WO2016063969A1 - ヘマグルチニン結合ペプチド - Google Patents

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thr
mephe
seq
amino acid
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規一 窪田
パトリック リード
小原　道法
圭一 舛屋
政輝 大内
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ペプチドリーム株式会社
公益財団法人東京都医学総合研究所
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    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes

Definitions

  • the present invention relates to hemagglutinin-binding peptides having anti-influenza virus activity.
  • Influenza viruses are enveloped RNA viruses and are classified into A, B, and C types according to the antigenicity of nucleoprotein (NP) and matrix protein (M).
  • NP nucleoprotein
  • M matrix protein
  • the epidemic in humans is mainly type A and type B. Even if the types such as A, B, and C are the same, they are further classified into a plurality of subtypes based on the antigenicity difference between hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA), which are molecules on the envelope surface, and H1N1, H5N1, etc. It is expressed.
  • HA hemagglutinin
  • NA neuraminidase
  • zanamivir Relenza (registered trademark)
  • oseltamivir Teamiflu (registered trademark)
  • Patent Document 2 As existing anti-influenza drugs, zanamivir (Relenza (registered trademark)) (for example, Patent Document 1) and oseltamivir (Tamiflu (registered trademark)) (for example, Patent Document 2) are widely used. Zanamivir and oseltamivir act by suppressing the activity of neuraminidase, which is required when influenza virus infects other cells from infected cells. Furthermore, there are amantadine and rimantadine that target matrix protein 2 (M2 protein) as anti-influenza drugs having other action mechanisms, which inhibit virus unshelling after cell infection.
  • M2 protein target matrix protein 2
  • These drugs that inhibit the function of neuraminidase or M2 protein are derivatized from substrates, molecular design based on three-dimensional structures, or discovery of functions from existing compounds It has been developed through such processes. That is, it belongs to an analog of a molecule present in a living body or a chemically prepared small molecule.
  • M2 protein inhibitors are only effective against influenza A, and neuraminidase inhibitors do not respond to influenza C without neuraminidase.
  • Antiviral drugs generally have limited efficacy due to the acquisition of viral drug resistance due to mutations. Antiviral viruses such as zanamivir, oseltamivir, amantadine, etc., which have been used for a long time, have emerged. ing. In addition to the reduction of drug affinity due to mutation of the target molecule, the acquisition of drug resistance by the virus is also due to the indirect mechanism of restoring the growth potential by mutation of a different molecule, and complete acquisition of resistance over the long term It is difficult to create drugs that can be avoided.
  • Patent Document 3 The present inventors have found a peptide exhibiting an inhibitory activity against influenza virus by binding to hemagglutinin.
  • an object of the present invention is to provide a hemagglutinin-binding peptide capable of obtaining a high anti-influenza virus effect.
  • the present inventors have found a peptide having a remarkably high anti-influenza virus effect. Then, it was confirmed that some of these peptides could obtain a sufficient anti-influenza virus effect even when administered after a lapse of a certain time from infection, and the present invention was completed.
  • a hemagglutinin-binding peptide comprising a polypeptide consisting of any of the following amino acid sequences (i) to (iv): (i) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg (SEQ ID NO: 1); (ii) Arg-Val-Ser-MePhe-Thr-Tyr-MePhe-MeSer-Tyr-Thr-Pro-Ser (SEQ ID NO: 2); (iii) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, added or substituted in SEQ ID NO: 1 or 2; and (iv) an amino acid having 90% or more sequence identity with SEQ ID NO: 1 or 2.
  • hemagglutinin-binding peptide according to [1], wherein the hemagglutinin-binding peptide includes a polypeptide having any one of the following amino acid sequences (v) to (vii): (v) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, added or substituted in the amino acid selected from positions 3, 6, 12, and 13 in SEQ ID NO: 1; (vi) an amino acid sequence in which one or several amino acids of amino acids selected from positions 3, 6, and 13 are substituted in SEQ ID NO: 1; and (vii) 13 in SEQ ID NO: 1.
  • a hemagglutinin-binding peptide comprising a polypeptide consisting of any one of the following amino acid sequences (viii) to (xviii): (viii) Thr-MeGly-Lys-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg (SEQ ID NO: 36); (ix) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ala-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg (SEQ ID NO: 37); (x) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Lys-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg (SEQ ID NO: 38); (xi) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-MePhe-MePhe-MePhe-Ly
  • Xaa 2 is MePhe or MeGly, Xaa 3 is MeGly or Thr; Xaa 4 is His Xaa 6 is a hemagglutinin-binding peptide according to [4] above, which is His or Arg; [6] Xaa 1 -Xaa 2 -Xaa 3 -Xaa 4 -Xaa 5 -Xaa 6 -Xaa 7 -Xaa 8 -Xaa 9 -Xaa 10 -Xaa 11 -Xaa 12 -Xaa 13 Ser-MePhe-MeGly-His-Val-His-Tyr-Ser-Val-MePhe-Asn-MeAla-Val, or Thr-MeGly-Thr-His-Val-Arg-Tyr-Thr-Val-MePhe-Asn-MeAla-Ser The hemagglutinin-binding peptide
  • the peptide of the present invention exhibits high inhibitory activity against influenza virus by binding to hemagglutinin, it also has antiviral effect against influenza virus resistant to neuraminidase inhibitors and M2 protein inhibitors. In addition, it is considered that the probability that a drug-resistant mutant appears can be further reduced by combining the peptide of the present invention with a drug that targets neuraminidase, M2 protein, or the like. Furthermore, the peptide of the present invention is highly useful as a therapeutic agent for influenza because a sufficient anti-influenza virus effect can be obtained even if it is administered after a lapse of a certain time from infection.
  • FIG. 1 is a photograph of a plate showing the results of a growth inhibition test with the peptide of the present invention against influenza virus H5N1-Vac3 (Example 2).
  • Figure 2 shows against highly pathogenic avian influenza viruses A / ws / Hokkaido / 1/08 (clade 2.3), A / ws / Mongolia / 3/05 (clade 2.2), A / Vietnam / UT3040 / 04 (clade 1)
  • FIG. 1 is a photograph of a plate showing the results of a growth inhibition test with the peptide of the present invention against influenza virus H5N1-Vac3 (Example 2).
  • Figure 2 shows against highly pathogenic avian influenza viruses A / ws / Hokkaido / 1/08 (clade 2.3), A / ws / Mongolia / 3/05 (clade 2.2
  • FIG. 3 is a photograph of a plate showing the results of a growth inhibition test with the peptide of the present invention against influenza virus H1N1-pdm2619 (Example 2).
  • FIG. 4 is a photograph of a plate showing the results of a growth inhibition test with the peptide of the present invention against influenza virus H2N2-Adachi (Example 2).
  • FIG. 5 is an outline of an experiment for determining the therapeutic effect of the special cyclic peptides iHA-100 and Zanamivir (Example 3).
  • FIG. 6 shows the therapeutic effect on highly pathogenic avian influenza virus H5N1 A / whooper swan / Hokkaido / 1/08 (5x MLD50) by the peptide of the present invention (Example 3).
  • Fig. 7 shows the therapeutic effect of Zanamivir on highly pathogenic avian influenza virus H5N1 A / whooper swan / Hokkaido / 1/08 (5x MLD50) (Example 3).
  • Example 5 which is a photograph of the plate which shows the result of the growth inhibition test by the peptide of this invention with respect to influenza virus H5N1-Vac3.
  • hemagglutinin-binding peptide includes a polypeptide consisting of any one of the following amino acid sequences (i) to (iv).
  • (ii) Arg-Val-Ser-MePhe-Thr-Tyr-MePhe-MeSer-Tyr-Thr-Pro-Ser SEQ ID NO: 2
  • hemagglutinin-binding peptide also includes a polypeptide comprising any one of the following amino acid sequences (v) to (xviii).
  • Thr-MeGly-Lys-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg SEQ ID NO: 36
  • MeGly N-methylglycine
  • MePhe N-methylphenylalanine
  • MeSer N-methylserine
  • Dap 2,3-diaminopropionic acid
  • the hemagglutinin-binding peptide according to the present invention has a deletion, addition or addition of one or several amino acids in SEQ ID NO: 41, 42 or 44 from the viewpoint of high neutralizing activity and inhibitory activity against influenza virus growth. It preferably includes a polypeptide comprising an amino acid sequence that is substituted; or an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of SEQ ID NOs: 41, 42, or 44, and from an amino acid sequence having SEQ ID NO: 41, 42, or 44 More preferably, the polypeptide comprises:
  • a polypeptide refers to a polypeptide in which two or more amino acids are bonded by peptide bonds, for example, a peptide bond of 8-30 amino acids can be used. There may be.
  • amino acid is used in its broadest sense, and includes derivatives and artificial amino acids in addition to natural amino acids. Derivatives include, for example, amino acids in which natural amino acids constituting proteins are modified. Examples of such amino acids include hydroxyproline and hydroxylysine, which are amino acids into which a hydroxyl group has been introduced, and diaminopropionic acid, which is an amino acid into which an amino group has been introduced.
  • amino acids include naturally occurring proteinaceous L-amino acids; unnatural amino acids; chemically synthesized compounds having characteristics known in the art that are characteristic of amino acids.
  • non-natural amino acids include ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acids (such as ⁇ -methylalanine), N-alkyl- ⁇ -amino acids, D-amino acids, ⁇ -amino acids, ⁇ -, whose main chain structure is different from that of the natural type.
  • Hydroxy acids amino acids whose side chain structure is different from the natural type (norleucine, homohistidine, etc.), amino acids with extra methylene in the side chain (such as “homo” amino acids, homophenylalanine, homohistidine, etc.), and carvone in the side chain Examples include, but are not limited to, amino acids (such as cysteic acid) in which an acid functional amino acid is substituted with a sulfonic acid group.
  • amino acids other than the 20 natural amino acids used for translation synthesis on ribosomes in living cells that is, amino acids corresponding to the following (1) to (3) are referred to as “special amino acids” There is.
  • Amino acids corresponding to amino acid residues on polypeptides that have been modified after translation synthesis for example, phosphorylated tyrosine, acetylated lysine, farnesylated cysteine
  • Naturally occurring amino acids that are not used for translational synthesis on ribosomes (3)
  • Non-naturally occurring artificial amino acids non-natural amino acids
  • DBE and CME are ester types when a special amino acid is bound to tRNA by flexizyme
  • DBE means 3,5-dinitrobenzyl ester
  • CME means cyanomethyl ester
  • the peptide of (iii) and (xvii) above is a peptide in which one or several amino acids are deleted, added or substituted in the amino acid sequence of the peptide according to any of SEQ ID NOs: 1, 2 and 36 to 44 Any peptide may be used as long as it can bind to hemagglutinin. Whether or not it can bind to hemagglutinin can be confirmed by those skilled in the art according to a known method.
  • the number of amino acids to be deleted, added, or substituted is the ability of the peptide to bind to hemagglutinin. However, it may be 1 to 5, 1 to 3, or 1 to 2, for example.
  • the location of deletion, addition, or substitution may be at the end of the peptide, in the middle, at one location, or at two or more locations.
  • the peptide of the above (iv) and (xviii) may be any peptide as long as it has 90% or more sequence identity with any of SEQ ID NOs: 1, 2, and 36 to 44 and can bind to hemagglutinin. Good.
  • the sequence identity may be 95% or more or 98% or more.
  • One embodiment of the hemagglutinin-binding peptide according to the present invention includes a polypeptide having the amino acid sequence of any one of (v) to (vii) above.
  • polypeptides include, for example: A polypeptide comprising an amino acid sequence in which the amino acid at position 12 in SEQ ID NO: 1 is substituted with a hydroxyamino acid; A polypeptide comprising an amino acid sequence in which the amino acid at position 13 in SEQ ID NO: 1 is substituted with a basic amino acid; A polypeptide comprising an amino acid sequence in which the amino acid at position 13 in SEQ ID NO: 1 is substituted with an amino acid smaller than arginine; Etc.
  • hydroxy amino acids examples include serine, threonine, tyrosine, hydroxyproline, hydroxylysine, and the like.
  • hydroxyproline can be used for substitution.
  • basic amino acids include arginine, lysine, citrulline, ornithine, creatine, histidine, diaminobutanoic acid, diaminopropionic acid and the like.
  • lysine or diaminopropion can be used for substitution.
  • the amino acid smaller than arginine is not particularly limited as long as the side chain after substitution is shorter than arginine.
  • an amino acid selected from alanine, glutamic acid and 2,3-diaminopropionic acid can be used for substitution.
  • hemagglutinin-binding peptide includes a polypeptide having the amino acid sequence of the following formula (I).
  • Xaa 1 is Ser or Thr
  • Xaa 2 is an N-methyl amino acid
  • Xaa 3 is any amino acid
  • Xaa 4 is a basic amino acid
  • Xaa 5 is Val
  • Xaa 6 is a basic amino acid
  • Xaa 7 is Tyr
  • Xaa 8 is Ser or Thr
  • Xaa 9 is Val
  • Xaa 10 is MePhe Xaa 11 is Asn
  • Xaa 12 is MeAla
  • Xaa 2 may be MePhe or MeGly
  • Xaa 3 may be MeGly or Thr
  • Xaa 4 may be His
  • Xaa 6 may be His or Arg.
  • polypeptide represented by the formula (I) is: Ser-MePhe-MeGly-His-Val-His-Tyr-Ser-Val-MePhe-Asn-MeAla-Val (SEQ ID NO: 4), or Thr-MeGly-Thr-His-Val-Arg-Tyr-Thr-Val-MePhe-Asn-MeAla-Ser (SEQ ID NO: 5) It may be.
  • MeAla represents N-methylalanine.
  • the hemagglutinin-binding peptide according to the present invention may be a peptide consisting of only one of the amino acid sequences (i) to (xviii) or only the amino acid sequence of the formula (I), and at least one end thereof is at least one peptide. It may be a polypeptide to which an amino acid is bound.
  • the full length of the hemagglutinin-binding peptide according to the present invention can be, for example, 30 amino acids or less, 20 amino acids or less, or 15 amino acids or less.
  • the peptide of the present invention includes various derivatives thereof as long as the problem of the present invention is solved.
  • Such derivatives include, for example, those in which the C-terminus is an amide, ester or carboxyl group, fused with a membrane-penetrating peptide (CPP) so as to be introduced into cells when administered.
  • CPP is a general term for peptides having affinity for cell membranes and ability to migrate into cells, and is a domain consisting of 11 amino acids of the trans-activator of transcription protein (TAT protein) expressed by HIV-1 virus.
  • TAT protein trans-activator of transcription protein
  • PTD Protein-transduction domain
  • Drosophila Antennapedia Drosophila Antennapedia
  • herpesvirus-derived VP22 herpesvirus-derived VP22
  • oligoarginine penetratin and the like are known.
  • CPPs have a high content of basic amino acids such as arginine, lysine and histidine.
  • the peptide derivative of the present invention include those with modifications such as phosphorylation, methylation, acetylation, adenylylation, ADP ribosylation, and glycosylation, and fusion peptides with other peptides and proteins. It is done.
  • These derivatives can be prepared by those skilled in the art by a known method or a method analogous thereto.
  • the hemagglutinin-binding peptide according to the present invention includes salts thereof as long as it solves the problems of the present invention.
  • salts of peptides salts with physiologically acceptable bases and acids are used.
  • inorganic acids hydroochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc.
  • organic salts Addition salts of acids (p-toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid, oxalic acid, p-bromophenylsulfonic acid, carboxylic acid, succinic acid, citric acid, benzoic acid, acetic acid, etc.), inorganic bases (ammonium hydroxide or alkali or Alkaline earth metal hydroxides, carbonates, bicarbonates, etc.), amino acid addition salts, and the like.
  • hemagglutinin-binding peptide according to the present invention may be cyclized (macrocyclic).
  • cyclization means that two amino acids separated by one or more amino acids are bound directly or indirectly through a linker or the like in one peptide to form a cyclic structure in the molecule. To do.
  • Cyclization includes disulfide bond, peptide bond, alkyl bond, alkenyl bond, ester bond, thioester bond, ether bond, thioether bond, phosphonate ether bond, azo bond, C—S—C bond, C—N—C bond, C ⁇ N—C bond, amide bond, lactam bridge, carbamoyl bond, urea bond, thiourea bond, amine bond, thioamide bond, and the like, but is not limited thereto.
  • the structure of the peptide may be stabilized and the affinity for the target may be increased.
  • the amino acid for macrocyclization can be, for example, an amino acid having the following functional group 1 and an amino acid having the corresponding functional group 2. Either functional group 1 or functional group 2 may be on the N-terminal side.
  • the amino acid having functional group 1 and the amino acid having functional group 2 may be N-terminal or C-terminal amino acids, respectively, or non-terminal amino acids.
  • X 1 is Cl, Br or I
  • Ar is an aromatic ring which may have a substituent.
  • a chloroacetylated amino acid for example, a chloroacetylated amino acid can be used.
  • the chloroacetylated amino acids include N-chloroacetyl-L-alanine, N-chloroacetyl-L-phenylalanine, N-chloroacetyl-L-tyrosine, N-chloroacetyl-L-tryptophan, N-3- (2-chloroacetamido) benzoyl- L-phenylalanine, N-3- (2-chloroacetamido) benzoyl-L-tyrosine, N-3- (2-chloroacetamido) benzoyl-L-tryptophane, ⁇ -N-chloroacetyl-L-diaminopropanoic acid, ⁇ -N-chloroacetyl -L-diaminobutyric acid, ⁇ -N-chloroacetyl
  • amino acid (A-2) for example, cysteine, homocysteine, mercaptonorvaline, mercaptonorleucine, 2-amino-7-mercaptoheptanoic acid, 2-amino-8-mercaptooctanoic acid, and the SH group of these amino acids are temporarily protected. And amino acids whose protective groups have been deprotected, and D-amino acid derivatives corresponding thereto. Cyclization methods are described, for example, by Kawakami, T. et al., Nature Chemical Biology 5, 888-890 (2009); Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009); Sako, Y. et.
  • amino acid (B-1) for example, propargylglycine, homopropargylglycine, 2-amino-6-heptynoic acid, 2-amino-7-octynoic acid, and 2-amino-8-nonynoic acid can be used. Further, 4-pentynoylated or 5-hexynoylated amino acids can also be used.
  • 4-pentynoylated amino acids include N- (4-pentenoyl) -L-alanine, N- (4-pentenoyl) -L-phenylalanine, N- (4-pentenoyl) -L-tyrosine, N- (4-pentenoyl ) -L-tryptophan, N-3- (4-pentynoylamido) benzoyl-L-phenylalanine, N-3- (4-pentynoylamido) benzoyl-L-tyrosine, N-3- (4-pentynoylamido) benzoyl-L-tryptophane , ⁇ -N- (4-pentenoyl) -L-diaminopropanoic acid, ⁇ -N- (4-pentenoyl) -L-diaminobutyric acid, ⁇ -N- (4-pentenoyl) -L-ornithine, ⁇ -
  • amino acid (B-2) for example, azidoalanine, 2-amino-4-azidobutanoic acid, azidoptonorvaline, azidonorleucine, 2-amino-7-azidoheptanoic acid, and 2-amino-8-azidooctanoic acid can be used.
  • azidoacetylated or 3-azidopentanoylated amino acids can also be used.
  • Azidoacetylated amino acids include N-azidoacetyl-L-alanine, N-azidoacetyl-L-phenylalanine, N-azidoacetyl-L-tyrosine, N-azidoacetyl-L-tryptophan, N-3- (4-pentynoylamido) benzoyl-L -phenylalanine, N-3- (4-pentynoylamido) benzoyl-L-tyrosine, N-3- (4-pentynoylamido) benzoyl-L-tryptophane, ⁇ -N-azidoacetyl-L-diaminopropanoic acid, ⁇ -N-azidoacetyl- Examples include L-diaminobutyric acid, ⁇ -N-azidoacetyl-L-ornithine, ⁇ -N-azido
  • the (C-1) amino acid, N- (4-aminomethyl-benzoyl ) -phenylalanine (AMB F), include 4-3-aminomethyltyrosine.
  • Examples of the amino acid (C-2) include 5-hydroxytryptophan (W OH ).
  • the cyclization method can be performed, for example, according to the method described in Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009), WO2008 / 117833.
  • amino acid (D-1) examples include 2-amino-6-chloro-hexynoic acid, 2-amino-7-chloro-heptynoic acid, 2-amino-8-chloro-octynoic acid, and the like.
  • amino acid (D-2) for example, cysteine, homocysteine, mercaptonorvaline, mercaptonorleucine, 2-amino-7-mercaptoheptanoic acid, 2-amino-8-mercaptooctanoic acid, and the SH group of these amino acids are temporarily protected. And amino acids whose protective groups have been deprotected, and D-amino acid derivatives corresponding thereto.
  • the cyclization method can be performed, for example, according to the method described in WO2012 / 074129.
  • amino acid (E-1) examples include N-3-chloromethylbenzoyl-L-phenylalanine, N-3-chloromethylbenzoyl-L-tyrosine, and N-3-chloromethylbenzoyl-L-tryptophane.
  • amino acid (E-2) for example, cysteine, homocysteine, mercaptonorvaline, mercaptonorleucine, 2-amino-7-mercaptoheptanoic acid, 2-amino-8-mercaptooctanoic acid, and the SH group of these amino acids are temporarily protected. And amino acids whose protective groups have been deprotected, and D-amino acid derivatives corresponding thereto.
  • amino acids (A-1) to (E-2) can be introduced into the hemagglutinin-binding peptide according to a known method, either by chemical synthesis described later or by translational synthesis.
  • hemagglutinin-binding peptide of the present invention can include a cyclic peptide having the following amino acid sequence.
  • hemagglutinin refers to an antigenic glycoprotein present on the surface of many bacteria and viruses including influenza virus, and is represented as “HA”. Hemagglutinin is involved in the process of virus attachment to host cells. Specifically, when hemagglutinin on the surface of the virus binds to sialic acid on the surface of the target host cell, the virus is encapsulated in the cell membrane and taken up into the cell in the form of endosomes containing the virus. Subsequently, the endosomal membrane and the viral membrane fuse, the viral genome is inserted into the cell, and proliferation begins. Hemagglutinin has at least 16 subtypes and is called H1 to H16. The influenza subtype name H indicates hemagglutinin.
  • the peptide of the present invention can be produced by a known peptide production method such as a liquid phase method, a solid phase method, a chemical synthesis method such as a hybrid method combining a liquid phase method and a solid phase method;
  • the hydroxyl group of a resin having a hydroxyl group is esterified with the carboxy group of the first amino acid (usually the C-terminal amino acid of the target peptide) in which the ⁇ -amino group is protected with a protecting group.
  • known dehydration condensing agents such as 1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole (MSNT), dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIPCDI) and the like can be used.
  • the ⁇ -amino group protecting group of the first amino acid is removed, and a second amino acid in which all functional groups other than the carboxy group of the main chain are protected is added to activate the carboxy group.
  • a second amino acid in which all functional groups other than the carboxy group of the main chain are protected is added to activate the carboxy group.
  • Combining the first and second amino acids is performed.
  • the ⁇ -amino group of the second amino acid is deprotected
  • a third amino acid in which all functional groups other than the carboxy group of the main chain are protected is added, the carboxy group is activated, and the second and Bind a third amino acid. This is repeated, and when a peptide having a desired length is synthesized, all functional groups are deprotected.
  • Resins for solid phase synthesis include Merrifield resin, MBHA resin, Cl-Trt resin, SASRIN resin, Wang resin, Rink amide resin, HMFS resin, Amino-PEGA resin (Merck), HMPA-PEGA resin (Merck) Is mentioned. These resins can be used after being washed with a solvent (dimethylformamide (DMF), 2-propanol, methylene chloride, etc.).
  • a solvent dimethylformamide (DMF), 2-propanol, methylene chloride, etc.
  • Protecting groups for ⁇ -amino groups include benzyloxycarbonyl (Cbz or Z) group, tert-butoxycarbonyl (Boc) group, fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group, benzyl group, allyl group, allyloxycarbonyl (Alloc). ) Group and the like.
  • the Cbz group can be deprotected by hydrofluoric acid, hydrogenation, etc.
  • the Boc group can be deprotected by trifluoroacetic acid (TFA)
  • the Fmoc group can be deprotected by treatment with piperidine.
  • methyl ester, ethyl ester, benzyl ester, tert-butyl ester, cyclohexyl ester and the like can be used.
  • the hydroxy group of serine or threonine can be protected with a benzyl group or a tert-butyl group, and the hydroxy group of tyrosine is protected with a 2-bromobenzyloxycarbonyl dilute or tert-butyl group.
  • the amino group of the lysine side chain and the carboxy group of glutamic acid or aspartic acid can be protected in the same manner as the ⁇ -amino group and ⁇ -carboxy group.
  • the activation of the carboxy group can be performed using a condensing agent.
  • the condensing agent include dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIPCDI), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC or WSC), (1H-benzotriazol-1-yloxy) tris.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DIPCDI diisopropylcarbodiimide
  • EDC or WSC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • (1H-benzotriazol-1-yloxy) tris (Dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP), 1- [bis (dimethylamino) methyl] -1H-benzotriazolium-3-oxide hexafluorophosphate
  • the cleavage of the peptide chain from the resin can be carried out by treatment with an acid such as TFA or hydrogen fluoride (HF).
  • an acid such as TFA or hydrogen fluoride (HF).
  • Production of a peptide by a genetic recombination method can be performed using a nucleic acid encoding the peptide of the present invention.
  • the nucleic acid encoding the peptide of the present invention may be DNA or RNA.
  • the nucleic acid encoding the peptide of the present invention can be prepared by a known method or a method analogous thereto. For example, it can be synthesized by an automatic synthesizer.
  • a restriction enzyme recognition site may be added, or a base sequence encoding an amino acid sequence for cutting out the resulting peptide chain with an enzyme or the like may be incorporated.
  • the nucleic acid when the peptide of the present invention is fused with a membrane-permeable peptide or the like, the nucleic acid includes a nucleic acid encoding the membrane-permeable peptide.
  • a chimeric protein expression method in which the target peptide is expressed as a chimeric peptide with another peptide can also be used.
  • the nucleic acid a nucleic acid encoding a target peptide and a peptide that binds to the peptide is used as the nucleic acid.
  • an expression vector is prepared using a nucleic acid encoding the peptide of the present invention.
  • the nucleic acid can be inserted downstream of the promoter of the expression vector, as it is, after digestion with a restriction enzyme, or by adding a linker.
  • Examples of vectors include E.
  • coli-derived plasmids pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19, pUC118, pBluescript II, etc.), Bacillus subtilis-derived plasmids (pUB110, pTP5, pC1912, pTP4, pE194, pC194 etc.), yeast-derived plasmids ( pSH19, pSH15, YEp, YRp, YIp, YAC, etc., bacteriophage (e phage, M13 phage, etc.), virus (retrovirus, vaccinia virus, adenovirus, adeno-associated virus (AAV), cauliflower mosaic virus, tobacco mosaic virus , Baculovirus, etc.) and cosmids.
  • Bacillus subtilis-derived plasmids pUB110, pTP5, pC1912, pTP4, pE194, pC194 etc
  • the promoter can be appropriately selected depending on the type of host.
  • a promoter derived from SV40 simian virus 40
  • CMV cytomegalovirus
  • E. coli trp promoter, T7 promoter, lac promoter, etc.
  • Expression vector encodes DNA replication origin (ori), selection marker (antibiotic resistance, auxotrophy, etc.), enhancer, splicing signal, poly A addition signal, tag (FLAG, HA, GST, GFP, etc.) It is also possible to incorporate nucleic acid or the like.
  • an appropriate host cell is transformed with the expression vector.
  • the host can be appropriately selected in relation to the vector.
  • Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus sp.), Yeast, insects or insect cells, animal cells and the like are used.
  • animal cells for example, HEK293T cells, CHO cells, COS cells, myeloma cells, HeLa cells, and Vero cells can be used. Transformation can be performed according to a known method such as a lipofection method, a calcium phosphate method, an electroporation method, a microinjection method, or a particle gun method, depending on the type of host.
  • the desired peptide is expressed by culturing the transformant according to a conventional method.
  • peptide purification from transformant cultures cultured cells are collected, suspended in an appropriate buffer, disrupted by sonication, freeze-thawing, etc., and roughly extracted by centrifugation or filtration. Obtain a liquid.
  • the peptide is secreted into the culture solution, the supernatant is collected.
  • Purification from a crude extract or culture supernatant is a known method or a method equivalent thereto (for example, salting out, dialysis method, ultrafiltration method, gel filtration method, SDS-PAGE method, ion exchange chromatography, affinity chromatography, Reversed phase high performance liquid chromatography).
  • the obtained peptide may be converted from a free form to a salt or from a salt to a free form by a known method or a method analogous thereto.
  • the translation synthesis system may be a cell-free translation system.
  • Cell-free translation systems include, for example, ribosomal proteins, aminoacyl tRNA synthetases (ARS), ribosomal RNA, amino acids, rRNA, GTP, ATP, translation initiation factor (IF) elongation factor (EF), termination factor (RF), and ribosome Includes regeneration factor (RRF), as well as other factors required for translation.
  • ARS aminoacyl tRNA synthetases
  • ribosomal RNA amino acids
  • rRNA GTP
  • ATP translation initiation factor
  • EF elongation factor
  • RF termination factor
  • RRF ribosome Includes regeneration factor
  • an Escherichia coli extract or a wheat germ extract may be added.
  • a rabbit erythrocyte extract or an insect cell extract may be added.
  • RNA polymerase RNA polymerase
  • E. coli-derived systems such as RTS-100 (registered trademark) from Roche Diagnostics, PURESYSTEM (registered trademark) from PGI, etc.
  • RTS-100 registered trademark
  • PURESYSTEM registered trademark
  • wheat germ extracts for example, those from Zoigene or Cell Free Science can be used.
  • the expression product can be obtained in a highly purified form without purification.
  • an artificial aminoacyl tRNA in which a desired amino acid or hydroxy acid is linked (acylated) to a tRNA may be used instead of the aminoacyl tRNA synthesized by a natural aminoacyl tRNA synthetase.
  • Such aminoacyl-tRNA can be synthesized using an artificial ribozyme.
  • Such ribozymes include flexizyme (H. Murakami, H. Saito, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 655-662; H. Murakami, D. Kourouklis, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 1077-1084; H. Murakami, A. Ohta, H.
  • Flexizyme is also known by the name of the original flexizyme (Fx) and dinitrobenzyl flexizyme modified from this (dFx), enhanced flexizyme (eFx), amino flexizyme (aFx) and the like.
  • the desired codon can be translated in association with the desired amino acid or hydroxy acid by using the tRNA to which the desired amino acid or hydroxy acid is linked, generated by flexizyme.
  • Special amino acids may be used as the desired amino acids.
  • unnatural amino acids necessary for the cyclization described above can also be introduced into hemagglutinin-binding peptides by this method.
  • influenza refers to an acute infection caused by an influenza virus. Infection causes cold-like symptoms with high fever and muscle pain in humans. It may be accompanied by gastrointestinal symptoms such as abdominal pain, vomiting, and diarrhea. Complications include pneumonia and influenza encephalopathy.
  • infection is used as a term indicating either a process in which a virus enters a living body through skin or mucous membrane, or a process in which a virus enters a cell by membrane fusion.
  • viral infection in this specification refers to a state in which a virus has entered a living body regardless of the presence or absence of symptoms.
  • the treatment or prevention of influenza is used in its broadest sense, for example, alleviation or prevention of one or more symptoms associated with influenza virus infection, suppression of the occurrence of symptoms after infection. Inhibiting (delaying or stopping) infection of cells with a virus in vivo, preventing growth (delaying or stopping) of virus in vivo, reducing the number of viruses in the living body, and the like. When showing at least one of these effects, it is judged useful for the treatment or prevention of influenza. Moreover, since the peptide of this invention has the neutralization activity with respect to hemagglutinin as shown in the Example mentioned later, it is understood that the same effect as an influenza vaccine can be acquired.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and may be orally or parenterally administered.
  • Parenteral administration includes, for example, intramuscular injection, intravenous injection, subcutaneous injection, transdermal administration, transmucosal administration (nasal, oral cavity, ocular, pulmonary, vaginal, transrectal) administration. Etc. are raised.
  • the pharmaceutical composition can be variously modified in view of the property that the polypeptide is easily metabolized and excreted. For example, polyethylene glycol (PEG) or a sugar chain can be added to a polypeptide to increase the residence time in blood and reduce antigenicity.
  • PEG polyethylene glycol
  • a sugar chain can be added to a polypeptide to increase the residence time in blood and reduce antigenicity.
  • biodegradable polymer compounds such as polylactic acid / glycol (PLGA), porous hydroxyapatite, liposomes, surface modified liposomes, emulsions prepared with unsaturated fatty acids, nanoparticles, nanospheres, etc. are sustained release bases It may be used as a polypeptide.
  • PLGA polylactic acid / glycol
  • porous hydroxyapatite hydroxyapatite
  • liposomes liposomes
  • surface modified liposomes emulsions prepared with unsaturated fatty acids
  • nanoparticles nanospheres, etc.
  • emulsions prepared with unsaturated fatty acids nanoparticles, nanospheres, etc.
  • emulsions prepared with unsaturated fatty acids nanoparticles, nanospheres, etc.
  • emulsions prepared with unsaturated fatty acids nanoparticles, nanospheres, etc.
  • emulsions prepared with unsaturated fatty acids nanoparticles, nanospheres,
  • the above-mentioned pharmaceutical composition may be used as it is, or may be formulated by adding pharmaceutically acceptable carriers, excipients, additives and the like.
  • the dosage form include liquids (for example, injections), dispersions, suspensions, tablets, pills, powders, suppositories, powders, fine granules, granules, capsules, syrups, lozenges, Examples include inhalants, ointments, eye drops, nasal drops, ear drops, and poultices.
  • Formulation includes, for example, excipients, binders, disintegrants, lubricants, solubilizers, solubilizers, colorants, flavoring agents, stabilizers, emulsifiers, absorption enhancers, surfactants, pH adjustments It can be carried out by a conventional method using an agent, preservative, antioxidant and the like as appropriate.
  • ingredients used for formulation include purified water, saline, phosphate buffer, dextrose, glycerol, ethanol and other pharmaceutically acceptable organic solvents, animal and vegetable oils, lactose, mannitol, glucose, sorbitol, crystalline cellulose , Hydroxypropyl cellulose, starch, corn starch, silicic anhydride, magnesium magnesium silicate, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethyl cellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch , Pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, tragacanth, casein, agar, polyethylene glycol, diglyse Emissions, glycerine, propylene glycol, vaseline, paraffin, octyldodecyl myristate, isopropyl myristate
  • the pharmaceutical composition can contain an absorption enhancer that improves the absorption of the poorly absorbable drug.
  • absorption promoters include surfactants such as polyoxyethylene lauryl ethers, sodium lauryl sulfate, and saponin; bile salts such as glycocholic acid, deoxycholic acid, and taurocholic acid; chelating agents such as EDTA and salicylic acids; Fatty acids such as caproic acid, capric acid, lauric acid, oleic acid, linoleic acid, mixed micelles; enamine derivatives, N-acyl collagen peptides, N-acyl amino acids, cyclodextrins, chitosans, nitric oxide donors, etc. Can be used.
  • Pills or tablets can also be coated with sugar coatings, gastric and enteric substances.
  • the injection can contain distilled water for injection, physiological saline, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil, alcohols and the like.
  • wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers, solubilizers, solubilizers, preservatives and the like can be added.
  • the dosage is the symptoms, patient age, sex, It varies depending on body weight, sensitivity difference, administration method, administration interval, active ingredient type, formulation type, and is not particularly limited. For example, 30 ⁇ g to 100 g, 100 ⁇ g to 500 mg, 100 ⁇ g to 100 mg are administered in one or several divided doses can do. In the case of injection administration, 1 ⁇ g / kg to 3000 ⁇ g / kg, 3 ⁇ g / kg to 1000 ⁇ g / kg may be administered once or divided into several times depending on the body weight of the patient.
  • the method for preventing or treating influenza using the peptide of the present invention can be carried out with reference to the description of the pharmaceutical composition.
  • the present invention also includes an influenza virus detection agent comprising the peptide of the present invention.
  • the peptide of the present invention specifically binds to hemagglutinin on the surface of influenza virus. Therefore, for example, instead of an anti-influenza antibody in an immunoassay such as an ELISA method, an influenza virus in a sample can be detected using the peptide of the present invention.
  • an influenza virus in a sample can be detected using the peptide of the present invention.
  • the peptide of the present invention may be detectably labeled.
  • Peptide labels include, for example, enzymes such as peroxidase and alkaline phosphatase, radioactive materials such as 125 I, 131 I, 35 S, and 3 H, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dansyl chloride, phycoerythrin, tetramethylrhodamine isothiocyanate, near red
  • an antibody labeled with a fluorescent substance such as an external fluorescent material, or a luminescent substance such as luciferase, luciferin, or aequorin is used.
  • antibodies labeled with nanoparticles such as colloidal gold and quantum dots can also be detected.
  • the peptide of the present invention can be detected by labeling with biotin and binding avidin or streptavidin labeled with an enzyme or the like.
  • an ELISA method using an enzyme label is preferable because it can easily and quickly measure an antigen.
  • an antibody that specifically recognizes a portion other than hemagglutinin of influenza virus is immobilized on a solid phase carrier, a sample is added and reacted, and then the labeled peptide of the present invention is added and reacted. After washing, reaction with an enzyme substrate, color development, and measurement of absorbance can detect influenza virus.
  • an unlabeled peptide of the present invention may be added, and an antibody against the peptide of the present invention may be enzyme-labeled and further added.
  • an enzyme substrate when the enzyme is peroxidase, 3,3′-diaminobenzidine (DAB), 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB), o-phenylenediamine (OPD), or the like can be used.
  • Alkaline phosphatase In this case, p-nitrophenyl phosphate (NPP) or the like can be used.
  • the “solid phase carrier” is not particularly limited as long as it can immobilize the antibody, and is made of a microtiter plate made of glass, metal or resin, substrate, beads, nitrocellulose membrane, nylon membrane, PVDF. Examples include a membrane, and the target substance can be immobilized on these solid phase carriers according to a known method.
  • the test kit according to the present invention includes reagents and instruments necessary for the above detection (including but not limited to the peptide, antibody, solid phase carrier, buffer solution, enzyme reaction stop solution, microplate reader, etc. of the present invention). including.
  • Example 1 [Chemical synthesis of special cyclic peptides that bind to hemagglutinin 1]
  • a hemagglutinin-binding peptide was identified by the same screening method as in Patent Document 3.
  • Peptide synthesis was performed using an automatic synthesizer SyroI (Biotage Japan) according to a general solid phase synthesis method using a 9-fluorenylmethoxycarbonyl group (Fmoc group) as a protective group for the ⁇ -amino group.
  • Rink Amide AM resin (Novabiochem) was added to the chip for synthesis and protected with 2- (1H-benzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) and Fmoc group Amino acids (both Novabiochem) were reacted sequentially. After linking N-terminal tryptophan to remove Fmoc, 6 equivalents of chloroacetyl N-hydroxysuccinate dissolved in 1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP; Nacalai Tesuque) was added and allowed to stand for 1 hour.
  • NMP 1-methyl-2-pyrrolidinone
  • the obtained peptide resin was washed three times with N, N-dimethylformamide (DMF; Nacalai Tesuque) and methylene chloride, dried, and a mixture of trifluoroacetic acid-water-triisopropylsilane (90: 5 by volume): 5) was added and stirred at room temperature for 2 hours.
  • the crude peptide cleaved by ether precipitation was recovered, washed twice with diethyl ether and dried, and then added with an 80% aqueous DMSO solution containing 125 mM trishydroxymethylaminomethane to a final concentration of 10 mM. For 1 hour.
  • the cyclic peptide solution was acidified and filtered, and the target product was purified by reverse phase high performance liquid chromatography using a C4 column (Cosmosil AR300 5C 4 (10 ⁇ 250 mm, Nacalai Tesuque)). Water-acetonitrile containing fluoroacetic acid was used, and the resulting peptide was identified by MALDI-TOF-MS using Autoflex II (Bruker Daltonics).
  • iHA-24 As a positive control, the following iHA-24 cyclic peptide (Patent Document 3) was used.
  • iHA-24 (annular) Cyclo Ac-Trp-Trp-Leu-Asp-Pro-Tyr-Trp-Leu-Thr-Trp-Tyr-Thr-Cys) -Gly-amide (SEQ ID NO: 15)
  • Example 2 [Evaluation of peptide activity against influenza virus] 1.
  • the peptide and the influenza virus were first mixed, and then a test was conducted in which the mixture was brought into contact with the cells. Specific test methods are shown below. 1) Three days before the assay, MDCK cells were seeded at 2 ⁇ 10 5 cells / well in 6-well plates. 2) On the day before infection with influenza virus, the cells were pretreated by exchanging with a cell culture medium containing 0.01 ⁇ M, 0.1 ⁇ M and 1 ⁇ M of each peptide.
  • Neutralization + Inhibition activity The neutralization activity was evaluated by the above-described method, and a growth inhibitory activity was also evaluated by adding a peptide or an anti-influenza drug to the agarose gel. Specific test methods are shown below. 1) Three days before the assay, MDCK cells were seeded at 2 ⁇ 10 5 cells / well in 6-well plates. 2) On the day before infection with influenza virus, the cells were pretreated by exchanging with a cell culture medium containing 0.01 ⁇ M, 0.1 ⁇ M and 1 ⁇ M of each peptide.
  • FIG. 1 shows the results of evaluation of peptide neutralization activity and neutralization + growth inhibition activity using H5N1 Vac-3 as influenza virus.
  • iHA-100 to 103 the number of plaques decreased in a dose-dependent manner.
  • iHA-100, 102 and 103 were significantly higher than the positive control iHA-24, and an antiviral effect comparable to that of zanamivir (trade name Relenza) was observed.
  • the amount of virus used was confirmed by performing back-titration (Back in the figure), but it was a predetermined amount of virus.
  • FIG. 4 shows the results of evaluating the neutralizing activity and neutralizing + growth inhibitory activity of the peptides against the influenza virus H2N2-Adachi strain as well as the inhibition and neutralizing activity against the influenza virus H2N2-Adachi strain.
  • iHA-100 the number of plaques decreased in a dose-dependent manner compared with iHA-24, and an antiviral effect comparable to that of zanamivir (trade name Relenza) was observed.
  • Example 3 [Comparison of therapeutic effects of special cyclic peptide iHA-100 and Zanamivir]
  • iHA-100 cyclic peptide and zanamivir were administered to mice, and the lethality due to virus infection was examined.
  • the results are shown in FIGS.
  • the lethality of iHA-100 also decreased in the group (iHA-100 6-10 dpi) in which administration was started 6 days after infection.
  • the zanamivir administration group (FIG. 7) dead individuals were observed even when administration was started 2 days after infection, and no therapeutic effect was obtained after the 4th day (FIG. 7).
  • Example 4 [Chemical synthesis of special cyclic peptides that bind to hemagglutinin 2] Using the same method as in Example 1, the following peptide in which iHA-100 (SEQ ID NO: 6) was modified was synthesized.
  • iHA-100-D4K ClAc- Trp-Thr-MeGly-Lys-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg-Cys-amide SEQ ID NO: 16
  • iHA-100-S7A ClAc- Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ala-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg-Cys-amide SEQ ID NO: 17
  • iHA-100-S7K ClAc- Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Lys-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg-Cys-amide SEQ ID NO: 18
  • iHA-100-D4K Cyclo (Ac-Trp-Thr-MeGly-Lys-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg-Cys) -amide (SEQ ID NO: 26); iHA-100-S7A Cyclo (Ac-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ala-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg-Cys) -amide (SEQ ID NO: 27); iHA-100-S7K Cyclo (Ac-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Lys-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg-Cys) -
  • Example 6 [Evaluation of peptide activity against influenza virus 2] IHA-100, iHA-100-D4K, iHA-100-S7A, iHA-100-S7K, iHA-100-S7E, iHA-100-R14A, iHA-100-R14E, iHA-100- synthesized in Example 4 The growth inhibitory activity of each peptide against influenza virus was evaluated by plaque assay using cyclic peptides of R14K, iHA-100-R14Dap and iHA-100-COOH.
  • the test was also performed with the contents of 0.03 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.003 ⁇ M, 0.001 ⁇ M, 0.0003 ⁇ M, and 0.0001 ⁇ M.
  • the results are shown in FIG.
  • the number of plaques decreased in a dose-dependent manner.
  • iHA-100-R14A, iHA-100-R14E and iHA-100-R14Dap show high antiviral effects, and in particular, iHA-100-R14A and iHA-100-R14Dap are highly antiviral even at low concentrations. The effect was seen.

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Abstract

　本発明は、既存のペプチドのよりも高い抗インフルエンザウイルス効果が得られるヘマグルチニン結合ペプチドを提供することを課題とする。本発明は、以下の(i)から(iv)のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むヘマグルチニン結合ペプチド等を提供する：　(i) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg（配列番号：１）；　(ii) Arg-Val-Ser-MePhe-Thr-Tyr-MePhe-MeSer-Tyr-Thr-Pro-Ser（配列番号：２）；　(iii) 配列番号：１又は２において、1又は数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているアミノ酸配列；及び　(iv) 配列番号：１又は２と90％以上配列同一性を有するアミノ酸配列。

Description

ヘマグルチニン結合ペプチド
　本出願は、２０１４年１０月２４日に出願された日本国特許出願第２０１４－２１７５８２号に基づく優先権を主張するものであり、その内容はここに参照として組み込まれる。
　本発明は、抗インフルエンザウイルス活性を有するヘマグルチニン結合ペプチド等に関する。
　新型インフルエンザウイルスの発生と拡大は歴史的に人類に大きな被害をもたらしており、現在においても高病原性鳥インフルエンザなどはヒトからヒトに感染するウイルスに変異した場合に大きな脅威となることが予想されている。
　インフルエンザウイルスは、エンベロープをもつＲＮＡウイルスであり、核タンパク質（ＮＰ）及びマトリックスタンパク質（Ｍ）の抗原性により、Ａ、Ｂ、Ｃ型に分類される。ヒトでの流行は主にＡ型及びＢ型である。
　Ａ、Ｂ、Ｃといった型が同じであっても、エンベロープ表面上の分子であるヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）の抗原性の違いから、さらに複数の亜型に分類され、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１等と表される。
　既存の抗インフルエンザ薬として、ザナミビル（リレンザ（登録商標））（例えば特許文献１）やオセルタミビル（タミフル（登録商標））（例えば、特許文献２）が広く用いられている。
　ザナミビルやオセルタミビルは、インフルエンザウイルスが感染細胞から他の細胞に感染する際に必要となるノイラミニダーゼの活性を抑えることで作用する。さらに他の作用機序を持つ抗インフルエンザ薬としてマトリックスタンパク質２（Ｍ２タンパク質）を標的とするアマンタジン、リマンタジンがあり、細胞感染後のウイルスの脱殻を阻害する。
　ノイラミニダーゼあるいはＭ２タンパク質の機能を阻害するこれらの薬剤は、酵素やイオンチャネルを標的とする他の薬剤と同様に、基質からの誘導体化や立体構造に基づく分子設計、あるいは既存化合物からの機能の発見などの過程を経て開発されている。すなわち生体に存在する分子の類縁体あるいは化学的に調製された低分子に属する。
　しかしながら、Ｍ２タンパク質阻害薬は、Ａ型インフルエンザにしか有効でなく、ノイラミニダーゼ阻害剤は、ノイラミニダーゼを有しないＣ型インフルエンザには奏功しない。
　また、抗ウイルス薬は変異によるウイルスの薬剤耐性の獲得により効力に限界が生じるのが一般的であり、ザナミビル、オセルタミビル、アマンタジンなど投与実績の多い抗インフルエンザウイルス薬においても耐性ウイルスの出現が認められている。ウイルスの薬剤耐性の獲得は標的分子の変異による薬剤の親和性の低下によるものの他に、異なる分子の変異による増殖力の回復という間接的な機構によるものもあり、長期にわたって耐性の獲得を完全に回避できる薬剤を創製することは困難である。
　本発明者らは、これまでに、ヘマグルチニンに結合することにより、インフルエンザウイルスに対する阻害活性を示すペプチドを見出した（特許文献３）。
米国特許第５３６０８１７号 米国特許第５７６３４８３号 特開２０１３－０７１９０４号公報
　これまで、ヘマグルチニンを標的とする抗インフルエンザウイルス薬は汎用されていないため、かかるペプチド薬は、ノイラミニダーゼ阻害剤やＭ２タンパク質阻害剤に耐性を有するインフルエンザウイルスにも抗ウイルス効果を示すと考えられる。しかしながら、さらに抗インフルエンザウイルス効果が高いヘマグルチニン結合ペプチドが求められている。
　また、これまでの抗インフルエンザウイルス薬は、感染初期に服用しなければ効果が得られないものが多く、感染から数日後に服用しても効果が得られる医薬が求められている。
　このような背景のもと、本発明は、高い抗インフルエンザウイルス効果が得られるヘマグルチニン結合ペプチドを提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を進めた結果、抗インフルエンザウイルス効果が著しく高いペプチドを見出した。そして、これらのペプチドの中に、感染から一定時間経過後に投与しても十分な抗インフルエンザウイルス効果が得られるものがあることを確認し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、
〔１〕以下の(i)から(iv)のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むヘマグルチニン結合ペプチド：
　(i) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg（配列番号：１）；
　(ii) Arg-Val-Ser-MePhe-Thr-Tyr-MePhe-MeSer-Tyr-Thr-Pro-Ser（配列番号：２）；
　(iii) 配列番号：１又は２において、1又は数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているアミノ酸配列；及び
　(iv) 配列番号：１又は２と90％以上配列同一性を有するアミノ酸配列；
〔２〕〔１〕に記載のヘマグルチニン結合ペプチドであって、以下の(v)から(vii)のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むヘマグルチニン結合ペプチド：
　(v) 配列番号：１において、３位、６位、１２位及び１３位から選択されるアミノ酸のうち１又は数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているアミノ酸配列；
　(vi) 配列番号：１において、３位、６位、及び１３位から選択されるアミノ酸のうち１又は数個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列；及び
　(vii) 配列番号：１において、１３位のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列；
〔３〕
　以下の(viii)から(xviii)のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むヘマグルチニン結合ペプチド：
　(viii) Thr-MeGly-Lys-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg（配列番号：３６）；
　(ix) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ala-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg（配列番号：３７）；
　(x) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Lys-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg（配列番号：３８）；
　(xi) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Glu-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg（配列番号：３９）；
　(xii) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Hyp-Arg（配列番号：４０）；
　(xiii) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Ala（配列番号：４１）；
　(xiv) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Glu（配列番号：４２）；
　(xv) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Lys（配列番号：４３）；
　(xvi) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Dap（配列番号：４４）；
　(xvii) 配列番号：３６～４４のいずれかにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているアミノ酸配列；及び
　(xviii) 配列番号：３６～４４のいずれかと９０％以上配列同一性を有するアミノ酸配列；
〔４〕下記式（Ｉ）のアミノ酸配列を含むヘマグルチニン結合ペプチド：
　(i) Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13（配列番号：３）（Ｉ）
　（式中、
　Xaa1は、Ser又はThrであり、
　Xaa2は、N-メチルアミノ酸であり、
　Xaa3は、任意のアミノ酸であり、
　Xaa4は、塩基性アミノ酸であり、
　Xaa5は、Valであり、
　Xaa6は、塩基性アミノ酸であり、
　Xaa7は、Tyrであり
　Xaa8は、Ser又はThrであり、
　Xaa9は、Valであり、
　Xaa10は、MePheであり、
　Xaa11は、Asnであり、
　Xaa12は、MeAlaであり、
　Xaa13は、Val又はSerである。）；
〔５〕Xaa2は、MePhe又はMeGlyであり、
　Xaa3は、MeGly又はThrであり、
　Xaa4は、Hisであり、
　Xaa6は、His又はArgである、上記〔４〕に記載のヘマグルチニン結合ペプチド；
〔６〕Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13が、
　Ser-MePhe-MeGly-His-Val-His-Tyr-Ser-Val-MePhe-Asn-MeAla-Val、又は、
　Thr-MeGly-Thr-His-Val-Arg-Tyr-Thr-Val-MePhe-Asn-MeAla-Ser
である、上記〔４〕又は〔５〕に記載のヘマグルチニン結合ペプチド；
〔７〕環状化している、上記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載のヘマグルチニン結合ペプチド；
〔８〕Ｎ末端から3アミノ酸以内にクロロアセチル化アミノ酸を有し、Ｃ末端から3アミノ酸以内にシステインを有する、上記〔７〕に記載のヘマグルチニン結合ペプチド；
〔９〕N末端にクロロアセチル－Trpを含み、C末端にCysを含み、これらのチオエーテル結合により環状化している、上記〔７〕に記載のヘマグルチニン結合ペプチド；
〔１０－１〕上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載のヘマグルチニン結合ペプチドを含む、インフルエンザの予防又は治療のための医薬組成物；
〔１０－２〕有効量の上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載のヘマグルチニン結合ペプチドを投与することを含む、インフルエンザの予防又は治療方法；
〔１１〕上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載のヘマグルチニン結合ペプチドを含む、インフルエンザウイルス検出薬；
〔１２〕上記〔１１〕に記載のインフルエンザ検出薬を含む、インフルエンザウイルス検出用キット、
に関する。
　本発明のペプチドは、ヘマグルチニンに結合することによりインフルエンザウイルスに対する高い阻害活性を示すので、ノイラミニダーゼ阻害剤やＭ２タンパク質阻害剤に耐性を有するインフルエンザウイルスに対しても抗ウイルス効果を有する。
　また、本発明のペプチドを、ノイラミニダーゼやＭ２タンパク質等を標的とする薬剤と組み合わせることにより、薬剤耐性変異体が出現する確率をより低くすることができるものと考えられる。
　さらに、本発明に係るペプチドは、感染から一定時間経過後に投与しても十分な抗インフルエンザウイルス効果が得られるので、インフルエンザの治療薬として有用性が高い。
図１は、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１－Ｖａｃ３に対する、本発明のペプチドによる増殖阻害試験の結果を示すプレートの写真である（実施例２）。 図２は、高病原性トリインフルエンザウイルスA/ws/Hokkaido/1/08 (clade 2.3)、A/ws/Mongolia/3/05(clade 2.2)、A/Vietnam/UT3040/04(clade 1)に対する、本発明のペプチドによる増殖阻害試験の結果を示すプレートの写真である（実施例２）。 図３は、インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１－ｐｄｍ２６１９に対する、本発明のペプチドによる増殖阻害試験の結果を示すプレートの写真である（実施例２）。 図４は、インフルエンザウイルスＨ２Ｎ２－Adachiに対する、本発明のペプチドによる増殖阻害試験の結果を示すプレートの写真である（実施例２）。 図５は、特殊環状ペプチドiHA-100とZanamivirの治療効果を判定するための実験概要である（実施例３）。 図６は、本発明のペプチドによる高病原性鳥インフルエンザウイルスH5N1 A/whooper swan/Hokkaido/1/08 (5x MLD50)に対する治療効果である（実施例３）。 図７は、Zanamivirによる高病原性鳥インフルエンザウイルスH5N1 A/whooper swan/Hokkaido/1/08 (5x MLD50)に対する治療効果を示す（実施例３）。 インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１－Ｖａｃ３に対する、本発明のペプチドによる増殖阻害試験の結果を示すプレートの写真である（実施例５）。
（ペプチド）
　本発明に係るヘマグルチニン結合ペプチドの一態様は、以下の(i)～(iv)のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
　(i) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg（配列番号：１）；
　(ii) Arg-Val-Ser-MePhe-Thr-Tyr-MePhe-MeSer-Tyr-Thr-Pro-Ser（配列番号：２）；
　(iii) 配列番号：１又は２において、１又は数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているアミノ酸配列；及び
　(iv) 配列番号：１又は２と９０％以上配列同一性を有するアミノ酸配列。
　本発明に係るヘマグルチニン結合ペプチドの一態様は、以下の(v)から(xviii)のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドも含む。
　(v) 配列番号：１において、３位、６位、１２位及び１３位から選択されるアミノ酸のうち１又は数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているアミノ酸配列；
　(vi) 配列番号：１において、３位、６位、及び１３位から選択されるアミノ酸のうち１又は数個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列；
　(vii) 配列番号：１において、１３位のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列；
　(viii) Thr-MeGly-Lys-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg（配列番号：３６）；
　(ix) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ala-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg（配列番号：３７）；
　(x) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Lys-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg（配列番号：３８）；
　(xi) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Glu-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg（配列番号：３９）；
　(xii) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Hyp-Arg（配列番号：４０）；
　(xiii) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Ala（配列番号：４１）；
　(xiv) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Glu（配列番号：４２）；
　(xv) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Lys（配列番号：４３）；
　(xvi) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Dap（配列番号：４４）；
　(xvii) 配列番号：３６～４４のいずれかにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているアミノ酸配列；及び
　(xviii) 配列番号：３６～４４のいずれかと９０％以上配列同一性を有するアミノ酸配列。
　式中、MeGlyはＮ－メチルグリシン、MePheはＮ－メチルフェニルアラニン、MeSerはＮ－メチルセリン、Dapは、２，３－ジアミノプロピオン酸を表す。
　一態様において、本発明に係るヘマグルチニン結合ペプチドは、インフルエンザウイルスの増殖に対する中和活性及び阻害活性が高いという観点から、配列番号４１、４２又は４４において１又は数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているアミノ酸配列；或いは配列番号４１、４２又は４４のいずれかと９０％以上配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことが好ましく、配列番号４１、４２又は４４を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことがより好ましい。
　本明細書においてポリペプチドは、２以上のアミノ酸がペプチド結合で結合しているものをいい、例えば、８－３０アミノ酸がペプチド結合したものとすることができ、直鎖状であっても環状であってもよい。
　本明細書において「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、その誘導体や人工のアミノ酸を含む。誘導体としては、例えば、タンパク質を構成する天然アミノ酸が修飾されたアミノ酸も含む。そのようなアミノ酸の例としては、ヒドロキシル基が導入されたアミノ酸であるヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン等、アミノ基が導入されたアミノ酸であるジアミノプロピオン酸等が挙げられる。
　本明細書においてアミノ酸としては、天然タンパク性Ｌ－アミノ酸；非天然アミノ酸；アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられる。非天然アミノ酸の例として、主鎖の構造が天然型と異なる、α，α－二置換アミノ酸（α－メチルアラニンなど）、Ｎ－アルキル－α－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、α－ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジンなど）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられるがこれに限定されない。
　本明細書においては、生細胞におけるリボソーム上で翻訳合成に用いられる２０種類の天然型アミノ酸以外のアミノ酸、即ち、以下の（１）～（３）に該当するアミノ酸を「特殊アミノ酸」と呼ぶ場合がある。
　（１）翻訳合成された後に修飾を受けたポリペプチド上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸（例えば、リン酸化チロシン、アセチル化リジン、ファルネシル化システイン）
　（２）リボソーム上での翻訳合成には用いられないが天然に存在するアミノ酸
　（３）天然に存在しない人工アミノ酸（非天然型アミノ酸）
　特殊アミノ酸の例を下表に示すが、これらに限定されない。なお、表中ＤＢＥとＣＭＥは、特殊アミノ酸をフレキシザイムでｔＲＮＡに結合させるときのエステルの種類であり、ＤＢＥは、3,5-dinitrobenzyl esterを意味し、ＣＭＥは、cyanomethyl esterを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　上記(iii)及び(xvii)のペプチドは、配列番号１、２及び３６～４４のいずれかに記載のペプチドのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているペプチドであって、ヘマグルチニンと結合可能である限り、どのようなペプチドであってもよい。ヘマグルチニンと結合可能であるか否かは、当業者が公知の方法に従って確認することができる。
　本明細書において、「１又は数個のアミノ酸が欠失、付加、又は置換されているペプチド」という場合、欠失、付加、又は置換されるアミノ酸の個数は、そのペプチドが、ヘマグルチニンに対する結合能を維持する限り特に限定されないが、例えば、１～５個、１～３個、又は１～２個とすることができる。欠失、付加、置換される場所は、ペプチドの末端であっても、中間であってもよく、１ヶ所であっても２ヶ所以上であってもよい。
　上記(iv)及び(xviii)のペプチドは、配列番号：１、２及び３６～４４のいずれかと９０％以上配列同一性を有し、ヘマグルチニンと結合可能である限りどのようなペプチドであってもよい。配列同一性は、９５％以上又は９８％以上であってもよい。
　本発明に係るヘマグルチニン結合ペプチドの一態様は、上記(v)から(vii)のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。そのようなポリペプチドの具体例としては、例えば：
　配列番号：１において、１２位のアミノ酸がヒドロキシアミノ酸で置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド；
　配列番号：１において、１３位のアミノ酸が、塩基性アミノ酸で置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド；
　配列番号：１において、１３位のアミノ酸が、アルギニンより小さいアミノ酸で置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド；
等が挙げられる。
　ヒドロキシアミノ酸としては、例えば、セリン、トレオニン、チロシン、ヒドロキリプロリン、ヒドロキシリジン等が挙げられ、一態様において、例えばヒドロキシプロリンを置換に用いることができる。
　塩基性アミノ酸としては、例えば、アルギニン、リジン、シトルリン、オルニチン、クレアチン、ヒスチジン、ジアミノブタン酸、ジアミノプロピオン酸等が挙げられ、一態様において、例えば、リジン又はジアミノプロピオンを置換に用いることができる。
　アルギニンより小さいアミノ酸は、置換後の側鎖がアルギニンより短いアミノ酸であれば特に限定されず、例えば、アラニン、グルタミン酸及び２，３－ジアミノプロピオン酸から選択されるアミノ酸を置換に用いることができる。
　本発明に係るヘマグルチニン結合ペプチドの別の一態様は、下記式（Ｉ）アミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
　Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13（配列番号：３）（Ｉ）
　式中、
　Xaa1は、Ser又はThrであり、
　Xaa2は、N-メチルアミノ酸であり、
　Xaa3は、任意のアミノ酸であり、
　Xaa4は、塩基性アミノ酸であり、
　Xaa5は、Valであり、
　Xaa6は、塩基性アミノ酸であり、
　Xaa7は、Tyrであり
　Xaa8は、Ser又はThrであり、
　Xaa9は、Valであり、
　Xaa10は、MePheであり、
　Xaa11は、Asnであり、
　Xaa12は、MeAlaであり、
　Xaa13は、Val又はSerを表す。
　Xaa2は、MePhe又はMeGlyであってもよく、
　Xaa3は、MeGly又はThrであってもよく、
　Xaa4は、Hisであってもよく、
　Xaa6は、His又はArgであってもよい。
　さらに、式（Ｉ）で表されるポリペプチドは、
　Ser-MePhe-MeGly-His-Val-His-Tyr-Ser-Val-MePhe-Asn-MeAla-Val（配列番号：４）、又は、
　Thr-MeGly-Thr-His-Val-Arg-Tyr-Thr-Val-MePhe-Asn-MeAla-Ser（配列番号：５）
であってもよい。
　式中、MeAlaは、Ｎ－メチルアラニンを示す。
　本発明に係るヘマグルチニン結合ペプチドは、(i)から(xviii)のいずれかのアミノ酸配列のみ、又は式（Ｉ）のアミノ酸配列のみからなるぺプチドであってもよく、その少なくとも一端に１以上のアミノ酸が結合しているポリペプチドであってもよい。本発明に係るヘマグルチニン結合ペプチドの全長は、例えば３０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、又は１５アミノ酸以下とすることができる。
　本発明のペプチドは、本発明の課題を解決するものである限り、その種々の誘導体も包含する。かかる誘導体としては、例えば、そのＣ末端がアミド、エステル、カルボキシル基になっているもの、投与したときに細胞内に導入されるよう、膜透過性ペプチド（cell-penetrating peptide, ＣＰＰ）と融合させたものが挙げられる。ＣＰＰは、細胞膜への親和性、細胞内への移行性を有するペプチドの総称であり、ＨＩＶ－１ウイルスが発現するTrans-activator of transcription protein（ＴＡＴタンパク質）の１１個のアミノ酸からなるドメインであるprotein-transduction domain（ＰＴＤ）や、ショウジョウバエのAntennapedia、ヘルペスウイルス由来のVP22、オリゴアルギニン、ペネトラチンなどが知られている。一般に、ＣＰＰはアルギニン、リジン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸の含有率が高いものが多い。
　また、本発明のペプチドの誘導体としては、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニリル化、ＡＤＰリボシル化、糖鎖付加などの修飾が加えられたもの、他のペプチドやタンパク質との融合ペプチドも挙げられる。これらの誘導体は、公知の方法又はそれに準ずる方法で当業者が調製することができる。
　また、本発明に係るヘマグルチニン結合ペプチドは、本発明の課題を解決するものである限り、その塩も包含する。ペプチドの塩としては、生理学的に許容される塩基や酸との塩が用いられ、例えば、無機酸（塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等）の付加塩、有機酸（ｐ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ－ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等）の付加塩、無機塩基（水酸化アンモニウム又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等）、アミノ酸の付加塩等が挙げられる。
　また、本発明に係るヘマグルチニン結合ペプチドは、環状化（大環状化）されていてもよい。本明細書において環状化とは、１つのペプチド内において、１アミノ酸以上離れた２つのアミノ酸が直接に、又はリンカー等を介して間接的に結合し、分子内に環状の構造を作ることを意味する。
　環状化は、ジスルフィド結合、ペプチド結合、アルキル結合、アルケニル結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホネートエーテル結合、アゾ結合、Ｃ－Ｓ－Ｃ結合、Ｃ－Ｎ－Ｃ結合、Ｃ＝Ｎ－Ｃ結合、アミド結合、ラクタム架橋、カルバモイル結合、尿素結合、チオ尿素結合、アミン結合、チオアミド結合などによることができるが、これらに限定されない。
　ペプチドを環状化することにより、ペプチドの構造を安定化させ、標的への親和性を高めることができる場合がある。
　大環状化のためのアミノ酸は、例えば、以下の官能基１を有するアミノ酸と、対応する官能基２を有するアミノ酸とすることができる。官能基１と官能基２は、どちらがＮ末端側にきてもよい。官能基１を有するアミノ酸と官能基２を有するアミノ酸は、それぞれＮ末端又はＣ末端アミノ酸であってもよいし、非末端アミノ酸であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　式中、Ｘ1はＣｌ、Ｂｒ又はＩであり、Ａｒは置換基を有していてもよい芳香環である。
　（A－1）のアミノ酸としては、例えば、クロロアセチル化したアミノ酸を用いることができる。クロロアセチル化アミノ酸としては、N-chloroacetyl-L-alanine、N-chloroacetyl-L-phenylalanine、N-chloroacetyl-L-tyrosine、N-chloroacetyl-L-tryptophan、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-tryptophane、β-N-chloroacetyl-L-diaminopropanoic acid、γ-N-chloroacetyl-L-diaminobutyric acid、σ-N-chloroacetyl-L-ornithine、ε-N-chloroacetyl-L-lysine、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tyrosine、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tryptophane、及びこれらに対応するD-アミノ酸誘導体（例えば、N-Chloroacetyl-D-alanine、N-Chloroacetyl-D-phenylalanine、N-Chloroacetyl-D-tyrosine、N-Chloroacetyl-D-tryptophan）などが挙げられる。
　（A－2）のアミノ酸としては、例えばcysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、2-amino-8- mercaptooctanoic acid、及びこれらのアミノ酸のSH基をいったん保護しておいた後に保護基を脱保護したアミノ酸、及びこれらに対応するD-アミノ酸誘導体などが挙げられる。
　環状化方法は、例えば、Kawakami, T. et al., Nature Chemical Biology 5, 888-890 (2009)；Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009)；Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934 (2008)；Goto, Y. et al., ACS Chemical Biology 3, 120-129 (2008)；Kawakami T. et al, Chemistry & Biology 15, 32-42 (2008)、WO2008/117833に記載された方法に従って行うことができる。
　（B－1）のアミノ酸としては、例えば、propargylglycine、homopropargylglycine、2-amino-6-heptynoic acid、2-amino-7-octynoic acid、2-amino-8-nonynoic acidを用いることができる。また、4-pentynoyl化や5-hexynoyl化したアミノ酸を用いることもできる。4-pentynoyl化アミノ酸としては、N-(4-pentenoyl)-L-alanine、N-(4-pentenoyl)-L-phenylalanine、N-(4-pentenoyl)-L-tyrosine、N-(4-pentenoyl)-L-tryptophan、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tryptophane、β-N-(4-pentenoyl)-L-diaminopropanoic acid、γ-N-(4-pentenoyl)-L-diaminobutyric acid、σ-N-(4-pentenoyl)-L-ornithine、ε-N-(4-pentenoyl)-L-lysine、及びこれらに対応するD-アミノ酸誘導体などが挙げられる。
　（B－2）のアミノ酸としては、例えば、azidoalanine、2-amino-4-azidobutanoic acid、azidoptonorvaline、 azidonorleucine、2-amino-7-azidoheptanoic acid、2-amino-8-azidooctanoic acidを用いることができる。また、azidoacetyl化や3-azidopentanoyl化したアミノ酸を用いることもできる。azidoacetyl化アミノ酸としては、N-azidoacetyl-L-alanine、N-azidoacetyl-L-phenylalanine、N-azidoacetyl-L-tyrosine、N-azidoacetyl-L-tryptophan、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tryptophane、β-N-azidoacetyl-L-diaminopropanoic acid、γ-N-azidoacetyl-L-diaminobutyric acid、σ-N-azidoacetyl-L-ornithine、ε-N-azidoacetyl-L-lysine、及びこれらに対応するD-アミノ酸誘導体などが挙げられる。
　環状化方法は、例えば、Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934 (2008)、WO2008/117833に記載された方法に従って行うことができる。
　（C－1）のアミノ酸としては、N-(4-aminomethyl-benzoyl)-phenylalanine (AMBF)、4-3-aminomethyltyrosineが挙げられる。
　（C－2）のアミノ酸としては、5-hydroxytryptophan (WOH)が挙げられる。
　環状化方法は、例えば、Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009)、WO2008/117833に記載された方法に従って行うことができる。
　（D－1）のアミノ酸としては、例えば、2-amino-6-chloro-hexynoic acid、2-amino-7-chloro-heptynoic acid、2-amino-8-chloro-octynoic acid、などが挙げられる。
　（D－2）のアミノ酸としては、例えばcysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、2-amino-8- mercaptooctanoic acid、及びこれらのアミノ酸のSH基をいったん保護しておいた後に保護基を脱保護したアミノ酸、及びこれらに対応するD-アミノ酸誘導体などが挙げられる。
　環状化方法は、例えば、WO2012/074129に記載された方法に従って行うことができる。
　（E－1）のアミノ酸としては、例えば、N-3-chloromethylbenzoyl-L-phenylalanine、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tyrosine、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tryptophane、が挙げられる。
　（E－2）のアミノ酸としては、例えばcysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、2-amino-8- mercaptooctanoic acid、及びこれらのアミノ酸のSH基をいったん保護しておいた後に保護基を脱保護したアミノ酸、及びこれらに対応するD-アミノ酸誘導体などが挙げられる。
　（A－1）から（E－2）のアミノ酸は、後述する化学合成によっても、翻訳合成によっても、公知の方法にしたがって、ヘマグルチニン結合ペプチドに導入することができる。
　本発明の一態様において、上記（A－1）から（E－2）のアミノ酸のうち、（A－1）と（A－2）のアミノ酸を用いて官能化を行うことが好ましい。
　例えば、本発明のヘマグルチニン結合ペプチドは、以下のアミノ酸配列からなる環状ペプチドを含むことができる。
　(I) Cyclo（Ac-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg-Cys）-amide（配列番号：１０）；
　(II) 配列番号：１０において、４位及び７位、１３位及び１４位から選択されるアミノ酸のうち１又は数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているアミノ酸配列；
　(III) 配列番号：１０において、４位、７位及び１４位から選択されるアミノ酸のうち１又は数個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列；
　(IV) 配列番号：１０において、１４位のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列；及び
　(V)配列番号２６から３５のいずれかのアミノ酸配列。
　本明細書において、ヘマグルチニンとは、インフルエンザウイルスをはじめとする多くの細菌やウイルスの表面に存在する抗原性糖タンパク質をいい、「ＨＡ」と表される。ヘマグルチニンは、ウイルスによる宿主細胞への接着過程に関与する。具体的には、ウイルス表面のヘマグルチニンが標的とする宿主細胞表面にあるシアル酸と結合すると、ウイルスは細胞膜に包みこまれ、ウイルスを含むエンドソームの形で細胞内に取り込まれる。続いて、エンドソーム膜とウイルス膜が融合し、ウイルスゲノムが細胞内に挿入され、増殖が開始される。
　ヘマグルチニンには、サブタイプが少なくとも１６種類存在し、Ｈ１～Ｈ１６と呼ばれる。インフルエンザの亜型名のＨはヘマグルチニンを示す。
　本発明のペプチドは、液相法、固相法、液相法と固相法を組み合わせたハイブリッド法等の化学合成法；遺伝子組み換え法等、公知のペプチドの製造方法によって製造することができる。
　固相法は、例えば、水酸基を有するレジンの水酸基と、α－アミノ基が保護基で保護された第一のアミノ酸（通常、目的とするペプチドのＣ末端アミノ酸）のカルボキシ基をエステル化反応させる。エステル化触媒としては、１－メシチレンスルホニル－３－ニトロ－１，２，４－トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。
　次に、第一アミノ酸のα－アミノ基の保護基を脱離させるとともに、主鎖のカルボキシ基以外のすべての官能基が保護された第二のアミノ酸を加え、当該カルボキシ基を活性化させて、第一及び第二のアミノ酸を結合させる。さらに、第二のアミノ酸のα－アミノ基を脱保護し、主鎖のカルボキシ基以外のすべての官能基が保護された第三のアミノ酸を加え、当該カルボキシ基を活性化させて、第二及び第三のアミノ酸を結合させる。これを繰り返して、目的とする長さのペプチドが合成されたら、すべての官能基を脱保護する。
　固相合成のレジンとしては、Merrifield resin、MBHA resin、Cl-Trt resin、SASRIN resin、Wang resin、Rink amide resin、HMFS resin、Amino-PEGA resin（メルク社）、HMPA-PEGA resin（メルク社）等が挙げられる。これらのレジンは、溶剤（ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２－プロパノール、塩化メチレン等）で洗浄してから用いることができる。
　α－アミノ基の保護基としては、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ又はＺ）基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）基等が挙げられる。
Ｃｂｚ基はフッ化水素酸、水素化等によって脱保護でき、Ｂｏｃ基はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により脱保護でき、Ｆｍｏｃ基はピペリジンによる処理で脱保護できる。
　α－カルボキシ基の保護は、メチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステル、ｔｅｒｔ－ブチルエステル、シクロヘキシルエステル等を用いることができる。
　アミノ酸のその他の官能基として、セリンやトレオニンのヒドロキシ基はベンジル基やｔｅｒｔ－ブチル基で保護することができ、チロシンのヒドロキシ基は２－ブロモベンジルオキシカルボニル希やｔｅｒｔ－ブチル基で保護する。リジン側鎖のアミノ基、グルタミン酸やアスパラギン酸のカルボキシ基は、α－アミノ基、α－カルボキシ基と同様に保護することができる。
　カルボキシ基の活性化は、縮合剤を用いて行うことができる。縮合剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣあるいはＷＳＣ）、（１Ｈ－ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＰ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチル］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム－３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）等が挙げられる。
　レジンからのペプチド鎖の切断は、ＴＦＡ、フッ化水素（ＨＦ）等の酸で処理することによって行うことができる。
　遺伝子組み換え法（翻訳合成系）によるペプチドの製造は、本発明のペプチドをコードする核酸を用いて行うことができる。本発明のペプチドをコードする核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
　本発明のペプチドをコードする核酸は、公知の方法又はそれに準ずる方法で調製することができる。例えば、自動合成装置によって合成することができる。得られたＤＮＡをベクターに挿入するために制限酵素認識部位を加えたり、できたペプチド鎖を酵素などで切り出すためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を組み込んでもよい。
　上述のとおり、本発明のペプチドを膜透過性ペプチド等と融合させる場合、上記核酸は、膜透過性ペプチドをコードする核酸も含む。
　宿主由来のプロテアーゼによる分解を抑制するため、目的のペプチドを他のペプチドとのキメラペプチドとして発現させるキメラタンパク質発現法を用いることもできる。この場合、上記核酸としては、目的とするペプチドと、これに結合するペプチドとをコードする核酸が用いられる。
　続いて、本発明のペプチドをコードする核酸を用いて発現ベクターを調製する。核酸はそのまま、又は制限酵素で消化し、又はリンカーを付加する等して、発現ベクターのプロモータの下流に挿入することができる。ベクターとしては、大腸菌由来プラスミド（pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pBluescript II等）、枯草菌由来プラスミド（pUB110、pTP5、pC1912、pTP4、pE194、pC194等）、酵母由来プラスミド（pSH19、pSH15、YEp、YRp、YIp、YAC等）、バクテリオファージ（eファージ、M13ファージ等）、ウイルス（レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、バキュロウイルス等）、コスミド等が挙げられる。
　プロモータは、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。宿主が動物細胞である場合は、例えば、SV40（simian virus 40）由来プロモータ、CMV（cytomegalovirus）由来プロモータを用いることができる。宿主が大腸菌である場合は、trpプロモータ、T7プロモータ、lacプロモータ等を用いることができる。
　発現ベクターには、DNA複製開始点（ori）、選択マーカー（抗生物質抵抗性、栄養要求性等）、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、タグ（FLAG、HA、GST、GFPなど）をコードする核酸等を組み込むこともできる。
　次に、上記発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換する。宿主は、ベクターとの関係で適宜選択することができ、例えば、大腸菌、枯草菌、バチルス属菌）、酵母、昆虫又は昆虫細胞、動物細胞等が用いられる。動物細胞として、例えば、HEK293T細胞、CHO細胞、COS細胞、ミエローマ細胞、HeLa細胞、Vero細胞を用いることができる。形質転換は、宿主の種類に応じ、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等、公知の方法に従って行うことができる。形質転換体を常法に従って培養することにより、目的とするペプチドが発現する。
　形質転換体の培養物からのペプチドの精製は、培養細胞を回収し、適当な緩衝液に懸濁してから超音波処理、凍結融解などの方法により細胞を破壊し、遠心分離やろ過によって粗抽出液を得る。培養液中にペプチドが分泌される場合には、上清を回収する。
　粗抽出液又は培養上清からの精製も公知の方法又はそれに準ずる方法（例えば、塩析、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、SDS－PAGE法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー等）で行うことができる。
　得られたペプチドは、公知の方法又はそれに準ずる方法で遊離体から塩に、又は塩から遊離体に変換してもよい。
　翻訳合成系は、無細胞翻訳系としてもよい。無細胞翻訳系は、例えば、リボソームタンパク質、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）、リボソームＲＮＡ、アミノ酸、ｒＲＮＡ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、翻訳開始因子（ＩＦ）伸長因子（ＥＦ）、終結因子（ＲＦ）、及びリボソーム再生因子（ＲＲＦ）、並びに翻訳に必要なその他の因子を含む。発現効率を高くするために大腸菌抽出液や小麦胚芽抽出液加えてもよい。他に、ウサギ赤血球抽出液や昆虫細胞抽出液を加えてもよい。
　これらを含む系に、透析を用いて連続的にエネルギーを供給することで、数１００μｇから数ｍｇ／ｍＬのタンパク質を生産することができる。遺伝子ＤＮＡからの転写を併せて行うためにＲＮＡポリメラーゼを含む系としてもよい。市販されている無細胞翻訳系として、大腸菌由来の系としてはロシュ・ダイアグノスティックス社のＲＴＳ－１００（登録商標）、ＰＧＩ社のＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）等、小麦胚芽抽出液を用いた系としてはゾイジーン社やセルフリーサイエンス社のもの等を使用できる。
　無細胞翻訳系によれば、発現産物を精製することなく純度の高い形で得ることができる。
　無細胞翻訳系においては、天然のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に合成されるアミノアシルｔＲＮＡに代えて、所望のアミノ酸又はヒドロキシ酸をｔＲＮＡに連結（アシル化）した人工のアミノアシルｔＲＮＡを用いてもよい。かかるアミノアシルｔＲＮＡは、人工のリボザイムを用いて合成することができる。
　かかるリボザイムとしては、フレキシザイム（flexizyme）（H. Murakami, H. Saito, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 655-662； H. Murakami, D. Kourouklis, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 1077-1084； H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga (2006) Nature Methods 3, 357-359 "The flexizyme system: a highly flexible tRNA aminoacylation tool for the synthesis of nonnatural peptides"；N. Niwa, Y. Yamagishi, H. Murakami, H. Suga (2009) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19, 3892-3894 "A flexizyme that selectively charges amino acids activated by a water-friendly leaving group"；及びWO2007/066627等）が挙げられる。フレキシザイムは、原型のフレキシザイム（Fx）、及び、これから改変されたジニトロベンジルフレキシザイム（dFx）、エンハンスドフレキシザイム（eFx）、アミノフレキシザイム（aFx）等の呼称でも知られる。
　フレキシザイムによって生成された、所望のアミノ酸又はヒドロキシ酸が連結されたｔＲＮＡを用いることにより、所望のコドンを、所望のアミノ酸又はヒドロキシ酸と関連付けて翻訳することができる。所望のアミノ酸としては、特殊アミノ酸を用いてもよい。例えば、上述した環状化に必要な非天然アミノ酸もこの方法により、ヘマグルチニン結合ペプチドに導入することができる。
（医薬組成物及び治療方法）
　後述する実施例に示されるとおり、本発明のペプチドは、インフルエンザウイルス表面のヘマグルチニンに結合することにより、抗インフルエンザウイルス効果を示す。従って、本発明のペプチドを含む組成物は、インフルエンザの予防又は治療剤として有用であり、同様に、本発明のペプチドは、インフルエンザの予防又は治療方法において有用である。
　本明細書において、インフルエンザとは、インフルエンザウイルスによる急性感染症をいう。感染すると、ヒトにおいては高熱、筋肉痛などを伴う風邪様の症状があらわれる。腹痛、嘔吐、下痢などの胃腸症状を伴う場合もあり、合併症として肺炎とインフルエンザ脳症がある。
　本明細書において感染とは、ウイルスが皮膚や粘膜を介して生体に侵入する過程、又は、ウイルスが膜融合により細胞内に侵入する過程のいずれかを指す用語として用いられる。また、本明細書においてウイルス感染とは、症状の有無にかかわらずウイルスが生体内に侵入している状態をいう。
　本明細書においてインフルエンザの治療又は予防とは、その最も広い意味で用いられ、例えば、インフルエンザウイルスの感染と関連する一つ又は複数の症状の緩和若しくは悪化の阻止、感染後の症状の発生の抑制、生体内におけるウイルスの細胞への感染の阻止（遅延又は停止）、生体内におけるウイルスの増殖の阻止（遅延又は停止）、生体内におけるウイルス数の減少等を生じさせることをいう。これらのうち少なくとも一つの効果を示すとき、インフルエンザの治療又は予防に有用であると判断される。
　また、後述する実施例に示されるとおり、本発明のペプチドは、ヘマグルチニンに対する中和活性を有するので、インフルエンザワクチンと同様の効果を得られうるものと理解される。
　本明細書において、医薬組成物の投与形態は特に限定されず、経口的投与でも非経口的投与でもよい。非経口投与としては、例えば、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射等の注射投与、経皮投与、経粘膜投与（経鼻、経口腔、経眼、経肺、経膣、経直腸）投与等が上げられる。
　上記医薬組成物は、ポリペプチドが代謝及び排泄されやすい性質に鑑みて、各種の修飾を行うことができる。例えば、ポリペプチドにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や糖鎖を付加して血中滞留時間を長くし、抗原性を低下させることができる。また、ポリ乳酸・グリコール（ＰＬＧＡ）などの生体内分解性の高分子化合、多孔性ヒドロキシアパタイト、リポソーム、表面修飾リポソーム、不飽和脂肪酸で調製したエマルジョン、ナノパーティクル、ナノスフェア等を徐放化基剤として用い、これにポリペプチドを内包させてもよい。経皮投与する場合、弱い電流を皮膚表面に流して角質層を透過させることもできる（イオントフォレシス法）。
　上記医薬組成物は、有効成分をそのまま用いてもよいし、薬学的に許容できる担体、賦形剤、添加剤等を加えて製剤化してもよい。剤形としては、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤等が挙げられる。
　製剤化は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、溶解補助剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤などを適宜使用し、常法により行うことができる。
　製剤化に用いられる成分の例としては、精製水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、動植物油、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ソルビトール、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、コーンスターチ、無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、トラガント、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、高級アルコール、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、等が挙げられるがこれらに限定されない。
　上記医薬組成物は、ペプチドが経粘膜吸収されにくいことに鑑みて、難吸収性薬物の吸収を改善する吸収促進剤を含むことができる。かかる吸収促進剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類、ラウリル硫酸ナトリウム、サポニン等の界面活性剤；グリココール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸等の胆汁酸塩；EDTA、サリチル酸類等のキレート剤；カプロン酸、カプリン酸、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、混合ミセル等の脂肪酸類；エナミン誘導体、N-アシルコラーゲンペプチド、N-アシルアミノ酸、シクロデキストリン類、キトサン類、一酸化窒素供与体等を用いることができる。
　丸剤又は錠剤は、糖衣、胃溶性、腸溶性物質で被覆することもできる。
　注射剤は、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、アルコール類等を含むことができる。さらに、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解剤、溶解補助剤、防腐剤等を加えることができる。
　本発明の医薬組成物を哺乳類（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ウマ、サル、ブタ等）、特にヒトに投与する場合の投与量は、症状、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、有効成分の種類、製剤の種類によって異なり、特に限定されないが、例えば、30μg～100g、100μg～500mg、100μg～100mgを1回又は数回に分けて投与することができる。注射投与の場合、患者の体重により、1μg/kg～3000μg/kg、3μg/kg～1000μg/kgを1回又は数回に分けて投与してもよい。
　本発明のペプチドを用いたインフルエンザの予防又は治療方法は、上記医薬組成物にかかる記載を参照して実施することができる。
（インフルエンザウイルス検出薬及び検出用キット）
　本発明は、本発明のペプチドを含むインフルエンザウイルス検出薬も包含する。本発明のペプチドは、インフルエンザウイルス表面のヘマグルチニンに特異的に結合する。従って、例えば、ＥＬＩＳＡ法等のイムノアッセイにおける抗インフルエンザ抗体に代えて、本発明のペプチドを用いて試料中のインフルエンザウイルスを検出することができる。
　検出薬として用いる場合、本発明のペプチドは、検出可能に標識してもよい。ペプチドの標識は、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ、3Ｈ等の放射性物質、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質で標識した抗体が用いられる。その他、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子で標識した抗体を検出することもできる。
　また、イムノアッセイでは、本発明のペプチドをビオチンで標識し、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンを結合させて検出することもできる。
　イムノアッセイの中でも、酵素標識を用いるＥＬＩＳＡ法は、簡便且つ迅速に抗原を測定することができて好ましい。例えば、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン以外の部分を特異的に認識する抗体を固相担体に固定し、サンプルを添加して反応させた後、標識した本発明のペプチドを添加して反応させる。洗浄後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定することにより、インフルエンザウイルスを検出することができる。固相担体に固定した抗体と試料を反応させた後、標識していない本発明のペプチドを添加し、本発明のペプチドに対する抗体を酵素標識してさらに添加してもよい。
　酵素基質は、酵素がペルオキシダーゼの場合、３，３'－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）、３，３'，５，５'－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、ｏ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）等を用いることができ、アルカリホスファターゼの場合、ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＮＰＰ）等を用いることができる。
　本明細書において「固相担体」は、抗体を固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属性、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、ＰＶＤＦメンブレン等が挙げられ、標的物質は、これらの固相担体に公知の方法に従って固定することができる。
　本発明に係る検査用キットは、上記検出に必要な試薬及び器具（本発明のペプチド、抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むが、これらに限定されない）を含む。
以下に示す実施例は、単なる例示であって、上述した実施形態と共に本発明を詳細に説明することのみを意図しており、本発明を限定するものではない。
［実施例１］
［ヘマグルチニンに結合する特殊環状ペプチドの化学合成１］
　特許文献３と同様のスクリーニング方法で、ヘマグルチニン結合ペプチドを同定した。当該ペプチドが実際にヘマグルチニンに対する結合活性を持つかどうか、インフルエンザウイルスの増殖に対する阻害活性を持つかどうかを確認する目的で、化学合成した。
　ペプチド合成は、自動合成機ＳｙｒｏＩ（Biotage Japan社）を用い、９－フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）をαアミノ基の保護基として用いる一般的な固相合成法に従って行った。
　Ｒｉｎｋ　Ａｍｉｄｅ　ＡＭ　ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社）の３μｍｏｌ相当を合成用チップに加え、2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate（ＨＢＴＵ）、及びＦｍｏｃ基で保護したアミノ酸（いずれもＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社）を順次反応させた。
　Ｎ末端のトリプトファンを連結してＦｍｏｃを外したのち、1-methyl-2-pyrrolidinone（ＮＭＰ；Nacalai Tesuque社）に溶解したＮ－ヒドロキシコハク酸クロロアセチルを６当量加えて１時間静置した。
　得られたペプチドレジンを、N,N-dimethylformamide（ＤＭＦ；Nacalai Tesuque社）と塩化メチレンで３回洗浄して乾燥し、トリフルオロ酢酸－水－トリイソプロピルシランの混合物（体積比で９０：５：５）を加えて室温で２時間攪拌した。
　エーテル沈殿により切断された粗ペプチドを回収し、ジエチルエーテルで２回洗浄して乾燥したのち、終濃度が１０ｍＭとなるように１２５ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタンを含む８０％ＤＭＳＯ水溶液を加えて、室温で１時間攪拌した。
　環状ペプチド溶液を酸性にして濾過し、Ｃ４カラム（Cosmosil AR300 5C4（10×250mm、Nacalai Tesuque社）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーで目的物を精製した。移動相として０．１％トリフルオロ酢酸を含む水－アセトニトリルを用いた。生成したペプチドは、Autoflex II（Bruker Daltonics社）を用いてMALDI-TOF-MSにより同定した。
　以下の４種類のペプチドを合成した。
　iHA-100
ClAc-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg-Cys-amide（配列番号：６）；
　iHA-101
ClAc-Trp-Arg-Val-Ser-MePhe-Thr-Tyr-MePhe-MeSer-Tyr-Thr-Pro-Ser-Cys-amide（配列番号：７）；
　iHA-102
ClAc-Trp-Ser-MePhe-MeGly-His-Val-His-Tyr-Ser-Val-MePhe-Asn-MeAla-Val-Cys-amide（配列番号：８）、又は、
　iHA-103
ClAc-Trp-Thr-MeGly-Thr-His-Val-Arg-Tyr-Thr-Val-MePhe-Asn-MeAla-Ser-Cys-amide（配列番号：９）
　上記４種のペプチドが環状化された以下のペプチドをインフルエンザウイルスの増殖阻害試験に用いた。
　iHA-100
Cyclo（Ac-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg-Cys）-amide（配列番号：１０）；
　iHA-101
Cyclo（Ac-Trp-Arg-Val-Ser-MePhe-Thr-Tyr-MePhe-MeSer-Tyr-Thr-Pro-Ser-Cys）-amide（配列番号：１１）；
　iHA-102
Cyclo（Ac-Trp-Ser-MePhe-MeGly-His-Val-His-Tyr-Ser-Val-MePhe-Asn-MeAla-Val-Cys）-amide（配列番号：１２）、又は、
　iHA-103
Cyclo（Ac-Trp-Thr-MeGly-Thr-His-Val-Arg-Tyr-Thr-Val-MePhe-Asn-MeAla-Ser-Cys）-amide（配列番号：１３）
　ポジティブコントロールとして、以下のiHA-24環状ペプチド（特許文献３）を用いた。
　iHA-24（直鎖）
ClAc-Trp-Trp-Leu-Asp-Pro-Tyr-Trp-Leu-Thr-Trp-Tyr-Thr-Cys-Gly-amide（配列番号：１４）
　iHA-24（環状）
Cyclo（Ac-Trp-Trp-Leu-Asp-Pro-Tyr-Trp-Leu-Thr-Trp-Tyr-Thr-Cys）-Gly-amide（配列番号：１５）
［実施例２］
［インフルエンザウイルスに対するペプチドの活性の評価］
１．中和活性
　インフルエンザウイルスに対するペプチドの中和活性を確認するため、ペプチドとインフルエンザウイルスをまず混合し、その後、この混合液と細胞を接触させる試験を行った。具体的な試験方法を以下に示す。
1) アッセイ3日前にMDCK細胞を6wellプレートへ2×105cells/wellで播いた。
2) インフルエンザウイルス感染前日に各ペプチド0.01μM、0.1μM、1μMを含有する細胞培養培地に交換して細胞を前処理した。
3) 各ペプチド0.01μM、0.1μM、1μMを含有する細胞培養培地110μlに55PFUのウイルス溶液110μlを混合し、CO2インキュベータにおいて37℃で1時間インキュベートした。
4) ペプチドとインキュベートしたウイルス液0.2mlを各wellに加え、全体に行き渡らせた。
5) 37℃又は34℃で1時間吸着させ、15分おきにプレートを揺らした。
6) ウイルス液を取り除き、BSA(-)/MEMで1回洗浄した。
7) 0.8%アガロースを加えた1%BSA/MEM 2mlを各wellに重層した。
8) アガロース凝固後、プレートの上下を反転させ、CO2インキュベータへ入れた。
9) 37℃又は34℃で2～3日培養した。
10) 10%ホルマリンを加えた。室温で1時間固定した。
11) ホルマリンとアガロース培地を取り除き、水洗した。
12) 1%クリスタルバイオレットで1時間染色した。
13) 水洗、乾燥後にプラーク数を判定した。
２．中和＋阻害活性
　上述の方法で中和活性を評価すると共に、アガロースゲル中に、ペプチド又は抗インフルエンザ薬を加えて、増殖阻害活性も評価した。具体的な試験方法を以下に示す。
1) アッセイ3日前にMDCK細胞を6wellプレートへ2×105cells/wellで播いた。
2) インフルエンザウイルス感染前日に各ペプチド0.01μM、0.1μM、1μMを含有する細胞培養培地に交換して細胞を前処理した。
3) 各ペプチド0.01μM、0.1μM、1μMを含有する細胞培養培地110μlに55PFUのウイルス溶液110μlを混合し、CO2インキュベータにおいて37℃で1時間インキュベートした。
4) ペプチドとインキュベートしたウイルス液0.2mlを各wellに加え、全体に行き渡らせた。
5) 37℃又は34℃で1時間吸着させ、15分おきにプレートを揺らした。
6) ウイルス液を取り除き、BSA(-)/MEMで1回洗浄した。
7) ペプチド0.01μM、0.1μM、1μM、10μg/mlアセチルトリプシン、0.8%アガロースを加えた1%BSA/MEM 2mlを各wellに重層した。又は、オセルタミビル（商品名タミフル）若しくはザナミビル（商品名リレンザ）を0.01μM、0.1μM、1μM含むアガロース培地を重層した。
8) アガロース凝固後、プレートの上下を反転させ、CO2インキュベータへ入れた。
9) 37℃又は34℃で2～3日培養した。
10) 10%ホルマリンを加えた。室温，1時間固定した。
11) ホルマリンとアガロース培地を取り除き、水洗した。
12) 1%クリスタルバイオレットで1時間染色した。
13) 水洗、乾燥後にプラーク数を判定した。
３．結果
３－１．インフルエンザウイルスH5N1 Vac-3に対するペプチドの活性評価結果
　インフルエンザウイルスとしてH5N1 Vac-3を用い、ペプチドの中和活性、及び中和＋増殖阻害活性を評価した結果を図１に示す。iHA-100～103のいずれにおいても、用量依存的にプラーク数が減少した。iHA-100、102及び103は、ポジティブコントロールのiHA-24よりも著しく高く、ザナミビル（商品名リレンザ）に匹敵する抗ウイルス効果が見られた。
　なお、使用したウイルスの量をBack-titrationを行って確認したが（図中Back）、所定のウイルス量であった。
３－２．高病原性H5N1株に対するペプチドの活性評価結果
　高病原性トリインフルエンザウイルスとして、以下の3つを使用し、ペプチドの中和活性、及び中和＋増殖阻害活性を評価した結果を図２に示す。
　A/ws/Hokkaido/1/08 (clade 2.3)
　A/ws/Mongolia/3/05(clade 2.2)
　A/Vietnam/UT3040/04(clade 1)
　iHA-100は、高病原性トリインフルエンザウイルス株に対しても、iHA-24よりはるかに高く、ザナミビルと同等の抗ウイルス効果を示した。
　なお、使用したウイルスの量をBack-titrationを行って確認したが所定のウイルス量であった。
３－３．インフルエンザウイルスH1N1-pdm2009の分離株の一つであるH1N1-pdm2619株に対するペプチドの活性評価結果
　インフルエンザウイルスとして、H1N1-pdm2619に対するペプチドの中和活性、及び中和＋増殖阻害活性を評価した結果を図３に示す。
　iHA-100～103のいずれにおいても、iHA-24と同等かそれ以上に、用量依存的にプラーク数が減少し、特にiHA-100では、ザナミビル（商品名リレンザ）に匹敵する抗ウイルス効果が見られた。
３－４．インフルエンザウイルスH2N2-Adachi株に対する阻害及び中和活性
　同様に、インフルエンザウイルスH2N2-Adachi株に対するペプチドの中和活性、及び中和＋増殖阻害活性を評価した結果を図４に示す。
　iHA-100において、iHA-24に比較して、用量依存的にプラーク数が減少し、ザナミビル（商品名リレンザ）に匹敵する抗ウイルス効果が見られた。
［実施例３］
［特殊環状ペプチドiHA-100とZanamivirの治療効果の比較］
　図５に示される手順で、マウスにiHA-100環状ペプチドとザナミビルを投与し、ウイルス感染による致死率を調べた。
　結果を図６及び７に示す。iHA-100（図６）は、感染から6日後に投与を開始した群（iHA-100 6-10dpi）でも、致死率が低下した。一方、ザナミビル投与群（図７）は、感染から2日後に投与を開始しても死亡個体が認められ，4日目以降では全く治療効果を得られなかった（図７）。
［実施例４］
［ヘマグルチニンに結合する特殊環状ペプチドの化学合成２］
　実施例１と同様の手法を用いて、iHA-100（配列番号６）を改変した以下のペプチドを合成した。
　iHA-100-D4K
ClAc-Trp-Thr-MeGly-Lys-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg-Cys-amide（配列番号：１６）；
　iHA-100-S7A
ClAc-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ala-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg-Cys-amide（配列番号：１７）；
　iHA-100-S7K
ClAc-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Lys-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg-Cys-amide（配列番号：１８）；
　iHA-100-S7E
ClAc-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Glu-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg-Cys-amide（配列番号：１９）；
　iHA-100-P13hyP
ClAc-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Hyp-Arg-Cys-amide（配列番号：２０）；
　iHA-100-R14A
ClAc-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Ala-Cys-amide（配列番号：２１）；
　iHA-100-R14E
ClAc-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Glu-Cys-amide（配列番号：２２）；
　iHA-100-R14K
ClAc-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Lys-Cys-amide（配列番号：２３）；
　iHA-100-R14Dap
ClAc-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Dap-Cys-amide（配列番号：２４）；
　iHA-100-COOH
ClAc-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg-Cys-COOH（配列番号：２５）；
　なお、上記ペプチド中、Dapは、２，３－ジアミノプロピオン酸であり、Hypは４－ヒドロキシプロリンである。
　さらに、上記ペプチドがそれぞれ環状化された以下のペプチドを合成した。
　iHA-100-D4K
Cyclo（Ac-Trp-Thr-MeGly-Lys-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg-Cys）-amide（配列番号：２６）；
　iHA-100-S7A
Cyclo（Ac-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ala-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg-Cys）-amide（配列番号：２７）；
　iHA-100-S7K
Cyclo（Ac-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Lys-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg-Cys）-amide（配列番号：２８）；
　iHA-100-S7E
Cyclo（Ac-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Glu-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg-Cys）-amide（配列番号：２９）；
　iHA-100-P13hyP
Cyclo（Ac-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Hyp-Arg-Cys）-amide（配列番号：３０）；
　iHA-100-R14A
Cyclo（Ac-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Ala-Cys）-amide（配列番号：３１）；
　iHA-100-R14E
Cyclo（Ac-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Glu-Cys）-amide（配列番号：３２）；
　iHA-100-R14K
Cyclo（Ac-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Lys -Cys）-amide（配列番号：３３）；
　iHA-100-R14Dap
Cyclo（Ac-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Dap -Cys）-amide（配列番号：３４）；
　iHA-100-COOH
Cyclo（Ac-Trp-Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg-Cys）-COOH（配列番号：３５）。
［実施例６］
［インフルエンザウイルスに対するペプチドの活性の評価２］
　実施例４で合成したiHA-100、iHA-100-D4K、iHA-100-S7A、iHA-100-S7K、iHA-100-S7E、iHA-100-R14A、iHA-100-R14E、iHA-100-R14K、iHA-100-R14Dap及びiHA-100-COOHの環状ペプチドを用い、プラークアッセイ法により、インフルエンザウイルスに対する各ペプチドの増殖阻害活性を評価した。各ペプチドの含有量としては、0.03μM、0.01μM、0.003μM、0.001μM、0.0003μM及び0.0001μMの含有量でも試験を行った。
　結果を図９に示す。いずれのペプチドの場合も、用量依存的にプラーク数が減少した。iHA-100-R14A、iHA-100-R14E及びiHA-100-R14Dapでは、高い抗ウイルス効果が見られ、特に、iHA-100-R14A及びiHA-100-R14Dapは、低濃度の場合でも高い抗ウイルス効果が見られた。

Claims (12)

  1. 　以下の(i)から(iv)のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むヘマグルチニン結合ペプチド：
    　(i) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg（配列番号：１）；
    　(ii) Arg-Val-Ser-MePhe-Thr-Tyr-MePhe-MeSer-Tyr-Thr-Pro-Ser（配列番号：２）；
    　(iii) 配列番号：１又は２において、１又は数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているアミノ酸配列；及び
    　(iv) 配列番号：１又は２と90％以上配列同一性を有するアミノ酸配列。
  2. 　請求項１に記載のヘマグルチニン結合ペプチドであって、以下の(v)から(vii)のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むヘマグルチニン結合ペプチド：
    　(v) 配列番号：１において、３位、６位、１２位及び１３位から選択されるアミノ酸のうち１又は数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているアミノ酸配列；
    　(vi) 配列番号：１において、３位、６位、及び１３位から選択されるアミノ酸のうち１又は数個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列；及び
    　(vii) 配列番号：１において、１３位のアミノ酸がアミノ酸で置換されているアミノ酸配列。
  3. 　以下の(viii)から(xviii)のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むヘマグルチニン結合ペプチド：
    　(viii) Thr-MeGly-Lys-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg（配列番号：３６）；
    　(ix) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ala-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg（配列番号：３７）；
    　(x) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Lys-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg（配列番号：３８）；
    　(xi) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Glu-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Arg（配列番号：３９）；
    　(xii) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Hyp-Arg（配列番号：４０）；
    　(xiii) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Ala（配列番号：４１）；
    　(xiv) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Glu（配列番号：４２）；
    　(xv) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Lys（配列番号：４３）；
    　(xvi) Thr-MeGly-Asp-MePhe-MePhe-Ser-MeSer-His-Tyr-Thr-Val-Pro-Dap（配列番号：４４）；
    　(xvii) 配列番号：３６～４４のいずれかにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているアミノ酸配列；及び
    　(xviii) 配列番号：３６～４４のいずれかと９０％以上配列同一性を有するアミノ酸配列。
  4. 　下記式（Ｉ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むヘマグルチニン結合ペプチド：
    　Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13（配列番号：３）（Ｉ）
    　（式中、
    　Xaa1は、Ser又はThrであり、
    　Xaa2は、N-メチルアミノ酸であり、
    　Xaa3は、任意のアミノ酸であり、
    　Xaa4は、塩基性アミノ酸であり、
    　Xaa5は、Valであり、
    　Xaa6は、塩基性アミノ酸であり、
    　Xaa7は、Tyrであり
    　Xaa8は、Ser又はThrであり、
    　Xaa9は、Valであり、
    　Xaa10は、MePheであり、
    　Xaa11は、Asnであり、
    　Xaa12は、MeAlaであり、
    　Xaa13は、Val又はSerである。）。
  5. 　Xaa2は、MePhe又はMeGlyであり、
    　Xaa3は、MeGly又はThrであり、
    　Xaa4は、Hisであり、
    　Xaa6は、His又はArgである、請求項４に記載のヘマグルチニン結合ペプチド。
  6. 　Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13が、
    　Ser-MePhe-MeGly-His-Val-His-Tyr-Ser-Val-MePhe-Asn-MeAla-Val（配列番号：４）、又は、
    　Thr-MeGly-Thr-His-Val-Arg-Tyr-Thr-Val-MePhe-Asn-MeAla-Ser（配列番号：５）
    である、請求項４又は５に記載のヘマグルチニン結合ペプチド。
  7. 　環状化している、請求項１から６のいずれか１項に記載のヘマグルチニン結合ペプチド。
  8. 　Ｎ末端から３アミノ酸以内にクロロアセチル化アミノ酸を有し、Ｃ末端から３アミノ酸以内にシステインを有する、請求項７に記載のヘマグルチニン結合ペプチド。
  9. 　N末端にクロロアセチル－Trpを含み、C末端にCysを含み、これらのチオエーテル結合により環状化している、請求項７に記載のヘマグルチニン結合ペプチド。
  10. 　請求項１から９のいずれか１項に記載のヘマグルチニン結合ペプチドを含む、インフルエンザの予防又は治療のための医薬組成物。
  11. 　請求項１から９のいずれか１項に記載のヘマグルチニン結合ペプチドを含む、インフルエンザウイルス検出薬。
  12. 　請求項１１に記載のインフルエンザ検出薬を含む、インフルエンザウイルス検出用キット。
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