JPWO2016068225A1 - デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤及び該増感剤を使用した測定法 - Google Patents
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Abstract
デング熱ウイルスを高感度に検出できるイムノクロマト測定法用増感剤及び該増感剤を使用した測定法を提供することにある。一般式［１］で示されるホスホリルコリン類似基構造を有する基を側鎖に有するポリマーが目的の性能を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。
Description
本発明は、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤、及び該増感剤の共存下で行うデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法に関する。
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願、特願2014-223503号優先権を請求する。
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願、特願2014-223503号優先権を請求する。
イムノクロマト法は、メンブレンの毛細管現象を利用したクロマトグラフィーの手法と免疫学的手法を組み合わせた方法である。イムノクロマト法は、抗原抗体反応に起因する高い特異性を備え、操作が煩雑な重厚な設備や機器を必要とせず、軽便なキットを用いて簡易かつ迅速に測定を行え、かつ結果を目視で判定できることから、臨床診断法として広く普及している（参照：特許文献１）。
イムノクロマト法は、簡易に測定できる利点はあるが、検出感度の精度が低く、陽性検体を用いても偽陰性と判定される場合もあるので、より高感度のイムノクロマト測定法が望まれている。
これまでに、高感度のイムノクロマト測定法を確立する目的で種々の方法が検討されており、例えば、特許文献２では、イムノクロマトの試薬の添加位置を変える事で高感度化する手法が開示されている。また、特許文献３では、メンブレンの素材を改良することで高感度化する手法が開示されている。
これまでに、高感度のイムノクロマト測定法を確立する目的で種々の方法が検討されており、例えば、特許文献２では、イムノクロマトの試薬の添加位置を変える事で高感度化する手法が開示されている。また、特許文献３では、メンブレンの素材を改良することで高感度化する手法が開示されている。
さらに、従来のイムノクロマト法に用いている検体希釈液に、添加剤を加えることで、高感度化を達成する方法が知られている。例えば、特許文献４、５及び６では、検体希釈液中に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ホスホリルコリン基を有する重合体、ヒアルロン酸を含有させることが開示されている。これらの開示では、試薬の添加位置を変える必要がなく、また従来のイムノクロマト用メンブレンを使用可能という利点がある。
しかしながら、上記特許文献では、フラビウイルス科フラビウイルス属の一つであるデング熱ウイルスの測定を高感度に行う方法に用いる増感剤については開示又は示唆をされていない。
本発明では、デング熱ウイルスを高感度に検出できるイムノクロマト測定法用増感剤及び該増感剤を使用した測定法を提供することにある。
本発明者らは、負電荷を有すグルコサミノグリカンが多くのフラビウイルスに対し接着因子として機能することを知見として得て、これまでのイムノクロマトグラフィー負電荷を有する免疫学的測定法用の公知の増感剤と比較して、デング熱ウイルスを高感度に検出できる化合物を見出すべく鋭意検討した結果、下記一般式［１］で示されるホスホリルコリン類似基構造を有する基を側鎖に有するポリマーが目的の性能を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下よりなる。
すなわち、本発明は以下よりなる。
下記一般式［１］で表されるポリマーを含んでなる、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤。
式中、Ｒは、水素原子又は陽イオンから選ばれる１種以上を示し、ｍとｎはモル比であり、ｍは９９〜５５、ｎは１〜４５である。
前記ポリマーは、下記一般式［２］で表されるモノマーに基づく構成単位と、メタクリル酸に基づく構成単位を有するコポリマーである。
前記ポリマーは、２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９〜５５：１〜４５である。
前記ポリマーは、２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９〜７０：１〜３０である。
前記ポリマーは、重量平均分子量１０，０００〜１，０００，０００の水溶性のポリマーである。
前記ポリマーは、２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９〜７０：１〜３０である。
前記ポリマーは、重量平均分子量１０，０００〜１，０００，０００の水溶性のポリマーである。
前項に記載のイムノクロマト測定法用増感剤を含む、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用検体希釈液。
前項に記載のイムノクロマト測定法用増感剤の存在下で抗原抗体反応を行わせることを特徴とする、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法。
前項に記載のイムノクロマト測定法用増感剤を含む、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定用器具。
以下の（１）（２）の工程を含むデング熱の治療方法。
（１）下記一般式［１］で表されるポリマーを含んでなるイムノクロマト測定法用増感剤の存在下で抗原抗体反応を行うデング熱ウイルスの測定工程。
（２）上記（１）の測定結果に基づき、デング熱ウイルス治療を患者に施す工程。
（１）下記一般式［１］で表されるポリマーを含んでなるイムノクロマト測定法用増感剤の存在下で抗原抗体反応を行うデング熱ウイルスの測定工程。
（２）上記（１）の測定結果に基づき、デング熱ウイルス治療を患者に施す工程。
上記式中、Ｒは、水素原子又は陽イオンから選ばれる１種以上を示し、ｍとｎはモル比であり、ｍは９９〜５５、ｎは１〜４５である。
上記ポリマーは、下記一般式［２］で表されるモノマーに基づく構成単位と、メタクリル酸に基づく構成単位を有するコポリマーである。
前記ポリマーは、２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９〜５５：１〜４５である。
前記ポリマーは、２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９〜７０：１〜３０である。
前記ポリマーは、重量平均分子量１０，０００〜１，０００，０００の水溶性のポリマーである。
前記ポリマーは、２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９〜７０：１〜３０である。
前記ポリマーは、重量平均分子量１０，０００〜１，０００，０００の水溶性のポリマーである。
本発明のデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤を使用した測定方法では、従来のデング熱ウイルスを検出するイムノクロマト測定法用と比較して、高感度でデング熱ウイルスを検出することができる。
さらに、本発明のデング熱の治療方法は、高感度でデング熱ウイルスを検出することができるので、デング熱の患者に迅速にデング熱治療を施すことができる。
さらに、本発明のデング熱の治療方法は、高感度でデング熱ウイルスを検出することができるので、デング熱の患者に迅速にデング熱治療を施すことができる。
本発明のデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤、該増感剤を含むデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用検体希釈液、該増感剤の存在下で抗原抗体反応を行わせるデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法、該増感剤を含むデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定用器具、及び、該増感剤の存在下で抗原抗体反応を行わせる工程を含むデング熱の治療方法を、以下で説明する。
なお、本発明のイムノクロマト測定法用増感剤を使用する測定法では、測定対象物質としてはデング熱ウイルスであるが、他の測定対象物質も検出できる。しかし、本発明のイムノクロマト測定法用増感剤は、デング熱ウイルスを高感度に検出できることを特徴とする。
なお、本発明のイムノクロマト測定法用増感剤を使用する測定法では、測定対象物質としてはデング熱ウイルスであるが、他の測定対象物質も検出できる。しかし、本発明のイムノクロマト測定法用増感剤は、デング熱ウイルスを高感度に検出できることを特徴とする。
本発明のデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤として用いられるポリマーは、下記一般式［１］で表される。
上記式中、Ｒは、水素原子又は陽イオンから選ばれる１種以上を示す。ここで、陽イオンは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオン等が挙げられ、これらの組み合わせであっても良い。
これらの組み合わせの例としては、メタクリル酸、メタクリル酸ナトリウム、メタクリル酸カリウム、メタクリル酸アンモニウム等を例示することができる。
これらの組み合わせの例としては、メタクリル酸、メタクリル酸ナトリウム、メタクリル酸カリウム、メタクリル酸アンモニウム等を例示することができる。
上記式中、ｍとｎはモル比であり、ｍとｎの割合は、９９〜５５：１〜４５、好ましくは９０〜６０：１０〜４０、より好ましくは８０〜６５：２０〜３５、最も好ましくは７０：３０である。
上記式で表されるポリマーは、重量平均分子量１０，０００〜１，０００，０００、好ましくは５０，０００〜５００，０００の水溶性ポリマーである。
本発明の一般式［１］で示される水溶性ポリマーは、下記一般式［２］で表されるモノマー｛MPC：２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート｝に基づく構成単位と、メタクリル酸に基づく構成単位を有するコポリマーにより成る。
イムノクロマト測定法用増感剤として用いられるポリマーは、好ましくは、以下を例示することができるが特に限定されない。
２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９〜５５：１〜４５である。
２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９〜７０：１〜３０である。
２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９０〜６０：１〜４０である。
２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が８０〜６５：２０〜３５である。
２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が約７０：約３０である。
前記ポリマーは、重量平均分子量１０，０００〜１，０００，０００の水溶性のポリマーである。
２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９〜５５：１〜４５である。
２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９〜７０：１〜３０である。
２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９０〜６０：１〜４０である。
２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が８０〜６５：２０〜３５である。
２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が約７０：約３０である。
前記ポリマーは、重量平均分子量１０，０００〜１，０００，０００の水溶性のポリマーである。
一般式［１］で示される水溶性ポリマーの具体的な製造例は、特開平０８−３３３４２１号、特許文献６に記載の方法を例示することができるが特に限定されない。
本発明のイムノクロマト測定法用増感剤として用いられるポリマーは、イムノクロマト測定法に用いられる各種試薬や試料に溶解させて用いてもよく、また、イムノクロマト測定法用キットに担持させて用いてもよいが、好ましくは、検体希釈液として用いることが好ましい。
なお、本発明のイムノクロマト測定法とは、用いられるイムノクロマト測定法用キットとして一般に、検体希釈液とテストストリップからなる。
なお、本発明のイムノクロマト測定法とは、用いられるイムノクロマト測定法用キットとして一般に、検体希釈液とテストストリップからなる。
検体希釈液とは、イムノクロマトグラフィー法で測定するに際しての、適当な希釈剤であり、トリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッド緩衝剤等の緩衝成分、アルブミン、グロブリン、カゼイン、血清、水溶性ゼラチン、界面活性剤、糖類、キレート剤等の安定化成分、サリチル酸、安息香酸、アジ化ナトリウム等の防腐成分を含むことができる。
本発明の増感剤を、検体希釈液に溶解させて用いる場合、その濃度は、抗原抗体反応がなされる際の濃度として、特に限定されないが、通常0.1〜5.0w/v％、好ましくは0.5〜1.0w/v％となるように用いられる。
テストストリップとは、一般に、検体の第一の抗原決定基にて抗原抗体反応可能な第一の物質と、前記検体の第二の抗原決定基にて抗原抗体反応可能で且つ標識された第二の物質と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一の物質は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の物質は前記捕捉部位から隔離した位置で前記担体にてクロマト展開可能なように配置されて構成される。
イムノクロマト測定用テストストリップは、市販品を用いても、公知の方法により作製したものを用いてもよい。公知の方法により作製する場合、上記展開膜で用いられる基材としては、通常この分野で用いられるものを用いればよく、例えばセルロース、ニトロセルロース、ナイロン等が好ましいものとして挙げられる。
本発明の増感剤を含むデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定用器具としては、例えば（１）展開膜からなるもの、（２）検体標識部並びに展開膜からなり、且つ該検体標識部と該展開膜とが毛管現象により移動可能なように形成されたもの、（３）検体標識部、展開膜並びに液体吸収部からなり、且つ該検体標識部と該展開膜と該液体吸収部とが、この順に毛管現象により移動可能なように形成されたもの、（４）検体滴下部、検体標識部、展開膜並びに液体吸収部からなり、且つ該検体滴下部と該検体標識部と該展開膜と該液体吸収部とが、この順に毛管現象により移動可能なように形成されたもの等が挙げられるが、特に限定されない。
本発明の増強剤を、前記イムノクロマト測定法用器具に担持させて用いる場合、その量は、担持される場所、使用する感度増強剤の種類、使用する測定対象物質の種類、使用する標識物質等により変動するが、例えばイムノクロマト測定法用器具の展開膜、検体標識部、検体滴下部等に担持させる場合、単位面積（cm2）当たりに含まれる感度増強剤の量として、通常0.01μg〜10ｍｇ、好ましくは0.1μg〜4ｍｇ、より好ましくは1〜800μgである。また、担持される面積は、用いられるイムノクロマト測定法用器具の種類及び大きさ、測定用試料の量により変動するが、イムノクロマト測定法用器具の展開膜の場合には、通常総面積の10〜60％、好ましくは20〜30％、検体標識部の場合には、通常総面積の1〜30％、好ましくは5〜15％、検体滴下部の場合には、通常総面積の5〜40％、好ましくは10〜20％である。
本発明のデング熱の治療方法は、少なくとも以下の（１）及び（２）の工程を含む。
（１）前記ポリマーを含んでなるイムノクロマト測定法用増感剤の存在下で抗原抗体反応を行うデング熱ウイルスの測定工程。
（２）上記（１）の測定結果に基づき、デング熱ウイルス治療を患者に施す工程。
なお、患者は、デング熱に感染しているおそれのある人も含む。なお、測定とは、患者由来の検体中にデング熱ウイルスが存在するかどうかを検出することを意味する。
また、デング熱ウイルス治療を患者に施す工程とは、公知治療薬、今後上市される治療薬、臨床段階の治療薬候補を患者に投与するだけでなく、対症療法（アスピリン投与、補液・輸液投与等）も含む。
本発明のデング熱の治療方法は、高感度でデング熱ウイルスを検出することができるので、デング熱の患者に迅速にデング熱治療を施すことができる。
（１）前記ポリマーを含んでなるイムノクロマト測定法用増感剤の存在下で抗原抗体反応を行うデング熱ウイルスの測定工程。
（２）上記（１）の測定結果に基づき、デング熱ウイルス治療を患者に施す工程。
なお、患者は、デング熱に感染しているおそれのある人も含む。なお、測定とは、患者由来の検体中にデング熱ウイルスが存在するかどうかを検出することを意味する。
また、デング熱ウイルス治療を患者に施す工程とは、公知治療薬、今後上市される治療薬、臨床段階の治療薬候補を患者に投与するだけでなく、対症療法（アスピリン投与、補液・輸液投与等）も含む。
本発明のデング熱の治療方法は、高感度でデング熱ウイルスを検出することができるので、デング熱の患者に迅速にデング熱治療を施すことができる。
以下、本実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
（本発明のポリマー及び比較例のポリマーの作成）
本発明のイムノクロマト測定法用増感剤として用いられるポリマー（実施態様例１、２）及び比較例のポリマーを作成した。詳細は、以下の通りである。
本発明のイムノクロマト測定法用増感剤として用いられるポリマー（実施態様例１、２）及び比較例のポリマーを作成した。詳細は、以下の通りである。
本発明のポリマー及び比較例のポリマーは、２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェート（ＭＰＣ）と１種又は２種のモノマーから合成した（参照：下記表１）。
（実施態様例のポリマー）
○実施態様例１ ＰＭＡ９９
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸とからなるコポリマー、分子量；100×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸の構成比；９９：１。
○実施態様例２ ＰＭＡ７０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸とからなるコポリマー、分子量；230×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸の構成比；７０：３０。
○実施態様例１ ＰＭＡ９９
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸とからなるコポリマー、分子量；100×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸の構成比；９９：１。
○実施態様例２ ＰＭＡ７０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸とからなるコポリマー、分子量；230×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸の構成比；７０：３０。
（比較例のポリマー）
○比較例１ ＰＭＰＣ
ＭＰＣモノマーのホモポリマー、分子量；1,000×103。
○比較例２ ＰＭＡ５０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸とからなるコポリマー、分子量；1100×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸の構成比；５０：５０。
○比較例３ ＰＭＡ３０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸とからなるコポリマー、分子量；700×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸の構成比；３０：７０。
○比較例４ ＰＭＢ８０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸ブチルとからなるコポリマー、分子量；600×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸ブチルの構成比；８０：２０。
○比較例５ ＰＭＢ３０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸ブチルとからなるコポリマー、分子量；90×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸ブチルの構成比；３０：７０。
○比較例６ ＰＭＥ７０
ＭＰＣモノマーとモノメチルエーテルポリエチレングリコールメタクリレートとからなるコポリマー、分子量；140×103、ＭＰＣモノマーとモノメチルエーテルポリエチレングリコールメタクリレートの構成比；７０：３０。
○比較例７ ＰＭＳ８０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸オクタデシルとからなるポリマー、分子量；40×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸オクタデシルの構成比；８０：２０。
○比較例８ ＰＭＺ８０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸ベンジルとからなるポリマー、分子量；240×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸ベンジルの構成比；８０：２０。
○比較例９ ＰＭＩ８０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸イソボルニルとからなるポリマー、分子量；260×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸イソボルニルの構成比；８０：２０。
○比較例１０ ＰＭＳ５０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸オクタデシルとからなるポリマー、分子量；200×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸オクタデシルの構成比；５０：５０。
○比較例１１ ＰＭＳ３０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸オクタデシルとからなるポリマー、分子量；200×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸オクタデシルの構成比；３０：７０。
○比較例１ ＰＭＰＣ
ＭＰＣモノマーのホモポリマー、分子量；1,000×103。
○比較例２ ＰＭＡ５０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸とからなるコポリマー、分子量；1100×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸の構成比；５０：５０。
○比較例３ ＰＭＡ３０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸とからなるコポリマー、分子量；700×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸の構成比；３０：７０。
○比較例４ ＰＭＢ８０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸ブチルとからなるコポリマー、分子量；600×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸ブチルの構成比；８０：２０。
○比較例５ ＰＭＢ３０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸ブチルとからなるコポリマー、分子量；90×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸ブチルの構成比；３０：７０。
○比較例６ ＰＭＥ７０
ＭＰＣモノマーとモノメチルエーテルポリエチレングリコールメタクリレートとからなるコポリマー、分子量；140×103、ＭＰＣモノマーとモノメチルエーテルポリエチレングリコールメタクリレートの構成比；７０：３０。
○比較例７ ＰＭＳ８０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸オクタデシルとからなるポリマー、分子量；40×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸オクタデシルの構成比；８０：２０。
○比較例８ ＰＭＺ８０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸ベンジルとからなるポリマー、分子量；240×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸ベンジルの構成比；８０：２０。
○比較例９ ＰＭＩ８０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸イソボルニルとからなるポリマー、分子量；260×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸イソボルニルの構成比；８０：２０。
○比較例１０ ＰＭＳ５０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸オクタデシルとからなるポリマー、分子量；200×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸オクタデシルの構成比；５０：５０。
○比較例１１ ＰＭＳ３０
ＭＰＣモノマーとメタクリル酸オクタデシルとからなるポリマー、分子量；200×103、ＭＰＣモノマーとメタクリル酸オクタデシルの構成比；３０：７０。
（本発明のイムノクロマト測定法用増感剤として用いられるポリマーの検出感度の確認）
本実施例では、本発明のイムノクロマト測定法用増感剤として用いられるポリマーのデング熱ウイルスの検出感度を確認するために、イムノクロマト用キットを反映したＥＬＩＳＡ法による定量的な比較（比較例のポリマーとの比較）を行った。詳細は、以下の通りである。
本実施例では、本発明のイムノクロマト測定法用増感剤として用いられるポリマーのデング熱ウイルスの検出感度を確認するために、イムノクロマト用キットを反映したＥＬＩＳＡ法による定量的な比較（比較例のポリマーとの比較）を行った。詳細は、以下の通りである。
（ポリマーの検出感度の測定方法）
抗DVｍAB（抗デング熱ウイルスモノクローナル抗体）の１０μg/mL溶液を５０μLずつマイクロチューブに入れ、さらに、終濃度が０．５、１．０重量％となるよう各実施態様例又は比較例のポリマーを含むイムノクロマト用ブロッキング試薬を該チューブに１００μＬずつ添加した。次に、イムノクロマト用ブロッキング剤（０．５重量％のカゼインを含むホウ酸緩衝液）を適量の血清で希釈したものを５０μＬと混合して、３７℃、６０分間静置した。
次に、該イムノクロマト用ブロッキング試薬を、さらに、該イムノクロマト用ブロッキング剤で前処理したＥＬＩＳＡプレートに添加し、３７℃、６０分間静置した。静置後、プレートを３００μＬの洗浄液（０．１重量％のＴｗｅｅｎを含むＰＢＳ溶液）で３回洗浄した。
次に、抗抗原２次抗体（１重量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液にて２０００倍に希釈したＰＯＤ標識の抗抗原２次抗体溶液）５０μＬを各ウェルに添加し３７℃、２時間静置した。各ウェルを３００μＬの洗浄液で３回洗浄し、過剰な抗抗原２次抗体を除去後、５０μＬのＴＭＢ（３，３'，５，５'−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を各ウェルに添加し室温にて５分間静置した。その後、１Ｎ−硫酸５０μＬを添加して反応停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。なお、ポリマー非添加系の吸光度の平均は、０．２１０であり、これに対する増感度比を評価した。ここで、増感度比が２．０以上であれば増感効果があると判断した。
抗DVｍAB（抗デング熱ウイルスモノクローナル抗体）の１０μg/mL溶液を５０μLずつマイクロチューブに入れ、さらに、終濃度が０．５、１．０重量％となるよう各実施態様例又は比較例のポリマーを含むイムノクロマト用ブロッキング試薬を該チューブに１００μＬずつ添加した。次に、イムノクロマト用ブロッキング剤（０．５重量％のカゼインを含むホウ酸緩衝液）を適量の血清で希釈したものを５０μＬと混合して、３７℃、６０分間静置した。
次に、該イムノクロマト用ブロッキング試薬を、さらに、該イムノクロマト用ブロッキング剤で前処理したＥＬＩＳＡプレートに添加し、３７℃、６０分間静置した。静置後、プレートを３００μＬの洗浄液（０．１重量％のＴｗｅｅｎを含むＰＢＳ溶液）で３回洗浄した。
次に、抗抗原２次抗体（１重量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液にて２０００倍に希釈したＰＯＤ標識の抗抗原２次抗体溶液）５０μＬを各ウェルに添加し３７℃、２時間静置した。各ウェルを３００μＬの洗浄液で３回洗浄し、過剰な抗抗原２次抗体を除去後、５０μＬのＴＭＢ（３，３'，５，５'−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を各ウェルに添加し室温にて５分間静置した。その後、１Ｎ−硫酸５０μＬを添加して反応停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。なお、ポリマー非添加系の吸光度の平均は、０．２１０であり、これに対する増感度比を評価した。ここで、増感度比が２．０以上であれば増感効果があると判断した。
（ポリマーの検出感度の向上の結果）
各ポリマーでの増感度比の結果を図１に示す。
実施態様例１及び実施態様例２のポリマーのみが増感度比２．０を超えた。すなわち、カルボキシル基を有するＭＰＣポリマーを用いた場合には、顕著な増感度を確認した。さらに、ＰＭＡ９９（実施態様例１）、ＰＭＡ７０（実施態様例２）において、より高い増感効果示し、同じカルボキシル基を有するポリマーであるＰＭＡ５０（比較例２）、ＰＭＡ３０（比較例３）では増感効果が２倍未満であることを確認した。
これにより、一般式［１］で示される水溶性ポリマーのｍとｎの割合は、９９〜５５：１〜４５、好ましくは９０〜６０：１０〜４０、より好ましくは８０〜６５：２０〜３５、最も好ましくは７０：３０であることを確認した。
各ポリマーでの増感度比の結果を図１に示す。
実施態様例１及び実施態様例２のポリマーのみが増感度比２．０を超えた。すなわち、カルボキシル基を有するＭＰＣポリマーを用いた場合には、顕著な増感度を確認した。さらに、ＰＭＡ９９（実施態様例１）、ＰＭＡ７０（実施態様例２）において、より高い増感効果示し、同じカルボキシル基を有するポリマーであるＰＭＡ５０（比較例２）、ＰＭＡ３０（比較例３）では増感効果が２倍未満であることを確認した。
これにより、一般式［１］で示される水溶性ポリマーのｍとｎの割合は、９９〜５５：１〜４５、好ましくは９０〜６０：１０〜４０、より好ましくは８０〜６５：２０〜３５、最も好ましくは７０：３０であることを確認した。
（公知のイムノクロマト測定用器具を使用しての検出感度の確認）
本実施例では、本発明のポリマーが、公知のデング熱ウイルスの検出キットの検出感度を向上させることができるか（増感効果があるか）どうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
本実施例では、本発明のポリマーが、公知のデング熱ウイルスの検出キットの検出感度を向上させることができるか（増感効果があるか）どうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
市販のRapiDeng Agキット（株式会社バイオメディカル研究所社製品）であるＩＣＡキットで評価した。より詳しくは、血清型が４種類（DV1、DV2、DV3及びDV4）のデング熱ウイルスを検出するために、DenV検出ICAキットの展開剤（５重量％EDTA、５μg／mLマウス血清、０．１重量％Tween／ＰＢＳ）に終濃度０．２重量％となるようＰＭＡ７０を添加し、２×１０６pfu/mLのDV溶液から１０倍、１００倍に希釈した溶液を加えICAを展開した。
（イムノクロマト測定用器具を使用しての検出感度の確認の結果）
公知のデング熱ウイルス検出用イムノクロマト測定用器具を使用しての検出感度向上の結果を図２に示す。
０．２重量％のＰＭＡ７０を添加した場合は、１００倍希釈したウイルス溶液を加えたICAキットでも増感により検出可能であった。一方、コントロールの無添加系では１０倍希釈したDV溶液では検出できず、原液のみにしか検出できなかった。
公知のデング熱ウイルス検出用イムノクロマト測定用器具を使用しての検出感度向上の結果を図２に示す。
０．２重量％のＰＭＡ７０を添加した場合は、１００倍希釈したウイルス溶液を加えたICAキットでも増感により検出可能であった。一方、コントロールの無添加系では１０倍希釈したDV溶液では検出できず、原液のみにしか検出できなかった。
（総論）
以上の実施例より、本発明は、公知のデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法と比較して、著しく増感効果が優れているイムノクロマト測定法を提供することができた。
さらに、本発明のデング熱の治療方法は、高感度でデング熱ウイルスを検出することができるので、デング熱の患者又はデング熱に感染しているおそれの患者に迅速にデング熱治療を施すことができるので治療効果が高い。
以上の実施例より、本発明は、公知のデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法と比較して、著しく増感効果が優れているイムノクロマト測定法を提供することができた。
さらに、本発明のデング熱の治療方法は、高感度でデング熱ウイルスを検出することができるので、デング熱の患者又はデング熱に感染しているおそれの患者に迅速にデング熱治療を施すことができるので治療効果が高い。
本発明は、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤を提供することができる。
Claims (9)
- 下記一般式［１］で表されるポリマーを含んでなる、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤。
- 前記ポリマーは、下記一般式［２］で表されるモノマーに基づく構成単位と、メタクリル酸に基づく構成単位を有するコポリマーである請求項１に記載のデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤。
- 前記ポリマーは、２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９〜５５：１〜４５である請求項１又は２に記載のデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤。
- 前記ポリマーは、２−(メタクリロイルオキシ)エチル−２'−(トリメチルアンモニオ)エチルホスフェートとメタクリル酸の構成比が９９〜７０：１〜３０である請求項１又は２に記載のデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤。
- 前記ポリマーは、重量平均分子量１０，０００〜１，０００，０００の水溶性のポリマーである請求項１〜４のいずれか１に記載のデング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用増感剤。
- 請求項１〜５のいずれか１に記載のイムノクロマト測定法用増感剤を含む、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法用検体希釈液。
- 請求項１〜５のいずれか１に記載のイムノクロマト測定法用増感剤の存在下で抗原抗体反応を行わせることを特徴とする、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定法。
- 請求項１〜５のいずれか１に記載のイムノクロマト測定法用増感剤を含む、デング熱ウイルスを測定対象物質とするイムノクロマト測定用器具。
- 以下の（１）（２）の工程を含むデング熱の治療方法、
（１）下記一般式［１］で表されるポリマーを含んでなるイムノクロマト測定法用増感剤の存在下で抗原抗体反応を行うデング熱ウイルスの測定工程、及び
（２）上記（１）の測定結果に基づき、デング熱ウイルス治療を患者に施す工程。
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-
2015
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