WO2016068225A1 - デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤及び該増感剤を使用した測定法 - Google Patents

デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤及び該増感剤を使用した測定法 Download PDF

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dengue virus
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immunochromatography
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功 宮崎
和美 谷ケ崎
史雄 中島
山田　智
伸行 坂元
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日油株式会社
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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F230/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and containing phosphorus, selenium, tellurium or a metal
    • C08F230/02—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and containing phosphorus, selenium, tellurium or a metal containing phosphorus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses

Definitions

  • the present invention relates to an immunochromatographic sensitizer using dengue virus as a measurement target substance, and an immunochromatography measurement method using dengue virus as a measurement target substance in the presence of the sensitizer.
  • Immunochromatography is a method that combines a chromatographic technique using the capillary action of a membrane and an immunological technique.
  • the immunochromatography method has high specificity due to antigen-antibody reaction, does not require heavy equipment and equipment that are complicated to operate, can be measured easily and quickly using a simple kit, and the results are judged visually. Since it can be performed, it is widely used as a clinical diagnostic method (see Patent Document 1).
  • the immunochromatography method has an advantage that it can be easily measured, but the accuracy of detection sensitivity is low, and even if a positive sample is used, it may be determined to be false negative. Therefore, a more sensitive immunochromatography method is desired. So far, various methods have been studied for the purpose of establishing a highly sensitive immunochromatographic measurement method. For example, Patent Document 2 discloses a technique for increasing sensitivity by changing the addition position of an immunochromatographic reagent. Yes. Patent Document 3 discloses a technique for increasing the sensitivity by improving the material of the membrane.
  • Patent Documents 4, 5 and 6 disclose that the specimen diluent contains bovine serum albumin (BSA), a polymer having a phosphorylcholine group, and hyaluronic acid.
  • BSA bovine serum albumin
  • a polymer having a phosphorylcholine group a polymer having a phosphorylcholine group
  • hyaluronic acid a polymer having a phosphorylcholine group
  • the present invention is to provide an immunochromatographic sensitizer capable of detecting dengue virus with high sensitivity and a measurement method using the sensitizer.
  • the present inventors have obtained as a finding that glucosaminoglycans having a negative charge function as an adhesion factor for many flaviviruses, and have been used for immunoassay methods having a negative immunochromatography so far.
  • a polymer having a phosphorylcholine-like group structure represented by the following general formula [1] in the side chain is obtained. It has been found that the desired performance is achieved, and the present invention has been completed. That is, this invention consists of the following.
  • a sensitizer for an immunochromatographic assay using a dengue virus comprising a polymer represented by the following general formula [1].
  • R represents one or more selected from a hydrogen atom or a cation
  • m and n are molar ratios
  • m is 99 to 55
  • n is 1 to 45.
  • the polymer is a copolymer having a structural unit based on a monomer represented by the following general formula [2] and a structural unit based on methacrylic acid.
  • the polymer has a constituent ratio of 2- (methacryloyloxy) ethyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate and methacrylic acid of 99 to 55: 1 to 45.
  • the polymer has a constituent ratio of 2- (methacryloyloxy) ethyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate and methacrylic acid of 99 to 70: 1 to 30.
  • the polymer is a water-soluble polymer having a weight average molecular weight of 10,000 to 1,000,000.
  • a specimen diluent for immunochromatographic assay using dengue virus which contains the sensitizer for immunochromatographic assay described in the previous section, as a substance to be measured.
  • a method for treating dengue fever comprising the following steps (1) and (2).
  • R represents one or more selected from a hydrogen atom or a cation
  • m and n are molar ratios
  • m is 99 to 55
  • n is 1 to 45.
  • the polymer is a copolymer having a structural unit based on a monomer represented by the following general formula [2] and a structural unit based on methacrylic acid.
  • the polymer has a constituent ratio of 2- (methacryloyloxy) ethyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate and methacrylic acid of 99 to 55: 1 to 45.
  • the polymer has a constituent ratio of 2- (methacryloyloxy) ethyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate and methacrylic acid of 99 to 70: 1 to 30.
  • the polymer is a water-soluble polymer having a weight average molecular weight of 10,000 to 1,000,000.
  • the dengue virus can be detected with higher sensitivity compared to the conventional immunochromatography method for detecting dengue virus. Can do. Furthermore, since the dengue fever treatment method of the present invention can detect dengue fever virus with high sensitivity, dengue fever treatment can be rapidly performed on a patient with dengue fever.
  • Sensitizer for immunochromatography method using dengue virus of the present invention as a substance to be measured specimen dilution liquid for immunochromatography method using dengue virus containing the sensitizer as a substance to be measured, antigen in the presence of the sensitizer Immunochromatography measurement method using dengue virus that causes antibody reaction as measurement target substance, immunochromatography measurement instrument using dengue virus containing the sensitizer as measurement target substance, and antigen-antibody reaction in the presence of the sensitizer
  • a method for treating dengue fever including the steps to be performed will be described below.
  • the measurement target substance is dengue virus, but other measurement target substances can also be detected.
  • the sensitizer for immunochromatography method of the present invention is characterized in that it can detect dengue virus with high sensitivity.
  • a polymer used as a sensitizer for an immunochromatographic assay using the dengue virus of the present invention as a substance to be measured is represented by the following general formula [1].
  • R shows 1 or more types chosen from a hydrogen atom or a cation.
  • the cation include sodium ion, potassium ion, and ammonium ion, and a combination thereof may be used. Examples of these combinations include methacrylic acid, sodium methacrylate, potassium methacrylate, ammonium methacrylate and the like.
  • m and n are molar ratios, and the ratio of m to n is 99 to 55: 1 to 45, preferably 90 to 60:10 to 40, more preferably 80 to 65:20 to 35, most Preferably it is 70:30.
  • the polymer represented by the above formula is a water-soluble polymer having a weight average molecular weight of 10,000 to 1,000,000, preferably 50,000 to 500,000.
  • the water-soluble polymer represented by the general formula [1] of the present invention is converted into a monomer represented by the following general formula [2] ⁇ MPC: 2- (methacryloyloxy) ethyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate ⁇ . It consists of a copolymer having a structural unit based on and a structural unit based on methacrylic acid.
  • the polymer used as the sensitizer for the immunochromatography measurement method can preferably be exemplified as follows, but is not particularly limited.
  • the composition ratio of 2- (methacryloyloxy) ethyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate and methacrylic acid is 99 to 55: 1 to 45.
  • the composition ratio of 2- (methacryloyloxy) ethyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate and methacrylic acid is 99 to 70: 1 to 30.
  • the composition ratio of 2- (methacryloyloxy) ethyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate and methacrylic acid is 90-60: 1-40.
  • the composition ratio of 2- (methacryloyloxy) ethyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate and methacrylic acid is 80 to 65:20 to 35.
  • the composition ratio of 2- (methacryloyloxy) ethyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate and methacrylic acid is about 70:30.
  • the polymer is a water-soluble polymer having a weight average molecular weight of 10,000 to 1,000,000.
  • the polymer used as the sensitizer for the immunochromatographic measurement method of the present invention may be used by being dissolved in various reagents and samples used for the immunochromatographic measurement method, or may be used by being supported on a kit for the immunochromatographic measurement method. However, it is preferably used as a specimen diluent.
  • the immunochromatography measurement method of the present invention generally comprises a specimen diluent and a test strip as the immunochromatography measurement kit used.
  • the specimen diluent is an appropriate diluent for measurement by immunochromatography, and includes buffer components such as Tris buffer, phosphate buffer, veronal buffer, borate buffer, Good buffer, albumin, It may contain stabilizing components such as globulins, caseins, serum, water-soluble gelatin, surfactants, sugars, chelating agents, and antiseptic components such as salicylic acid, benzoic acid, and sodium azide.
  • buffer components such as Tris buffer, phosphate buffer, veronal buffer, borate buffer, Good buffer, albumin
  • stabilizing components such as globulins, caseins, serum, water-soluble gelatin, surfactants, sugars, chelating agents, and antiseptic components such as salicylic acid, benzoic acid, and sodium azide.
  • the concentration thereof is not particularly limited as the concentration at the time of antigen-antibody reaction, but is usually 0.1 to 5.0 w / v%, preferably 0.5. Used to be ⁇ 1.0w / v%.
  • the test strip is generally a first substance capable of antigen-antibody reaction with a first antigenic determinant of a specimen, and a second substance labeled with an antigen-antibody reaction and labeled with a second antigenic determinant of the specimen.
  • a membrane carrier wherein the first substance is previously fixed at a predetermined position of the membrane carrier to form a capture site, and the second material is separated from the capture site at the carrier. It is arranged and configured so that it can be chromatographed on
  • the test strip for immunochromatographic measurement may be a commercially available product or one prepared by a known method.
  • a base material used in the spread membrane those usually used in this field may be used.
  • cellulose, nitrocellulose, nylon and the like are preferable.
  • Examples of an immunochromatographic measurement instrument using a dengue virus containing the sensitizer of the present invention as a substance to be measured include (1) an instrument comprising a developing membrane, (2) a specimen labeling part and a developing film, and the specimen labeling part. And (3) a specimen labeling part, a development film, and a liquid absorption part, and the specimen labeling part, the development film, and the liquid absorption part. (4) a specimen dropping section, a specimen labeling section, a developing film, and a liquid absorbing section, and the specimen dropping section, the specimen labeling section, and the development.
  • the amount thereof depends on the place where it is supported, the type of sensitivity enhancer used, the type of measurement target substance used, the labeling substance used, etc.
  • the amount of the sensitivity enhancer contained per unit area (cm 2 ) is usually 0.01 ⁇ g to 10 mg when it is carried on, for example, a development membrane, specimen labeling part, specimen dropping part or the like of an instrument for immunochromatography. , Preferably 0.1 ⁇ g to 4 mg, more preferably 1 to 800 ⁇ g.
  • the supported area varies depending on the type and size of the instrument for immunochromatography used and the amount of the sample for measurement. 60%, preferably 20-30%, usually 1 to 30% of the total area in the case of the specimen labeling part, preferably 5 to 15%, in the case of the specimen dropping part, usually 5 to 40% of the total area It is preferably 10 to 20%.
  • the method for treating dengue fever of the present invention includes at least the following steps (1) and (2).
  • the patient includes a person who may be infected with dengue fever.
  • Measurement means detecting whether or not dengue virus is present in a patient-derived specimen.
  • the process of giving dengue virus treatment to patients includes not only the administration of known therapeutic drugs, future therapeutic drugs, and clinical therapeutic candidates to patients, but also symptomatic treatment (administration of aspirin, fluid replacement / infusion, etc.) ) Is also included. Since the dengue fever treatment method of the present invention can detect dengue fever virus with high sensitivity, dengue fever treatment can be rapidly performed on a patient with dengue fever.
  • the polymer of the present invention and the polymer of the comparative example were synthesized from 2- (methacryloyloxy) ethyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate (MPC) and one or two monomers (see: Table 1 below). .
  • Embodiment Example 1 PMA99 Copolymer composed of MPC monomer and methacrylic acid, molecular weight: 100 ⁇ 10 3 , composition ratio of MPC monomer and methacrylic acid; 99: 1.
  • Embodiment 2 PMA70 Copolymer composed of MPC monomer and methacrylic acid, molecular weight; 230 ⁇ 10 3 , composition ratio of MPC monomer and methacrylic acid; 70:30.
  • Comparative polymer (Comparative polymer) ⁇ Comparative Example 1 PMPC MPC monomer homopolymer, molecular weight; 1,000 ⁇ 10 3 .
  • Comparative Example 2 PMA50 Copolymer composed of MPC monomer and methacrylic acid, molecular weight; 1100 ⁇ 10 3 , composition ratio of MPC monomer and methacrylic acid; 50:50.
  • Comparative Example 3 PMA30 Copolymer composed of MPC monomer and methacrylic acid, molecular weight: 700 ⁇ 10 3 , composition ratio of MPC monomer and methacrylic acid; 30:70.
  • the immunochromatographic blocking reagent was further added to an ELISA plate pretreated with the immunochromatographic blocking agent and allowed to stand at 37 ° C. for 60 minutes. After standing, the plate was washed 3 times with 300 ⁇ L of a washing solution (PBS solution containing 0.1 wt% Tween). Next, 50 ⁇ L of an anti-antigen secondary antibody (a POD-labeled anti-antigen secondary antibody solution diluted 2000 times with a phosphate buffer containing 1% by weight of BSA) was added to each well, and the plate was allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours. I put it.
  • a washing solution PBS solution containing 0.1 wt% Tween
  • each well was washed 3 times with 300 ⁇ L of washing solution to remove excess anti-antigen secondary antibody, and then 50 ⁇ L of TMB (3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine) was added to each well for 5 minutes at room temperature. Left to stand. Thereafter, 50 ⁇ L of 1N-sulfuric acid was added to stop the reaction, and the absorbance at 450 nm was measured. In addition, the average of the light absorbency of a polymer non-added system was 0.210, and the sensitivity increase ratio was evaluated. Here, if the sensitization ratio was 2.0 or more, it was determined that there was a sensitizing effect.
  • the ratio of m to n of the water-soluble polymer represented by the general formula [1] is 99 to 55: 1 to 45, preferably 90 to 60:10 to 40, more preferably 80 to 65:20 to 35. Most preferably, it was confirmed that it was 70:30.
  • ICA kit which is a commercially available RapiDeng Ag kit (product of Biomedical Research Institute, Inc.). More specifically, in order to detect dengue viruses with 4 serotypes (DV1, DV2, DV3 and DV4), a developing agent of DenV detection ICA kit (5 wt% EDTA, 5 ⁇ g / mL mouse serum, 0.1 wt) % Tween / PBS), PMA70 was added to a final concentration of 0.2 wt%, and a solution diluted 10-fold and 100-fold from a 2 ⁇ 10 6 pfu / mL DV solution was added to develop ICA.
  • a developing agent of DenV detection ICA kit 5 wt% EDTA, 5 ⁇ g / mL mouse serum, 0.1 wt) % Tween / PBS
  • PMA70 was added to a final concentration of 0.2 wt%
  • PMA70 was added to a final concentration of 0.2 wt%
  • FIG. 2 shows the result of detection sensitivity improvement using a known immunochromatographic instrument for detecting dengue virus.
  • PMA70 0.2% by weight of PMA70 was added, detection was possible by sensitization even with an ICA kit to which a virus solution diluted 100-fold was added.
  • detection was not possible with 10-fold diluted DV solution, but only with the stock solution.
  • the present invention was able to provide an immunochromatographic measurement method having a significantly superior sensitizing effect as compared with an immunochromatographic measurement method using a known dengue virus as a substance to be measured. Furthermore, since the dengue fever treatment method of the present invention can detect dengue fever virus with high sensitivity, a dengue fever treatment can be promptly performed on a patient with dengue fever or a patient who may be infected with dengue fever. Is expensive.
  • the present invention can provide a sensitizer for an immunochromatographic assay using dengue virus as a substance to be measured.

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Abstract

　デング熱ウイルスを高感度に検出できるイムノクロマト測定法用増感剤及び該増感剤を使用した測定法を提供することにある。　一般式［１］で示されるホスホリルコリン類似基構造を有する基を側鎖に有するポリマーが目的の性能を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。

Description

デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤及び該増感剤を使用した測定法
　本発明は、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤、及び該増感剤の共存下で行うデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願、特願2014-223503号優先権を請求する。
　イムノクロマト法は、メンブレンの毛細管現象を利用したクロマトグラフィーの手法と免疫学的手法を組み合わせた方法である。イムノクロマト法は、抗原抗体反応に起因する高い特異性を備え、操作が煩雑な重厚な設備や機器を必要とせず、軽便なキットを用いて簡易かつ迅速に測定を行え、かつ結果を目視で判定できることから、臨床診断法として広く普及している（参照：特許文献１）。
　イムノクロマト法は、簡易に測定できる利点はあるが、検出感度の精度が低く、陽性検体を用いても偽陰性と判定される場合もあるので、より高感度のイムノクロマト測定法が望まれている。
　これまでに、高感度のイムノクロマト測定法を確立する目的で種々の方法が検討されており、例えば、特許文献２では、イムノクロマトの試薬の添加位置を変える事で高感度化する手法が開示されている。また、特許文献３では、メンブレンの素材を改良することで高感度化する手法が開示されている。
　さらに、従来のイムノクロマト法に用いている検体希釈液に、添加剤を加えることで、高感度化を達成する方法が知られている。例えば、特許文献４、５及び６では、検体希釈液中に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ホスホリルコリン基を有する重合体、ヒアルロン酸を含有させることが開示されている。これらの開示では、試薬の添加位置を変える必要がなく、また従来のイムノクロマト用メンブレンを使用可能という利点がある。
　しかしながら、上記特許文献では、フラビウイルス科フラビウイルス属の一つであるデング熱ウイルスの測定を高感度に行う方法に用いる増感剤については開示又は示唆をされていない。
特開平０１－０６３８６５号公報 特開２０１４－６６６７４号公報 特開２０１４－６２８２０号公報 特開２００８－２９２３２６号公報 特開２００８－０５８３３４号公報 特開２００３－３４４４１３号公報
　本発明では、デング熱ウイルスを高感度に検出できるイムノクロマト測定法用増感剤及び該増感剤を使用した測定法を提供することにある。
　本発明者らは、負電荷を有すグルコサミノグリカンが多くのフラビウイルスに対し接着因子として機能することを知見として得て、これまでのイムノクロマトグラフィー負電荷を有する免疫学的測定法用の公知の増感剤と比較して、デング熱ウイルスを高感度に検出できる化合物を見出すべく鋭意検討した結果、下記一般式［１］で示されるホスホリルコリン類似基構造を有する基を側鎖に有するポリマーが目的の性能を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下よりなる。
　下記一般式［１］で表されるポリマーを含んでなる、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　式中、Ｒは、水素原子又は陽イオンから選ばれる１種以上を示し、ｍとｎはモル比であり、ｍは９９～５５、ｎは１～４５である。
　前記ポリマーは、下記一般式［２］で表されるモノマーに基づく構成単位と、メタクリル酸に基づく構成単位を有するコポリマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　前記ポリマーは、２－(メタクリロイルオキシ)エチル－２'－(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９～５５：１～４５である。
　前記ポリマーは、２－(メタクリロイルオキシ)エチル－２'－(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９～７０：１～３０である。
　前記ポリマーは、重量平均分子量１０，０００～１，０００，０００の水溶性のポリマーである。
　前項に記載のイムノクロマト測定法用増感剤を含む、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用検体希釈液。
　前項に記載のイムノクロマト測定法用増感剤の存在下で抗原抗体反応を行わせることを特徴とする、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法。
　前項に記載のイムノクロマト測定法用増感剤を含む、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定用器具。
　以下の（１）（２）の工程を含むデング熱の治療方法。
　（１）下記一般式［１］で表されるポリマーを含んでなるイムノクロマト測定法用増感剤の存在下で抗原抗体反応を行うデング熱ウイルスの測定工程。
　（２）上記（１）の測定結果に基づき、デング熱ウイルス治療を患者に施す工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　上記式中、Ｒは、水素原子又は陽イオンから選ばれる１種以上を示し、ｍとｎはモル比であり、ｍは９９～５５、ｎは１～４５である。
　上記ポリマーは、下記一般式［２］で表されるモノマーに基づく構成単位と、メタクリル酸に基づく構成単位を有するコポリマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　前記ポリマーは、２－(メタクリロイルオキシ)エチル－２'－(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９～５５：１～４５である。
　前記ポリマーは、２－(メタクリロイルオキシ)エチル－２'－(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９～７０：１～３０である。
　前記ポリマーは、重量平均分子量１０，０００～１，０００，０００の水溶性のポリマーである。
　本発明のデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤を使用した測定方法では、従来のデング熱ウイルスを検出するイムノクロマト測定法用と比較して、高感度でデング熱ウイルスを検出することができる。
　さらに、本発明のデング熱の治療方法は、高感度でデング熱ウイルスを検出することができるので、デング熱の患者に迅速にデング熱治療を施すことができる。
各ポリマーでの増感度比の結果 公知のイムノクロマト測定用器具を使用しての検出感度向上の結果
　本発明のデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤、該増感剤を含むデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用検体希釈液、該増感剤の存在下で抗原抗体反応を行わせるデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法、該増感剤を含むデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定用器具、及び、該増感剤の存在下で抗原抗体反応を行わせる工程を含むデング熱の治療方法を、以下で説明する。
　なお、本発明のイムノクロマト測定法用増感剤を使用する測定法では、測定対象物質としてはデング熱ウイルスであるが、他の測定対象物質も検出できる。しかし、本発明のイムノクロマト測定法用増感剤は、デング熱ウイルスを高感度に検出できることを特徴とする。
　本発明のデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤として用いられるポリマーは、下記一般式［１］で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　上記式中、Ｒは、水素原子又は陽イオンから選ばれる１種以上を示す。ここで、陽イオンは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオン等が挙げられ、これらの組み合わせであっても良い。
　これらの組み合わせの例としては、メタクリル酸、メタクリル酸ナトリウム、メタクリル酸カリウム、メタクリル酸アンモニウム等を例示することができる。
　上記式中、ｍとｎはモル比であり、ｍとｎの割合は、９９～５５：１～４５、好ましくは９０～６０：１０～４０、より好ましくは８０～６５：２０～３５、最も好ましくは７０：３０である。
　上記式で表されるポリマーは、重量平均分子量１０，０００～１，０００，０００、好ましくは５０，０００～５００，０００の水溶性ポリマーである。
　本発明の一般式［１］で示される水溶性ポリマーは、下記一般式［２］で表されるモノマー｛MPC：２－(メタクリロイルオキシ)エチル－２'－(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート｝に基づく構成単位と、メタクリル酸に基づく構成単位を有するコポリマーにより成る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　イムノクロマト測定法用増感剤として用いられるポリマーは、好ましくは、以下を例示することができるが特に限定されない。
　２－(メタクリロイルオキシ)エチル－２'－(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９～５５：１～４５である。
　２－(メタクリロイルオキシ)エチル－２'－(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９～７０：１～３０である。
　２－(メタクリロイルオキシ)エチル－２'－(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９０～６０：１～４０である。
　２－(メタクリロイルオキシ)エチル－２'－(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が８０～６５：２０～３５である。
　２－(メタクリロイルオキシ)エチル－２'－(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が約７０：約３０である。
　前記ポリマーは、重量平均分子量１０，０００～１，０００，０００の水溶性のポリマーである。
　一般式［１］で示される水溶性ポリマーの具体的な製造例は、特開平０８－３３３４２１号、特許文献６に記載の方法を例示することができるが特に限定されない。
　本発明のイムノクロマト測定法用増感剤として用いられるポリマーは、イムノクロマト測定法に用いられる各種試薬や試料に溶解させて用いてもよく、また、イムノクロマト測定法用キットに担持させて用いてもよいが、好ましくは、検体希釈液として用いることが好ましい。
　なお、本発明のイムノクロマト測定法とは、用いられるイムノクロマト測定法用キットとして一般に、検体希釈液とテストストリップからなる。
　検体希釈液とは、イムノクロマトグラフィー法で測定するに際しての、適当な希釈剤であり、トリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッド緩衝剤等の緩衝成分、アルブミン、グロブリン、カゼイン、血清、水溶性ゼラチン、界面活性剤、糖類、キレート剤等の安定化成分、サリチル酸、安息香酸、アジ化ナトリウム等の防腐成分を含むことができる。
　本発明の増感剤を、検体希釈液に溶解させて用いる場合、その濃度は、抗原抗体反応がなされる際の濃度として、特に限定されないが、通常0.1～5.0w/v％、好ましくは0.5～1.0w/v％となるように用いられる。
　テストストリップとは、一般に、検体の第一の抗原決定基にて抗原抗体反応可能な第一の物質と、前記検体の第二の抗原決定基にて抗原抗体反応可能で且つ標識された第二の物質と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一の物質は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の物質は前記捕捉部位から隔離した位置で前記担体にてクロマト展開可能なように配置されて構成される。
　イムノクロマト測定用テストストリップは、市販品を用いても、公知の方法により作製したものを用いてもよい。公知の方法により作製する場合、上記展開膜で用いられる基材としては、通常この分野で用いられるものを用いればよく、例えばセルロース、ニトロセルロース、ナイロン等が好ましいものとして挙げられる。
　本発明の増感剤を含むデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定用器具としては、例えば（１）展開膜からなるもの、（２）検体標識部並びに展開膜からなり、且つ該検体標識部と該展開膜とが毛管現象により移動可能なように形成されたもの、（３）検体標識部、展開膜並びに液体吸収部からなり、且つ該検体標識部と該展開膜と該液体吸収部とが、この順に毛管現象により移動可能なように形成されたもの、（４）検体滴下部、検体標識部、展開膜並びに液体吸収部からなり、且つ該検体滴下部と該検体標識部と該展開膜と該液体吸収部とが、この順に毛管現象により移動可能なように形成されたもの等が挙げられるが、特に限定されない。
　本発明の増強剤を、前記イムノクロマト測定法用器具に担持させて用いる場合、その量は、担持される場所、使用する感度増強剤の種類、使用する測定対象物質の種類、使用する標識物質等により変動するが、例えばイムノクロマト測定法用器具の展開膜、検体標識部、検体滴下部等に担持させる場合、単位面積（cm2）当たりに含まれる感度増強剤の量として、通常0.01μg～10ｍｇ、好ましくは0.1μg～4ｍｇ、より好ましくは1～800μgである。また、担持される面積は、用いられるイムノクロマト測定法用器具の種類及び大きさ、測定用試料の量により変動するが、イムノクロマト測定法用器具の展開膜の場合には、通常総面積の10～60％、好ましくは20～30％、検体標識部の場合には、通常総面積の1～30％、好ましくは5～15％、検体滴下部の場合には、通常総面積の5～40％、好ましくは10～20％である。
　本発明のデング熱の治療方法は、少なくとも以下の（１）及び（２）の工程を含む。
　（１）前記ポリマーを含んでなるイムノクロマト測定法用増感剤の存在下で抗原抗体反応を行うデング熱ウイルスの測定工程。
　（２）上記（１）の測定結果に基づき、デング熱ウイルス治療を患者に施す工程。
　なお、患者は、デング熱に感染しているおそれのある人も含む。なお、測定とは、患者由来の検体中にデング熱ウイルスが存在するかどうかを検出することを意味する。
　また、デング熱ウイルス治療を患者に施す工程とは、公知治療薬、今後上市される治療薬、臨床段階の治療薬候補を患者に投与するだけでなく、対症療法（アスピリン投与、補液・輸液投与等）も含む。
　本発明のデング熱の治療方法は、高感度でデング熱ウイルスを検出することができるので、デング熱の患者に迅速にデング熱治療を施すことができる。
　以下、本実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
（本発明のポリマー及び比較例のポリマーの作成）
　本発明のイムノクロマト測定法用増感剤として用いられるポリマー（実施態様例１、２）及び比較例のポリマーを作成した。詳細は、以下の通りである。
　本発明のポリマー及び比較例のポリマーは、２－(メタクリロイルオキシ)エチル－２'－(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート（ＭＰＣ）と１種又は２種のモノマーから合成した（参照：下記表１）。
（実施態様例のポリマー）
　○実施態様例１　ＰＭＡ９９ 
　ＭＰＣモノマーとメタクリル酸とからなるコポリマー、分子量；100×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸の構成比；９９：１。
　○実施態様例２　ＰＭＡ７０
　ＭＰＣモノマーとメタクリル酸とからなるコポリマー、分子量；230×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸の構成比；７０：３０。
（比較例のポリマー）
　○比較例１　ＰＭＰＣ
　ＭＰＣモノマーのホモポリマー、分子量；1,000×103。
　○比較例２　ＰＭＡ５０
　ＭＰＣモノマーとメタクリル酸とからなるコポリマー、分子量；1100×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸の構成比；５０：５０。
　○比較例３　ＰＭＡ３０
　ＭＰＣモノマーとメタクリル酸とからなるコポリマー、分子量；700×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸の構成比；３０：７０。
　○比較例４　ＰＭＢ８０
　ＭＰＣモノマーとメタクリル酸ブチルとからなるコポリマー、分子量；600×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸ブチルの構成比；８０：２０。
　○比較例５　ＰＭＢ３０
　ＭＰＣモノマーとメタクリル酸ブチルとからなるコポリマー、分子量；90×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸ブチルの構成比；３０：７０。
　○比較例６　ＰＭＥ７０
　ＭＰＣモノマーとモノメチルエーテルポリエチレングリコールメタクリレートとからなるコポリマー、分子量；140×103、ＭＰＣモノマーとモノメチルエーテルポリエチレングリコールメタクリレートの構成比；７０：３０。
　○比較例７　ＰＭＳ８０
　ＭＰＣモノマーとメタクリル酸オクタデシルとからなるポリマー、分子量；40×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸オクタデシルの構成比；８０：２０。
　○比較例８　ＰＭＺ８０
　ＭＰＣモノマーとメタクリル酸ベンジルとからなるポリマー、分子量；240×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸ベンジルの構成比；８０：２０。
　○比較例９　ＰＭＩ８０
　ＭＰＣモノマーとメタクリル酸イソボルニルとからなるポリマー、分子量；260×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸イソボルニルの構成比；８０：２０。
　○比較例１０　ＰＭＳ５０
　ＭＰＣモノマーとメタクリル酸オクタデシルとからなるポリマー、分子量；200×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸オクタデシルの構成比；５０：５０。
　○比較例１１　ＰＭＳ３０
　ＭＰＣモノマーとメタクリル酸オクタデシルとからなるポリマー、分子量；200×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸オクタデシルの構成比；３０：７０。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（本発明のイムノクロマト測定法用増感剤として用いられるポリマーの検出感度の確認）
　本実施例では、本発明のイムノクロマト測定法用増感剤として用いられるポリマーのデング熱ウイルスの検出感度を確認するために、イムノクロマト用キットを反映したＥＬＩＳＡ法による定量的な比較（比較例のポリマーとの比較）を行った。詳細は、以下の通りである。
（ポリマーの検出感度の測定方法）
　抗DVｍAB（抗デング熱ウイルスモノクローナル抗体）の１０μg/mL溶液を５０μLずつマイクロチューブに入れ、さらに、終濃度が０．５、１．０重量％となるよう各実施態様例又は比較例のポリマーを含むイムノクロマト用ブロッキング試薬を該チューブに１００μＬずつ添加した。次に、イムノクロマト用ブロッキング剤（０．５重量％のカゼインを含むホウ酸緩衝液）を適量の血清で希釈したものを５０μＬと混合して、３７℃、６０分間静置した。
　次に、該イムノクロマト用ブロッキング試薬を、さらに、該イムノクロマト用ブロッキング剤で前処理したＥＬＩＳＡプレートに添加し、３７℃、６０分間静置した。静置後、プレートを３００μＬの洗浄液（０．１重量％のＴｗｅｅｎを含むＰＢＳ溶液）で３回洗浄した。
　次に、抗抗原２次抗体（１重量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液にて２０００倍に希釈したＰＯＤ標識の抗抗原２次抗体溶液）５０μＬを各ウェルに添加し３７℃、２時間静置した。各ウェルを３００μＬの洗浄液で３回洗浄し、過剰な抗抗原２次抗体を除去後、５０μＬのＴＭＢ（３，３'，５，５'－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を各ウェルに添加し室温にて５分間静置した。その後、１Ｎ－硫酸５０μＬを添加して反応停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。なお、ポリマー非添加系の吸光度の平均は、０．２１０であり、これに対する増感度比を評価した。ここで、増感度比が２．０以上であれば増感効果があると判断した。
（ポリマーの検出感度の向上の結果）
　各ポリマーでの増感度比の結果を図１に示す。
　実施態様例１及び実施態様例２のポリマーのみが増感度比２．０を超えた。すなわち、カルボキシル基を有するＭＰＣポリマーを用いた場合には、顕著な増感度を確認した。さらに、ＰＭＡ９９（実施態様例１）、ＰＭＡ７０（実施態様例２）において、より高い増感効果示し、同じカルボキシル基を有するポリマーであるＰＭＡ５０（比較例２）、ＰＭＡ３０（比較例３）では増感効果が２倍未満であることを確認した。
　これにより、一般式［１］で示される水溶性ポリマーのｍとｎの割合は、９９～５５：１～４５、好ましくは９０～６０：１０～４０、より好ましくは８０～６５：２０～３５、最も好ましくは７０：３０であることを確認した。
（公知のイムノクロマト測定用器具を使用しての検出感度の確認）
　本実施例では、本発明のポリマーが、公知のデング熱ウイルスの検出キットの検出感度を向上させることができるか（増感効果があるか）どうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
　市販のRapiDeng　Agキット（株式会社バイオメディカル研究所社製品）であるＩＣＡキットで評価した。より詳しくは、血清型が４種類（DV1、DV2、DV3及びDV4）のデング熱ウイルスを検出するために、DenV検出ICAキットの展開剤（５重量％EDTA、５μg／mLマウス血清、０．１重量％Tween／ＰＢＳ）に終濃度０．２重量％となるようＰＭＡ７０を添加し、２×１０６pfu/mLのDV溶液から１０倍、１００倍に希釈した溶液を加えICAを展開した。
（イムノクロマト測定用器具を使用しての検出感度の確認の結果）
　公知のデング熱ウイルス検出用イムノクロマト測定用器具を使用しての検出感度向上の結果を図２に示す。
　０．２重量％のＰＭＡ７０を添加した場合は、１００倍希釈したウイルス溶液を加えたICAキットでも増感により検出可能であった。一方、コントロールの無添加系では１０倍希釈したDV溶液では検出できず、原液のみにしか検出できなかった。
（総論）
　以上の実施例より、本発明は、公知のデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法と比較して、著しく増感効果が優れているイムノクロマト測定法を提供することができた。
　さらに、本発明のデング熱の治療方法は、高感度でデング熱ウイルスを検出することができるので、デング熱の患者又はデング熱に感染しているおそれの患者に迅速にデング熱治療を施すことができるので治療効果が高い。
　本発明は、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤を提供することができる。

Claims (9)

  1. 　下記一般式［１］で表されるポリマーを含んでなる、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒは、水素原子又は陽イオンから選ばれる１種以上を示し、ｍとｎはモル比であり、ｍは９９～５５、ｎは１～４５である。）
  2. 　前記ポリマーは、下記一般式［２］で表されるモノマーに基づく構成単位と、メタクリル酸に基づく構成単位を有するコポリマーである請求項１に記載のデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  3. 　前記ポリマーは、２－(メタクリロイルオキシ)エチル－２'－(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９～５５：１～４５である請求項１又は２に記載のデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤。
  4. 　前記ポリマーは、２－(メタクリロイルオキシ)エチル－２'－(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９～７０：１～３０である請求項１又は２に記載のデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤。
  5. 　前記ポリマーは、重量平均分子量１０，０００～１，０００，０００の水溶性のポリマーである請求項１～４のいずれか１に記載のデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤。
  6. 　請求項１～５のいずれか１に記載のイムノクロマト測定法用増感剤を含む、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用検体希釈液。
  7. 　請求項１～５のいずれか１に記載のイムノクロマト測定法用増感剤の存在下で抗原抗体反応を行わせることを特徴とする、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法。
  8. 　請求項１～５のいずれか１に記載のイムノクロマト測定法用増感剤を含む、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定用器具。
  9. 　以下の（１）（２）の工程を含むデング熱の治療方法、
    　（１）下記一般式［１］で表されるポリマーを含んでなるイムノクロマト測定法用増感剤の存在下で抗原抗体反応を行うデング熱ウイルスの測定工程、及び
    　（２）上記（１）の測定結果に基づき、デング熱ウイルス治療を患者に施す工程。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ｒは、水素原子又は陽イオンから選ばれる１種以上を示し、ｍとｎはモル比であり、ｍは９９～５５、ｎは１～４５である。）
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