の大きさおよび密度を工夫することなどによって実現することができる。

図９および図１０は、バイオリアクター１の他の実施態様を示す概略横断面図である。これら第３及び第４実施態様のバイオリアクター１はほぼ同じなので、一緒に説明することにする。これら実施態様では、担体７からなる積層体は円錐形である。即ち、それぞれの担体は、少なくとも、バイオリアクターの主方向に対して垂直でない（即ち斜めの）角度を有する部分からなる。この円錐形は、個々の担体間に生じる気泡の排除を単純化できる作用効果がある。さらに、バイオリアクターを空にする操作や収穫操作の操作性がよくなる。理由は、バイオリアクターを空にするさいパドル（水がたまること）を形成する恐れがなくなるからである。例えば、担体７の一方の側のみを細胞付着に利用するが、担体７の両側を細胞付着に利用することは不可能ではない。これは、上部キャビティおよび下部キャビティ両者にインペラーを使用すると実施できる（図１４を参照）。この場合には、バイオリアクターの向きを逆にすればよい。即ち、第１操作において細胞を挿入し、時間をかけて第１担体に沈着させた後、バイオリアクターの向きを逆にし、（必要ならば）さらに細胞を追加し、時間をかけて第２担体に沈着させる。

図１３ａ〜図１３ｇは、本発明の実施態様に従ってバイオリアクター内の各担体の両側を使用する手法を示す図である。第１ステップ（図１３ａ）において、培地Ｍ中の細胞Ｃをバイオリアクター１に導入し、インペラー９を操作して細胞Ｃを均一に分配する。第２ステップ（図１３ｂ）において、細胞Ｃを担体７の第１側に沈着させる。細胞Ｃから出る矢印が、沈着方向を示す。これをトリガーするのは重力である。第３ステップ（図１３ｃ）において、バイオリアクター１から培地Ｍを取り出す。第４ステップ（図１３ｄ）において、培地Ｍ中の細胞Ｃをさらにバイオリアクター１に追加導入し、インペラー９を操作して細胞Ｃを均一に分配する。第５ステップ（図１３ｅ）において、インペラー９の動作を止め、その後にバイオリアクター１の上下を逆にする。第６ステップ（図１３ｆ）において、細胞Ｃを担体７の第２側に沈着させる。第７ステップ（図１３ｇ）において、バイオリアクター１をその最初の向きに戻し、今度は細胞Ｃを各担体７の両側において成長させる。

図１４は、図２と同様なバイオリアクターであって、バイオリアクターの上部キャビティにポンプなどの第２循環手段を存在させたバイオリアクターを示す図である。このバイオリアクターは、上下を逆にして操作できる。

図１５は、開放スペース２の幅が中心１７に対する距離が長くなるにつれて広くなる、本発明実施態様のバイオリアクターに使用する担体を示す。担体７は、交代固形担体２７およびこれら固形担体２７を横方向に分離する開放スペース２からなる。

図１６は、開放スペース２をリッジ１９によって架橋することによって溝状トレンチ２０を画定した、本発明実施態様によるバイオリアクターに使用する担体の部分を示す図である。

図１７は、本発明の一実施態様によるバイオリアクターに使用する設計の担体を示す概略上面図（左側）であって、担体の開放スペースによってカバーされる全表面積（Ａ）の拡大速度が、担体の幾何学的中心に対する半径方向距離（Ｄ）が長くなるにつれて速くなることを示すグラフ（右側）でもある。

図１８は、本発明によるバイオリアクターの一実施態様に使用する担体７の積層体の縁部を示す横断面図である。図示のように、リッジ１０が、２つの隣接担体７と、ポリマー材料に埋設されることになる外側に突出するリッジ１９との間の距離を画定する。

図１９は、レベル６を画定する担体７の積層体からなる、細胞培養バイオリアクター１を示す斜視図である。担体７は２種類のものが交互に積層されている。第１担体はその縁部によって保持され、中心開放スペースを有する。第２担体は中心軸２４に取り付けられることによって保持され、積層体を閉じる壁まで延長しないことによって２つの隣接レベルを相互に流体接続する開放スペースをもつ。

図２０〜図２５は、バイオリアクター１などの細胞培養装置（cell culture device）が担体７_ａ〜７_ｎを有し、外部の有利な点から内部の担体の少なくとも一つ以上の細胞Ｃの成長を観察できるようになっている実施態様に関する。一つの考えられるアプローチの場合、これは、外部の有利な点Ｖから担体７_ａ〜７_ｎ-１を介して担体７ｎまで走る光学的に透明な観察線を設定することによって実現することができる。一つの具体的な実施態様の場合、図２０に示すように、細胞が成長しない各担体７_ａ〜７_ｎ-１上に表面領域Ａを設定すればよい。この領域設定は、領域を疎水性化して細胞付着または成長を阻止する方法か、あるいは細胞付着を自然に遅らせるか、あるいは阻止する物質を使用し、（例えば親水性化処理を使用するなどして）これを領域Ａ以外の領域での細胞成長に応用することなどの化学的処理を使用すれば実施することができる。担体７_ａ〜７_ｎ-１におけるこれら領域Ａは全体として整合しているため、実質的に邪魔にならない観察線が、担体７_ｎ上の細胞成長領域Ａ_ｃｇに設定される。従って、顕微鏡Ｏなどの観察装置によって、担体７_ａ〜７_ｎ-１上の細胞成長からの干渉を受けることなくこの成長領域Ａ_ｃｇ上の細胞を簡単に観察することができる。この場合、領域Ａは窓として考えればよい。

図２１に、各担体７_ａ〜７_ｎ-１には対応するが、細胞成長を観察することが望ましい担体７_ｎには対応しない光学的に透明な物質Ｔを使用することによって細胞成長を阻止する領域Ａを設定することによって望ましい観察線を設定した別な実施態様を示す。この物質によって隣接担体間のスペースを完全に充填し、望ましい有利な点Ｖから実質的に連続光学路を構成する。前述の実施態様と同様に、複数の観察線を設定すると、バイオリアクターの異なるレベルで観察を行うことができる。いずれの実施態様の場合も、領域Ａをできるだけ小さくして、細胞成長領域が最小化することがないようにするとともに、にもかかわらず望ましい観察を実施できるようにするのが好ましい。

図２２について説明すると、バイオリアクター１などの同じ装置において異なる担体に対して異なる観察線を設定することも可能である。例えば、担体７_ｎ上の細胞成長を観察する構成は図２０に示す通りである。なお、細胞成長が実質的に阻止される領域はＡ_１である。層７_ｎ−２については、対応する担体７_ａ〜７_ｎ−３上の同様な領域Ａ_２によって異なる光学路が設定される。さらに、この光学路は異なる領域Ａ_３内に担体７_ｎ＋３に到達するまで延ばすことができる。なお、このパターンを必要な回数、あるいは望ましい回数繰り返すと、一つかそれ以上の担体を観察できる。

これらアプローチを使用して、本明細書に記載するように、同じハウジング内に担体７を積層したバイオリアクター１などの細胞培養装置内の細胞成長領域を観察することは可能であるが、これは他の用途にも適用可能である。即ち、図２３〜図２５に示すように、それぞれが個別に入り口を備えた複数の積層可能な担体７_ａ、７_ｂおよび７_ｃからなる細胞培養装置（例えば、バイオリアクター１から構成することができる）に前記実施態様を使用することができる。図２２〜図２４において、担体７_ａおよび７_ｂは細胞成長を阻止する領域Ａを備えているため、これら領域を介して担体７_ｃ上の成長領域Ａ_ｃｇを外部から観察できる。同様に、図２５の場合は、“キューブ”状の担体７_ａおよび７_ｂに位置する光学的に透明な材料Ｔが細胞成長を阻止する領域Ａを形成するため、これら領域を介して担体７_ｃ上の成長領域Ａ_ｃｇを外部から観察できる（ただし、担体７_ａおよび７_ｂの介在部分が、望ましい方法で観察を可能にする程度に光学的に透明でなければならいことは言うまでもない）。いずれにせよ、下にある層を観察できると、これら下部担体の細胞成長を観察するために上部担体の積層を解体する必要がなくなるため、コスト的に、かつ時間的に有利である。

図２６に、担体７_ａ〜７_ｎが整合した開口を備えているため、所定の担体上の細胞を観察できる一つの実施態様を示す。具体的には、バイオリアクター１の入り口２１および出口２２が、複数の担体を積層状態で有するハウジング内に位置する。第１担体７_ａについては、少なくとも一つの開放スペース２を設け、（少なくとも一部が透明な）ハウジングの第１側１２を介して次の隣接担体７_ｂ上の成長領域Ａ_ｃｇを直接観察できるように配列する。同様に、第１担体７_ａおよび第２担体７_ｂについても、開放スペース２を整合配列して、次の隣接担体７_ｃに至る実質的に連続的な光学経路を作る。このパターンを必要な回数、あるいは所望回数繰り返すと、外部の有利な点から、所定の担体上の成長領域を観察することができる。なお、この場合、第１担体が観察すべき最も内側の担体に対応する個数の開口をもち、それぞれ連続する担体が前の開口数よりも一つ少ない開口数であることが好ましい。さらに、このアプローチについては、担体７_ｎの開放スペース２によって示すように、第２側１１から担体を観察できるようにしてもよい（ただし、ハウジングをこれに合わせて変更する必要があることは言うまでもない）。

また、開放スペース２については、前記に概略したように、流体、酸素および栄養素が最も望ましい流れで層に流れることを確保するように配列することが可能である。例えば、第１の組の開口が細胞栄養素を“ジグザグ”に流し、そして第２の組の整合開口が観察に使用できるなどの（最適には、整合開口を流れる“直線“流れがオフセット開口を流れる主流れに対して低くなるように配列を行う）２つの異なる組の開口を担体（７）に配列することも可能である。

本明細書で使用したように、そして特に断らない限り、“からなる、有する、あるいは、備える”（comprising）は、狭義の“からなる”（consisting）とは同義ではない。従ってこれらの術語については、以下に示す意味に限定して解釈すべきではない。即ち、他の要素またはステップ（工程）を排除するものではない。換言すれば、以上説明してきた特徴、完全体、ステップまたは構成成分の存在を特定していると解釈すべきではあるが、一つかそれ以上の他の特徴、完全体、ステップまたは構成成分、あるいはこれらの群を排除するものではない。従って、“構成成分ＡおよびＢからなる（を有する、を備える）装置”という表現の範囲の場合、構成成分ＡおよびＢのみからなる装置に限定すべきではない。これは、本明細書の開示に関する限り、装置の必須の構成成分はＡおよびＢであることを意味する。さらに、“からなる、を有する、あるいは、を備える”は常に“のみからなる”（consisting）を包含し、本明細書の開示の実施態様において“からなる、を有する、あるいは、を備える”と表現が出てきた場合、“のみからなる”が“からなる、を有する、あるいは、を備える”と代替可能な同じ実施態様もまた、本明細書開示の実施態様である。

さらに、本明細書開示および特許請求の範囲における“第１”、“第２”、“第３”などの用語は、同様な要素間を区別するもので、必ずしもランク化するさいの一時的でかつ空間的な順、あるいはその他の順を表すものではない。なお、これら用語は状況により互換性をもつもので、以上説明してきた本発明の実施態様は、前記以外で図示以外の他の順でも操作可能である。

加えて、本明細書開示および特許請求の範囲における“上部”（top）、“下部”（bottom）、“上”（over）、“下”（under）などの用語は、記述的、叙述的用語であり、必ずしも相対的な位置を指すものではない。なお、これら用語は状況により互換性をもつもので、以上説明してきた本発明の実施態様は、前記以外で図示以外の他の配向位置でも操作可能である。

本明細書の開示全体を通じて、“一つの実施態様”（one embodiment）または“実施態様”（an embodiment）は、当該実施態様に関連して記載されている具体的な特徴、構造または特性が、本明細書に開示されている少なくとも一つの実施態様に包含されることを意味する。本明細書に頻出する“一つの実施態様”または“実施態様”はいずれも、必ずしも同じ実施態様を指すものではなく、異なる実施態様を指す場合もある。さらに、具体的な特徴、構造または特性は、当業者には自明なように、一つかそれ以上の実施態様において任意な方法で組み合わせることができるものである。

本明細書で使用されているように、そして特に断らない限り、用語“長さ”（length）は、ある対象（例えば、開放スペース）の最長の寸法を指す。

本明細書で使用されているように、そして特に断らない限り、用語“幅”（width）は、長さに対して直角に取ったある対象の最大寸法を指す。従って、“幅”は“長さ”より決して大きくなることはない。

本発明の各種実施態様の前記説明は、例示的なもので、制限または限定を意図するものではない。本明細書の開示内容に照らして、各種の変更態様などが可能である。以上説明してきた実施態様は、最良の適用例を示すもので、これによって当業者ならば、各種の実施態様および各種の変更態様を具体的な用途に応用できるはずである。これら変更態様などはすべて本発明の範囲内に包摂包含されるものである。

Ｐ：主方向
１：バイオリアクター
２：開放スペース
３：下部キャビティ
４：上部キャビティ
５：流体チャネル
６：レベル
７：担体
９：インペラー
１１：第１側
１２：第２側
２１：入り口ポート
２２：出口ポート
３０：外部循環システム
３２：培地貯蔵タンク

Claims (1)

1. Ｎ個の担体の積層体と、組み込まれた透明材料のカラム（Ｔ）とを具備してなり、該カラム（Ｔ）により担体Ｎ−１の表面上の細胞成長領域を外部の任意の位置からの光学的透明な観察線を形成するようにしたことを特徴とするバイオリアクター（１）。

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