JP2010209052A - インフルエンザ治療／予防薬 - Google Patents

Abstract

【課題】十分な可溶性と、より高いインフルエンザウイルス感染阻害活性を有するヘマグルチニン結合ペプチド、該ペプチドを含む医薬組成物、インフルエンザウイルス感染阻害剤、インフルエンザ治療・予防薬を提供する。
【解決手段】インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに結合するペプチドを糖鎖修飾することにより、著しく高いウイルス感染阻害活性を有するヘマグルチニン結合ペプチド。および、これを含有し、インフルエンザの治療または予防に有効な医薬組成物。
【選択図】なし

Description

本発明は、インフルエンザ治療／予防薬に関する。

インフルエンザウイルス膜にはヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）といった２種類のスパイク糖蛋白質が存在し、それぞれウイルスの感染成立及びウイルスの宿主細胞からの出芽に重要な役割を果たしている。前者のヘマグルチニンは、ヒトやその他の動物（ほ乳類、鳥類、は虫類、魚類、両生類等）といった宿主の細胞膜上に普遍的に存在するシアル酸含有糖鎖を受容体として認識して特異的に結合し、インフルエンザウイルスの細胞内へのエンドサイトーシスを導く。一方、後者のノイラミニダーゼは、受容体破壊酵素であり、宿主細胞からウイルス粒子が出芽または遊離する際に、自らのまたは宿主細胞膜上のシアル酸残基を切断する役割を担っている。

現在、インフルエンザウイルス感染治療剤として、ヘマグルチニンの抗原性を基に作製されるワクチンが一般的に用いられている。インフルエンザウイルス感染の第１ステップに関与するヘマグルチニンには、抗原決定領域（Ａ〜Ｅ、２５〜７５％の相同性）のアミノ酸配列の多様性に基づいて、種々の亜型が存在する。このため、完全に感染防止や発症阻止できるワクチンの開発は非常に困難である。さらに、この抗原決定領域は突然変異しやすく、既存ワクチンに耐性を有するウイルスが生じやすいという問題もある。一方、ヘマグルチニンにおける、宿主細胞の受容体と結合するいわゆる受容体結合ポケット領域は、比較的変異が少なく、その三次元構造はよく保存されている（例えば、非特許文献１参照）。

従って、ヘマグルチニンに特異的に結合する物質によってインフルエンザウイルスの宿主細胞への結合を阻害すれば、広くインフルエンザウイルスの感染防止に効果があることが期待される。このため、ヘマグルチニン結合ペプチドを有効成分として含有するインフルエンザウイルス感染阻害剤の開発が進められている（例えば、特許文献１、２参照）。これらのペプチドは、アルキル化によってミセルを形成しやすくなり、インフルエンザウイルス感染阻害活性の向上がみられることが開示されているが（例えば、特許文献３参照）、一方でペプチドの溶解性が低下するという問題も生じていた。

特開２００２−２８４７９８号公報 特開２００７−１４５７７７号公報 特開２００６−１０１７０９号公報

Y. Suzuki, Prog. Lipid. Res., 33, 429 （1994）

本発明は、十分な可溶性と、高いインフルエンザウイルス感染阻害活性を有するヘマグルチニン結合ペプチドを提供し、このヘマグルチニン結合ペプチドを含む医薬組成物、インフルエンザ感染阻害剤、インフルエンザ治療薬、インフルエンザ予防薬を提供することを目的とする。

本発明に係るヘマグルチニン結合ペプチドは、糖鎖で修飾されていることを特徴とする。このヘマグルチニン結合ペプチドは、ＧＬＡＭＡＰＳ（配列番号１）、ＳＶＧＨＶＲＱＨＧ（配列番号３）、あるいはＧＬＡＭＡＰＳＶＧＨＶＲＱＨＧ（配列番号５）のアミノ酸配列を有していてもよい。また、ヘマグルチニン結合ペプチドを修飾する糖鎖はＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）であることが好ましい。また、前記糖鎖が、セリン残基に付加されていることが好ましい。

本発明に係る医薬組成物は、上記いずれかのヘマグルチニン結合ペプチドを含有することを特徴とする。この医薬組成物は、インフルエンザの治療または予防のために用いてもよい。

本発明に係るヘマグルチニン結合ペプチドのヘマグルチニン結合性を向上させるための方法は、糖鎖で修飾することを特徴とする。このヘマグルチニン結合ペプチドは、ＧＬＡＭＡＰＳ（配列番号１）、ＳＶＧＨＶＲＱＨＧ（配列番号３）、あるいはＧＬＡＭＡＰＳＶＧＨＶＲＱＨＧ（配列番号５）のアミノ酸配列を有していてもよい。また、本方法に係る糖鎖はＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）であることが好ましい。また、前記糖鎖を、セリン残基に付加することが好ましい。

また、本発明のペプチドは、ＧＬＡＭＡＰＳ（配列番号１）、ＭＡＰＳＶＧＨＶＲ（配列番号２）、あるいはＳＶＧＨＶＲＱＨＧ（配列番号３）のアミノ酸配列を有する。

本発明により、十分な可溶性と、高いインフルエンザウイルス感染阻害活性を有するヘマグルチニン結合ペプチドを提供し、このヘマグルチニン結合ペプチドを含む医薬組成物、インフルエンザウイルス感染阻害剤、インフルエンザ治療薬、インフルエンザ予防薬を提供することができる。

本発明の一実施形態であるＤ１ペプチドの合成概要を示した図である。 本発明の一実施形態であるＤ１（ＧａｌＮＡｃ−Ｓ７）の合成概要を示した図である。 本発明の一実施形態であるビオチン化変異Ｄ１ペプチドの合成概要を示した図である。 本発明の一実施形態である、各ビオチン化変異Ｄ１ペプチドのＨ１Ｎ１（Ａ）およびＨ３Ｎ２（Ｂ）に対する相対的結合アフィニティを示したグラフである。

以下、本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。

実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis （Ed.）, Molecular cloning, a laboratory manual （3rd edition）, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York （2001）; F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl （Ed.）, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。

なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

＝＝糖鎖修飾ヘマグルチニン結合ペプチド＝＝
本発明に係るヘマグルチニン結合ペプチドは糖鎖で修飾されていることを特徴とする。

ヘマグルチニン結合ペプチドの結合対象であるヘマグルチニンは、インフルエンザウイルスの膜上に存在するタンパク質であって、少なくとも１６種類存在し、それらのサブタイプはＨ１〜Ｈ１６と呼ばれ、そのうち、Ｈ１〜Ｈ３はヒトインフルエンザウイルスに由来する。

ヘマグルチニン結合ペプチドは、ヘマグルチニンに結合性を有するペプチドであれば、天然由来のアミノ酸配列を有しても、人為的に作出されたアミノ酸配列を有しても制限されず、例えば、
ＧＬｘＭｘＰｘｘｘＨＶＲｘｘｘ（配列番号４）
の配列を有するペプチドが挙げられる。
さらに、具体的な配列として、
ＧＬＡＭＡＰＳＶＧＨＶＲＱＨＧ（配列番号５）
ＳＲＡＦＤＬＬＤＱＰＬＳＮＡＲ（配列番号６）
ＴＳＶＮＲＧＦＬＬＱＲＡＳＨＰ（配列番号７）
ＱＰＹＧＦＩＡＦＳＲＡＡＨＳＰ（配列番号８）
等を有するペプチド（特開２００２−２８４７９８）であってもよく、あるいは
（Ａ−１、配列番号９）
や、これに人為的に変異を付加した
ＡＲＬＳＰＮＭＶＨＬＮＰＡＱＰ（ｓ−１、配列番号１０）
ＡＲＬＰＲＴＭＶＨＰＬＰＡＱＰ（ｓ−２、配列番号１１）
ＡＲＬＳＰＴＭＶＨＰＨＰＡＬＳ（ｓ−３、配列番号１２）
ＡＲＬＰＰＴＭＶＲＰＮＧＰＱＰ（ｅ−１、配列番号１３）
ＡＲＬＰＰＡＭＶＲＰＮＧＰＱＰ（ｅ−２、配列番号１４）
ＡＲＬＳＰＴＭＶＲＰＩＧＡＱＰ（ｅ−３、配列番号１５）
ＡＲＬＳＰＴＭＶＨＬＮＧＡＱＰ（ｅ−４、配列番号１６）
ＡＲＬＳＨＩＭＶＨＲＮＧＡＱＰ（ｅ−５、配列番号１７）
ＡＲＬＰＰＡＭＶＨＰＮＧＡＱＨ（ｅ−６、配列番号１８）
ＡＲＬＳＰＴＭＶＨＰＮＧＡＱＨ（ｅ−７、配列番号１９）
ＡＲＬＳＰＡＭＶＨＰＮＧＡＲＬ（ｅ−８、配列番号２０）
ＡＲＬＳＰＡＭＶＲＰＮＧＡＲＰ（ｅ−９、配列番号２１）
ＡＲＬＳＰＴＭＶＨＲＨＧＡＱＰ（ｅ−１０、配列番号２２）
ＴＲＬＰＰＴＭＩＨＰＮＧＡＱＰ（ｅ−１１、配列番号２３）
ＡＲＬＳＰＴＭＶＨＰＲＧＡＱＰ（ｅ−１２、配列番号２４）
ＡＲＬＳＰＴＭＶＨＲＮＧＶＱＰ（ｅ−１３、配列番号２５）
ＡＲＬＰＰＡＭＡＲＰＮＳＡＱＰ（ｅ−１４、配列番号２６）
等を有するペプチド（特開２００６−１０１７０９）であってもよい。

また、上記いずれかのヘマグチニン結合ペプチドのアミノ酸配列において、数アミノ酸（好ましくは、６アミノ酸以下、より好ましくは３アミノ酸以下、最も好ましくは１アミノ酸）が欠失、挿入、又は置換されたアミノ酸配列を有するペプチドも、ヘマグチニン結合性を有する範囲内で、ヘマグチニン結合ペプチドに含まれる。

また、ヘマグルチニン結合ペプチドは、上記いずれかの配列のみを含むペプチドであってもよいが、ヘマグルチニン結合性を有する限り、その部分配列を有するペプチドであってもよい。その部分配列は特に限定されないが、５アミノ酸以上であることが好ましく、７アミノ酸以上であることがより好ましい。例えば、その配列として、
ＧＬＡＭＡＰＳ（配列番号１）
ＭＡＰＳＶＧＨＶＲ（配列番号２）
ＳＶＧＨＶＲＱＨＧ（配列番号３）
等が挙げられる。

あるいは、上記いずれかの配列のＮ末端側、Ｃ末端側、あるいはその両方に任意のペプチドが付加されたペプチドであってもよく、ヘマグルチニン結合性を有する範囲において制限されない。特に、当該配列の片方の末端あるいは両方の末端にセリン残基が付加されたペプチドが好ましい。

さらに、ヘマグルチニン結合ペプチドは、適宜化学修飾することができ、例えばアルキル化、または脂質化（リン脂質化）等によって、その細胞親和性や組織親和性を増大させたり、血中半減期を延長させて薬理効果を増強させたりすることができる。

本発明に係るヘマグルチニン結合ペプチドは糖鎖で修飾されている。ここで、修飾する糖鎖は、ヘマグルチニン結合ペプチドのヘマグルチニン結合性を保持し、あるいは、ヘマグルチニン結合性を向上させることができる範囲で特に限定されないが、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）であることが好ましい。

このように糖鎖で修飾されたヘマグルチニン結合ペプチドにおける、糖鎖付加位置は、そのペプチドのヘマグルチニン結合性を保持し、あるいは、ヘマグルチニン結合性を向上させることができる範囲で特に限定されないが、セリン残基に付加させることが好ましく、例えば、Ｄ１ペプチド（配列番号５）においてはＣ末端から７番目のアミノ酸であるセリン残基であることが好ましい。あるいは、ヘマグルチニン結合ペプチドの末端に付加したセリン残基であってもよい。

ここで、糖鎖修飾ヘマグルチニン結合ペプチドのヘマグルチニンに対する結合活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ法によって測定することができるが、これに限らず、ＲＩＡ、ＥＩＡ、ウエスタン・ブロッティングなど、タンパク質間の相互作用を定量的に測定できる周知の手法を用いて測定することができる。

＝＝糖鎖修飾ヘマグルチニン結合ペプチドの製造方法＝＝
本発明に係る上記いずれの糖鎖修飾ヘマグルチニン結合ペプチドも、化学合成法等の常法によって製造することができるが、その方法は、目的の糖鎖修飾ペプチドを合成することができる範囲で特に制限されない（例えば、Mizuno, Trends in Glycoscience and Glycotechnology, vol. 13（69）, p.11-30, 2001参照）。

例えば、あらかじめペプチド鎖を合成し、最後に糖鎖とペプチドを結合させてもよい（コンバージェント法）。ペプチド鎖の合成は化学合成法や遺伝子組換え等の常法によって製造することができ、その後、例えば、ペプチド鎖中のアミノ酸残基のβカルボキシル基と糖鎖アミンとを縮合させて、糖鎖修飾ペプチドとすることができる。この場合の糖鎖の合成方法は、固相樹脂を担体として糖と糖を化学反応させて合成させる方法、低分子量ポリエチレングリコールを担体として化学反応させる方法、あるいは酵素を用いた糖鎖合成手法等の周知の方法を用いることができる。

しかし、反応条件の容易さで、アミノ酸または糖鎖アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させるステップワイズエロンゲーション法や、アミノ酸および糖鎖アミノ酸が数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法が好ましい。これらの方法で用いる糖鎖アミノ酸としては、例えばＮ−結合型糖アミノ酸、Ｏ−結合型糖アミノ酸あるいはＣ−結合型糖アミノ酸を挙げることができ、糖鎖修飾ペプチド合成に使用するアミノ酸は当業者が適宜選択することができる。

Ｎ−結合型糖アミノ酸（アスパラギン結合型アミノ酸）は、対応する糖アミンとアスパラギン酸誘導体のβ−カルボキシル基との縮合により得ることができる。この場合の縮合剤としては、ＤＣＣ、ＥＥＤＱ、ＥＤＣ、ＴＢＴＵ等を例示できる。糖アミンは、パラジウム黒、リンドラー触媒、酸化白金、ラネーニッケル等の触媒を用いた糖アジドの触媒還元、またはプロパンジチオールによる還元により合成することができる。または、遊離の糖を飽和炭酸水素アンモニウム、もしくは炭酸アンモニア水溶液中で数日間反応させることで遊離の糖アミンを調製することもできる。あるいは、糖アミンを経ずに、トリアルキルホスフィン存在下で、糖アジドとアスパラギン酸誘導体から糖アスパラギン酸を合成することもできる。あるいは、糖イソチオシアネートやペンテニルグルコシドを用いる反応によってＮ−結合型等アミノ酸を合成することもできる。

Ｏ−結合型アミノ酸（セリン／スレオニン結合型アミノ酸）は、ハロゲン糖、グリコシルトリクロロアセトイミデート、チオグリコシド、アセチル化糖等を糖供与体とした一般的なグリコシル化反応により合成することができる。特に、Ｆｍｏｃ−セリンやＦｍｏｃ−スレオニンのペンタフルオロフェニルエステルを糖受容体として用いる方法は、得られる糖アミノ酸のカルボキシル基が既に活性化された状態であり、そのまま糖ペプチド合成に用いることができるため、好ましい。

Ｃ−結合型アミノ酸は、人工の糖アミノ酸であり、上記Ｎ−およびＯ−結合天然型アミノ酸に比較して安定であり、生体内で医薬等として利用されるためには特に有用である。合成法としては、例えば、グリコシルアルデヒドのwitting反応によってβ−Ｇａｌ−ＣＨ_２−ＳｅｒのＣ−グリコシドアナログを合成したり、ＧｌｃとＧａｌのトリクロロアセロミデート体をアミノ酸より誘導したシリルエノール誘導体と反応させＧｌｃ−ＣＨ_２−ＳｅｒとＧａｌ−ＣＨ_２−Ｓｅｒをそれぞれ合成したりすることができることが報告されているが、これらに限定されない。

ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミド等）、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種のペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えば ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。

なお、ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸ないしペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等として保護することができる。また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばＴｙｒの水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第三級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に例えばＡｒｇのグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、２−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明のペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って行うことができる。

このように作製された糖鎖修飾ペプチドは、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、向流分配法等、ペプチド化学の分野で汎用されている常法に従って、適宜その精製を行うことができる。

さらに、糖鎖修飾ペプチドをアルキル化あるいは脂質化する場合、当業者に周知の方法に従って行うことができる（例えば、特開２００６−１０１７０９参照）。

＝＝糖鎖修飾ヘマグルニチン結合ペプチドを含有する医薬組成物＝＝
本発明に係る医薬組成物は、上記いずれかの糖鎖修飾ヘマグルチニン結合ペプチドを含有することを特徴とする。本医薬組成物の使用用途は限定されず、例えば、下記に説明するようにインフルエンザの治療・予防等のために用いても、あるいは、インフルエンザウイルス検出やインフルエンザ診断のためのキット等に用いても、ヘマグルチニンを介して生じるインフルエンザウイルスの感染、および、それに伴う種々の細胞機能や生命現象を解明するためのツールとして用いてもよい。

また本医薬組成物は、必要に応じ、糖鎖修飾ヘマグルチニン結合ペプチドをリポソーム製剤として調製したものであってもよい。この場合、酸性リン脂質を膜構成成分とするか、あるいは、中性リン脂質と酸性リン脂質とを膜構成成分とするリポソームに、本発明の糖鎖修飾ヘマグルチニン結合ペプチドが保持されている（例えば、特開２００６−１０１７０参照）。

＝＝インフルエンザの治療または予防に用いるための医薬組成物＝＝
本発明に係る、糖鎖修飾ヘマグルチニン結合ペプチドを含有する医薬組成物は、インフルエンザの治療または予防に用いられることが好ましい。

本医薬組成物の対象とするインフルエンザウイルスはその型や由来を特に制限するものでなく、Ａ型、Ｂ型またはＣ型ないしヒト分離型、ブタやウマ等の他の哺乳動物分離型または鳥類分離型等のいずれであってもよい。

インフルエンザウイルスが細胞に感染する際、インフルエンザウイルスの有するヘマグルニチンが、宿主細胞の受容体に特異的に結合し、その受容体を足場として、ウイルスが細胞に感染する。よって、ヘマグルチニンに結合する物質によってインフルエンザウイルスの宿主細胞受容体への結合を阻害することができ、つまり、インフルエンザウイルスが宿主細胞に感染するのを阻害することができる。実際、これまでに阻害効果の有無を調べた全てのヘマグルチニン結合性ペプチドは、ヘマグルチニンの宿主細胞への結合を阻害することができた（国際公開ＷＯ００／５９９３２、特開２００２−２８４７９８公報）。

このように、本発明の糖鎖修飾ヘマグルチニン結合ペプチドは、インフルエンザウイルスが宿主細胞に感染するのを阻害することができる。よって、以上のように、本発明の糖鎖修飾ヘマグルチニン結合ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物として、インフルエンザウイルスが宿主細胞に感染するのを阻害するためのインフルエンザウイルス感染阻害剤、インフルエンザに罹患した患者を治療するためのインフルエンザ治療剤、インフルエンザに罹患する前に予防的に投与するためのインフルエンザ予防剤などが考えられる。

これらの医薬組成物は、有効成分としての糖鎖修飾ヘマグルチニン結合性ペプチドと、必要に応じて薬学的に許容される担体とを含有する製剤として、インフルエンザウイルスに感染した患者に投与したり、感染前の健常人に予防的に投与したりすることができるが、投与対象動物はヒトに限定されず、インフルエンザウイルスに感染する可能性のあるいずれの脊椎動物にも投与することができる。

ここで用いられる薬学的に許容される担体は、調製される医薬組成物の形態に応じて、慣用されている担体の中から適宜選択して用いることができる。例えば、医薬組成物が溶液形態として調製される場合、担体として、精製水（滅菌水）または生理学的緩衝液、グリコール、グリセロール、オリーブ油のような注射投与可能な有機エステルなどを使用することができる。また、この医薬組成物には、慣用的に用いられる安定剤、賦形剤などを含むことができる。

これらの医薬組成物の投与方法には特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、疾病の重篤度等に応じて適宜決定すればよいが、製剤形態としては、特に注射剤、点滴剤、噴霧剤（点鼻剤や吸入剤など）等の非経口投与形態が好ましい。その場合、特に注射剤や点滴剤として調製する場合は、必要に応じて塩溶液、ブドウ糖やアミノ酸等の通常の補液などと混合して静脈内、筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内に投与する。噴霧剤として調製する場合、例えば、受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体として、乳糖、グリセリン等を使用してエアロゾル、ドライパウダー等に製剤化した噴霧剤を、口腔または気道粘膜へ噴霧することにより粘膜投与する。

また、これらの医薬組成物の１日当りの投与量は、投与する者の症状、年齢、体重、性別、治療期間、治療効果、投与方法などにより適宜変更しうるが、ヘマグルチニン結合ペプチドの量に換算して通常成人１回当り約０．００１〜２０００ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。当該製剤は１日１回投与に限らず、数回に分けて投与してもよい。当該製剤は１日１回投与に限らず、数回に分けて投与してもよい。

これらの医薬組成物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、他の抗ウイルス剤、抗炎症剤や、症状を緩和する薬剤など）と組み合わせて使用してもよい。

[実施例１]
本実施例では、ヘマグルチニン結合Ｄ１ペプチドまたはその部分配列を有するペプチド、および、糖鎖修飾ヘマグルチニン結合Ｄ１ペプチドまたはその部分配列を有するペプチド（表１）を合成した。

図１および２に示す合成概要に従って、上記各ペプチドを固相法によるＦｍｏｃ化学を用いて自動ペプチド合成機（ＰＳＳＭ−８、島津製作所）と手作業で合成した。

＝＝非修飾ペプチド合成法＝＝
非糖修飾ペプチド合成のため、反応容器（code 292-05250-02、島津製作所）に樹脂Fmoc-NH-SAL-Resin（code A00102、渡辺化学工業）を添付マニュアルに従って所定量加え、リアクションベッセルインサート（code 292-05211、島津製作所）を挿入した。この時、糖鎖修飾ペプチド合成のためにはFmoc-NH-SAL-PEG-Reginを樹脂として用いた。ペプチド合成のためのデータをロードした自動ペプチド合成機に、各試薬（Ｆｍｏｃ−アミノ酸、ＨＯＢｔ（1-hydroxybenzotriazole）/ＤＭＦ（N,N-dimethylformamide）、ＮＭＭ（4-methylmorpholine）／ＤＭＦ、ＰＩＰ（piperidine）/ＤＭＦ）と反応容器をセットし、添付マニュアルに従って操作し、各ペプチド合成を行った。プログラムに従ったＮ末端のＦｍｏｃ基脱保護反応により、この合成工程で生じるＮ末端のＦｍｏｃ基が脱保護された。

＝＝糖鎖修飾ペプチド合成法＝＝
糖鎖修飾ペプチドは、表１のアミノ酸配列における下線部を上述の非修飾ペプチド合成法に従い合成した後、ペプチド合成機から反応容器を取り出し、ＤＭＦで４回洗浄した。ここにＰＩＰ/ＤＭＦを加えて１分間ボルテックスし、さらにＰＩＰ/ＤＭＦを加えて１５分間ボルテックス後、ＤＭＦで５回洗浄した。この反応容器に各糖アミノ酸、ＰｙＢＯＰ（benzotriazol-1-yl-oxy-tripyrolidinophosphorium hexafluorophosphate、ＨＯＢｔ、ＤＩＥＡ（diisopropylethylamine）を加え、ＤＭＦ中で静置して反応させた。反応条件を表２に示す。なお、ＧａｌＮＡｃ修飾のためのＦｍｏｃ−アミノ酸としてFmoc-Ser（GalNAc（AC）3-α-D）-OH・0.6 IPE（分子量７１７．０６、code M01980、渡辺化学工業）、Ｇｌｃ（グルコサミン）修飾のためのＦｍｏｃ−アミノ酸としてtetra-O-acetyl-β-D-Glc-Fmoc-Ser（分子量６８５．２７、code 3-02670、Carbo Mer, Inc社）、Ｌａｃ（ラクトシル）修飾のためのＦｍｏｃ−アミノ酸としてhepta-O-acetyl-β-D-lactosyl-Fmoc-Ser（分子量１０５９．１４、code 3-02672、Carbo Mer, Inc社）を用いた。

反応後、ＤＭＦとＤＣＭ（dichloromethane）で各４回洗浄した。この反応容器を再びペプチド合成機にセットし、上述の非修飾ペプチド合成法と同様に残りのアミノ酸伸長反応を行った。

＝＝アルキル基付加法＝＝
ペプチドを合成した後の反応容器をＤＭＦで４回洗浄後、ＰＩＰ/ＤＭＦを加えて１分間ボルテックスで攪拌し、ＰＩＰ/ＤＭＦを加えてさらに１５分間攪拌した後、ＤＭＦで５回洗浄した。ここに、各０．０６ｍｍｏｌのステアリン酸（CH₃（CH₂）₁₆COOH）とＰｙＢＯＰ、０．３６ ｍｌの ０．５ ｍｍｏｌ/ｍｌ ＨＯＢｔ/ＤＭＦ、および、０．３ ｍｌ の１．０ ｍｍｏｌ/ｍｌ ＮＭＭ/ＤＣＭを加えて３０分間ボルテックスで攪拌した。反応後、ＤＣＭで４回、ステアリン酸の溶け残りが完全に取り除かれるまで洗浄し、ＤＭＦで４回、ＨＯＢｔの溶け残りが完全に取り除かれるまで洗浄した。

＝＝合成ペプチドの樹脂からの切り出し＝＝
上記のようにして得られた、ペプチドを樹脂から切り出すため、各ペプチド樹脂をポリプロピレン製のミニカラム（アシスト社）に回収し、メタノール洗浄と真空乾燥を５回繰り返した。その後、t-ブチルメチルエーテルで洗浄と真空乾燥を２回繰り返した。ここに、合成したペプチドの種類に従って、表３のクリーベイジカクテルを１ｍｌ加え、所定時間インキュベートした。その後、反応容器の蓋を取り外し、容器上部口から加圧して１５ ｍｌ遠心管にカクテルを回収した。この遠心管に、糖鎖非修飾ペプチドの場合はジエチルエーテル、糖鎖修飾ペプチドの場合はジエチルエーテル：ＤＣＭ（２０：１）を１０ｍｌ加えて反応を停止させ、遠心によってペプチドを沈殿させた。このペレットを、ジエチルエーテルまたはジエチルエーテル：ＤＣＭ（２０：１）で洗浄後、遠心管に残ったペプチドのペレットに窒素ガスを吹き付けてエーテルを飛ばし、各種粗ペプチドを得た。

＝＝糖鎖修飾ペプチドのアセチル基除去＝＝
上記のように取得された粗糖鎖修飾ペプチドに、０．０１ ｍｏｌ/ｌの NaOMe-MeOH 溶液（２８％ナトリウムメトキシド-メタノール溶液（197-02463、Wako社）の５００倍希釈）を加え、表２に従い６時間または一晩ボルテックスで攪拌して反応させた。反応後、１ＭＨＣｌを加えて反応を停止させた後、３５００ｒｐｍで５分間遠心して沈殿を回収した。

＝＝ペプチドの精製＝＝
得られた凍結乾燥粗ペプチドを、非修飾ペプチドはＭｉｌｌｉＱ水、アルキル化または糖鎖修飾ペプチドは酢酸に溶解し、０．４５μｍフィルター（Millex-LH, 4mm, code SLLH H04、Millipore社）でろ過した。ろ過の際必要に応じて遠心した。この各種合成ペプチドはＯＤＳ（オクタデシル）カラムあるいはＣ４カラム（直径４．６ｘ２５０ｍｍまたは２０ｘ２５０ｍｍ、ＷＣ社）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分画し、所望のペプチドを単離した。溶出条件は表４に示した。単離された各ペプチドは、マススペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）によって分子量を測定し、同定した。

本実施例で合成した全てのペプチドのマススペクトロメトリーの結果、ＨＰＬＣにより得られたペプチド純度、および、分析条件、収量、収率をそれぞれ表４および５に示す。収量や収率は各ペプチドでばらつきがある。

[実施例２]
本実施例では、ヘマグルチニン結合ペプチドにおけるヘマグルチニン結合モチーフを同定する。

＝＝ビオチン化変異Ｄ１ペプチドの合成＝＝
図３に示す合成概要に従い、各ビオチン化変異Ｄ１ペプチドを、固相法によるＦｍｏｃ化学を用いて自動ペプチド合成機（ＰＳＳＭ−８、島津製作所）と手作業で合成した。Ｆｍｏｃ−ビオチン化アミノ酸として、Fmoc-Lys（biotin）-OH （code 04-12-1237, Novabiochem社）を用いた。この時、表６に示すように、Ｄ１ペプチド（配列番号５）におけるアミノ酸配列の、Ｃ末端側から３番目および５番目のアラニンを除いた全てのアミノ酸残基を一つずつアラニンに置換し、ビオチン化Ｄ１ペプチド、および、１３種類のビオチン化変異Ｄ１ペプチドを合成した。

＝＝ヘマグルチニン固定化膜の作製＝＝
ヘマグルチニン（Ｈ１Ｎ１（A/New Caledonia/20/99） または Ｈ３Ｎ２（A/New York/55/2004））溶液をＰＢＳで希釈し、７０μｇ／ｍｌに調製した。これを、９６穴ポリスチレンプレート（code 442404, nunc社）に各穴１００μｌずつ加え、４℃で一晩インキュベートしてヘマグルチニンを吸着させた。その後、各穴２００μｌのＰＢＳで３回ずつ洗浄し、これをヘマグルチニン固定化膜とした。

＝＝ヘマグルチニン結合解析＝＝
上記のように作製したヘマグルチニン固定化膜に、２０、４０、あるいは５０μＭに希釈したビオチン化変異Ｄ１ペプチドを一穴あたり１００μｌ加え、室温で２時間インキュベートした。その後、各穴を２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。ここに、１％ウシ血清アルブミン添加ＰＢＳで１００００希釈したペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（code 189733, Calbiochem社）を１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートした。各穴を２００μｌのＰＢＳで５回ずつ洗浄した。発色基質として、３０％Ｈ_２Ｏ_２溶液（4℃）を最終濃度０．０２％になるように加えたフェニレンジアミン（０．４ｍｇ／ｍｌ ０．１Ｍクエン酸、０．１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄, ｐＨ５．０）を調製し、これを各穴１００μｌずつ加え、遮光して１５分間インキュベートした。その後、各穴に１．５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を１００μｌずつ加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（Multiskan MS, Labosystems 社）で、４９２ｎｍ波長における吸光度を測定した。

図４は、ビオチン化Ｄ１ペプチドの各ヘマグルチニンへの結合を１とした場合の、各ビオチン化変異Ｄ１ペプチドのＨ１Ｎ１（Ａ）およびＨ３Ｎ２（Ｂ）に対する相対的結合アフィニティを示している。

Ｈ１Ｎ１型ヘマグルチニンに対する結合アフィニティは、変異Ｄ１ペプチドＡ２、Ａ４、Ａ１２ではＤ１ペプチドと比較して顕著に低下（約５０％）した。また、Ａ１でも結合活性が低下（約６０％）した。従って、Ｈ１Ｎ１型ヘマグルチニンへの結合に特に重要なアミノ酸残基は、Ｃ末端から１番目、２番目、４番目、１２番目である。

また、Ｈ３Ｎ２型ヘマグルチニンに対する結合アフィニティは、すべてのペプチド希釈濃度において、変異Ｄ１ペプチドＡ１、Ａ２、Ａ４、Ａ１２でＤ１ペプチドと比較して顕著に低下した。また、２０μＭではＡ６、Ａ１０、Ａ１１でも結合活性が低下した。従って、Ｈ３Ｎ２型ヘマグルチニンへの結合に特に重要なアミノ酸残基はＣ末端から１番目、２番目、４番目、１２番目であり、６番目、１０番目、１１番目も結合に関与することが示された。

以上の結果は、
ＧＬｘＭｘＰｘｘｘＨＶＲｘｘｘ（配列番号４、ｘは任意のアミノ酸）
のアミノ酸配列を有するペプチドは、ヘマグルチニン結合性を有するペプチドであることを示す。

[実施例３]
本実施例では、各合成ヘマグルチニン結合ペプチドの感染阻害活性を示す。

＝＝感染阻害活性評価（プラークアッセイ法）＝＝
１０％ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地中で培養したＭＤＣＫ細胞（Mardin-Darby canine kidney、理研ＢＲＣ セルバンク）を、１ウエルあたり１００ｍｌずつ３ｘ１０^５細胞／ｍｌの密度で６穴マイクロプレートに播種し、５％ＣＯ_２、３７℃で一晩培養した。全てのウエルにおいて細胞が単層飽和になっていることを確認した後、血清非含有ＭＥＭ培地で２回洗浄した。ここで、系列希釈したＡ亜型インフルエンザウイルス（ＨＡ１（Ａ/ＰＲ/８/３４）あるいはＨＡ３（Ａ/Ａｉｃｈｉ/２/６８））（１００〜２００ｐｆｕ（plaque forming units））と 同じく系列希釈した評価対象のヘマグルチニン結合ペプチド（実施例１で合成）の混合液を各ウエルに２００μｌずつ接種した。これを５％ＣＯ_２、３７℃で３０分間インキュベートした後、ウイルス―ペプチド混合液を除き、ＰＢＳで１回洗浄した。ここに、５０℃に加温した寒天と重層用培地の混合培地を２ｍｌ／ウエル加え、室温で３０分静置して寒天を固めた後にプレートを反転して５％ＣＯ_２、３７℃で２日間培養した。ウイルス感染後２日目に重層培地を除き、プレートを乾燥させた。その後、クリスタルバイオレット染色液を用いて室温で３〜５分染色・固定化した後、水道水で洗浄し、プラークの形成（ｐｆｕ/ｍｌ）を計算した。

ウイルスのＭＤＣＫ細胞への感染が最大時の５０％である時のヘマグルチニン結合ペプチドの濃度がＩＣ_５０である。ｌｏｇ変換したペプチド濃度（ｘ）を横軸、ｌｏｇｉｔ変換したウイルスの感染量／ウイルスの最大感染量（ｙ）を縦軸とし、直線回帰分析を行った。縦軸が０の時のペプチド濃度がＩＣ_５０となる。

表７に各ペプチドのインフルエンザウイルス感染阻害活性を示す。Ｄ１ペプチドそのものはＨ１、Ｈ３のいずれのインフルエンザウイルスの感染阻害活性も示さなかった。一方で、糖鎖修飾Ｄ１ペプチド（Ｄ１（ＧａｌＮＡｃ−Ｓ７））、および、Ｄ１（１−７、ＧａｌＮＡｃ−Ｓ７）、Ｄ１（７−１５、ＧａｌＮＡｃ−Ｓ７）は著しく高い阻害活性を示した。糖鎖修飾の位置は、Ｄ１ペプチド中央のセリンに付加した場合（Ｄ１（ＧａｌＮＡｃ−Ｓ７））に活性がより高かったが、糖鎖修飾したセリンをＣ末端に付加した場合（Ｄ１（０−１５，ＧａｌＮＡｃ−ＳＯ））もＤ１ペプチドに比較して活性が高かった。

一方、アルキル化したＤ１ペプチド（Ｃ１８−Ｄ１）、Ｄ１（４−１２）、Ｄ１（７−１５）では、Ｄ１ペプチドと比較し、インフルエンザ感染阻害活性が向上していた（Ｄ１ペプチドに関しては、特開２００２−２８４７９８参照）。しかし、糖鎖修飾Ｄ１ペプチドの場合には、アルキル化した場合（Ｃ１８−Ｄ１（ＧａｌＮＡｃ−Ｓ７））でも、アルキル化しない場合（Ｄ１（ＧａｌＮＡｃ−Ｓ７））と比べ、感染阻害活性の有意な上昇を示さなかった。さらに、糖鎖修飾されていても、アミノ酸配列がＤ１配列と逆の場合（ｒＤ１（ＧａｌＮＡｃ−Ｓ７））には阻害活性を示さず、また、Ｄ１ペプチドであってもＧｌｃあるいはＬａｃで糖鎖修飾されている場合には阻害活性を示さなかった。

このように、糖鎖修飾されていないヘマグルチニン結合ペプチドは、そのアルキル化によりウイルス阻害活性が向上する。しかし、ＧａｌＮＡｃ糖鎖修飾されたヘマグルチニン結合ペプチドでは、そのアルキル化の有無に関わらず、Ｈ１あるいはＨ３を有するウイルスの感染阻害活性が向上する。

[実施例４]
本実施例では、各合成ヘマグルチニン結合ペプチドの臨界ミセル濃度を測定する。

上記実施例１で合成した各ペプチドのうちＤ１、Ｃ１８−Ｄ１、Ｄ１（ＧａｌＮＡｃ−Ｓ７）、およびＣ１８−Ｄ１（ＧａｌＮＡｃ−Ｓ７）を０．００１μＭ〜３０μＭの濃度に希釈し、各１ｍｌをガラスチューブ（１３ｘ１００ｍｍ）に導入した。これを、分光蛍光光度計（ＦＬ−２５００、日立）により４４０ｎｍ波長を照射して蛍光強度を測定した。ここで得られた結果について、縦軸に測定した蛍光強度、横軸にｌｏｇ変換した濃度をプロットし、蛍光強度が増大し始めるペプチド濃度を臨界ミセル濃度と決定した。

背景技術および実施例３でも述べた通り、インフルエンザウイルス受容体結合性ペプチドをアルキル化することにより、ペプチドがミセルを形成しやすくなり、同時にその感染阻害活性が向上することは既に開示されている（特開２００６−１０１７０９、特開２００７−１４５７７７）。表８に示すように、アルキル化ペプチドであるＣ１８−Ｄ１とＣ１８−Ｄ１（ＧａｌＮＡｃ−Ｓ７）はそれぞれ０．２９μＭ、０．３８μＭの濃度でミセルを形成することが示された。一方で、Ｄ１およびＤ１（ＧａｌＮＡｃ−Ｓ７）はミセルを形成しないことが示された。

このように、糖鎖修飾ヘマグルチニン結合ペプチドは、ミセルを形成しないにも関わらず、高いインフルエンザウイルス感染阻害活性を有する。

Claims (11)

1. 糖鎖で修飾されていることを特徴とするヘマグルチニン結合ペプチド。
2. 配列番号１、３、５のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のヘマグルチニン結合ペプチド。
3. 前記糖鎖がＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）であることを特徴とする、請求項１または２に記載のヘマグルチニン結合ペプチド。
4. 前記糖鎖が、セリン残基に付加されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のヘマグルチニン結合ペプチド。
5. 請求項１〜４のいずれかに記載のヘマグルチニン結合ペプチドを含有する医薬組成物。
6. インフルエンザの治療または予防に用いるための、請求項５に記載の医薬組成物。
7. ヘマグルチニン結合ペプチドの、ヘマグルチニン結合性を向上させるための方法であって、糖鎖で修飾することを特徴とする方法。
8. 前記ヘマグルチニン結合ペプチドが、配列番号１、３、５のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. 前記糖鎖がＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）であることを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
10. 前記糖鎖を前記ペプチドのセリン残基に結合させることを特徴とする請求項７〜９に記載の方法。
11. 配列番号１、２、３のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド。