JP2024518158A - 細胞の培養及び採取のための固定床バイオリアクター及び関連する方法 - Google Patents

Abstract

培地入口（３１０）、培地出口（３１２）、及び培地入口と培地出口との間に配置され、それらと流体連通している内部空洞を備えた容器；充填床構成で培地入口と培地出口の間の内部空洞に配置された細胞培養基材であって、複数の多孔質ディスク（３０８）が積層配置された細胞培養基材；並びに、流体を保持するための採取容積（２０１０，２０２０）であって、内部空洞と流体連通している採取容積を含む、固定床バイオリアクターシステム（３００）が提供され、ここで、複数の多孔質ディスクの各々が、その上で細胞を培養するように構成された表面を含む。採取容積は容器の内側にあっても外側にあってもよい。

Description

関連出願の相互参照

本出願は、その内容が依拠され、その全体がここに参照することによって本願に援用される、２０２１年５月３日出願の米国仮特許出願第６３／１８３，３８６号の米国法典第３５編特許法１１９条に基づく優先権の利益を主張する。

本開示は、概して、細胞を培養するための装置、システム、及び方法に関する。特に、本開示は、細胞培養基材、そのような基材を組み込んだ固定床バイオリアクター容器及びシステム、並びにモジュール式で拡張可能な基材、容器、及びシステムを含む、そのような基材及びバイオリアクターを使用して細胞を培養する方法に関する。

バイオプロセス産業では、ホルモン、酵素、抗体、ワクチン、及び細胞療法の生産を目的として、細胞の大規模培養が行われる。バイオプロセスで用いられる細胞のかなりの部分は足場依存性であり、これは、細胞が増殖し機能するために接着する表面を必要とすることを意味する。従来、接着細胞の培養は、Ｔフラスコ、ペトリ皿、細胞工場、セルスタック容器、ローラボトル、及びＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）容器など、多数の容器形式のうちの１つに組み込まれた二次元（２Ｄ）細胞接着表面上で行われる。これらの手法には、治療薬又は細胞の大規模生産を可能にするのに十分に高い細胞密度を達成することが困難であることを含む、重大な欠点を有する可能性がある。

培養細胞の体積密度を増加させるための代替方法が提案されている。これらには、撹拌タンク内で行われるマイクロキャリア培養が含まれる。この手法では、マイクロキャリアの表面に接着した細胞は一定のせん断応力にさらされ、その結果、増殖及び培養性能に重大な影響を及ぼす。高密度細胞培養システムの別の例は、中空繊維バイオリアクターであり、ここで、細胞は、繊維間空間で増殖するときに大きい三次元凝集体を形成する可能性がある。しかしながら、栄養素が不足すると、細胞の増殖及び性能は著しく阻害される。この問題を軽減するために、これらのバイオリアクターは小型に作られており、大規模製造には適していない。

足場依存性細胞の高密度培養システムの別の例は、充填床バイオリアクターシステムである。例えば、細胞を捕捉するための支持体又はマトリクスシステムの充填床を含む充填床バイオリアクターシステムは、以前に特許文献１から３に開示されている。充填床マトリクスは通常、基材としての多孔質粒子又はポリマーの不織布マイクロファイバーで作られる。このようなバイオリアクターは、再循環フロースルーバイオリアクターとして機能する。このようなバイオリアクターに関する重大な問題の１つは、充填床内の細胞分布が不均一であることである。例えば、充填床は、デプスフィルタとして機能し、主に入口領域で細胞が捕捉され、その結果、接種ステップ中に細胞分布の勾配が生じる。加えて、繊維がランダムに充填されていることにより、充填床の断面の流動抵抗及び細胞捕捉効率は均一ではない。例えば、培地は、細胞充填密度が低い領域では速く流れ、抵抗が高い領域では、捕捉された細胞の数が多いことから、ゆっくりと流れる。これにより、体積細胞密度が低い領域には栄養素及び酸素がより効率的に供給され、細胞密度が高い領域では次善の培養条件で維持される、チャネリング効果が生じる。従来技術に開示されている充填床システムの別の重大な欠点は、培養プロセスの最後にインタクトな生細胞を効率的に回収することができないことである。特許文献４には、細胞採取ステップ中の充填床からの細胞回収効率を向上させるためのバイオリアクターの設計が開示されている。これは、充填床マトリクスを緩め、充填床粒子を撹拌して、多孔性マトリクスを衝突させ、それによって細胞を分離することに基づいている。しかしながら、この手法は手間がかかり、重大な細胞損傷を引き起こす可能性があるため、全体的な細胞生存率が低下する。

ローラボトルには、取り扱いが容易であること、接着面上の細胞を監視することができることなど、幾つかの利点がある。しかしながら、生産の観点から見ると、主な欠点は、ローラボトルの構成が製造床面積の大きい面積を占める一方で、容積に対する表面積の比率が低いことである。ローラボトル形式で接着細胞が利用できる表面積を増加させるために、さまざまな手法が用いられている。幾つかの解決策は市販の製品に実装されているが、ローラボトルの生産性をさらに向上させるにはまだ改善の余地が残っている。従来、ローラボトルはブロー成形プロセスによって単一の構造として製造されている。このような製造の簡素化により、バイオプロセス産業におけるローラボトルの経済的な実行可能性が可能となる。細胞培養に利用可能な表面積を増加させるためのローラボトルの幾つかの変更は、製造プロセスを変更することなく実現できるが、得られる変更したローラボトルの表面積はわずかしか増加しない。ローラボトル設計の他の変更により、製造プロセスに大幅な複雑性が加わり、バイオプロセス業界では経済的に実行不可能となる。したがって、その製造に同じブロー成形プロセスを使用しつつ、増加した表面積とバイオプロセスの生産性を備えたローラボトルを提供することが望ましい。

早期臨床治験用のウイルスベクターの製造は既存のプラットフォームでも可能であるが、後期の商業生産規模に到達するためには、高品質の製品をより多く生産することができるプラットフォームが必要とされている。

米国特許第４，８３３，０８３号明細書 米国特許第５，５０１，９７１号明細書 米国特許第５，５１０，２６２号明細書 米国特許第９，２７３，２７８号明細書

均一な細胞分布、容易に達成可能な、収量の増加、及び生細胞の採取が可能な高密度形式での細胞の培養を可能にする、細胞培養マトリクス、充填床バイオリアクター容器、及びバイオリアクターシステム、並びに方法が必要とされている。加えて、研究からプロセス開発、製造規模など、さまざまなスケールでのさまざまなユースケースのニーズに対応するために、生産レベルを調整可能なスケーラブルな解決策を可能にするようなマトリクス、容器、システム、及び方法が必要とされている。

本開示の一実施形態によれば、固定床バイオリアクターシステムが提供される。バイオリアクターシステムは、培地入口、培地出口、及び培地入口と培地出口との間に配置され、かつそれらと流体連通している内部空洞を備えた容器を含む。バイオリアクターシステムは、充填床構成で培地入口と培地出口の間の内部空洞に配置された細胞培養基材をさらに含み、該細胞培養基材は積層配置された複数の多孔質ディスクを含む。複数の多孔質ディスクの各々は、その上で細胞を培養するための表面を有する。内部空洞は、細胞培養セクションとスペーサセクションとを含み、細胞培養基材が細胞培養セクションを画定し、スペーサセクションは細胞培養セクションと培地出口との間に配置される。

１つ以上の実施形態の態様は、細胞培養基材と培地出口との間の内部空洞に配置され、それらの間にスペーサセクションを画定するスペーサをさらに含む。スペーサは、細胞培養基材を培地出口から一定の距離に配置し、細胞培養基材を内部空洞の細胞培養セクションに閉じ込める。スペーサは、スペーサセクションの長さに平行な方向に延びる複数のスペーサ部材を含むことができる。幾つかの実施形態のさらなる態様として、充填床保持器を細胞培養基材とスペーサとの間に配置することができ、充填床保持器は細胞培養基材の上部に構造的支持を提供する。充填床保持器は、多孔質であり、実質的に剛性であり、内部空洞の幅のかなりの部分にわたって延在することができる。

１つ以上の実施形態のさらなる態様では、複数の多孔質ディスクの各ディスクは、第１の面、該第１の面とは反対側の第２の面、第１の面と第２の面とを分離するディスク厚さ、及びディスク内に形成された、ディスク厚さを貫通する複数の開口部を有する。複数の開口部は、細胞培養培地、細胞、又は細胞副生成物のうちの少なくとも１つが細胞培養基材を通って流れることを可能にするように配置される。

該システムは、培地入口と細胞培養セクションとの間に配置された入口分配プレートをさらに含むことができる。入口分配プレートは、培地入口から内部空洞に入る流体を細胞培養基質の領域全体に分配することができる。該システムは、スペーサセクションと培地出口との間に配置された出口分配プレートをさらに含むことができる。

１つ以上の実施形態の一態様として、上記バイオリアクターシステムは、細胞培養基材とスペーサセクションとの間に配置された充填床保持器をさらに含み、該充填床保持器は細胞培養基材の上部に構造的支持を提供するように構成される。充填床保持器は、多孔質であり、実質的に剛性であり、内部空洞の幅のかなりの部分にわたって延在することができる。該システムは、充填床保持器と培地出口との間の内部空洞内に配置され、それらの間にスペーサセクションを画定するスペーサをさらに含むことができる。スペーサは、細胞培養基材を培地出口から一定の距離に配置し、細胞培養基材を内部空洞の細胞培養セクションに閉じ込める。充填床保持器は、例えば、剛性の格子構造とすることができる。

１つ以上の実施形態の追加の態様として、スペーサは、調節可能な長さを有し、細胞培養セクションと培地出口との間のさまざまな所定の距離を維持するように調節可能であり、それにより、細胞培養セクションに収容することができる細胞培養基材内の多孔質ディスクの数を変化させることができる。

１つ以上の実施形態のさらなる態様では、該システムは、異なる長さの複数の取り外し可能なスペーサを含み、該複数の取り外し可能なスペーサの各々は、細胞培養セクションと培地出口との間に、各他のスペーサによって維持される距離とは異なる所定の距離を維持するためにスペーサセクション内に配置することができ、それにより、細胞培養セクションに収容することができる細胞培養基材内の多孔質ディスクの数を、スペーサセクションに配置されたスペーサの長さに基づいて変化させることができる。

幾つかの実施形態の一態様では、該システムは、細胞培養基材と培地入口との間に配置された少なくとも１つの多孔質スペーサディスクをさらに含む。少なくとも１つの多孔質スペーサディスクはスペーサディスク細孔径を含むことができ、複数の多孔質ディスクの各々は、スペーサディスク細孔径がディスク細孔径より大きくなるようにディスク細孔径を有することができる。少なくとも１つの多孔質スペーサディスクは、第１のスペーサディスク細孔径を有する第１のディスクと、第２のスペーサディスク細孔径を有する第２のディスクとを含むことができ、第１のスペーサディスク細孔径は第２のスペーサディスク細孔径とは異なる。

幾つかの実施形態の一態様として、複数の多孔質ディスクは複数の織物メッシュ層を含む。複数の織物メッシュ層の各々は、画定された、実質的に均一な細孔のアレイを有する。複数の織物メッシュ層の各層は複数の織り混ぜられた繊維を含み、該複数の織り混ぜられた繊維は、第１の方向に互いに平行に走る第１の繊維群と、第２の方向に互いに平行に走る第２の繊維群とを含む。第１の方向は、第２の方向に対して実質的に垂直でありうる。幾つかの実施形態では、メッシュの複数の織り混ぜられた繊維は、第１の繊維群と第２の繊維群とからなる。

１つ以上の実施形態の一態様として、培地入口は、細胞培養前又は細胞培養中に細胞及び細胞培養培地の少なくとも一方を内部空洞に供給するように構成され、培地出口は、細胞培養中又は細胞培養後に細胞、細胞培養培地、及び細胞副生成物のうちの少なくとも１つを内部空洞から取り出すように構成される。培地出口は、採取動作中にスペーサセクションに加圧流体を供給するように構成され、培地入口は、採取動作中に内部空洞から細胞、細胞培養培地、及び細胞副生成物のうちの少なくとも１つを取り出すように構成される。バイオリアクターシステムは、培地出口を介して内部空洞を加圧流体で満たし、細胞、細胞培養培地、及び細胞副生成物のうちの少なくとも１つを培地入口を通じて押し出すように構成される。

１つ以上の実施形態の態様は、５０枚から１０００枚の多孔質ディスク、又は１００枚から５００枚の多孔質ディスクである複数の多孔質ディスクを含む。複数の多孔質ディスクは、ディスクあたり約１．００×１０^７から約２．００×１０^７個の細胞平均密度まで細胞を培養することができる。複数の多孔質ディスクの各ディスクは、間に細孔を画定する繊維を有することができ、該繊維は約５０μｍから約１０００μｍの直径を有し、細孔は約１００μｍから約１０００μｍの直径を有する。

本開示の１つ以上の実施形態による、細胞培養基材の三次元モデルの斜視図 図１Ａの基材の二次元平面図 図１Ｂにおける基材の線Ａ－Ａに沿った断面図 幾つかの実施形態による、第１の幾何学形状を有する細胞培養基材の一例の写真 幾つかの実施形態による、第２の幾何学形状を有する細胞培養基材の一例の写真 幾つかの実施形態による、第３の幾何学形状を有する細胞培養基材の一例の写真 １つ以上の実施形態による多層細胞培養基材の斜視図 図３Ａの多層細胞培養基材の平面図 １つ以上の実施形態による、図３Ｂの多層細胞培養基材の線Ｂ－Ｂに沿った断面図 １つ以上の実施形態による、図４の多層細胞培養基材の線Ｃ－Ｃに沿った断面図 １つ以上の実施形態による、多層細胞培養マトリクスを備えた充填床細胞培養システムの概略図 １つ以上の実施形態による、充填床細胞培養システムの断面図 １つ以上のさらなる実施形態による、充填床細胞培養システムの断面図 １つ以上の実施形態による、バイオリアクター容器の構成要素例の写真 １つ以上の実施形態による、図７Ａ～８の細胞培養システムの流れ分配プレートの平面図 １つ以上の実施形態による、図７Ａ～８の細胞培養システムの充填床保持器の平面図 １つ以上の実施形態による、図７Ａ～８の細胞培養システムのスペーサの斜視図 １つ以上の実施形態による、第１の高さを有するスペーサ及び第１の高さ又は厚さの細胞培養マトリクスを備えた細胞培養システムの断面図 １つ以上の実施形態による、第２の高さを有するスペーサ及び第２の高さ又は厚さの細胞培養マトリクスを備えた細胞培養システムの断面図 １つ以上の実施形態による、第３の高さを有するスペーサ及び第３の高さ又は厚さの細胞培養マトリクスを備えた細胞培養システムの断面図 １つ以上の実施形態による、充填床細胞培養システムを組み込んだバイオプロセシングシステムの概略図 １つ以上の実施形態による、細胞採取プロセスの３つの段階における充填床細胞培養システムの断面図 １つ以上の実施形態による、細胞培養システム上で細胞を培養するためのプロセスフロー図 １つ以上の実施形態による、細胞培養システムの灌流流量を制御するための動作のプロセスフロー図 １つ以上の実施形態による、細胞が第１の細胞播種密度で播種された、細胞培養基材上の染色されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の顕微鏡写真 １つ以上の実施形態による、細胞が第２の細胞播種密度で播種された、細胞培養基材上の染色されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の顕微鏡写真 １つ以上の実施形態による、細胞が第３の細胞播種密度で播種された、細胞培養基材上の染色されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の顕微鏡写真 １つ以上の実施形態による、充填床バイオリアクター内で細胞を培養した後、細胞培養基材上で細胞採取操作を行った、染色された細胞を含む細胞培養マトリクスのディスクの写真 １つ以上の実施形態による、充填床バイオリアクター内で細胞を培養した後、及び細胞培養基材上で細胞採取操作を行った後の、染色された細胞を含む細胞培養マトリクスのディスクの写真 ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋ（登録商標）を使用して培養された細胞と比較した、本開示の実施形態による２つの例について採取された総細胞の実験結果を示す棒グラフ ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋ（登録商標）を使用して培養された細胞と比較した、本開示の実施形態による２つの例についての容器あたりの総ゲノムコピーの実験結果を示す棒グラフ 本開示の実施形態、ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋ（登録商標）を使用して培養された細胞と比較した、本開示の実施形態による２つの例についての表面積あたりのゲノムコピーの実験結果を示す棒グラフ １つ以上の実施形態による、ピンフィールドを備えたバイオリアクター容器の概略的な断面図 １つ以上の実施形態による、図１８Ａの一部の部分断面拡大図 １つ以上の実施形態による、同じ容器内に細胞培養セクション及び採取容積を備えたバイオリアクター容器の概略図 １つ以上の実施形態による、細胞培養セクション及び外部採取容積を備えたバイオリアクター容器の概略図 １つ以上の実施形態による、バイオリアクターの上部、中間、及び底部から採取された細胞、並びに平均採取数を示す図 １つ以上の実施形態による、複数の実施例及びバイオリアクターサイズにわたる一貫したＡＡＶ２－ＧＦＰベクターの収量／ｃｍ^２を示す図 他のプラットフォームと比較した、本開示の実施形態ＡのＡＡＶ２－ＧＦＰ ＶＧ収量／ｃｍ^２の一例を示す図 他のプラットフォームと比較した、本開示の実施形態ＡのＡＡＶ２－ＧＦＰ ＶＧ収量／容器の一例を示す図 ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地を使用した、本開示の一実施形態によるバイオリアクターにおけるＡＡＶ２－ＧＦＰウイルスベクターの産生を示すグラフ ＨＥＫ２９３Ｔ増殖期にはＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地を使用し、トランスフェクション期及び産生期には無血清ＤＭＥＭ培地を使用した、本開示の一実施形態によるバイオリアクターにおけるＡＡＶ２－ＧＦＰウイルスベクターの産生を示すグラフ 本開示の実施形態による、細胞培養基材の異なる表面積サイズに対する容器あたりの総バルクＶＧの一例を示すグラフ １つ以上の実施形態による細胞培養システムの詳細な概略図

本開示のさまざまな実施形態は、もしあれば、図面を参照して詳細に説明される。さまざまな実施形態への言及は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。加えて、本明細書に記載された例は限定的ではなく、特許請求された発明の多くの可能な実施形態のうちの幾つかを単に記載するものである。

本開示の実施形態は、細胞培養基材、及びそのような基材を組み込んだ細胞培養システム又はバイオリアクターシステム、並びにそのような基材を使用して細胞を培養する方法を対象とする。実施形態は、容器内で細胞培養基材を使用して細胞の播種、培養、トランスフェクション、及び／又は採取を実施することができ、かつ異なる生産スケールで動作させることができる、バイオリアクター容器も含む。

従来の大規模細胞培養バイオリアクターでは、さまざまなタイプの充填床バイオリアクターが使用されてきた。通常、これらの充填床は、接着細胞又は浮遊細胞を保持し、成長及び増殖を支援するための多孔質マトリクスを含む。充填床マトリクスは体積に対する表面積の比率が高く、他のシステムよりも細胞密度を高くすることができる。充填床は多くの場合、細胞がマトリクスの繊維に物理的に捕捉されるか又は絡み合う、デプスフィルタとして機能する。しかしながら、細胞接種材料は充填床を通って直線的に流れるため、細胞は充填床内で不均一に分布することになる。したがって、例えば、細胞密度は、バイオリアクターの入口領域でより高く、バイオリアクターの出口部分では大幅に低くなる。充填床内の細胞のこの不均一な分布は、バイオプロセス製造におけるこのようなバイオリアクターのスケーラビリティを著しく妨げる。

従来技術で開示されている充填床バイオリアクターにおいて遭遇する別の問題は、チャネリング効果である。充填された不織布繊維のランダムな性質に起因して、充填床の任意の断面における局所的な繊維密度は均一ではない。培地は、繊維密度が低い領域（床透過性が高い）では迅速に流れるが、繊維密度が高い（床透過性が低い）領域では非常に遅くなる。充填床全体にわたる不均一な培地灌流により、チャネリング効果が生じる。これは、細胞培養全体とバイオリアクターの性能に悪影響を与える重大な栄養素及び代謝物の勾配の発生として現れる。培地の灌流が低い領域に位置する細胞は飢餓状態になり、多くの場合、栄養素の不足又は代謝物中毒により死滅する。不織繊維足場が充填されたバイオリアクターを使用する場合、細胞採取はさらに別の問題に遭遇する。充填床はデプスフィルタとして機能することから、細胞培養プロセスの最後に放出される細胞は充填床内に閉じ込められ、細胞回収率は非常に低くなる。これにより、生細胞が製品となるバイオプロセスにおけるこのようなバイオリアクターの利用が大幅に制限される。

本開示は、細胞又は細胞由来生成物（例えば、タンパク質、抗体、ウイルス粒子）の任意の実際的な生産スケールへの容易かつ効果的なスケールアップを可能にする、足場依存性細胞のための細胞増殖マトリクス及び／又は充填床システムの実施形態を含む。一実施形態では、マトリクスには、接着細胞が接着して増殖するための構造的に規定された表面積が設けられており、これは、良好な機械的強度を有し、充填床又は他のバイオリアクター内でアセンブリされた場合に、非常に均一な多数の相互接続された流体ネットワークを形成する。特定の実施形態では、機械的に安定で非分解性の織物メッシュを使用して、接着細胞の産生を支援することができる。このようなマトリクスへの均一な細胞播種が達成でき、また、細胞又はバイオリアクターの他の生成物の効率的な採取も達成可能である。加えて、本開示の実施形態は、開示されたマトリクス上で接着細胞のコンフルエントな単層又は多層を達成するための細胞培養を支援し、制限された栄養素の拡散及び代謝産物濃度の増加を伴う３Ｄ細胞凝集体の形成を回避することができる。１つ以上の実施形態の構造的に画定されたマトリクスは、完全な細胞回収及びバイオリアクターの充填床からの一貫した細胞収集を可能にする。本開示の別の実施形態によれば、治療用タンパク質、抗体、ウイルスワクチン、又はウイルスベクターのバイオプロセス生産のためのマトリクスを備えたバイオリアクターを使用する細胞培養方法が提供される。

本明細書で用いられる場合、「構造的に定義された」とは、構成要素が、定義された構造設計に従って、ランダムではない順序付けられた構造を有することを意味する。

１つ以上の実施形態では、高体積密度形式で足場依存性細胞の接着及び増殖を支援する細胞培養マトリクスが提供される。マトリクスは、灌流バック床バイオリアクターなどのバイオリアクターシステムにおいてアセンブリし、使用することができ、マトリクス又は填床内での大きい細胞凝集体及び／又は制御不能な細胞凝集体の形成を防ぎつつ、接種ステップ中に均一な細胞分布を提供する。したがって、マトリクスはバイオリアクターの動作中の拡散制限を排除する。加えて、マトリクスは、バイオリアクターからの細胞採取を簡単かつ効率的に可能にする。

マトリクスは、比較的薄い厚さによって分離された第１の面と第２の面とを有する薄い又はシート状の構造を有する基材材料で形成することができる。言い換えれば、シート状の基材の厚さは、基材の第１の面及び第２の面の幅及び／又は長さに比べて薄い。さらに、複数の孔又は開口部が、基材の厚さを貫通して形成される。開口部間の基材材料は、細胞が二次元（２Ｄ）表面であるかのように基材材料の表面に接着でき、同時に基材材料の周囲及び開口部を通る適切な流体の流れも可能になるサイズ及び幾何学形状のものである。幾つかの実施形態では、基材はポリマーベースの材料であり、成形ポリマーシート；厚さ全体に穿孔された開口部を備えたポリマーシート；メッシュ様の層に融合された多数のフィラメント；又は、メッシュ層へと織られた複数のフィラメントとして形成することができる。マトリクスの物理的構造は、足場依存性細胞を培養するための高い表面積対体積比を有する。さまざまな実施形態によれば、マトリクスは、均一な細胞播種、均一な培地灌流、及び効率的な細胞採取を獲得するために、ある特定の方法でバイオリアクター内に配置又は充填することができる。

本開示の実施形態は、バッチあたり約１０^１５から約１０^１８個以上のウイルスゲノムスケールでウイルスゲノムを産生することができる実用的なサイズのウイルスベクタープラットフォームを実現することができる。例えば、幾つかの実施形態では、ウイルスゲノム収量は、バッチあたり約１０^１５から約１０^１６のウイルスゲノム、又はバッチあたり約１０^１６から約１０^１９のウイルスゲノム、又はバッチあたり約１０^１６～１０^１８のウイルスゲノム、又はバッチあたり約１０^１７から約１０^１９のウイルスゲノム、又はバッチあたり約１０^１８から約１０^１９のウイルスゲノム、又はバッチあたり約１０^１８以上のウイルスゲノムでありうる。「バッチ」とは、単一のバイオリアクター容器で実施される単一の細胞培養を意味しうる。本明細書の実施形態のスケーラビリティの理由から、バイオリアクター容器及び含まれる細胞培養基材は、これらの収量を達成するために適切に拡張することができる。このスケーラビリティは、均一な細胞播種と培養、均一な培地の流れ、及び／又は均一な採取を提供する、細胞培養基材の構造的に規定された性質によって支援される。幾つかの実施形態では、バッチは、協調的な細胞培養動作において用いられる複数のバイオリアクター容器を含むことができる。

加えて、本明細書に開示される実施形態は、細胞培養基材への細胞の接着及び増殖だけでなく、培養細胞の生存可能な採取も可能にする。生細胞を採取できないことは、現在のプラットフォームの重大な欠点であり、生産能力に十分な数の細胞を構築及び維持することが困難になる。本開示の実施形態の一態様によれば、８０％から１００％が生存、又は約８５％から約９９％が生存、又は約９０％から約９９％が生存を含めて、細胞培養基材から生細胞を採取することができる。例えば、採取される細胞のうち、少なくとも８０％が生存、少なくとも８５％が生存、少なくとも９０％が生存、少なくとも９１％が生存、少なくとも９２％が生存、少なくとも９３％が生存、少なくとも９４％が生存、少なくとも９５％が生存、少なくとも９６％が生存、少なくとも９７％が生存、少なくとも９８％が生存、又は少なくとも９９％が生存する。細胞は、例えばトリプシン、ＴｒｙｐＬＥ、又はＡｃｃｕｔａｓｅを使用して細胞培養基材から放出させることができる。

図１Ａ及び１Ｂは、それぞれ、本開示の１つ以上の実施形態の一例による、細胞培養基材１００の三次元（３Ｄ）斜視図及び二次元（２Ｄ）平面図を示している。細胞培養基材１００は、第１の方向に延びる第１の複数の繊維１０２と、第２の方向に延びる第２の複数の繊維１０４とからなる織りメッシュ層である。基材１００の織物繊維は複数の開口部１０６を形成する。開口部のサイズ及び形状は、織りのタイプ（例えば、フィラメントの数、形状、及びサイズ；交差するフィラメント間の角度など）に基づいて変化しうる。開口部は、図１Ｂの第１の直径Ｄ_１及び第２の直径Ｄ_２によって示されるように、ある特定の幅又は直径によって画定することができる。織物メッシュは、マクロスケールでは、二次元のシート又は層と考えることができる。しかしながら、織物メッシュを詳しく調べてみると、交差するメッシュの繊維が上下することにより、立体的な構造が明らかになる。したがって、図１Ｃに示されるように、織物メッシュ１００の厚さＴは、単一の繊維の厚さより厚くなりうる。本明細書で用いられる場合、厚さＴは、織りメッシュの第１の面１０８と第２の面１１０との間の最大厚さである。

図１Ｂでは、開口部１０６は、対向する繊維１０２間の距離として画定される直径Ｄ_１と、対向する繊維１０４間の距離として画定される直径Ｄ_２とを有する。Ｄ_１とＤ_２は、織りの形状に応じて、等しくても、等しくなくてもよい。Ｄ_１とＤ_２が等しくない場合、大きい方を長径、小さい方を短径と呼ぶ。幾つかの実施形態では、開口部の直径とは、開口部の最も広い部分を指しうる。別段の指定がない限り、本明細書で用いられる開口部の直径は、開口部の対向する側部の平行な繊維間の距離を指す。

複数の繊維１０２の所与の繊維は太さｔ_１を有し、複数の繊維１０４の所与の繊維は太さｔ_２を有する。図１Ａに示されるような円形断面の繊維、又は他の三次元断面の繊維の場合、太さｔ_１及びｔ_２は、繊維断面の最大直径又は太さである。幾つかの実施形態によれば、複数の繊維１０２はすべて、同じ太さｔ_１を有し、複数の繊維１０４はすべて、同じ太さｔ_２を有する。さらに、ｔ_１とｔ_２は等しくてもよい。しかしながら、１つ以上の実施形態では、ｔ_１及びｔ_２は等しくない。加えて、複数の繊維１０２及び複数の繊維１０４の各々は、２つ以上の異なる太さ（例えば、ｔ_１ａ、ｔ_１ｂなど、及びｔ_２ａ、ｔ_２ｂなど）の繊維を含みうる。図１Ａ～１Ｃに示されるように、織物メッシュの三次元的性質により、細胞の接着及び増殖に利用可能な繊維の有効表面積は、マクロスケールで同じ基材寸法を有する同等の平面２Ｄ表面における接着のための表面積を超える。

織物メッシュは、モノフィラメント又はマルチフィラメントのポリマー繊維から構成されうる。１つ以上の実施形態では、モノフィラメント繊維は約５０μｍから約１０００μｍの範囲の直径を有しうる。マイクロスケールレベルでは、細胞と比較した繊維のスケール（例えば、繊維の直径が細胞よりも大きい）に起因して、モノフィラメント繊維の表面は、接着細胞が接着し、増殖するための通常の２Ｄ表面として表示される。このような繊維は、画定されたパターンとある程度の構造的剛性とを備えたメッシュに織り込まれる。繊維は、約１００μｍ×１００μｍから約１０００μｍ×１０００μｍの範囲の開口部を有するメッシュへと織ることができる。フィラメント直径及び開口部直径のこれらの範囲は、幾つかの実施形態の例であるが、すべての実施形態によるメッシュの可能な特徴部サイズを制限することを意図するものではない。

基材メッシュは、例えば、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンオキシド、ポリピロール類、及びポリプロピレンオキシドを含む、細胞培養用途に適合するポリマー材料のモノフィラメント又はマルチフィラメント繊維から製造することができる。メッシュ基材は、例えば、編み物、経編み物、又は織物（平織、綾織、オランダ織、五本針織）を含む、異なる構造パターン又は織りを有しうる。

メッシュフィラメントの表面化学は、所望の細胞接着特性を提供するために修飾する必要がある場合がある。このような修飾は、メッシュのポリマー材料の化学処理を通じて、又は細胞接着分子をフィラメント表面にグラフトすることによって行うことができる。あるいは、メッシュは、例えば、コラーゲン又はＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を含む、細胞接着特性を実証する生体適合性ヒドロゲルの薄層でコーティングすることができる。あるいは、メッシュのフィラメント繊維の表面は、業界で知られているさまざまなタイプのプラズマ、処理ガス、及び／又は化学薬品を用いた処理プロセスを通じて細胞接着特性を与えることができる。

図２Ａ～２Ｃは、本開示の幾つかの企図される実施形態による織物メッシュの異なる例を示している。これらのメッシュの繊維直径と開口部サイズ、並びに同等の２Ｄ表面と比較したそれぞれのメッシュの単層によってもたらされる細胞培養表面積の増加のおおよその規模を、以下の表１にまとめる。表１において、メッシュＡは図２Ａのメッシュを指し、メッシュＢは図２Ｂのメッシュを指し、メッシュＣは図２Ｃのメッシュを指す。表１の３つのメッシュ形状は単なる例であり、本開示の実施形態はこれらの特定の例に限定されない。メッシュＣは表面積が最も大きいため、細胞の接着及び増殖において高密度を達成するのに有利であり、したがって細胞培養に最も効率的な基材を提供することができる。しかしながら、幾つかの実施形態では、例えば、培養チャンバ内で所望の細胞分布又は流れ特性を達成するために、メッシュＡ又はメッシュＢなどのより低い表面積を有するメッシュ、又は異なる表面積のメッシュの組合せを含むことは、細胞培養マトリクスにとって有利でありうる。

上の表に示されるように、メッシュの三次元品質により、同等のサイズの平面２Ｄ表面と比較して、細胞の接着及び増殖のための表面積の増加がもたらされる。この増加した表面積は、本開示の実施形態のスケーラビリティに役立つ。プロセス開発及びプロセスの検証研究では、試薬のコストを節約し、実験スループットを向上させるために、多くの場合、小規模のバイオリアクターが必要とされる。本開示の実施形態は、このような小規模な研究に適用可能であるが、同様に産業規模にスケールアップすることもできる。例えば、直径２．２ｃｍの円形の形状をした１００層のメッシュＣを、内径２．２ｃｍの円筒状の充填床に充填すると、細胞が接着及び増殖するために利用可能な総表面積は、約９３５ｃｍ^２に等しくなる。このようなバイオリアクターを１０倍に拡張するには、７ｃｍの内径と１００層の同じメッシュとを備えた、円筒状の充填床の同様のセットアップを使用することもできる。このような場合、総表面積は９，３５０ｃｍ^２になるであろう。幾つかの実施形態では、利用可能な表面積は約９９，０００ｃｍ^２／Ｌ以上である。幾つかの実施形態では、バイオリアクター容器は、例えば１００～１０００の層又はそれより多くの層、又は約３００層の細胞培養基材を含む、１００を超える層を有する細胞培養マトリクスを有することができる。幾つかの例では、３００層の細胞培養マトリクスは、約３×１０^９から５×１０^９ｃｍ^２の表面積を有することができる。幾つかの実施形態では、充填床バイオリアクターは、例えば１ｍ^２、２ｍ^２、２．５ｍ^２、３ｍ^２、４ｍ^２、５ｍ^２、及び１０ｍ^２、並びにそれらの間の範囲を含む、１から１０ｍ^２の等価表面積を有する。充填床でのプラグ型灌流流により、充填床の断面表面積のｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ^２で表される同じ流量を、バイオリアクターの小規模バージョン及び大規模バージョンで使用することができる。

十分な剛性を備えた構造的に画定された培養マトリクスを使用することにより、マトリクス又は充填床全体にわたる高い流動抵抗の均一性が達成される。さまざまな実施形態によれば、マトリクスは、単層又は多層フォーマットで配置することができる。この柔軟性により、拡散の制限が排除され、マトリクスに接着した細胞に栄養素と酸素が均一に供給される。加えて、マトリクスには充填床構成の細胞捕捉領域が欠けており、培養終了時に高い生存率での完全な細胞採取が可能になる。該マトリクスはまた、充填床の充填の均一性ももたらし、プロセス開発ユニットから大規模な産業用バイオプロセスユニットまでの直接的な拡張を可能にする。充填床から細胞を直接採取する能力は、撹拌した又は機械的に振動させた容器内でマトリクスを再懸濁する必要性を排除する。さらに、細胞培養マトリクスの高い充填密度により、産業規模で管理可能な量で高いバイオプロセス生産性が得られる。

図３Ａは、多層基材２００を備えたマトリクスの実施形態を示しており、図３Ｂは、同じ多層基材２００の平面図である。多層基材２００は第１のメッシュ基材層２０２と第２のメッシュ基材層２０４とを含む。第１の基材層２０２と第２の基材層２０４とが重なっているにもかかわらず、メッシュの形状（例えば、開口部直径の繊維直径に対する比）は、図３Ｂのフィラメントのない開口部２０６によって示されるように、第１の基材層２０２と第２の基材層２０４の開口部が重なり合い、流体が多層基材２００の全厚を通って流れる経路を提供するようなものである。図３Ａ及び３Ｂは基材の２つの層のみを示しているが、本開示の実施形態は、例えば、図３Ａ及び３Ｂに示されるような積層配置で配置された細胞培養基材の多くの層を含む細胞培養マトリクスを含むものと理解されたい。図３Ｂは、基材層２０２及び２０４が完全に位置合わせされていないことを示しているが、開口部２０６が位置合わせされるように層を位置合わせすることもできる。

図４は、図３Ｂの線Ｂ－Ｂにおける多層基材２００の断面図を示している。矢印２０８は、第２の基材層２０４の開口部を通過し、その後、第１の基材層２０２のフィラメントの周囲を通る、可能な流体流路を示している。メッシュ基材層の幾何学形状は、一又は複数の基材層を通る効率的かつほぼ均一な流れを可能にするように設計される。マトリクス２００の構造は、複数の配向でマトリクスを通る流体の流れに適応することができる。例えば、図４に示されるように、バルク流体の流れの方向（矢印２０８で示される）は、第１の基材層２０２及び第２の基材層２０４の主側面に対して垂直である。しかしながら、マトリクスは、基材層の側面がバルクフロー方向と平行になるように、流れに対して配向することもできる。例えば、図５は、図４の線Ｃ－Ｃに沿った多層基材２００の断面図を示しており、マトリクス２００の構造は、多層基材２００の流体経路を通る流体の流れ（矢印２１０）を可能にする。流体の流れがメッシュ層の第１の面及び第２の面に対して垂直又は平行であることに加えて、マトリクスは、複数の基材片を中間の角度で配置することができ、あるいは流体の流れに対してランダムに配置することもできる。このマトリクスの柔軟性により、さまざまな用途で、及びバイオリアクター又は容器の設計での使用が可能になる。

本明細書で論じられるように、１つ以上の実施形態によれば、細胞培養基材は、バイオリアクター容器内で使用することができる。例えば、基材は、充填床バイオリアクター構成で、又は三次元培養チャンバ内の他の構成で使用することができる。しかしながら、実施形態は三次元培養空間に限定されず、基材は二次元培養表面構成とみなされるうるものにおいても使用することができることが企図されており、ここで、基材の１つ以上の層は、平底の培養皿内などに平らに置かれ、細胞の培養基材を提供する。汚染の懸念があることから、容器は使用後に廃棄することができる使い捨て容器とすることができる。

１つ以上の実施形態によれば、細胞培養マトリクスがバイオリアクター容器の培養チャンバ内で用いられる、細胞培養のための充填床バイオリアクターシステムが提供される。図６は、バイオリアクター容器３０２の内部空洞に細胞培養チャンバ３０４を有する、バイオリアクター容器３０２を含む細胞培養システム３００の一例を示している。細胞培養チャンバ３０４内には、複数の基材層３０８から作られた細胞培養マトリクス３０６がある。複数の基材層３０８は、積み重ねて配置された複数の分離可能な別個の基材層を含むことができるが、複数の層を貼り合わせた一体型の細胞培養マトリクスも含むことができる。基材層３０８は、第１の面又は第２の面が、隣接する基材層の第１の面又は第２の面に面するように積層される。バイオリアクター容器３００は、一端に培地、細胞、及び／又は栄養素を培養チャンバ３０４に投入するための入口３１０を有し、反対端に培養チャンバ３０４から培地、細胞、又は細胞産物を除去するための出口３１２を有する。この方法で基材層を積層可能にすることにより、画定された構造及び積層された基材を通る効率的な流体の流れに起因して、細胞の接着及び増殖に悪影響を与えることなく、システムを容易にスケールアップすることができる。

１つ以上の実施形態では、充填床の流れ抵抗及び体積密度は、異なる幾何学形状の基材層を交互に配置することによって制御することができる。特に、メッシュのサイズ及び幾何学形状（例えば、繊維の直径、開口部の直径、及び／又は開口部の幾何学形状）は、充填床形式における流体の流れ抵抗を規定する。異なるサイズ及び幾何学形状のメッシュを間に配置することにより、バイオリアクターの特定の部分の流れ抵抗を制御することができる。これにより、充填床バイオリアクター内の液体灌流の均一性を向上させることができる。例えば、１０層のメッシュＡ（表１）に続いて１０層のメッシュＢ（表１）、さらに１０層のメッシュＣ（表１）を積み重ねて、所望の充填床特性を達成することができる。別の例として、充填床は、１０層のメッシュＢから始まり、次に５０層のメッシュＣ、さらに１０層のメッシュＢが続きうる。このような繰り返しパターンは、バイオリアクター全体にメッシュが充填されるまで継続させてもよい。これらは単なる例であり、可能な組み合わせを制限することを意図するものではなく、説明の目的で使用されている。実際、異なるサイズのメッシュをさまざまに組み合わせて、細胞増殖表面の体積密度と流れ抵抗の異なるプロファイルを得ることが可能である。例えば、異なる体積細胞密度のゾーン（例えば、低／高／低／高などの密度のパターンを生成する一連のゾーン）を備えた充填床カラムは、異なるサイズのメッシュを交互に配置することによってアセンブリすることができる。

図６では、バルク流れ方向は、（矢印の方向が示すように）入口３１０から出口３１２の方向になり、この例では、基材層３０８の第１及び第２の主面はバルク流れ方向に対して垂直である。しかしながら、実施形態はこの構成に限定されない。例えば、基材は、第１の面及び第２の面がバルク流れ方向に平行になるように、又はバルク流れ方向に対して何らかの中間角度をなすように、培養空間内に配置することができる。したがって、本開示の実施形態のマトリクスは、いずれの構成においても採用することができる。いずれの構成においても、基材は、培養チャンバによって画定された内部空間を適切に満たすようなサイズ及び形状にすることができる。加えて、基材の個々の層のサイズ又は基材の層のスタックのサイズは、内部空間を満たすようなサイズにすることができ、あるいは、所望に応じて、内部空間の全体未満を満たすようなサイズにすることもできる。例えば、幾つかの実施形態では、基材層のスタックが内部空間全体よりも少ない容積を占めることが望ましい場合がある。

上で論じたように、本開示の実施形態は、容器内で細胞培養基材を使用して、細胞の播種、培養、トランスフェクション、及び／又は採取を実施することができ、かつ異なる生産スケールを動作させることができる、バイオリアクター容器を含む。本開示の実施形態によるバイオリアクターにより、エンドユーザは、同じバイオリアクターユニットを使用して１倍から１０倍のスケールでバイオプロセス実験を実施することができる。これらの実施形態の単純なスケーラビリティモデルは、１つのシステム内で、研究からプロセス開発、そして生産スケールへのバイオプロセスの移行を可能にする。バイオリアクター容量の構成におけるこのような柔軟性により、１倍から１０倍のスケール範囲でのプロセスの最適化と検証にかかるコストと時間が節約される。幾つかの実施形態の態様により、エンドユーザは、バイオリアクターのスケールアップ中に再最適化する必要なしに、同じ所定の流量で細胞を播種し、採取することができる。

図７は、１つ以上の実施形態による灌流型のバイオリアクター３２０を示している。バイオリアクター３２０は、流体、細胞、栄養素を含む培地をバイオリアクター３２０の内部空洞３２７に供給することができる培地入口３２１を含む。内部空洞３２７は、細胞培養基材３２３が配置される細胞培養セクション３２７ａと、スペーサ３２５が配置されるスペーサセクション３２７ｂとを含むものと考えることができる。培地入口３２１は流れ分配プレート３２２に通じている。流れ分配プレート３２２は、細胞培養基材３２３が保持される内部空間の幅全体にわたって流入培地を分散及び／又は分配する。図示されてはいないが、同様の流れ分配プレートを出口３２６の直前に配置することができる。出口分配プレートは、培地又は成分を内部空洞３２７の幅全体から出口まで注ぎ込むのに役立ちうる。以下でさらに説明するように、バイオリアクター３２０は、流体が出口３２６を通じて内部空洞３２７に入れられるモードで動作させることもでき、その場合、出口分配プレートは、内部空洞３２７の幅全体にわたって流体を均等に分配するのに役立ちうる。この逆流モードでは、入口３２１を使用して、内部空洞３２７から流体又は成分を取り出すことができる。

細胞培養基材３２３は、例えば多孔質ポリマー基材を含む、本明細書に開示される実施形態に対応しうる。基材３２３は、該基材３２３の流れ分配プレート側から基材３２３の反対側又は上部まで延びる高さｈを有する。任意選択的に、流れ分配プレート３２２の反対側の基材３２３の上部には、充填床保持器３２４がある。充填床保持器３２４は、培地入口３２１から入る培地の流れに対して基材３２３に構造的支持を提供するように設計されている。したがって、充填床保持器３２４は、充填床基材３２３の位置及び／又は形状を保持するのに役立ちうる。充填床保持層３２４は、異なる実施形態による多くの構成を有することができるが、概して、細胞を含む培地が充填床保持層３２４を通過できるようにしつつ、基材３２３を所定の位置に保持するのに十分な構造を有する。充填床保持層３２４の上にはスペーサ３２５がある。スペーサ３２５は、スペーサセクション３２７ｂ、又は基材３２３及び／又は充填床保持層３２４の上かつ内部空洞３２７の上部にある培地出口３２６の前の内部空間を実質的に満たすようなサイズである。この空間を満たすことによって、スペーサ３２５は、内部空間の上部又は内部空間内の何らかの支持機構に対して固定され、したがって充填床保持層３２４及び基材３２３を所定の位置に保つ。

スペーサ３２５はまた、細胞培養セクション３２７ａの上のスペーサセクション３２７ｂ内にヘッドスペースを形成する。このヘッドスペースは、基材３２３、とりわけ基材３２３の上部近くの流れの均一性を高める効果を有することができる。例えば、基材３２３の上部が内部空洞３２７の上部に近い場合には、内部キャビティ３２７の上部における流れの制限により、圧力が増大した領域が生じ、充填層内の流れの均一性に影響を与える可能性がある。以下に論じるように、このヘッドスペースは、採取動作中に加圧流体が内部空洞３２７を満たし始めるための空間も提供する。

図７Ｂは、図７Ａの実施形態の変形を示している。図７Ｂでは、少なくとも１つの多孔質スペーサディスク３２８が細胞培養基材３２３と培地入口３２１との間に配置されている。多孔質スペーサディスク３２８は、異なる形態をとることができるが、概して、内部空洞３２７の幅又は基材３２３の幅にわたって延在し、流体が多孔質スペーサディスク３２８を通って流れることを可能にする多孔質である。実施形態によれば、多孔質スペーサディスク３２８は、基材の開口部又は細孔の細孔径よりも大きいスペーサディスク細孔径を有する。幾つかの実施形態では、複数の多孔質スペーサディスク３２８を、基材３２３と入口３２１との間に積み重ねることができる。これらの複数の多孔質スペーサディスク３２８は各々、同じ構造（例えば、厚さ及びスペーサディスク細孔サイズ）を有することも、異なる構造（例えば、異なる厚さ及びスペーサディスク細孔サイズ）を有することもできる。多孔質スペーサディスク３２８は、流体が細胞培養基材３２３に到達する前に、入口３２１又は分配プレート３２２から流れる流体をさらに均一にし、分配するのに役立てることができることが企図されている。

図７Ａ及び７Ｂの基材３２３は、不織布であってもよく、又は織物ＰＥＴ基材などの織布であってもよい。しかしながら、基材は、幾つかの実施形態では不織布でありうる。基材は、積層配置された基材材料の複数の層、又は基材材料のロール若しくはらせんを含むことができる。

図８は、図７Ａ及び７Ｂのバイオリアクター３２０の一例の構成要素の写真である。図示されるように、バイオリアクター３２０は、２つ以上の分離可能な筐体構成要素３５０ａ及び３５０ｂを含むことができる。下部筐体構成要素３５０ａには、培地入口（図８には示されていない）の上に位置する流れ分配プレート３５２が示されている。充填床保持器３５４の一例が示されている。充填床保持器３５４は、ほぼ格子状であり、画定された厚さを有する。充填床保持器３５４の格子は、格子を通る培地及び他の成分の流れを可能にするが、バイオリアクター内の任意の基材層に支持を提供する。スペーサ３５５の一例も示されている。筐体構成要素３５０ａ、３５０ｂ、分配プレート３５２、充填床保持器３５４、及びスペーサ３５５の形状及びサイズは、例としてのみ示されており、本開示の実施形態は、示された構成に限定されない。第１の多孔質スペーサディスク３５６、第２の多孔質スペーサディスク３５７、及び第３の多孔質スペーサディスク３５８も入口付近に示されている。第２及び第３の多孔質スペーサディスク３５７、３５８は、この例では同一の構造を有し、両方とも、細胞培養基材３６０の細孔又は開口部直径よりも大きいスペーサディスク細孔径を有するメッシュ又はネット材料から作られている。第１の多孔質スペーサディスク３５６もメッシュ、ネット、又は格子材料から作られているが、第２及び第３の多孔質スペーサディスク３５７、３５８の細孔径よりも大きいスペーサディスク細孔径を有する。

図９Ａは、図８の分配プレート３５２と同様の分配プレート２の平面図を示している。分配プレート２の孔７は、分配プレートの幅及びバイオリアクターの内部空間にわたって流れを均等に分配するように配置されている。図９Ｂは、幾つかの実施形態による、充填床保持器４の平面図を示しており、これは、流動抵抗を最小限に抑えつつ、充填床領域内に細胞培養基材を効果的に保持するために、多数の大きい開口部８を画定する格子形状を有している。

図１０は、図８のスペーサ３５５の三次元モデルを示している。スペーサは、充填床領域内で基材を圧縮及び／又保持することができると同時に、バイオリアクターの内部空洞３２７内にスペーサセクション３２７ｂを形成して（図７Ａを参照）、充填床細胞培養マトリクス上のヘッドスペースを画定することができる。異なる高さの取り外し可能なスペーサ３５５は、ユーザが異なる体積の細胞培養基材を用いてバイオリアクター内で細胞培養を実施することを可能にし、充填床から培地出口ポートへの培地の無制限の流れを可能にすることができる。すなわち、より高い高さを有するスペーサ３５５は、それに対応して充填床の高さを低くすることができ、一方、より低い高さを有するスペーサ３５５は、それに対応して、より高い充填床のためのより多くの空間を可能にすることができる。幾つかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、高さの異なる個別のスペーサを使用するのではなく、調整可能な高さを有するスペーサを含むことができる。

図１１は、異なる高さのスペーサインサートを備え、それに対応して異なる高さの充填床基材を備えた、アセンブリされた充填床バイオリアクターの例を示している。この例では、左から右に、同じバイオリアクターを生産性が３倍に拡張するように構成することができる。しかしながら、本開示の実施形態は、構成要素のサイズをそれに応じて調整することによって、所与のバイオリアクターの生産性をさらに広範囲にスケールアップできるようにすることが企図されている。

図１２は、１つ以上の実施形態による、バイオプロセッシングシステム４００に組み込まれたバイオリアクター４０２を示している。システム４００は、例えば、ｐＨ、温度、及び酸素化レベルなどの細胞培養培地パラメータを適切に維持するための培地調整容器４１１を含む。自動制御ポンプ４０９はバイオリアクター４０２を通して培地を灌流するために用いられる。バイオリアクター入口４１３には、細胞の接種又は採取した細胞の収集を容易にする追加の３方向ポートが装備されている。システム４００は、培地調整容器４１１内のセンサ４１２だけでなく、インラインセンサを含んでいてもよい。

図１３は、バイオリアクターから細胞を採取するプロセス中の複数の段階における上記の実施形態によるバイオリアクターを示している。細胞採取プロセスには、バイオリアクターに細胞解離溶液４２２を予め充填し、充填床を所定の時間インキュベートして細胞を基材から分離することが含まれる。得られた細胞懸濁液は、図１３の左から右への進行に示されるように、培地出口４２６を通じて加圧流体（例えば、空気）を加えつつ、入口４２１を通って外へ出る培地／細胞の逆流によって、培地入口４２１から回収される。

表３は、図７～１３の実施形態に従って６０ｍｍのバイオリアクター内で実施されたＡＡＶ産生の結果を示している。６０ｍｍのバイオリアクターは、総基材表面積６７８０ｃｍ^２に相当する。トランスフェクト細胞収量、トランスフェクション効率、及び１ｃｍ^２あたりのウイルスゲノム収量が示されている。

本開示の上記の拡張可能な容器の実施形態は、同じプラットフォーム及び同じバイオリアクター容器を使用していくつかの異なるスケールでプロセスの最適化又は産生を可能にする、足場依存性細胞のための充填床バイオリアクターシステムを目的としている。一実施形態では、例えば、バイオリアクター容器３２０は、接着細胞が接着し、増殖し、トランスフェクトされ、生成物を産生するための充填床３２３を保持する。細胞培養培地を充填床及びバイオリアクター容器を通して継続的に灌流して、細胞に酸素及び栄養素を補給し、有害な代謝産物を除去することができる。培地は、計算された流量で容器入口３２１を通して導入され、出口３２６を通してバイオリアクターから出る。充填された基材材料全体にわたって均一な流れ分布を達成するために、流れ分配プレート３２２が充填床領域の前に位置づけられる。この流れ分配プレートは、分岐又は半径方向に相互接続された設計を有しており、充填床全体にわたって流れを均一に分配することができる。

別の実施形態では、充填床の層は、隆起した保持格子４によってしっかりと充填された状態で保持される。この保持格子は大きい開口部を有しており、バイオリアクターの灌流中の流動抵抗を最小限に抑えるが、構造的に十分な剛性を備えているため、充填床の表面に均一に圧力をかけて、ＰＥＴメッシュの層をしっかりと充填した状態に保つ。開示されたバイオリアクター内の充填床の体積は、保持格子４を所定の位置に固定するために異なる寸法のスペーサ５を利用することによって変化させることができる。バイオリアクター容器のサイズ及び充填床の直径は、約１ｃｍ（実験室スケール）から約１０ｃｍ（プロセス開発スケール）、５０ｃｍ（パイロットスケール）、２００ｃｍ（製造スケール）まで変化しうる。

図８は、接着ＨＥＫ２９３Ｔ細胞によるウイルス粒子のバイオプロダクションにおいて試験したバイオリアクターの一部を示している。バイオリアクターの充填床領域の内径は６０ｍｍであり、アセンブリされた状態のバイオリアクターの充填床は１０から３００層の剛性のＰＥＴ基材で構成されうる。これは、接着細胞が接着、増殖、及び目的の化合物を産生するために利用可能な６７８～２０３００ｃｍ^２の表面積に相当する。図１２は、培地調整容器、バイオリアクターへの培地の流れを可能にするポンプ、及びバイオプロセスを成功させるために必要なプロセス条件を支援する外部溶存酸素センサから構成される主要な外部構成要素に接続される、アセンブリされた状態のバイオリアクター容器４０２の概略図を示している。細胞培養培地は、培地調整容器４１１内で調整され、適切なｐＨ、温度、及び溶存酸素レベルが維持される。その後、ポンプ４０９によって、培地がバイオリアクターを通して灌流される。ポンプ４０９の流量は、バイオリアクターを出る培地中の溶存酸素の所定の最小レベルを維持するように自動的に調整されるフィードバックループに組み込まれている。所与のバイオプロセスが必要とするすべてのトランスフェクション試薬、栄養素、及び追加の培地補給剤を、バルク培地に導入することができ、使用済み培地は培地調整容器４１１を介して除去することができる。プロセスの最後に、培地をバイオリアクターから排出し、細胞採取溶液４２２を再充填することができる（図１３）。細胞を基材から剥離するのに十分な所定の時間、採取溶液中で充填床をインキュベートした後、細胞は、７０ｍｌ／ｃｍ^２（充填床断面積）／分の範囲の流速を達成するためにバイオリアクター出口６に空気圧を印加することによる逆流によって採取される。細胞はバイオリアクター３方向ポート４１３において採取される。細胞はバイオリアクター内で直接溶解することもでき、ＡＶＶ粒子を含む溶解物溶液は３方向ポート４１３を通じて収集することができる。

培地調整容器４０４は、懸濁バッチ、流加培養、又は灌流培養のためのバイオプロセス産業で用いられる典型的なバイオリアクターに見られるセンサ及び制御部品を含むことができる。これらには、ＤＯ酸素センサ、ｐＨセンサ、酸素供給器／ガス散布ユニット、温度プローブ、並びに栄養素添加ポート及び塩基添加ポートが含まれるが、これらに限定されない。散布ユニットに供給されるガス混合物は、Ｎ_２、Ｏ_２、及びＣＯ_２ガス用のガス流量コントローラによって制御することができる。培地調整容器４０４はまた、培地を混合するためのインペラも含む。上に挙げたセンサによって測定されるすべての培地パラメータは、培地調整容器４０４と通信する培地調整制御ユニット４１８によって制御することができ、細胞培養培地４０６の状態を測定及び／又は所望のレベルに調整することが可能である。

培地調整容器４０４からの培地４０６は、細胞を播種して培養を開始するための細胞接種材料の注入ポートも含みうる入口を介して、バイオリアクター４０２へと送給される。バイオリアクター容器４０２はまた、そこを通じて細胞培養培地が容器４０２から出る、１つ以上の出口も含みうる。加えて、細胞又は細胞産物が出口から排出されてもよい。バイオリアクター４０２からの流出物の内容を分析するために、ラインに１つ以上のセンサ４１２を設けることができる。幾つかの実施形態では、システム４００は、バイオリアクター４０２への流れを制御するための流量制御ユニットを含む。例えば、流量制御ユニットは、１つ以上のセンサ４１２から信号を受信し、その信号に基づいて、バイオリアクター４０２への入口４０８の上流にあるポンプ（例えば、蠕動ポンプ）に信号を送信することによって、バイオリアクター４０２への流れを調整することができる。したがって、センサ４１２によって測定された要因の１つ又は組合せに基づいて、ポンプは、バイオリアクター４０２への流れを制御して、所望の細胞培養条件を得ることができる。

培地灌流速度は、培地調整容器４０４及び充填床バイオリアクター出口に位置したセンサからのセンサ信号を収集して比較する、信号処理ユニットによって制御される。充填床バイオリアクター４０２を通る培地灌流の充填流の性質により、栄養素、ｐＨ、及び酸素の勾配が充填床に沿って発生する。バイオリアクターの灌流流量は、図１４Ｂのフローチャートに従って、蠕動ポンプに動作可能に接続された流量制御ユニットによって自動的に制御することができる。

本開示の１つ以上の実施形態は、従来の方法とは異なる細胞接種ステップを提供する。従来の方法では、従来のマトリクスを備えた充填床が培地で満たされ、濃縮された接種材料が培地循環ループに注入される。細胞懸濁液は、従来の充填床マトリクス上での捕捉による細胞播種の不均一性を軽減するために、増加した流量でバイオリアクターを通ってポンピングされる。このような従来の方法では、細胞の大部分が充填床バイオリアクターに捕捉されるまで、高い流量での循環ループ内の細胞のポンピングがおそらく数時間継続される。しかしながら、従来の充填床バイオリアクターの不均一な深層濾過の性質に起因して、細胞は充填床内に不均一に分布しており、バイオリアクターの入口領域では細胞密度が高く、バイオリアクターの出口領域では細胞密度が低くなる。

対照的に、本開示の実施形態によれば、バイオリアクター内の培養チャンバの空隙容積と等しい体積の細胞接種材料が、バイオリアクター４０２の入口にある細胞接種材料注入ポートを通じて充填床に直接注入される（図１２）。次いで、本明細書に記載される細胞培養マトリクス中に存在する均一かつ連続的な流体通路により、細胞懸濁液は充填床内に均一に分布する。播種の初期段階での重力に起因する細胞の沈降を防ぐために、接種材料の注入後すぐに培地の灌流を開始することができる。重力のバランスをとり、充填床バイオリアクターから細胞が洗い流されるのを回避するために、灌流流量は事前にプログラムされた閾値未満に維持される。したがって、初期の細胞接着段階では、細胞は充填床内で穏やかに転がり、均一な細胞の分布と利用可能な基材表面への接着が達成される。

図１４Ａは、幾つかの実施形態による、本明細書に開示される細胞培養システムで使用する処理ステップを示している。図１４Ａに示されるように、これらのプロセスステップは、プロセスの準備（Ｓ１）、細胞の播種及び接着（Ｓ２ａ、Ｓ２ｂ）、細胞の増殖（Ｓ３）、トランスフェクション（Ｓ４ａ、Ｓ４ｂ）、ウイルスベクターの産生（Ｓ５ａ、Ｓ５ｂ）、及び採取（Ｓ６ａ、Ｓ６ｂ）を含みうる。

図１４Ｂは、図１２のシステム４００などの灌流バイオリアクターシステムの流れを制御するための方法４５０の一例を示している。方法４５０によれば、システム４００のある特定のパラメータは、バイオリアクター最適化の実施を通じてステップＳ１において事前に決定される。これらの最適化の実施から、ｐＨ_１、ｐＯ_１、［グルコース］_１、ｐＨ_２、ｐＯ_２、［グルコース］_２、及び最大流量の値を決定することができる。ｐＨ_１、ｐＯ_１、及び［グルコース］_１の値は、ステップＳ２においてバイオリアクター４０２の細胞培養チャンバ内で測定され、ｐＨ_２、ｐＯ_２、及び［グルコース］_２は、ステップＳ３において培地調整容器４０４内のセンサ４１２によって測定される。Ｓ２及びＳ３におけるこれらの値に基づいて、灌流ポンプ制御ユニットは、Ｓ４において、灌流流量を維持又は調整するための決定を行う。例えば、ｐＨ_２≧ｐＨ_２ｍｉｎ、ｐＯ_２≧ｐＯ_２ｍｉｎ、及び［グルコース］_２≧［グルコース］_２ｍｉｎのうちの少なくとも１つである場合、細胞培養チャンバへの細胞培養培地の灌流流量は、現在の速度で継続されうる（Ｓ５）。現在の流量が細胞培養システムの所定の最大流量以下である場合には、灌流流量を増加させる（Ｓ７）。さらには、現在の流量が細胞培養システムの所定の最大流量以下でない場合、細胞培養システムのコントローラは、次のうちの少なくとも１つを再評価することができる：（１）ｐＨ_２ｍｉｎ、ｐＯ_２ｍｉｎ、及び［グルコース］_２ｍｉｎ；（２）ｐＨ_１、ｐＯ_１、及び［グルコース］_１；並びに、（３）バイオリアクター容器の高さ（Ｓ６）。

細胞培養マトリクスは、所望のシステムに応じて、培養チャンバ内で複数の構成で配置することができる。例えば、１つ以上の実施形態では、システムは、培養チャンバ内の画定された細胞培養空間の幅を横切って延びる幅を有する、基材の１つ以上の層を含む。このように基材の複数の層を所定の高さまで積層することができる。基材の層は、１つ以上の層の第１及び第２の面が、培養チャンバ内の画定された培養空間を通る培養培地のバルク流方向に対して垂直になるように配置することができる。幾つかの実施形態では、１つ以上の層の第１の面及び第２の面は、バルク流れ方向に対して平行でありうる。１つ以上の実施形態では、細胞培養マトリクスは、バルク流に対して第１の配向にある１つ以上の基材層と、第１の配向とは異なる第２の配向にある１つ以上の他の層とを含む。例えば、さまざまな層は、バルク流方向に対して平行又は垂直であるか、あるいはその間の何らかの角度をなす、第１の面及び第２の面を有しうる。

１つ以上の実施形態では、細胞培養システムは、充填床構成の複数の個別の細胞培養基材片を含み、この基材片の長さ及び／又は幅は培養チャンバに比べて小さい。本明細書で用いられる場合、基材片の長さ及び／又は幅が培養空間の長さ及び／又は幅の約５０％以下であるとき、基材片は、培養チャンバに比べて小さい長さ及び／又は幅を有すると見なされる。したがって、細胞培養システムは、所望の配置で培養空間に充填された複数の基材片を含みうる。基材片の配置は、ランダム又はセミランダムであってもよいし、あるいは、基材片が実質的に同様の配向（例えば、水平、垂直、又はバルク流方向に対して０°から９０°の間の角度）で配向されるなど、所定の順序又は配列を有していてもよい。

本明細書で用いられる「画定された培養空間」とは、細胞培養マトリクスによって占有され、細胞播種及び／又は培養が行われる、培養チャンバ内の空間を指す。画定された培養空間は、培養チャンバのほぼ全体を満たすことができ、あるいは培養チャンバ内の空間の一部を占有してもよい。本明細書で用いられる場合、「バルク流方向」は、細胞の培養中及び／又は培養チャンバへの培地の流入又は流出中の、細胞培養マトリクスを通るか又は細胞培養マトリクス上の流体又は培地のバルク質量流の方向として定義される。

１つ以上の実施形態では、細胞培養マトリクスは、固定機構によって培養チャンバ内に固定される。固定機構は、細胞培養マトリクスの一部を、該マトリクスを取り囲む培養チャンバの壁、又は培養チャンバの一端のチャンバ壁に固定することができる。幾つかの実施形態では、固定機構は、細胞培養マトリクスの一部を、培養チャンバを通る部材、例えば、培養チャンバの長手方向軸に平行に走る部材、又は長手方向軸に垂直に走る部材に接着する。しかしながら、１つ以上の他の実施形態では、細胞培養マトリクスは、チャンバ又はバイオリアクター容器の壁に固定的に取り付けられることなく、培養チャンバ内に含まれていてもよい。例えば、マトリクスは、該マトリクスがそれらの境界又は構造部材にしっかりと固定されることなく、バイオリアクター容器の所定の領域内に保持されるように、培養チャンバの境界又はチャンバ内の他の構造部材によって収容されてもよい。

幾つかの実施形態の一態様は、ローラボトル構成のバイオリアクター容器を提供する。培養チャンバは、本開示に記載される１つ以上の実施形態による細胞培養マトリクス及び基材を収容することができる。

ローラボトル構成では、バイオリアクター容器は、該バイオリアクター容器を容器の中心長手方向軸の周りを移動させるための手段に動作可能に取り付けられうる。例えば、バイオリアクター容器は、中心長手方向軸の周りを回転することができる。回転は、連続的（例えば、一方向に継続する）であっても、不連続的（例えば、単一方向又は交互方向に断続的に回転する、あるいは前後の回転方向に振動する）であってもよい。動作中、バイオリアクター容器の回転が、チャンバ内の細胞及び／又は流体を移動させる。この動きは、チャンバの壁に対して相対的であると見なすことができる。例えば、バイオリアクター容器がその中心長手方向軸の周りを回転すると、重力により、流体、培地、及び／又は未接着細胞がチャンバの下部に向かって残る可能性がある。しかしながら、１つ以上の実施形態では、細胞培養マトリクスは本質的に容器に対して固定されているため、容器とともに回転する。１つ以上の他の実施形態では、細胞培養マトリクスは取り付けられておらず、容器が回転すると、容器に対して所望の程度まで自由に移動することができる。細胞は細胞培養マトリクスに接着することができるが、容器の移動により、細胞は培養チャンバ内の細胞培養培地又は液体、及び酸素又は他のガスの両方に曝露されうる。

本開示の実施形態による細胞培養マトリクス、例えば織物又はメッシュ基材を含むマトリクスなどを使用することにより、ローラボトル 容器には、接着細胞が接着、増殖、及び機能するために利用可能な表面積の増加がもたらされる。特に、ローラボトル内にモノフィラメントポリマー材料の織物メッシュの基材を使用すると、表面積は、標準的なローラボトルの約２．４から約４．８倍、又は約１０倍増加しうる。本明細書で論じられるように、メッシュ基材の各モノフィラメントストランドは、それ自体が接着細胞が接着するための２Ｄ表面として存在することができる。加えて、多層のメッシュをローラボトルに配置することができ、利用可能な総表面積が標準的なローラボトルの約２から２０倍の範囲に増加する。したがって、細胞播種、培地交換、及び細胞回収を含む既存のローラボトル設備及び処理は、本明細書に開示される改良型細胞培養マトリクスの追加によって、既存の動作インフラストラクチャ及び処理ステップへの影響を最小限に抑えつつ、変更することができる。

バイオリアクター容器は、任意選択的に、入口及び／又は出口手段に取り付けることができる１つ以上の出口を含む。１つ以上の出口を通じて、液体、培地、又は細胞をチャンバに供給したり、チャンバから取り出したりすることができる。容器内の単一のポートが入口と出口の両方として機能してもよく、あるいは専用の入口及び出口として複数のポートが設けられてもよい。

実施形態は、中心長手方向軸の周りの容器の回転に限定されない。例えば、容器 は、該容器に対して中心に位置しない軸の周りを回転してもよい。加えて、回転軸は水平軸でも垂直軸でもよい。

本開示の細胞培養マトリクス、細胞培養システム、及び関連方法の有効性を実証するために、以下の実施例に従って、細胞の播種及び培養に関する研究を行った。

実施例１では、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）織物メッシュ基材を有する細胞培養マトリクス（図１５Ａ～１５Ｃを参照）を静的細胞培養条件で試験した。ＰＥＴメッシュをエタノールで洗浄し、酸素ＲＦプラズマでプラズマ処理した。ゼラチンをメッシュフィラメントの表面に吸着させ、細胞接着を促進させた。ディスク状のメッシュ片をＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）超低接着（ＵＬＡ）６ウェルプレート内に配置した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を異なる播種密度（それぞれ、図１５Ａ、１５Ｂ、及び１５Ｃに対応する、５０Ｋ／ｃｍ^２、７５Ｋ／ｃｍ^２、１００Ｋ／ｃｍ^２）でメッシュディスク上に播種し、細胞培養を３日間行った。フィラメント表面上の細胞を、蛍光のＧｒｅｅｎ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ染料で染色した。図１５Ａ～１５Ｃは、フィラメント表面上の細胞を視覚化した結果を示している。細胞のサイズに対するメッシュフィラメントのサイズにより、モノフィラメント繊維が細胞の接着及び増殖のための二次元表面として効果的に機能することが可能となる。細胞増殖は、メッシュから細胞を採取し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＶｉ－Ｃｅｌｌ（登録商標）セルカウンターで計数することによって測定した。結果は、静的細胞培養条件下、細胞培養マトリクス上で良好な細胞接着及び増殖を示した。

実施例２では、本開示の実施形態の一例に従い、図６に示されるような充填床バイオリアクターシステムで細胞を培養した。充填床は円筒状であり、各々が円形又はディスク形の細胞培養基材のスタックでできている。具体的には、実施例２では、充填床は、約２５ｍｍの高さを有し、各々、直径約２０ｍｍのＰＥＴメッシュ基材のディスク１００枚を含んでいた。使用したメッシュは表１のメッシュＣに対応する。細胞接着に利用可能な総二次元表面積は約７６０ｃｍ^２であったと推定される。バイオリアクターに接種するために、８ｍｌのＨＥＫ２９３Ｔ細胞懸濁液（２００万細胞／ｍｌ）を充填床に直接注入した。細胞懸濁液の導入直後に培地灌流を開始し、灌流流量を３ｍｌ／分に設定した。この流量での灌流を２４時間継続し、その後、流量を１ｍｌ／分に減らした。この後、バイオリアクターの出口でｐＯ_２の５０％以上の飽和及び７以上のｐＨを維持するように灌流流量を調整した。２～３日後、バイオリアクターで実施した細胞をクリスタルバイオレットで染色し、バイオリアクターを分解してマトリクス内での細胞接着の均一性を確認した。好ましい実施形態によれば、バイオリアクターは、初期接着段階中に充填床内で細胞を連続的に転がす播種方法によって播種することができる。その結果、２日間の細胞培養後、充填床のすべての部分で均一な細胞分布が達成される。これは、細胞播種段階でバイオリアクターを連続的に灌流したときに、均一な細胞分布が達成されたことを示唆している。

実施例３では、細胞を充填床バイオリアクターシステム内で培養し、バイオリアクター内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生のためにＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションを実施した。実施例２と同じバイオリアクター設定を実施例３でも使用した（例えば、図６を参照）。充填床は、１００枚のＰＥＴメッシュディスク（表１のメッシュＣ）を含んでいた。各ディスクの直径は約２０ｍｍであり、充填床の高さは約２５ｍｍで、細胞の接着及び増殖に利用可能な二次元表面積は合計約７６０ｃｍ^２であった。バイオリアクターに接種するために、８ｍｌのＨＥＫ２９３Ｔ細胞懸濁液（２００万細胞／ｍｌ）を充填床に直接注入した。約５０ｍｌの培地を含む培地保存容器をバイオリアクター容器に取り付けた。＋１０％ＦＢＳ及び＋６ｍＭのＬ－グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）ＡＴＣＣ（登録商標）培地で細胞を７２時間培養した。保存容器内の培地のｐＨが７を下回ったら、培地を新しい培地と交換した。バイオリアクターの出口でｐＯ２の５０％以上の飽和及び７以上のｐＨを維持するように、灌流流量を適切に調整した。７２時間後、培養培地を＋１０％ＦＢＳ、＋６ｍＭのＬ－グルタミンを含む５０ｍｌのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＤＭＥＭ（１５－０１８）に交換し、トランスフェクション試薬を、ＡＡＶ２及びＰＥＩｐｒｏ（登録商標）が２μｇ／ｍｌの最終濃度となるように１：２の比率で添加した。次の７２時間の間に、保存ボトル内のｐＨが７未満に低下した場合は、培養培地を新しい供給培地に交換した。バイオリアクターの出口でｐＯ２の５０％以上の飽和及び７以上のｐＨを維持するように、灌流流量を適切に調整した。５Ｘ ＴｒｙｐＬＥ（商標）を使用して細胞を採取した。トランスフェクション効率は蛍光フローサイトメータで分析し、ウイルス粒子及びウイルスゲノム力価はＥＬＩＳＡ及びＰＣＲアッセイによって分析した。細胞培養の結果を表２に示す。ここで、「ＶＰ」はウイルスタンパク質を表し、「ＧＣ」はゲノムコピーを表す。

本明細書に開示される実施形態は、細胞培養及びウイルスベクター産生のための既存のプラットフォームに優る利点を有する。本開示の実施形態は、例えば、接着細胞又は半接着細胞、トランスフェクトされた細胞を含むヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＨＥＫ２３など）、レンチウイルス（幹細胞、ＣＡＲ－Ｔ）及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルスベクターを含めた、多くの種類の細胞及び細胞副生成物の産生に使用することができることに留意されたい。これらは、本明細書に開示されるバイオリアクター又は細胞培養基材の幾つかの一般的な用途の例であるが、当業者であれば他の用途への実施形態の適用可能性を理解するように、開示される実施形態の使用又は用途を限定することを意図するものではない。

上で論じたように、本開示の実施形態の利点の１つは、細胞培養基材を通る流れの均一性である。理論に束縛されることは望まないが、細胞培養基材の規則的な構造又は均一な構造は、培地が流れることができる一貫した均一な本体を提供すると考えられる。対照的に、既存のプラットフォームは主にフェルト状又は不織繊維材料などの不規則又はランダムな基材に依拠している。本開示の基材の均一な特性は、基材上で達成される均一かつ一貫した細胞播種を調べることによって説明することができる。例えば、図１６Ａは、本開示の幾つかの実施形態による基材材料の３つのディスク（１８０１、１８０２、１８０３）を示している。図１６Ａのディスクは、本明細書に記載される織物ＰＥＴメッシュ材料であり、各々が約６０ｍｍの直径を有する。同様のディスクを１０から３００層詰め込んだバイオリアクターの表面積は、約６７８から２０，３００ｃｍ^２になるであろう。この例では、１００枚のディスクのスタックを使用して細胞培養を実施した。第１のディスク１８０１はバイオリアクター内のこのようなディスクのスタックの上部ディスクであり、第２のディスク１８０２はスタックの中間のディスクであり、第３のディスク１８０３はスタックの底部ディスクであった。

図１６Ａは、接種の７２時間後のバイオリアクター内の細胞分布の均一性を示している。充填床の３つの異なる領域に由来する基材層をバイオリアクターから取り出し、クリスタルバイオレットで染色して、接着したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を視覚化した。上部層、中間層及び底部層の細胞の染色の均一性は、播種及び接着ステップ中に細胞が充填床全体にわたる均一な分布を示した。開示されたバイオリアクターから採取された細胞の効率を確認するために、充填床基材試料も採取後に染色した（図１６Ｂを参照）。図１６Ｂは、採取ステップ後に充填床の３つの異なるゾーンから回収された染色された基材層を示している。図１６Ｂからわかるように、採取プロセスにより、バイオリアクターから９５％を超える細胞を回収した。細胞培養結果を表３に示す。

図１６Ａ及び１６Ｂの画像を生成した実験では、バイオリアクターに細胞培養培地を事前に充填し、システムを一晩プレコンディショニングして、ｐＨ７．２、Ｄ．Ｏ．１００％、及び３７℃の定常状態に達した。４００ｍｌのＡＴＣＣ ＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ＋６ｍＭ Ｌ－グルタミンを使用して、バイオリアクターシステム全体を満たした。懸濁液中、３０ｍｌのＨＥＫ２９３Ｔ細胞（５００万細胞／ｍＬ）を、３方向ポートを通して充填床に直接注入して、接種を形成した。最初の４８時間、バイオリアクターを前処理した培地で３０ｍＬ／分の速度で灌流して、充填床内で均一な細胞分布、接着、及び初期増殖を可能にした。４８時間の培養後、２００ｍｌの新鮮な完全ＡＴＣＣ ＤＭＥＭ培地をシステムに添加して、グルコースレベルを１ｇ／Ｌを上回るように維持した。灌流流量を、バイオリアクター出口においてＤＯ_externalが４５％以上の培地飽和度を維持するように自動的に調整した。接種の７２時間後、培地を５００ｍｌのＣｏｒｎｉｎｇ ＤＭＥＭ（１５－０１８）＋１０％ＦＢＳ＋６ｍＭのＬ－グルタミンと交換し、２時間灌流させた。トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクション混合物（プラスミドＤＮＡとＰＥＩの比率１：２の複合体；総ＤＮＡ０．８μｇ／１００万細胞）を培地の最終濃度が総ＤＮＡ２μｇ／ｍｌになるように添加し、消費済みの栄養素を補充するために、培養培地を５００ｍｌの新鮮な完全Ｃｏｒｎｉｎｇ ＤＭＥＭ（１５－０１８）培地と交換した。灌流流量を、バイオリアクターの出口でＤＯ_externalが４５％以上の飽和度を維持するように自動的に調整した。その後の４８時間の培養中にグルコースレベルを監視し、必要に応じて培地の追加又は交換を通じて補充し、レベルを０．３ｇ／Ｌを上回るように維持した。トランスフェクションの７２時間後、細胞をＤＰＢＳ洗浄し、１Ｘ Ａｃｃｕｔａｓｅ溶液を使用して採取した。トランスフェクション効率は蛍光フローサイトメトリーによって分析し、ウイルス粒子及びウイルスゲノム力価はＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲアッセイによって分析した。

クリスタルバイオレット染色を使用して、図１６Ａのディスクの表面全体にわたる細胞の均一な増殖を強調した。第１のディスク１８０１、第２のディスク１８０２、及び第３のディスク１８０３が細胞培養マトリクスのスタック全体に広がっているにもかかわらず、細胞増殖は３つのディスクすべてにわたって一貫している。図１６Ａの画像は、７２時間の培養後に、細胞を基材から採取する前に撮影したものである。図１６Ｂは、細胞が採取された後の同じ３つのディスク（１８０１’、１８０２’、及び１８０３’）を示している。図１６Ｂにおいて結晶染色が相対的に存在しないことによって示されるように、細胞は、各ディスクの表面全体及び細胞培養マトリクススタックの３つのディスク全体にわたって均一に採取された。分析に基づくと、９５％以上の細胞がバイオリアクターから回収された。総表面積６７８０ｃｍ^２の直径６０ｍｍの基材スタック／容器でのＡＡＶ産生の細胞培養結果を以下の表３に示す。これは、トランスフェクトされた細胞の収量、トランスフェクション効率、及び１ｃｍ^２あたりのウイルスゲノム収量を示している。繰り返しになるが、基材の均一な構造と均一な流動特性が、この効率的かつ均一な増殖及び採取能力に寄与すると考えられる。

下記表４は、異なる直径（２９ｍｍ及び６０ｍｍ）のバイオリアクター容器を含む複数の実験に関連した上記の結果を示している。データは、より小さい容器（例えば、直径２９ｍｍ、表面積１６００ｃｍ^２）とより大きい（例えば、直径６０ｍｍ、表面積６７８０ｃｍ^２）容器及び／又は充填床マトリクスとの間で優れたスケーラビリティを示している。

実施例。６０ｍｍバイオリアクターユニットでのＨＥＫ２９３Ｔ細胞によるＡＡＶ産生、及び充填床バイオリアクターでのＡＡＶ産生。

充填床バイオリアクターは、図７に示すようにアルファユニットでアセンブリした。実際のバイオリアクターの部品を図８に示す。１００層の構造化され処理されたＰＥＴ基材を含む直径６０ｍｍの充填床をバイオリアクター内に配置した。充填床の高さは２６ｍｍであり、細胞の接着及び増殖に利用可能な総２Ｄ表面積は６７８０ｃｍ^２と計算された。バイオリアクターに細胞培養培地をあらかじめ充填し、システムを一晩プレコンディショニングして、ｐＨ７．２、Ｄ．Ｏ．１００％、及び３７℃の定常状態を達成した。４００ｍｌのＡＴＣＣ ＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ＋６ｍＭ Ｌ－グルタミンを使用して、バイオリアクターシステム全体を満たした（図１２）。懸濁液中、３０ｍｌのＨＥＫ２９３Ｔ細胞（５００万細胞／ｍＬ）、接種のために３方向ポート４１３を通して充填床に直接注入した。

最初の４８時間、バイオリアクターを前処理した培地で３０ｍＬ／分の速度で灌流して、充填床内で均一な細胞分布、接着、及び初期増殖を可能にした。４８時間の培養後、２００ｍｌの新鮮な完全ＡＴＣＣ ＤＭＥＭ培地をシステムに添加して、グルコースレベルを１ｇ／Ｌを上回るように維持した。灌流流量を、バイオリアクター出口においてＤＯ_externalが４５％以上の培地飽和度を維持するように自動的に調整した。

接種の７２時間後、培地を５００ｍｌのＣｏｒｎｉｎｇ ＤＭＥＭ（１５－０１８）＋１０％ＦＢＳ＋６ｍＭのＬ－グルタミンと交換し、２時間灌流させた。トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクション混合物（プラスミドＤＮＡとＰＥＩの比率１：２の複合体；総ＤＮＡ０．８μｇ／１００万細胞）を培地の最終濃度が総ＤＮＡ２μｇ／ｍｌになるように添加し、消費済みの栄養素を補充するために、培養培地を５００ｍｌの新鮮な完全Ｃｏｒｎｉｎｇ ＤＭＥＭ（１５－０１８）培地と交換した。灌流流量を、バイオリアクターの出口においてＤＯ_externalが４５％以上の飽和度を維持するように自動的に調整した。

その後の４８時間の培養中にグルコースレベルを監視し、必要に応じて培地の追加又は交換を通じて補充し、レベルを０．３ｇ／Ｌを上回るように維持した。トランスフェクションの７２時間後、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、１Ｘ Ａｃｃｕｔａｓｅ溶液を使用して採取した。トランスフェクション効率は蛍光フローサイトメトリーによって分析し、ウイルス粒子及びウイルスゲノム力価はＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲアッセイによって分析した。図１６Ａは、接種の７２時間後のバイオリアクター内の細胞分布の均一性を示している。図１６Ｂからわかるように、採取プロセスにより、バイオリアクターから９５％を超える細胞を回収した。細胞培養結果を表３に示す。

上で論じたように、本開示の実施形態は、比較的小さく実用的な設置面積で高密度の細胞を培養可能な充填床細胞培養マトリクス及び／又はバイオリアクターを提供することができる。例えば、上記表３及び４の実施例の６０ｍｍの細胞培養マトリクスは、約６８７０ｃｍ^２の表面積を有する。参考までに、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋ（登録商標）は、約１７２０ｃｍ^２の表面積を有する。表３及び４の直径６０ｍｍの細胞培養マトリクスは、ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋ（登録商標）よりも小さいバイオリアクターに収容することができるが、それでもなお、採取時の細胞数が増加し、容器あたりの総ゲノムコピー数（ＧＣ、又はウイルスゲノム（ＶＧ））が増加する。図１７Ａ、１７Ｂ、及び１７Ｃは、ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋ（登録商標）の２Ｄ表面上の細胞培養からのデータと比較した、表３及び４の直径６０ｍｍの基材を用いた本開示による２つのバイオリアクター容器内での細胞培養から得られたデータを示しており、これには、１ｃｍ^２あたりのＧＣが含まれ（図１７Ｃ）、この例では、ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋ（登録商標）よりも低いが、より高い表面積でそれを補っている。

図２６は、１つ以上の実施形態による細胞培養システム５２０のより詳細な概略図を示している。システム５２０の基本構造は、図１２のシステム４００と同様であり、ＰＥＴ織物メッシュなどの細胞培養材料の充填床を含む容器を有する充填床バイオリアクター５２２と、別個の培地調整容器５２４とを備えている。しかしながら、システム４００とは対照的に、システム５２０は、センサ、ユーザインターフェース及び制御装置、並びに培地及び細胞のためのさまざまな入口及び出口を含む、システムの詳細を示している。幾つかの実施形態によれば、培地調整容器５２４は、適切な温度、ｐＨ、Ｏ_２、及び栄養素を提供するためにコントローラ５２６によって制御される。幾つかの実施形態では、バイオリアクター５２２はコントローラ５２６によって制御することもできるが、他の実施形態では、バイオリアクター５２２は、別個の潅流回路５２８内に設けられ、バイオリアクター５２２の出口又はその近くでのＯ２の検出に基づいて、ポンプを使用して、潅流回路５２８を通る培地の流量を制御する。

例示的な実装形態
以下は、開示された主題の実装形態のさまざまな態様の説明である。各態様は、開示された主題のさまざまな特徴、特性、又は利点のうちの１つ以上を含みうる。実装形態は、開示された主題の幾つかの態様を説明することを意図しており、すべての可能な実装形態の包括的又は網羅的な説明と見なされるべきではない。

態様１は、細胞培養システムであって、
バイオリアクター容器と、
該バイオリアクター容器内に配置され、細胞を培養するように構成された細胞培養マトリクスであって、該細胞培養マトリクスが第１の面、該第１の面とは反対側の第２の面、第１の面と第２の面とを分離する厚さ、及び基材内に形成され、基材の厚さを貫通する複数の開口部を備えた基材を含み、該複数の開口部が、細胞培養培地、細胞、又は細胞副生成物のうちの少なくとも１つが基材の厚さを通って流れることを可能にするように構成される、細胞培養マトリクスと
を含む、細胞培養システムに関する。

態様２は、基材が、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンオキシド、ポリピロール類、及びポリプロピレンオキシドのうちの少なくとも１つを含む、態様１に記載の細胞培養システムに関する。

態様３は、基材が、成形ポリマー格子シート、３Ｄ印刷された格子シート、及び織物メッシュシートのうちの少なくとも１つを含む、態様１又は態様２に記載の細胞培養システムに関する。

態様４は、基材が、１つ以上の繊維を含む織物メッシュを含む、態様３に記載の細胞培養システムに関する。

態様５は、１つ以上の繊維が、平坦、円形、長方形、又は多角形のうちの少なくとも１つである断面形状を含む、態様４に記載の細胞培養システムに関する。

態様６は、１つ以上の繊維が、モノフィラメント繊維及びマルチフィラメント繊維のうちの少なくとも一方を含む、態様４又は態様５に記載の細胞培養システムに関する。

態様７は、１つ以上の繊維が、約５０μｍから約１０００μｍ、約５０μｍから約６００μｍ、約５０μｍから約４００μｍ、約１００μｍから約３２５μｍ、又は約１５０μｍから約２７５μｍの第１の繊維直径を有する第１の繊維を含む、態様４から６のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様８は、１つ以上の繊維が、約５０μｍから約１０００μｍ、約５０μｍから約６００μｍ、約５０μｍから約４００μｍ、約１００μｍから約３２５μｍ、又は約１５０μｍから約２７５μｍの第２の繊維直径を有する第２の繊維をさらに含む、態様７に記載の細胞培養システムに関する。

態様９は、第２の繊維直径が第１の繊維直径とは異なる、態様８に記載の細胞培養システムに関する。

態様１０は、複数の開口部が、約１００μｍから約１０００μｍ、約２００μｍから約９００μｍ、又は約２２５μｍから約８００μｍの開口部直径を含む、態様１から７のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様１１は、繊維直径が約２５０μｍから約３００μｍであり、開口部直径が約７５０μｍから約８００μｍであるか、又は繊維直径が約２７０μｍから約２７６μｍであり、開口部直径が約７８５μｍから約７９５μｍである、態様１０に記載の細胞培養システムに関する。

態様１２は、繊維直径が約２００μｍから約２３０μｍであり、開口部直径が約５００μｍから約５５０μｍであるか、又は繊維直径が約２１５μｍから約２２５μｍであり、開口部直径が約５１５μｍから約５３０μｍである、態様１０に記載の細胞培養システムに関する。

態様１３は、繊維直径が約１２５μｍから約１７５μｍであり、開口部直径が約２２５μｍから約２７５μｍであるか、又は繊維直径が約１５０μｍから約１６５μｍであり、開口部直径が約２３５μｍから約２５５μｍである、態様１０に記載の細胞培養システムに関する。

態様１４は、開口部直径の繊維直径に対する比が、約１．０から約３．５、約１．２５から約３．２５、約１．４から約３．０、約１．５から約２．９、約１．５から約２．４、又は約２．４から約２．９である、態様１０から１３のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様１５は、複数の開口部が、正方形、長方形、菱形、偏菱形、円形、又は楕円形の形状を有する開口部を含む、態様１から１４のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様１６は、複数の開口部が規則的なパターンで配列される、態様１から１５のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様１７は、細胞培養マトリクスが単層基材を含む、態様１から１６のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様１８は、細胞培養マトリクスが多層基材を含み、該多層基材が少なくとも第１の基材層と第２の基材層とを含み、第１の基材層が第１の面と該第１の面とは反対側の第２の面とを含み、第２の基材層が、第３の面と該第３の面とは反対側の第４の面とを含み、第２の面が第３の面に面する、態様１から１７のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様１９は、多層基材が、第１の基材層が第２の基材層に対して所定の位置合わせを有するように構成される、態様１８に記載の細胞培養システムに関する。

態様２０は、多層基材が、第１の基材層上の繊維の交点が第２の基材層の開口部に面するように構成される、態様１９に記載の細胞培養システムに関する。

態様２１は、第１の基材層の開口部が第２の基材層の開口部と少なくとも部分的に重なる、態様１９又は態様２０に記載の細胞培養システムに関する。

態様２２は、第１の基材層及び第２の基材層の開口部が位置合わせされる、態様２１に記載の細胞培養システムに関する。

態様２３は、多層基材が、第１の基材層が第２の基材層に対してランダムな配向を有するように構成される、態様１８に記載の細胞培養システムに関する。

態様２４は、細胞培養マトリクスが、バイオリアクター容器を通る培地のバルク流れ方向が第１の面及び第２の面に対して平行又は垂直となるようにバイオリアクター容器内に配置される、態様１から２３のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様２５は、細胞培養マトリクスが、バイオリアクター容器内にランダムに充填された複数の基材を含む、態様１から２４のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様２６は、バイオリアクター容器が充填床バイオリアクターである、態様１から２５のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様２７は、バイオリアクター容器が、該バイオリアクター容器内に配置され、細胞培養マトリクスを含む培養空間と、該培養空間に流体を提供するか、又は培養空間から流体を取り出すように構成された１つ以上の開口部とを含む、態様１から２６のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様２８は、１つ以上の開口部が、流体を培養空間の内部に提供するように構成された入口と、流体をバイオリアクター容器の培養空間から取り出すことができるように構成された出口とを含む、態様２７に記載の細胞培養システムに関する。

態様２９は、バイオリアクター容器が、入口を含む第１の端部、該第１の端部とは反対側にある、出口を含む第２の端部、第１の端部と第２の端部との間に配置されている培養空間を含む、態様２８に記載の細胞培養システムに関する。

態様３０は、細胞培養マトリクスが培養空間の形状に対応する形状を有する、態様２９に記載の細胞培養システムに関する。

態様３１は、細胞培養マトリクスが、円筒状のロールの構成のポリマーメッシュ材料を含む、態様１から３０のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様３２は、円筒状のロールの中心長手方向軸が培地の流れ方向に対して平行である、態様３１に記載の細胞培養システムに関する。

態様３３は、円筒状のロールを解くことによって、円筒状のロールがバイオリアクター容器内の培養空間の形状へと拡張するように構成される、態様３１又は態様３２に記載の細胞培養システムに関する。

態様３４は、円筒状のロールが、該円筒状のロールが収縮した状態で培養空間に挿入され、培養空間内に配置されると培養空間内で拡張するように構成される、態様３１から３３のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様３５は、円筒状のロール及び培養空間が、ポリマーメッシュ材料と培養空間の壁との間の摩擦力によってポリマーメッシュ材料を培養空間内の所定の位置に保持されるように構成される、態様３１から３４のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様３６は、円筒状のロールが、バイオリアクター容器の開口部を通じて培養空間に挿入されるように構成される、態様３４に記載の細胞培養システムに関する。

態様３７は、開口部がバイオリアクター容器の入口及び出口のうちの一方である、態様３６に記載の細胞培養システムに関する。

態様３８は、バイオリアクター容器が培養空間内に基材支持体を含み、該基材支持体が、培養空間内で細胞培養マトリクスを誘導、位置合わせ、又は固定するように構成される、態様３１から３７のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様３９は、基材支持体が、第１の端部又は第２の端部のうちの一方から第１の端部又は第２の端部のうちの他方へと延びる支持部材を含み、円筒状のロールが、支持部材が円筒状のロールの中心長手方向軸に対して平行になるように支持部材を取り囲むように構成される、態様３８に記載の細胞培養システムに関する。

態様４０は、バイオリアクター容器が、細胞培養中にバイオリアクター容器の中心長手方向軸の周りを回転するように構成される、態様１から３９のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様４１は、中心長手方向軸が、細胞培養中、重力の方向に対して垂直である、態様４０に記載の細胞培養システムに関する。

態様４２は、細胞培養システムが、バイオリアクター容器の回転中に基材が細胞培養流体中を移動するように構成される、態様４０又は態様４１に記載の細胞培養システムに関する。

態様４３は、細胞培養システムが、バイオリアクター容器に動作可能に連結し、中心長手方向軸の周りでバイオリアクター容器を回転させるように構成された回転手段をさらに含む、態様４０から４２のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様４４は、細胞培養マトリクスが、異なる幾何学形状の織物メッシュをさらに含む複数の基材を含み、異なる幾何学形状が、繊維直径、開口部直径、又は開口部幾何学形状のうちの少なくとも１つにおいて異なっている、態様１から４３のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様４５は、異なる幾何学形状の織物メッシュが、バイオリアクター容器内の所望の流れ特性に基づいて、バイオリアクター容器内に所定の配置で配置される、態様４４に記載の細胞培養システムに関する。

態様４６は、所望の流れ特性が、細胞培養マトリクス全体にわたる液体培地の均一な灌流、及び細胞培養マトリックス全体にわたる細胞増殖の分布のうちの少なくとも一方を含む、態様４５に記載の細胞培養システムに関する。

態様４７は、異なる幾何学形状の織物メッシュが、第１の幾何学形状を有する第１のメッシュと第２の幾何学形状を有する第２のメッシュとを含み、所定の配置が、バルク流れ方向に関して第２のメッシュの上流にある第１のメッシュを含む、態様４５又は態様４６に記載の細胞培養システムに関する。

態様４８は、所定の配置が、第２のメッシュのスタックの上流に配置された第１のメッシュのスタックを含む、態様４７に記載の細胞培養システムに関する。

態様４９は、所定の配置が、バルク流れ方向に沿って交互に配置された第１のメッシュのスタックと第２のメッシュのスタックとを含む、態様４７又は態様４８に記載の細胞培養システムに関する。

態様５０は、接着細胞又は細胞副生成物を採取するための手段をさらに含む、態様１から４９のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様５１は、細胞副生成物が、タンパク質、抗体、ウイルス、ウイルスベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、マクロベシクル、エクソソーム、及び多糖類のうちの少なくとも１つを含む、態様５０に記載の細胞培養システムに関する。

態様５２は、基材が官能化表面を含み、該官能化表面が、ポリマーメッシュ材料への接着細胞の接着を改善するために物理的又は化学的に修飾されている、態様１から５１のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様５３は、細胞培養マトリクスが、メッシュの表面上に培養培地中の成分を吸着又は吸収するように構成された表面を含む、態様１から５２のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様５４は、細胞培養マトリクスが、ポリマーメッシュ材料の表面上にコーティングを含み、該コーティングが、接着細胞の接着を促進するように構成される、態様１から５３のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様５５は、細胞がコーティングに接着する、態様５４に記載の細胞培養システムに関する。

態様５６は、コーティングが、細胞培養マトリクスへの細胞の接着を促進するように構成された生物学的な又は合成の生物活性分子である、態様５４又は態様５５に記載の細胞培養システムに関する。

態様５７は、コーティングが、ヒドロゲル、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、生物活性分子又はペプチド、及び生物学的タンパク質のうちの少なくとも１つである、態様５４から５６のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様５８は、官能化表面がプラズマ処理されている、態様５３から５６のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様５９は、細胞が、接着細胞、浮遊細胞、及び織物メッシュに接着する緩く接着した細胞のうちの少なくとも１つを含む、態様１から５８のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様６０は、バイオリアクター容器の入口に培地を供給するように構成された培地調整容器をさらに含む、態様１から５９のいずれかに記載の細胞培養システムに関する。

態様６１は、第１の面、該第１の面とは反対側の第２の面、第１の面と第２の面とを分離する厚さ、及び基材内に形成され、基材の厚さを貫通する複数の開口部を備えた基材を含み、複数の開口部が、細胞培養培地、細胞、又は細胞副生成物のうちの少なくとも１つが基材の厚さを通って流れることを可能にするように構成される、細胞培養マトリクスに関する。

態様６２は、基材が、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンオキシド、ポリピロール類、及びポリプロピレンオキシドのうちの少なくとも１つを含む、態様６１に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様６３は、基材が、成形ポリマー格子シート、３Ｄ印刷された格子シート、及び織物メッシュシートのうちの少なくとも１つを含む、態様６１又は態様６２に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様６４は、基材が１つ以上の繊維を含む織物メッシュを含む、態様６３に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様６５は、１つ以上の繊維が、平坦、円形、長方形、又は多角形のうちの少なくとも１つである断面形状を含む、態様６４に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様６６は、１つ以上の繊維が、モノフィラメント繊維及びマルチフィラメント繊維のうちの少なくとも一方を含む、態様６４又は態様６５に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様６７は、１つ以上の繊維が、約５０μｍから約１０００μｍ、約５０μｍから約６００μｍ、約５０μｍから約４００μｍ、約１００μｍから約３２５μｍ、又は約１５０μｍから約２７５μｍの第１の繊維直径を有する第１の繊維を含む、態様６４から６６のいずれかに記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様６８は、１つ以上の繊維が、約５０μｍから約１０００μｍ、約５０μｍから約６００μｍ、約５０μｍから約４００μｍ、約１００μｍから約３２５μｍ、又は約１５０μｍから約２７５μｍの第２の繊維直径を有する第２の繊維をさらに含む、態様６７に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様６９は、第２の繊維直径が第１の繊維直径とは異なる、態様６８に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様７０は、複数の開口部が、約１００μｍから約１０００μｍ、約２００μｍから約９００μｍ、又は約２２５μｍから約８００μｍの開口部直径を含む、態様６１から６９のいずれかに記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様７１は、繊維直径が約２５０μｍから約３００μｍであり、開口部直径が約７５０μｍから約８００μｍであるか、又は繊維直径が約２７０μｍから約２７６μｍであり、開口部直径が約７８５μｍから約７９５μｍである、態様７０に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様７２は、繊維直径が約２００μｍから約２３０μｍであり、開口部直径が約５００μｍから約５５０μｍであるか、又は繊維直径が約２１５μｍから約２２５μｍであり、開口部直径が約５１５μｍから約５３０μｍである、態様７０に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様７３は、繊維直径が約１２５μｍから約１７５μｍであり、開口部直径が約２２５μｍから約２７５μｍであるか、又は繊維直径が約１５０μｍから約１６５μｍであり、開口部直径が約２３５μｍから約２５５μｍである、態様７０に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様７４は、開口部直径の繊維直径に対する比が、約１．０から約３．５、約１．２５から約３．２５、約１．４から約３．０、約１．５から約２．９、約１．５から約２．４、又は約２．４から約２．９である、態様７０から７３のいずれかに記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様７５は、複数の開口部が、正方形、長方形、菱形、偏菱形、円形、又は楕円形の形状を有する開口部を含む、態様１から７４のいずれかに記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様７６は、複数の開口部が規則的なパターンで配列される、態様１から７５のいずれかに記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様７７は、細胞培養マトリクスが単層基材を含む、態様１から７６のいずれかに記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様７８は、細胞培養マトリクスが少なくとも第１の基材層と第２の基材層とを備えた多層基材を含み、第１の基材層が第１の面と該第１の面とは反対側の第２の面とを含み、第２の基材層が、第３の面と該第３の面とは反対側の第４の面とを含み、第２の面が第３の面に面する、態様１から７７のいずれかに記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様７９は、多層基材が、第１の基材層が第２の基材層に対して所定の位置合わせを有するように構成される、態様７８に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様８０は、多層基材が、第１の基材層上の繊維の交点が第２の基材層の開口部に面するように構成される、態様７９に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様８１は、第１の基材層の開口部が第２の基材層の開口部と少なくとも部分的に重なる、態様７９又は態様８０に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様８２は、第１の基材層及び第２の基材層の開口部が位置合わせされる、態様８１に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様８３は、多層基材が、第１の基材層が第２の基材層に対してランダムな配向を有するように構成される、態様７８に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様８４は、細胞培養マトリクスが複数の基材を含み、該複数の基材の各々が、複数の基材の他のものに対してランダムな配向にある、態様６１から８３のいずれかに記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様８５は、細胞培養マトリクスが、積層配置された複数の基材を含む、態様６１から８３のいずれかに記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様８６は、複数の基材のうちの１つの第１の面及び第２の面が、積層配置での他の基材の第１の面及び第２の面に対して実質的に平行である、態様８５に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様８７は、基材が円筒状のロールの構成である、態様６１から８３のいずれかに記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様８８は、培養チャンバ内に配置されると、円筒状のロールを部分的に解くことによって、円筒状のロールがバイオリアクター容器内の培養チャンバの形状へと拡張するように構成される、態様８７に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様８９は、円筒状のロールが、該円筒状のロールが収縮した状態で培養空間に挿入され、培養空間内に配置されると培養空間内で拡張するように構成される、態様８８に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様９０は、細胞培養マトリクスが、異なる幾何学形状の織物メッシュを含む複数の基材を含み、異なる幾何学形状が、繊維直径、開口部直径、又は開口部幾何学形状のうちの少なくとも１つにおいて異なっている、態様６１から８９のいずれかに記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様９１は、異なる幾何学形状の織物メッシュが、バイオリアクター容器内の所望の流れ特性に基づいて所定の配置で配列される、態様９０に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様９２は、所望の流れ特性が、細胞培養マトリクス全体にわたる液体培地の均一な灌流、及び細胞培養マトリックス全体にわたる細胞増殖の分布のうちの少なくとも一方を含む、態様９１に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様９３は、異なる幾何学形状の織物メッシュが第１の幾何学形状を有する第１のメッシュと第２の幾何学形状を有する第２のメッシュとを含み、所定の配置が、細胞培養マトリクスを通る細胞培養培地の所望のバルク流れ方向に関して第２のメッシュの上流にある第１のメッシュを含む、態様９１又は態様９２に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様９４は、所定の配置が、第２のメッシュのスタックの上流に配置された第１のメッシュのスタックを含む、態様９３に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様９５は、所定の配置が、バルク流れ方向に沿って交互に配置された第１のメッシュのスタックと第２のメッシュのスタックとを含む、態様９３又は態様９４に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様９６は、細胞培養マトリクスが、細胞、タンパク質、抗体、ウイルス、ウイルスベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、マクロベシクル、エクソソーム、及び多糖類のうちの少なくとも１つを培養及び／又は採取するように構成される、態様６１から９５のいずれかに記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様９７は、基材が官能化表面を含み、該官能化表面が、ポリマーメッシュ材料への接着細胞の接着を改善するために物理的又は化学的に修飾されている、態様６１から９６のいずれかに記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様９８は、細胞培養マトリクスが、メッシュの表面上に培養培地中の成分を吸着又は吸収するように構成された表面を含む、態様６１から９７のいずれかに記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様９９は、細胞培養マトリクスがポリマーメッシュ材料の表面上にコーティングを含み、該コーティングが接着細胞の接着を促進するように構成される、態様６１から９８のいずれかに記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様１００は、細胞がコーティングに接着する、態様９９に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様１０１は、コーティングが、細胞培養マトリクスへの細胞の接着を促進するように構成された生物学的な又は合成の生物活性分子である、態様９９又は態様１００に記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様１０２は、コーティングが、ヒドロゲル、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、生物活性分子又はペプチド、及び生物学的タンパク質のうちの少なくとも１つである、態様９９から１０１のいずれかに記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様１０３は、官能化表面がプラズマ処理されている、態様９９から１０２のいずれかに記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様１０４は、細胞が、接着細胞、浮遊細胞、及び織物メッシュに接着する緩く接着した細胞のうちの少なくとも１つを含む、態様６１から１０３のいずれかに記載の細胞培養マトリクスに関する。

態様１０５は、バイオリアクター内で細胞を培養する方法に関し、該方法は、バイオリアクター容器を提供するステップであって、バイオリアクター容器が、該バイオリアクター容器内の細胞培養チャンバと、該細胞培養チャンバ内に配置され、その上で細胞を培養するように構成された細胞培養マトリクスとを含み、該細胞培養マトリクスが、第１の面、該第１の面とは反対側の第２の面、第１の面と第２の面とを分離する厚さ、及び基材内に形成され、基材の厚さを貫通する複数の開口部を備えた基材を含む、ステップ；細胞培養マトリクス上に細胞を播種するステップ；細胞培養マトリクス上で細胞を培養するステップ；並びに、細胞の培養産物を採取するステップを含み、基材の複数の開口部は、細胞培養培地、細胞、又は細胞副生成物のうちの少なくとも１つが基材の厚さを通って流れることを可能にするように構成される。

態様１０６は、基材が、成形ポリマー格子シート、３Ｄ印刷された格子シート、及び織物メッシュシートのうちの少なくとも１つを含む、態様１０５に記載の方法に関する。

態様１０７は、基材がポリマー材料を含む、態様１０５又は態様１０６に記載の方法に関する。

態様１０８は、ポリマー材料が、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンオキシド、ポリピロール類、及びポリプロピレンオキシドのうちの少なくとも１つである、態様１０７に記載の方法に関する。

態様１０９は、播種するステップが、細胞を基材に接着させるステップを含む、態様１０５から１０８のいずれかに記載の方法に関する。

態様１１０は、播種するステップが、細胞接種材料を細胞培養マトリクスに直接注入するステップを含む、態様１０５から１０９のいずれかに記載の方法に関する。

態様１１１は、細胞接種材料が、バイオリアクター容器の細胞接種材料注入ポートを通じて注入される、態様１１０に記載の方法に関する。

態様１１２は、細胞接種材料の体積が細胞培養チャンバの空隙容積に等しい、態様１１０又は態様１１１に記載の方法に関する。

態様１１３は、細胞接種材料を注入した後、培養チャンバを通じて細胞培地を灌流するステップをさらに含む、態様１１０から１１２のいずれかに記載の方法に関する。

態様１１４は、培養中に細胞培養培地及び酸素のうちの少なくとも一方を細胞に供給するステップをさらに含む、態様１０５から１１３のいずれかに記載の方法に関する。

態様１１５は、細胞培養培地を供給するステップが、細胞培養チャンバを通じて基材全体にわたって細胞培養培地を流すステップを含む、態様１１４に記載の方法に関する。

態様１１６は、細胞培養培地を供給するステップが、バイオリアクター容器に流体的に接続される培地調整容器を提供するステップ、及び培地調整容器からバイオリアクター容器に細胞培養培地を供給するステップを含む、態様１１４又は態様１１５に記載の方法に関する。

態様１１７は、培養中又は培養後に培地の少なくとも一部がバイオリアクター容器から回収され、培地調整容器に戻される、態様１１６に記載の方法に関する。

態様１１８は、細胞培養チャンバへの細胞培養培地の流れを制御するステップをさらに含み、細胞培養培地が、細胞、細胞培養栄養素、又は酸素のうちの少なくとも１つを含む、態様１０５から１１７のいずれかに記載の方法に関する。

態様１１９は、バイオリアクター容器内の細胞培養培地、細胞、及び／又は細胞産物、又はバイオリアクター容器からの生産物を分析するステップをさらに含む、態様１０５から１１８のいずれかに記載の方法に関する。

態様１２０は、分析するステップが、ｐＨ_１、ｐＯ_１、［グルコース］_１、ｐＨ_２、ｐＯ_２、［グルコース］_２、及び流量のうちの少なくとも１つを測定するステップを含み、ｐＨ_１、ｐＯ_１、及び［グルコース］_１が細胞培養チャンバ内で測定され、ｐＨ_２、ｐＯ_２、及び［グルコース］_２が細胞培養チャンバ又はバイオリアクター容器の出口で測定される、態様１１９に記載の方法に関する。

態様１２１は、細胞培養チャンバへの細胞培養培地の流れが、少なくとも一部には、細胞培養培地、細胞、及び／又は細胞産物の分析結果に基づいて制御される、態様１１９又は態様１２０に記載の方法に関する。

態様１２２は、ｐＨ_２≧ｐＨ_２ｍｉｎ、ｐＯ_２≧ｐＯ_２ｍｉｎ、及び［グルコース］_２≧［グルコース］_２ｍｉｎのうちの少なくとも１つである場合、細胞培養チャンバへの細胞培養培地の灌流流量が現在の速度で継続され、ｐＨ_２ｍｉｎ、ｐＯ_２ｍｉｎ、及び［グルコース］_２ｍｉｎが細胞培養システムの設計に基づいて事前に決定される、態様１２０又は態様１２１に記載の方法に関する。

態様１２３は、現在の流量が細胞培養システムの所定の最大流量以下の場合、灌流流量を増加させる、態様１２０から１２２のいずれかに記載の方法に関する。

態様１２４は、現在の流量が細胞培養システムの所定の最大流量以下でない場合、細胞培養システムのコントローラが、ｐＨ_２ｍｉｎ、ｐＯ_２ｍｉｎ、及び［グルコース］_２ｍｉｎ、ｐＨ_１、ｐＯ_１、及び［グルコース］_１、並びにバイオリアクター容器の高さのうちの少なくとも１つを再評価する、態様１２０から１２３のいずれかに記載の方法に関する。

態様１２５は、少なくとも約２４時間、少なくとも約４８時間、又は少なくとも約７２時間の培養後に、細胞が、約９０％を超える、又は約９５％を超える生存率を有する、態様１０５から１２４のいずれかに記載の方法に関する。

態様１２６は、細胞が、接着細胞、浮遊細胞、及び細胞培養マトリクスに接着する緩く接着した細胞のうちの少なくとも１つを含む、態様１０５から１２５のいずれかに記載の方法に関する。

態様１２７は、細胞の培養の産物が、細胞、タンパク質、抗体、ウイルス、ウイルスベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、マクロベシクル、エクソソーム、及び多糖類のうちの少なくとも１つを含む、態様１０５から１２６のいずれかに記載の方法に関する。

態様１２８は、細胞の培養の産物が、少なくとも８０％が生存している、少なくとも８５％が生存している、少なくとも９０％が生存している、少なくとも９１％が生存している、少なくとも９２％が生存している、少なくとも９３％が生存している、少なくとも９４％が生存している、少なくとも９５％が生存している、少なくとも９６％が生存している、少なくとも９７％が生存している、少なくとも９８％が生存している、又は少なくとも９９％が生存している細胞を含む、態様１２７に記載の方法に関する。

態様１２９は、少なくとも１つのリザーバを含む細胞培養容器と、少なくとも１つのリザーバ内に配置された細胞培養マトリクスであって、細胞が接着するように構成された表面を備えた複数の織り混ぜられた繊維を有する織物基材を含む細胞培養マトリクスとを含む、バイオリアクターシステムに関する。

態様１３０は、織物基材が、複数の織り混ぜられた繊維の均一な配置を含む、態様１２９に記載のシステムに関する。

態様１３１は、織物基材が、複数の繊維間に配置された複数の開口部を含む、態様１２９又は態様１３０に記載のシステムに関する。

態様１３２は、複数の繊維がポリマー繊維を含む、態様１２９から１３１のいずれかに記載のシステムに関する。

態様１３３は、ポリマー繊維が、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンオキシド、ポリピロール類、及びポリプロピレンオキシドのうちの少なくとも１つを含む、態様１３２に記載のシステムに関する。

態様１３４は、細胞培養マトリクスが複数の織物基材を含む、態様１２９から１３３のいずれかに記載のシステムに関する。

態様１３５は、複数の基材の各基材が、第１の面、該第１の面とは反対側の第２の面、第１の面と第２の面とを分離する厚さを含み、複数の開口部が基材の厚さを貫通する、態様１３４に記載のシステムに関する。

態様１３６は、複数の基材の基材が、基材の第１の面及び第２の面の一方が隣接する基材の第１の面又は第２の面の他方に隣接するように、互いに隣接して配置される、態様１３４又は態様１３５に記載のシステムに関する。

態様１３７は、複数の基材の少なくとも一部がスペーサ材料又は障壁によって分離されない、態様１３４から１３６のいずれかに記載のシステムに関する。

態様１３８は、複数の基材の少なくとも一部が互いに物理的に接触している、態様１３４から１３７のいずれかに記載のシステムに関する。

態様１３９は、細胞培養容器が、少なくとも１つのポートを通じて少なくとも１つのリザーバに材料を供給、又は少なくとも１つのリザーバから材料を取り出すように構成された少なくとも１つのポートを含む、態様１２９から１３８のいずれかに記載のシステムに関する。

態様１４０は、少なくとも１つのポートが、少なくとも１つのリザーバに材料を供給するための少なくとも１つの入口と、少なくとも１つのリザーバから材料を取り出すための少なくとも１つの出口とを含む、態様１３９に記載のシステムに関する。

態様１４１は、材料が、培地、細胞、又は細胞産物のうちの少なくとも１つを含む、態様１４０に記載のシステムに関する。

態様１４２は、第１の端部、第２の端部、及び第１の端部と第２の端部との間の少なくとも１つのリザーバを備えた細胞培養容器と、少なくとも１つのリザーバ内に配置された細胞培養マトリクスであって、細胞が接着するように構成された表面を有する各々が複数の織り混ぜられた繊維を含む複数の織物基材を備えた細胞培養マトリクスとを含む、バイオリアクターシステムに関し、ここで、該バイオリアクターシステムは、材料を少なくとも１つのリザーバを通して第１の端部から第２の端部への流れ方向に流すように構成され、複数の織物基材の基材は、各織物基材が、他の織物基材の各々に対して実質的に平行になり、流れ方向に対して実質的に垂直になるように積み重ねられる。

態様１４３は、基材の各々が、第１の面、該第１の面とは反対側の第２の面、第１の面と第２の面とを分離する厚さを含み、複数の開口部が基材の厚さを貫通する、態様１４２に記載のシステムに関する。

態様１４４は、第１の端部、第２の端部、及び第１の端部と第２の端部との間の少なくとも１つのリザーバを備えた細胞培養容器と、少なくとも１つのリザーバ内に配置された細胞培養マトリクスであって、細胞が接着するように構成された表面を有する各々が複数の織り混ぜられた繊維を含む複数の織物基材を備えた細胞培養マトリクスとを含む、バイオリアクターシステムに関し、ここで、該バイオリアクターシステムは、材料を少なくとも１つのリザーバを通して第１の端部から第２の端部への流れ方向に流すように構成され、複数の織物基材の基材は、各織物基材が、他の織物基材の各々に対して実質的に平行になり、流れ方向に対して実質的に平行になるように積み重ねられる。

態様１４５は、基材の各々が、第１の面、該第１の面とは反対側の第２の面、第１の面と第２の面とを分離する厚さを含み、複数の開口部が基材の厚さを貫通する、態様１４４に記載のシステムに関する。

態様１４６は、バイオリアクターシステムであって、第１の端部、第２の端部、及び第１の端部と第２の端部との間の少なくとも１つのリザーバを備えた細胞培養容器と、少なくとも１つのリザーバ内に配置された細胞培養マトリクスであって、そこに細胞が接着するように構成された表面を有する複数の織り混ぜられた繊維を備えた織物基材を含む、細胞培養マトリクスとを含み、少なくとも１つのリザーバ及び細胞培養マトリクスのうちの少なくとも一方が、細胞培養中にバイオリアクター容器の中心長手方向軸の周りを回転するように構成される、バイオリアクターシステムに関する。

態様１４７は、織物基材が、バイオリアクター容器の中心長手方向軸を少なくとも部分的に取り囲む円筒状基材として、少なくとも１つのリザーバ内に配置される、態様１４６に記載のシステムに関する。

態様１４８は、バイオリアクターシステムが、材料を少なくとも１つのリザーバを通して第１の端部から第２の端部への流れ方向に流すように構成される、態様１４６又は態様１４７に記載のシステムに関する。

態様１４９は、円筒状基材の中心長手方向軸が、培地の流れ方向に対して平行である、態様１４８に記載のシステムに関する。

態様１５０は、円筒状基材が、巻かれた織物基材の巻き戻しによって少なくとも１つのリザーバの壁と接触するように拡張するように構成された、巻かれた織物基材を含む、態様１４６から１４９のいずれかに記載のシステムに関する。

態様１５１は、巻かれた織物基材が、細胞培養容器内の少なくとも１つのリザーバの内部の形状へと拡張するように構成される、態様１４６から１５０のいずれかに記載のシステムに関する。

態様１５２は、巻かれた織物基材が、該巻かれた織物基材が収縮した巻かれた状態にある間に培養空間に挿入され、リザーバ内に配置されるとリザーバ内で拡張するように構成される、態様１５１に記載のシステムに関する。

態様１５３は、巻かれた織物基材及びリザーバが、織物基材とリザーバの壁との間の摩擦力によって織物基材がリザーバ内の実質的に所定の位置に保持されるように構成される、態様１５１又は態様１５２に記載のシステムに関する。

態様１５４は、巻かれた織物基材が、細胞培養容器の開口部を通してリザーバ内に挿入されるように構成される、態様１５１から１５３のいずれかに記載のシステムに関する。

態様１５５は、開口部が細胞培養容器の入口及び出口のうちの一方である、態様１５４に記載のシステムに関する。

態様１５６は、細胞培養容器が、リザーバ内に基材支持体を含み、該基材支持体が培養空間内で織物基材を誘導、位置合わせ、又は固定するように構成される、態様１４６から１５５のいずれかに記載のシステムに関する。

態様１５７は、基材支持体が、第１の端部又は第２の端部のうちの一方から第１の端部又は第２の端部のうちの他方へと延びる支持部材を含み、巻かれた織物基材が、支持部材が巻かれた織物基材の中心長手方向軸に対して平行になるように、支持部材の周囲の少なくとも一部を取り囲むように構成される、態様１５６に記載のシステムに関する。

態様１５８は、中心長手方向軸が、細胞培養中に重力の方向に対して垂直である、態様１４６から１５７のいずれかに記載のシステムに関する。

態様１５９は、バイオリアクターシステムが、細胞培養容器の回転中に基材が細胞培養流体中を移動するように構成される、態様１４６から１５８のいずれかに記載のシステムに関する。

態様１６０は、バイオリアクターシステムが、細胞培養容器に動作可能に連結し、中心長手方向軸の周りで細胞培養容器を回転させるように構成された回転手段をさらに含む、態様１４６から１５９のいずれかに記載のシステムに関する。

態様１６１は、織り混ぜられた複数の繊維と、該複数の繊維間に配置された複数の開口部とを含む織物基材を含む、細胞培養マトリクスに関し、ここで、各繊維は、細胞が接着するように構成された表面を含む。

態様１６２は、繊維の表面が、細胞がそこに放出可能に接着するように構成される、態様１６１に記載のマトリクスに関する。

態様１６３は、複数の繊維がポリマー繊維を含む、態様１６１又は態様１６２に記載のマトリクスに関する。

態様１６４は、ポリマー繊維が、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンオキシド、ポリピロール類、及びポリプロピレンオキシドのうちの少なくとも１つを含む、態様１６３に記載のマトリクスに関する。

態様１６５は、細胞培養マトリクスが複数の織物基材をさらに含む、態様１６１から１６４のいずれかに記載のマトリクスに関する。

態様１６６は、複数の基材の各基材が、第１の面、該第１の面とは反対側の第２の面、第１の面と第２の面とを分離する厚さを含み、複数の開口部が基材の厚さを貫通する、態様１６５に記載のマトリクスに関する。

態様１６７は、複数の基材の基材が、基材の第１の面及び第２の面の一方が隣接する基材の第１の面及び第２の面の他方に隣接するように、互いに隣接して配置される、態様１６５又は態様１６６に記載のマトリクスに関する。

態様１６８は、複数の基材の少なくとも一部が、スペーサ材料又は障壁によって分離されない、態様１６５から１６７のいずれかに記載のマトリクスに関する。

態様１６９は、複数の基材の少なくとも一部が互いに物理的に接触している、態様１６５から１６８のいずれかに記載のマトリクスに関する。

態様１７０は、培地入口、培地出口、及び細胞培養空間を備えた容器であって、細胞培養空間が、容器の内部に配置され、培地入口及び培地出口と流体連通して培地入口と培地出口との間に配置されている、容器を含む、バイオリアクターシステムに関し、ここで、細胞培養空間は、細胞培養基材セクションと、該細胞培養基材セクションと培地出口との間に配置されたスペーサセクションとを含み、細胞培養空間は、細胞培養基材を充填床構成で含むように構成される。

態様１７１は、細胞培養基材が態様６１から１０４のいずれかに記載の細胞培養マトリクスを含む、態様１７０に記載のバイオリアクターシステムに関する。

態様１７２は、培地入口と細胞培養空間との間に配置された流れ分配プレートをさらに含む、態様１７０又は態様１７１に記載のバイオリアクターシステムに関する。

態様１７３は、細胞培養空間とスペーサセクションとの間に配置された充填床保持層をさらに含む、態様１７０から１７２のいずれかに記載のバイオリアクターシステムに関する。

態様１７４は、培地出口と細胞培養空間との間に配置されたスペーサインサートをさらに含む、態様１７０から１７３のいずれかに記載のバイオリアクターシステムに関する。

態様１７５は、スペーサインサートが、培地出口と充填床保持層との間に配置される、態様１７４に記載のバイオリアクターシステムに関する。

定義
「全合成」又は「完全合成」とは、完全に合成原料から構成され、動物由来又は動物起源の材料を欠いている、マイクロキャリア又は培養容器の表面などの細胞培養物品を指す。本開示の全合成された細胞培養物品は、異種汚染のリスクを排除する。

「含む（Include,includes）」、又は同様の用語は、網羅的であるが限定的ではない、すなわち包括的であって排他的ではないことを意味する。

「ユーザ」とは、本明細書に開示されているシステム、方法、物品、又はキットを使用する人々を指し、細胞又は細胞産生物を採取するために細胞を培養している人々、又は本明細書の実施形態に従って培養及び／又は採取された細胞又は細胞産生物を使用する人々を含む。

本開示の実施形態を説明する際に採用される、例えば、組成物中の成分の量、濃度、体積、プロセス温度、プロセス時間、収率、流量、圧力、粘度などの値、及びそれらの範囲、又は構成要素の寸法及び同様の値並びにそれらの範囲を変更する「約」は、例えば、材料、組成物、複合材料、濃縮物、構成部品、製造品、又は使用製剤の調製に使用される一般的な測定及び取り扱い手順を通じて；これらの手順における不注意によるエラーを通じて；方法を実行するために使用される出発材料又は原料の製造、供給源、又は純度の違いを通じて；及び同様の考慮事項を通じて発生する可能性のある数量の変動を指す。「約」という用語は、特定の初期濃度又は混合物を伴う組成物又は製剤の劣化に起因して異なる量、及び特定の初期濃度又は混合物を伴う組成物又は製剤の混合又は加工に起因して異なる量も包含する。

「任意選択の」又は「任意選択的に」とは、その後に記載される事象又状況が発生してもしなくてもよいこと、及び、その記載が、当該事象又状況が発生する場合と発生しない場合を含むことを意味する。

本明細書で用いられる不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」及びその対応する定冠詞「ｔｈｅ」は、別段の指定がない限り、少なくとも１つ又は１つ以上を意味する。

当業者によく知られている略語が用いられることがある（例えば、時間を「ｈ」又は「ｈｒｓ」、グラムを「ｇ」又は「ｇｍ」、ミリリットルを「ｍＬ」、室温を「ｒｔ」、ナノメートルを「ｎｍ」、及び同様の略語）。

成分、原料、添加剤、寸法、条件、及び同様の特徴、並びにそれらの範囲について開示されている特定の好ましい値は、例示のみを目的としており、他の定義された値又は定義された範囲内の他の値を除外しない。本開示のシステム、キット、及び方法は、本明細書に記載されるいずれかの値、特定の値、さらに具体的な値、及び好ましい値のうちの任意の値又は任意の組合せを含みうる。

特に明記しない限り、本明細書に記載の任意の方法は、そのステップが特定の順序で実行されることを必要とすると解釈されることは、決して意図していない。したがって、方法クレームがその工程が従うべき順序を実際に列挙していないか、又は工程が特定の順序に限定されるべきであることが特許請求の範囲又は明細書に具体的に述べられていない場合には、いかなる特定の順序も、推測されることは、決して意図していない。

開示される実施形態の精神又は範囲から逸脱することなく、さまざまな修正及び変更を加えることができることは、当業者にとって明白であろう。実施形態の精神及び本質を組み込んだ開示された実施形態の修正、組合せ、部分組合せ、及び変形が当業者に想起されうることから、本開示の実施形態は、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内のあらゆるものを含むと解釈されるべきである。

上で論じたように、１つ以上の実施形態の態様は、細胞、細胞培養培地、及び他の成分のうちの少なくとも１つをバイオリアクター容器の内部空洞に供給するように構成された培地入口を含み、該培地出口は、細胞培養中又は細胞培養後に細胞又は他の生物学的薬剤、細胞培養培地、及び細胞又は生物学的副生成物のうちの少なくとも１つを内部空洞から取り出すように構成される。加えて、本明細書で論じられるように、バイオリアクターの内容物の採取手順を実施するために、培地出口は、採取動作中に加圧流体をスペーサセクションに供給するように構成することができ、培地入口は、採取動作中に内部空洞から細胞、細胞培養培地、及び細胞副生成物のうちの少なくとも１つを取り出すように構成される。バイオリアクターシステムは、培地出口を介して内部空洞を加圧流体で満たし、細胞、細胞培養培地、及び細胞副生成物のうちの少なくとも１つを、培地入口を通じて押し出すように構成される。したがって、スペーサセクションは、本明細書では採取容積と呼ぶこともでき、これは、採取手順の少なくとも一部を実施するために、何らかの加圧手段によって加圧されているか、又は流体で満たされている空間又は容積であることを意味する。

本明細書に開示される幾つかの実施形態は、スペーサセクション又は採取容積内に取り外し可能なスペーサを提示する。幾つかの実施形態では、図１８Ａ及び１８Ｂに示されるように、ピンフィールド２０００を培地出口と細胞培養基材との間に配置することができる。ピンフィールド２０００は、バイオリアクターの流れ方向の長手方向軸に実質的に平行に延びる１つ以上の部材として、又は細胞培養基材から出口へと延びる方向に延びるものとして特徴付けることができる。図１８Ｂは、図１８Ａのバイオリアクター容器及びピンフィールドの一部の拡大図を示している。ピンフィールドは、バイオリアクター容器の一端又は培地出口と細胞培養基材との間に分離を生じさせることによって、採取容積を少なくとも部分的に画定することができる。ピンフィールドはまた、細胞培養基材をバイオリアクター容器の内部空洞内の所定の位置に保持するのにも役立ちうる。幾つかの実施形態では、図１８Ａ及び１８Ｂに示されるように、ピンフィールドは、培地出口近くの流体出口プレートと一体化していてもよく、又はそれに連結されていてもよい。図１８Ｂでは、流体出口プレートの孔が見られる。言い換えれば、流体出口プレートは、内部空洞内から流体を収集し、それを培地出口に送達する役割をすることができ、同時にピンフィールドも含む。採取手順中など、容器を通る流れが逆になると、流体出口プレートも同様に逆に動作し、培地出口を介してバイオリアクター容器に流入する流体の流体入口プレートとして効果的に機能し、内部空洞の幅及び／又は細胞培養基材の幅全体に分配され、効率的に採取することができるものと理解されたい。図１８Ａ及び１８Ｂの採取容積は、本明細書に図示され説明される他の実施形態の幾つかと比較して、高さが比較的小さいことにも留意されたい。一部の用途では、その空間が採取溶液を保持できる限り、小さな空間しか必要とせず、採取溶液はその後、採取中に加圧されて細胞培養基材に送られる。

前述の実施形態の幾つかでは、採取容積は、細胞培養基材と培地出口との間のバイオリアクター容器内に示されている。これは、図１９Ａの採取容積２０１０によって概略的に示されている。しかしながら、実施形態はこの構成に限定されない。図１９Ｂでは、例えば、採取容積２０２０は、細胞培養基材を収納するバイオリアクター容器の内部空洞の外側に配置されるが、培地出口に流体的に接続される。したがって、採取容積２０２０内で加圧される採取溶液は、ホースなどの流体コネクタを介して、採取用の培地出口を通じて細胞培養基材に送ることができる。採取容積２０２０が細胞培養基材から分離されているということは、採取容積がバイオリアクター容器から完全に除去されているか、又は単に多区画バイオリアクター容器内の細胞培養基材とは別個の区画内に保持されていることを意味しうるものと理解されたい。採取容積の別個の筐体は、バイオリアクター容器のサイズ及び複雑性を低減し、その空隙容積を低減するという点で有利であり、これは使い捨てのユニットであってもよく、細胞培養材料が予め充填されていてもよい。結果として生じるサイズと複雑性の低減により、消耗部分又は使い捨て部分から生じる廃棄物を制限することができ、また、システムのさまざまな構成要素を配置する際の柔軟性を高めることもできる。加えて、採取容積を別の容器に収容することにより、採取溶液を所望の時間まで細胞培養メッシュからより容易に分離しておくことができ、採取溶液の状態をより容易に制御することができ、採取溶液の加圧を、採取が行われる前に、細胞培養基材、細胞、又は他の成分に悪影響を与えることなく達成することがより容易になる。採取容積は、細胞培養空間の外部であっても、バイオリアクターシステムの通常の流体再循環経路を使用して維持することができる。

幾つかの実施形態によれば、採取溶液は、細胞の採取、及び／又は細胞培養基材からの細胞の放出を補助する１つ以上の成分を含むことができる。例としてはＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）又はＴｒｙｐＬＥ（登録商標）が挙げられるが、当業者であれば、使用することができる代替的な採取剤を理解するであろう。

さらなる実施例
本明細書で論じられるように、本開示の実施形態は、均一な流体の流れ、細胞播種、細胞の増殖及び培養、並びに細胞採取をもたらすバイオリアクター、及びそれを使用する方法を含む。一例として、図２０は、本開示の一実施形態によるバイオリアクターを示している。バイオリアクターは、積み重ねて配置された織物ＰＥＴメッシュの層を含む固定床細胞培養基材を含んでいる。細胞培養基材の層を分離する他の流体流動装置又は他の物理的構造が存在しないことに留意されたい。得られる固定床は、優れた性能を実現する、均一で一貫した床であり、２．５ｍ^２の表面積を有していた。細胞を図２０のバイオリアクター内で細胞培養基材上に播種し、培養した。次に、培養期間の後、基材の層を充填床の３つの異なる領域（上部、中間、及び底部）から取り出した。細胞を、ＧＦＰ染色を使用してこれらの取り出した層で計測し、充填床のさまざまな領域の代表的な細胞カウント数を確認した。図２０に示されるように、バイオリアクターの上部（９５％ＧＦＰ＋、ＭＦＩ：２５７９）、中間（９７％ＧＦＰ＋、ＭＦＩ：２２３７）、及び底部（９６％ＧＦＰ＋、ＭＦＩ：２０１８）から採取された細胞の細胞カウント数は、驚くほど一貫していた。結果として得られた平均カウント数は、ＧＦＰ＋が９６％、ＭＦＩが２４２３であった。

図２１は、１つ以上の実施形態による、複数の実施例及びバイオリアクターサイズにわたる一貫したＡＡＶ２－ＧＦＰベクターの収量／ｃｍ^２を示している。具体的には、３つのサイズは、０．２ｍ^２、０．７ｍ^２、及び２．５ｍ^２の細胞培養基材表面積を含む。各サイズは、バルクＶＧ／ｃｍ^２で測定して、一貫した％ＧＦＰ＋細胞及び一貫したウイルスベクター収量をもたらした。

図２２は、他のプラットフォームと比較した、本開示の実施形態ＡのＡＡＶ２－ＧＦＰ ＶＧ収量／ｃｍ^２の一例を示している。図２０のバイオリアクターと同様に、実施形態Ａのバイオリアクターは、２．５ｍ^２の細胞培養基材表面積を有している。比較に使用した他の２つのプラットフォームは、２．６５ｍ^２の市販の固定床リアクターと、２Ｄ細胞増殖表面を備えたＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）社のＴ７５フラスコで構成されていた。各プラットフォームに対して３つの実験を実施した。２．６５ｍ^２のプラットフォームと比較して、実施形態Ａは、ＡＡＶ２－ＧＦＰ ＶＧ／ｃｍ^２の大幅な増加を示し、他のプラットフォームと比較して２０倍を超える増加をもたらした。

図２３は、図２２の他のプラットフォームと比較した、本開示の実施形態Ａの容器あたりのＡＡＶ２－ＧＦＰ ＶＧ収量の一例を示している。再び、実施形態Ａは、２．６５ｍ^２プラットフォームと比較して２０倍を超える増加、及びＴ７５フラスコと比較して３３０倍を超える増加を示している。

図２４ａは、プロトコル全体にＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地を使用した、本開示の一実施形態によるバイオリアクターにおけるＡＡＶ２－ＧＦＰウイルスベクターの産生を示しており、一方、図２４Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ増殖期に用いられたＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地を使用した、本開示の一実施形態によるバイオリアクターにおけるＡＡＶ２－ＧＦＰウイルスベクターの産生を示しており、無血清ＤＭＥＭ培地をトランスフェクション及び生産段階に使用した。

図２５は、本開示の実施形態による、細胞培養基材の異なる表面積サイズに対する容器あたりの総バルクＶＧの一例を示している。トランスフェクションから７２時間後のＧＦＰ＋細胞のフローサイトメトリーとＡＡＶ２－ＧＦＰ収量を両方の条件で示している。これらの図は、本開示の実施形態で無血清培地を使用することの有効性を示している。

本明細書で実証されるように、本開示の実施形態は、実証された固定床を通る均一な流体の流れを可能にする細胞培養バイオリアクター、システム、及び関連する方法を提供する。実施形態は、均一なＨＥＫ２９３の増殖及び効率的な生細胞採取を実証している。実施形態は、９０％を超えるトランスフェクション効率と、約２．０Ｅ＋１０のＡＡＶ２－ＧＦＰベクター収量／ｃｍ^２が、複数の実施及びバイオリアクターサイズにわたって一貫していることを実証しており、これにより設計のスケーラビリティが確認された。並列評価において、本開示の実施形態は、別の固定床リアクターと比較して２０倍を超える高いＡＡＶ２－ＧＦＰ ＶＧ収量／ｃｍ^２、及びＴ７５フラスコと比較して同等のＶＧ収量／ｃｍ２を実証した。加えて、本開示の実施形態は、ウイルスベクターの収量に重大な影響を与えることなく、無血清ＤＭＥＭ培地中でトランスフェクション及びウイルスベクターの産生を実施する実現可能性を実証した。

本明細書の実施形態のさらなる利点も明らかである。例えば、幾つかの実施形態では、細胞培養基材は、バイオリアクターの内部空洞の直径全体にわたり途切れることなく広がる。これは、代替手段で用いられる複雑な流路及び経路よりも単純である。固定床を通る流れは一方向であるか、又はプラグフローとして特徴付けることができ、これもまた動作を簡素化し、例えば、細胞播種及び採取を含めた性能が向上する。その結果、充填層のすべての層が同じ効率で灌流されており、層全体にわたる又は層を通る培地の流れ又はフラックスが得られる。

以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。

実施形態１
固定床バイオリアクターシステムであって、
培地入口、培地出口、及び前記培地入口と培地出口との間に配置され、かつそれらと流体連通している内部空洞を備えた容器、
充填床構成で前記培地入口と前記培地出口との間の前記内部空洞内に配置された細胞培養基材であって、複数の多孔質ディスクを積層配置で含む、細胞培養基材、並びに
流体を保持するように構成された採取容積であって、前記内部空洞と流体連通している採取容積
を含み、
前記複数の多孔質ディスクの各々が、その上で細胞を培養するように構成された表面を含む、
固定床バイオリアクターシステム。

実施形態２
前記細胞培養基材と前記培地出口との間の前記内部空洞内に配置されたスペーサをさらに含み、前記スペーサが、前記細胞培養基材を前記培地出口から一定の距離に配置し、前記細胞培養基材を前記内部空洞の細胞培養セクションに閉じ込めるように構成される、実施形態１に記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態３
前記スペーサが、前記多孔質ディスクの積層配置の高さと平行な方向に延びる複数のピンを備えたピンフィールドを含む、実施形態２に記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態４
前記採取容積が、前記容器内の前記培地出口と前記細胞培養基材との間に配置される、実施形態１から３のいずれかに記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態５
前記採取容積が前記容器の外側に配置され、かつ前記容器の前記培地出口に流体的に接続される、実施形態１から３のいずれかに記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態６
前記複数の多孔質ディスクの各ディスクが、第１の面、該第１の面とは反対側の第２の面、前記第１の面と前記第２の面とを分離するディスク厚さ、及び前記ディスク内に形成された、前記ディスク厚さを貫通する複数の開口部を含み、
前記複数の開口部が、細胞培養培地、細胞、又は細胞副生成物のうちの少なくとも１つが前記細胞培養基材を通って流れることを可能にするように構成される、
実施形態１から５のいずれかに記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態７
前記培地入口と前記細胞培養基材との間に配置された入口分配プレートをさらに含み、該入口分配プレートが、前記培地入口から前記内部空洞に入る流体を前記細胞培養基材の領域全体に分配するように構成される、実施形態１から６のいずれかに記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態８
前記細胞培養基材と前記培地出口との間に配置された出口分配プレートをさらに含む、実施形態１から７のいずれかに記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態９
前記ピンフィールドが前記出口分配プレートと一体化している、実施形態８に記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態１０
前記採取容積が、該採取容積内で前記流体を加圧し、その加圧流体を、流体経路を通じて前記培地出口へと導いて、前記容器から内容物を採取するように構成される、実施形態９に記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態１１
前記バイオリアクターシステムが、前記細胞培養基材１ｃｍ^２あたり、少なくとも約１×１０^８、少なくとも約１×１０^９、少なくとも約１×１０^１０、又は少なくとも約２×１０^１０個のウイルスゲノムを生成するように構成される、実施形態１から１０のいずれかに記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態１２
前記バイオリアクターシステムが、約９０％を超えるウイルストランスフェクション効率、又は約９５％を超えるウイルストランスフェクション効率を達成するように構成される、実施形態１から１１のいずれかに記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態１３
前記バイオリアクターシステムが、前記細胞培養基材全体にわたって均一なトランスフェクション効率を達成するように構成される、実施形態１２に記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態１４
前記均一なトランスフェクションが、前記細胞培養基材スタック構成全体にわたる個々の多孔質ディスク上で、約±１０％以内、約±８％以内、約±６％以内、約±４％以内、約±２％以内、又は約±１％以内のトランスフェクション効率を含む、実施形態１３に記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態１５
前記複数の多孔質ディスクが複数の織物メッシュ層を含む、実施形態１に記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態１６
前記複数の織物メッシュ層の各々が、画定された、実質的に均一な細孔のアレイを有する、実施形態１５に記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態１７
前記複数の織物メッシュ層の各層が複数の織り混ぜられた繊維を含み、該複数の織り混ぜられた繊維が、第１の方向に互いに平行に走る第１の繊維群と、第２の方向に互いに平行に走る第２の繊維群とを含む、実施形態１５に記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態１８
前記第１の方向が前記第２の方向に対して実質的に垂直である、実施形態１７に記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態１９
前記培地入口が、細胞培養前又は細胞培養中に細胞及び細胞培養培地の少なくとも一方を前記内部空洞に供給するように構成され、前記培地出口が、細胞培養中又は細胞培養後に細胞、細胞培養培地、及び細胞副生成物のうちの少なくとも１つを前記内部空洞から取り出すように構成される、実施形態１から１８のいずれかに記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態２０
前記バイオリアクターシステムが、採取動作中に前記採取容積から前記細胞培養基材に加圧流体を供給するように構成され、前記培地入口が、前記採取動作中に前記内部空洞から細胞、細胞培養培地、及び細胞副生成物のうちの少なくとも１つを取り出すように構成される、実施形態１９に記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態２１
前記バイオリアクターシステムが、前記培地出口を介して前記内部空洞を前記加圧流体で満たし、細胞、細胞培養培地、及び細胞副生成物のうちの少なくとも１つを、前記培地入口を通じて押し出すように構成される、実施形態２０に記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態２２
前記複数の多孔質ディスクが５０枚から１０００枚の多孔質ディスクを含む、実施形態１から２１のいずれかに記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態２３
前記複数の多孔質ディスクが１００枚から５００枚の多孔質ディスクを含む、実施形態２２に記載の固定床バイオリアクターシステム。

実施形態２４
前記複数の多孔質ディスクの各ディスクが間に細孔を画定する繊維を含み、該繊維が約５０μｍから約１０００μｍの直径を有し、前記細孔が約１００μｍから約１０００μｍの直径を有する、実施形態１に記載の固定床バイオリアクターシステム。

１００ 細胞培養基材
１０２ 第１の複数の繊維
１０４ 第２の複数の繊維
１０６ 複数の開口部
１０８ 第１の面
１１０ 第２の面
２００ 多層基材／マトリクス
２０２ 第１のメッシュ基材層
２０４ 第２のメッシュ基材層
２０６ 開口部
３００ 細胞培養システム
３０２ バイオリアクター容器
３０４ 細胞培養チャンバ
３０６ 細胞培養マトリクス
３０８ 複数の基材層
３１０ 入口
３１２ 出口
３２０ 灌流型のバイオリアクター
３２１ 培地入口
３２２ 流れ分配プレート
３２３ 細胞培養基材
３２４ 充填床保持器
３２５ スペーサ
３２６ 培地出口
３２７ 内部空洞
３２７ａ 細胞培養セクション
３２７ｂ スペーサセクション
３２８ 多孔質スペーサディスク
３５０ａ，３５０ｂ 筐体構成要素
３５２ 流れ分配プレート
３５４ 充填床保持器
３５５ スペーサ
３５６ 第１の多孔質スペーサディスク
３５７ 第２の多孔質スペーサディスク
３５８ 第３の多孔質スペーサディスク
３６０ 細胞培養基材
４００ バイオプロセッシングシステム
４０２ バイオリアクター
４０９ 制御ポンプ
４１１ 培地調整容器
４１２ センサ
４１３ ３方向ポート
４２１ 培地入口
４２２ 細胞解離溶液
４２６ 培地出口

Claims (15)

1. 固定床バイオリアクターシステムであって、
   培地入口、培地出口、及び前記培地入口と培地出口との間に配置され、かつそれらと流体連通している内部空洞を備えた容器、
   充填床構成で前記培地入口と前記培地出口との間の前記内部空洞内に配置された細胞培養基材であって、複数の多孔質ディスクを積層配置で含む、細胞培養基材、並びに
   流体を保持するように構成された採取容積であって、前記内部空洞と流体連通している採取容積
   を含み、
   前記複数の多孔質ディスクの各々が、その上で細胞を培養するように構成された表面を含む、
   固定床バイオリアクターシステム。
2. 前記細胞培養基材と前記培地出口との間の前記内部空洞内に配置されたスペーサをさらに含み、前記スペーサが、前記細胞培養基材を前記培地出口から一定の距離に配置し、前記細胞培養基材を前記内部空洞の細胞培養セクションに閉じ込めるように構成される、請求項１に記載の固定床バイオリアクターシステム。
3. 前記スペーサが、前記多孔質ディスクの積層配置の高さと平行な方向に延びる複数のピンを備えたピンフィールドを含む、請求項２に記載の固定床バイオリアクターシステム。
4. 前記採取容積が、前記容器内の、前記培地出口と前記細胞培養基材との間に配置される、請求項１に記載の固定床バイオリアクターシステム。
5. 前記採取容積が前記容器の外側に配置され、かつ前記容器の前記培地出口に流体的に接続される、請求項１に記載の固定床バイオリアクターシステム。
6. 前記培地入口と前記細胞培養基材との間に配置された入口分配プレートをさらに含み、該入口分配プレートが、前記培地入口から前記内部空洞に入る流体を前記細胞培養基材の領域全体に分配するように構成されている、請求項１に記載の固定床バイオリアクターシステム。
7. 前記細胞培養基材と前記培地出口との間に配置された出口分配プレートをさらに含む、請求項１に記載の固定床バイオリアクターシステム。
8. 前記ピンフィールドが前記出口分配プレートと一体化している、請求項７に記載の固定床バイオリアクターシステム。
9. 前記採取容積が、該採取容積内で前記流体を加圧し、その加圧流体を、流体経路を通じて前記培地出口へと導いて、前記容器から内容物を採取するように構成される、請求項８に記載の固定床バイオリアクターシステム。
10. 前記バイオリアクターシステムが、約９０％を超えるウイルストランスフェクション効率、又は約９５％を超えるウイルストランスフェクション効率を達成するように構成される、請求項１に記載の固定床バイオリアクターシステム。
11. 前記バイオリアクターシステムが、前記細胞培養基材全体にわたって均一なトランスフェクション効率を達成するように構成される、請求項１０に記載の固定床バイオリアクターシステム。
12. 前記均一なトランスフェクションが、前記細胞培養基材スタック構成全体にわたる個々の多孔質ディスク上で、約±１０％以内、約±８％以内、約±６％以内、約±４％以内、約±２％以内、又は約±１％以内のトランスフェクション効率を含む、請求項１１に記載の固定床バイオリアクターシステム。
13. 前記培地入口が、細胞培養前又は細胞培養中、細胞及び細胞培養培地の少なくとも一方を前記内部空洞に供給するように構成され、前記培地出口が、細胞培養中又は細胞培養後に細胞、細胞培養培地、及び細胞副生成物のうちの少なくとも１つを前記内部空洞から取り出すように構成されており、かつ
    前記バイオリアクターシステムが、採取動作中に前記採取容積から前記細胞培養基材に加圧流体を供給するように構成され、前記培地入口が、前記採取動作中に前記内部空洞から細胞、細胞培養培地、及び細胞副生成物のうちの少なくとも１つを取り出すように構成される、
    請求項１に記載の固定床バイオリアクターシステム。
14. 前記バイオリアクターシステムが、前記培地出口を介して前記内部空洞を前記加圧流体で満たし、細胞、細胞培養培地、及び細胞副生成物のうちの少なくとも１つを、前記培地入口を通じて押し出すように構成される、請求項１３に記載の固定床バイオリアクターシステム。
15. 前記複数の多孔質ディスクが、５０枚から１０００枚の多孔質ディスクを含む、請求項１に記載の固定床バイオリアクターシステム。

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