WO2016067946A1 - 中空糸膜モジュールのプライミング方法 - Google Patents

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WO2016067946A1
WO2016067946A1 PCT/JP2015/079412 JP2015079412W WO2016067946A1 WO 2016067946 A1 WO2016067946 A1 WO 2016067946A1 JP 2015079412 W JP2015079412 W JP 2015079412W WO 2016067946 A1 WO2016067946 A1 WO 2016067946A1
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hollow fiber
fiber membrane
priming
membrane module
outlet
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PCT/JP2015/079412
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English (en)
French (fr)
Inventor
伸好 梅田
修平 谷口
Original Assignee
株式会社カネカ
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/3621—Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/3643—Priming, rinsing before or after use
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/02—Blood transfusion apparatus
    • A61M1/0259—Apparatus for treatment of blood or blood constituents not otherwise provided for
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/34—Filtering material out of the blood by passing it through a membrane, i.e. hemofiltration or diafiltration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D63/00—Apparatus in general for separation processes using semi-permeable membranes
    • B01D63/02—Hollow fibre modules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D65/00—Accessories or auxiliary operations, in general, for separation processes or apparatus using semi-permeable membranes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D67/00—Processes specially adapted for manufacturing semi-permeable membranes for separation processes or apparatus
    • B01D67/0081—After-treatment of organic or inorganic membranes
    • B01D67/0088—Physical treatment with compounds, e.g. swelling, coating or impregnation

Definitions

  • the present invention relates to a technique for priming a hollow fiber membrane module filled with a hollow fiber membrane.
  • Hollow fiber membrane modules filled with hollow fiber membranes are widely used for the purpose of separating and filtering proteins, viruses, and contaminants in cell suspensions in the fields of blood purification and plasma separation in the field of extracorporeal circulation, and cell medicine. It has been.
  • the blood and air bubbles filled in the hollow fiber membrane module need to be completely removed beforehand because the blood that has passed through the hollow fiber membrane module returns directly into the body.
  • a priming solution such as a physiological saline solution is introduced into the hollow fiber membrane module before starting extracorporeal circulation (Patent Document 1).
  • the priming solution is introduced through different channels from the inside and outside of the hollow fiber membrane, that is, from both the blood channel side and the dialysate side. Is a complicated and time-consuming process.
  • Patent Document 2 a priming method in the case of using a hollow fiber membrane module in the field of cell medicine.
  • the cell suspension that has passed through the hollow fiber membrane module is not returned directly into the body, so it is necessary to completely remove air and bubbles in the hollow fiber membrane module beforehand.
  • the necessity for considering the priming was low.
  • the priming process in which the inside and outside of the hollow fiber membrane is filled with a priming solution such as physiological saline before starting the cell treatment to increase the effective filtration area of the hollow fiber membrane, It is very important because it contributes to the improvement of the cell recovery rate. Furthermore, when using a hollow fiber membrane module for cellular medical applications, unlike blood purification, it is difficult to assume that a priming solution is introduced from the outside of the hollow fiber membrane, but the priming solution is quickly brought into contact with the hollow fiber membrane. In view of the above, there are cases where the priming liquid is introduced from the outside of the hollow fiber membrane through the mouth having a large diameter.
  • a priming method in which a priming solution introduced from the inside of the hollow fiber membrane can be filled into both the inside and the outside of the hollow fiber membrane.
  • a priming solution introduced from the inside of the hollow fiber membrane can be filled into both the inside and the outside of the hollow fiber membrane.
  • the structure of the hollow fiber membrane module such as providing an air release valve outside the hollow fiber membrane to release the air existing outside the hollow fiber membrane. It was.
  • the present inventors have designed a hollow fiber membrane module of any shape by designing the linear velocity of the priming liquid introduced into the hollow fiber membrane module within a specific range. In doing so, the inventors have found a priming method in which the priming liquid introduced from the inside of the hollow fiber membrane can be easily filled into both the inside and the outside of the hollow fiber membrane, thereby completing the present invention.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a method for priming a hollow fiber membrane module in which a hollow fiber membrane is filled in a container having an inlet, an outlet and a filtrate outlet A priming method comprising a step of filling a priming solution at a linear velocity of 35 cm / min to 450 cm / min from the inlet or outlet of the hollow fiber membrane module by 15% or more with respect to the volume of the hollow fiber membrane module.
  • the priming method according to (1) wherein the pressure difference between the internal pressure and the external pressure of the hollow fiber membrane during priming is 7 mmHg or more and 29 mmHg or less.
  • a cell suspension is introduced from the outlet of the hollow fiber membrane module, and the cell-free filtrate.
  • a method for producing a cell concentrate comprising a step of concentrating a cell suspension while discharging from a filtrate outlet.
  • (11) The method for producing a cell concentrate according to (10), wherein a hollow fiber membrane module having at least one filtrate outlet is used.
  • the effective filtration area of the hollow fiber membrane module at the time of cell treatment is increased, and the filtration rate is improved without causing a decrease in cell recovery rate that occurs when priming is insufficient.
  • the cell recovery rate can be improved without reducing the filtration rate.
  • a suitable priming can be performed even in a hollow fiber membrane module that does not have an air release valve outside the hollow fiber membrane. it can.
  • the hollow fiber membrane module which does not have the air release valve processed with the priming method of this invention since cell processing can be completed, maintaining a closed environment, the obtained cell can be provided as a therapeutic use.
  • the priming method of the present invention is a method of priming a hollow fiber membrane module in which a hollow fiber membrane is filled in a container having an inlet, a outlet and a filtrate outlet.
  • the hollow fiber membrane module used in the present invention is of a type in which a hollow fiber membrane is filled in a container having an inlet, an outlet and a filtrate outlet.
  • a priming solution is introduced from the inlet (or outlet) into the hollow fiber membrane. While filling the space inside the hollow fiber membrane, a part of the priming liquid passes through the fine holes provided in the hollow fiber membrane wall and is discharged to the outside of the hollow fiber membrane. Filled with space between.
  • the priming solution inside the hollow fiber membrane is replaced with the cell suspension via the outlet (or inlet), and the priming solution discharged outside the hollow fiber membrane is replaced with the cell suspension via the filtrate outlet. Each is discharged from the hollow fiber membrane module.
  • the introduction port and the discharge port communicate with each other through the inside of the hollow fiber membrane.
  • a liquid such as a cell suspension passes from the introduction port through the hollow portion inside the hollow fiber membrane, and is led out of the hollow fiber membrane module from the lead-out port.
  • the liquid component moves outside through the hollow fiber membrane wall, so that cell concentration can be performed.
  • the inlet for the priming solution introduced into the hollow fiber membrane module in the priming step may be the outlet for the cell suspension introduced in the subsequent cell concentration step.
  • One of the inlets and outlets for the liquid for the purpose is indicated as “inlet” and the other is indicated as “outlet”.
  • a port for introducing the priming liquid into the hollow fiber membrane module will be described as an “introduction port”, and a port for extracting the priming liquid from the hollow fiber membrane module will be described as a “outlet port”.
  • the hollow fiber membrane module is not particularly limited as long as it has the above-described configuration, and examples thereof include a hollow fiber membrane module A shown in FIG.
  • a container 1 constituting the hollow fiber membrane module A includes a body portion 2 and heads 3 and 9 on both sides thereof, and a filtrate discharge port 4 is provided in the vicinity of the head 9.
  • the position of the filtrate discharge port 4 may be provided at the end of the head 9 or the body 2, or may be provided at the center of the body 2.
  • the number of the filtrate outlets 4 is not particularly limited, and it is preferable that at least one filtrate outlet 4 is provided in view of the use of the hollow fiber membrane module for the purpose of separation and filtration after priming.
  • the filtrate outlet 4 and the filtrate outlet 4 ′ are provided at substantially the same distance from the inlet 8a of the hollow fiber membrane module B, but are provided at different positions. Also good.
  • the filtrate produced in the hollow fiber membrane module B is introduced into the waste liquid container 13 by driving the pump 11b from the filtrate discharge ports 4, 4 ′.
  • the hollow fiber membrane module B is provided with the filtrate outlet 4 ′ and the pump 11a and pressure gauge 14a in the circuit 16 on the inlet 8a side instead of providing the pump 11a and pressure gauge 14a on the outlet 8b side. It has the same configuration as the hollow fiber membrane module A except that 'is provided. Therefore, as for the configuration of the hollow fiber membrane module B, the description of the configuration common to the hollow fiber membrane module A is omitted unless particularly required.
  • an inlet 8 a is provided in the lower head 9 and an outlet 8 b is provided in the upper head 3.
  • the inlet 8a is an inlet for introducing the priming liquid into the inside of the hollow fiber membrane
  • the outlet 8b is an outlet for leading out the priming liquid from the inside of the hollow fiber membrane.
  • the bundle 5 of hollow fiber membranes loaded and the bundle 5 of hollow fiber membranes provided inside the head 3 are fixed inside the trunk portion 2 and the open end 6 of the hollow fiber membrane is provided.
  • It has a resin layer portion 7 that is formed and a structure equivalent to that provided inside the head portion 9.
  • the resin layer portion 7 and the open end 6 have a structure covered with the head 3 (or the head 9), and the inlet 8a, outlet 8b and filtrate outlet 4 constitute a hollow fiber membrane. It is separated from the wall material to make it non-continuous.
  • the hollow fiber membrane module A shown in FIG. 1 distinguishes each part as the trunk
  • Various structures can be adopted as long as they are continuous and have a structure in which the inlet 8a and outlet 8b and the filtrate outlet 4 are separated by the wall material constituting the hollow fiber membrane.
  • the hollow fiber membrane module A may be sterilized from the viewpoint of preventing bacteria from entering the cells.
  • the sterilization method is not particularly limited, and sterilization methods widely used for sterilization of medical devices such as ⁇ -ray sterilization, electron beam sterilization, EOG sterilization, and high-pressure steam sterilization can be suitably used.
  • acrylonitrile polymers such as acrylonitrile butadiene styrene terpolymer; polytetrafluoroethylene, polychlorotrifluoroethylene, copolymers of tetrafluoroethylene and hexafluoropropylene, halogenated polymers such as polyvinyl chloride; Polyamide, polyimide, polysulfone, polycarbonate, polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride acrylic copolymer, acrylonitrile, butadiene styrene, polystyrene, polymethylpentene, and the like can be used.
  • a material having sterilization resistance specifically, polypropylene, polyvinyl chloride, polyethylene, polyimide, polycarbonate, polysulfone, polymethylpentene, polystyrene and the like are preferable.
  • the material of the resin layer portion for fixing the hollow fiber membrane general adhesive materials such as polyurethane resin, epoxy resin, and silicon resin can be preferably used.
  • the hollow fiber membrane module is preferably filled with about 10 to 1000 hollow fiber membranes in a container.
  • the arrangement of the hollow fiber membrane may be linear, bent, or spiral, and both ends of the hollow fiber membrane are held between the inlet and the outlet. If it is done, the shape is not particularly limited.
  • the hollow fiber membranes for priming may be arranged in the vertical direction, arranged in the horizontal direction, or arranged in the oblique direction, but in order to maximize the effective filtration area It is more preferable that the hollow fiber membranes are arranged in the vertical direction.
  • the effective filtration area is the membrane area inside the hollow fiber membrane where the outside of the hollow fiber membrane is immersed in the priming liquid after priming.
  • a synthetic polymer material can be preferably used from the viewpoint of material safety and stability.
  • polysulfone-based or cellulose-based hydrophilic polymer materials can be more preferably used.
  • polyethersulfone and cellulose ester can be most suitably used because of the safety, stability, and availability of the material.
  • the hole diameter of the hole provided in the wall of the hollow fiber membrane is preferably 0.1 ⁇ m or more and 1.5 ⁇ m or less.
  • the pore diameter is less than 0.1 ⁇ m, the air existing outside the hollow fiber membrane is not replaced by the priming solution during priming, or impurities such as unnecessary proteins are efficiently removed when the cell suspension is concentrated. It is not preferable because it cannot be done.
  • the pore diameter is less than 0.1 ⁇ m, the size of the pore is usually expressed by a molecular weight cut off. For example, in a hollow fiber membrane of about 500 kD, the priming solution cannot pass through the pores of the hollow fiber membrane due to surface tension. Therefore, the air existing outside the hollow fiber membrane is not replaced by the priming liquid.
  • the upper limit of the pore diameter is preferably 1.5 ⁇ m or less, more preferably 1.2 ⁇ m or less, and further preferably 1.0 ⁇ m or less.
  • the pore diameter of the hollow fiber membrane refers to the average pore diameter of the hollow fiber membrane, and is generally measured and calculated by a palm porometer.
  • the inner diameter formed inside the hollow fiber membrane is not particularly limited as long as it is large enough to allow cell suspension to pass through.
  • the priming solution examples include infusion solutions typified by physiological saline, distilled water, Ringer's solution, liquids containing inorganic salts, saccharides, serum, and proteins, buffer solutions, plasma, culture media, and the like.
  • a physiological saline solution or an infusion solution can be preferably used from the viewpoint of safety.
  • the liquid containing serum, plasma, and protein can be used as a priming solution because the surface of the hollow fiber membrane is coated with protein, thereby preventing cell adhesion to the hollow fiber membrane and improving the cell recovery rate. It can be used suitably.
  • the priming liquid does not have to be one kind of liquid, and two or more liquids from these groups can be mixed and used. As an example of mixing and using two liquids, a combination of a physiological saline solution added with albumin or a culture medium added with serum can be mentioned.
  • the priming liquid is introduced into the volume of the hollow fiber membrane module from the inlet or outlet of the hollow fiber membrane module at a linear velocity of 35 cm / min to 450 cm / min.
  • the priming liquid is characterized by including a priming step of filling 15% or more, which increases the effective filtration area of the hollow fiber membrane module at the time of cell treatment, and improves the filtration rate without causing a decrease in cell recovery rate.
  • the effective filtration area is the membrane area inside the hollow fiber membrane where the outside of the hollow fiber membrane is immersed in the priming solution.
  • the lower limit of the linear velocity of the priming liquid introduced inside the hollow fiber membrane is 35 cm / min.
  • the upper limit of the linear velocity of the priming liquid introduced into the hollow fiber membrane is 450 cm / min, preferably 420 cm / min, more preferably 300 cm / min. If the linear velocity is less than 35 cm / min, there is a concern that the priming process will take too much time.
  • the hollow fiber will be used before the air outside the hollow fiber membrane is replaced with the priming liquid.
  • the inner side of the membrane is infiltrated with the priming liquid, and the outer side of the hollow fiber membrane cannot be filled with the priming liquid.
  • the total cross-sectional area of the hollow fiber membrane referred to here is the total area of the cross-sectional areas of the lumens of the hollow fiber membranes filled in the hollow fiber membrane module.
  • Total cross-sectional area (cm 2 )) (Number of hollow fibers (number)) ⁇ ⁇ ⁇ (Hollow fiber inner diameter (cm)) ⁇ (Hollow fiber inner diameter (cm)) ⁇ 4 (Formula 2) Can be obtained.
  • the distance between the resin layer portions refers to the distance between the resin layer portions in which the hollow fibers are fixed at the upper and lower portions in the hollow fiber membrane module.
  • volume of the hollow fiber membrane module is preferably 10 cm 3 or more 500 cm 3 or less. If the volume is less than 10 cm 3 , a sufficient distance between the resin layer portions at both ends of the hollow fiber membrane module cannot be ensured. In that case, the inner side of the hollow fiber membrane is immediately after the priming treatment of the present invention. It gets completely wet and the air outside the hollow fiber membrane is not replaced by the priming solution. Further, if the volume exceeds 500 cm 3 , there is a concern that the priming process takes too much time.
  • the lower limit of the volume is more preferably 20 cm 3, more preferably 30 cm 3.
  • the upper limit of the volume is more preferably 400 cm 3, more preferably 300 cm 3.
  • the filling rate of the priming liquid refers to the amount filled in the container after priming.
  • the filling rate (%) of the priming solution can be calculated by displaying the value obtained by dividing the length (cm) of the yarn membrane by the distance (cm) between the resin layer portions at both ends of the hollow fiber membrane module in percent.
  • the filling rate of the priming solution is preferably 40% or more, and more preferably 70% or more, because the cells are less likely to clog the hollow fiber membrane, resulting in a higher cell recovery rate.
  • the pressure difference between the internal pressure and the external pressure of the hollow fiber membrane during priming is 7 mmHg (933 Pa) or more and 29 mmHg (3866 Pa) or less.
  • the internal pressure (mmHg or Pa) of the hollow fiber membrane is an absolute value of the pressure inside the hollow fiber membrane at the time of priming, and is near the outlet (outlet and / or inlet) of the hollow fiber membrane module. Refers to the absolute value of the air pressure measurement. Therefore, when the pump is placed near the inlet of the priming liquid to control the linear velocity and the priming liquid is introduced inside the hollow fiber membrane, the internal pressure measurement value (also referred to as the internal pressure value) becomes a positive pressure. When the pump is disposed near the outlet of the priming liquid to control the linear velocity and the priming liquid is introduced inside the hollow fiber membrane, the internal pressure value becomes a negative pressure.
  • the internal pressure value is preferably a negative pressure.
  • the internal pressure value becomes a negative pressure
  • introduction of the priming solution inside the hollow fiber membrane and replacement of the air outside the hollow fiber membrane with the priming solution can be performed more efficiently.
  • the internal pressure becomes a negative pressure.
  • introduction of the priming solution inside the hollow fiber membrane and replacement of the air outside the hollow fiber membrane with the priming solution can be performed more efficiently.
  • the lower limit of the internal pressure is preferably 8 mmHg (1067 Pa), and the upper limit is preferably 66 mmHg (8799 Pa).
  • the priming introduced into the hollow fiber membrane module B using the pump 11a ′ becomes a positive pressure.
  • the pressure of the liquid introduced inside the hollow fiber membrane 5 filled in the hollow fiber membrane module A may be measured.
  • the internal pressure may be measured by connecting a pressure gauge 14a to an arbitrary position of a tube connecting the outlet port 8b for the priming liquid and the pump 11a, and as shown in FIG. You may connect the pressure gauge 14a 'for measuring an internal pressure to the arbitrary positions of the tube which connected the inlet 8a of priming liquid, and pump 11a'.
  • the external pressure (mmHg or Pa) of the hollow fiber membrane is the absolute value of the pressure outside the hollow fiber membrane during priming, and the absolute value of the measured pressure value of air in the space outside the hollow fiber membrane.
  • the external pressure measurement value also referred to as the external pressure value
  • the external pressure value becomes positive
  • the external pressure value becomes a negative pressure.
  • the lower limit of the external pressure is 0 mmHg (0 Pa)
  • the upper limit is preferably 46 mmHg (6133 Pa).
  • the external pressure may be measured by measuring the pressure of the liquid in the gap between the hollow fiber membrane 5 filled in the hollow fiber membrane modules A and B shown in FIGS.
  • a pressure gauge connection port 15 is provided on the side surface of the body portion 2, and a pressure gauge 14 b is connected to the pressure gauge connection port 15 to perform measurement.
  • the pressure difference refers to the absolute value of the difference obtained by subtracting the external pressure measurement value from the internal pressure measurement value.
  • the pressure difference is less than 7 mmHg (933 Pa)
  • the linear velocity is too small and the priming process takes too much time.
  • the pressure difference exceeds 29 mmHg (3866 Pa)
  • the linear velocity is too high, and the inside of the hollow fiber membrane is completely wetted with the priming solution, and the air outside the hollow fiber membrane is not replaced with the priming solution.
  • the lower limit of the pressure difference is preferably 7 mmHg (933 Pa)
  • the upper limit of the pressure difference is preferably 29 mmHg (3866 Pa), more preferably 22 mmHg (2933 Pa), and even more preferably 17 mmHg (2266 Pa).
  • the linear velocity is controlled using a pump provided near the inlet of the priming liquid, and the priming liquid is introduced into the hollow fiber membrane from the inlet, the difference obtained by subtracting the external pressure value from the internal pressure value is positive.
  • the linear velocity is controlled using a pump provided near the outlet of the priming liquid and the priming liquid is introduced into the hollow fiber membrane from the inlet, the external pressure value is subtracted from the internal pressure value. The difference is negative.
  • the present invention relates to a method for producing a cell concentrate, comprising a step of concentrating a cell suspension while discharging from an outlet.
  • cells used here include artificial pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), mesenchymal stem cells, adipose-derived mesenchymal cells, adipose-derived stromal stem cells, pluripotent adult stem cells, bone marrow Pluripotent biological stem cells such as stromal cells, hematopoietic stem cells, T cells, B cells, killer T cells (cytotoxic T cells), NK cells, NKT cells, lymphocyte cells such as regulatory T cells, Macrophages, monocytes, dendritic cells, granulocytes, erythrocytes, platelets, nerve cells, muscle cells, fibroblasts, somatic cells such as hepatocytes, cardiomyocytes, cells that have been treated for gene transfer or differentiation, tumors Examples are rare cells such as cells, endothelial cells and fetal cells.
  • the cell suspension is not particularly limited as long as it is a suspension containing the cells.
  • a cell suspension after culturing the cells exemplified above in vitro can be used.
  • Examples of the culture solution for culturing cells in vitro include DMEM, ⁇ -MEM, MEM, IMEM, RPMI-1640, and the like.
  • a culture solution to which a stimulating factor such as cytokine, antibody or peptide is added can also be used.
  • the step of concentrating the cell suspension includes a cell-free protein or inorganic salt from the cell suspension that has flowed into the hollow fiber membrane from the inlet or outlet of the hollow fiber membrane module.
  • the inlet and outlet of the hollow fiber membrane module are connected by a circuit, and the concentrated cell concentrate is again flowed into the hollow fiber membrane to further concentrate cell components.
  • the concentration of the cell suspension proceeds to produce a cell concentrate that has been concentrated to a desired cell concentration.
  • the said cell concentrate represents the cell suspension concentrated by passing through a hollow fiber membrane module.
  • the cell suspension may be introduced into the hollow fiber membrane module from the introduction port in the same manner as the priming solution, or conversely, may be introduced into the hollow fiber membrane module from the outlet port of the priming solution.
  • the linear velocity of the cell suspension when introduced into the hollow fiber membrane module is preferably greater than 500 cm / min and not greater than 2000 cm / min.
  • the linear velocity is 500 cm / min or less, the concentration process takes time and is not efficient. If it exceeds 2000 cm / min, there is a concern that damage to the cells due to shearing or pressure increases.
  • the lower limit of the linear velocity is preferably greater than 500 cm / min, more preferably greater than 800 cm / min, and even more preferably greater than 1200 cm / min.
  • the upper limit of the linear velocity is preferably 2000 cm / min, more preferably 1800 cm / min, and further preferably 1500 cm / min.
  • the filtration rate of the cell suspension (mL / m 2 / min) is preferably 1000 mL / m 2 / min or more 4250mL / m 2 / min or less.
  • the filtration rate is a value obtained by dividing the flow rate (mL / min) of the filtrate per 1 m 2 of the hollow fiber membrane area discharged from the filtrate outlet by the time (minutes).
  • the concentration process takes time and is not efficient. If it exceeds 4250 mL / m 2 / min, the cells are likely to be clogged in the hollow fiber membrane, and there is a concern that the cell recovery rate is lowered.
  • the lower limit of the filtration rate is preferably 1000 mL / m 2 / min, more preferably 1250 mL / m 2 / min, and further preferably 1500 mL / m 2 / min.
  • the upper limit of the filtration rate is preferably 4250mL / m 2 / min, more preferably from 4000 mL / m 2 / min, more preferably 3750 mL / m 2 / min.
  • the filtration rate of the cell suspension is preferably 1500 mL / m 2 / min or more and 3750 mL / m 2 / min or less because a concentration treatment with high recovery efficiency can be performed in a short time.
  • the hollow fiber membrane area when determining the filtration rate is the membrane area of the entire hollow fiber membrane filled in the hollow fiber membrane module regardless of whether the outside of the hollow fiber membrane is infiltrated with liquid or not.
  • (Membrane area (m 2 )) (Inner diameter of hollow fiber (m)) ⁇ ⁇ ⁇ (Distance between resin layers (m)) ⁇ (Number of hollow fibers (number)) Is calculated by
  • the membrane area 0.05 m 2 or more 0.20 m 2 or less.
  • the lower limit is preferably 0.05 m 2 of the membrane area, more preferably 0.07 m 2, more preferably 0.09 m 2.
  • the upper limit is preferably 0.20 m 2 of the membrane area, more preferably 0,18M 2, more preferably 0.16 m 2.
  • FIG. 1 the priming method and the cell concentrate production method of the present invention will be illustrated using FIG. 1, but the present invention is not limited to this, and various modifications are made without departing from the gist of the present invention. be able to.
  • a tube or the like is attached to the inlet 8a and outlet 8b of the hollow fiber membrane module A.
  • the ends of the tubes attached to the inlet 8a and the outlet 8b are connected to a storage container 10 such as a bag containing priming liquid, and a liquid such as a priming liquid circulates between the storage container 10 and the hollow fiber membrane module A.
  • the circuit 16 is formed so that it can.
  • a pump 11a may be interposed in the tube so that a liquid such as a priming liquid can circulate in the attached tube.
  • the filtrate outlet 4 is kept closed by the two-way stopcock 12 until the priming process is completed.
  • the entire attachment of the hollow fiber membrane module A and the tube or the like is preferably performed in an aseptic environment such as a clean bench.
  • the pump 11a is moved counterclockwise as viewed from the circuit 16 shown in FIG. 1, and the priming liquid is filled into the hollow fiber membrane from the inlet 8a below the hollow fiber membrane module A.
  • the driving speed of the pump 11a is adjusted so that the linear velocity of the priming liquid is 35 cm / min or more and 450 cm / min or less, and the priming liquid is filled until the volume of the hollow fiber membrane module A is 15% or more. After confirming that this is done, the pump 11a is stopped to finish the priming.
  • the priming solution in the storage container 10 is replaced with a cell suspension, and the two-way stopcock 12 in the tube connecting the filtrate outlet 4 and the waste liquid container 13 is opened,
  • the pump 11a is moved clockwise as viewed from the circuit 16 shown in FIG. 1 to start the cell suspension concentration process.
  • it is possible to perform filtration while applying pressure to the hollow fiber membrane by narrowing the flow path on the filtrate discharge port 4 side, or while installing a machine 11b such as a pump on the tube on the filtration side while applying pressure. Filtration may be performed, and various filtration methods used in general hollow fiber membrane modules can be used in combination.
  • a three-way stopcock 17 is provided as a branching portion at an appropriate location of the circuit 16 connecting the inlet 8a and the storage container 10, and this branching portion is provided.
  • the three-way stopcock 17 is connected to the recovery container 18 and the pump 11a is driven to introduce the cell concentrate in the hollow fiber membrane module A, the storage container 10 and the circuit 16 into the recovery container 18.
  • the present invention relates to a method for treating various diseases in which a cell concentrate obtained by the above production method is administered to humans or non-human animals.
  • immune cell therapy for cancer using immune cells such as cytotoxic T cells, NK cells, NKT cells, dendritic cells, and pluripotent biological stem cells such as mesenchymal stem cells are used.
  • Cells used for these treatments can be cells derived from iPS cells, ES cells, and cells into which various genes have been introduced.
  • the cell concentrate obtained by the above production method can also be suitably used as a medium exchange application in which a fresh medium is added to the cell concentrate and the culture is performed again.
  • the cell recovery rate (%) is the value obtained by dividing the number of cells in the cell suspension at the time of concentration to a certain amount by the number of cells in the cell suspension before treatment. It shows that the recovery efficiency is excellent.
  • the number of cells (cells) was determined by measuring the cell suspension with a blood cell counter (trade name “K-4500”, manufactured by Sysmex), calculating the cell concentration of the leukocyte fraction as the cell concentration in this example, It can be calculated by the product of the turbidity (mL) and the cell concentration (cells / mL).
  • the cell recovery rate (%) is preferably 70% or more, and more preferably 85% or more.
  • the cell viability ratio is a percentage obtained by dividing the cell viability in the cell suspension collected in the collection container 18 by the cell viability in the cell suspension before processing. The higher the value, the less damage to the cells.
  • the dead cell rate (%) was determined by adding 10 ⁇ L of via-probe (manufactured by BD) to 100 ⁇ L of each cell suspension prepared so that the cell concentration was 10 6 cells per mL, and let stand for 10 minutes at room temperature in a dark place. Then, it can be taken into a flow cytometer (trade name “FACSCanto” manufactured by BD) and measured as a via-probe positive rate (%).
  • the cell viability ratio is preferably 95% or more, and more preferably 96% or more. If it is less than 95%, the cells are greatly damaged in the cell concentration step. For example, when administered to a patient for cell therapy, the cells may not function normally and may not exhibit therapeutic effects.
  • the cell suspension used in the examples was 1500 mL of a cell suspension (RPMI 1640 medium containing 10% FBS) containing cultured Jurkat cells.
  • the priming method and the cell concentrate production method in each experimental example were performed using an apparatus in which the hollow fiber membrane module A, the storage container 10 and the waste liquid container 13 were connected by a tube.
  • an introduction port 8a is provided on the bottom surface of the head portion 9 below, and a filtrate discharge port 4 is provided on the side surface of the body 2 in the vicinity thereof, and is above the hollow fiber membrane module A.
  • a head provided with a lead-out port 8b on the top surface of the head 3 and a pressure gauge connection port 15 on the side surface of the body 2 in the vicinity thereof was used.
  • a vinyl chloride tube was connected to each of the inlet 8a and outlet 8b of the hollow fiber membrane module A described in each example.
  • the other ends of the vinyl chloride tubes connected to the inlet port 8a and the outlet port 8b are connected to a plastic storage container 10 in which a physiological saline solution is stored, and the physiological saline solution in the storage container 10 is transferred to the hollow fiber membrane module A.
  • a circuit 16 was formed so as to be able to circulate between the storage container 10 and the storage container 10 via a tube.
  • a pump 11a and an internal pressure gauge 14a were installed in the vinyl chloride tube on the outlet 8b side, and physiological saline was set to flow at a flow rate described in the examples described later.
  • a tube and a two-way stopcock 12 are attached to the filtrate outlet 4 of the hollow fiber membrane module A, the end of the tube is connected to a waste container 13, and a pump 11b is installed in the tube.
  • the two-way stopcock 12 was closed so as to discharge at a flow rate described in 1.
  • An external pressure gauge 14b was attached to the pressure gauge connection port 15.
  • a three-way cock 17 was attached to a tube connecting the storage container 10 and the introduction port 8a of the hollow fiber membrane module A, and a plastic collection container 18 was connected to the three-way cock 17 via the tube.
  • the pump 11a is driven to fill the hollow fiber membrane module A with physiological saline from the introduction port 8a.
  • the values (mmHg) of the external pressure gauge 14b and the internal pressure gauge 14a, The length (cm) of the hollow fiber membrane in the portion where the outer side was immersed in the priming solution was recorded.
  • the value of the external pressure pressure gauge 14b was set as the “external pressure” of the hollow fiber membrane
  • the value of the internal pressure pressure gauge 14a was set as the “internal pressure” of the hollow fiber membrane.
  • the value obtained by dividing the length (cm) of the hollow fiber membrane where the outside of the hollow fiber membrane is immersed in the priming solution by the distance (cm) between the resin layer portions at both ends of the hollow fiber membrane module is displayed as a percentage.
  • the filling efficiency (%) of the priming solution was calculated.
  • the two-way stopcock 12 is opened, the storage container 10 storing the physiological saline is aseptically replaced with another storage container 10 storing the cell suspension, and the flow rate of the pump 11a will be described later.
  • the flow rate was set to be the flow rate described in 1., and the flow direction was opposite to the flow direction of the priming solution. That is, the cell suspension was introduced into the hollow fiber membrane module A from the outlet 8b, and the filtrate was discharged from the filtrate outlet 4 while circulating the cell suspension between the storage container 10.
  • the two-way stopcock 12 is closed, and the cell concentrate in the tube and hollow fiber separation membrane 5 is introduced into the inlet 8a at a flow rate of 75 mL / min by the pump 11a. From the circuit 16 between the inlet 8a and the storage container 10 and recovered in a recovery container 18 that was branched from the circuit.
  • the time required from the start of passing the cell suspension to the end of collection was measured with a stopwatch, and the treatment time was measured. Finally, the number of cells in the cell concentrate in the collection container 18 was measured, and the cell recovery rate and the survival rate ratio were calculated. Examples are shown below.
  • Example 1 A hollow fiber membrane made of polyethersulfone (PES) [trade name: MFC-K1] is placed in a cylindrical container 1 having a diameter of 4.5 cm and a height of 24 cm, which is provided with a filtrate discharge port 4 and a pressure gauge connection port 15 at the side end.
  • PES polyethersulfone
  • heads (3, 9) provided with inlets 8a and outlets 8b were attached to both end faces of the cylindrical container 1, and a hollow fiber membrane module A was obtained.
  • the produced hollow fiber membrane module A was calculated to have a filtration area of 0.18 m 2 and a total cross-sectional area of 0.77 cm 2 using Equation 2.
  • the priming conditions were such that the outlet flow rate was 27 mL / min (linear velocity: 35 cm / min).
  • the internal pressure value was -8 mmHg
  • the external pressure value was -1 mmHg
  • the absolute value of the pressure difference was 7 mmHg.
  • the distance between the resin layer portions 7 at both ends of the hollow fiber membrane module A is 23 cm, and the length of the hollow fiber membrane in which the outside of the hollow fiber membrane is immersed in the priming liquid at the end of priming is 21 cm. there were. Therefore, the filling efficiency of the priming liquid (ratio of the length of the hollow fiber membrane in which the outside of the hollow fiber membrane is immersed in the priming liquid with respect to the distance between the resin layer portions 7 at both ends of the module) was calculated to be 91%.
  • the concentration conditions were such that the flow rate in the vicinity of the priming liquid outlet 8b was 450 mL / min (linear speed: 588 cm / min), and the filtration speed discharged from the filtrate outlet 4 was 1823 mL / m 2 / min.
  • the treatment time was 362 seconds
  • the cell recovery rate was 86%
  • the survival rate ratio was 97%.
  • Example 2 The same hollow fiber membrane module A as in Example 1 was used.
  • the priming conditions were such that the flow rate in the vicinity of the outlet 8b was 230 mL / min (linear velocity: 300 cm / min).
  • the internal pressure value was ⁇ 32 mmHg
  • the external pressure value was ⁇ 15 mmHg
  • the pressure difference was 17 mmHg.
  • the distance between the resin layer portions 7 at both ends of the hollow fiber membrane module A was 23 cm, and the length of the hollow fiber membrane in which the outside of the hollow fiber membrane was immersed in the priming liquid was 17 cm. Therefore, the filling efficiency of the priming solution was calculated to be 74%.
  • the concentration conditions were such that the flow rate in the vicinity of the priming liquid outlet 8b was 450 mL / min (linear speed: 588 cm / min), and the filtration speed discharged from the filtrate outlet 4 was 1823 mL / m 2 / min.
  • the treatment time was 364 seconds
  • the cell recovery rate was 85%
  • the survival rate ratio was 96%.
  • Example 3 The same hollow fiber membrane module A as in Example 1 was used.
  • the priming condition was such that the flow rate near the outlet 8b was 322 mL / min (linear velocity: 420 cm / min).
  • the internal pressure value was ⁇ 34 mmHg
  • the external pressure value was ⁇ 12 mmHg
  • the pressure difference was 22 mmHg.
  • the distance between the resin layer portions 7 at both ends of the hollow fiber membrane module A was 23 cm, and the length of the hollow fiber membrane in which the outside of the hollow fiber membrane was immersed in the priming liquid was 10 cm. Therefore, the filling efficiency of the priming solution was calculated to be 44%.
  • the concentration conditions were such that the flow rate in the vicinity of the priming liquid outlet 8b was 450 mL / min (linear speed: 588 cm / min), and the filtration speed discharged from the filtrate outlet 4 was 1823 mL / m 2 / min.
  • the treatment time was 365 seconds
  • the cell recovery rate was 73%
  • the survival rate ratio was 97%.
  • Example 4 The same hollow fiber membrane module A as in Example 1 was used.
  • the priming conditions were such that the flow rate near the outlet 8b was 344 mL / min (linear velocity: 450 cm / min).
  • the internal pressure value was ⁇ 36 mmHg
  • the external pressure value was ⁇ 7 mmHg
  • the pressure difference was 29 mmHg.
  • the distance between the resin layer portions 7 at both ends of the hollow fiber membrane module A was 23 cm
  • the length of the hollow fiber membrane in which the outside of the hollow fiber membrane was immersed in the priming liquid was 4 cm. Therefore, the filling efficiency of the priming solution was calculated to be 17%.
  • the concentration conditions were such that the flow rate in the vicinity of the priming liquid outlet 8b was 450 mL / min (linear speed: 588 cm / min), and the filtration speed discharged from the filtrate outlet 4 was 1823 mL / m 2 / min.
  • the treatment time was 363 seconds
  • the cell recovery rate was 70%
  • the survival rate ratio was 95%.
  • Example 5 Using the same hollow fiber membrane module A as in Example 1, priming was performed under the same conditions as in Example 1. The concentration conditions were such that the flow rate near the priming solution outlet 8b was 600 mL / min (linear velocity: 784 cm / min), and the filtration rate discharged from the filtrate outlet 4 was 2422 mL / m 2 / min. As a result, the treatment time was 297 seconds, the cell recovery rate was 76%, and the survival rate ratio was 98%.
  • a hollow fiber membrane (trade name: D06-M20U-06-N, hollow fiber inner diameter 600 ⁇ m, pore diameter 0.2 ⁇ m, manufactured by Spectrum) made of mixed cellulose ester (ME) has a filtrate outlet 4 and a pressure gauge at the side end.
  • a hollow fiber membrane module A in which a cylindrical container 1 having a diameter of 6.98 mm and a height of 68 cm provided with a connection port 15 is filled so as to have a filtration area of 335 cm 2 , and both ends of the hollow fiber membrane are fixed by resin layer portions 7. It was used. The distance between the resin layer portions 7 at both ends at this time was 65 cm.
  • the total cross-sectional area of the hollow fiber membrane was calculated to be 0.077 cm 2 .
  • the priming conditions were such that the flow rate near the outlet 8b was 2.7 mL / min (linear velocity: 35 cm / min).
  • the internal pressure value was -55 mmHg
  • the external pressure value was -46 mmHg
  • the pressure difference was 9 mmHg.
  • the distance between the resin layer portions 7 at both ends of the hollow fiber membrane module A was 65 cm
  • the vertical length of the hollow fiber membrane in which the outside of the hollow fiber membrane was immersed in the priming liquid was 62 cm. Therefore, the filling efficiency of the priming solution was calculated as 95%.
  • Example 7 A hollow fiber membrane (trade name: D06-M10U-06-N, hollow fiber inner diameter 600 ⁇ m, hole diameter 0.1 ⁇ m, manufactured by Spectrum) made of mixed cellulose ester (ME) has a filtrate outlet 4 and a pressure gauge at the side end.
  • a cylindrical container 1 having a diameter of 6.98 mm and a height of 68 cm provided with a connection port 15 is filled so as to have a filtration area of 335 cm 2 , and both ends of the bundle 5 of hollow fiber membranes are fixed inside the container 1 with a resin layer portion 7.
  • the hollow fiber membrane module A was used. The distance between the resin layer portions 7 at both ends at this time was 65 cm.
  • the total cross-sectional area of the hollow fiber membrane was calculated to be 0.077 cm 2 .
  • the priming conditions were such that the flow rate near the outlet 8b was 2.7 mL / min (linear velocity: 35 cm / min).
  • the internal pressure value was -66 mmHg
  • the external pressure value was -46 mmHg
  • the pressure difference was 20 mmHg.
  • the distance between the resin layer portions 7 at both ends of the hollow fiber membrane module was 65 cm, and the length of the hollow fiber membrane in which the outside of the hollow fiber membrane was immersed in the priming liquid was 46 cm. Therefore, the filling efficiency of the priming liquid was calculated to be 71%.
  • Example 1 The same hollow fiber membrane module A as in Example 1 was used.
  • the priming conditions were such that the flow rate near the outlet 8b was 459 mL / min (linear velocity: 600 cm / min).
  • the internal pressure value was -58 mmHg
  • the external pressure value was -28 mmHg
  • the pressure difference was 30 mmHg.
  • the distance between the resin layer portions 7 at both ends of the hollow fiber membrane module A was 23 cm, and the length of the hollow fiber membrane in which the outside of the hollow fiber membrane was immersed in the priming liquid was 1 cm. Therefore, the filling efficiency of the priming solution was calculated to be 4%.
  • the concentration conditions were such that the flow rate in the vicinity of the priming liquid outlet 8b was 450 mL / min (linear speed: 588 cm / min), and the filtration speed discharged from the filtrate outlet 4 was 1823 mL / m 2 / min.
  • the treatment time was 364 seconds
  • the cell recovery rate was 65%
  • the survival rate ratio was 95%.
  • Polyethersulfone (PES) hollow fiber membrane (trade name: D06-E500-05-N, hollow fiber inner diameter 500 ⁇ m, fraction 500 kD, manufactured by Spectrum) is connected to the filtrate outlet 4 and pressure gauge at the end of the side.
  • a cylindrical container 1 with a diameter of 6.98 mm and a height of 68 cm is filled with a mouth 15 so as to have a filtration area of 370 cm 2 , and both ends of the bundle 5 of hollow fiber membranes are fixed in the container 1 with a resin layer portion 7.
  • the hollow fiber membrane module A was used. The distance between the resin layer portions 7 at both ends at this time was 65 cm.
  • the total cross-sectional area of the hollow fiber membrane was calculated to be 0.071 cm 2 .
  • the priming condition was that the flow rate near the outlet 8b was 2.1 mL / min (linear velocity: 35 cm / min).
  • the internal pressure value was -55 mmHg
  • the external pressure value was 89 mmHg
  • the pressure difference was 144 mmHg.
  • the distance between the resin layer portions 7 at both ends of the hollow fiber membrane module A was 65 cm, and the length of the hollow fiber membrane in which the outside of the hollow fiber membrane was immersed in the priming liquid was 0 cm. Therefore, the filling efficiency of the priming solution was calculated as 0%.
  • Table 1 shows the conditions, priming conditions, concentration conditions and performance of the hollow fiber membrane modules of Examples 1 to 5 and Comparative Examples 1 and 2. In Examples 6 and 7 and Comparative Example 2, only priming was performed, and cell concentration was not performed.
  • the priming method is a method of filling the hollow fiber membrane module with 15% or more of the volume of the hollow fiber membrane module at a linear velocity of 35 cm / min to 450 cm / min.
  • the cell concentrate can be produced with a significantly higher cell recovery rate and viability ratio than those of Comparative Example 1.
  • the priming solution can be easily filled both inside and outside the hollow fiber membrane, and the subsequent cells In the suspension treatment step, the effective filtration area is increased, and the cell recovery rate and filtration rate can be improved.
  • the obtained cells can be provided for therapeutic use.
  • Example 3 and Example 5 shown in Table 1 the filtration rate is reduced without causing a decrease in cell recovery rate by lowering the linear velocity during priming and increasing the effective filtration area during cell treatment. This is expected to shorten the processing time of the cell suspension.
  • Example 1 and Example 6 shown in Table 1 show that polysulfone-based and cellulose-based polymer materials are more preferably used as the material for the hollow fiber membrane. Further, the results of Example 1, Example 7 and Comparative Example 2 indicate that when priming is performed, the hole diameter provided in the wall of the hollow fiber membrane is preferably 0.1 ⁇ m or more.
  • A, B Hollow fiber membrane module Container 2. Torso part 3. Head 4, 4 '. 4. Filtrate outlet 5. bundle of hollow fiber membranes Open end 7. Resin layer 8a. Inlet 8b. Outlet 9. Head 10. Storage containers 11a, 11a ′. Pump 11b. Pump 12. 12. Two-way stopcock Waste liquid containers 14a, 14a ′. Internal pressure gauge 14b. External pressure gauge 15. Pressure gauge connection port 16. Circuit 17. Three-way stopcock 18. Collection container

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Abstract

導入口、導出口及び濾液排出口を有する容器に中空糸膜が充填された中空糸膜モジュールの導入口または導出口よりプライミング液を線速度３５ｃｍ／分以上４５０ｃｍ／分以下で、前記中空糸膜モジュールの容積に対して１５％以上充填する工程を含むプライミング方法。本発明によれば、細胞懸濁液処理時の有効濾過面積が大きくなり、細胞の回収率や濾過速度を向上させることができ、さらに、閉鎖環境を維持したまま細胞処理を完遂できるため、得られた細胞は治療用途として提供することができる。

Description

中空糸膜モジュールのプライミング方法
　本発明は、中空糸膜を充填した中空糸膜モジュールをプライミングする技術に関する。
　体外循環の分野における血液浄化や血漿分離、あるいは細胞医療の分野において細胞懸濁液中のタンパクやウイルス、夾雑物を分離、濾過する目的で、中空糸膜を充填した中空糸膜モジュールが幅広く用いられている。体外循環の分野で中空糸膜モジュールを使用する場合、中空糸膜モジュールを通過した血液が直接体内に戻ることから、中空糸膜モジュール内に充填されている空気や気泡を予め完全に除去する必要があり、体外循環を開始する前に生理食塩液などのプライミング液を中空糸膜モジュール内に導入する「プライミング」を行っている（特許文献１）。しかし、中空糸膜モジュール全体にプライミング液を充填するため、プライミング液を中空糸膜の内側と外側、すなわち血液流路側と透析液側の両方から異なる流路で導入しており、流路の切り替えが煩雑で時間のかかる工程になっている。
　一方、細胞医療の分野で中空糸膜モジュールを使用する場合のプライミング方法については全く考慮されていない（特許文献２）。これは、細胞医療の分野では、体外循環と異なり、中空糸膜モジュールを通過した細胞懸濁液を直接体内に戻さないので、中空糸膜モジュール内の空気や気泡を予め完全に除去する必要がなく、プライミングを行うことについて配慮する必要性が低かったことが考えられる。しかしながら、細胞懸濁液中のタンパクやウイルス、夾雑物を効率的に分離、濾過するためには、中空糸膜の内側と外側がともに濡れている状態で細胞の処理を行う必要があることから、細胞の処理を開始する前に中空糸膜の内側と外側に生理食塩液などのプライミング液を充填し、中空糸膜の有効濾過面積を大きくする「プライミング」のプロセスは、濾過速度の向上や、細胞回収率の向上に寄与することから非常に重要である。さらに、細胞医療用途で中空糸膜モジュールを使用する場合は、血液浄化とは異なり、中空糸膜の外側からプライミング液を導入することは想定しにくいが、中空糸膜にプライミング液を速やかに接触させる観点から、径の大きな口を通じて中空糸膜の外側からプライミング液を導入する場合があった。従って、細胞医療用途においても、中空糸膜の内側から導入したプライミング液を中空糸膜の内側と外側の両方に充填できるプライミング方法が求められているものの、前記のように、従来では全く考慮されておらず、またこれを実現するためには、中空糸膜の外側に大気開放弁を設け、中空糸膜の外側に存在する空気を開放するなど、中空糸膜モジュールの構造を工夫するほかなかった。
特開２００９－２６８７６２号公報 国際公開第２０１３／０６１８５９号
　本発明の目的は、上記中空糸膜モジュールのプライミング方法における問題点を解決することを課題とする。具体的には、任意の形状の中空糸膜モジュールをプライミングするにあたり、中空糸膜の内側からのみ導入したプライミング液を、中空糸膜の内側と外側の両方に簡便に充填することのできるプライミング方法を提供することにある。
　また、本発明の他の目的は、前記プライミング方法を施した中空糸膜モジュールを用いて、細胞懸濁液から細胞濃縮液を短時間で効率よく製造する方法を提供することにある。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、中空糸膜モジュールに導入するプライミング液の線速度を特定範囲に設計することで、任意の形状の中空糸膜モジュールをプライミングするにあたり、中空糸膜の内側から導入したプライミング液を、中空糸膜の内側と外側の両方に簡便に充填することのできるプライミング方法を見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）導入口、導出口及び濾液排出口を有する容器に中空糸膜が充填された中空糸膜モジュールをプライミングする方法であって、
　前記中空糸膜モジュールの導入口または導出口よりプライミング液を線速度３５ｃｍ／分以上４５０ｃｍ／分以下で、前記中空糸膜モジュールの容積に対して１５％以上充填する工程
を含むプライミング方法。
（２）プライミング時の中空糸膜の内圧と外圧の圧力差が７ｍｍＨｇ以上２９ｍｍＨｇ以下である前記（１）に記載のプライミング方法。
（３）前記内圧が陰圧である前記（２）に記載のプライミング方法。
（４）前記線速度が３５ｃｍ／分以上３００ｃｍ／分以下である前記（１）～（３）のいずれかに記載のプライミング方法。
（５）プライミング液を前記中空糸膜モジュールの容積に対して７０％以上充填する前記（１）～（４）のいずれかに記載のプライミング方法。
（６）前記中空糸膜の内側にプライミング液を導入する前記（１）～（５）のいずれかに記載のプライミング方法。
（７）前記導入口および前記導出口が前記中空糸膜の内側を通じて連通している前記（１）～（６）のいずれかに記載のプライミング方法。
（８）中空糸膜の孔径が０．１μｍ以上１．０μｍ以下である前記（１）～（７）のいずれかに記載のプライミング方法。
（９）前記プライミング液が、生理食塩液、輸液、血清または培地からなる群より選ばれる１種以上である前記（１）～（８）のいずれかに記載のプライミング方法。
（１０）前記（１）～（９）のいずれかに記載のプライミング方法を中空糸膜モジュールに施した後に、細胞懸濁液を中空糸膜モジュールの導出入口より導入し、細胞を含まない濾液を濾液排出口より排出しながら、細胞懸濁液を濃縮する工程、を含む細胞濃縮液の製造方法。
（１１）前記濾液排出口を少なくとも１つ以上備えた中空糸膜モジュールを用いる前記（１０）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
（１２）細胞懸濁液を線速度５００ｃｍ／分以上２０００ｃｍ／分以下で中空糸膜モジュールの導出入口より導入する前記（１０）または（１１）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
（１３）細胞懸濁液を濾過速度１５００ｍＬ／ｍ２／分以上３７５０ｍＬ／ｍ２／分以下で濾液出口より導出する前記（１２）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
　本発明のプライミング方法によれば、細胞処理時の中空糸膜モジュールの有効濾過面積が大きくなり、プライミングが不十分であった場合に生じる細胞回収率の低下を引き起こすことなく、濾過速度を向上させたり、また、濾過速度を下げることなく細胞回収率を向上させることができる。さらに、本発明のプライミング方法では、中空糸膜モジュールの構造を工夫する必要がないので、例えば、中空糸膜の外側に大気開放弁を設けていない中空糸膜モジュールでも好適なプライミングを行うことができる。そして、本発明のプライミング方法で処理した大気開放弁を有さない中空糸膜モジュールでは、閉鎖環境を維持したまま細胞処理を完遂できるため、得られた細胞は治療用途として提供することができる。
本発明のプライミング方法および細胞濃縮液の製造方法の実施形態の一例を示す概略図である。 本発明のプライミング方法および細胞濃縮液の製造方法の実施形態の別の一例を示す概略図である。
　以下に、本発明について説明する。
　本発明のプライミング方法とは、導入口、導出口及び濾液排出口を有する容器に中空糸膜が充填された中空糸膜モジュールをプライミングする方法である。
　本発明で用いる中空糸膜モジュールは、導入口、導出口及び濾液排出口を有する容器に中空糸膜が充填されたタイプのものである。前記中空糸膜モジュールでは、前記導入口（または導出口）から中空糸膜の内側にプライミング液が導入される。プライミング液は、中空糸膜の内側の空間を満たしながら、一部は中空糸膜壁に設けられた微細孔を通過して中空糸膜の外側に排出され、前記容器と前記中空糸膜との間の空間に満たされる。そして、中空糸膜の内側のプライミング液は前記導出口（または導入口）を介して、中空糸膜の外側に排出されたプライミング液は濾液排出口を介して、細胞懸濁液に置き換わるかたちでそれぞれ中空糸膜モジュールから排出される。
　また、前記導入口および導出口は前記中空糸膜の内側を通じで連通している。このような構成とすることで、細胞懸濁液などの液体は前記導入口から前記中空糸膜の内側の中空部分を通り、導出口から中空糸膜モジュールの外に導出され、例えば、中空糸膜の内側を細胞懸濁液が通過した際に、液体成分が中空糸膜壁を通じて外側に移行することで、細胞濃縮が実施できる。
　なお、プライミング工程において中空糸膜モジュールに導入されるプライミング液の導入口は、次いで行う細胞濃縮工程で導入される細胞懸濁液の導出口になることがあることから、本発明では、濾過するための液体用の出入口の一方の口を「導入口」と示し、他方の口を「導出口」と示す。
　ただし、以降の説明では、プライミング液を中空糸膜モジュールに導入するための口を「導入口」、プライミング液を中空糸膜モジュールから導出するための口を「導出口」として説明する。
　前記中空糸膜モジュールとしては、前記構成を有するものであればよく特に限定はないが、例えば、図１に示す中空糸膜モジュールＡが挙げられる。中空糸膜モジュールＡを構成する容器１は、胴部２とその両側の頭部３、頭部９からなり、頭部９付近には濾液排出口４が備えられている。この濾液排出口４の位置は頭部９や胴部２の端部に備えられていてもよいし、胴部２の中央部に備えられていてもよい。濾液排出口４の数も特に限定はなく、プライミング後に分離や濾過の用途で中空糸膜モジュールが使用されることを鑑みると、濾液排出口４は１つ以上備えていることが好ましく、濾過速度を高め短時間で分離や濾過を完遂するために、図２に示す中空糸膜モジュールＢのように２つの濾液排出口４、４’またはそれ以上備えていることがより好ましい。また、中空糸膜モジュールに大気開放弁を設ける必要はなく、閉鎖系を維持したままプライミングすることができる。前記中空糸膜モジュールＢでは、濾液排出口４と濾液排出口４’の位置は、中空糸膜モジュールＢの導入口８ａから略同じ距離に設けられているが、別の位置に設けられていてもよい。また、中空糸膜モジュールＢで生じた濾液は、前記濾液排出口４、４’からポンプ１１ｂを駆動させることで廃液容器１３に導入される。
　なお、前記中空糸膜モジュールＢは、濾液排出口４’を設け、かつ導出口８ｂ側にポンプ１１ａおよび圧力計１４ａを設けるかわりに、導入口８ａ側の回路１６にポンプ１１ａ’および圧力計１４ａ’を設けた以外は、前記中空糸膜モジュールＡと同じ構成を有する。したがって、中空糸膜モジュールＢの構成について、中空糸膜モジュールＡと共通の構成については、特に必要がない限り説明を省略する。
　また、図１では、下側の頭部９に導入口８ａ、上側の頭部３に導出口８ｂが設けられている。導入口８ａとは、中空糸膜の内側にプライミング液を導入する入口のことであり、導出口８ｂとは、プライミング液を中空糸膜の内側より導出する出口のことである。胴部２内部には、装填された中空糸膜の束５と、頭部３の内部に設けられた中空糸膜の束５を胴部２内部に固定するとともに中空糸膜の開口端６を形成している樹脂層部７と、更に頭部９の内部に設けられたこれと同等の構造とを有している。この樹脂層部７および開口端６は、頭部３（或いは頭部９）に被冠された構造となっており、導入口８ａ、導出口８ｂと濾液排出口４とが中空糸膜を構成する壁材により隔てられ、連続しない構造となっている。
　なお、図１に示す中空糸膜モジュールＡは、各部分を容器１の胴部２、頭部３、頭部９というように区別しているが、これは便宜的なものである。設計上、容器１の胴部２、頭部３および頭部９が別々のパーツから形成されている場合でも、導入口８ａと導出口８ｂが中空糸膜を構成する壁材で隔てられることなく連続しており、更に導入口８ａおよび導出口８ｂと濾液排出口４とが中空糸膜を構成する壁材により隔てられている構造を備えていれば、各種構造をとることが可能である。
　前記中空糸膜モジュールＡは、細胞への細菌の混入を防ぐ観点から、滅菌したものでもよい。滅菌方法は、特に限定されず、γ線滅菌、電子線滅菌、ＥＯＧ滅菌、高圧蒸気滅菌などの医療用具の滅菌に汎用されている滅菌方法を好適に用いることができる。
　中空糸膜モジュールの容器の素材として、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、アクリロニトリル、ブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等を使用できる。特に耐滅菌性を有する素材、具体的にはポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン等が好ましい。
　中空糸膜を固定する樹脂層部の素材としては、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂、およびシリコン樹脂など一般的な接着材料が好ましく用いることができる。
　前記中空糸膜モジュールには、中空糸膜を１０～１０００本程度束ねたものを容器内に充填していることが好ましい。なお、本発明において、中空糸膜の配置は、直線状になっていても、撓んでいても、らせん状になっていてもよく、導入口と導出口の間に中空糸膜の両端が保持されていれば特に形状は限定されない。さらに、プライミングを行う際の中空糸膜は鉛直方向に配置されていても、水平方向に配置されていても、斜め方向に配置されていてもよいが、有効濾過面積を最大化するためには、中空糸膜が鉛直方向に配置している方がより好ましい。なお、有効濾過面積とは、プライミング後に中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている部分の中空糸膜内側の膜面積のことである。
　本発明に用いられる中空糸膜の樹脂材料は、材料の安全性、安定性などの点から合成高分子材料が好ましく用いることができる。この中でも、ポリスルホン系又はセルロース系の親水性の高分子材料がより好ましく用いることができる。さらに、ポリエーテルスルホン、セルロースエステルが材料の安全性、安定性、入手のしやすさから最も好適に用いることができる。
　また、中空糸膜の壁に設けられた孔の孔径は０．１μｍ以上１．５μｍ以下が好ましい。前記孔径が０．１μｍ未満であると、プライミングの際に中空糸膜外側に存在する空気がプライミング液によって置換されない、または細胞懸濁液の濃縮時に不要な蛋白質などの夾雑物を効率的に除去できないため好ましくない。前記孔径が０．１μｍを下回ってくると、孔の大きさは通常分画分子量で表現されるが、例えば５００ｋＤ程度の中空糸膜では、表面張力によりプライミング液が中空糸膜の孔を通過できないため、中空糸膜外側に存在する空気がプライミング液によって置換されない。一方、前記孔径が１．５μｍを超えても、プライミングの工程で特段の問題は生じないが、細胞の大きさに近い孔径が中空糸膜上に存在するため、細胞懸濁液を濃縮する工程において孔への詰まりが生じ、細胞回収率が大きく低下する可能性があるため好ましくない。
　前記孔径の上限は、１．５μｍ以下が好ましく、１．２μｍ以下がより好ましく、１．０μｍ以下がさらに好ましい。
　前記中空糸膜の孔径は、中空糸膜の平均孔径を指し、一般的にパームポロメーターにより測定、算出される。
　なお、前記中空糸膜の内側に形成される内径については、細胞懸濁液を通液できる大きさがあればよく、特に限定はない。
　前記プライミング液としては、生理食塩液、蒸留水、リンゲル液に代表される輸液や、無機塩、糖類、血清、タンパク質を含む液体、緩衝液、血漿、培地等が挙げられる。特に安全性の観点から生理食塩液や輸液を好適に用いることができる。また、血清、血漿、タンパク質を含む液体は、中空糸膜の表面をタンパク質でコーティングすることによって、細胞の中空糸膜への接着が抑制され、細胞回収率の向上が期待できることから、プライミング液として好適に用いることができる。プライミング液は１種類の液体である必要はなく、これらの群から２つ以上の液体を混合して使用することもできる。２つの液体を混合して使用する例としては、アルブミンを添加した生理食塩液や、血清を添加した培地といった組み合わせが挙げられる。
　本発明のプライミング方法は、細胞懸濁液を導入する前に、中空糸膜モジュールの導入口または導出口よりプライミング液を線速度３５ｃｍ／分以上４５０ｃｍ／分以下で、中空糸膜モジュールの容積に対して１５％以上充填するプライミング工程を含むことに特徴があり、これにより細胞処理時の中空糸膜モジュールの有効濾過面積が大きくなり、細胞回収率の低下を引き起こすことなく濾過速度を向上させることが可能となる。
　なお、有効濾過面積とは、中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている部分の中空糸膜内側の膜面積であり、本発明では、以下の式１：
（有効濾過面積（ｃｍ２））＝π×（中空糸内径（ｃｍ））×（中空糸の外側がプライミング液に浸っている部分の中空糸膜の長さ（ｃｍ））×（中空糸本数（本））（式１）
で求めることができる。
　前記線速度（ｃｍ／分）とは、単位時間当たりに中空糸膜内側に流入する液量、すなわち流速（ｃｍ３／分＝ｍＬ／分）を中空糸膜の総断面積（ｃｍ２）で除した値である。
　本発明のプライミング方法において、中空糸膜内側に導入するプライミング液の線速度の下限は、３５ｃｍ／分である。また、中空糸膜内側に導入するプライミング液の線速度の上限は、４５０ｃｍ／分であり、好ましくは４２０ｃｍ／分、より好ましくは３００ｃｍ／分である。前記線速度が３５ｃｍ／分未満であると、プライミング工程に時間がかかりすぎることが懸念され、また、４５０ｃｍ／分を超えると、中空糸膜外側の空気がプライミング液に置換される前に中空糸膜の内側がプライミング液により浸潤し、中空糸膜の外側にプライミング液を充填することができなくなる。
　なお、ここでいう中空糸膜の総断面積とは、中空糸膜モジュールに充填された中空糸膜の内腔の断面積の合計面積であり、以下の式２：
（総断面積（ｃｍ２））＝（中空糸本数（本））×π×（中空糸内径（ｃｍ））×（中空糸内径（ｃｍ））÷４（式２）
で求めることができる。
　若しくは、中空糸内径（ｃｍ）、濾過面積（ｃｍ２）、樹脂層部間の距離（ｃｍ）から、以下の式３：
　（総断面積（ｃｍ２））＝[（中空糸内径（ｃｍ）]×[濾過面積（ｃｍ２）]÷[樹脂層部間の距離（ｃｍ）] ÷４（式３）
で求めることができる。
　また、前記濾過面積とは、以下の式４：
（濾過面積（ｃｍ２））＝π×（中空糸内径（ｃｍ））×（樹脂層部間の距離（ｃｍ））×（中空糸本数（本））（式４）
により求められた値のことである。
　前記樹脂層部間の距離とは、中空糸を中空糸膜モジュール内上下２箇所で固定した樹脂層部の間の距離をさす。
　中空糸膜モジュールの容積（ｃｍ３）は、以下の式５：
（中空糸膜モジュールの容積（ｃｍ３））＝（中空糸膜モジュールの総断面積（ｃｍ２））×（中空糸膜モジュール両端の樹脂層部間の距離（ｃｍ））（式５）
により算出される。
　前記中空糸膜モジュールの容積は１０ｃｍ３以上５００ｃｍ３以下が好ましい。前記容積が１０ｃｍ３未満では、中空糸膜モジュール両端の樹脂層部間の距離を十分に確保することができず、その場合は、本発明のプライミング処理を行ってもすぐに中空糸膜内側が完全に濡れてしまい、中空糸膜外側の空気がプライミング液に置換されない。また、前記容積が５００ｃｍ３を超えると、プライミング工程に時間がかかりすぎることが懸念される。前記容積の下限は、２０ｃｍ３がより好ましく、３０ｃｍ３がさらに好ましい。前記容積の上限は、４００ｃｍ３がより好ましく、３００ｃｍ３がさらに好ましい。
　本発明のプライミング方法においては、中空糸膜モジュールを構成する容器の前記容積に対してプライミング液が１５％以上充填されている。ここで、前記プライミング液の充填率とは、プライミングを実施した後の前記容器内に充填されている量をいい、具体的には、中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている部分の中空糸膜の長さ（ｃｍ）を中空糸膜モジュール両端の樹脂層部間の距離（ｃｍ）で除した値をパーセントで表示することによりプライミング液の充填率（％）を算出することができる。
　前記プライミング液の充填率が１５％未満であると、有効濾過面積が小さいため、細胞を含む液体を処理する際に、細胞が中空糸膜に詰まりやすく、細胞回収率の低下を引き起こすことが懸念される。前記プライミング液の充填率は、４０％以上が好ましく、中でも７０％以上であることで、細胞が中空糸膜に詰まりにくく、その結果細胞回収率がより高くなるためより好ましい。
　また、本発明のプライミング方法では、プライミング時の中空糸膜の内圧と外圧の圧力差が７ｍｍＨｇ（９３３Ｐａ）以上２９ｍｍＨｇ（３８６６Ｐａ）以下となるように調整することが好ましい。
　前記中空糸膜の内圧（ｍｍＨｇまたはＰａ）とは、プライミング時の中空糸膜の内側の圧力の絶対値のことであり、中空糸膜モジュールの導出入口（導出口および／または導入口）付近の空気の圧力測定値の絶対値を参照している。従って、プライミング液の導入口付近にポンプを配置して線速を制御し、プライミング液を中空糸膜の内側に導入する場合は、内圧測定値（内圧値ともいう）が陽圧になり、反対にプライミング液の導出口付近にポンプを配置して線速を制御し、プライミング液を中空糸膜の内側に導入する場合は、内圧値が陰圧になる。内圧値は陰圧であることが好ましい。内圧値が陰圧になることで、プライミング液の中空糸膜の内側の導入と、中空糸膜外側の空気のプライミング液への置換とをより効率よく行うことができる。
　例えば、図１に示す中空糸膜モジュールＡでは、プライミング液の導出口８ｂ付近に備えられたポンプ１１ａを用いて線速を制御するために、内圧は陰圧になる。このように、内圧が陰圧になることで、プライミング液の中空糸膜の内側の導入と、中空糸膜外側の空気のプライミング液への置換とをより効率よく行うことができる。内圧の下限は８ｍｍＨｇ（１０６７Ｐａ）であることが好ましく、上限は６６ｍｍＨｇ（８７９９Ｐａ）であることが好ましい。
　また、図２に示す中空糸膜モジュールＢのようにプライミング液の導入口８ａ付近にポンプ１１ａ’を備えている場合には、前記ポンプ１１ａ’を用いて中空糸膜モジュールＢ内に導入するプライミング液の線速を制御するために、内圧は陽圧になる。
　なお、前記内圧の測定方法としては、前記中空糸膜モジュールＡに充填された中空糸膜５の内側に導入されている液体の圧力を測定すればよい。例えば、図１に示すように、プライミング液の導出口８ｂとポンプ１１ａとを接続したチューブの任意の位置に圧力計１４ａを接続して内圧を測定すればよいし、図２に示すように、プライミング液の導入口８ａとポンプ１１ａ’とを接続したチューブの任意の位置に内圧を測定するための圧力計１４ａ’を接続してもよい。
　また、前記中空糸膜の外圧（ｍｍＨｇまたはＰａ）とは、プライミング時の中空糸膜の外側の圧力の絶対値のことであり、中空糸膜外側の空間における空気の圧力測定値の絶対値を参照している。プライミング液の導入口付近にポンプを配置して線速を制御し、プライミング液を中空糸膜の内側に導入する場合は、外圧測定値（外圧値ともいう）が陽圧になり、反対にプライミング液の導出口付近にポンプを配置して線速を制御し、プライミング液を中空糸膜の内側に導入する場合は、外圧値が陰圧になる。外圧の下限は０ｍｍＨｇ（０Ｐａ）であり、上限は４６ｍｍＨｇ（６１３３Ｐａ）であることが好ましい。
　なお、前記外圧の測定方法としては、図１、２に示す中空糸膜モジュールＡ、Ｂに充填された中空糸膜５と胴部２との間隙にある液体の圧力を測定すればよく、例えば、図１において胴部２の側面に圧力計接続口１５を設け、この圧力計接続口１５に圧力計１４ｂを接続して測定すればよい。
　前記圧力差（ｍｍＨｇまたはＰａ）は、前記内圧測定値から外圧測定値を引いた差の絶対値をさしている。
　前記圧力差が７ｍｍＨｇ（９３３Ｐａ）未満の場合は、線速が小さすぎてプライミング工程に時間がかかりすぎる。また、前記圧力差が２９ｍｍＨｇ（３８６６Ｐａ）を超えると、線速が大きすぎて、すぐに中空糸膜内側がプライミング液で完全に濡れてしまい、中空糸膜外側の空気がプライミング液に置換されない。
　本発明のプライミング方法において、前記圧力差の下限は７ｍｍＨｇ（９３３Ｐａ）が好ましく、また、前記圧力差の上限は２９ｍｍＨｇ（３８６６Ｐａ）が好ましく、２２ｍｍＨｇ（２９３３Ｐａ）がより好ましく、１７ｍｍＨｇ（２２６６Ｐａ）がさらに好ましい。
　なお、プライミング液の導入口付近に備えられたポンプを用いて線速を制御し、プライミング液を導入口より中空糸膜の内側に導入する場合は内圧値から外圧値を引いた差が正の値になり、反対にプライミング液の導出口付近に備えられたポンプを用いて線速を制御し、プライミング液を導入口より中空糸膜の内側に導入する場合は、内圧値から外圧値を引いた差が負の値になる。
　また、本発明は、前記のようなプライミング方法を中空糸膜モジュールに施した後に、細胞懸濁液を前記中空糸膜モジュールの導入口または導出口より導入し、細胞を含まない濾液を濾液排出口より排出しながら、細胞懸濁液を濃縮する工程、を含む細胞濃縮液の製造方法に関する。
　ここにおける細胞としては、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系細胞、脂肪由来間質幹細胞、多能性成体幹細胞、骨髄ストローマ細胞、造血幹細胞等の多分化能を有する生体幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、キラーＴ細胞（細胞障害性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞などのリンパ球系の細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、顆粒球、赤血球、血小板、神経細胞、筋細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞などの体細胞、遺伝子の導入や分化などの処理を行った細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、胎児細胞などの希少細胞が例示される。
　前記細胞懸濁液は、前記細胞を含む懸濁液であれば特に限定されないが、例えば、脂肪、皮膚、血管、角膜、口腔、腎臓、肝臓、膵臓、心臓、神経、筋肉、前立腺、腸、羊膜、胎盤、臍帯などの生体組織を酵素処理、破砕処理、抽出処理、分解処理または超音波処理などをした後の懸濁液、血液や骨髄液を密度勾配遠心処理、ろ過処理、酵素処理、分解処理または超音波処理などの前処理をして調製された細胞懸濁液等が例示される。
　また、前記に例示した細胞を生体外で培養した後の細胞懸濁液を使用することができる。細胞を生体外で培養するときの培養液の例としては、ＤＭＥＭ、α－ＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０等が挙げられる。また、サイトカイン、抗体やペプチドなどの刺激因子を添加した培養液も使用できる。
　前記細胞懸濁液を濃縮する工程とは、具体的には、中空糸膜モジュールの導入口または導出口から中空糸膜の内側に流入した細胞懸濁液から、細胞を含まないタンパクや無機塩などの成分が濾液として中空糸膜の外側に濾別され、細胞成分が濃縮された細胞懸濁液を導出口または導入口より流出させる工程のことである。また、中空糸膜モジュールの導入口と出口は回路で接続されており、濃縮された細胞濃縮液を、再び中空糸膜の内側に流入させ、細胞成分がさらに濃縮されるように構成される。この濃縮が繰り返されることにより、細胞懸濁液の濃縮が進んで所望の細胞濃度にまで濃縮された細胞濃縮液が生成されることになる。なお、前記細胞濃縮液とは、中空糸膜モジュールを通過することにより濃縮された細胞懸濁液のことを表す。
　細胞懸濁液は、プライミング液と同じように導入口から中空糸膜モジュールに導入してもよく、逆にプライミング液の導出口から中空糸膜モジュールに導入することもできる。
　前記中空糸膜モジュールに導入するときの細胞懸濁液の線速度は、５００ｃｍ／分より大きく、２０００ｃｍ／分以下であることが好ましい。
　前記線速度が５００ｃｍ／分以下であると、濃縮処理に時間がかかり効率的でない。２０００ｃｍ／分を超えると、細胞へのせん断や圧力によるダメージが大きくなることが懸念される。
　前記線速度の下限は５００ｃｍ／分より大きいことが好ましく、８００ｃｍ／分より大きいことがより好ましく、１２００ｃｍ／分より大きいことがさらに好ましい。また、前記線速度の上限は２０００ｃｍ／分であることが好ましく、１８００ｃｍ／分がより好ましく、１５００ｃｍ／分がさらに好ましい。
　前記濃縮工程における、細胞懸濁液の濾過速度は（ｍＬ／ｍ２／分）は、１０００ｍＬ／ｍ２／分以上４２５０ｍＬ／ｍ２／分以下であることが好ましい。
　前記濾過速度とは、濾液排出口より排出される中空糸膜面積１ｍ２あたりの濾液の流量（ｍＬ／分）を、時間（分）で除した値のことである。
　前記濾過速度が１０００ｍＬ／ｍ２／分未満の場合、濃縮処理に時間がかかり効率的でない。４２５０ｍＬ／ｍ２／分を超えると、細胞が中空糸膜に詰まりやすく、細胞回収率の低下を引き起こすことが懸念される。
　また、前記濾過速度の下限は、１０００ｍＬ／ｍ２／分が好ましく、１２５０ｍＬ／ｍ２／分がより好ましく、１５００ｍＬ／ｍ２／分がさらに好ましい。また、前記濾過速度の上限は、４２５０ｍＬ／ｍ２／分が好ましく、４０００ｍＬ／ｍ２／分がより好ましく、３７５０ｍＬ／ｍ２／分がさらに好ましい。
　中でも、前記細胞懸濁液の濾過速度は、１５００ｍＬ／ｍ２／分以上３７５０ｍＬ／ｍ２／分以下であることで短時間かつ回収効率の高い濃縮処理が可能となるため好ましい。
　なお、前記濾過速度を求める際の中空糸膜面積は、中空糸膜の外側が液体で浸潤しているかどうかに関わらず、中空糸膜モジュールに充填された中空糸膜全体の膜面積のことをさしており、
（膜面積（ｍ２））＝（中空糸の内径（ｍ））×π×（樹脂層部間の距離（ｍ））×（中空糸本数（本））
により算出される。
　前記膜面積としては、０．０５ｍ２以上０．２０ｍ２以下が好ましい。前記膜面積が０．２０ｍ２を超えると細胞懸濁液が中空糸膜内に残存する液量が多くなり回収率が低下することが懸念され、また、０．０５ｍ２未満では、濾過流量が十分でなく短時間で処理ができない、もしくは細胞が中空糸膜に詰まりやすく、細胞回収率の低下を引き起こすことが懸念される。前記膜面積の下限は０．０５ｍ２が好ましく、０．０７ｍ２がより好ましく、０．０９ｍ２がさらに好ましい。前記膜面積の上限は０．２０ｍ２が好ましく、０，１８ｍ２がより好ましく、０．１６ｍ２がさらに好ましい。
　以下、本発明のプライミング方法および細胞濃縮液の製造方法を、図１を使用して例示するが、本発明はこれに限定されるものではなく、本発明の主旨に反しない範囲で各種変更することができる。
　まず、中空糸膜モジュールＡの導入口８ａおよび導出口８ｂにチューブ等を取り付ける。導入口８ａおよび導出口８ｂに取り付けたチューブの端はプライミング液が入ったバッグなどの貯留容器１０に連結し、前記貯留容器１０と中空糸膜モジュールＡとの間でプライミング液などの液体が循環できるように回路１６を形成する。さらに取り付けたチューブ内を、プライミング液などの液体が循環できるように、ポンプ１１ａをこのチューブに介在させてもよい。また、濾液排出口４はプライミング工程が終わるまで二方活栓１２で閉じた状態にしておく。中空糸膜モジュールＡおよびチューブ等の全体の取り付けは、クリーンベンチ等の無菌的な環境下で行われることが好ましい。
　次に、ポンプ１１ａを図１に示す回路１６からみて反時計周りに動かしてプライミング液を中空糸膜モジュールＡの下方にある導入口８ａから中空糸膜内側に充填する。前記ポンプ１１ａの駆動速度は、プライミング液の線速度が３５ｃｍ／分以上４５０ｃｍ／分以下になるように調整し、前記中空糸膜モジュールＡの容積に対して１５％以上になるまでプライミング液が充填されていることを確認してからポンプ１１ａを止めてプライミングを終了する。
　次に、プライミングが終了したら、前記貯留容器１０内のプライミング液を細胞懸濁液に交換し、濾液排出口４と廃液容器１３とを連結しているチューブにある二方活栓１２を開放し、ポンプ１１ａを図１に示す回路１６からみて時計周りに動かして細胞懸濁液の濃縮工程を開始する。
　このとき、濾液排出口４側の流路を狭くするなどして中空糸膜に圧力をかけながら濾過することもできるし、濾過側のチューブにポンプなどの機械１１ｂを設置して圧力をかけながら濾過を行ってもよく、一般的な中空糸膜モジュールで用いられる各種濾過方法を併用することができる。
　また、前記濃縮工程後に、細胞濃縮液を回収する方法としては、例えば、前記導入口８ａと貯留容器１０とを接続する回路１６の適当な場所に分岐部として三方活栓１７を設け、この分岐部の三方活栓１７に回収容器１８を接続し、前記ポンプ１１ａを駆動しながら、中空糸膜モジュールＡ、貯留容器１０および回路１６内の細胞濃縮液を前記回収容器１８に導入する方法が挙げられるが、特に限定はない。
　以上のようにして、閉鎖環境を維持して得られる細胞濃縮液には細菌などの混入がないことから、そのまま各種疾患の治療用途に提供することができる。
　例えば、前記製造方法で得られる細胞濃縮液をヒトや非ヒト動物に投与する各種疾患の治療方法に関する。
　前記治療方法としては、細胞障害性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞などの免疫細胞を使用したがんに対する免疫細胞療法、間葉系幹細胞などの多分化能を有する生体幹細胞を使用した、骨、関節、血管、臓器などの組織再生に対する細胞移植治療法、間葉系幹細胞を使用したＧＶＨＤ治療法が挙げられる。これらの治療に用いられる細胞は、iＰＳ細胞、ＥＳ細胞より誘導した細胞や、各種遺伝子を導入した細胞を使用することもできる。さらに、前記製造方法で得られる細胞濃縮液は、細胞濃縮液に新鮮な培地を加え、再び培養を行う培地交換の用途としても好適に使用することができる。
　以下、実験結果を用いて本発明を説明する。
　細胞回収率（％）とは、一定量まで濃縮した時点での細胞懸濁液中の細胞数を、処理をする前の細胞懸濁液中の細胞数で除した値で、値が高いほど回収効率に優れていることを示す。
　細胞数（個）は、細胞懸濁液を血球カウンター（シスメックス製、商品名「Ｋ－４５００」）により測定し、白血球分画の細胞濃度を本実施例での細胞濃度として算出し、細胞懸濁液量（ｍＬ）と細胞濃度（個／ｍＬ）の値の積で算出することができる。
　細胞回収率（％）は７０％以上であることが好ましく、８５％以上がさらに好ましい。８５％未満になると、細胞治療用途として患者に投与する際に必要な細胞数を確保できない可能性がある。さらに７０％未満になると、細胞損失が大きすぎて細胞処理用途としての使用に適さないと判断される可能性が高い。
　また、ここで細胞生存率比とは、回収容器１８に回収した細胞懸濁液中の細胞生存率を、処理をする前の細胞懸濁液中の細胞生存率で除した値をパーセントで表示したものであり、値が高いほど細胞に与えるダメージが少ないことを示す。細胞生存率は{細胞生存率（％）＝１００－死細胞率（％）}により算出される。
　死細胞率（％）は、細胞濃度が１ｍLあたり１０の６乗個になるよう調製した各細胞懸濁液１００μLに対し、ｖｉａ－ｐｒｏｂｅ（ＢＤ製）を１０μＬ加え１０分間室温暗所で静置させた後、フローサイトメーター（ＢＤ製、商品名「ＦＡＣＳＣａｎｔｏ」）に取り込み、ｖｉａ－ｐｒｏｂｅの陽性率（％）として測定することができる。
　本発明において細胞生存率比は、９５％以上であることが好ましく、９６％以上がさらに好ましい。９５％未満の場合は、細胞濃縮工程において細胞が大きくダメージを受けており、例えば細胞治療用途として患者に投与したときに、細胞が正常に機能せず、治療効果を発揮しない可能性がある。
　実施例に使用する細胞懸濁液は、培養したＪｕｒｋａｔ細胞を含有する細胞懸濁液（１０％ＦＢＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地）１５００ｍＬとした。
　各実験例におけるプライミング方法および細胞濃縮液の製造方法は、図１に示すように、中空糸膜モジュールＡ、貯留容器１０および廃液容器１３をチューブで接続した装置を用いて行った。前記中空糸膜モジュールＡとしては、下方にある頭部９の底面に導入口８ａ、その付近の胴部２側面に濾液排出口４が設けられており、前記中空糸膜モジュールＡの上方にある頭部３の天面に導出口８ｂ、その付近の胴部２側面に圧力計接続口１５が設けられているものを用いた。
　また、各実施例に記載した中空糸膜モジュールＡの導入口８ａ、および導出口８ｂにそれぞれ塩化ビニルチューブをつなげた。導入口８ａおよび導出口８ｂにつなげた塩化ビニルチューブのそれぞれの他方端は生理食塩液が貯留されたプラスチック製の貯留容器１０に接続し、貯留容器１０中の生理食塩液が中空糸膜モジュールＡと貯留容器１０との間を、チューブを介して循環できるように回路１６を形成した。
　導出口８ｂ側の塩化ビニルチューブにはポンプ１１ａおよび内圧圧力計１４ａを設置し、生理食塩液が後述の実施例に記載した流速で流れるように設定した。
　中空糸膜モジュールＡの濾液排出口４にはチューブおよび二方活栓１２を取り付け、チューブの端を廃液容器１３と接続し、さらに前記チューブにはポンプ１１ｂを設置して、濾液が後述の実施例に記載した流速で排出されるように設定し、二方活栓１２を閉じた。
　また、前記圧力計接続口１５には外圧圧力計１４ｂを取り付けた。
　また、貯留容器１０と中空糸膜モジュールＡの導入口８ａとを接続しているチューブに三方活栓１７を取り付け、さらに、この三方活栓１７にチューブを介してプラスチック製の回収容器１８を接続した。
　次に、ポンプ１１ａを駆動して、導入口８ａから中空糸膜モジュールＡ内に生理食塩液を充填し、このときの外圧圧力計１４ｂと内圧圧力計１４ａの値（ｍｍＨｇ）、中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている部分の中空糸膜の長さ（ｃｍ）をそれぞれ記録した。
　なお、外圧圧力計１４ｂの値を中空糸膜の「外圧」とし、内圧圧力計１４ａの値を中空糸膜の「内圧」とした。
　また、中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている部分の中空糸膜の長さ（ｃｍ）を中空糸膜モジュール両端の樹脂層部間の距離（ｃｍ）で除した値をパーセントで表示することによりプライミング液の充填効率（％）を算出した。
　続いて、二方活栓１２を開け、生理食塩液が貯留された貯留容器１０を細胞懸濁液が貯留された別の貯留容器１０に無菌的に交換し、ポンプ１１ａの流速について後述の実施例に記載した流速になるよう設定し、通液方向はプライミング液の通液方向と逆方向になるようにした。
　すなわち、導出口８ｂより細胞懸濁液を中空糸膜モジュールＡに導入し、前記貯留容器１０との間で細胞懸濁液を循環させながら濾液を濾液排出口４より排出した。
　濾液の容量が一定量（７０ｍＬ～８０ｍＬ）になるまで濃縮した後、二方活栓１２を閉じ、チューブ、中空糸型分離膜５内の細胞濃縮液をポンプ１１ａにより流量７５ｍＬ／分で導入口８ａから押し出して導入口８ａと貯留容器１０との間にある回路１６から分岐した回収容器１８に回収した。
　細胞懸濁液の通液開始から回収終了までに要した時間をストップウォッチで計測し、処理時間を測定した。最後に回収容器１８中の細胞濃縮液の細胞数を測定し、細胞回収率および生存率比を算出した。以下に実施例を示す。
（実施例１）　
　側面端部に濾液排出口４および圧力計接続口１５を備えた直径４．５ｃｍ、高さ２４ｃｍの円筒型容器１に、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）製の中空糸膜〔商品名：ＭＦＣ－Ｋ１、中空糸内径５７０μｍ、孔径０．２μｍ、東洋紡社製〕３００本を充填し、この中空糸膜の束５の両端を樹脂層部７で容器１内部に固定した。
　このときの両端の樹脂層部７間の距離は２３ｃｍであった。次に、円筒型容器１の両端面に導入口８ａ、導出口８ｂが設けられた頭部（３、９）を取り付け、中空糸膜モジュールＡとした。
　作製した中空糸膜モジュールＡの濾過面積は０．１８ｍ２、総断面積は前記式２を用いて０．７７ｃｍ２と算出した。プライミング条件は、導出口の流量が２７ｍＬ／分（線速度３５ｃｍ／分）とした。
　このとき、内圧値は－８ｍｍＨｇ、外圧値は－１ｍｍＨｇ、圧力差の絶対値は７ｍｍＨｇであった。
　また、中空糸膜モジュールＡの両端の樹脂層部７間の距離は２３ｃｍであり、そのうちプライミング終了時に中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の垂直方向の長さは２１ｃｍであった。
　従って、プライミング液の充填効率（モジュール両端の樹脂層部７間の距離に対する中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さの割合）は、９１％と算出された。
　濃縮条件は、プライミング液導出口８ｂ付近の流量が４５０ｍＬ／分（線速度５８８ｃｍ／分）、濾液排出口４より排出される濾過速度は１８２３ｍＬ／ｍ２／分とした。その結果、処理時間は３６２秒、細胞回収率は８６％、生存率比は９７％であった。
（実施例２）
　実施例１と同様の中空糸膜モジュールＡを用いた。プライミング条件は、導出口８ｂ付近の流量が２３０ｍＬ／分（線速度３００ｃｍ／分）とした。
　このとき、内圧値は－３２ｍｍＨｇ、外圧値は－１５ｍｍＨｇ、圧力差は１７ｍｍＨｇであった。
　また、中空糸膜モジュールＡの両端の樹脂層部７間の距離は２３ｃｍであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さは１７ｃｍであった。
　従って、プライミング液の充填効率は、７４％と算出された。
　濃縮条件は、プライミング液導出口８ｂ付近の流量が４５０ｍＬ／分（線速度５８８ｃｍ／分）、濾液排出口４より排出される濾過速度は１８２３ｍＬ／ｍ２／分とした。その結果、処理時間は３６４秒、細胞回収率は８５％、生存率比は９６％であった。
（実施例３）
　実施例１と同様の中空糸膜モジュールＡを用いた。プライミング条件は、導出口８ｂ付近の流量が３２２ｍＬ／分（線速度４２０ｃｍ／分）とした。このとき、内圧値は－３４ｍｍＨｇ、外圧値は－１２ｍｍＨｇ、圧力差は２２ｍｍＨｇであった。
　また、中空糸膜モジュールＡの両端の樹脂層部７間の距離は２３ｃｍであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さは１０ｃｍであった。
　従って、プライミング液の充填効率は、４４％と算出された。
　濃縮条件は、プライミング液導出口８ｂ付近の流量が４５０ｍＬ／分（線速度５８８ｃｍ／分）、濾液排出口４より排出される濾過速度は１８２３ｍＬ／ｍ２／分とした。その結果、処理時間は３６５秒、細胞回収率は７３％、生存率比は９７％であった。
（実施例４）
　実施例１と同様の中空糸膜モジュールＡを用いた。プライミング条件は、導出口８ｂ付近の流量が３４４ｍＬ／分（線速度４５０ｃｍ／分）とした。このとき、内圧値は－３６ｍｍＨｇ、外圧値は－７ｍｍＨｇ、圧力差は２９ｍｍＨｇであった。
　また、中空糸膜モジュールＡの両端の樹脂層部７間の距離は２３ｃｍであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さは４ｃｍであった。
　従って、プライミング液の充填効率は、１７％と算出された。
　濃縮条件は、プライミング液導出口８ｂ付近の流量が４５０ｍＬ／分（線速度５８８ｃｍ／分）、濾液排出口４より排出される濾過速度は１８２３ｍＬ／ｍ２／分とした。その結果、処理時間は３６３秒、細胞回収率は７０％、生存率比は９５％であった。
（実施例５）
　実施例１と同様の中空糸膜モジュールＡを用いて、実施例１と同じ条件でプライミングを実施した。
　濃縮条件は、プライミング液導出口８ｂ付近の流量が６００ｍＬ／分（線速度７８４ｃｍ／分）、濾液排出口４より排出される濾過速度は２４２２ｍＬ／ｍ２／分とした。
　その結果、処理時間は２９７秒、細胞回収率は７６％、生存率比は９８％であった。
（実施例６）
　混合セルロースエステル（ＭＥ）製の中空糸膜〔商品名：Ｄ０６－Ｍ２０Ｕ－０６－Ｎ、中空糸内径６００μｍ、孔径０．２μｍ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製〕が、側面端部に濾液排出口４および圧力計接続口１５を備えた直径６．９８ｍｍ、高さ６８ｃｍの円筒型容器１に濾過面積が３３５ｃｍ２になるよう充填され、中空糸膜の両端を樹脂層部７で固定された中空糸膜モジュールＡを使用した。
　このときの両端の樹脂層部７間の距離は６５ｃｍであった。これらの値を前記式３に代入することにより、中空糸膜の総断面積を０．０７７ｃｍ２と算出した。
　プライミング条件は、導出口８ｂ付近の流量が２.７ｍＬ／分（線速度３５ｃｍ／分）とした。このとき、内圧値は－５５ｍｍＨｇ、外圧値は－４６ｍｍＨｇ、圧力差は９ｍｍＨｇであった。また、中空糸膜モジュールＡの両端の樹脂層部７間の距離は６５ｃｍであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の垂直方向の長さは６２ｃｍであった。
　従って、プライミング液の充填効率は、９５％と算出された。
（実施例７）　　
　混合セルロースエステル（ＭＥ）製の中空糸膜〔商品名：Ｄ０６－Ｍ１０Ｕ－０６－Ｎ、中空糸内径６００μｍ、孔径０．１μｍ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製〕が、側面端部に濾液排出口４および圧力計接続口１５を備えた直径６．９８ｍｍ、高さ６８ｃｍの円筒型容器１に濾過面積が３３５ｃｍ２になるよう充填され、中空糸膜の束５の両端を樹脂層部７で容器１内部に固定された中空糸膜モジュールＡを使用した。
　このときの両端の樹脂層部７間の距離は６５ｃｍであった。これらの値を前記式３に代入することにより、中空糸膜の総断面積を０．０７７ｃｍ２と算出した。
　プライミング条件は、導出口８ｂ付近の流量が２.７ｍＬ／分（線速度３５ｃｍ／分）とした。このとき、内圧値は－６６ｍｍＨｇ、外圧値は－４６ｍｍＨｇ、圧力差は２０ｍｍＨｇであった。また、中空糸膜モジュール両端の樹脂層部７間の距離は６５ｃｍであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さは４６ｃｍであった。
　従って、プライミング液の充填効率は、７１％と算出された。
（比較例１）
　実施例１と同様の中空糸膜モジュールＡを用いた。プライミング条件は、導出口８ｂ付近の流量が４５９ｍＬ／分（線速度６００ｃｍ／分）とした。このとき、内圧値は－５８ｍｍＨｇ、外圧値は－２８ｍｍＨｇ、圧力差は３０ｍｍＨｇであった。
　また、中空糸膜モジュールＡの両端の樹脂層部７間の距離は２３ｃｍであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さは１ｃｍであった。
　従って、プライミング液の充填効率は、４％と算出された。濃縮条件は、プライミング液導出口８ｂ付近の流量が４５０ｍＬ／分（線速度５８８ｃｍ／分）、濾液排出口４より排出される濾過速度は１８２３ｍＬ／ｍ２／分とした。
　その結果、処理時間は３６４秒、細胞回収率は６５％、生存率比は９５％であった。
（比較例２）　　
　ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）製の中空糸膜〔商品名：Ｄ０６－Ｅ５００－０５－Ｎ、中空糸内径５００μｍ、分画５００ｋＤ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製〕が、側面端部に濾液排出口４および圧力計接続口１５を備えた直径６．９８ｍｍ、高さ６８ｃｍの円筒型容器１に濾過面積が３７０ｃｍ２になるよう充填され、中空糸膜の束５の両端を樹脂層部７で容器１内に固定された中空糸膜モジュールＡを使用した。このときの両端の樹脂層部７間の距離は６５ｃｍであった。これらの値を前記式３に代入することにより、中空糸膜の総断面積を０．０７１ｃｍ２と算出した。
　プライミング条件は、導出口８ｂ付近の流量が２.１ｍＬ／分（線速度３５ｃｍ／分）とした。このとき、内圧値は－５５ｍｍＨｇ、外圧値は８９ｍｍＨｇ、圧力差は１４４ｍｍＨｇであった。
　また、中空糸膜モジュールＡの両端の樹脂層部７間の距離は６５ｃｍであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さは０ｃｍであった。
　従って、プライミング液の充填効率は、０％と算出された。
　実施例１～５および比較例１、２の中空糸膜モジュールの条件、プライミング条件、濃縮条件および性能を表１に示す。なお、実施例６、７および比較例２ではプライミングのみを行い、細胞濃縮は行わなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示す結果から、実施例１～５では、プライミング液を中空糸膜モジュールに線速度３５ｃｍ／分以上４５０ｃｍ／分以下で、中空糸膜モジュールの容積に対して１５％以上充填するプライミング方法とすることにより、比較例１に比べて有意に高い細胞回収率および生存率比で細胞濃縮液を製造できることは明らかである。また、実施例１～５のように、プライミング時の線速度を濃縮時の線速度よりも低く調整することで、中空糸膜の内側と外側の両方にプライミング液を簡便に充填でき、続く細胞懸濁液処理工程において有効濾過面積が大きくなり、細胞の回収率や濾過速度を向上させることができる。さらに、実施例１～５では閉鎖環境を維持したまま細胞処理を完遂できるため、得られた細胞は治療用途として提供することができる。
　また、表１に示す実施例３と実施例５との結果から、プライミング時の線速を下げ、細胞処理時の有効濾過面積を大きくすることにより、細胞回収率の低下を引き起こすことなく濾過速度を向上させることができ、これにより細胞懸濁液の処理時間の短縮が期待される。
　表１に示す実施例１および実施例６は、中空糸膜の材料としてポリスルホン系、およびセルロース系の高分子材料がより好ましく用いられることを示している。また、実施例１と実施例７と比較例２との結果から、プライミングを行う場合、中空糸膜の壁に設ける孔径は０．１μｍ以上が好ましいことを示している。
　Ａ、Ｂ.中空糸膜モジュール
　１．容器
　２．胴部
　３．頭部
　４、４’．濾液排出口
　５．中空糸膜の束
　６．開口端
　７．樹脂層部
　８ａ．導入口
　８ｂ．導出口
　９．頭部
　１０．貯留容器
　１１ａ、１１ａ’．ポンプ
　１１ｂ．ポンプ
　１２．二方活栓
　１３．廃液容器
　１４ａ、１４ａ’．内圧圧力計
　１４ｂ．外圧圧力計
　１５．圧力計接続口
　１６．回路
　１７．三方活栓
　１８．回収容器

Claims (13)

  1. 　導入口、導出口及び濾液排出口を有する容器に中空糸膜が充填された中空糸膜モジュールをプライミングする方法であって、
    　前記中空糸膜モジュールの導入口または導出口よりプライミング液を線速度３５ｃｍ／分以上４５０ｃｍ／分以下で、前記中空糸膜モジュールの容積に対して１５％以上充填する工程
    を含むプライミング方法。
  2. 　プライミング時の中空糸膜の内圧と外圧の圧力差が７ｍｍＨｇ以上２９ｍｍＨｇ以下である請求項１に記載のプライミング方法。
  3. 　前記内圧が陰圧である請求項２に記載のプライミング方法。
  4. 　前記線速度が３５ｃｍ／分以上３００ｃｍ／分以下である請求項１～３のいずれか１項に記載のプライミング方法。
  5. 　プライミング液を前記中空糸膜モジュールの容積に対して７０％以上充填する請求項１～４のいずれか１項に記載のプライミング方法。
  6. 　前記中空糸膜の内側にプライミング液を導入する請求項１～５のいずれか１項に記載のプライミング方法。
  7. 　前記導入口および前記導出口が前記中空糸膜の内側を通じて連通している請求項１～６のいずれか１項に記載のプライミング方法。
  8. 　中空糸膜の孔径が０．１μｍ以上１．０μｍ以下である請求項１～７のいずれか１項に記載のプライミング方法。
  9. 　前記プライミング液が、生理食塩液、輸液、血清または培地からなる群より選ばれる１種以上である請求項１～８のいずれか１項に記載のプライミング方法。
  10. 　請求項１～７のいずれか１項に記載のプライミング方法を中空糸膜モジュールに施した後に、細胞懸濁液を中空糸膜モジュールの導出入口より導入し、細胞を含まない濾液を濾液排出口より排出しながら、細胞懸濁液を濃縮する工程、を含む細胞濃縮液の製造方法。
  11. 　前記濾液排出口を少なくとも１つ以上備えた中空糸膜モジュールを用いる請求項１０に記載の細胞濃縮液の製造方法。
  12. 　細胞懸濁液を線速度５００ｃｍ／分以上２０００ｃｍ／分以下で中空糸膜モジュールの導出入口より導入する請求項１０または１１に記載の細胞濃縮液の製造方法。
  13. 　細胞懸濁液を濾過速度１５００ｍＬ／ｍ２／分以上３７５０ｍＬ／ｍ２／分以下で濾液出口より導出する請求項１２に記載の細胞濃縮液の製造方法。
     
     
     
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