CN116568801A - 细胞培养基调节容器和灌注生物反应器系统 - Google Patents

Abstract

提供了一种用于灌注生物反应器系统的培养基调节容器。该培养基调节容器包括具有容纳一定体积的液体细胞培养基的内腔的容器；将细胞培养基从灌注生物反应器返回到容器的培养基入口；以及使细胞培养基离开容器并转移到灌注生物反应器的培养基出口。提供了用于测量或检测细胞培养基特征的传感器，该传感器以内嵌式传感器的形式提供在培养基入口和培养基出口的至少一个中，或者以贴片传感器的形式附接到培养基调节容器的侧壁或底部。

Description

细胞培养基调节容器和灌注生物反应器系统

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119要求2020年11月30日提交的序列号为63/119,007的美国临时申请和2020年11月30日提交的序列号为63/119,045的美国临时申请的优先权权益，本文以上述申请的内容为基础并通过引用将其全文纳入本文。

技术领域

本公开一般涉及用于细胞培养系统的培养基调节系统，以及具有培养基调节系统的用于细胞培养的生物反应器和生物反应器系统。

背景技术

在生物工艺产业中，进行大规模培养细胞以为了生产激素、酶、抗体、疫苗和细胞疗法。细胞和基因疗法市场正在迅速增长，有前景的治疗正在进入临床试验并迅速走向商业化。然而，一个细胞疗法剂量可能需要数以亿计的细胞或数万亿病毒。因此，能够在短时间内提供大量的细胞产品对临床成功至关重要。

生物工艺中使用的细胞中有很大一部分是锚固依赖性的，这意味着细胞需要附着在表面上才能生长和发挥功能。传统上，贴壁细胞的培养是在二维(2D)细胞贴壁表面上进行的，该表面被包括在多种容器形式的一种中，如T形烧瓶、培养皿、细胞工厂、细胞堆叠容器、滚瓶和容器。这些方法可具有显著的缺点，包括难以实现足够高的细胞密度以使其能够大规模生产治疗剂或细胞。已经提出了增加培养细胞的体积密度的替代方法。其中包括在搅拌槽中进行的微载体培养。高密度细胞培养系统的另一个例子是中空纤维生物反应器，其中细胞在间隙纤维空间中增殖时可以形成大的三维聚集体。

用于锚固依赖性细胞的高密度培养系统的另一个例子是填充床生物反应器系统。在这种类型的生物反应器中，使用细胞基材来提供用于贴壁细胞的附着的表面。沿着表面或通过半多孔基材灌注培养基，以提供细胞生长所需的营养和氧气。例如，在第4,833,083号、第5,501,971号和第5,510,262号美国专利中已先前公开了包含载体或基质系统的填充床以捕获细胞的填充床生物反应器系统。填充床基质通常由作为基材的多孔颗粒或聚合物的非织造微纤维制成。这种生物反应器起到再循环流通生物反应器的作用。

在这些不同类型的细胞培养反应器中，细胞必须在受控条件下生长，包括被悬浮或灌注在细胞培养基中，细胞培养基是一种含有细胞生命和生长所需营养物质的液体培养基。必须监测和控制细胞培养基的内容，包括pH、溶解气体比、营养物质和废物，以及培养基和/或细胞的温度，以优化细胞生长和生物反应器的其他性能。因此，需要将培养基调节系统与生物反应器组合使用以调节其中的培养基。传统上，培养基调节已经被整合到细胞培养容器自身中。换言之，培养基调节和/或细胞培养基的混合发生在培养细胞的同一容器中。培养基调节通常在中空直壁内容器或容器(例如烧杯或瓶子)中进行，其具有复杂的系统，包括用于控制培养基的组成的探针，用于混合培养基的一个或多个搅拌器，以及包围容器的某种类型的温度控制夹套。探针可通过容器主体上的盖子进入容器，并且无菌始终是一个问题，尤其是如果在使用过程中系统敞开或打开的情况下。

然而，需要改进的培养基调节系统，该系统能够满足可规模化的细胞培养平台的需求，同时提供简单、可靠和封闭的结构。

发明内容

根据本公开的一个实施方式，提供了一种用于灌注生物反应器系统的培养基调节容器，其包括容器，该容器包括被构造成容纳一定体积的液体细胞培养基的内腔；被构造为将细胞培养基从灌注生物反应器返回到容器的培养基入口；以及被构造为使细胞培养基离开容器并转移到灌注生物反应器的培养基出口，其中培养基入口和培养基出口中的至少一个包括一个或多个被构造为测量或检测细胞培养基的特征的内嵌式(inline)传感器。

在一些实施方式的方面中，一个或多个内嵌式传感器包括溶解氧传感器、pH传感器和温度传感器中的至少一种。培养基调节容器还包括被构造为在内腔中鼓出(sparge)气体的气体鼓泡管。培养基调节容器还包括灌注回路，灌注回路包括被构造为将细胞培养基从培养基出口泵送到培养基返回器的泵，培养基返回器将细胞培养基返回到内腔。

在一些实施方式中，提供了一种用于灌注生物反应器系统的培养基调节容器，其包括：容器，其包括被构造为容纳一定体积的液体细胞培养基的内腔；培养基入口，其被构造为将细胞培养基从灌注生物反应器返回到容器；培养基出口，其被构造为使细胞培养基离开容器并转移到灌注生物反应器；和一个或多个贴片(patch)传感器，其附接到培养基调节容器的侧壁或底部中的至少一个并且被构造为测量或检测细胞培养基的特征。一个或多个贴片传感器可以包括溶解氧传感器、pH传感器和温度传感器中的至少一种。

本公开的其他方面将部分地在随后的具体实施方式、附图和任何权利要求中阐述，以及部分地将从具体实施方式中得出，或者可以通过本公开的实践来学习。应理解，前面的一般性描述和下面的详细描述都只是示例性和解释性的，而不是对所公开的发明的限制。

附图简要说明

图1示出了根据本公开的一个或多个实施方式的细胞培养系统的示意图。

图2示出了根据一个或多个实施方式的具有内嵌式传感器的培养基调节容器的示意图。

图3示出了根据一个或多个实施方式的具有内嵌式传感器和再循环回路的培养基调节容器的示意图。

图4示出了根据一个或多个实施方式的具有贴片传感器的培养基调节容器的示意图。

图5示出了根据一个或多个实施方式的培养基调节容器的气体鼓泡管和培养基入口的放大图。

图6示出了根据一个或多个实施方式的培养基调节容器的示意图。

图7示出了根据一个或多个实施方式的培养基调节容器的示意图。

图8A是标准培养基调节容器的几何图形图。

图8B是标准培养基调节容器的几何图形图。

图8C是根据一个或多个实施方式的培养基调节容器的几何图形图。

图8D是根据一个或多个实施方式的培养基调节容器的几何图形图。

图8E是根据一个或多个实施方式的培养基调节容器的几何图形图。

图9A是根据一个或多个实施方式的培养基调节容器的几何图形图。

图9B是根据一个或多个实施方式的培养基调节容器的几何图形图。

具体实施方式

下面参考附图(若有)对本公开的各个实施方式进行详细描述。参考各个实施方式不限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的范围限制。此外，在本说明书中列出的任何实例都不是限制性的，并且仅列出了要求保护的本发明的诸多可能的实施方式中的一些实施方式。

本公开的实施方式涉及培养基调节容器和系统，以及包括培养基调节系统的细胞培养系统。特别地，本文所述的培养基调节系统包括与用于细胞培养的容器分离的培养基调节容器。培养基调节容器和系统可以包括各种传感器，例如内嵌式和贴片传感器，以及用于改善细胞培养基的加氧(oxygenation)和降低污染风险的改进或简化设计。在一些实施方式中，设想了生物反应器是具有用于细胞生长的高密度支架的固定床或填充床生物反应器。

例如用于悬浮细胞培养的许多生物反应器容器也被用作培养基调节容器。因此，该容器被设计为减少细胞所经历的剪切力，并且将在培养基中包含专门的固定传感器或探针以监测细胞培养参数。然而，由于培养基调节容器与细胞培养生物反应器容器分离，因此在本公开的实施方式中这些特征中的许多特征是不需要的。这种设计不受细胞培养容器内调节培养基的限制，还可以提高性能并降低复杂性和/或成本。例如，具有集成培养基调节的细胞培养生物反应器必须高度工程化以保持生物反应器为封闭系统，从而防止污染，同时还要允许多个探针/传感器穿透容器和/或培养基以监测细胞培养进度。对于一次性使用的容器来说，所需的工程水平会使成本过高。

图1示出了根据本公开的一个或多个实施方式的细胞培养系统50的示意图。细胞培养系统50包括用于生长的细胞、细胞副产物和/或病毒载体的生物反应器容器13，以及用于调节供应到生物反应器容器的培养基的培养基调节系统100。如图1所示，系统50可以被构造在再循环回路中，其中培养基通过出口102流出培养基调节系统100，通过管道104或其他流体连接器流到生物反应器容器13。在生物反应器容器13内，培养基向细胞提供必要的营养并维持健康的细胞环境。任选地，培养基可以通过返回管106或其他连接器返回到培养基调节容器100。本公开的实施方式包括整个细胞培养系统50，以及单独的培养基调节系统100，其可以用在各种系统或应用中来调节培养基。

图2是根据本公开的一个或多个实施方式的用于灌注生物反应器系统的培养基调节容器120的示意图。培养基调节容器120包括培养基入口121和培养基出口122，分别用于将细胞培养基转移到培养基调节容器120和从培养基调节容器120转移细胞培养基。在培养基出口122处提供了三个内嵌式传感器：溶解氧(DO)传感器124、pH传感器126和温度传感器128。培养基调节容器120还包括气体鼓泡器130、通气口(vent)132和补充入口134。图2中的系统通过使用内嵌式传感器来监测容器出口处的培养基，从而减少了容器盖中的穿孔数。

图3示出了根据一个或多个实施方式的培养基调节容器140。与图2的培养基调节容器120一样，培养基调节器140包括培养基入口121和培养基出口122，分别用于将细胞培养基转移到培养基调节容器120和从培养基调节容器120转移细胞培养基。在连接到培养基出口122的灌注回路上提供了三个内嵌式传感器：溶解氧(DO)传感器124、pH传感器126和温度传感器128。培养基调节容器140还包括气体鼓泡器130、通气口132和补充入口134。然而，与图2中的系统不同，培养基调节容器140还具有内置灌注回路，即使下游灌注流(通过培养基出口122)已经停止，还可以使用内嵌式传感器继续采样培养基。

在图4中，提供了根据本公开的另一个实施方式的培养基调节容器150。与图2的培养基调节容器120一样，培养基调节器150包括培养基入口121和培养基出口122，分别用于将细胞培养基转移到培养基调节容器150和从培养基调节容器150转移细胞培养基。培养基调节容器150还包括气体鼓泡器130、通气口132和补充入口134。与图2和图3的内嵌式传感器不同，培养基调节容器150使用设置在培养基调节容器150上的贴片传感器154、156、158：溶解氧(DO)传感器154、pH传感器156和温度传感器158。每种类型的贴片传感器的三种不同位置如图4所示：传感器垂直布置在培养基调节容器150的侧壁上；传感器水平布置在侧壁上；以及在容器150底部。作为一些实施方式的一个方面，贴片传感器放置在培养基调节容器150的底部上可以使系统的组装(即，传感器154、156、158的放置)更容易并且培养基调节容器150可以在对接工位(docking station)正确定向以保持贴片传感器的读出(例如，光学读出)。这也将使得能够使用底部磁力搅拌器，前提是培养基调节容器150底部的贴片传感器不妨碍位于培养基调节容器150底部的外围部分的磁性传感器(例如，传感器154、156、158)。虽然图2和图3仅显示了内嵌式传感器，图4仅显示了贴片传感器，但本公开的实施方式包括具有内嵌式传感器和贴片传感器的组合的培养基调节容器。

图5是具有围绕培养基入口164和气体入口166的外气体鼓泡管162的气体鼓泡系统160的放大图(未按比例)。外气体鼓泡管162可以包括小孔或狭缝168，这些小孔或狭缝太小而不足以让气泡通过，但大到足以让细胞培养基从外气体鼓泡管162排出并进入培养基调节容器的更大的细胞培养基储存区中。孔或狭缝168也可以帮助弹出(pop)外气体鼓泡管162内的气泡。气体流过气体入口166到达外气体鼓泡管162底部附近的鼓泡环170。气泡172然后从鼓泡环170逸出，并在外气体鼓泡管162内上浮，从而在外气体鼓泡管162内产生上行流。存在于培养基入口164底部的培养基然后也由于上行流而向上流动。鼓泡环170还可以根据要实施的期望功能释放期望尺寸的气泡。例如，可以释放大气泡用于浮力作用(buoyancy)和CO₂汽提，也可以释放小气泡用于O₂交换。外气体鼓泡管162具有用于排放的开口174。开口174可以配备有排放塞176，排放塞176在高培养基水平时关闭并且在较低培养基水平时降落。通过将用过的培养基引入外气体鼓泡管162内的有限空间，可以发生更有效的鼓泡，并且鼓出的气泡可以远离培养基调节容器的出口，从而防止气泡进入生物反应器容器。

图6示出了具有顶部培养基入口202和底部培养基出口204的培养基调节容器200。顶部培养基入口202的优点在于，可以利用容器200的覆盖(overlay)部分中的气体混合物将培养基分散在容器200的内壁上(例如，滴落或喷洒)，以帮助培养基加氧。当培养基流进容器时，可以实现高表面积体积比(培养基膜或细流(rivulet))，从而在达到大体积之前对培养基进行预加氧。可以用搅拌来进行混合，或者可以用底部开口的气体鼓泡管来进行混合。底部培养基出口204的优点在于可以降低容器200中液体的滞留量(hang-up)，并且在培养基出口204中提供较高的液体压力，以防止出气(out-gassing)和随后在泵的上游形成气泡。

培养基调节容器200还包括DO内嵌式传感器206、pH内嵌式传感器208和温度内嵌式传感器210。此外，培养基调节容器200可以具有气体鼓泡管212、通气口214、混合器216、补充入口218和气体覆盖管220。

图7显示了培养基调节容器230，其为图6中培养基调节容器200的变体。培养基调节容器230包括气体鼓泡管231、补充入口238、培养基入口233、排气口234、混合器236、气体覆盖管239和转盘曝气器(spinning disk aerator)232。用过的培养基撞击正在旋转的盘232，并产生培养基的小液滴，这些小液滴在培养基调节容器230的覆盖部分中加氧。该转盘230可以在培养基混合器236或者在其自身的旋转轴上。

如上所述，用于灌注生物反应器系统的培养基调节在关于细胞剪切、传感和混合方面对其要求较少。正因如此，更有可能设计出超越传统直侧壁容器的容器，甚至可以提供额外的好处。因此，本公开的实施方式包括具有新的和独特的侧壁几何的容器，其使得能够在灌注系统中使用不同最小体积的培养基。此外，可以使用相同的培养基调节容器来适配更大范围的灌注系统，可以在不依赖于鼓泡(其可以在细胞培养基中造成不期望的起泡)的情况下实现更大的空气/培养基界面以增加表面处的气体交换。本公开的实施方式包括具有比传统直侧壁容器更大的调节比的培养基调节容器。"调节比"是指由给定部件(在此是培养基调节容器)可提供的容量范围。换言之，调节比是最大容量与最小容量的比率。较大的调节比允许用户将相同的培养基调节容器用于不同尺寸的灌注系统。

本公开的实施方式包括各种不同几何的培养基调节容器，各种不同几何可以允许这些培养基调节容器被用于不同的实施方案，并且由于其体积范围(即培养基调节容器的调节比)，一些培养基调节容器可用于更广泛的灌注床尺寸范围，并且可以用于增加覆盖界面(即气体/培养基界面)的表面积以改善气体交换。

图8A-8E显示了根据一些实施方式的培养基调节容器的各种几何。图8A显示了用于培养基调节容器的传统生物反应器容器的示例。培养基(或容器)的体积随着容器中培养基高度的增加而线性增加。其具有明显的缺点，即具有大的最小工作体积，并且气体/培养基界面的表面积不会随着培养基体积的增加而增加。尽管该缺点部分地被这样一个事实所抵消，即在小体积下，表面积与体积的比率可能足够大以使所谓的覆盖气体处理(overlaygassing)能够将气体溶解到培养基中。

图8B显示了如何可改变培养基调节容器的几何以减小最小工作体积，但随之而来的是总工作体积较小，并且表面积还是不会随着培养基量的增加而变大。在这种情况下，表面积与体积的比率非常小，并且在大大超过最小工作体积的情况下覆盖气体处理不会起效。

图8C是可以减少最小工作体积的同时保持容器的大的总工作体积的一个实施方式的实例。与图8A中的实例一样，表面积与体积的比率将允许对一定体积的培养基进行有效的覆盖气体处理。

图8D是使用锥形调节容器的实施方式的另一个实施例。由于底部的尺寸较小，实现了较低的最小工作体积，随着额外培养基的添加，表面积与体积的比率增加。这有两个好处，即具有更大的总工作体积，并允许增加表面积与体积的比率以在高达最大工作体积时一直保留覆盖气体处理的选项。

图8E显示了在某些情况下可能更实用的同时仍包含图8D的锥形的另一种几何。图8E的容器具有由顶部宽度W_t和顶部高度H_t限定的顶部部分，具有锥形高度H_c的锥形部分以及具有底部宽度W_b和底部高度H_b的底部部分。在锥形部分上方的具有垂直侧壁的顶部部分允许容器具有覆盖气体的顶部空间和更利于具有安装有探针和搅拌用搅拌器的顶板的几何。表1显示了根据顶部宽度W_t、顶部高度H_t、锥体高度H_c、底部宽度W_b、底部高度H_b以及最小工作体积和总工作体积定义的八种示例性培养基调节容器。

表1.各种培养基调节容器几何的最小工作体积和最大工作体积图9A和9B显示了根据一些实施方式的可以与灌注固定床一起使用的两种培养基调节容器构造。在一些实施方式的一个方面，灌注固定床可以通过增加填充床的高度和/或填充床堆叠体中的基材层的数量而缩放到不同的容量。图9A和9B中的不同垂直部分将与填充床中增加数量的细胞培养层一起使用。较大的顶部半径(或尺寸)提供了表面积的增加，以保持恒定的表面积与体积比，从而可以使用相同的气体处理方案，并且体积也增加以允许随着床尺寸的增加而产生的额外细胞数所需的额外培养基体积。应该注意的是，容器的截面可以是圆形、矩形或正方形以适配从容器底部到顶部的表面积与体积比。

在一些实施方式中，培养基调节系统还包括一个或多个传感器来感测外壳内的气体、或气体交换系统内的培养基、或在进入生物反应器之前、离开生物反应器之后或在生物反应器内时的培养基的性质。一个或多个传感器可以测量温度、pH、氧气(O₂)、CO₂或与正在进行的细胞培养操作相关的许多变量中的任何一个。

可以设想，本文公开的培养基调节容器和系统可以与具有固定床细胞培养基材的填充床的生物反应器一起使用。在传统的大规模细胞培养生物反应器中，已经使用了不同类型的填充床生物反应器。通常，这些填充床含有多孔基质以保留贴壁细胞或悬浮细胞，并支持生长和增殖。填充床基质提供了高的表面积与体积比，因此细胞密度可以高于其他系统。然而，填充床通常起到深度过滤器的作用，其中细胞被物理地捕获或陷入在基质的纤维中。因此，由于细胞接种物通过填充床的线性流动，细胞在填充床内受到不均匀分布，导致细胞密度随着填充床的深度或宽度而变化。例如，细胞密度在生物反应器的入口区域可以更高，而在更靠近生物反应器出口的地方明显更低。填充床内细胞的这种不均匀分布显著阻碍了这种生物反应器在生物工艺制造中的可扩展性和可预测性，甚至可能导致填充床单位表面积或体积的细胞生长或病毒载体生产效率降低。

在现有技术中公开的填充床生物反应器中遇到的另一个问题是通道效应(channeling effect)。由于填充的非织造纤维的随机性，在填充床的任何给定截面处的局部纤维密度都是不均匀的。培养基在具有低纤维密度(高床渗透性)的区域中快速流动，而在具有高纤维密度(较低床渗透性的区域)中要缓慢得多。由此产生的通过填充床的不均匀培养基灌注产生了通道效应，其表现为显著的营养和代谢物梯度，对整体细胞培养和生物反应器性能产生负面影响。位于低培养基灌注区域的细胞会挨饿，并且经常因缺乏营养或因代谢产物中毒而死亡。细胞收获是当使用填充有非织造纤维支架的生物反应器时会碰到的另一个问题。由于填充床具有深度过滤器的功能，在细胞培养过程结束时释放的细胞被截留在填充床内，细胞回收率非常低。这大大限制了这种生物反应器在以活细胞为产物的生物工艺中的利用。因此，不均匀性导致了不同程度暴露于流动和剪切的区域，事实上减少了可用的细胞培养面积，导致不均匀的培养，并干扰了转染效率和细胞释放。

为了解决现有细胞培养方案的这些和其他问题，本公开的实施方式提供了细胞生长基材、这种基材的基质和/或使用这种基材的填充床系统，其能够对锚固依赖性细胞进行高效和高产率的细胞培养并产生细胞产物(例如，蛋白质、抗体、病毒颗粒)。实施方式包括由有序和规则阵列的多孔基材材料制成的多孔细胞培养基质，其能够实现均匀的细胞接种和培养基/营养物灌注，以及高效的细胞收获。实施方式还能从工艺开发规模到全生产规模实现具有能够接种和生长细胞和/或收获细胞产物的基材和生物反应器的可缩放的细胞培养方案，而不牺牲实施方式的均匀性能。例如，在一些实施方式中，生物反应器可以很容易地从工艺开发规模扩展到产品规模，并且在整个生产规模中具有相当的每单位基材表面积的病毒基因组(VG/cm²)。本文实施方式的可收获性和可缩放性使得其能够用于有效的种子训练以在相同细胞基材上以多种规模生长细胞群体。此外，本文的实施方式提供了具有高表面积和所描述的其他特征的组合的细胞培养基质，使得能够实现高产率的细胞培养方案。在一些实施方式中，例如，本文所讨论的细胞培养基质和/或生物反应器每批可产生10¹⁶至10¹⁸个病毒基因组(VG)。

在一个实施方式中，提供了一种基质，其具有用于贴壁细胞附着和增殖的结构限定的表面区域，其具有良好的机械强度，并且当组装在填充床或其他生物反应器中时形成高度均匀的多个互连的流体网络。在具体的实施方式中，可以使用机械稳定的、不可降解的织造网作为支持贴壁细胞生产的基材。本文公开的细胞培养基质支持高体积密度形式的锚固依赖性细胞的附着和增殖。这种基质的均匀细胞接种以及生物反应器的细胞或其他产物的有效收获是可以实现的。此外，本公开的实施方式支持细胞培养以在接种步骤期间提供均匀的细胞分布，并在所公开的基质上实现汇聚(confluent)的单层或多层贴壁细胞，并且可以避免形成大的和/或不可控的3D细胞聚集体以及有限的营养物扩散和增加的代谢物浓度。因此，该基质消除了生物反应器操作过程中的扩散限制。此外，该基质使得能够从生物反应器中轻松有效地收获细胞。一个或多个实施方式的结构限定的基质使得能够从生物反应器的填充床中完全回收细胞以及一致的收获细胞。

根据一些实施方式，还提供了一种细胞培养方法，其使用具有基质的生物反应器来进行治疗性蛋白质、抗体、病毒疫苗或病毒载体的生物工艺生产。

与细胞培养生物反应器中使用的现有细胞培养基材(即，随机排序纤维的非织造基材)相反，本公开的实施方式包括具有限定和有序结构的细胞培养基材。限定和有序的结构允许一致的和可预测的细胞培养结果。此外，该基材具有开放的多孔结构，以防止细胞截留，并使得能够实现通过填充床的均匀流动。这种结构能够改善细胞接种、营养物质输送、细胞生长和细胞收获。根据一个或多个具体实施方式，基质由具有薄的片状构造的基材材料形成，该薄的片状结构具有由相对小的厚度分开的第一侧和第二侧，使得片材的厚度相对于基材的第一侧和第二边的宽度和/或长度是较小的。此外，穿过基材的厚度形成有多个孔或开口。开口之间的基材材料的尺寸和几何允许细胞粘附于基材材料的表面，就好像它是近似二维(2D)的表面一样，同时也允许足够的流体围绕基材材料流动并通过开口。在一些实施方式中，基材是基于聚合物的材料，并且可以形成为模制的聚合物片材；具有开口并且开口穿通厚度的聚合物片材；融合成网状层的多条细丝；3D打印的基材；或织造成网状层的多条细丝。基质的物理结构具有用于培养锚固依赖性细胞的高表面积体积比。根据多种实施方式，基质可以以本文讨论的一些方式布置或填充在生物反应器中，以实现均匀的细胞接种和生长、均匀的培养基灌注和有效的细胞收获。

本公开的实施方式可以实现实际大小的病毒载体平台，其可以每批大于约10¹⁴个病毒基因组、每批大于约10¹⁵个病毒基因组、每批大于约10¹⁶个病毒基因组、每批大于约10¹⁷个病毒基因组，或高达或大于每批约g 10¹⁶个病毒基因组的规模来生产病毒基因组。在一些实施方式中，每批生产约10¹⁵至约10¹⁸或更多的病毒基因组。例如，在一些实施方式中，病毒基因组产量可以是每批约10¹⁵至约10¹⁶个病毒基因组，或每批约10¹⁶至约10¹⁹个病毒基因组，或每批约10¹⁶至10¹⁸个病毒基因组，或每批约10¹⁷至约10¹⁹个病毒基因组，或每批约10¹⁸至约10¹⁹个病毒基因组，或每批约10¹⁸个或更多病毒基因组。

此外，本文公开的实施方式不仅能使细胞附着于细胞培养基质并生长，而且还能收获有活力的培养细胞。不能收获有活力的细胞是目前平台的一个重要缺陷，其导致难以建立和维持生产容量的足够数量的细胞。根据本公开的实施方式的一个方面，可从细胞培养基材中收获有活力的细胞，包括80％至100％有活力的，或约85％至约99％有活力的，或约90％至约99％有活力的细胞。例如，在收获的细胞中，至少80％是有活力的，至少85％是有活力的，至少90％是有活力的，至少91％是有活力的，至少92％是有活力的，至少93％是有活力的，至少94％是有活力的，至少95％是有活力的，至少96％是有活力的，至少97％是有活力的，或至少99％是有活力的。可以用例如胰蛋白酶、TrypLE或Accutase从细胞培养基材中释放出细胞。

细胞培养基材可以是由沿第一方向延伸的第一多条纤维和沿第二方向延伸的第二多条纤维制成的织造网层。基材的织造纤维形成多个开口，这些开口可以由一种或多种宽度或直径限定。开口的大小和形状可以根据织造的类型而变化(例如，纤丝的数量、形状和大小；相交纤丝之间的角度，等等)。从宏观上看，织造网可以被描述为二维的片材或层。然而，仔细检查织造网证明由于网的纤维相交的起伏而产生三维结构。在不希望受到理论约束的情况下，相信基材的三维结构是有利的，因为它为培养贴壁细胞提供了大的表面积，而且网的结构刚性可以提供使流体均匀流动的一致的、可预测的细胞培养基质结构。

在一个或多个实施方式中，纤维可以具有约50μm至约1000μm；约100μm至约750μm；约125μm至约600μm；约150μm至约500μm；约200μm至约400μm；约200μm至约300μm；或约150μm至约300μm的直径。在微观水平上，由于纤维与细胞相比的尺度(例如，纤维直径大于细胞)，单丝纤维的表面呈现为近似2D表面供贴壁细胞附着和增殖。纤维可以织造成具有约100μmx100μm至约1000μm x 1000μm的开口的网。在一些实施方式中，开口可以具有约50μm至约1000μm；约100μm至约750μm；约125μm至约600μm；约150μm至约500μm；约200μm至约400μm；或约200μm至约300μm的直径。纤丝直径和开口直径的这些范围是一些实施方式的示例，但并不旨在限制根据所有实施方式的网的可能特征尺寸。对纤维直径和开口直径的组合进行选择以在例如细胞培养基质包括多个相邻的网层(例如，各个层的堆叠或卷绕的网层)时提供通过基材的有效且均匀的流体流动。

纤维直径、开口直径和织造类型/图案等因素将决定可用于细胞附着和生长的表面积。此外，当细胞培养基质包括堆叠、卷或其他重叠基材的排布时，细胞培养基质的填充密度将影响填充床基质的表面积。填充密度可以随着基材材料的填充厚度(例如，基材层所需的空间)而变化。例如，如果细胞培养基质的堆叠具有一定的高度，则堆叠的每一层可以说具有通过将堆叠的总高度除以堆叠的层数来确定的填充厚度。填充厚度将根据纤维直径和织法而变化，但也可以根据堆叠中相邻层的排列而变化。例如，由于织造层的三维性质，相邻层可以基于其彼此的排列而包含一定量的互锁或重叠。在第一种排列中，相邻层可以紧密地依靠在一起，但在第二种排列中，相邻层可具有零重叠，例如当上层的最低点与下层的最高点直接接触时。对于一些应用来说，可能希望提供具有较低的层的填充密度(例如当更高的渗透性是优先项时)或较高的填充密度(例如当基材表面积最大化是优先项时)的细胞培养基质。根据一个或多个实施方式，填充厚度可以为约50μm至约1000μm；约100μm至约750μm；约125μm至约600μm；约150μm至约500μm；约200μm至约400μm；约200μm至约300μm。

上述结构因素可以决定细胞培养基质的表面积，无论是单层细胞培养基材还是具有多层基材的细胞培养基质)。例如，在具体的实施方式中，具有圆形形状和6cm直径的单层织造网基材可以具有约68cm²的有效表面积。本文所用的“有效表面积”是指可用于细胞附着和生长的一部分基材中纤维的总表面积。除非另有说明，否则“表面积”指的是该有效表面积。根据一个或多个实施方式，具有6cm直径的单个织造网基材层可以具有约50cm²至约90cm²；约53cm²至约81cm²；约68cm²；约75cm²；或约81cm²的有效表面积。这些有效表面积范围仅作为示例提供，并且一些实施方式可以具有不同的有效表面积。细胞培养基质也可以根据孔隙率来表征，如本文的实施例中所讨论的。

基材网可以由在细胞培养应用中相容的聚合物材料的单纤丝或多纤丝纤维制成，聚合物材料包括例如聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚环氧乙烷、聚吡咯和聚环氧丙烷。网基材可以具有不同的图案或织法，包括例如针织、经针织或织造(例如平纹编织、斜纹编织、密纹编织、五针编织(five needleweave))。

可能需要对网纤丝的表面化学进行改性以提供所需的细胞粘附特性。这种改性可以通过对网的聚合物材料进行化学处理或通过将细胞粘附性分子接枝到纤丝表面来进行。或者，网可以涂覆具有细胞粘附特性的生物相容性水凝胶的薄层，包括，例如胶原或或者，通过使用具有行业已知的各种类型的等离子体、工艺气体和/或化学品的处理工艺，可以使网的纤丝纤维的表面具有细胞粘附性。然而，在一个或多个实施方式中，网能够在没有表面处理的情况下提供有效的细胞生长表面。

图1的系统50包括容纳本文公开的一个或多个实施方式的细胞培养基质的生物反应器13。如上所述，生物反应器13可以流体连接到培养基调节容器100，并且该系统能够将调节容器100内的细胞培养基供应到生物反应器13。培养基调节容器100可以包括在生物工艺产业中使用的典型生物反应器中见到的传感器和控制部件，以用于悬浮批料、馈送批料或灌注培养。这些传感器和控制部件包括但不限于DO氧传感器、pH传感器、加氧器/气体鼓泡单元、温度探针以及营养物添加端口和碱添加端口。供应到鼓泡单元的气体混合物可以由N₂、O₂和CO₂气体的气流控制器控制。培养基调节容器100还可以包含用于混合培养基的泵或叶轮。以上列出的传感器测量的所有培养基参数可以由与培养基调节容器100连通的培养基调节控制单元控制，并且能够测量和/或将细胞培养基的条件调节到所需水平。如图1所示，培养基调节容器100是作为与生物反应器容器13分离的容器提供的。其优势在于能够将调节培养基的地方与细胞培养的地方分开，然后将调节后的培养基供应到细胞培养的空间。

来自培养基调节容器100的培养基通过连接器或管道104输送到生物反应器13，该连接器或管道还可以包括用于细胞接种物的接种并开始培养细胞的注射端口。生物反应器容器13还可以包括通向另一个连接器或管道105的一个或多个出口，细胞培养基通过该连接器或管道离开容器13。为了分析来自生物反应器13的流出物的内容，可以在管线中提供一个或多个传感器。在一些实施方式中，系统50包括用于控制流入和/或流出生物反应器13和/或培养基调节系统100的流量的流量控制单元。例如，流量控制单元可以接收来自一个或多个传感器(例如O₂传感器)的信号，并且基于该信号，通过向生物反应器13的入口上游的泵(例如蠕动泵)发送信号来调节进入生物反应器13的流量。因此，基于传感器测量的一个或多个因素的组合，泵可以控制进入生物反应器13的流量，以获得所需的细胞培养条件。

培养基灌注速率由信号处理单元控制，该信号处理单元收集并比较来自培养基调节系统100的传感器信号和例如位于生物反应器13的出口内或出口处的传感器信号。由于通过填充床生物反应器的培养基灌注的填充流性质，沿着填充床形成了营养物、pH和氧气梯度。生物反应器的灌注流速可以由可操作地连接到蠕动泵的流量控制单元自动控制。

示例性实施方案

以下是对本公开的主题的实施方案的各个方面的描述。每个方面可以包括所公开的主题的各种特征、特性或优点中的一种或多种。实施方案旨在例示所公开的主题的几个方面，并且不应被认为是对所有可能的实施方案的全面或详尽的描述。

方面1涉及一种用于灌注生物反应器系统的培养基调节容器，该培养基调节容器包括：容器，该容器包括被构造成容纳液体细胞培养基体积的内腔；培养基入口，其被构造为将细胞培养基从灌注生物反应器返回到容器；以及培养基出口，其被构造为将细胞培养基从容器转移到灌注生物反应器，其中培养基入口和培养基出口中的至少一个包括一个或多个被构造为测量或检测细胞培养基的特征的内嵌式传感器。

方面2涉及如方面1所述的培养基调节容器，其中，所述一个或多个内嵌式传感器包括溶解氧传感器、pH传感器和温度传感器中的至少一种。

方面3涉及如方面1或方面2所述的培养基调节容器，其还包括被构造为在内腔中鼓出气体的气体鼓泡管。

方面4涉及如方面1-3中任一方面所述的培养基调节容器，其还包括灌注回路，所述灌注回路包括泵，所述泵被构造为将细胞培养基从培养基出口泵送到培养基返回器，所述培养基返回器将细胞培养基返回到内腔。

方面5涉及如方面4所述的培养基调节容器，其中所述一个或多个内嵌式传感器被成列地设置在灌注回路中。

方面6涉及如方面4或方面5所述的培养基调节容器，其还包括被构造为向灌注生物反应器供应培养基的供应管，所述供应管被设置在培养基出口和灌注回路中的一个或多个内嵌式传感器之间。

方面7涉及如前述方面中任一方面所述的培养基调节容器，其还包括附接到培养基调节容器的侧壁或底部的一个或多个贴片传感器。

方面8涉及如方面7所述的培养基调节容器，其中，所述一个或多个贴片传感器包括溶解氧传感器、pH传感器和温度传感器中的至少一种。

方面9涉及如方面1-8中任一方面所述的培养基调节容器，其还包括设置在内腔内的外鼓泡管，其中所述培养基入口包括在内腔内的管道，所述管道至少部分地设置在外鼓泡管内，并且其中气体入口至少部分地设置在外鼓泡管内。

方面10涉及如方面9所述的培养基调节容器，其中，所述外鼓泡管包括侧壁，所述侧壁包括多个开口，所述多个开口的尺寸被设置为防止气泡从外鼓泡管内穿过所述多个开口。

方面11涉及一种用于灌注生物反应器系统的培养基调节容器，该培养基调节容器包括：容器，其包括用于容纳一定体积的液体细胞培养基的内腔；培养基入口，其被构造为将细胞培养基从灌注生物反应器返回到容器；培养基出口，其被构造为使细胞培养基离开容器并转移到灌注生物反应器；和一个或多个贴片传感器，其被附接到培养基调节容器的侧壁或底部的至少一个并被构造为测量或检测细胞培养基的特征。

方面12涉及如方面11所述的培养基调节容器，其中，所述一个或多个贴片传感器包括溶解氧传感器、pH传感器和温度传感器中的至少一种。

方面13涉及如方面11或方面12所述的培养基调节容器，其还包括被构造为在内腔中鼓出气体的气体鼓泡管。

方面14涉及如方面11-13中任一方面所述的培养基调节容器，其中所述培养基入口和培养基出口中的至少一个包括被构造为测量或检测细胞培养基的特征的一个或多个内嵌式传感器。

方面15涉及如方面14所述的培养基调节容器，其中，所述一个或多个内嵌式传感器包括溶解氧传感器、pH传感器和温度传感器中的至少一种。

方面16涉及如方面11-15中任一方面所述的培养基调节容器，其还包括灌注回路，所述灌注回路包括泵，所述泵被构造为将细胞培养基从培养基出口泵送到培养基返回器，所述培养基返回器将细胞培养基返回到内腔。

方面17涉及如方面16所述的培养基调节容器，其中所述一个或多个内嵌式传感器被成列地设置在灌注回路中。

方面18涉及如方面16或方面17所述的培养基调节容器，其还包括被构造为向灌注生物反应器供应培养基的供应管，所述供应管被设置在培养基出口和灌注回路中的一个或多个内嵌式传感器之间。

方面19涉及如方面11-18中任一方面所述的培养基调节容器，其还包括设置在内腔内的外鼓泡管，其中所述培养基入口包括在内腔内的管道，所述管道至少部分地设置在外鼓泡管内，并且其中气体入口至少部分地设置在外鼓泡管内。

方面20涉及如方面19所述的培养基调节容器，其中，所述外鼓泡管包括侧壁，所述侧壁包括多个开口，所述多个开口的尺寸被设置为防止气泡从外鼓泡管内穿过所述多个开口。

方面21涉及一种细胞培养系统，其包括：生物反应器，所述生物反应器包括第一容器，所述第一容器被构造成包含用于基于贴壁的细胞的细胞培养基材；和被构造为调节细胞培养基的第二容器，所述第二容器通过一个或多个流体流动连接器与第一容器保持流体连通，其中第二容器被构造为对其中包含的细胞培养基进行覆盖气体处理，并且第二容器包括适合于根据生物反应器和细胞培养基材的尺寸来调节不同体积的细胞培养基的几何。

方面22涉及如方面21所述的细胞培养系统，其进一步包括被构造为测量或检测细胞培养基的特征的一个或多个传感器。

方面23涉及如方面22所述的细胞培养系统，其中一个或多个传感器是设置在流体入口或流体出口中的内嵌式传感器，其中细胞培养基通过所述流体入口进入第二容器，细胞培养基通过所述流体出口流出第二容器。

方面24涉及如方面22或方面23所述的细胞培养系统，其中一个或多个传感器包括附接到第二容器的侧壁和底部中的至少一处的贴片传感器。

方面25涉及如方面22-24中任一方面所述的细胞培养系统，其进一步包括连接到第二容器并被构造为向第二容器供应气体和细胞营养物中的至少一种的气体入口和细胞营养物入口中的至少一个。

方面26涉及如方面25所述的细胞培养系统，其进一步包括通过气体入口连接到第二容器的气体供应和通过细胞营养物入口连接到第二容器的细胞营养物供应中的至少一种。

方面27涉及如方面21-26中任一方面所述的细胞培养系统，其中第一容器和第二容器被布置在灌注回路中，灌注回路包括被构造为将细胞培养基从第二容器输送到第一容器的新鲜培养基供应线，以及被构造为将细胞培养基从第一容器输送到第二容器的废培养基供应线。

方面28涉及如方面21-27中任一方面所述的细胞培养系统，其中第二容器包括被构造为容纳细胞培养基的内腔，内腔包括内腔的第一部分的第一直径和内腔的第二部分的第二直径，第二直径大于第一直径。

方面29涉及如方面28所述的细胞培养系统，其中所述第一部分在内腔中比第二部分低，使得需先用流体填充第二部分，再可用流体填充第二部分。

方面30如涉及方面28或方面29所述的细胞培养系统，其中所述内腔包括倒锥形部分。

方面31涉及方面28-30中任一方面所述的细胞培养系统，其中所述第一部分包括具有垂直侧壁的恒定直径，第二部分包括具有倾斜侧壁的可变直径。

方面32涉及如方面31所述的细胞培养系统，其中所述内腔进一步包括具有第三直径的第三部分，所述第三直径等于或大于第二部分的最宽直径，并且第二部分被置于第一部分和第三部分之间。

方面33涉及如方面32所述的细胞培养系统，其中所述第一部分包括垂直侧壁和恒定的第一直径，第二部分包括具有从第一直径增加到第二直径的变化直径的倾斜侧壁，以及第三部分包括垂直侧壁。

方面34涉及如方面28-30中任一方面所述的细胞培养系统，其中所述第一部分包括具有垂直侧壁的恒定的第一直径，第二部分包括具有垂直侧壁的恒定的第二直径。

方面35涉及如方面34所述的细胞培养系统，其中所述内腔进一步包括具有大于第二直径的第三直径的第三部分。

方面36涉及如方面28-35中任一方面所述的细胞培养系统，其中所述内腔包括约0.3L至约35L的工作体积。

定义

“完全合成”或“全合成”是指完全由合成源材料组成且不含任何源自动物或动物源性材料的细胞培养制品，例如微载体或培养容器表面。所公开的全合成细胞培养制品消除了异种污染的风险。

"包括"、"包含"或类似术语意为包括但不限于，即，内含而非排他。

"用户"是指使用本文公开的系统、方法、制品或试剂盒的人，并包括正在培养细胞来收获细胞或细胞产物的人，或正在使用根据本文实施方式培养和/或收获的细胞或细胞产物的人。

在描述本公开的实施方式中所使用的修饰例如组合物中成分的量、浓度、体积、工艺温度、工艺时间、产量、流率、压力、粘度等数值及其范围，或者部件尺寸等数值及其范围的"约"是指数量的变化，可发生在例如：用于制备材料、组合物、复合物、浓缩物、部件零件、制造制品或应用制剂的典型测定和处理步骤中；这些程序中的无意误差；用来实施所述方法的起始材料或成分的制造、来源、或纯度方面的差异中；以及类似的考虑因素中。术语"约"还包括由于组合物或制剂的老化而与特定的初始浓度或混合物不同的量，以及由于混合或加工组合物或制剂而与特定的初始浓度或混合物不同的量。

"任选的"或"任选地"意为随后描述的事件或情形可能发生，也可能不发生，而且该描述包括事件或情形发生的情况和事件或情形不发生的情况。

除非另外说明，否则，本文所用的不定冠词"一个"或"一种"及其对应的定冠词"该(所述)"表示至少一(个/种)，或者一(个/种)或多(个/种)。

可采用本领域普通技术人员熟知的缩写(例如，表示小时的"h"或"hrs"；表示克的"g"或"gm"；表示毫升的"mL"；表示室温的"rt"；表示纳米的"nm"以及类似缩写)。

在组分、成分、添加剂、尺寸、条件和类似方面公开的具体和优选的数值及其范围仅用于说明；它们不排除其他限定数值或限定范围内的其他数值。本公开的系统、试剂盒和方法可包括本文所述的任何数值或者各数值、具体数值、更具体的数值和优选数值的任何组合，包括明确或隐含公开的中间数值和中间范围。

除非另有明确说明，否则本文所述的任何方法都不应被解释为要求以特定顺序执行其步骤。因此，如果方法权利要求实际上没有陈述其步骤所遵循的顺序，或者在权利要求书或说明书中没有以任何其他方式具体表示步骤限于特定的顺序，则绝不旨在暗示任何特定顺序。

对本领域的技术人员而言，显而易见的是可以进行各种修改和变动而不偏离公开的实施方式的精神或范围。因为本领域技术人员可以结合实施方式的精神和实质，对所公开的实施方式进行各种改良、组合、子项组合和变化，因此，应认为本公开的实施方式包括所附权利要求书范围内的全部内容及其等同内容。

Claims (20)

1.一种用于灌注生物反应器系统的培养基调节容器，所述培养基调节容器包括：

容器，其包括被构造为容纳液体细胞培养基体积的内腔；

培养基入口，其被构造为将细胞培养基从灌注生物反应器返回到容器；和

培养基出口，其被构造为使细胞培养基离开容器并转移到灌注生物反应器，

其中所述培养基入口和培养基出口中的至少一个包括被构造为测量或检测细胞培养基的特征的一个或多个内嵌式传感器。

2.如权利要求1所述的培养基调节容器，其中，所述一个或多个内嵌式传感器包括溶解氧传感器、pH传感器和温度传感器中的至少一种。

3.如权利要求1或权利要求2所述的培养基调节容器，其还包括被构造为在所述内腔中鼓出气体的气体鼓泡管。

4.如权利要求1-3中任一项所述的培养基调节容器，其还包括灌注回路，所述灌注回路包括泵，所述泵被构造为将细胞培养基从培养基出口泵送到培养基返回器，所述培养基返回器将细胞培养基返回到内腔。

5.如权利要求4所述的培养基调节容器，其中所述一个或多个内嵌式传感器被成列地设置在灌注回路中。

6.如权利要求4或权利要求5所述的培养基调节容器，其还包括被构造为向灌注生物反应器供应培养基的供应管，所述供应管被设置在培养基出口和灌注回路中的一个或多个内嵌式传感器之间。

7.如前述权利要求中任一项所述的培养基调节容器，其还包括附接到培养基调节容器的侧壁或底部的一个或多个贴片传感器。

8.如权利要求7所述的培养基调节容器，其中，所述一个或多个贴片传感器包括溶解氧传感器、pH传感器和温度传感器中的至少一种。

9.如权利要求1-8中任一项所述的培养基调节容器，其还包括设置在内腔内的外鼓泡管，

其中所述培养基入口包括在内腔内的管道，所述管道至少部分地设置在外鼓泡管内，并且

其中气体入口至少部分地设置在外鼓泡管内。

10.如权利要求9所述的培养基调节容器，其中，所述外鼓泡管包括侧壁，所述侧壁包括多个开口，所述多个开口的尺寸被设置为防止气泡从外鼓泡管内穿过所述多个开口。

11.一种用于灌注生物反应器系统的培养基调节容器，所述培养基调节容器包括：

容器，其包括被构造为容纳液体细胞培养基体积的内腔；

培养基入口，其被构造为将细胞培养基从灌注生物反应器返回到容器；

培养基出口，其被构造为使细胞培养基离开所述容器并转移到灌注生物反应器；和

一个或多个贴片传感器，所述贴片传感器附接到培养基调节容器的侧壁或底部中的至少一个并且被构造为测量或检测细胞培养基的特征。

12.如权利要求11所述的培养基调节容器，其中，所述一个或多个贴片传感器包括溶解氧传感器、pH传感器和温度传感器中的至少一种。

13.如权利要求11或权利要求12所述的培养基调节容器，其还包括被构造为在内腔中鼓出气体的气体鼓泡管。

14.如权利要求11-13中任一项所述的培养基调节容器，其中所述培养基入口和培养基出口中的至少一个包括被构造为测量或检测细胞培养基的特征的一个或多个内嵌式传感器。

15.如权利要求14所述的培养基调节容器，其中，所述一个或多个内嵌式传感器包括溶解氧传感器、pH传感器和温度传感器中的至少一种。

16.如权利要求11-15中任一项所述的培养基调节容器，其还包括灌注回路，所述灌注回路包括泵，所述泵被构造为将细胞培养基从培养基出口泵送到培养基返回器，所述培养基返回器将细胞培养基返回到内腔。

17.如权利要求16所述的培养基调节容器，其中所述一个或多个内嵌式传感器成列地设置在灌注回路中。

18.如权利要求16或权利要求17所述的培养基调节容器，其还包括被构造为向灌注生物反应器供应培养基的供应管，所述供应管被设置在培养基出口和灌注回路中的一个或多个内嵌式传感器之间。

19.如权利要求11-18中任一项所述的培养基调节容器，其还包括设置在内腔内的外鼓泡管，

其中所述培养基入口包括在所述内腔内的管道，所述管道至少部分地设置在外鼓泡管内，并且

其中气体入口至少部分地设置在外鼓泡管内。

20.如权利要求19所述的培养基调节容器，其中，所述外鼓泡管包括侧壁，所述侧壁包括多个开口，所述多个开口的尺寸被设置为防止气泡从外鼓泡管内穿过所述多个开口。