CN117561324A - 用于细胞培养和收获的固定床生物反应器及其相关方法 - Google Patents

Abstract

提供了一种固定床生物反应器系统(300)，其包括容器，所述容器具有培养基进口(310)、培养基出口(312)，以及设置在培养基进口与培养基出口之间并且与培养基进口和培养基出口流体连通的内部腔室；细胞培养基材，所述细胞培养基材在内部腔室中以填充床构造设置在培养基进口与培养基出口之间，所述细胞培养基材包括以堆叠布置的多个多孔盘片(308)；以及用于容纳流体的收获空间(2010,2020)，所述收获空间与所述内部腔室流体连通，其中所述多个多孔盘片中的每一个盘片包括被构造成在其上培养细胞的表面。所述收获空间可以在容器内部或外部。

Description

用于细胞培养和收获的固定床生物反应器及其相关方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119要求于2021年5月3日提交的系列号为63/183,386的美国临时申请的优先权权益，本申请以该申请的内容为基础，并且通过引用的方式全文纳入本文。

技术领域

本公开总体涉及用于培养细胞的设备、系统和方法。具体地，本公开涉及细胞培养基材，包含这种基材的固定床生物反应器容器和系统，以及使用这种基材和生物反应器来培养细胞的方法。

背景技术

在生物加工产业中，为了激素、酶、抗体、疫苗的生产以及细胞疗法，进行大规模的细胞培养。生物加工中使用的大部分细胞是锚定依赖性的，这意味着细胞需要粘附到表面上才能生长和发挥功能。传统上，贴壁细胞的培养是在二维(2D)细胞贴壁表面上进行的，这些表面被包括在多种容器形式中的一种中，这些容器形式例如T形瓶、皮氏培养皿、细胞工厂、细胞堆叠容器、滚瓶和容器。这些方式可能具有显著的缺点，包括难以达到足够高的细胞密度以使其适用于大规模生产细胞或疗法。

已经提出了替代性方法来增加所培养的细胞的体积密度。这些方法包括在搅拌罐中进行的微载体培养。在这种方式中，附着在微载体表面的细胞受到恒定的剪切应力，从而对增殖和培养性能产生显著影响。高密度细胞培养系统的另一个例子是中空纤维生物反应器，在该生物反应器中，当细胞在纤维间隙空间中增殖时，可以形成大型三维聚集体。然而，缺乏营养物质会显著抑制细胞得生长和性能。为了缓解这一问题，这些生物反应器被造得较小，而不适于大规模制造。

用于锚定依赖性细胞的高密度培养系统的另一个例子是填充床生物反应器系统。例如，包括用于截留细胞的载体或基质系统的填充床的填充床生物反应器系统先前已经公开于第4,833,083号；第5,501,971号和第5,510,262号美国专利中。填充床基质通常由作为基材的多孔颗粒或者聚合物的非织造微纤维制成。这种生物反应器起到再循环流通生物反应器的作用。这种生物反应器的重大问题之一是填充床中的细胞分布不均匀。例如，填充床起到深度过滤器的作用，并且细胞主要被截留在进口区域处，导致在接种步骤期间产生细胞分布梯度。此外，由于纤维填充的随机性，填充床截面的流动阻力和细胞滞留效率不均匀。例如，培养基快速流过细胞堆积密度低的区域，而缓慢流过因为被滞留的细胞数目较高而导致阻力较高的区域。这产生了通道效应，其中营养物和氧气更有效地输送到细胞体积密度较低的区域，而细胞密度较高的区域则被保持在次优培养条件下。现有技术中公开的填充床系统的另一个显著缺点是不能够在培养过程结束时有效地收获完整的活细胞。第9,273,278号美国专利公开了一种生物反应器设计，用于在细胞收获步骤期间提高从填充床回收细胞的效率。该生物反应器设计是基于使填充床基质疏松并且搅动或搅拌填充床颗粒，以使多孔基质碰撞并因此使细胞脱离。然而，该方法是费力的，并且可能造成显著的细胞损伤，因此降低整体细胞活力。

滚瓶有几个优点，例如易于处理，以及能够监测附着表面上的细胞。然而，从生产的角度来看，主要缺点是表面积与体积之比低，同时滚瓶构造占据了大面积的制造占地空间。已经使用各种方法在滚瓶形式中增加贴壁细胞可用的表面积。一些解决方案已在市售产品中实施，但仍有改进空间以进一步提高滚瓶生产率。传统上，滚瓶是通过吹塑工艺作为单一结构生产的。这种制造简单性使滚瓶在生物加工行业中具有经济可行性。可以在不改变制造工艺的情况下，可以实现一些滚瓶改进以增加细胞培养的可用表面积，但是仅获得了改进的滚瓶表面积的边际增加。滚瓶设计的其他改变显著增加了制造工艺的复杂性，使其在生物加工业中失去了经济可行性。因此需要提供具有增加的表面积和生物加工生产力的滚瓶，同时使用相同的吹塑工艺进行制造。

虽然利用现有平台可以制造用于早期临床试验的病毒载体，但需要一种能够生产更多高质量产品的平台，以达到后期商业制造规模。

需要细胞培养基质、填充床生物反应器容器和生物反应器系统以及方法，以实现高密度形式培养细胞，并且具有均匀的细胞分布，以及容易获得且收获产率增加，以及收获活细胞。此外，需要这些基质、容器、系统和方法能够实现可缩放的解决方案，以实现可调整的生产水平，从而适应不同规模下的各种使用情况的需要，例如，从研究到工艺开发到制造规模。

发明内容

根据本公开的一个实施方式，提供了一种固定床生物反应器系统。所述生物反应器系统包括：容器，所述容器具有培养基进口、培养基出口，以及设置在培养基进口与培养基出口之间并且与培养基进口和培养基出口流体连通的内部腔室。所述生物反应器系统还包括细胞培养基材，所述细胞培养基材以填充床构造位于培养基进口与培养基出口之间的内部腔室中，其中，细胞培养基材包括呈堆叠布置的多个多孔盘片。所述多孔盘片中的每个多孔盘片都具有在其上培养细胞的表面。内部腔室包括细胞培养区和间隔件区，其中，细胞培养基材限定了细胞培养区，间隔件区被设置在细胞培养区与培养基出口之间。

一个或多个实施方式的方面还包括间隔件，其在内部腔室中被设置在细胞培养基材与培养基出口之间并且在细胞培养基材与培养基出口之间限定了间隔件区。间隔件使细胞培养基材与培养基出口间隔一定的距离并且将细胞培养基材限制于内部腔室的细胞培养区。间隔件可包括在平行于间隔件区的长度的方向上延伸的多个间隔件构件。作为一些实施方式的另一方面，在细胞培养基材与间隔件之间可设置填充床保持器(retainer)，并且填充床保持器向细胞培养基材的顶部提供结构支撑。填充床保持器可以是多孔的、基本刚性的，并且可以在内部腔室的大部分宽度上延伸。

在一个或多个实施方式的另外的方面中，所述多个多孔盘片中的每个多孔盘片具有第一侧，与第一侧相对的第二侧，将第一侧和第二侧分开的盘片厚度，以及形成于盘片中并且穿过盘片厚度的多个开口。所述多个开口被布置成允许细胞培养基、细胞或者细胞副产物中的至少一种流动通过细胞培养基材。

所述系统还可包括设置在培养基进口与细胞培养区之间的进口分配板。所述进口分配板可将从培养基进口进入内部腔室的流体分配在细胞培养基材的区域上。所述系统还可包括设置在间隔件区与培养基出口之间的出口分配板。

作为一个或多个实施方式的一方面，上述生物反应器系统还包括设置在细胞培养基材与间隔件区之间的填充床保持器，所述填充床保持器被构造成向细胞培养基材的顶部提供结构支撑。填充床保持器可以是多孔的、基本刚性的，并且可以在内部腔室的大部分宽度上延伸。所述系统还可包括间隔件，间隔件在内部腔室中被设置在填充床保持器与培养基出口之间，并且在填充床保持器与培养基出口之间限定了间隔件区。间隔件使细胞培养基材与培养基出口间隔一定的距离，并且将细胞培养基材限制于内部腔室的细胞培养区。填充床保持器例如可以是刚性栅格结构。

作为一个或多个实施方式的附加方面，间隔件具有可调节的长度，并且可调节以在细胞培养区与培养基出口之间维持各种预定距离，由此，可容纳在细胞培养区中的细胞培养基材中的多孔盘片的数目可变化。

在一个或多个实施方式的另一方面中，所述系统包括多个不同长度的可拆卸的间隔件，该多个可拆卸的间隔件中的每个间隔件能够被放置在间隔件区中，以在细胞培养区与培养基出口之间维持预定的距离，该距离与其他各个间隔件所维持的距离不同，由此，可基于设置在间隔件区中的间隔件的长度来改变细胞培养区中可容纳的细胞培养基材中的多孔盘片的数目。

在一些实施方式的一个方面中，所述系统还包括设置在细胞培养基材与培养基进口之间的至少一个多孔间隔件盘片。所述至少一个多孔间隔件盘片可包括间隔件盘片孔直径，并且所述多个多孔盘片中的每个多孔盘片可具有盘片孔直径，使得间隔件盘片孔直径大于盘片孔直径。所述至少一个多孔间隔件盘片可包括具有第一间隔件盘片孔直径的第一盘片和具有第二间隔件盘片孔直径的第二盘片，其中，第一间隔件盘片孔直径不同于第二间隔件盘片孔直径。

作为一些实施方式的一个方面，所述多个多孔盘片包括多个织造网层。所述多个织造网层中的每一层具有限定的、基本均匀的孔阵列。所述多个织造网层中的每一层包括多个交织纤维，所述多个交织纤维包括在第一方向上彼此平行延伸的第一组纤维，以及在第二方向上彼此平行延伸的第二组纤维。第一方向可以基本上垂直于第二方向。在一些实施方式中，网的多个交织纤维由第一组纤维和第二组纤维组成。

作为一个或多个实施方式的一个方面，培养基进口被构造成在细胞培养之前或期间，向内部腔室供应细胞和细胞培养基中的至少一种，并且培养基出口被构造成在细胞培养期间或之后，从内部腔室收回细胞、细胞培养基和细胞副产物中的至少一种。培养基出口被构造成在收获操作期间，向间隔件区供应加压流体，并且培养基进口被构造成在收获操作期间，从内部腔室收回细胞、细胞培养基和细胞副产物中的至少一种。所述生物反应器系统被构造成用加压流体经由培养基出口填充内部腔室，从而迫使细胞、细胞培养基和细胞副产物中的至少一种通过培养基进口排出。

一个或多个实施方式的方面包括50至1000个多孔盘片、或者100至500个多孔盘片的所述多个多孔盘片。所述多个多孔盘片可将细胞培养到约1.00×10⁷个细胞/盘片至约2.00×10⁷个细胞/盘片的平均密度。所述多个多孔盘片中的每个盘片可具有纤维，在纤维之间限定了孔，其中，所述纤维具有约50μm至约1000μm的直径，并且所述孔具有约100μm至约1000μm的直径。

附图简要说明

图1A示出了根据本公开的一个或多个实施方式的细胞培养基材的三维模型的透视图。

图1B是图1A的基材的二维平面图。

图1C是图1B中的基材沿着线A-A的截面图。

图2A是根据一些实施方式的具有第一几何结构的示例性细胞培养基材的照片。

图2B是根据一些实施方式的具有第二几何结构的示例性细胞培养基材的照片。

图2C是根据一些实施方式的具有第三几何结构的示例性细胞培养基材的照片。

图3A是根据一个或多个实施方式的多层细胞培养基材的透视图。

图3B是图3A的多层细胞培养基材的平面图。

图4是根据一个或多个实施方式的图3B的多层细胞培养基材沿着线B-B的截面图。

图5是根据一个或多个实施方式的图4的多层细胞培养基材沿着线C-C的截面图。

图6是根据一个或多个实施方式的具有多层细胞培养基质的填充床细胞培养系统的示意图。

图7A是根据一个或多个实施方式的填充床细胞培养系统的截面图。

图7B是根据一个或多个其他实施方式的填充床细胞培养系统的截面图。

图8是根据一个或多个实施方式的生物反应器容器的示例性部件的照片。

图9A是根据一个或多个实施方式的图7A-8的细胞培养系统的流率分配板的平面图。

图9B是根据一个或多个实施方式的图7A-8的细胞培养系统的填充床保持器栅格的平面图。

图10是根据一个或多个实施方式的图7A-8的细胞培养系统的间隔件的透视图。

图11A是根据一个或多个实施方式的细胞培养系统的截面图，该细胞培养系统包括具有第一高度的间隔件以及第一高度或厚度的细胞培养基质。

图11B是根据一个或多个实施方式的细胞培养系统的截面图，该细胞培养系统包括具有第二高度的间隔件以及第二高度或厚度的细胞培养基质。

图11C是根据一个或多个实施方式的细胞培养系统的截面图，该细胞培养系统包括具有第三高度的间隔件以及第三高度或厚度的细胞培养基质。

图12是根据一个或多个实施方式的包括填充床细胞培养系统的生物工艺系统的示意图。

图13根据一个或多个实施方式，显示了细胞收获过程的三个阶段的填充床细胞培养系统的截面图。

图14A是根据一个或多个实施方式的在细胞培养系统上培养细胞的工艺流程图。

图14B是根据一个或多个实施方式的用于控制细胞培养系统的灌注流率的操作的流程图。

图15A是根据一个或多个实施方式的在细胞培养基材上的染色的HEK293T细胞的显微照片，其中，细胞以第一细胞接种密度接种。

图15B是根据一个或多个实施方式的在细胞培养基材上的染色的HEK293T细胞的显微照片，其中，细胞以第二细胞接种密度接种。

图15C是根据一个或多个实施方式的在细胞培养基材上的染色的HEK293T细胞的显微照片，其中，细胞以第三细胞接种密度接种。

图16A是根据一个或多个实施方式的，在填充床生物反应器中进行细胞培养后，但是尚未在细胞培养基材上进行细胞收获操作的，带有染色细胞的细胞培养基质的盘片的照片。

图16B是根据一个或多个实施方式的，在填充床生物反应器中进行细胞培养后并且在细胞培养基材上进行细胞收获操作后的，带有染色细胞的细胞培养基质的盘片的照片。

图17A是示出了根据本公开实施方式的两个实施例所收获的总细胞与使用培养的细胞相比的实验结果的条形图。

图17B是示出了根据本公开实施方式的两个实施例的每个容器的总基因组拷贝数与使用培养的细胞相比的实验结果的条形图。

图17C是示出了根据本公开实施方式的两个实施例的单位表面积的基因组拷贝数的与使用培养的细胞相比的实验结果的条形图。

图18A是根据一个或多个实施方式的具有销区(pin field)的生物反应器容器的示意性的截面图。

图18B是根据一个或多个实施方式的图18A的一部分的局部截面特写图。

图19A是根据一个或多个实施方式的生物反应器容器的示意图，该生物反应器具有在同一容器内的细胞培养区和收获空间。

图19B是根据一个或多个实施方式的生物反应器容器的示意图，该生物反应器具有细胞培养区和外部收获空间。

图20显示了根据一个或多个实施方式，从生物反应器的顶部、中间和底部收获的细胞，以及平均收获计数。

图21显示了根据一个或多个实施方式，在多个示例运行和生物反应器尺寸上的一致的AAV2-GFP载体产率/cm²。

图22显示了与其他平台相比，根据本公开的实施方式A的AAV2-GFP VG产率/cm²的示例。

图23显示了与其他平台相比，根据本公开的实施方式A的AAV2-GFP VG产率/容器的示例。

图24A显示了根据本公开的一个实施方式，使用FBS/DMEM培养基在生物反应器中的AAV2-GFP病毒载体生产。

图24B显示了根据本公开的一个实施方式，使用FBS/DMEM培养基在生物反应器中的AAV2-GFP病毒载体生产，其中FBS/DMEM培养基用于HEK293T生长阶段，无血清DMEM培养基用于转染和生产阶段。

图25显示了根据本公开的实施方式，对于不同表面积尺寸的细胞培养基，各容器的总体VG的示例。

图26是根据一个或多个实施方式的细胞培养系统的具体示意图。

具体实施方式

下面参考附图(若有)对本公开的各个实施方式进行详细描述。对各个实施方式的引用并不限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求的范围限制。此外，在本说明书中列出的任何示例都不是限制性的，而仅列出了要求保护的本发明的诸多可能的实施方式中的一些实施方式。

本公开的实施方式涉及细胞培养基材，以及包括所述基材的细胞培养或生物反应器系统，并且涉及使用所述基材来培养细胞的方法。实施方式还包括生物反应器容器，所述生物反应器容器能够利用容器中的细胞培养基材进行细胞接种、培养、转染和/或收获，并且能够以不同的生产规模来操作。

在常规的大规模细胞培养生物反应器中，已经使用了不同类型的填充床生物反应器。通常，这些填充床包含多孔基质来保留贴壁或悬浮细胞，以及支持生长和增殖。填充床基质提供了高的表面积/体积比，因此细胞密度可以比其他系统中的高。填充床常起到深层过滤器的作用，其中，细胞被物理捕获或缠结在基质的纤维中。然而，由于细胞接种物线性流动通过填充床，因此细胞在填充床内不均匀分布。因此，例如，在生物反应器的进口区域具有较高的细胞密度，而在生物反应器的出口部分具有显著更低的细胞密度。细胞在填充床内的这种不均匀分布显著阻碍了此类生物反应器在生物工艺制造中的可缩放性。

现有技术公开的填充床生物反应器中遇到的另一个问题是通道效应。由于填充的非织造纤维的随机性质，在填充床的任何给定截面处的局部纤维密度都是不均匀的。培养基在低纤维密度(高的床渗透性)的区域中迅速流动，并且在高纤维密度(较低的床渗透性)的区域中流动缓慢得多。穿过填充床的不均匀的培养基灌注产生了通道效应。其自身表现出形成明显的营养物质和代谢产物梯度，对整体细胞培养和生物反应器性能产生负面影响。位于低培养基灌注区域中的细胞会挨饿，还经常因缺乏营养物或代谢物中毒而死亡。当使用填充有非织造纤维骨架的生物反应器时，细胞收获是遇到的另一个问题。由于填充床起到深层过滤器的作用，因此在细胞培养过程结束时释放的细胞被截留在填充床内，并且细胞回产率极低。这大大限制了这种生物反应器在以活细胞为产品的生物工艺中的利用。

本公开包括用于锚定依赖性细胞的细胞生长基质和/或填充床系统的实施方式，它们能够容易且有效地放大到用于细胞或细胞衍生产品(例如，蛋白质、抗体、病毒颗粒)的任何实际生产规模。在一个实施方式中，提供了一种基质，该基质具有结构限定的表面区域以供贴壁细胞附着和增殖，其具有良好的机械强度，当组装在填充床或其他生物反应器中时形成高度均匀的多重互连流体网络。在具体的实施方式中，机械稳定的不可降解的织造网可用于支持贴壁细胞生产。这种基质可实现均匀的细胞接种，以及有效收获细胞或生物反应器的其他产物。此外，本公开的实施方式支持细胞培养以在本公开的基质上实现融合的单层或多层贴壁细胞，并且可以避免形成营养物质扩散有限且代谢物浓度增加的3D细胞聚集体。一个或多个实施方式的结构限定的基质能够从生物反应器的填充床完全回收细胞并实现一致的细胞收获。在本公开的另一个实施方式中，提供了一种使用具有基质的生物反应器来进行细胞培养的方法，用于治疗性蛋白质、抗体、病毒疫苗或病毒载体的生物工艺生产。

如本文所用的“结构限定”是指依照限定的结构设计，具有非随机的有序结构的部件。

在一个或多个实施方式中，提供了一种细胞培养基质，其支持锚定依赖性细胞以高的体积密度形式附着和增殖。基质可以组装并用在生物反应器系统中，例如，灌注填充床生物反应器，并且在接种步骤期间提供均匀的细胞分布，同时防止在基质或填充床内形成大型和/或不可控的细胞聚集体。因此，该基质消除了生物反应器操作期间的扩散限制。此外，该基质使得能够从生物反应器容易且有效地收获细胞。

基质可由薄或片状结构的基材材料形成，该基材材料具有通过相对较小的厚度分开的第一侧和第二侧。换言之，片状基材的厚度相对于基材的第一侧和第二侧的宽度和/或长度较小。此外，形成有通过基材厚度的多个孔或开口。开口之间的基材材料的尺寸和几何结构允许细胞粘附于基材材料的表面，就好像其是二维(2D)表面，同时还允许有足够的流体在基材材料周围流动并流动通过开口。在一些实施方式中，基材是聚合物基材料，并且可以形成为模制的聚合物片；具有穿透厚度的开口的聚合物片；熔合成网状层的多个纤丝；或者织造成网层的多个纤丝。基质的物理结构具有高的表面/体积比以用于培养锚定依赖性细胞。根据各个实施方式，基质可以某些方式被布置或填充在生物反应器中，以获得均匀的细胞接种，均匀的培养基灌注，以及有效的细胞收获。

本公开的实施方式可实现具有实用尺寸的病毒载体平台，其可以生产每批次约10¹⁵至约10¹⁸个或更多的病毒基因组规模的病毒基因组。例如，在一些实施方式中，病毒基因组产率可以是每批约10¹⁵至约10¹⁶个病毒基因组，或每批约10¹⁶至约10¹⁹个病毒基因组，或每批约10¹⁶至10¹⁸个病毒基因组，或每批约10¹⁷至约10¹⁹个病毒基因组，或每批约10¹⁸至约10¹⁹个病毒基因组，或每批约10¹⁸个或更多病毒基因组。“批次”可指单个生物反应器容器的单次细胞培养运行。由于本文实施方式的可缩放性，生物反应器容器和所包含的细胞培养基材可以适当缩放以实现这些产率。该可缩放性得益于细胞培养基材的结构限定的性质，该性质提供了均匀的细胞接种和培养，均匀的培养基流动和/或均匀的收获。在一些实施方式中，批次包括用于协同细胞培养操作的多个生物反应器容器。

此外，本文公开的实施方式不仅能够实现细胞附着并生长在细胞培养基材上，还能够实现培养细胞的活收获。在现有平台中，不能够收获活细胞是一个明显缺点，这导致难以构建和维持足够数目的细胞来形成生产能力。根据本公开实施方式的一个方面，可从细胞培养基材收获活细胞，包括80％至100％的活细胞，或约85％至约99％的活细胞，或约90％至约99％的活细胞。例如，收获的细胞中至少80％是活的，至少85％是活的，至少90％是活的，至少91％是活的，至少92％是活的，至少93％是活的，至少94％是活的，至少95％是活的，至少96％是活的，至少97％是活的，至少98％是活的，或者至少99％是活的。可以使用例如胰蛋白酶、TrypLE或Accutase从细胞培养基材释放细胞。

图1A和1B分别示出了根据本公开的一个或多个实施方式的实例的细胞培养基材100的三维(3D)透视图和二维(2D)平面图。细胞培养基材100是由沿第一方向延伸的第一多条纤维102和沿第二方向延伸的第二多条纤维104制成的织造网层。基材100的织造纤维形成了多个开口106。开口的尺寸和形状可基于编织的类型(例如，纤丝的数目、形状和尺寸；相交纤丝之间的角度等)而改变。开口可由一定的宽度或直径来限定，如图1B中的第一直径D₁和第二直径D₂所示。织造网在宏观尺度上可被认为是二维片或层。然而，对织造网的仔细观察显示了由于网的相交纤维的上升和下降而产生的三维结构。因此，如图1C所示，织造网100的厚度T可以比单个纤维的粗度厚。如本文所用，厚度T是织造网的第一侧108与第二侧110之间的最大厚度。

在图1B中，开口106具有直径D₁和直径D₂，直径D₁定义为相对的纤维102之间的距离，直径D₂定义为相对的纤维104之间的距离。取决于编织的几何形状，D₁和D₂可相等或不相等。在D₁和D₂不相等的情况下，较大的直径可称为主直径，较小的直径可称为次直径。在一些实施方式中，开口的直径可以指开口的最宽部分。除非另外规定，否则本文所用的开口直径应指在开口的相对两侧的平行纤维之间的距离。

多个纤维102中的给定纤维具有粗度t₁，多个纤维104中的给定纤维具有粗度t₂。对于圆形截面的纤维，如图1A所示，或其他三维截面，粗度t₁和t₂是纤维截面的最大直径或最大粗度。根据一些实施方式，多个纤维102均具有相同的粗度t₁，并且多个纤维104均具有相同的粗度t₂。此外，t₁和t₂可以相等。然而，在一个或多个实施方式中，t₁和t₂可以不相等。此外，多个纤维102和多个纤维104中的每一个可以包含两种或更多种不同粗度(例如，t_1a、t_1b等，以及t_2a、t_2b等)的纤维。由于织造网的三维性质，如图1A-1C所示，可用于细胞附着和增殖的纤维的有效表面积超过了在宏观尺度上具有相同基材尺寸的相当的平面2D表面上供附着的表面积。

织造网可以包括单纤丝或多纤丝聚合物纤维。在一个或多个实施方式中，单纤丝纤维的直径可以在约50μm至约1000μm的范围内。在微观尺度级别上，由于纤维相比于细胞的尺度(例如，纤维直径大于细胞)的缘故，因此单纤丝纤维的表面作为常规2D表面存在以供贴壁细胞附着和增殖。这种纤维被编织成具有限定图案和一定量的结构刚性的网。纤维可被编织成约100μmx100μm至约1000μmx1000μm开口范围的网。这些纤丝直径和开口直径的范围是一些实施方式的示例，但并不旨在限制所有实施方式的网的可能的特征尺寸。

基材网可以由在细胞培养应用中可相容的聚合物材料的单纤丝或多纤丝纤维制造，所述聚合物材料例如包括聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚环氧乙烷、聚吡咯和聚环氧丙烷。网基材可以具有不同的结构图案或编织形式，例如，包括针织、经向针织或织造(例如平纹编织、斜纹编织、荷兰编织、五针编织)。

可能需要对网纤丝的表面化学进行改性，以提供期望的细胞粘附性质。这样的改性可通过网的聚合物材料的化学处理，或者通过将细胞粘附分子接枝到纤丝表面来实现。或者，可以使用生物相容性水凝胶的薄层来涂覆网，该生物相容性水凝胶具有细胞粘附性质，其包括，例如胶原或或者，可通过使用行业已知的各种类型的等离子体、工艺气体和/或化学品的处理过程，使网的纤丝纤维表面具有细胞粘附性质。

图2A-2C示出了根据本公开的一些设想的实施方式的织造网的不同示例。下表1中概括了这些网的纤维直径和开口尺寸，以及由相应的网的单层所提供的细胞培养表面积相对于相当的2D表面的大致增幅。在表1中，网A是指图2A的网，网B是指图2B的网，并且网C是指图2C的网。表1的三种网几何结构仅是示例，本公开的实施方式不限于这些特定的示例。由于网C提供了最高的表面积，其可以有利于实现高密度的细胞粘附和增殖，并因此为细胞培养提供最有效的基材。然而，在一些实施方式中，可能有利的是，细胞培养基质包括表面积较低的网，例如网A或网B，或者不同表面积的网的组合，以例如在培养腔室内实现期望的细胞分布或流动特性。

表1.图2A-2C中的网的比较，以及与2D表面相比获得的细胞培养表面积的增加。

如上表所示，与尺寸相当的平面2D表面相比，网的三维性质为细胞附着和增殖提供了增加的表面积。这种增加的表面积有助于本公开实施方式的可缩放性。对于工艺开发和工艺验证研究，常需要小规模的生物反应器以便节约试剂成本和增加实验通量。本公开的实施方式可应用于这种小规模的研究，但是也可以放大到工业规模。例如，如果将2.2cm直径圆形的100层网C填充到内直径为2.2cm的圆柱形填充床中，则可用于细胞附着和增殖的总表面积等于约935cm²。为了将这种生物反应器规模扩大十倍，可使用内直径为7cm的圆柱形填充床和100层相同的网的类似设置。在这种情况中，总表面积将等于9,350cm²。在一些实施方式中，可用的表面积为约99,000cm²/L或更大。在一些实施方式中，生物反应器容器可具有细胞培养基质，该细胞培养基质具有超过100层的细胞培养基材，例如，包括100-1000层或更多，或者约300层的细胞培养基材。在一些示例中，300层的细胞培养基质可具有约3×10⁹至5×10⁹cm²的表面积。在一些实施方式中，填充床生物反应器具有1m²至10m²的等效表面积，例如，包括1m²、2m²、2.5m²、3m²、4m²、5m²和10m²，以及其间的范围。由于填充床中的平推流式灌注流，以ml/min/(cm²填充床截面表面积)表示的相同的流率可以用在较小规模和较大规模的生物反应器形式中。

通过使用具有足够刚性的结构限定的培养基质，在基质或填充床上实现了高流动阻力均匀性。根据各个实施方式，可以单层或多层形式部署基质。这种灵活性消除了扩散限制并且为附着于基质的细胞提供了均匀的营养物质和氧气输送。此外，基质在填充床构造中没有任何细胞滞留区域，允许在培养结束时收获高活力的细胞。该基质还为填充床提供了填充均匀性，并实现了从工艺开发单元到大规模工业生物加工单元的直接可缩放性。从填充床直接收获细胞的能力消除了在搅拌或机械摇动的容器中重新悬浮基质的需要。进一步地，细胞培养基质的高填充密度在工业规模可管理的体积中产生了高生物工艺生产率。

图3A显示了具有多层基材200的基质的一个实施方式，图3B是同一多层基材200的平面图。多层基材200包括第一网基材层202和第二网基材层204。尽管第一基材层202和第二基材层204重叠，但是网的几何结构(例如，开口直径与纤维直径的比值)使得第一基材层202和第二基材层204的开口重叠，并为流体流过多层基材200的总厚度提供路径，如图3B中的无纤丝开口206所示。虽然图3A和3B仅示出了两个基材层，但应理解，本公开的实施方式包括的细胞培养基质包括许多层的细胞培养基材，这些层例如以如图3A和3B所示的堆叠布置来布置。虽然图3B显示出基材层202和204不是完美对齐的，但是这些层也可以是对齐的，以使得开口206是对齐的。

图4示出了在图3B中的线B-B处的多层基材200的截面图。箭头208示出了通过第二基材层204中的开口然后围绕第一基材层202中的纤丝的可能的流体流动路径。网基材层的几何结构被设计为允许有效且大致均匀地流过一个或多个基材层。基质200的结构可允许流体以多个取向流动通过基质。例如，如图4所示，总体流体流动方向(如箭头208所示)垂直于第一基材层202和第二基材层204的主侧表面。然而，基质也可以相对于流体流动定向，使得基材层的侧面平行于总体流动方向。例如，图5示出了沿着图4的线C-C的多层基材200的截面图，基质200的结构允许流体流(箭头210)通过多层基材200中的流体路径。除了垂直或平行于网层的第一和第二侧面的流体流动外，基质还可以使得多个基材片以中间角度布置，或者甚至相对于流体流动随机布置。这种基质的灵活性允许其用于各种应用和生物反应器或容器设计。

如本文所讨论的，根据一个或多个实施方式，细胞培养基材可用在生物反应器容器内。例如，基材可用在填充床生物反应器构造中，或者三维培养腔室内的其他构造中。然而，实施方式不限于三维培养空间，并且预期基材可用于可被认为是二维培养表面构造的构造中，其中基材的一层或多层平放，例如，在平底培养皿中，以为细胞提供培养基材。由于污染问题，容器可以是一次性容器，并且在使用后可弃去。

根据一个或多个实施方式，提供了一种用于培养细胞的填充床生物反应器系统，其中，在生物反应器容器的培养腔室内使用细胞培养基质。图6示出了细胞培养系统300的一个实例，细胞培养系统300包括生物反应器容器302，其具有在生物反应器容器302的内部腔室中的细胞培养腔室304。在细胞培养腔室304内是由多层基材层308制成的细胞培养基质306。多个基材层308可包括堆叠布置的多个可分离且相区分的基材层，但是也可包括其中多个层固定在一起的一体化细胞培养基质。基材层308被堆叠成一个基材层的第一侧或第二侧面向相邻基材层的第一侧或第二侧。生物反应器容器300在一端具有进口310，该进口310用于将培养基、细胞和/或营养物质输入到培养腔室304中，在相对端具有出口312，该出口312用于从培养腔室304移除培养基、细胞或细胞产物。通过允许以这种方式堆叠基材层，系统可容易地扩大规模，并且由于限定的结构以及通过堆叠基材的有效流体流动，因此对细胞附着和增殖不会产生不利影响。

在一个或多个实施方式中，填充床的流动阻力和体积密度可以通过交错不同几何结构的基材层来控制。具体地，网尺寸和几何结构(例如，纤维直径、开口直径和/或开口几何结构)限定了填充床形式中的流体流动阻力。通过交错的具有不同尺寸和几何结构的网，可控制生物反应器的特定部分中的流动阻力。这将能够在填充床生物反应器中获得液体灌注的更好的均匀性。例如，可堆叠10层的网A(表1)，接着堆叠10层的网B(表1)，接着堆叠10层的网C(表1)，以实现期望的填充床特性。又例如，填充床可以从10层的网B开始，接着是50层的网C，接着是10层的网B。这种重复模式可继续直到整个生物反应器被网填充。这些仅是示例，并且用于说明的目的不意图限制可能的组合。实际上，具有不同尺寸的网的各种组合都是可能的，以获得细胞生长表面的体积密度和流动阻力的不同分布。例如，具有不同细胞体积密度的区域(例如，产生低/高/低/高等密度模式的一系列区域)的填充床柱可通过交错不同尺寸的网来组装。

在图6中，总体流动方向在从进口310到出口312的方向上(如通过所示的箭头方向所指示的)，并且在该实例中，基材层308的第一主侧和第二主侧垂直于总体流动方向。然而，实施方式不限于该构造。例如，基材可被布置在培养空间内，以使得第一侧和第二侧平行于总体流动方向，或者相对于总体流动方向呈一定的中间角度。因此，本公开的实施方式的基质可用于任何一种构造。在任何一种构造中，可调整基材的尺寸和形状，以适当填充由培养腔室所限定的内部空间。此外，根据需要，可以调整基材的各个层的尺寸或者基材层的堆叠体的尺寸，以填充内部空间，或者可填充小于整个内部空间。例如，在一些实施方式中，可能期望基材层的堆叠体占据小于完整的内部空间。

如上所述，本公开的实施方式包括生物反应器容器，所述生物反应器容器能够利用容器中的细胞培养基材进行细胞接种、培养、转染和/或收获，并且能够以不同的生产规模来操作。根据本公开的实施方式所述的生物反应器能够使终端用户使用相同的生物反应器单元以1倍至10倍的规模运行生物工艺实验。这些实施方式的简单的可缩放模型能够在一个系统中实现生物工艺从研究到工艺开发到生产规模的转变。生物反应器容量的构造的这种灵活性将节约工艺优化的成本和时间，并在1倍到10倍的规模范围内有效。一些实施方式的方面也将允许终端用户在相同的预定流率下接种和收获细胞而不需要在生物反应器的放大期间进行重新优化。

图7根据一个或多个实施方式示出了灌注型生物反应器320。生物反应器320包括培养基进口321，通过该培养基进口321，培养基(包括流体、细胞和营养物质)可被进料到生物反应器320的内部腔室327。内部腔室327可被认为是包含细胞培养区327a和间隔件区327b，在细胞培养区327a中设置有细胞培养基材323，在间隔件区327b中设置有间隔件325。培养基进口321通向流体分布板322。流体分布板322在容纳有细胞培养基材323的内部空间的宽度上分散和/或分配进入的培养基。虽然未示出，但是可刚好在出口326之前设置类似的流率分配板。出口分配板可帮助将培养基或组分从跨越内部腔室327的宽度集中到出口。如下文将详细解释的，生物反应器320还可以某种模式来操作，其中，流体通过出口326被放置到内部腔室327中，在这种情况中，出口分配板可帮助在内部腔室327的宽度上均匀地分配流体。在这种反向流模式中，进口321可用于从内部腔室327移除流体或组分。

细胞培养基材323可相当于本文公开的实施方式，包括例如多孔聚合物基材。基材323具有高度h，其从基材323的流率分配板侧延伸到基材323的相对侧或顶部。任选地，在与流率分配板322相对的基材323的顶部处是填充床保持器324。填充床保持器324被设计成向基材323提供结构支持，以抵抗来自培养基进口321的培养基的流动。由此，填充床保持器324可帮助保持填充床基材323的位置和/或形状。根据不同的实施方式，填充床保持层324可具有许多构造，但是总的来说，具有足以将基材323保持在适当位置同时允许培养基(包括细胞在内)穿过填充床保持层324的结构。在填充床保持层324的顶部是间隔件325。间隔件325的尺寸被调整成基本上填充间隔件区327b，或者基材323和/或填充床保持层324上方以及内部腔室327顶部处的培养基出口326之前的内部空间。通过填充该空间，间隔件325顶靠内部空间的顶部或者内部空间内的一些支撑特征，并因此使填充床保持层324和基材323保持在适当位置。

间隔件325还在细胞培养区327a上方的间隔件区327b中产生顶部空间。该顶部空间可具有增强基材323中，尤其是基材323的顶部附近的流动均匀性的作用。例如，如果基材323的顶部在内部腔室327的顶部附近，则内部腔室327顶部处的流动限制可产生压力增加的区域并影响填充床中的流动均匀性。如下文将论述的，该顶部空间在收获操作期间还提供了供加压流体开始填充内部腔室327的空间。

图7B显示图7A的实施方式的变化形式。在图7B中，在细胞培养基材323与培养基进口321之间设置有至少一个多孔间隔件盘片328。多孔间隔件盘片328可呈现不同形式，但是一般在内部腔室327的宽度或基材323的宽度上延伸，并且是多孔的，以允许流体流动穿过多孔间隔件盘片328。根据实施方式，多孔间隔件盘片328具有间隔件盘片孔直径，其大于基材中的开口或孔的孔直径。在一些实施方式中，在基材323与进口321之间可堆叠多个多孔间隔件盘片328。这些多个多孔间隔件盘片328各自可具有相同的构造(例如，厚度和间隔件盘片孔尺寸)或不同构造(例如，不同厚度和间隔件盘片孔尺寸)。预计多孔间隔件盘片328可在流体到达细胞培养基材323之前进一步均匀化及分配从进口321或分配板322流来的流体。

图7A和7B中的基材323可以是非织造或织造的，例如，织造的PET基材。然而，在一些实施方式中，基材可以是非织造的。基材可包括呈堆叠布置的多个基材材料层，或者呈卷绕或螺旋的基材材料。

图8是图7A和7B的生物反应器320的实例的部件照片。如图所示，生物反应器320可包括两个或更多个可分离的壳体部件350a和350b。在下方的壳体部件350a中，示出了流率分配板352，其位于培养基进口(在图8中未示出)的上方。示出了填充床保持器354的一个实例。填充床保持器354一般是栅格形状的并具有限定的厚度。填充床保持器354的栅格虽然允许培养基和其他组分流动通过栅格，但是仍向生物反应器内的任何基材层提供支撑。还示出了间隔件355的一个实例。壳体部件350a、350b、分配板352、填充床保持器354和间隔件355的形状和尺寸仅作为示例示出，本公开的实施方式不限于所示的构造。还示出了在进口附近的第一多孔间隔件盘片356、第二多孔间隔件盘片357和第三多孔间隔件盘片358。在该实例中，第二多孔间隔件盘片357和第三多孔间隔件盘片358具有相同的构造，均由筛网或网材料制成，所述材料具有比细胞培养基材360的孔或开口直径大的间隔件盘片孔直径。第一多孔间隔件盘片356也由筛网(mesh)、网(net)或栅格材料制成，但是具有比第二多孔间隔件盘片357和第三多孔间隔件盘片358大的间隔件盘片孔直径。

图9A示出了分配板2的平面图，该分配板2类似于图8的分配板352。分配板2中的孔7被布置成在分配板的宽度上以及生物反应器的内部空间均匀地分配流率。图9B根据一些实施方式示出了填充床保持器4的平面图，该填充床保持器4具有栅格形状，所述栅格形状限定了多个大型开口8以最大程度地减少流动阻力，但是仍将细胞培养基材有效地保留在填充床区域内。

图10示出了图8的间隔件355的三维模型。间隔件可压迫基材和/或将基材保留在填充床区域中，与此同时，在生物反应器的内部腔室327中建立间隔件区327b(参见图7A)，以在填充床细胞培养基质的上方限定顶部空间。不同高度的可拆卸的间隔件355可允许使用者在具有不同体积的细胞培养基材的生物反应器中进行细胞培养，并且允许培养基从填充床不受限制地流到培养基出口端口。也就是说，具有较大高度的间隔件355可相应地降低填充床的高度，而具有较小高度的间隔件355可相应在地允许有更多的空间用于更高的填充床。在一些实施方式中，生物反应器系统可包括高度可调的间隔件，而不是使用高度不同的各单独的间隔件。

图11示出了组装的填充床生物反应器的实例，其有高度不同的间隔件插入件，相应地填充床基材具有不同高度。在该实例中，从左到右，同样的生物反应器可被构造成生产率放大3倍。然而，预计通过相应地调整部件尺寸，本公开的实施方式将允许给定的生物反应器的生产率放大甚至更大的范围。

图12根据一个或多个实施方式，示出了被并入到生物加工系统400中的生物反应器402。系统400包括培养基调节容器411，其例如用于适当地维持细胞培养基参数，例如，pH、温度和供氧水平。自动控制泵409用于将培养基灌注通过生物反应器402。生物反应器进口413配备有额外的三通端口以促进细胞接种或收集所收获的细胞。系统400可以包括内嵌传感器，以及在培养基调节容器411中的传感器412。

图13示出了在从生物反应器收获细胞的过程期间的多个阶段中，根据上述实施方式所述的生物反应器。细胞收获过程涉及用细胞解离溶液422预填充生物反应器，以及孵育填充床预定量的时间以使细胞从基材脱离。通过使培养基/细胞逆向流动通过进口421并经培养基出口426施加加压流体(例如，空气)，从培养基进口421收回所得到的细胞悬浮液，如图13中的从左到右的阶段进展所示。

表3示出了根据图7-13的实施方式的60mm生物反应器中的AAV生产运行结果。该60mm生物反应器对应于6780cm²的总基材表面积。示出了转染细胞产率、转染效率和每cm²的病毒基因组产率。

本公开的上述可缩放容器的实施方式是用于锚定依赖性细胞的目标填充床生物反应器系统，其允许使用相同的平台和相同的生物反应器容器在几种不同规模下实现工艺优化或生产。在一个实施方式中，例如，生物反应器容器320保持住填充床323以供贴壁细胞附着、增殖、转染和产生产物。细胞培养基可连续灌注通过填充床和生物反应器容器，从而向细胞补充氧气和营养物质以及移除有害代谢产物。培养基以计算的流率通过容器进口321引入，并且通过出口326离开生物反应器。为了在填充的基材材料上实现均匀的流率分配，将流率分配板322定位在填充床区域的前面。该流率分配板可以具有分支和径向互连设计，以允许在填充床整体上实现均匀的流率分配。

在另一个实施方式中，填充床的层通过刚性保持栅格4而被保持在紧密填充状态。该保持栅格具有大型开口，最大程度地减少了生物反应器灌注期间的流动阻力，但是其在结构上仍具有足够的刚度以在填充床表面上均匀施加压力来将PET网的层保持在紧密填充。本公开的生物反应器中的填充床的体积可通过采用不同尺寸的间隔件5将保持栅格4固定在适当位置来改变。生物反应器容器的尺寸和填充床的直径可从～1cm(实验室规模)变化到～10cm(工艺开发规模)，变化到50cm(中试规模)，变化到200cm(制造规模)。

图8示出了在通过HEK293T贴壁细胞进行病毒颗粒的生物生产中测试的生物反应器的零件。生物反应器填充床区域的内直径为60mm，并且生物反应器的组装状态的填充床可以由10至300层刚性PET基材组成。这对应于678-20300cm²的表面积供贴壁细胞附着、生长和产生感兴趣的化合物。图12示出了处于组装状态并且连接到主要外部部件的生物反应器容器402的示意图，主要外部部件包括培养基调节容器，允许将培养基物流泵送到生物反应器中的泵，以及支持成功的生物工艺所需的工艺条件的外部溶解氧传感器。细胞培养基在培养基调节容器411中得到调节，在该培养基调节容器411中维持适当的pH、温度和溶解氧水平。随后，通过泵409使培养基灌注通过生物反应器。泵409的流率被整合到反馈环路中，所述反馈环路自动调整以维持离开生物反应器的培养基中的溶解氧的最小预定水平。经由培养基调节容器411，可将给定的生物工艺所需的所有转染试剂、营养物质和额外的培养基补充物引入到总体培养基中，并且可以移除使用过的培养基。在工艺结束时，可从生物反应器排出培养基，并用细胞收获溶液422重新填充(图13)。在收获溶液中孵育填充床预定的时间，并且该预定的时间足以使细胞从基材脱离后，通过在生物反应器出口6处施加空气压以达到流率为70ml/cm²(填充床横截面积)/分钟的逆向流来收获细胞。在生物反应器的三通端口413处收获细胞。也可以在生物反应器中直接裂解细胞，并且可通过三通端口413收集包含AVV颗粒的裂解物溶液。

培养基调节容器404可包括生物加工产业中使用的典型生物反应器中见到的传感器和控制部件，以用于悬浮批料、进料批料或灌注培养。这些包括但不限于DO氧气传感器，pH传感器，供氧器/气体鼓泡单元，温度探针，以及营养物添加端口和碱添加端口。供应到鼓泡单元的气体混合物可通过用于N₂、O₂和CO₂气体的气体流率控制器来控制。培养基调节容器404还包括用于培养基混合的叶轮。上文列出的传感器所测量的所有培养基参数可通过培养基调节控制单元418来控制，所述培养基调节控制单元418与培养基调节容器404通信，并且能够测量和/或调节细胞培养基406的条件以达到期望的水平。

来自培养基406调节容器404的培养基通过进口被输送到生物反应器402，该进口还可以包括注射端口以用于细胞接种，从而接种细胞并开始细胞培养。生物反应器容器402还可以包括一个或多个出口，细胞培养基通过该出口离开容器402。此外，细胞或细胞产物可以通过出口输出。为了分析来自生物反应器402的流出物的内容物，可以在线路中提供一个或多个传感器412。在一些实施方式中，系统400包括流率控制单元，其用于控制进入到生物反应器402中的流率。例如，流率控制单元可以接收来自所述一个或多个传感器412的信号，并且基于该信号，通过将信号发送给在生物反应器402的进口408上游的泵(例如，蠕动泵)，调整进入到生物反应器402中的流率。因此，基于传感器412所测得的一个因子或多个因子的组合，泵可控制进入到生物反应器402中的流率，以获得期望的细胞培养条件。

培养基灌注率由信号处理单元控制，该信号处理单元收集并比较来自培养基调节容器404的传感器信号以及来自位于填充床生物反应器出口处的传感器的传感器信号。由于通过填充床生物反应器402的培养基灌注的填充流动性质，沿着填充床形成了营养物、pH和氧气梯度。根据图14B的流程图，生物反应器的灌注流率可通过操作性连接到蠕动泵的流率控制单元自动控制。

本公开的一个或多个实施方式提供了不同于常规方法的细胞接种步骤。在常规方法中，用培养基填充具有常规基质的填充床，并将浓缩接种物注射到培养基循环回路中。细胞悬浮液以增加的流率被泵送通过生物反应器，从而减少通过在常规填充床基质上捕获所进行的细胞接种的不均匀性。在这样的常规方法中，以升高的流率将细胞泵送到循环回路中并持续或许几小时，直到在填充床生物反应器中捕获大部分的细胞。然而，由于常规填充床生物反应器的不均匀的深层床过滤性质，细胞在填充床内不均匀地分布，并且在生物反应器的进口区域处有较高的细胞密度，而在生物反应器的出口区域处有较低的细胞密度。

相较之下，根据本公开的实施方式，体积与生物反应器的培养腔室的空隙体积相等的细胞接种物通过生物反应器402的进口处的细胞接种物注射端口被直接注射到填充床中(图12)。由于在本文所述的细胞培养基质中存在的均匀且连续的流体通道，细胞悬浮液随后在填充床内均匀分布。为了防止在初始接种阶段因为重力导致细胞沉降，可以在接种物注射之后立即开始培养基灌注。灌注流率保持在低于预设的阈值，以平衡重力并避免细胞从填充床生物反应器中被洗掉。因此，在最初的细胞附着阶段，细胞在填充床内被轻轻翻滚，并且实现了细胞在可用的基材表面上的均匀分布和附着。

图14A根据一些实施方式，示出了如本文公开的细胞培养系统所用的工艺步骤。如图14A所示，这些工艺步骤可包括工艺准备(S1)，接种和附着细胞(S2a,S2b)，细胞扩增(S3)，转染(S4a,S4b)，病毒载体的生产(S5a,S5b)，以及收获(S6a,S6b)。

图14B示出了用于控制灌注生物反应器系统(例如，图12的系统400)的流率的方法450的一个实例。根据方法450，在步骤S1处通过生物反应器优化运行来预先确定系统400的某些参数。根据这些优化运行，可确定pH₁、pO₁、[葡萄糖]₁、pH₂、pO₂、[葡萄糖]₂和最大流率的值。在步骤S2处，在生物反应器402的细胞培养腔室内测量pH₁、pO₁和[葡萄糖]₁的值，在步骤S3处，通过传感器412来测量培养基调节容器404中的pH₂、pO₂和[葡萄糖]₂。基于S2和S3处的这些值，灌注泵控制单元在S4处做出决定以维持或调整灌注流率。例如，如果满足pH₂≥pH_2最小，pO₂≥pO_2最小和[葡萄糖]₂≥[葡萄糖]_2最小中的至少一项，则细胞培养基到细胞培养腔室的灌注流率可以继续处于当前流率(S5)。如果当前的流率小于或等于细胞培养系统的预定最大流率，则增加灌注流率(S7)。此外，如果当前的流率不小于或等于细胞培养系统的预定最大流率，则细胞培养系统的控制器可重新评估以下中的至少一项：(1)pH_2最小、pO_2最小和[葡萄糖]_2最小；(2)pH₁、pO₁和[葡萄糖]₁；以及(3)生物反应器容器的高度(S6)。

取决于期望的系统，细胞培养基质可以多种构造布置在培养腔室内。例如，在一个或多个实施方式中，系统包括一个或多个基材层，并且其宽度在培养腔室中的限定的细胞培养空间的整个宽度上延伸。多个基材层可以以这种方式堆叠到预定高度。基材层可以被布置成使得一个或多个层的第一侧和第二侧垂直于培养基通过培养腔室中的限定的培养空间的总体流动方向。在一些实施方式中，一个或多个层的第一侧和第二侧可以平行于总体流动方向。在一个或多个实施方式中，细胞培养基质包括相对于总体流处于第一取向的一个或多个基材层，以及处于与第一取向不同的第二取向的一个或多个其他层。例如，各个层可以具有平行或垂直于总体流动方向或者处于平行与垂直之间的某个角度的第一侧和第二侧。

在一个或多个实施方式中，细胞培养系统包括在填充床构造中的多个离散的细胞培养基材片，其中，基材片的长度和/或宽度相对于培养腔室较小。如本文所用，当基材片的长度和/或宽度为培养空间的长度和/或宽度的约50％或更小时，基材片被认为具有相对于培养腔室较小的长度和/或宽度。因此，细胞培养系统可以包括以期望的布置方式填充到培养空间中的多个基材片。基材片的布置可以是随机或半随机的，或者可以具有预定顺序或对齐形式，例如，基材片以基本上相似的方向来定向(例如，相对于总体流动方向水平，垂直，或者成0°至90°之间的角度)。

如本文所用的“限定的培养空间”是指培养腔室内由细胞培养基质占据的空间，细胞接种和/或培养将在其中进行。限定的培养空间可以大致填充整个培养腔室，或者可以占据培养腔室内的一部分空间。如本文所用的“总体流动方向”被定义为在细胞培养期间，和/或在培养基流入或流出培养腔室期间，流体或培养基通过细胞培养基质或者在细胞培养基质上的总体质量流的方向。

在一个或多个实施方式中，细胞培养基质通过固定机构固定在培养腔室内。固定机构可以将细胞培养基质的一部分固定到包围基质的培养腔室的壁上，或者固定到培养腔室一端的腔室壁上。在一些实施方式中，固定机构将细胞培养基质的一部分粘附到延伸穿过培养腔室的构件，例如，平行于培养腔室的纵轴线延伸的构件，或者粘附到垂直于纵轴线延伸的构件。然而，在一个或多个其他实施方式中，细胞培养基质可以包含在培养腔室内并且不固定地附接于培养腔室或生物反应器容器的壁。例如，基质可以由培养腔室的边界或室内的其他结构构件容纳，使得基质保持在生物反应器容器的预定区域内，而基质并没有不动地固定到这些边界或结构构件上。

一些实施方式的一个方面提供了滚瓶构造的生物反应器容器。培养腔室能够包含根据本公开所述的一个或多个实施方式的细胞培养基质和基材。

在滚瓶构造中，生物反应器容器可以操作性地附接到用于围绕容器的中心纵轴线移动生物反应器容器的装置。例如，生物反应器容器可以围绕中心纵轴线旋转。旋转可以是连续的(例如，在一个方向上连续)，或者不连续的(例如，在单个方向或交替方向上间歇旋转，或者以来回的旋转方向振荡)。在操作时，生物反应器容器的旋转造成腔室内的细胞和/或流体移动。该移动可以被认为是相对于腔室壁的移动。例如，当生物反应器容器围绕其中心纵轴线旋转时，重力可以造成流体、培养基和/或未粘附的细胞保持朝向室的下部。然而，在一个或多个实施方式中，细胞培养基质相对于容器基本是固定的，因此随着容器一起旋转。在一个或多个其他的实施方式中，细胞培养基质可以是未附接的，并且当容器旋转时，其相对于容器自由移动到期望的程度。细胞可以粘附于细胞培养基质，同时，容器的移动使得细胞暴露于细胞培养基或液体，以及培养腔室中的氧气或其他气体。

通过使用本公开实施方式的细胞培养基质，例如，包括织造或网基材的基质，滚瓶容器具有可用于贴壁细胞附着、增殖和功能化的增加的表面积。具体地，在滚瓶内使用单纤丝聚合物材料的织造网的基材，相比于标准滚瓶，表面积可以增加约2.4倍至约4.8倍，或者达到标准滚瓶的约10倍。如本文所述，网基材的每个单纤丝线股能够使其自身呈现2D表面以供贴壁细胞粘附。此外，在滚瓶中可以布置多个网层，使得相比于标准滚瓶，可用的总表面积增加约2至20倍。因此，通过添加本文公开的改进的细胞培养基质，可改变现有的滚瓶设施和加工(包括细胞接种、培养基交换和细胞收获)，并且对现有的操作基础设施和加工步骤的影响最小。

生物反应器容器任选地包括一个或多个出口，其能够附接于进口和/或出口装置。通过该一个或多个出口，液体、培养基或细胞可以被供应到室或者从室移除。容器中的单个端口可以同时起到进口和出口的作用，或者可以提供多个端口以用于专门的进口和出口。

实施方式不限于围绕中心纵轴线的容器旋转。例如，容器可以围绕轴线旋转，该轴线不位于相对于容器的中心。此外，旋转轴线可以是水平或垂直轴线。

实施例

为了说明本公开的细胞培养基质、细胞培养系统和相关方法的功效，根据以下实施例进行关于细胞接种和培养的研究。

在实施例1中，在静态细胞培养条件中测试具有聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)织造网基材(参见图15A-15C)的细胞培养基质。在乙醇中洗涤PET网并且在氧RF等离子体中进行等离子体处理。使明胶吸附在网纤丝的表面上以促进细胞粘附。将网的盘形片放置到康宁超低粘附(ULA)六孔板中。以不同的接种密度(50K/cm²、75K/cm²、100K/cm²，分别对应于图15A、15B和15C)将HEK293T细胞接种到网盘片上，进行三天的细胞培养。用荧光绿细胞跟踪染料对纤丝表面上的细胞进行染色。图15A-15C示出了纤丝表面上的细胞的这种可视化结果。网纤丝相对于细胞大小的尺寸使得单纤丝纤维能有效地作为二维表面以供细胞附着和增殖。通过从网中收获细胞并且在来自贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)的/>细胞计数器上计数，测量细胞增殖。结果显示，在静态细胞培养条件下，在细胞培养基质上具有优异的细胞附着和增殖。

在实施例2中，根据本公开的一个实施方式的示例，在填充床生物反应器系统(例如，图6所示的系统)中培养细胞。填充床具有圆柱形状并且由细胞培养基材的堆叠体制成，每个细胞培养基材具有圆形或盘形。具体地，在实施例2中，填充床的高度为约25mm，并且包括一百个PET网基材的盘片，每个盘片的直径为约20mm。所用的网对应于表1中的网C。估计可用于细胞附着的总二维表面积为约760cm²。为了对生物反应器进行接种，将8ml的HEK293T细胞悬浮液(二百万个细胞/ml)直接注射到填充床中。在引入细胞悬浮液后立即开始培养基灌注，并且将灌注流率设置为3ml/min(毫升/分钟)。以该流率继续灌注24小时，然后将流率减小到1ml/min。在这之后，调整灌注流率以维持生物反应器出口处的pO₂≥50％饱和压，并且pH≥7。在两到三天后，用结晶紫来染色生物反应器所运行的细胞，并且拆解生物反应器以证明基质内的细胞附着均匀性。根据优选的实施方式，可通过接种方法对生物反应器进行接种，其中，在初始附着阶段期间，细胞在填充床内连续翻滚。结果，在细胞培养两天后，填充床的所有部分均实现了均匀的细胞分布。这表明，当生物反应器在细胞接种阶段被连续灌注时，实现了均匀的细胞分布。

在实施例3中，在填充床生物反应器系统中培养细胞，并且在生物反应器中进行HEK293T细胞的转染以用于腺相关病毒(AAV)生产。在实施例3中使用与实施例2相同的生物反应器设置(参见，例如图6)。填充床包含100个PET网(表1的网C)的盘片。每个盘片的直径为约20mm，并且床高度为约25mm，可用于细胞附着和增殖的二维表面积总共为约760cm²。为了对生物反应器进行接种，将8ml的HEK293T细胞悬浮液(二百万个细胞/ml)直接注射到填充床中。将包含约50ml培养基的培养基储存容器附接于生物反应器容器。细胞在杜氏改良伊氏培养基(DMEM)培养基(具有+10％FBS和+6mM L-谷氨酰胺)中培养72小时。当储存容器中的培养基的pH降到低于7时，用新鲜培养基供料替换培养基。相应地，调整灌注流率以维持生物反应器出口处的pO₂≥50％饱和压，并且pH≥7。在72小时后，用50ml的/> DMEM(15-018)(具有+10％ FBS,+6mM L-谷氨酰胺)改变培养基，加入转染试剂以得到2ug/ml AAV2和/>的比率为1:2的最终浓度。在接下去的72小时期间，如果储瓶中的pH降到低于7，则将培养基换成新鲜供料。相应地，调整灌注流率以维持生物反应器出口处的pO₂≥50％饱和压，并且pH≥7。使用5X TrypLE^TM收获细胞。通过荧光流式细胞分析仪来分析转染效率，通过ELISA和PCR试验来分析病毒颗粒和病毒基因组滴度。表2中示出了细胞培养结果，其中，“VP”代表病毒蛋白，并且“GC”代表基因组拷贝。/>

表2.填充床生物反应器中的HEK 293T细胞的转染和AAV生产的结果。

本文公开的实施方式相对于用于细胞培养和病毒载体生产的现有平台具有一些优点。应注意，本公开的实施方式可用于生产多种类型的细胞和细胞副产物，包括例如贴壁或半贴壁细胞，人胚胎肾(HEK)细胞(例如HEK23)，包括转染细胞，病毒载体，如慢病毒(干细胞、CAR-T)和腺相关病毒(AAV)。这些是如本文公开的生物反应器或细胞培养基材的一些常见应用的实施例，但它们不旨在限制所公开的实施方式的使用或应用，因为本领域普通技术人员会理解实施方式可应用于其他用途。

如上所述，本公开实施方式的一个优点是通过细胞培养基材的流动均匀性。不希望囿于理论，认为细胞培养基材的规则且均匀的结构提供了培养基可从中流过的一致且均匀的主体。相较之下，现有的平台主要依赖于不规则或随机的基材，例如，毡状或非织造纤维状材料。本公开的基材的均匀性质可通过检查在基材上实现的均匀且一致的细胞接种来说明。例如，图16A根据本公开的一些实施方式示出了基材材料的三个盘片(1801、1802、1803)。图16A中的盘片是如本文所述的PET织造网材料，并且每个盘的直径为约60mm。填充有10至300层类似盘片的生物反应器的表面积将达到约678至20,300cm²。在该实施例中，使用100个盘片的堆叠体进行细胞培养。第一盘片1801是在生物反应器内的这些盘片的堆叠体中的顶部盘片，第二盘片1802是堆叠体的中间盘片，并且第三盘片1803是堆叠体的底部盘片。

图16A显示了在接种后72小时，在生物反应器内的细胞分布的均匀性。从生物反应器收回来自填充床的三个不同区域的基材层，并且用结晶紫染色以使附着的HEK 293T细胞可视化。顶层、中间层和底层细胞的染色均匀性证明了在接种和附着步骤期间，细胞均匀的分布于整个填充床。在收获后也对填充床基材样品进行染色，以证明从本公开的生物反应器收获的细胞的效率(参见图16B)。图16B示出了在收获步骤后，从填充床的三个不同区收回的染色基材层。如从图16B中可看到的，收获过程从生物反应器回收了超过95％的细胞。细胞培养结果示于表3。

在产生图16A和16B的图像的实验中，用细胞培养基预填充生物反应器，并且预调节系统过夜，以达到pH 7.2、D.O.100％和37℃的稳态。使用400ml的ATCC DMEM培养基+10％FBS+6mM L-谷氨酰胺来填充整个生物反应器系统。将悬浮的30ml的HEK293T细胞(五百万个细胞/ml)通过三通端口直接注射到填充床中以形成接种物。用预调节的培养基以30mL/min灌注生物反应器并持续第一个48小时，以使得在填充床中具有均匀的细胞分布，附着和初始生长。在培养48小时后，将200ml的新鲜完全ATCC DMEM培养基添加到系统中以维持高于1g/L的葡萄糖水平。自动调整灌注流率以维持生物反应器出口处的DO_外≥45％的培养基饱和。在接种后72小时，用500ml的康宁DMEM(15-018)+10％ FBS+6mM L-谷氨酰胺更换培养基并允许灌注2小时。加入转染混合物(质粒DNA和PEI以1:2的比值的复合物；0.8ug的总DNA/百万个细胞)以在转染后24小时达到2μg的总DNA/ml培养基的最终浓度，用500ml新鲜完全康宁DMEM(15-018)培养基更换培养基，以补充消耗的营养物质。自动调整灌注流率以维持生物反应器出口处的DO_外≥45％饱和。在随后的48小时培养期间监测葡萄糖水平，并根据需要通过培养基添加或更换进行补充，以保持高于0.3g/L的水平。在转染后72小时，用DPBS洗涤细胞并使用1X Accutase溶液收获细胞。通过荧光流式细胞计数仪来分析转染效率，通过ELISA和qPCR试验来分析病毒颗粒和病毒基因组滴度。

使用结晶紫染色来突出图16A中的盘片的整个表面上细胞的均匀生长。尽管第一盘片1801、第二盘片1802和第三盘片1803散布在细胞培养基质的堆叠体中，但所有三个盘片上的细胞生长都是一致的。图16A中的图像是在培养72小时后且从基材中收获细胞之前拍摄的。图16B显示出在收获了细胞之后的相同的三个盘片(1801′、1802′和1803′)。如图16B中的结晶染色的相对缺失所示，已经在每个盘片的表面上和细胞培养基质堆叠体的三个盘片上均匀地收获了细胞。基于分析，从生物反应器中回收了超过95％的细胞。下表3示出了在这些总表面积为6780cm²的直径为60mm的基材堆叠体/容器中的AAV生产的细胞培养结果，其中显示了转染细胞产率、转染效率和每cm²的病毒基因组产率。同样地，基材的均匀结构和均匀的流动特性被认为有助于这种有效且均匀的生长和收获能力。

表3.来自60mm生物反应器的转染细胞产率，转染效率和每cm²的病毒基因组产率。

下表4示出了在包括不同直径(29mm和60mm)的生物反应器容器的多个实验背景下的上述结果。数据显示了较小(例如，29mm直径，1600cm²表面积)和较大(例如，60mm直径，6780cm²表面积)容器和/或填充床基质之间的良好可缩放性。

表4.在生物反应器整个尺寸上的一致结果。

实施例：在60mm生物反应器单元中通过HEK 293T细胞进行的AAV生产以及在填充床生物反应器中的AAV生产。

以α单元组装填充床生物反应器，如图7所示。实际的生物反应器零件示于图8。将60mm直径的填充床放置在生物反应器中，该填充床包括100层结构化且经处理的PET基材。填充床高度为26mm，经计算，可用于细胞附着和增殖的总2D表面积为6780cm²。用细胞培养基预填充生物反应器并预调节系统过夜，以达到pH 7.2、D.O.100％和37℃的稳态。使用400ml的ATCC DMEM培养基+10％FBS+6mM L-谷氨酰胺来填充整个生物反应器系统(图12)。将悬浮的30ml的HEK293T细胞(五百万个细胞/ml)通过三通端口413直接注射到填充床中以形成接种物。

用预调节的培养基以30mL/min灌注生物反应器并持续第一个48小时，以使得在填充床中具有均匀的细胞分布，附着和初始生长。在培养48小时后，将200ml的新鲜完全ATCCDMEM培养基添加到系统中以维持高于1g/L的葡萄糖水平。自动调整灌注流率以维持生物反应器出口处的DO_外≥45％的培养基饱和。

在接种后72小时，用500ml的康宁DMEM(15-018)+10％FBS+6mM L-谷氨酰胺更换培养基并允许灌注2小时。加入转染混合物(质粒DNA和PEI以1:2的比值的复合物；0.8ug的总DNA/百万个细胞)以在转染后24小时达到2μg的总DNA/ml培养基的最终浓度，用500ml新鲜完全康宁DMEM(15-018)培养基更换培养基，以补充消耗的营养物质。自动调整灌注流率以维持生物反应器出口处的DO_外≥45％饱和。

在随后的48小时培养期间监测葡萄糖水平，并根据需要通过培养基添加或更换进行补充，以保持高于0.3g/L的水平。在转染后72小时，用DPBS洗涤细胞并使用1X Accutase溶液收获细胞。通过荧光流式细胞术来分析转染效率，通过ELISA和qPCR试验来分析病毒颗粒和病毒基因组滴度。图16A显示了在接种后72小时，在生物反应器内的细胞分布的均匀性。如从图16B中可看到的，收获过程从生物反应器回收了超过95％的细胞。细胞培养结果示于表3。

如上所述，本公开的实施方式可提供能够在相对小的和切实有效的占地面积中培养高密度细胞的填充床细胞培养基质和/或生物反应器。例如，上表3和4中的实施例中的60mm细胞培养基质具有约6870cm²的表面积。作为参考，康宁具有约1720cm²的表面积。表3和4的60mm直径的细胞培养基质可被容纳在比/>小的生物反应器中，但是仍然可以在收获时得到更高的细胞计数、更高的总基因组拷贝数(GC或病毒基因组(VG))/容器。图17A、17B和17C示出了从两个本公开的生物反应器容器中的细胞培养物得到的数据，生物反应器容器具有表3和4中的直径为60mm的基材，与来自的2D表面上的细胞培养物数据相比，虽然在本实施例的GC/cm²(图17C)低于/>但是通过更高的表面积得到了弥补。

图26根据一个或多个实施方式，示出了细胞培养系统520的更详细的示意图。系统520的基本构造类似于图12的系统400，其中，填充床生物反应器522具有容器，其包含细胞培养材料(例如，PET织造网)的填充床，以及单独的培养基调节容器524。然而，相较于系统400，系统520显示了系统的细节，包括传感器，用户界面和控制，以及用于培养基和细胞的各种进口和出口。根据一些实施方式，通过控制器524来控制培养基调节容器526，以提供适当的温度、pH、O₂和营养物质。虽然在一些实施方式中，生物反应器522也可通过控制器526来控制，但是在另一些实施方式中，生物反应器522在单独的灌注回路528中提供，其中，基于在生物反应器522的出口处或附近的O₂的检测，使用泵来控制通过灌注回路528的培养基流率。

示例性实施方案

以下是对本公开的主题的各个实施方案的方面的描述。每个方面可以包括所公开的主题的各种特征、特性或优点中的一种或多种。实施方案旨在例示所公开的主题的几个方面，并且不应被认为是对所有可能的实施方案的全面或详尽的描述。

方面1涉及一种细胞培养系统，其包括：生物反应器容器；以及

细胞培养基质，所述细胞培养基质被设置在生物反应器容器中并且被构造用于培养细胞；其中，所述细胞培养基质包括基材，所述基材包括第一侧，与第一侧相对的第二侧，将第一侧和第二侧分开的厚度，以及形成于基材中并且穿过基材厚度的多个开口，并且其中，所述多个开口被构造成允许细胞培养基、细胞或细胞产物中的至少一种流动通过基材的厚度。

方面2涉及方面1的细胞培养系统，其中，基材包括聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚环氧乙烷、聚吡咯和聚环氧丙烷中的至少一种。

方面3涉及方面1或方面2的细胞培养系统，其中，基材包括模制的聚合物格状片、3D打印的格状片和织造网片中的至少一种。

方面4涉及方面3的细胞培养系统，其中，基材包括含有一种或多种纤维的织造网。

方面5涉及方面4的细胞培养系统，其中，所述一种或多种纤维包含截面形状，所述截面形状是扁形(flat)、圆形、矩形或多边形中的至少一种。

方面6涉及方面4或方面5的细胞培养系统，其中，所述一种或多种纤维包含单纤丝纤维和多纤丝纤维中的至少一种。

方面7涉及方面4-6中任一方面的细胞培养系统，其中，所述一种或多种纤维包含第一纤维，其具有第一纤维直径，所述第一纤维直径为约50μm至约1000μm，约50μm至约600μm，约50μm至约400μm，约100μm至约325μm，或约150μm至约275μm。

方面8涉及方面7的细胞培养系统，其中，所述一种或多种纤维还包含第二纤维，其具有第二纤维直径，所述第二纤维直径为约50μm至约1000μm，约50μm至约600μm，约50μm至约400μm，约100μm至约325μm，或约150μm至约275μm。

方面9涉及方面8的细胞培养系统，其中，第二纤维直径与第一纤维直径不同。

方面10涉及方面1-7中任一方面的细胞培养系统，其中，多个开口包括约100μm至约1000μm，约200μm至约900μm，或约225μm至约800μm的开口直径。

方面11涉及方面10的细胞培养系统，其中，纤维直径为约250μm至约300μm，并且开口直径为约750μm至约800μm，或者其中，纤维直径为约270μm至约276μm，并且开口直径为约785μm至约795μm。

方面12涉及方面10的细胞培养系统，其中，纤维直径为约200μm至约230μm，并且开口直径为约500μm至约550μm，或者其中，纤维直径为约215μm至约225μm，并且开口直径为约515μm至约530μm。

方面13涉及方面10的细胞培养系统，其中，纤维直径为约125μm至约175μm，并且开口直径为约225μm至约275μm，或者其中，纤维直径为约150μm至约165μm，并且开口直径为约235μm至约255μm。

方面14涉及方面10-13中任一方面的细胞培养系统，其中，开口直径与纤维直径的比值为约1.0至约3.5，约1.25至约3.25，约1.4至约3.0，约1.5至约2.9，约1.5至约2.4，或约2.4至约2.9。

方面15涉及方面1-14中任一方面的细胞培养系统，其中，所述多个开口包括形状为正方形、矩形、菱形、长斜方形、圆形或椭圆形的开口。

方面16涉及方面1-15中任一方面的细胞培养系统，其中，所述多个开口以规则图案排列。

方面17涉及方面1-16中任一方面的细胞培养系统，其中，细胞培养基质包括单层基材。

方面18涉及方面1-17中任一方面的细胞培养系统，其中，细胞培养基质包括多层基材，所述多层基材至少包括第一基材层和第二基材层，其中，第一基材层包括第一侧以及与第一侧相对的第二侧，并且第二基材层包括第三侧以及与第三侧相对的第四侧，第二侧面向第三侧。

方面19涉及方面18的细胞培养系统，其中，多层基材被构造成使得第一基材层相对于第二基材层具有预定的对齐。

方面20涉及方面19的细胞培养系统，其中，多层基材被构造成使得第一基材层上的纤维相交处面向第二基材层中的开口。

方面21涉及方面19或方面20的细胞培养系统，其中，第一基材层中的开口与第二基材层中的开口至少部分重叠。

方面22涉及方面21的细胞培养系统，其中，第一基材层中的开口和第二基材层中的开口对齐。

方面23涉及方面18的细胞培养系统，其中，多层基材被构造成使得第一基材层相对于第二基材层具有随机的对齐。

方面24涉及方面1-23中任一方面的细胞培养系统，其中，所述细胞培养基质被设置在生物反应器容器中，使得培养基通过生物反应器容器的总体流动方向平行于或垂直于第一侧和第二侧。

方面25涉及方面1-24中任一方面的细胞培养系统，其中，细胞培养基质包括被随机填充到生物反应器容器中的多个基材。

方面26涉及方面1-25中任一方面的细胞培养系统，其中，生物反应器容器是填充床生物反应器。

方面27涉及方面1-26中任一方面的细胞培养系统，其中，生物反应器容器包括：设置在生物反应器容器内并且容纳细胞培养基质的培养空间，一个或多个开口，所述一个或多个开口被构造成向培养空间提供流体或者从培养空间移除流体。

方面28涉及方面27的细胞培养系统，其中，所述一个或多个开口包括进口和出口，所述进口被构造成向培养空间的内部提供流体，所述出口被构造成从生物反应器容器的培养空间移除流体。

方面29涉及方面28的细胞培养系统，其中，生物反应器容器包括：包含进口的第一端，与第一端相对并且包含出口的第二端，被设置在第一端与第二端之间的培养空间。

方面30涉及方面29的细胞培养系统，其中，细胞培养基质具有与培养空间的形状对应的形状。

方面31涉及方面1-30中任一方面的细胞培养系统，其中，细胞培养基质包括具有圆柱形卷构造的聚合物网材料。

方面32涉及方面31的细胞培养系统，其中，圆柱形卷的中心纵轴线平行于培养基的流动方向。

方面33涉及方面31或方面32的细胞培养系统，其中，圆柱形卷被构造成通过圆柱形卷的解开而在生物反应器容器中延展成培养空间的形状。

方面34涉及方面31-33中任一方面的细胞培养系统，其中，圆柱形卷被构造成当圆柱形卷处于收缩状态时被插入到培养空间中，当被设置在培养空间内时在培养空间内延展。

方面35涉及方面31-34中任一方面的细胞培养系统，其中，圆柱形卷和培养空间被构造成凭借聚合物网材料与培养空间壁之间的摩擦力将聚合物网材料在培养空间内保持就位。

方面36涉及方面34的细胞培养系统，其中，圆柱形卷被构造成通过生物反应器容器中的开口被插入到培养空间中。

方面37涉及方面36的细胞培养系统，其中，所述开口是生物反应器容器的进口和出口之一。

方面38涉及方面31-37中任一方面的细胞培养系统，其中，生物反应器容器包括位于培养空间内的基材支撑件，所述基材支撑件被构造成将细胞培养基质引导、对齐或稳固在培养空间内。

方面39涉及方面38的细胞培养系统，其中，基材支承件包括从第一端或第二端之一延伸向第一端或第二端中另一者的支撑构件，其中，圆柱形卷被构造成包围支撑构件，使得支撑构件与圆柱形卷的中心纵轴线平行。

方面40涉及方面1-39中任一方面的细胞培养系统，其中，生物反应器容器被构造成在细胞培养期间围绕生物反应器容器的中心纵轴线旋转。

方面41涉及方面40的细胞培养系统，其中，在细胞培养期间，中心纵轴线垂直于重力方向。

方面42涉及方面40或方面41的细胞培养系统，其中，所述细胞培养系统被构造成在生物反应器容器旋转期间，基材移动通过细胞培养流体。

方面43涉及方面40-42中任一方面的细胞培养系统，其中，细胞培养系统还包括旋转装置，其操作性地连接到生物反应器容器并且被构造成使生物反应器容器围绕中心纵轴线旋转。

方面44涉及方面1-43中任一方面的细胞培养系统，其中，细胞培养基质包括多个基材，所述多个基材包括具有不同几何结构的织造网，其中，不同几何结构在纤维直径、开口直径或开口几何结构中的至少一项上不同。

方面45涉及方面44的细胞培养系统，其中，具有不同几何结构的织造网基于生物反应器容器内的期望的流动特性以预定的布置被设置在生物反应器容器中。

方面46涉及方面45的细胞培养系统，其中，期望的流动特性包括以下中的至少一种：液体培养基均匀地灌注穿过细胞培养基质，和在整个细胞培养基质上分布着细胞生长。

方面47涉及方面45或方面46的细胞培养系统，其中，具有不同几何结构的织造网包括具有第一几何结构的第一网和具有第二几何结构的第二网，并且其中，预定的布置包括：相对于总体流动方向，第一网在第二网的上游。

方面48涉及方面47的细胞培养系统，其中，预定的布置包括第一网的堆叠体，其被设置在第二网的堆叠体的上游。

方面49涉及方面47或方面48的细胞培养系统，其中，预定的布置包括沿着总体流动方向成交替布置的第一网的堆叠体和第二网的堆叠体。

方面50涉及方面1-49中任一方面的细胞培养系统，其还包括用于收获贴壁细胞或细胞副产物的装置。

方面51涉及方面50的细胞培养系统，其中，细胞副产物包括蛋白质、抗体、病毒、病毒载体、病毒样颗粒(VLP)、微泡(Macrovesicle)、外泌体和多糖中的至少一种。

方面52涉及方面1-51中任一方面的细胞培养系统，其中，所述基材包括功能化表面，所述功能化表面经物理或化学改性以改善贴壁细胞对聚合物网材料的粘附。

方面53涉及前述任一方面的细胞培养系统，其中，所述细胞培养基质包括被构造成将培养基中的组分吸附或吸收到网表面上的表面。

方面54涉及方面1-53中任一方面的细胞培养系统，其中，所述细胞培养基质包括在聚合物网材料表面上的涂层，所述涂层被构造成促进贴壁细胞的粘附。

方面55涉及方面54的细胞培养系统，其中，细胞粘附于涂层。

方面56涉及方面54或方面55的细胞培养系统，其中，所述涂层是被构造成促进细胞附着于细胞培养基质的生物分子或合成的生物活性分子。

方面57涉及方面54-56中任一方面的细胞培养系统，其中，所述涂层是水凝胶、胶原、生物活性分子或肽、以及生物蛋白质中的至少一种。

方面58涉及方面53-56中任一方面的细胞培养系统，其中，功能化表面是经过等离子体处理的。

方面59涉及前述任一方面的细胞培养系统，其中，所述细胞包括以下中的至少一种：贴壁细胞、悬浮细胞、和松散贴壁细胞，其粘附于织造网。

方面60涉及前述任一方面的细胞培养系统，其还包括培养基调节容器，所述培养基调节容器被构造成向生物反应器容器的进口供应培养基。

方面61涉及一种细胞培养基质，其包括：基材，所述基材包括第一侧，与第一侧相对的第二侧，将第一侧和第二侧分开的厚度，以及形成于基材中并且穿过基材厚度的多个开口，其中，所述多个开口被构造成允许细胞培养基、细胞或细胞产物中的至少一种流动通过基材的厚度。

方面62涉及方面61的细胞培养基质，其中，基材包括聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚环氧乙烷、聚吡咯和聚环氧丙烷中的至少一种。

方面63涉及方面61或方面62的细胞培养基质，其中，基材包括模制的聚合物格状片、3D打印的格状片和织造网片中的至少一种。

方面64涉及方面63的细胞培养基质，其中，基材包括含有一种或多种纤维的织造网。

方面65涉及方面64的细胞培养基质，其中，所述一种或多种纤维包含截面形状，所述截面形状是扁形、圆形、矩形或多边形中的至少一种。

方面66涉及方面64或方面65的细胞培养基质，其中，所述一种或多种纤维包含单纤丝纤维和多纤丝纤维中的至少一种。

方面67涉及方面64-66中任一方面的细胞培养基质，其中，所述一种或多种纤维包含第一纤维，其具有第一纤维直径，所述第一纤维直径为约50μm至约1000μm，约50μm至约600μm，约50μm至约400μm，约100μm至约325μm，或约150μm至约275μm。

方面68涉及方面67的细胞培养基质，其中，所述一种或多种纤维还包含第二纤维，其具有第二纤维直径，所述第二纤维直径为约50μm至约1000μm，约50μm至约600μm，约50μm至约400μm，约100μm至约325μm，或约150μm至约275μm。

方面69涉及方面68的细胞培养基质，其中，第二纤维直径与第一纤维直径不同。

方面70涉及方面61-69中任一方面的细胞培养基质，其中，多个开口包括约100μm至约1000μm，约200μm至约900μm，或约225μm至约800μm的开口直径。

方面71涉及方面70的细胞培养基质，其中，纤维直径为约250μm至约300μm，并且开口直径为约750μm至约800μm，或者其中，纤维直径为约270μm至约276μm，并且开口直径为约785μm至约795μm。

方面72涉及方面70的细胞培养基质，其中，纤维直径为约200μm至约230μm，并且开口直径为约500μm至约550μm，或者其中，纤维直径为约215μm至约225μm，并且开口直径为约515μm至约530μm。

方面73涉及方面70的细胞培养基质，其中，纤维直径为约125μm至约175μm，并且开口直径为约225μm至约275μm，或者其中，纤维直径为约150μm至约165μm，并且开口直径为约235μm至约255μm。

方面74涉及方面70-73中任一方面的细胞培养基质，其中，开口直径与纤维直径的比值为约1.0至约3.5，约1.25至约3.25，约1.4至约3.0，约1.5至约2.9，约1.5至约2.4，或约2.4至约2.9。

方面75涉及方面1-74中任一方面的细胞培养基质，其中，所述多个开口包括形状为正方形、矩形、菱形、长斜方形、圆形或椭圆形的开口。

方面76涉及方面1-75中任一方面的细胞培养基质，其中，所述多个开口以规则图案排列。

方面77涉及方面1-76中任一方面的细胞培养基质，其中，细胞培养基质包括单层基材。

方面78涉及方面1-77中任一方面的细胞培养基质，其中，细胞培养基质包括多层基材，所述多层基材至少包括第一基材层和第二基材层，其中，第一基材层包括第一侧以及与第一侧相对的第二侧，并且第二基材层包括第三侧以及与第三侧相对的第四侧，第二侧面向第三侧。

方面79涉及方面78的细胞培养基质，其中，多层基材被构造成使得第一基材层相对于第二基材层具有预定的对齐。

方面80涉及方面79的细胞培养基质，其中，多层基材被构造成使得第一基材层上的纤维相交处面向第二基材层中的开口。

方面81涉及方面79或方面80的细胞培养基质，其中，第一基材层中的开口与第二基材层中的开口至少部分重叠。

方面82涉及方面81的细胞培养基质，其中，第一基材层中的开口和第二基材层中的开口对齐。

方面83涉及方面78的细胞培养基质，其中，多层基材被构造成使得第一基材层相对于第二基材层具有随机的对齐。

方面84涉及方面61-83中任一方面的细胞培养基质，其中，细胞培养基质包括多个基材，所述多个基材中的每个基材相对于所述多个基材中的其他基材成随机取向。

方面85涉及方面61-83中任一方面的细胞培养基质，其中，细胞培养基质包括成堆叠布置的多个基材。

方面86涉及方面85的细胞培养基质，其中，所述多个基材中的一个基材的第一侧和第二侧基本上平行于堆叠布置中的其他基材的第一侧和第二侧。

方面87涉及方面61-83中任一方面的细胞培养基质，其中，所述基材成圆柱形卷构造。

方面88涉及方面87的细胞培养基质，其中，圆柱形卷被构造成当被设置在培养腔室内时，其通过圆柱形卷的部分解开而在生物反应器容器内延展成培养腔室的形状。

方面89涉及方面88的细胞培养基质，其中，圆柱形卷被构造成当圆柱形卷处于收缩状态时被插入到培养空间中，并且当被设置在培养空间内时，其在培养空间内延展。

方面90涉及方面61-89中任一方面的细胞培养基质，其中，细胞培养基质包括多个基材，所述多个基材包括具有不同几何结构的织造网，其中，不同几何结构在纤维直径、开口直径或开口几何结构中的至少一项上不同。

方面91涉及方面90的细胞培养基质，其中，具有不同几何结构的织造网基于生物反应器容器内的期望的流动特性以预定的布置排列。

方面92涉及方面91的细胞培养基质，其中，期望的流动特性包括以下中的至少之一：液体培养基均匀地灌注穿过细胞培养基质，和在整个细胞培养基质上分布着细胞生长。

方面93涉及方面91或方面92的细胞培养基质，其中，具有不同几何结构的织造网包括具有第一几何结构的第一网和具有第二几何结构的第二网，并且其中，预定的布置包括：相对于细胞培养基穿过细胞培养基质的期望的总体流动方向，第一网在第二网的上游。

方面94涉及方面93的细胞培养基质，其中，预定的布置包括第一网的堆叠体，其被设置在第二网的堆叠体的上游。

方面95涉及方面93或方面94的细胞培养基质，其中，预定的布置包括沿着总体流动方向成交替布置的第一网的堆叠体和第二网的堆叠体。

方面96涉及方面61-95中任一方面的细胞培养基质，其中，细胞培养基质被构造用于培养和/或收获细胞、蛋白质、抗体、病毒、病毒载体、病毒样颗粒(VLP)、微泡(macrovesicle)、外泌体和多糖中的至少一种。

方面97涉及方面61-96中任一方面的细胞培养基质，其中，所述基材包括功能化表面，所述功能化表面经物理或化学改性以改进贴壁细胞对聚合物网材料的粘附。

方面98涉及方面61-97中任一方面的细胞培养基质，其中，所述细胞培养基质包括表面，所述表面被构造成将培养基中的组分吸附或吸收到网表面上。

方面99涉及方面61-98中任一方面的细胞培养基质，其中，所述细胞培养基质包括在聚合物网材料表面上的涂层，所述涂层被构造成促进贴壁细胞的粘附。

方面100涉及方面99的细胞培养基质，其中，细胞粘附于涂层。

方面101涉及方面99或方面100的细胞培养基质，其中，所述涂层是生物分子或合成的生物活性分子，其被构造成促进细胞附着于细胞培养基质。

方面102涉及方面99-101中任一方面的细胞培养基质，其中，所述涂层是水凝胶、胶原、生物活性分子或肽、以及生物蛋白质中的至少一种。

方面103涉及方面99-102中任一方面的细胞培养基质，其中，功能化表面是经过等离子体处理的。

方面104涉及方面61-103中任一方面的细胞培养基质，其中，所述细胞包括以下中的至少一种：贴壁细胞、悬浮细胞、和松散贴壁细胞，其粘附于织造网。

方面105涉及一种在生物反应器中培养细胞的方法，所述方法包括：提供生物反应器容器，所述生物反应器容器包括：在生物反应器容器内的细胞培养腔室，和细胞培养基质，所述细胞培养基质被设置在细胞培养腔室中并且被构造用于在其上培养细胞，所述细胞培养基质包括基材，所述基材包括第一侧，与第一侧相对的第二侧，将第一侧和第二侧分开的厚度，以及形成于基材中并且穿过基材厚度的多个开口；在细胞培养基质上接种细胞；在细胞培养基质上培养细胞；以及收获细胞培养的产物，其中，基材中的所述多个开口被构造成允许细胞培养基、细胞或细胞产物中的至少一种流动通过基材的厚度。

方面106涉及方面105的方法，其中，基材包括模制的聚合物格状片、3D打印的格状片和织造网片中的至少一种。

方面107涉及方面105或方面106的方法，其中，基材包括聚合物材料。

方面108涉及方面107的方法，其中，聚合物材料是聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚环氧乙烷、聚吡咯和聚环氧丙烷中的至少一种。

方面109涉及方面105-108中任一方面的方法，其中，所述接种包括使细胞附着于基材。

方面110涉及方面105-109中任一方面的方法，其中，所述接种包括将细胞接种物直接注射到细胞培养基质中。

方面111涉及方面110的方法，其中，所述细胞接种物通过生物反应器容器中的细胞接种物注射端口来注射。

方面112涉及方面110或方面111的方法，其中，所述细胞接种物的体积约等于细胞培养腔室的空隙体积。

方面113涉及方面110-112中任一方面的方法，其还包括在注射细胞接种物后，将细胞培养基灌注通过培养腔室。

方面114涉及方面105-113中任一方面的方法，其还包括在培养期间，向细胞供应细胞培养基和氧气中的至少一种。

方面115涉及方面114的方法，其中，细胞培养基的供应包括使细胞培养基流动通过细胞培养腔室和在基材上流动。

方面116涉及方面114或方面115的方法，其中，供应细胞培养基包括：提供培养基调节容器，所述培养基调节容器与生物反应器容器流体连接，并且将细胞培养基从培养基调节容器供应到生物反应器容器。

方面117涉及方面116的方法，其中，在培养期间或之后，从生物反应器容器回收至少一部分的培养基并且返回到培养基调节容器。

方面118涉及方面105-117中任一方面的方法，其还包括：控制细胞培养基流动到细胞培养腔室，其中，所述细胞培养基包括细胞、细胞培养营养物质或氧气中的至少一种。

方面119涉及方面105-118中任一方面的方法，其还包括：分析生物反应器容器内或者从生物反应器容器中输出的细胞培养基、细胞和/或细胞产物。

方面120涉及方面119的方法，其中，所述分析包括：测量pH₁、pO₁、[葡萄糖]₁、pH₂、pO₂、[葡萄糖]₂和流率中的至少之一，其中，pH₁、pO₁和[葡萄糖]₁在细胞培养腔室内测量，并且其中，pH₂、pO₂和[葡萄糖]₂在细胞培养腔室或生物反应器容器的出口处测量。

方面121涉及方面119或方面120的方法，其中，至少部分基于分析细胞培养基、细胞和/或细胞产物的结果，控制细胞培养基流动到细胞培养腔室。

方面122涉及方面120-121中任一方面的方法，其中，如果满足pH₂≥pH_2最小、pO₂≥pO_2最小和[葡萄糖]₂≥[葡萄糖]_2最小中的至少一项，则细胞培养基到达细胞培养腔室的灌注流率继续处于当前流率，其中pH_2最小、pO_2最小和[葡萄糖]_2最小是基于细胞培养系统的设计而预先确定的。

方面123涉及方面120-122中任一方面的方法，其中，如果目前的流率小于或等于细胞培养系统的预定最大流率，则增加灌注流率。

方面124涉及方面120-123中任一方面的方法，其中，如果目前的流率不小于或等于细胞培养系统的预定最大流率，则细胞培养系统的控制器重新评估以下中的至少之一：pH_2最小、pO_2最小和[葡萄糖]_2最小；pH₁、pO₁和[葡萄糖]₁；以及生物反应器容器的高度。

方面125涉及方面105-124中任一方面的方法，其中，在培养至少约24小时，至少约48小时，或者至少约72小时后，细胞具有超过约90％或者超过约95％的活力。

方面126涉及方面105-125中任一方面的方法，其中，所述细胞包括以下中的至少一种：贴壁细胞、悬浮细胞、和松散贴壁细胞，其粘附于细胞培养基质。

方面127涉及方面105-126中任一方面的方法，其中，细胞培养的产物包括细胞、蛋白质、抗体、病毒、病毒载体、病毒样颗粒(VLP)、微泡、外泌体和多糖中的至少一种。

方面128涉及方面127的方法，其中，细胞培养的产物包含细胞，所述细胞至少80％是活的，至少85％是活的，至少90％是活的，至少91％是活的，至少92％是活的，至少93％是活的，至少94％是活的，至少95％是活的，至少96％是活的，至少97％是活的，至少98％是活的，或者至少99％是活的。

方面129涉及一种生物反应器系统，其包括：细胞培养容器，其包括至少一个储器；和设置在所述至少一个储器中的细胞培养基质，所述细胞培养基质包括织造基材，所述织造基材具有多个交织纤维，所述纤维的表面被构造成在其上粘附细胞。

方面130涉及方面129的系统，其中，织造基材包括多个交织纤维的均匀布置。

方面131涉及方面129或方面130的系统，其中，织造基材包括设置在多个纤维之间的多个开口。

方面132涉及方面129-131中任一方面的系统，其中，所述多个纤维包括聚合物纤维。

方面133涉及方面132的系统，其中，聚合物纤维包括聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚环氧乙烷、聚吡咯和聚环氧丙烷中的至少一种。

方面134涉及方面129-133中任一方面的系统，其中，细胞培养基质包括多个织造基材。

方面135涉及方面134的系统，其中，所述多个基材中的每个基材包括第一侧，与第一侧相对的第二侧，将第一侧和第二侧分开的厚度，其中，所述多个开口穿过基材的厚度。

方面136涉及方面134或方面135的系统，其中，所述多个基材中的基材被布置成彼此相邻，使得基材的第一侧和第二侧之一与相邻基材的第一侧或第二侧中的另一者相邻。

方面137涉及方面134-136中任一方面的系统，其中，所述多个基材的至少一部分不被间隔件材料或屏障分离。

方面138涉及方面134-137中任一方面的系统，其中，所述多个基材的至少一部分相互物理接触。

方面139涉及方面129-138中任一方面的系统，其中，所述细胞培养容器包括至少一个端口，所述端口被构造成通过所述至少一个端口向所述至少一个储器供应材料或者从所述至少一个储器移除材料。

方面140涉及方面139的系统，其中，所述至少一个端口包括用于向所述至少一个储器供应材料的至少一个进口，以及用于从所述至少一个储器移除材料的至少一个出口。

方面141涉及方面140的系统，其中，所述材料包括培养基、细胞或细胞产物中的至少一种。

方面142涉及一种生物反应器系统，其包括：细胞培养容器，其包括第一端、第二端、以及在第一端与第二端之间的至少一个储器；和设置在所述至少一个储器中的细胞培养基质，所述细胞培养基质包括多个织造基材，每个织造基材包括多个交织纤维，并且纤维的表面被构造成供细胞粘附，

其中，所述生物反应器系统被构造成使材料在从第一端到第二端的流动方向上流动通过所述至少一个储器，其中，所述多个织造基材中的基材堆叠，以使得每个织造基材基本上平行于每个其他织造基材并且基本上垂直于流动方向。

方面143涉及方面142的系统，其中，所述基材中的每个基材包括第一侧，与第一侧相对的第二侧，将第一侧和第二侧分开的厚度，其中，所述多个开口穿过基材的厚度。

方面144涉及一种生物反应器系统，其包括：细胞培养容器，其包括第一端、第二端、以及在第一端与第二端之间的至少一个储器；和设置在所述至少一个储器中的细胞培养基质，所述细胞培养基质包括多个织造基材，每个织造基材包括多个交织纤维，并且纤维的表面被构造成供细胞粘附，

其中，所述生物反应器系统被构造成使材料在从第一端到第二端的流动方向上流动通过所述至少一个储器，其中，所述多个织造基材中的基材堆叠，以使得每个织造基材基本上平行于每个其他织造基材并且基本上平行于流动方向。

方面145涉及方面144的系统，其中，所述基材中的每个基材包括第一侧，与第一侧相对的第二侧，将第一侧和第二侧分开的厚度，其中，所述多个开口穿过基材的厚度。

方面146涉及一种生物反应器系统，其包括：细胞培养容器，其包括第一端，第二端，以及在第一端与第二端之间的至少一个储器；和设置在所述至少一个储器中的细胞培养基质，所述细胞培养基质包括织造基材，所述织造基材包括多个交织纤维，并且所述纤维的表面被构造成供细胞粘附，并且其中，所述至少一个储器和细胞培养基质中的至少之一被构造成在细胞培养期间围绕生物反应器容器的中心纵轴线旋转。

方面147涉及方面146的系统，其中，织造基材作为圆柱形基材被设置在所述至少一个储器中，所述圆柱形基材至少部分包围生物反应器容器的中心纵轴线。

方面148涉及方面146或方面147的系统，其中，生物反应器系统被构造成使材料在从第一端到第二端的流动方向上流动通过所述至少一个储器。

方面149涉及方面148的系统，其中，圆柱形基材的中心纵轴线平行于培养基的流动方向。

方面150涉及方面146-149中任一方面的系统，其中，圆柱形基材包括卷绕织造基材，其被构造成通过卷绕织造基材的展开而延展到接触所述至少一个储器的壁。

方面151涉及方面146-150中任一方面的系统，其中，卷绕织造基材被构造成在细胞培养容器中延展成所述至少一个储器的内部的形状。

方面152涉及方面151的系统，其中，卷绕织造基材被构造成，当卷绕织造基材处于收缩卷绕状态时被插入到培养空间中，当被设置在储器内时在储器内延展。

方面153涉及方面151或方面152的系统，其中，卷绕织造基材和储器被构造成，凭借织造基材与储器壁之间的摩擦力将织造基材在储器内基本上保持就位。

方面154涉及方面151-153中任一方面的系统，其中，卷绕织造基材被构造成通过细胞培养容器中的开口插入到储器中。

方面155涉及方面154的系统，其中，所述开口是细胞培养容器的进口和出口之一。

方面156涉及方面146-155中任一方面的系统，其中，细胞培养容器包括位于储器内的基材支撑件，所述基材支撑件被构造成将织造基材引导、对齐或稳固在培养空间内。

方面157涉及方面156的系统，其中，基材支撑件包括从第一端或第二端之一延伸向第一端或第二端中的另一者的支撑构件，其中，卷绕织造基材被构造成包围支撑构件的周围的至少一部分，使得支撑构件与卷绕织造基材的中心纵轴线平行。

方面158涉及方面146-157中任一方面的系统，其中，在细胞培养期间，中心纵轴线垂直于重力方向。

方面159涉及方面146-158中任一方面的系统，其中，生物反应器系统被构造成在细胞培养容器旋转期间，使基材移动通过细胞培养流体。

方面160涉及方面146-159中任一方面的系统，其中，生物反应器系统还包括旋转装置，其操作性地连接到细胞培养容器并且被构造成使细胞培养容器围绕中心纵轴线旋转。

方面161涉及一种细胞培养基质，其包括：织造基材，其包括交织的多个纤维以及设置在多个纤维之间的多个开口，其中，所述纤维各自包括被构造成供细胞粘附的表面。

方面162涉及方面161的基质，其中，纤维的表面被构造供细胞可释放地与其粘附。

方面163涉及方面161或方面162的基质，其中，所述多个纤维包括聚合物纤维。

方面164涉及方面163的基质，其中，聚合物纤维包括聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚环氧乙烷、聚吡咯和聚环氧丙烷中的至少一种。

方面165涉及方面161-164中任一方面的基质，其中，细胞培养基质还包括多个织造基材。

方面166涉及方面165的基质，其中，所述多个基材中的每个基材包括第一侧，与第一侧相对的第二侧，将第一侧和第二侧分开的厚度，其中，所述多个开口穿过基材的厚度。

方面167涉及方面165或方面166的基质，其中，所述多个基材中的基材被布置成彼此相邻，使得基材的第一侧和第二侧之一与相邻基材的第一侧或第二侧中的另一者相邻。

方面168涉及方面165-167中任一方面的基质，其中，所述多个基材的至少一部分不被间隔件材料或屏障分离。

方面169涉及方面165-168中任一方面的基质，其中，所述多个基材的至少一部分相互物理接触。

方面170涉及一种生物反应器系统，其包括：容器，所述容器包括培养基进口、培养基出口和细胞培养空间，所述细胞培养空间被设置在容器的内部并且与培养基进口和培养基出口流体连通且在培养基进口与培养基出口之间；其中，细胞培养空间包括细胞培养基材区以及设置在细胞培养基材区与培养基出口之间的间隔件区，并且其中，细胞培养空间被构造成容纳呈填充床构造的细胞培养基材。

方面171涉及方面170的生物反应器系统，其中，细胞培养基材包括方面61-104中任一方面的细胞培养基质。

方面172涉及方面170或方面171的生物反应器系统，其还包括设置在培养基进口与细胞培养空间之间的流率分配板。

方面173涉及方面170-172中任一方面的生物反应器系统，其还包括设置在细胞培养空间与间隔件区之间的填充床保持层。

方面174涉及方面170-173中任一方面的生物反应器系统，其还包括设置在培养基出口与细胞培养空间之间的间隔件插入件。

方面175涉及方面174的生物反应器系统，其中，间隔件插入件被设置在培养基出口与填充床保持层之间。

定义

“完全合成”或“全合成”是指细胞培养制品(例如微载体或者培养容器的表面)完全由合成源材料组成，并且不具有任何源自动物的或者动物来源的材料。本公开的完全合成的细胞培养制品消除了异种污染的风险。

“包括”、“包含”或类似术语是指包括但不限于，即包括性的而非排他。

根据本文的实施方式，“使用者”是指使用本文公开的系统、方法、制品或试剂盒的人，包括培养细胞以收获细胞或细胞产物的人，或者使用所培养和/或收获的细胞或细胞产物的人。

用来描述本公开实施方式的“约”，例如，修饰组合物中成分的量、浓度、体积、过程温度、过程时间、产率、流率、压力、粘度等数值及它们的范围或者组件尺寸等数值及它们的范围时，是指可能发生的数值变化，例如由以下引起的：用于制备材料、组合物、复合物、浓缩物、组件零件、制品或应用制剂的典型测定和处理程序；这些程序中的过失误差；用于实施方法的原料或成分的纯度、来源或制造方面的差异；以及类似的考虑因素。术语“约”还包括由于具有特定初始浓度或混合物的组合物或制剂陈化而不同的量，以及由于混合或加工具有特定初始浓度或混合物的组合物或制剂而不同的量。

“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情形可能发生，也可能不发生，而且该描述包括事件或情形发生的情况和事件或情形不发生的情况。

除非另外说明，否则，本文所用的不定冠词“一个”或“一种”及其对应的定冠词“该(所述)”表示至少一(个/种)，或者一(个/种)或多(个/种)。

可采用本领域普通技术人员熟知的缩写(例如，表示小时的“h”或“hrs”；表示克的“g”或“gm”；表示毫升的“mL”；表示室温的“rt”；表示纳米的“nm”以及类似缩写)。

在组分、成分、添加剂、尺度、条件和类似方面公开的具体和优选的数值及其范围仅用于说明，它们不排除其他限定数值或限定范围内的其他数值。本公开的系统、试剂盒和方法可包括本文所述的任何数值或者各数值、具体数值、更具体的数值和优选数值的任何组合，包括显义或隐义的中间数值和中间范围。

除非另有明确说明，否则不应将本文中规定的任何方法解释为要求按特定顺序执行其步骤。因此，如果方法权利要求没有实际上陈述步骤遵循一定的顺序，或者在权利要求或说明书中没有以其他方式具体说明步骤将被限制为特定顺序，则决不意图推断任何特定顺序。

对本领域的技术人员显而易见的是，在不脱离本公开的实施方式的精神或范围的情况下，可以进行各种修改和变动。因为本领域技术人员可以结合实施方式的精神和实质，对所公开的实施方式进行各种改良、组合、子项组合和变化，因此，应认为本公开的实施方式包括所附权利要求书范围内的全部内容及其等同内容。

如上所述，一个或多个实施方式的多个方面包括，培养基进口被构造成在细胞培养之前或期间，向内部腔室供应细胞、细胞培养基和其他组分中的至少一种，并且培养基出口被构造成在细胞培养期间或之后，从内部腔室收回细胞、细胞培养基和细胞副产物中的至少一种。此外，如本文所讨论的，为了进行生物反应器内容物的收获过程，培养基出口被构造成在收获操作期间，向间隔件区供应加压流体，并且培养基进口被构造成在收获操作期间，从内部腔室收回细胞、细胞培养基和细胞副产物中的至少一种。所述生物反应器系统被构造成用加压流体经由培养基出口填充内部腔室，从而迫使细胞、细胞培养基和细胞副产物中的至少一种通过培养基进口排出。因此，间隔件区在本文中也可以称为收获空间，这意味着它是可以通过一些加压方式而被加压或填充流体的空间或体积，以执行至少一部分收获程序。对生物反应器的填充床上方的出口和间隔件区进行加压，以允许将收获溶液以恒定的高流率输送通过填充床，从而从生物反应器回收细胞或细胞产物。本领域技术人员可以基于生物反应器的阻力来计算所需的压力，以获得所需的高流率的收获溶液。

本文公开的一些实施方式在间隔件区或收获空间内提供了可拆卸的间隔件。在一些实施方式中，如图18A和18B所示，可以在培养基出口和细胞培养基之间设置销区2000。销区2000可以被表征为基本上平行于生物反应器流动方向的纵轴线延伸的一个或多个构件，或者在从细胞培养基延伸到出口的方向上延伸。图18B显示了图18A中生物反应器容器和销区的一部分的放大图。销区可以通过在生物反应器容器或培养基出口的一端与细胞培养基材之间产生分离，以至少部分地限定收获空间。销区还可用于将细胞培养基材保持在生物反应器容器的内部腔室内的适当位置。在一些实施方式中，如图18A和18B所示，销区可以与培养基出口附近的流体出口板集成或联接。在图18B中，可以看到流体出口板上的孔。换言之，流体出口板可用于收集来自内部腔室内的流体并将其输送到培养基出口，同时还包括销区。应该理解，当通过容器的流向逆转时，例如在收获过程中，流体出口板也可以相反地作为流体入口板有效发挥作用，使通过培养基出口进入生物反应器容器的流体分配在内部腔室和/或细胞培养基材的宽度上，以进行有效收获。还应注意的是，与本文所示和描述的一些其他实施方式相比，图18A和18B中的收获空间在高度上相对较小。在一些应用中只需要很小的空间，只要该空间可以容纳一些收获溶液，然后在收获过程中对其加压并将其输送通过细胞培养基材。

在上述一些实施方式中，显示收获空间在生物反应器容器内在细胞培养基材和培养基出口之间。这示意性地显示为图19A中的收获空间2010。然而，实施方式不限于此构造。例如，在图19B中，收获空间2020设置在容纳细胞培养基材的生物反应器容器的内部腔室的外部，但与培养基出口流体连接。因此，在收获空间2020中被加压的收获溶液可以经由流体连接器，例如软管，通过培养基出口被输送到细胞培养基材，以进行收获。应理解，与细胞培养基材分离的收获空间2020可以意味着收获空间完全从生物反应器容器中移出，或者简单地容纳在多隔室生物反应器容器中与细胞培养基材分离的隔室中。收获空间的单独容纳在减小生物反应器容器的尺寸和复杂性以及减小其空隙体积方面是有利的，其可以是一次性单元并且可以预先装载细胞培养材料。由此减少的尺寸和复杂性可以限制由消耗品或一次性部分产生的废物，还可以允许更灵活地布置系统的各种部件。此外，通过将收获空间容纳在单独的容器中，可以更容易地将收获溶液与细胞培养网保持分离直到所需的时间，可以更容易控制收获溶液的条件，并且更容易实现收获溶液的加压，而不会在收获发生之前对细胞培养基材、细胞或的其他组件产生不利影响。即使在细胞培养空间外部，也可以利用生物反应器系统的正常流体再循环路径来维持收获空间。

根据一些实施方式，收获溶液可以含有一种或多种有助于收获细胞和/或将细胞从细胞培养基材中释放的组分。示例包括或/>但本领域普通技术人员将理解可使用的其他收获剂。

更多实施例

如本文所述，本公开的实施方式包括生物反应器及其使用方法，其可以实现均匀的流体流动、细胞接种、细胞生长和培养以及细胞收获。例如，图20显示了根据本公开的一个实施方式的生物反应器。生物反应器包括固定床细胞培养基材，该基材包括堆叠布置的织造PET网层。应注意，细胞培养基材的各层之间没有其他流体流动装置或其他物理结构分隔。所得到的固定床是均匀一致的床，能够实现优异的性能，并且具有2.5m²的表面积。在图20的生物反应器中，在细胞培养基材上接种细胞并进行培养。然后，在培养期之后，从填充床的三个不同区域(顶部、中间和底部)移除基材层。使用GFP染色法计算这些移除的层上的细胞转染效率，以观察填料床不同区域的代表性细胞数。如图20所示，从生物反应器的顶部(95％GFP+，MFI:2579)、中间(97％GFP+、MFI:2237)和底部(96％GFP+和MFI:2018)收获的细胞的转染效率非常一致。得到的平均计数为96％的GFP+和2423的MFI。

图21显示了根据一个或多个实施方式，在多个示例运行和生物反应器尺寸上一致的AAV2-GFP载体产率/cm²。具体地，这三种尺寸包括0.2m²、0.7m²和2.5m²的细胞培养基材表面积。通过总体VG/cm²测量，每种尺寸产生一致的％GFP+细胞和一致的病毒载体产率。

图22显示了与其他平台相比，根据本公开的实施方式A的AAV2-GFP VG产率/cm²的示例。如图20所示，实施方式A的生物反应器具有2.5m²的细胞培养基材表面积。用于比较的另外两个平台包括2.65m²的市售固定床反应器和来自的具有2D细胞生长表面的T75烧瓶。每个平台进行三次实验。与2.65m²的平台相比，实施方式A显示出AAV2-GFP VG/cm²的大幅增加，与其它平台相比增加了超过二十倍。

图23显示了与图22中的其他平台相比，根据本公开的实施方式A的AAV2-GFP VG产率/容器的示例。同样地，与2.65m²平台相比，实施方式A显示出增加了超过20倍，并且与T75烧瓶相比增加了超过330倍。

图24a显示了根据本公开的一个实施方式的生物反应器中的AAV2-GFP病毒载体生产，整个方案使用FBS/DMEM培养基，而图24B显示了根据本公开的一个实施方式的生物反应器中的AAV2-GFP病毒载体生产，其中HEK293T生长阶段使用FBS/DMEM培养基，转染和生产阶段使用无血清DMEM培养基。

图25显示了根据本公开的实施方式，对于不同表面积尺寸的细胞培养基，每个容器的总体VG的示例。显示了两种条件下转染后72小时GFP+细胞的流式细胞分析结果和AAV2-GFP产率。这些数据显示了在本公开的实施方式中使用无血清培养基的有效性。

如本文所示，本公开的实施方式提供了细胞培养生物反应器、系统和相关方法，其能够使流体均匀流过所示的固定床。实施方式已经证明了均匀的HEK293生长和有效的活细胞收获。实施方式已经证明了在多次运行和生物反应器尺寸上是一致的>90％的转染效率和～2.0E+10AAV2-GFP载体产率/cm²，证实了设计的可缩放性。在并排评估中，本公开的实施方式显示，与另一固定床反应器相比，AAV2-GFP VG产率/cm²高出超过20倍，与T75烧瓶相比，VG产率/cm²与之相当。此外，本公开的实施方式证明了在无血清DMEM培养基中进行转染和病毒载体生产的可行性，而对病毒载体产率没有显著影响。

本发明实施方式的其他优点也是显而易见的。例如，在一些实施方式中，细胞培养基材在生物反应器内部腔室的直径上不间断地延伸。这比替代方案中采用的复杂流道和路径更简单。通过固定床的流动是单向的，或者可以被表征为平推流，这再次简化了操作并提高了性能，包括例如细胞接种和收获。因此，填料床的所有层都以相同的效率进行灌注，培养基通过或穿过层的流动或通量也是相同的。

Claims (24)

1.一种固定床生物反应器系统，其包括：

容器，所述容器包括培养基进口、培养基出口，以及设置在培养基进口与培养基出口之间并且与培养基进口和培养基出口流体连通的内部腔室；

细胞培养基材，所述细胞培养基材在内部腔室中以填充床构造被设置在培养基进口与培养基出口之间，其包括呈堆叠布置的多个多孔盘片；以及

收获空间，所述收获空间被构造成容纳流体，所述收获空间与所述内部腔室流体连通，

其中，所述多个多孔盘片中的每个多孔盘片包括表面，所述表面被构造成在该表面上培养细胞。

2.如权利要求1所述的固定床生物反应器系统，其还包括间隔件，所述间隔件在内部腔室中被设置在细胞培养基材与培养基出口之间，所述间隔件被构造成使细胞培养基材与培养基出口间隔开一段距离，以及将细胞培养基材限制在内部腔室的细胞培养区内。

3.如权利要求2所述的固定床生物反应器系统，其中，所述间隔件包括销区，所述销区包括在平行于所述多孔盘片的堆叠布置的高度的方向上延伸的多个销。

4.如权利要求1-3中任一项所述的固定床生物反应器系统，其中，所述收获空间设置在所述容器内部，在所述培养基出口和所述细胞培养基材之间。

5.如权利要求1-3中任一项所述的固定床生物反应器系统，其中，所述收获空间设置在所述容器外部，并且流体连接到所述容器的培养基出口。

6.如前述权利要求中任一项所述的固定床生物反应器系统，其中，所述多个多孔盘片中的每个多孔盘片包括第一侧，与第一侧相对的第二侧，将第一侧和第二侧分开的盘片厚度，以及形成于盘片中并且穿过盘片厚度的多个开口，

其中，所述多个开口被布置成允许细胞培养基、细胞或者细胞副产物中的至少一种流动通过细胞培养基材。

7.如前述权利要求中任一项所述的固定床生物反应器系统，其还包括设置在培养基进口与细胞培养基材之间的进口分配板，所述进口分配板被构造成在细胞培养基材的区域上分配从培养基进口进入内部腔室的流体。

8.如前述权利要求中任一项所述的固定床生物反应器系统，其还包括设置在细胞培养基材与培养基出口之间的出口分配板。

9.如权利要求8所述的固定床生物反应器系统，其中所述销区与所述出口分配板整合成一体。

10.如权利要求9所述的固定床生物反应器系统，其中，所述收获空间被构造成对所述收获空间内的流体加压，并将加压的流体引导通过流体路径至所述培养基出口，以从所述容器收获内容物。

11.如前述权利要求中任一项所述的固定床生物反应器系统，其中，所述生物反应器被构造成产生至少约1×10⁸、至少约1×10⁹、至少约1×10¹⁰或至少约2×10¹⁰个病毒基因组/cm²细胞培养基材。

12.如前述权利要求中任一项的固定床生物反应器系统，其中，所述生物反应器系统被构造成实现大于约90％的病毒转染效率，或大于约95％的病毒转染效率。

13.如权利要求12所述的固定床生物反应器系统，其中所述生物反应器系统被构造成在整个细胞培养基材中实现均匀的转染效率。

14.如权利要求13所述的固定床生物反应器系统，其中，所述均匀转染包括在整个细胞培养基材堆叠构造的各个多孔盘片上实现约±10％、约±8％、约±6％、约±4％、约±2％或约±1％内的转染效率差异。

15.如权利要求1所述的固定床生物反应器系统，其中，所述多个多孔盘片包括多个织造网层。

16.如权利要求15所述的固定床生物反应器系统，其中，所述多个织造网层中的每一层具有限定的、基本均匀的孔阵列。

17.如权利要求15所述的固定床生物反应器系统，其中，所述多个织造网层中的每一层包括多个交织纤维，所述多个交织纤维包括在第一方向上彼此平行延伸的第一组纤维，以及在第二方向上彼此平行延伸的第二组纤维。

18.如权利要求17所述的固定床生物反应器系统，其中，第一方向基本上垂直于第二方向。

19.如前述权利要求中任一项所述的固定床生物反应器系统，其中，培养基进口被构造成在细胞培养之前或期间，向内部腔室供应细胞和细胞培养基中的至少一种，并且培养基出口被构造成在细胞培养期间或之后，从内部腔室收回细胞、细胞培养基和细胞副产物中的至少一种。

20.如权利要求19所述的固定床生物反应器系统，其中，所述生物反应器系统被构造成在收获操作期间将加压的流体从收获空间供应到细胞培养基材，并且所述培养基进口被构造成在收获操作期间从内部腔室收回细胞、细胞培养基和细胞副产物中的至少一种。

21.如权利要求20所述的固定床生物反应器系统，其中，所述生物反应器系统被构造成用加压流体经由培养基出口填充内部腔室，从而迫使细胞、细胞培养基和细胞副产物中的至少一种通过培养基进口排出。

22.如前述权利要求中任一项所述的固定床生物反应器系统，其中，所述多个多孔盘片包括50至1000个多孔盘片。

23.如权利要求22所述的固定床生物反应器系统，其中，所述多个多孔盘片包括100至500个多孔盘片。

24.如权利要求1所述的固定床生物反应器系统，其中，所述多个多孔盘片中的每个盘片包括纤维，纤维之间限定了孔，所述纤维具有约50μm至约1000μm的直径，并且所述孔具有约100μm至约1000μm的直径。