EA011037B1

EA011037B1 - Олигомерные пептиды и их применение для лечения вич инфекций

Info

Publication number: EA011037B1
Application number: EA200700062A
Authority: EA
Inventors: Кнут Адерманн; Франк Кирххофф; Ян Мюнх; Аксель Шульц; Вольф-Георг Форссманн
Original assignee: Ипф Фармасьютикалз Гмбх
Priority date: 2004-06-18
Filing date: 2005-06-17
Publication date: 2008-12-30
Also published as: AU2005254736B2; AP2007003877A0; BRPI0511005A; CN100577686C; NO20070296L; WO2005123771A3; US20070123465A1; EP1756160B1; JP4782782B2; AU2005254736A1; JP2008505854A; WO2005123771A2; CA2569807A1; EP1756160A2; EA200700062A1; ZA200705769B; AP2081A; MXPA06014393A; CN1968964A

Abstract

Изобретение относится к олигомерным пептидам с биологической активностью против ВИЧ инфекции, имеющим аминокислотную последовательность (Z-LE-X-IP-X-X-X-P-X-X-X-X-X-X-K-X-X-X-X-X-Z), где n указывает число мономерных пептидных цепей, причем n равно 2, 3 или 4; Xпредставляет собой лизин, аланин или аспарагиновую кислоту; Хпредставляет собой цистеин, метионин или изолейцин; Хпредставляет собой серии, цистеин, лизин или глицин; Хпредставляет собой изолейцин, аланин, фенилаланин или цистеин; Хпредставляет собой пролин, D-пролин или замещенный L-или D-пролин; Хпредставляет собой цистеин или глутаминовую кислоту; Хпредставляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или цистеин; Хпредставляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или цистеин; Хпредставляет собой аминокислоту с ароматической боковой цепью; Хпредставляет собой глицин, аланин или аспарагин; Хпредставляет собой пролин, аспарагиновую кислоту, октагидроиндолил-2-карбоновую кислоту или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту; Xпредставляет собой фенилаланин, аланин, глицин, глутаминовую кислоту или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту; Xпредставляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью; Xпредставляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью; Xпредставляет собой фенилаланин или удален; Zпредставляет собой NHили последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков; Zпредставляет собой СООН или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков; и олигомерным пептидам, которые представляют собой их фрагменты и/или производные, особенно амидированные, алкилированные, ацилированные,

Description

Настоящее изобретение относится к олигомерным пептидам, которые проявляют ингибиторную активность в отношении инфицирования клеток человека вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). В частности, они представляют собой олигомерные пептиды, включающие мономерные пептидные цепи с аминокислотной последовательностью (Ζ₁ -ЬЕ-Х₁ -ΙΡ-Χ2-Χ3-Χ4-Ρ-Χ5-Χ6-Χ7 -Х₈-Х₉-Х₁₀-К-Х_п -Х₁₂-Х₁₃-Х₁₄Χ₁₅-Ζ₂)_η, где η указывает число мономерных пептидных цепей, в соответствии с чем η равно 2, 3 или 4; Х₁представляет собой лизин, аланин или аспарагиновую кислоту; Х₂ представляет собой цистеин, метионин или изолейциы; Х₃ представляет собой серии, цистеин, лизин или глицин; Х₄ представляет собой изолейцин, аланин, фенилаланин или цистеин; Х₅ представляет собой пролин, Ό-пролин или замещенный Ьили Ό-пролин; Х₆ представляет собой цистеин или глутаминовую кислоту; Х₇ представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или цистеин; Х₈ представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или цистеин; Х9 представляет собой аминокислоту с ароматической боковой цепью; Х₁₀ представляет собой глицин, аланин или аспарагин; Х₁₁представляет собой пролин, аспарагиновую кислоту, октагидроиндолил-2-карбоновую кислоту или Ό1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту; Х₁₂ представляет собой фенилаланин, аланин, глицин, глутаминовую кислоту или И-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту; Х₁₃ представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью; Х14 представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью; Х15 представляет собой фенилаланин или удален; Ζ₁ представляет собой ΝΗ₂ или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков; Ζ₂представляет собой СООН или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков; и олигомерные пептиды, которые представляют собой их фрагменты и/или производные, особенно амидированные, алкилированные, ацилированные, сульфатированные, пэгилированные, фосфорилированные и/или гликозилированные производные и их мутанты; и при условии, что (а) если Х₁₂ представляет собой аланин, глицин, глутаминовую кислоту или П-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту, то Х₁₃, Х₁₄ и Х₁₅ представляют собой фенилаланин, валин и фенилаланин, соответственно; и/или (Ъ) если Х₁₂ представляет собой фенилаланин, то Х₁₃, Х₁₄ и Х₁₅ представляют собой валин, фенилаланин и удаление, соответственно; и (с) в любой мономерной пептидной цепи олигомерного пептида существует максимально три цистеиновых остатка; и (ά) олигомерный пептид не является последовательностью (ЕЕЛ1РС81РРЕЕЬЕОКРЕУЕ)₂ (У1В-576) и (е) мономерные пептидные цепи не связаны пептидными связями между Νконцом одной пептидной цепи и С-концом другой пептидной цепи.

Кроме того, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим мономерные пептидные цепи олигомерных пептидов по изобретению, за исключением тех молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют мономерные пептидные цепи, уже раскрытые в патенте АО 2004/056871. Настоящее изобретение также касается антител, которые специфически связываются с олигомерными пептидами, а также к лекарственному средству, включающему указанные пептиды, нуклеиновые кислоты и/или антитела. Раскрыто также применение олигомерных пептидов по изобретению для получения лекарственного средства для лечения ВИЧ инфекций. Настоящее изобретение также касается теста, включающего, по меньшей мере, один олигомерный пептид по изобретению, для определения молекул, способных взаимодействовать с гибридным белком ВИЧ. Более того, настоящее изобретение действительно раскрывает диагностическое средство, содержащее, по меньшей мере, один из олигомерных пептидов по изобретению, и/или, по меньшей мере, одну молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению и/или, по меньшей мере, одно антитело по изобретению. Раскрывается также применение олигомерных пептидов по изобретению в указанном выше тесте, а также применение диагностического средства для тестирования выделенных плазмы, ткани, мочи, семенной жидкости и/или цереброспинальной жидкости на ВИЧ инфекцию.

Уровень техники

В последние годы выполнялись интенсивные исследования в области лекарств с активностью против ВИЧ инфекции. Разработано и протестировано несколько лекарств, которые задерживают и подавляют проявление СПИДа и снижают уровень ВИЧ в крови. В США продолжительность жизни ВИЧинфицированных больных после проявления СПИДа поднялась с 11 месяцев в 1984 г. до 46 месяцев в 1997 г.

При поиске лекарств применяли различные стратегии, которые привели к нескольким классам лекарств, таким как блокаторы протеаз, ингибирующие протеазу, которая требуется вирусу для репликации, и лекарства, ингибирующие обратную транскриптазу вируса, которая существенна для репликации ретровирусов. Совсем недавно разработанная группа активных агентов представляла собой ингибиторы слияния, которые должны предотвращать слияние вируса с клетками-хозяевами. Было показано также, что предоставление интерлейкина-2 в сочетании с другими активными агентами может повышать силу иммунного ответа.

Ингибиторы входа блокируют присоединение вирусных частиц ВИЧ к клеткам крови с помощью блокирования одной из молекулярных стадий, происходящих при прикреплении вируса к клетке-хозяину и входе в клетку-хозяина. Важной стадией является связывание ВИЧ с одним из главных корецепторов хемокинов ССР5 и СХСР4 (СС рецептор хемокинов 5 и СХСР рецептор хемокинов 4). Эти корецепторы локализованы на поверхности клеток крови и требуются для связывания белков оболочки ВИЧ перед

- 1 011037 внедрением вируса. Другая стадия взаимодействия вируса с клетками, требуемая для входа, представляет собой связывание белка оболочки ВИЧ др 120 с клеточными рецепторами СИ4. Эти стадии часто обозначаются как прикрепление вирусной частицы к клеткам-мишеням. Блокирование связывания ВИЧ с корецепторами хемокинов, как показано, подавляет вход вируса (8!πζ1<ί 1.М., Ргос. №111. Асай 8с1. И8Л, 2001, 98, 12718-12723). То же самое происходит, как сообщалось, при блокировании взаимодействия др1120 с рецепторами СИ4 (Бш е! а1., Ргос. №а!1. Асас1 8с1. И8А, 2003,100, 11013-11018). Белок др41 также был признан как потенциальная мишень для разработки лекарства против ВИЧ (Согйоп е! а1., АГО8 Векеагсй апй Нитап Ве1гоу1гикек 11,677-686, 1995). Первый одобренный гибридный ингибитор представляет собой энфувирид (Т-20, ГГ^еоп. ΌΡ178) (патенты νϋ 01/51673 А2; νϋ 96/40191; Сегу1а 1.8. е! а1., С1ш. 1пГес!. Όίκ, 2003, 37, 1102-1106; КйЬу 1.М., №а!иге Мейюте, 1998, 4, 1302-1307). Этот гибридный ингибитор идентичен части белка др41 оболочки ВИЧ, названной НВ-2, и ингибирует слияние ВИЧ-клеток путем связывания с сегментом НВ-1 (НВ = семичленный повтор) др41, таким образом предотвращая связывание НВ-2 с сегментом НВ-1 др41, что, в свою очередь, предотвращает образование шестиспирального пучка, требуемого для слияния вирусной частицы и клетки крови. Не было показано, что Т-20 связывает сегменты белка, отличные от НВ-1 др41 ВИЧ, или даже другие молекулы вирусного или эукариотного происхождения. Другой агент с биологической активностью против ВИЧ описан недавно в патенте νϋ 01/34640. Раскрывается пептид из 20 аминокислот, названный У1В1Р (ингибирующий вирус пептид), который выделен из гемофильтрата человека, и обнаружено, что он ингибирует инфицирование клеток человека ВИЧ. Синтетические производные У1В1Р с биологической активностью против ВИЧ раскрыты в патенте νϋ 2004/056871.

Несмотря на эти попытки и различные доступные лекарства, проблема остается нерешенной, так что все еще нет лечения против СПИДа, потому что известные лекарства, хотя и способны существенно снижать уровень ВИЧ в организме и инфицированных ВИЧ клетках крови, не удаляют вирус полностью. Конкретное препятствие заключается в том, что ВИЧ особенно склонен к мутациям, которые часто ведут к развитию устойчивости против определенных лекарств. В целом известные лекарства являются достаточно эффективными, только если они вводятся в сочетании с другими лекарствами. Такая комбинированная терапия в настоящее время увеличивает продолжительность жизни среднего больного, не обеспечивая излечение, и обычно сопровождается тяжелыми побочными эффектами и часто не позволяет больному вести «нормальную» жизнь.

В медицине существует огромная потребность в обеспечении новыми лекарствами и усовершенствованными лекарствами, которые будут вести к улучшенному лечению, меньшим побочным эффектам и существенному увеличению средней продолжительности жизни инфицированных ВИЧ перед или после проявления СПИДа.

Настоящее изобретение обращено к проблеме обеспечения новыми лекарствами, которые будут преодолевать проблемы, описанные выше, и предоставят эффективное лечение или внесут вклад в эффективную сочетанную терапию.

Краткое изложение сущности изобретения

Неожиданно проблема решается с помощью олигомерных пептидов, предлагаемых в настоящем изобретении, которые взаимодействуют, по меньшей мере, с гибридным белком др41 ВИЧ. Гибридный пептид представляет собой самую аминоконцевую часть др41, состоящую из приблизительно 30 аминокислотных остатков. В настоящей модели гидрофобный гибридный пептид др41 служит в качестве якоря, связывающего вирусную частицу с мембраной клетки-хозяина (И1тйгоу А.8. е! а1., ВюсйетШгу, 2003, 42, 14150-14158; МоЬ1еу е! а1., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а, 1999, 1418, 1-18), и пептиды настоящего изобретения вмешиваются в процесс вхождения ВИЧ в клетку, и, таким образом, предотвращают вхождение вируса.

Пептиды настоящего изобретения представляют собой пептиды, проявляющие биологическую активность против инфицирования ВИЧ, включающие мономерные пептидные цепи с аминокислотной последовательностью (2₁-БЕ-Х₁-1Р-Х₂-Х₃-Х₄-Р-Х₅-Х₆-Х₇-Х₈-Х₉-Х₁₀-К-Х₁₁-Х₁₂-Х₁₃-Х₁₄-Х₁₅-2₂)_п, где п указывает число мономерных пептидных цепей, в соответствии с чем п равно 2, 3 или 4;

X_I представляет собой лизин, аланин или аспарагиновую кислоту;

Х₂ представляет собой цистеин, метионин или изолейцин;

Х₃ представляет собой серии, цистеин, лизин или глицин;

Х4 представляет собой изолейцин, аланин, фенилаланин или цистеин;

Х₅ представляет собой пролин, Ό-пролин или замещенный Б-или Ό-пролин;

Х6 представляет собой цистеин или глутаминовую кислоту;

Х7 представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или цистеин;

Х8 представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или цистеин;

Х₉ представляет собой аминокислоту с ароматической боковой цепью;

Х₁₀ представляет собой глицин, аланин или аспарагин;

XII представляет собой пролин, аспарагиновую кислоту, октагидроиндолил-2-карбоновую кислоту

- 2 011037 или О-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту;

Х₁₂ представляет собой фенилаланин, аланин, глицин, глутаминовую кислоту или Ό-1,2,3,4тетрагидроизохинолин-3 -карбоновую кислоту;

Х₁₃ представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью;

Х₁₄ представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью;

Х₁₅ представляет собой фенилаланин или удален;

Ζ₁ представляет собой ΝΗ₂ или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков; Ζ₂ представляет собой СООН или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;

и олигомерные пептиды, которые представляют собой фрагменты и/или производные, особенно амидированные, алкилированные, ацилированные, сульфатированные, пэгилированные, фосфорилированные и/или гликозилированные производные и их мутанты, и при условии, что (a) если Х₁₂ представляет собой аланин, глицин, глутаминовую кислоту или Ό-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту, то Х₁₃, Х₁₄ и Х₁₅ представляют собой фенилаланин, валин и фенилаланин, соответственно; и/или (b) если Х₁₂ представляет собой фенилаланин, то Х₁₃, Х₁₄ и Х₁₅ представляют собой валин, фенилаланин и удаление, соответственно; и (c) в пептиде существует максимально три цистеиновых остатка; и (й) олигомерный пептид не представляет собой (ЬЕА1РС81РРЕРЕР6КРРУР)₂ (У1Е-576); и (е) мономерные пептидные цепи не связаны пептидными связями между Ν-концом одной пептидной цепи и С-концом другой пептидной цепи.

В предпочтительном осуществлении указанного выше пептида с общей формулой ^1-ЬЕ-Х1-1Р-Х₂Х₃-Х₄-Р-Х₅-Х₆-Х₇-Х₈-Х9-Х1₀-К-Хц-Х1₂-Х1₃-Х1₄-Х1₅^₂)_п, Х₇ представляет собой фенилаланин, цистеин, валин, изолейцин, лейцин, 3,3-дифенилаланин, 1-нафтилаланин или п-фторфенилаланин; Х₈ представляет собой фенилаланин, лейцин, аланин, триптофан, глицин, цистеин, О-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3карбоновую кислоту или Ь-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту; Х₉ представляет собой фенилаланин или О-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту; и Ζ₁ предпочтительно представляет собой ΝΗ2 или последовательность из от 1 до 3 аминокислотных остатков, и Ζ2 предпочтительно представляет собой СООН или последовательность из от 1 до 3 аминокислотных остатков. Биологическая активность против ВИЧ инфекции указанных выше пептидов при измерении как 1С₅₀ равна или ниже 6500 нМ.

Дополнительное осуществление пептидов по изобретению с биологической активностью против инфицирования ВИЧ представляет собой такое, где пептиды имеют аминокислотную последовательность где п указывает число мономерных пептидных цепей, в соответствии с чем п равно 2, 3 или 4;

Х₃ представляет собой серии, цистеин или глицин;

Х4 представляет собой изолейцин или цистеин;

Х₅ представляет собой пролин, Ό-пролин или любой замещенный Ь- или Ό-пролин;

Х₇ представляет собой фенилаланин, цистеин, валин, изолейцин или 3,3-дифенилаланин;

Х₈ представляет собой фенилаланин, лейцин, аланин, глицин, цистеин, Ό-1, 2, 3, 4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту или Ь-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту;

Х9 представляет собой аминокислоту с ароматической боковой цепью;

Х₁₀ представляет собой глицин или аспарагин;

X_II представляет собой пролин или И-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту; Ζ₁ представляет собой ΝΗ₂ или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков; Ζ₂ представляет собой СООН или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;

и олигомерные пептиды, которые представляют собой фрагменты и/или производные, особенно амидированные, алкилированные, ацилированные, сульфатированные, пэгилированные, фосфорилированные и/или гликозилированные производные и их мутанты.

В предпочтительном осуществлении указанного выше олигомерного пептида с общей формулой ^1-ЕЕ-Х1-1Р-Х₂-Х₃-Х₄-Р-Х₅-Х₆-Х₇-Х₈-Х₉-Х1₀-К-Х11-РУР^₂)_п, Х₉ представляет собой фенилаланин или Ό1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту, Ζι представляет собой предпочтительно ΝΗ₂ или последовательность из от 1 до 3 аминокислотных остатков, и Ζ₂ представляет собой предпочтительно СООН или последовательность из от 1 до 3 аминокислотных остатков. Биологическая активность против ВИЧ инфекции указанного выше олигомерного пептида при измерении как 1С₅₀ равна или ниже 2000 нМ.

Еще одно осуществление олигомерных пептидов по изобретению с биологической активностью против инфицирования ВИЧ представляет собой такое, где пептиды имеют аминокислотную последовательность (^-ЕЕ-Х₁-1Р-Х2-Х₃-1Р-Х5-Х6-Х7-Х8-Р-Х10-КРРУР^2)п,

- 3 011037 где η указывает число мономерных пептидных цепей, в соответствии с чем п равно 2, 3 или 4;

Χι представляет собой лизин, аланин или аспарагиновую кислоту;

Х₃ представляет собой серии или глицин;

Х₅ представляет собой Ь-пролин, Ό-пролин или любой замещенный Ь- или Ό-пролин;

Х₆ представляет собой цистеин или глутаминовую кислоту;

X- представляет собой фенилаланин или валин;

Χ₈ представляет собой фенилаланин, лейцин, аланин или Ь-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3карбоновую кислоту;

В предпочтительном осуществлении олигомерного пептида с общей формулой (Ζι-ΕΕ-Χι-ΙΡ-Χ₂-Χ₃ΙΡ-Χ₅-Χ₆-Χ_--Χ₈-Ε-Χι₀-ΚΡΕνΕ-Ζ₂)_η, Ζ_£ представляет собой предпочтительно NΗ₂ или последовательность из от 1 до 3 аминокислотных остатков, и Ζ2 представляет собой предпочтительно СООН или последовательность из от 1 до 3 аминокислотных остатков. Биологическая активность против ВИЧ инфекции пептида при измерении как 1С₅₀ равна или ниже 800 нМ.

Еще одно осуществление олигомерных пептидов изобретения с биологической активностью против инфицирования ВИЧ представляет собой такое, где пептиды имеют аминокислотную последовательность (Ζι -ΕΕΆΙΡ-Χ₂-8ΙΡ-Χ₅-Χ₆-ν-Χ₈-ΕΝΚΡΕνΡ-Ζ₂)_η, где η указывает число мономерных пептидных цепей, в соответствии с чем п равно 2, 3 или 4;

Х₂ и Х₆ представляют собой цистеины или Х₂ представляет собой метионин и Х₆ представляет собой глутаминовую кислоту

Х₅ представляет собой Ό-пролин или Ь-пролин;

Х8 представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или лизин; Ζ1 представляет собой ΝΗ2 или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;

Ζ2 представляет собой СООН или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков; и олигомерные пептиды, которые представляют собой фрагменты и/или производные, особенно амидированные, алкилированные, ацилированные, сульфатированные, пэгилированные, фосфорилированные и/или гликозилированные производные и их мутанты, при условии, что, по меньшей мере, имеет место одно из следующего:

Х2 и Х6 представляют собой цистеины; или

Х₅ представляет собой Ό-пролин; или

Χ₈ не является лизином.

В предпочтительном осуществлении пептида с общей формулой (Ζ₁-ΕΕΆΙΡ-Χ₂-§ΙΡ-Χ₅-Χ₆-ν-Χ₈ΕΝΚΡΕνΕ-Ζ₂)_η, Ζι представляет собой предпочтительно ΝΗ₂ или последовательность из от 1 до 3 аминокислотных остатков, и Ζ2 представляет собой предпочтительно СООН или последовательность из от 1 до 3 аминокислотных остатков.

Предпочтительно в олигомерных пептидах изобретения цепи мономерных пептидов поперечно сшиты. Они могут быть поперечно сшиты с помощью либо прямых межмолекулярных связей между двумя боковыми цепями аминокислот двух мономерных пептидов, либо между боковой цепью аминокислоты одного мономерного пептида и Ν- или С-концом другого мономерного пептида. В другом осуществлении изобретения связи представляют собой непрямые связи посредством бифункциональных линкерных молекул.

Осуществление олигомерных пептидов настоящего изобретения является также таковым, где цистеиновые остатки в мономерных пептидных цепях в положениях 6 и 11, 6 и 12, - и 12 или 3 и 13 связаны с помощью межмолекулярной дисульфидной связи. Таким образом, олигомерные пептиды с цистеиновыми остатками в этих положениях могут существовать с межмолекулярным мостиком между этими остатками одной мономерной пептидной цепи или с дисульфидными связями между мономерными пептидными цепями, т. е. олигомеризация достигается за счет дисульфидных связей. Таким образом, осуществлением являются также те олигомерные пептиды, где каждая мономерная пептидная цепь включает два цистеиновых остатка, где олигомеризация достигается посредством двух цистеиновых остатков, которые связаны дисульфидными связями с двумя цистеиновыми остатками второй мономерной пептидной цепи, что ведет к гомодимеру, включающему две мономерные полипептидные цепи, связанные посредством двух дисульфидных мостиков. Осуществлением являются также олигомерные пептиды с тремя цистеинами в каждой мономерной пептидной цепи, где два цистеиновых остатка в каждой мономерной единице вовлечены в межмолекулярную дисульфидную связь, и третий цистеин в каждой мономерной пептидной цепи принимает участие в олигомеризации путем образования дисульфидной связи с цистеиновым остатком мономерной цепи, не участвующей в межмолекулярной дисульфидной связи. Допол- 4 011037 нительным осуществлением являются олигомерные пептиды с одним цистеиновым остатком в каждой мономерной пептидной цепи, где указанные цистеиновые остатки связаны друг с другом с помощью дисульфидной связи, связывая, таким образом, мономерные пептидные цепи олигомерного пептида. Гомодимер, образованный таким путем, предпочтителен. В другом осуществлении олигомерных пептидов с цистеиновыми остатками в каждой мономерной пептидной цепи по меньшей мере один цистеиновый остаток в каждой мономерной пептидной цепи поперечно сшит посредством бифункциональной небольшой органической спейсерной группы, содержащей две тиоловые группы, с цистеиновым остатком в другой мономерной пептидной цепи олигомерного пептида. Димеры являются предпочтительным осуществлением олигомерных пептидов, включающих по меньшей мере один цистеиновый остаток.

Еще одним осуществлением является олигомерный пептид, включающий по меньшей мере одну из описанных выше черт, где по меньшей мере в одной из мономерных пептидных цепей олигомерного пептида остаток лейцина в аминокислотном положении 1, и глутаминовая кислота в аминокислотном положении 2, ковалентно связаны Ν-алкилированной амидной связью или сложной эфирной связью, или восстановленной пептидной связью, или ретроинверсной пептидной связью, или Ν-алкилированной ретроинверсной пептидной связью. Предпочтительными являются димеры, где остаток лейцина в аминокислотном положении 1, и глутаминовая кислота в аминокислотном положении 2, ковалентно связаны Ν-алкилированной амидной связью или сложной эфирной связью, или восстановленной пептидной связью, или ретроинверсной пептидной связью, или Ν-алкилированной ретроинверсной пептидной связью.

Осуществлением является также олигомерный пептид по меньшей мере с одной из описанных выше черт, включающий 2, 3 или 4 повторяющиеся единицы мономерной пептидной цепи в линейном порядке, где мономерные пептидные цепи ковалентно связаны посредством непрямой пептидной связи между Ζ₂ и Ζ₁ последовательных мономерных пептидных цепей. Непрямая пептидная связь возникает, если небольшой органический бифункциональный спейсер с аминогруппой и карбоксильной группой связывает Ζ2 с Ζ1 последовательных мономерных пептидных цепей. В таком линейном олигомерном пептиде с непрямой пептидной связью повторяющиеся единицы либо все являются идентичными мономерными пептидными цепями, приводя к гомогенному олигомерному пептиду, либо повторяющиеся единицы выбраны из различных мономерных пептидных цепей, так что тетрамер может включать 1, 2, 3 или 4 неидентичные мономерные пептидные цепи, тример - 1, 2 или 3 неидентичные мономерные пептидные цепи, или димер - 2 неидентичные мономерные пептидные цепи, приводя к гетерогенному олигомерному пептиду. Предпочтительные линейные олигомерные пептиды с непрямой пептидной связью представляют собой таковые с двумя повторяющимися единицами, т.е. димеры. Осуществлением являются также циклические олигомерные пептиды, в частности таковые с 2, 3 или 4 мономерными пептидными цепями. Одна форма циклического олигомерного пептида включает повторяющиеся единицы мономерной пептидной цепи, где первая и все последующие мономерные пептидные цепи ковалентно связаны посредством прямой или непрямой пептидной связи между Ζ₂ и Ζ₁ последовательных мономерных пептидных цепей, и существует по меньшей мере одна дополнительная ковалентная связь между первой и второй, и/или первой и третьей, и/или первой и четвертой мономерными пептидными цепями, и/или второй с третьей, и/или второй с четвертой мономерными пептидными цепями, и/или третьей с четвертой мономерными пептидными цепями. По меньшей мере одна дополнительная ковалентная связь может быть выбрана из группы амидных связей, в частности пептидных связей, таких как существующие между боковыми цепями аминокислотных остатков кислых и основных аминокислот, или аминоконцом первой мономерной пептидной цепи и карбоксиконцом последней мономерной пептидной цепи, оксимных связей, гидразоновых связей, тиазолидиновых связей, тиоэфирных связей, простых эфирных связей и дисульфидных связей между остатками цистеина и т. д.

Дополнительным осуществлением в соответствии с изобретением является любой из описанных выше линейных олигомерных пептидов, включающий в себя по меньшей мере один цистеиновый остаток, который либо образует прямую дисульфидную связь с цистеиновым остатком другого олигомерного пептида, включая линейный олигомерный пептид по меньшей мере с одним цистеиновым остатком, или где указанные цистеиновые остатки связаны друг с другом через короткий органический бифункциональный спейсер с двумя тиоловыми группами. Вместо или в дополнение к дисульфидному мостику между описанными выше линейными олигомерными пептидами и другим олигомерным пептидом связь между этими пептидами устанавливается через по меньшей мере одну амидную связь, образованную между одной карбоксильной группой и одной аминогруппой аминокислотных остатков с кислой и основной боковыми цепями, соответственно. Указанные кислые и основные боковые цепи могут альтернативно связываться через короткий органический бифункциональный спейсер, включающий аминогруппу, а также карбоксильную группу.

Дополнительное осуществление олигомерных пептидов по изобретению является таковым, где мономерные пептидные цепи ковалентно связаны друг с другом через по меньшей мере одну амидную связь между двумя мономерными пептидными цепями, что достигается с помощью ковалентной связи между аминогруппой боковой цепи основной аминокислоты в одной мономерной пептидной цепи и карбоксильной группой боковой цепи кислой аминокислоты в другой мономерной пептидной цепи. В частности, такие амидные связи могут образовываться между боковыми цепями остатка лизина и боковой

- 5 011037 цепью остатка аспартата, и/или между боковыми цепями остатка лизина и остатка глутамата. В дополнительном осуществлении олигомеризация этих пептидных цепей достигается непрямо с помощью бифункциональной небольшой органической спейсерной группы, содержащей одну аминогруппу и одну карбоксильную группу, которая поперечно сшивает эти мономерные пептидные цепи с помощью ковалентного связывания ее аминогруппы с карбоксилом боковой цепи кислой аминокислоты одной пептидной цепи и ее карбоксильной группы с аминогруппой боковой цепи основной аминокислоты второй пептидной цепи. Тетрамеры, тримеры и димеры могут быть образованы посредством прямой или непрямой амидной связи между боковыми цепями кислых и основных аминокислот мономерных пептидных цепей, где димеры являются предпочтительным осуществлением. Осуществлением являются также олигомерные пептиды, которые содержат до четырех пептидных цепей, ковалентно связанных пептидной связью через их карбоксиконец с аминогруппами аминокислоты, содержащей две аминогруппы, такой как лизин и низшие производные лизина. Дополнительное осуществление представляет собой олигомерный пептид, который включает две или четыре мономерные пептидные цепи и, по меньшей мере, одно лизиновое ядро, которое ковалентно связывает мономерные пептидные цепи. Лизиновое ядро функционирует в качестве линкерной молекулы (которая может быть также описана как спейсер) и имеет формулу КХ, гдэ X представляет собой либо аминокислоту, полиэтиленгликольную группу, либо отсутствует, т.е. X пропущен. Лизиновое ядро связывает две мономерные пептидные цепи путем образования двух пептидных связей с карбоксиконцами каждой мономерной пептидной цепи. Предпочтительной аминокислотой в лизиновом ядре является аланин, и предпочтительной полиэтиленгликольной группой является миниПЭГ. Лизиновое ядро может быть связано через аминокислоту с аминогруппами в ее боковых цепях, такими как остаток лизина или низший гомолог лизина, с другим лизиновым ядром посредством пептидной связи. Если оба лизиновых ядра ковалентно связывают две мономерные пептидные цепи, полученный олигомерный пептид включает 4 мономерные пептидные цепи. Лизиновое ядро также относится к дендримерной структуре, и мономерные пептидные цепи, как говорится, связываются с дендримерной структурой лизинового ядра. Дополнительным осуществлением являются олигомерные пептиды по изобретению, где мономерные пептидные цепи связаны через по меньшей мере одну оксимную, гидразоновую и тиазолидиновую связь, с применением реакционноспособных боковых цепей природных и неприродных аминокислот. Оксимные и гидразоновые связи могут возникать между альдегидной функциональной группой, образованной из аминокислоты с гидроксильной группой в боковой цепи, такой как серии, и гидроксиламиновой или гидразиновой боковой цепью, введенной через специальные аминокислоты, такие как аминооксиуксусная кислота, аминосерин или гидразинкарбоновая кислота. Образование тиазолидина может происходить между Ν-концевым остатком цистеина и альдегидными боковыми цепями (примеры: Сйаи \У.С. с1 а1. (ебйога), Гтос κοίίά рйаке рерОбе куиШеык: А ртасбса1 арртоасй, Οχίοτά Ишуегайу Рге55. Θχίοτά, 2000, р. 243-263; №уаЬюс11ет 2004/5 Са!а1одие, ВеадегЩ ίοτ Рерббе апб Нщ11ТйгоидйрЩ §уи1йе818, р.5.2-5.3). Осуществлением согласно изобретению является также олигомерный пептид, в котором каждая мономерная пептидная цепь включает по меньшей мере один аминокислотный остаток с атомом серы в боковой цепи, определяющий возможность ковалентной связи между мономерными пептидными цепями посредством тиоэфирного мостика. Среди тех олигомерных пептидов, которые связаны через по меньшей мере один тиоэфирный мостик, предпочтительны те, в которых связаны две мономерные пептидные цепи, т. е. димеры. Те олигомерные пептиды, в которых мономерные пептидные цепи связаны друг с другом через бифункциональную спейсерную молекулу, выбранную из группы органических спейсеров с двумя тиоловыми группами, органических спейсеров с двумя аминогруппами, органических спейсеров с двумя карбоксильными группами и органических спейсеров с одной карбоксильной группой и одной аминогруппой, являются дополнительным предпочтительным осуществлением; особенно олигомерные пептиды с двумя мономерными пептидными цепями, т. е. димеры.

Дополнительным осуществлением согласно изобретению являются олигомерные пептиды, которые взаимодействуют с гибридным пептидом др41 ВИЧ, характеризуемые 1С₅₀, равной или ниже 6500 нМ, такие как У1К.-574 (8ЕО ΙΌ ΝΟ. 2) или У1К.-57 7 (8ЕО ГО ΝΟ. 3), предпочтительно 1С₅₀, равной или ниже 2000 нМ, и наиболее предпочтительно 1С₅₀, равной или ниже 800 нМ, такие как νΐΚ-673 (8ЕО ГО ΝΟ. 4) с 1С₅₀ 607 нМ. Осуществлениями согласно изобретению являются также нуклеиновые кислоты, кодирующие мономерные пептидные цепи олигомерных пептидов настоящего изобретения, за исключением тех нуклеиновых кислот, которые уже раскрыты в патенте XVΟ 2004/056871. Таким образом, нуклеиновые кислоты, кодирующие мономерные пептидные цепи νΐΚ-674, νΐΚ-675, У1К.-676, У1К.-677, У1К.-678, νΐΚ-679, νΐΚ-680, νΐΚ-681, У1К.-682, У1К.-683, νΐΚ-684, νΐΚ-685, νΐΚ-686, νΐΚ-687, νΐΚ-688, νΐΚ-689, νΐΚ-690, νΐΚ-691, νΐΚ-692, УГО-693 и У1К.-694, которые соответствуют У1К.-166, νΐΚ- 175, νΐΚ-261, νΐΚ-273, νΐΚ-274, У1К-344, У1К-345, У1К-348, У1К-352, У1К- 353, У1К357, У1К-358, У1К-448, У1К-449, νΐΚ-454, У1К-455, νΐΚ-483, У1К- 484, νΐΚ-512, У1К-568 и νΐΚ-580, соответственно, в патенте νΟ 2004/056871, не являются частью изобретения. Дополнительными осуществлениями являются антитела, специфически связывающиеся с этими олигомерными пептидами изобретения. Антитела являются специфическими, так как они узнают олигомерные пептиды, но не выделенные мономерные пептидные цепи. Следовательно, сайт, связывающийся с антителом, включает часть молекулы, которая отлична от одной единичной мономерной цепи. Например, связывающий сайт может включать связь между двумя

- 6 011037 мономерными пептидными цепями.

Дополнительным осуществлением является лекарство, включающее любые из этих олигомерных пептидов, нуклеиновых кислот, за исключением тех, которые не заявляются, кодирующих мономерные пептидные цепи этих олигомерных пептидов, или специфических антител, направленных против этих олигомерных пептидов. В одном осуществлении лекарство находится в фармацевтических составах для перорального, внутривенного, внутримышечного, интраназального, внутрикожного, подкожного и/или внутриоболочечного введения. Дополнительным осуществлением является указанное лекарство, включающее, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент. Осуществлением также является лекарство, в котором указанный, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент представляет собой ингибитор вирусных протеаз, ингибитор обратной транскриптазы, ингибитор слияния, цитокин, ингибитор цитокинов, ингибитор интегразы, ингибитор гликозилирования или ингибитор мРНК вируса и т.д. Применение этих олигомерных пептидов для получения лекарства для лечения ВИЧ инфекций представляет собой дополнительное осуществление. Осуществлением является также тест для определения молекул, способных взаимодействовать с гибридным белком ВИЧ, включающим любой из указанных выше олигомерных пептидов изобретения. Применение этих олигомерных пептидов в указанном тесте также представляет собой осуществление. Дополнительным осуществлением является диагностический агент, включающий любые из описанных выше олигомерных пептидов, нуклеиновых кислот или антител, за исключением тех, которые не заявляются. Еще одним осуществлением является применение диагностического агента для тестирующих систем для тестирования уровней ВИЧ инфекции в выделенных плазме, ткани, моче, семенной жидкости и/или цереброспинальной жидкости.

Подробное описание изобретения

Олигомерные пептиды настоящего изобретения относятся к происходящему из гемофильтрата пептиду νΐΡΙΡ (8ΕΟ ΙΌ N0: 1), как раскрыто и описано в патенте АО 01/34640, и пептидам, раскрытым и описанным в патенте РСТ/ЕР03/15654, которые обладают биологической активностью в отношения предотвращения инфицирования ВИЧ. Пептиды настоящего изобретения отличаются от пептидов, раскрытых и описанных в патентах АО 01/34640 РСТ/ЕР03/15654, тем, что все они представляют собой олигомерную структуру, состоящую по меньшей мере из двух одинарных мономерных пептидных цепей.

Мономерные пептидные цепи связываются по меньшей мере одной ковалентной связью. Ковалентные связи могут представлять собой дисульфидную связь, амидную связь, в частности, пептидную связь, тиоэфирную связь, простую эфирную связь или оксимную, гидразоновую или тиазолидиновую связь. Для создания олигомерного пептида изобретения мономерные пептидные цепи олигомеризуют с помощью связывания по меньшей мере двух одинарных мономерных пептидных цепей с применением реакционноспособных групп боковых цепей аминокислот или концевых функциональных групп. Одинарные пептидные цепи либо синтезируются химически, либо продуцируются биотехнологически, т. е. с помощью экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих эти одинарные пептидные цепи, в микроорганизмах, таких как бактерии, например, Е. сой, в грибах, например, дрожжах, и/или в клетках млекопитающих в культуре, и затем ковалентно связываются с получением олигомеров. Олигомерные пептиды могут быть также синтезированы в виде дендримерных структур, которые содержат аминокислоты или группу, содержащую по меньшей мере две аминогруппы, к которым присоединяют мономерные пептидные цепи с применением способов твердофазного пептидного синтеза. Примерами таких групп являются орнитин, лизин, диаминомасляная кислота и диаминопропионовая кислота (№уаЫосйеш 2004/5 Са1а1одие, Веадеи18 Еот Рерйбе апб Нщй- ТйтоидйрЩ 8уп1йе515, р.26-29).

Олигомерные пептиды изобретения включают также полипептиды, которые собраны линейно из повторяющихся единиц мономерных пептидных цепей через непрямые пептидные связи, где повторяющиеся единицы соответствуют мономерным пептидным цепям. Непрямая пептидная связь возникает, если небольшой органический бифункциональный спейсер с аминогруппой и карбоксильной группой связывает Ζ₂ с Ζ₁ последовательных мономерных пептидных цепей. Олигомерный пептид с последовательностью (ΕΕΑΙΡί.’5>ΙΡΡΕΕΕΕΟΙ<ΡΕνΕ)₂ (νΐΒ-576), раскрытый в патенте РСТ/ЕР03/15654, где димеризация достигается посредством дисульфидной связи между остатками цистеина в положении 6 двух мономерных пептидных цепей, не является олигомерным пептидом по изобретению. Однако димер с (ЕЕА1РС81РРЕЕЕЕОКРЕУЕ)₂ (8ΕΟ ΙΌ N0. 56), где димеризация достигается любым другим способом, в частности через любой один из глутаматных остатков и небольшой бифункциональный линкер с двумя аминогруппами, который связывает две мономерные цепи путем образования двух амидных связей на глутаматных остатках, является частью настоящего изобретения. Частью настоящего изобретения является также димер с последовательностью (^ΕΑIРС8IРРΕΕ^Ε^I<РΕVΕ)₂ (8Ε0 ΙΌ N0: 57), где димеризация достигается через остаток лизина в аминокислотном положении 16 и небольшой бифункциональный линкер с двумя карбоксильными группами, который связывает две мономерные цепи путем образования двух амидных связей на двух остатках лизина.

Мономерные пептидные цепи олигомерных пептидов по изобретению все отличаются от νίΒΙΓ дикого типа (8Ε0 ΙΌ N0: 1), по меньшей мере, в аминокислотном положении 13, где νίΒΙΓ содержит остаток лизина, тогда как мономерные пептидные цепи олигомерных пептидов настоящего изобретения не содержат остатка лизина в аминокислотном положении 13. В дополнение к этому, мономерные пептид- 7 011037 ные цепи олигомерных пептидов настоящего изобретения имеют дополнительные изменения аминокислот среди их 20 или 21 аминокислоты по сравнению с У1К!Р (8ЕО Ш N0: 1). Все олигомерные пептиды настоящего изобретения обладают существенно более высокой активностью против ВИЧ (измеряемой по 1С₅₀ против двух штаммов ВИЧ-1), чем У1Я1Р (8Е0 Ш N0: 1). Мономерные пептидные цепи олигомерных пептидов изобретения основаны на аминокислотной последовательности из 20 или 21 аминокислоты с возможными расширениями от 1 до 10 аминокислот на обоих концах, соответственно Ζ₁ и Ζ₂, где расширение из 3 аминокислот предпочтительно. Применяемая здесь нумерация аминокислот всегда соответствует аминокислотам с 1 по 21 основной последовательности безотносительно к возможному Νконцевому расширению, обусловленному остатком Ζ1, так что аминокислотное положение 1 соответствует лейцину и аминокислотное положение 21 - фенилаланину или отсутствует. Применяются обычные одно- или трехбуквенные коды аминокислот. Если не указано иначе, используются Ь-знантиомеры аминокислот. Строчная буква «р» обозначает Ό-пролин. Другие Ό-энантиомеры указаны приставкой «Ό-». «Т1с» обозначает тетрагидроизохинолинкарбоновую кислоту. «0ю» обозначает октагидроиндолкарбоновую кислоту.

Термин «олигомерный пептид» относится к петтиду, включающему, в частности, две, три или четыре мономерные пептидные цепи, которые ковалентно связаны друг с другом. Предпочтителен димер, который представляет собой олигомерный пептид, образованный двумя ковалентно связанными мономерными пептидными цепями. Указанный димер включает по меньшей мере одну ковалентную связь между мономерными пептидными цепями, но может также иметь больше ковалентных связей. Олигомерный пептид с тремя мономерными пептидными цепями называется тримером. Олигомерный пептид с четырьмя мономерными пептидными цепями называется тетрамером. В тримерах минимальное количество соединяющих ковалентных связей составляет по меньшей мере две, но может быть выше, и тетрамеры должны включать по меньшей мере три ковалентные связи.

Термин «мономерная пептидная цепь» относится к пептидной единице олигомерного пептида и представляет собой аминокислотную последовательность из 20 или 21 аминокислоты с возможными расширениями от 1 до 10 аминокислот на обоих концах, соответственно Ζ₁ и Ζ₂, где расширение из 3 аминокислот предпочтительно. Олигомерный пептид изобретения включает п мономерных пептидных цепей.

Термин «олигомерный пептид», который обозначается формулой (последовательность),,, относится к молекуле, образованной η пептидами, ковалентно связанными друг с другом. При применении здесь ясно, что «олигомерный пептид» не ограничивается конкретным типом связи между мономерными пептидными цепями. Связь может быть, например, цистеиновым мостиком или связью с участием боковой цепи лизина. Термин «олигомерный пептид» и формула (последовательность )_η в контексте изобретения, таким образом, не понимается в том смысле, что η мономеров аминокислот все соединены с помощью традиционных пептидных связей между Ν- и С-концом.

Термин «поперечно сшитый» относится к любой межмолекулярной ковалентной связи между двумя мономерными пептидами, которая отличается от традиционной пептидной связи между Ν-концом одного мономерного пептида и С-концом другого мономерного пептида.

Термин «ковалентно связанный» вполне понятен специалисту в данной области техники и относится к связям, таким как амидные, тиоловые тиоэфирные, оксимные, гидразоновые и тиазолидиновые связи, которые вводятся для создания олигомерного пептида. В частности, это относится к двум, трем или четырем мономерным пептидным цепям, ковалентно связанным друг с другом, с созданием, таким образом, димеров, тримеров и тетрамеров соответственно. Олигомерные пептиды изобретения описываются как «ковалентно связанные», однако это не требует того, чтобы каждая мономерная пептидная цепь олигомерного пептида должна быть связана с каждой другой мономерной пептидной цепью в олигомерном пептиде; димеры ковалентно связаны с помощью по меньшей мере одной из перечисленных выше химических связей; тримеры ковалентно связаны с помощью по меньшей мере двух из перечисленных выше химических связей; таким образом, для первой мономерной пептидной цепи достаточно быть связанной со второй мономерной пептидной цепью, а для второй - быть связанной с третьей мономерной пептидной цепью; тетрамеры ковалентно связаны с помощью по меньшей мере трех из перечисленных выше химических связей, таким образом, для первой мономерной пептидной цепи достаточно быть связанной со второй мономерной пептидной цепью, а для второй - быть связанной с третьей мономерной пептидной цепью, и для третьей мономерной пептидной цепи достаточно быть связанной с четвертой мономерной пептидной цепью. Мономерные пептидные цепи в олигомерном пептиде могут иметь идентичную или различную аминокислотную последовательность. Олигомерные пептиды, созданные из идентичных мономерных пептидных цепей, обозначаются так же, как «гомогенные» олигомерные пептиды, и в случае димеров они обозначаются так же, как «гомодимеры». Если мономерные пептидные цепи в олигомерном пептиде отличаются, к олигомерному пептиду и его мономерным пептидным цепям применяется термин «гетерологичный». Ковалентная связь может быть «прямой связью» между соответствующими пептидными цепями, такой как дисульфидная связь, тиоэфирная связь, простая эфирная связь, амидная связь, оксимная связь, тиазолидиновая связь, гидразоновая связь, т. е. без спейсерной молекулы мостика. Пептидные цепи могут быть также ковалентно связаны с помощью спейсера любой химической природы

- 8 011037 (НоиЬсп-\Усу1. Мс11юЙ5 οί огдашс сйеш181гу, 8уп111С515 οί рерййек апй рерИйотшейск, Сеогд ТЫете Уег1ад, 81ийдаг1 2002), тогда говорится. что мономерные пептидные цепи связаны «непрямой связью». Предпочтительны небольшие органические бифункциональные спейсеры, такие как таковые с двумя тиоловыми группами, с двумя аминогруппами, с двумя карбоксильными группами и таковые с одной карбоксильной группой и одной аминогруппой.

Применяемый здесь термин «гидрофобная аминокислота» вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к любой из существующих в природе аминокислот глицину, аланину, валину, лейцину, изолейцину, метионину, пролину, фенилаланину, тирозину, триптофану и к неэндогенным гидрофобным аминокислотам. Сходные синтетические неэндогенные аминокислоты, имитирующие поведение существующих в природе аминокислот, могут быть также применены в той мере, если биологическая активность против ВИЧ существенно не снижается.

Применяемый здесь термин «ароматические аминокислоты» вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к любой из аминокислот - фенилаланину, тирозину, триптофану, гистидину и к неэндогенным ароматическим аминокислотам, таким как 1-нафтилаланин, 3,3дифенилаланин, п-фторфенилаланин или П-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбэновая кислота или Ь1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновая клслота и т.д. Сходные синтетические неэндогенные аминокислоты, имитирующие поведение таких аминокислот, могут быть также применены в той мере, если биологическая активность против ВИЧ существенно не снижается.

Термин «боковая цепь кислой аминокислоты» вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к карбоксильной кислотной боковой цепи глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты и любой другой природной или неприродной аминокислоты, несущей карбоновую кислоту в качестве функциональной группы боковой цепи, такой как 2-аминоадипиновая кислота.

Термин «боковая цепь основной аминокислоты» вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к аминогруппе боковой цепи лизина, орнитина или любой другой природной или неприродной аминокислоты, несущей аминогруппу в качестве функциональной группы боковой цепи, такой как диаминопропионовая кислота. Также аминокислоты с основными боковыми цепями, которые относятся к настоящему изобретению, представляют собой низшие производные лизина, которые обладают укороченной боковой цепью только из трех, двух или только одного углеродного атома (по сравнению с лизином), которые несут аминогруппу.

Термин «неприродная аминокислота» вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к любой аминокислоте, которая не принадлежит к 20 эндогенно существующим аминокислотам, которые представляют собой: глицин, цистеин, аланин, валин, лизин, лейцин, изолейцин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, глутамин, аспарагин, аргинин, гистидин, тирозин, фенилаланин, триптофан, серии, треонин, пролин и метионин.

Термин «мутанты» вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к вариантам последовательностей, в которых одна или более аминокислот, как раскрыто, заменены, т.е. одна или более аминокислот заменены другой аминокислотой; в частности, если один или более заместителей аминокислот представляют собой Ό-форму замещенной аминокислоты, и биологическая активность олигомерного пептида существенно не снижается по сравнению с незамещенным олигомерным пептидом. Введение Ό-аминокислот может быть полезным, например, для улучшения устойчивости к действию протеолитических ферментов. Мутанты изобретения предпочтительно отличаются от олигомерного пептида по п.1 по одной, двум, трем или четырем аминокислотам. В предпочтительном осуществлении мутации являются консервативными, так что свойства боковой цепи измененных аминокислот не отличаются существенно от исходной аминокислоты. Мутанты включают также варианты последовательностей, где одна или более аминокислот удалены из последовательности или вставлены в последовательность.

Термин «фрагменты» вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к вариантам последовательностей, в которых последовательность укорочена с Ν- или С-конца. В предпочтительных осуществлениях у олигомерных пептидов отсутствует до 2, 4 или 6 аминокислот с Νили С-конца.

Термин «производное» вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к химически модифицированному олигомерному пептиду. Эта модификация может представлять собой аминокислотную замену, множественные замены или различные химические модификации пептида на Ν- или С-конце, в боковых цепях пептида, в Са- и Να -атомах пептидного остова и атомах, образующих пептидные связи остова.

Термин «амидированный» вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к модификации олигомерного пептида, при которой С-концевая карбоксильная группа замещена СОМК.₂-группой, где В представляет собой атом водорода или любую функциональную группу, которой можно заместить, по меньшей мере, один из атомов водорода.

Термин «ацилированный» вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к олигомерным пептидам, которые содержат ковалентно связанный остаток карбоновой кислоты, отличный от аминокислоты у аминогрупп на Ν-конце и/или у боковых цепей аминогрупп.

- 9 011037

Термин «алкилированный» вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к олигомерным пептидам, которые модифицированы алкильной группой различной длины и структуры у Ν-концевой аминогруппы, у любого атома остова и/или у любой функциональной группы боковой цепи.

Термин «сульфатированный» вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к олигомерным пептидам, несущим сульфатную часть у гидроксильной группы тирозина или замещенного производного тирозинового остатка.

Термин «пэгилированный» вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к пептидам, которые содержат ковалентно связанную полиэтиленгликольную (ПЭГ) часть, состоящую по меньшей мере из двух повторяющихся единиц -СН₂-СН₂-О-, типичных для полиэтиленгликоля.

Предпочтительной является так называемая мини-ПЭГ группа. Пэгилированные группы могут иметь молекулярную массу до 20 кДа и могут связываться с различными функциональными группами в пептидной последовательности прямо или через спейсерную группу у Ν- или С-конца и/или у функциональных групп боковых цепей. Спейсерную группу выбирают из группы бифункциональных углеводородных цепей, характеризуемых остовом из двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми или девяти атомов углерода, и двумя функциональными группами, такими как две аминогруппы, две карбоксильные группы или одна аминогруппа и одна карбоксильная группа. Одна или более пэгилированных групп могут содержаться у различных сайтов пептида. В частности, предпочтительным является мини-ПЭГ на Сконцевой стороне пептида, за которой следует остаток цистеина.

Термин «фосфорилированный» вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к олигомерным пептидам, у которых гидроксильные группы боковых цепей треонина, серина, гидропролина, гидроксилизина, тирозина и/или любой другой неприродной гидроксиаминокислоты этерифицированы фосфатной группой.

Термин «гликозилированный» вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к олигомерным пептидам, которые содержат мономерную и/или олигомерную углеводную часть, которая связана посредством гликозильной или спиртовой гидроксильной группы с боковыми цепями серина, треонина, тирозина, аспарагина и/или неприродных аминокислот.

Термин «циклический» вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к олигомерным пептидам, которые содержат циклический структурный мотив по меньшей мере в одной из его мономерных пептидных цепей или циклический структурный мотив, включающий, по меньшей мере две мономерные полипептидные цепи. Циклизация может быть достигнута с помощью циклизации остова или путем связывания боковой цепи аминокислоты с боковой цепью другой аминокислоты, присутствующей в той же молекуле. В предпочтительном осуществлении изобретения два цистеиновых остатка или одна боковая цепь карбоновой кислоты и одна боковая цепь, содержащая аминогруппу, образуют циклический мотив посредством дисульфидной связи или амидной связи, соответственно.

Выражение «биологическая активность против инфицирования ВИЧ» относится к способности олигомерных пептидов, по меньшей мере, мешать или предотвращать вход вируса в клетки млекопитающих. Более конкретно, оно относится к его способности взаимодействовать с гибридным белком др41 ВИЧ. Биологическая активность против инфицирования ВИЧ измеряется по величине 1С₅₀. Предпочтительно, чтобы биологическая активность олигомерного пептида изобретения против ВИЧ инфекции была таковой, чтобы его величина 1С₅₀ была ниже величины 1С₅₀ У1В1Р дикого типа.

Олигомерные пептиды изобретения проявляют благоприятные свойства в плане противовирусной активности против инфекции ВИЧ и стабильности в плазме крови по сравнению с исходным У1К1Р (8ЕЦ ΙΌ N0.: 1) или мономерными аналогами. В частности, димерные пептиды обладают лучшими качествами и поэтому предпочтительны. Для получения димерных пептидов изобретения мономерные пептидные цепи химически соединяют с введением ковалентной связи между двумя пептидными цепями. Ковалентная связь может быть прямой связью между функциональными группами боковых цепей, такими как тиоловые группы остатков цистеина, или связью, включающей спейсер между пептидными цепями, имеющейся при связывании двух идентичных цепей пептида с двумя аминогруппами остатка лизина. Последнюю часто обозначают как наименьшая форма дендримера на основе лизина (8аб1ег К., 1. Вю1ес11по1оду, 2002, 90, 195-229). Две пептидные цепи могут быть также соединены посредством амидной связи между одиночными пептидными цепями, которая обеспечивается ковалентной связью между аминогруппой боковой цепи одной пептидной цепи и карбоксильной группой боковой цепи второй цепи. Эта связь может быть также обеспечена путем применения малой бифункциональной органической спейсерной молекулы, которая сшивает две пептидные цепи ковалентной связью с карбоксильной боковой цепью одной пептидной цепи и аминогруппой боковой цепи второй пептидной цепи. Более того, эта органическая спейсерная молекула может быть использована для сшивки двух идентичных пептидных цепей по аминогруппам, если спейсерная молекула содержит две кислотные группы, или для сшивки двух идентичных пептидных цепей по карбоксильным группам, если спейсерная молекула содержит две аминогруппы (РеппшЦоп е1 а1. (ебйога), РерДбе купШекЦ рго!осо1§, Нитапа Рге§8, То1о\га 1994). Две пептид

- 10 011037 ные цепи мономеров могут быть также соединены посредством образования оксима, гидразона и тиазолидина с применением реакционных боковых цепей природных или неприродных аминокислот (Воке К., 1. Ат. Сйет. 8ос, 1994, 116, 30-33; 8йао, 1. & Тат 1. Р., 1995, 1. Ат. Сйет. 8ос, 117, 3893-3899; Бщсй I. е! а1, Вюсои)цда1е Сйет., 1992, 3, 147-153; Ьш С.-Б. & Тат 1.Р., Ргос. Ыа11. Асаб. 8сЕ И8А, 1994, 91, 65846588). Кроме того, олигомерные пептиды изобретения получают твердофазным пептидным синтезом линейного олигомерного пептида, содержащего повторяющиеся единицы мономерных пептидных цепей.

Олигомерные пептиды согласно изобретению, в частности димерные пептиды изобретения структурно и биологически более стабильны и более активны по сравнению с νίΒΙΡ дикого типа (8ЕО ΙΌ N0: 1). Они проявляют повышенный период полужизни, что обеспечивает более высокую концентрацию в плазме. Кроме того, они вызывают повышение локальной концентрации противовирусно активной пептидной цепи в месте действия. Таким образом, олигомерные пептиды изобретения представляют собой молекулы, которые более благоприятно взаимодействуют с молекулой вирусного рецептора, вызывая более эффективную блокаду вхождения вируса.

Было также обнаружено, что путем избирательного варьирования аминокислотной последовательности мономерных пептидных цепей по отношению к νίΒΙΡ дикого типа (8Е0 ΙΌ N0. 1) получаются олигомерные пептиды со значительно повышенной активностью против ВИЧ. Наиболее значительное повышение активности наблюдается для олигомерных пептидов, в которых Ь-пролин в положении 10 олигомерной пептидной цепи заменен Ό-пролином и/или в положения аминокислот 6 и 11 введены два цистеина и/или когда положительно заряженный лизин в положении 13 заменен аминокислотой с гидрофобной или ароматической боковой цепью. Полагают, что повышение активности по сравнению с νίΒΙΡ дикого типа (8Е0 ΙΌ N0. 1 обусловлено изменением структуры. Известно, что цистеиновые мостики оказывают влияние на структуру и значительно снижают гибкость пептида, как и введение Ό-пролина, который вызывает изменение в элементах вторичной структуры пептида и, таким образом, изменяет ориентацию различных частей пептида относительно друг друга. Более того, замена лизина незаряженной гидрофобной или ароматической аминокислотой должна изменять структуру, поскольку меняется вероятное взаимодействие положительно заряженной боковой цепи лизина с отрицательно заряженными аминокислотами в положениях 2 и 11 той же молекулы или с отрицательно заряженной частью молекулы рецептора. Дополнительное значительное повышение активности против ВИЧ наблюдается при замене остатка аланина в положении 3 мономерной пептидной цепи олигомерного пептида положительно или отрицательно заряженным остатком путем замены остатками лизина или аспарагиновой кислоты. Введение заряженного остатка в положение 3 может повышать интенсивность связывания с соответствующей частью рецепторной молекулы за счет усиления электростатических или диполярных сил. Было обнаружено, что замена аминокислотных остатков в положениях 7 и/или 15 мономерных пептидных цепей олигомерного пептида небольшим аминокислотным остатком, в частности глицином, повышает активность против ВИЧ олигомерных пептидов согласно изобретению. Остатки глицина являются остатками, вносящими наименьшие стерические затруднения, и обеспечивают оптимальную внутреннюю укладку пептида при связывании с рецепторной молекулой или при образовании агрегатов, притом что они сами необходимы для связывания с рецепторной молекулой. Описанные замены могут сочетаться в мономерных пептидных цепях олигомерных пептидов изобретения.

Мономерные цепи пептидов изобретения могут быть химически синтезированы или получены рекомбинантной экспрессией нуклеиновых кислот, кодирующих мономерные пептидные цепи согласно изобретению. Из-за малого размера, т.е. малого количества аминокислот в мономерных пептидных цепях, находящихся в олигомерных пептидах изобретения, для химического синтеза таких мономерных пептидных цепей могут быть применены исключительно способы пептидного синтеза. По сравнению с синтезом гибридного ингибитора ВИЧ Т-20, для которого необходим синтез трех отдельных фрагментов с последующим соединением трех фрагментов с образованием конечного продукта Т-20, мономерные пептидные цепи настоящего изобретения можно синтезировать в большом масштабе с помощью ступенчатых твердофазных способов или при применении жидкофазной химии. Таким образом, способ получения мономерных пептидных цепей олигомерных пептидов настоящего изобретения является прямым, и поэтому издержки на производство олигомерных пептидов настоящего изобретения являются низкими. Ковалентное связывание мономерных пептидов также является прямым, т.е. для него не требуются сложные химические реакции, и поэтому реакция присоединения не вносит значительного вклада в стоимость конечных продуктов, включающих олигомерные пептиды.

Дополнительным преимуществом олигомерных пептидов настоящего изобретения является их растворимость и стабильность в широком диапазоне рН (рН 2-8,5) в растворителях с разной ионной силой. В частности, следует отметить их стабильность в плазме крови. Химический синтез можно проводить на твердой основе с помощью твердофазных способов или в жидкой фазе, причем оба способа являются стандартными способами, известными специалистам. Мономерные пептидные цепи олигомерных пептидов изобретения можно также синтезировать лигированием двух или более фрагментов с защищенными или незащищенными боковыми цепями с применением стандартных способов, известных специалистам (Тат 1.Р., Вюро1утега, 2001, 60, 194-205). Твердофазный синтез мономерных пептидных цепей олигомерных пептидов согласно изобретению или их фрагментов можно проводить с применением Бтос/1Вц- 11 011037 или Вос/Вх1-типа защиты аминокислот. Могут быть применены другие защитные группы, которые не входят в стандартную схему защиты Ртос. Очистка синтетических мономерных пептидных цепей и олигомерных пептидов осуществляется способами хроматографии, такой как с обращенной фазой, ионообменная или исключающая по размеру. Упомянутые выше способы химического синтеза мономерных пептидных цепей и олигомерных пептидов изобретения рассмотрены в нескольких обзорных публикациях (примеры: СНап У.С. е! а1. (еййогк), Ртос койй рНаке рерййе купШещк: А ргасйса1 арргоасй, ОхГогй Ишуегкйу Ргекк, ОхГогй, 2000; 8ее^а1й N. е! а1., Рерййек: Ыо1оду апй сйетщйу, УПеу-УСН, ХУетНет!, 2002; Соойтап М., НонЬеп-ХУеуГ Ме!Нойк оГ огдашс сйетщйу, 8уп1йек1к оГ рерййек апй рерИйоттейск, Сеогд ТЫете Уег1ад, 8!и!!даг! 2002).

Введение дисульфидной связи в мономерную пептидную цепь олигомерных пептидов изобретения может быть произведено применением окислительных химических способов в отношении мономерных пептидных цепей, содержащих по меньшей мере два цистеиновых остатка, способов, известных специалистам (РеппшЦоп е! а1. (еййогк), Рерййе куЩНейк рго!осо1к, Нитапа Ргекк, То!о\са 1994; СНап ХУ.С. е! а1. (еййогк), Ртос ко11й рНаке рерййе куЩНекй: А ргасйса1 арргоасй, ОхГогй ИшуегкИу Ргекк, ОхГогй, 2000). Дисульфидные связи между мономерными пептидными цепями олигомерных пептидов изобретения могут быть образованы при применении восстановленных мономерных пептидных цепей-предшественников, содержащих, по меньшей мере, один незащищенный цистеиновый остаток, полученных при твердофазном синтезе или синтезе в растворе, обработкой окислителем. В качестве окисляющих агентов могут быть применены кислород, диметилсульфоксид, соли железа(111), йод или другие. Дисульфиды мономерных пептидных цепей олигомерных пептидов изобретения можно альтернативно вводить в пептиды при применении предшественников, содержащих защитные группы на соответствующих цистеиновых остатках. В качестве защитных групп могут быть использованы ацетамидметил, трет-бутил, 8-третбутил или другие. Удаление защитных групп и образование внутрицепочечной дисульфидной связи может быть осуществлено при применении таких агентов, как йод, фосфины или другие.

Циклические мономерные пептидные цепи олигомерных пептидов, отличные от содержащих дисульфидную связь, могут быть получены посредством циклизации остова мономерной пептидной цепи или благодаря химической связи между по меньшей мере одной реакционной группой боковой цепи, такой как амино, карбокси, гидрокси или тио, и любой другой реакционной группой, находящейся в той же молекуле, как это известно специалисту (Ь1 е! а1., Сшт. Тор. Мей. СНет., 2002, 2, 325-341; Тат 1.Р., Вюро1утегк, 2001, 60, 194-205; Соойтап М., НонЬеп-ХУеуГ Ме1йойк оГ огдашс сйет1к1гу, 8уп!Нек1к оГ рерПйек апй рерИйоттейск, Сеогд ТЫете Уег1ад, 8!н!!даг! 2002).

Ковалентно связанные олигомеры мономерных пептидов получают соединением двух пептидных цепей с помощью химических связей разного типа. Связанные дисульфидом олигомеры синтезируют соединением двух пептидов либо с помощью активированных цистеинов, либо без какой-либо предварительной активации цистеинов (8асса В. е! а1., 1. Рер!. 8сЦ 2002, 8, 192-204; 8ее\\Ый N. е! а1., РерРйек: Ь1о1оду апй сйет1к1гу, Уйеу-УСН, ХУетНет!, 2002). Тиоэфирные связи, простые эфирные связи и пептидные связи между двумя пептидными цепями могут быть введены в соответствии с различными способами, известными специалисту и описанными в литературе (8ее\са1й N. е! а1., Рерййек: Ью1оду апй сйетЩгу, Уйеу-УСН, ХУетНет!, 2002). Дендримеры на основе лизина можно синтезировать присоединением Ртос-Ьук (Ртос)-ОН к твердой основе. После снятия защиты с аминокислоты твердофазный пептидный синтез ведет к олигомерным пептидам (8ее\\Ый N. е! а1., Рерййек: Ыо1оду апй сйеш1к!гу, ХУйеуУСН, Уешйет, 2002; СНап У.С. (еййогк) Ртос ко11й рНаке рерРйе куЩНекй: А ргасйса1 арргоасй, ОхГогй Ищуегкйу Ргекк, ОхГогй 2000). Между лизиновым остатком карбоксильного конца и пептидными цепями могут быть помещены дополнительные остатки лизина. Лизин можно заменить любой другой аминокислотой, содержащей две аминогруппы, такой как орнитин и любая неприродная аминокислота, содержащая аминогруппу в боковой цепи, такая как диаминопропионовая кислота.

В предпочтительном олигомерном пептиде согласно изобретению соединение двух пептидных цепей посредством амидной связи между двумя отдельными пептидными цепями обеспечивается ковалентной связью между аминогруппой боковой цепи одной пептидной цепи с карбоксильной группой боковой цепи второй цепи. Эту связь можно также получить при применении небольшой бифункциональной органической спейсерной молекулы, которая сшивает две пептидные цепи путем ковалентного связывания с карбоксильной боковой цепью одной пептидной цепи и с аминогруппой боковой цепи второй пептидной цепи. Более того, эта органическая спейсерная молекула может быть использована для сшивки двух идентичных пептидных цепей по их аминогруппам, если спейсерная молекула содержит две кислотные группы, или для двух идентичных пептидных цепей по их карбоксильным группам, если спейсерная молекула содержит две аминогруппы. Данные способы известны специалисту и описаны в литературе (РеппБпЦоп е! а1. (еййогк), Рерййе куЩНейк рго!осо1к, Нитапа Ргекк, То!о\са 1994).

Цитирование двух мономерных пептидных цепей с образованием оксима, гидразона или тиазолидина с использованием реакционных боковых цепей природных или неприродных аминокислот может быть осуществлено путем присоединения мономерного пептида с гидроксиламиновой или гидразиновой группой к пептиду, содержащему альдегидную группу, или путем присоединения пептида с ^концевым цистеином к пептиду с альдегидом с применением способов, известных специалисту и описанных в ли

- 12 011037 тературе (Сйап \У.С. е! а1. (ебйогк), Етос ко11б рйаке рерОбе куп(Нек1к: А ргасбса1 арргоасй, Θχίοτά Ишуегкйу Ргекк, Θχίοτά, 2000, р. 243-263; ЫоуаЫосйет 2004/5 Са1а1од. КеадеШк ίοτ Рерйбе апб Н1дй-Тйтоидйри1 8уп1йек1к, р.5.2-5.3; Коке К.,1. Ат. Сйет. 8ос, 1994, 116, 30-33; 8йао, 1. & Тат 1.Р., 1995, 1. Ат. Сйет. 8ос, 117, 3893-3899; Е1ксй I., е! а1., Вюсопщда1е Сйет., 1992, 3, 147-153; Ьш С.-Е. & Тат ЕР., Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А, 1994, 91, 6584-6588).

В следующем параграфе кратко описывается, как различные олигомерные пептиды изобретения ковалентно связываются. Все эти пептиды представляют собой димеры.

νΐΚ-674: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Сук6 и Сук11 одной мономерной пептидной цепи и Сук6 и Сук11, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-675: связан посредством амидной связи между С1и11 одной мономерной пептидной цепи и Ьук16 второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-676: связан посредством амидной связи между С1и 11 одной мономерной пептидной цепи и Ьук16 второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-677: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Сук7 и Сук12 одной мономерной пептидной цепи и Сук7 и Сук12, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΤΚ-678: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Сук7 и Сук12 одной мономерной пептидной цепи и Сук7 и Сук12, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΤΚ-679: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Сук6 и Сук11одной мономерной пептидной цепи и Сук6 и Сук11, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΤΚ-680: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Сук6 и Сук11 одной мономерной пептидной цепи и Сук6 и Сук11, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-681: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Сук6 и Сук11 одной мономерной пептидной цепи и Сук6 и Сук11, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-682: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Сук6 и Сук11 одной мономерной пептидной цепи и Сук6 и Сук11, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΤΚ-683: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Сук6 и Сук11 одной мономерной пептидной цепи и Сук6 и Сук11, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΤΚ-684: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Сук6 и Сук11 одной мономерной пептидной цепи и Сук6 и Сук11, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-685: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Сук6 и Сук11 одной мономерной пептидной цепи и Сук6 и Сук11, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-686: связан посредством амидной связи между С1и11 одной мономерной пептидной цепи и Ьук16 второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-687: связан посредством амидной связи между С1и11 одной единицы и Ьук16 второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΤΚ-689: связан посредством амидной связи между С1и11 одной мономерной пептидной цепи и Ьук16 второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-690: связан посредством амидной связи между С1и11 одной мономерной пептидной цепи и Ьук16 второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-691: связан посредством амидной связи между С1и11 одной мономерной пептидной цепи и Ьук16 второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-692: связан посредством амидной связи между С1и11 одной мономерной пептидной цепи и Ьук16 второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-693: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Сук8 и Сук13 одной мономерной пептидной цепи и Сук8 и Сук13, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-694: связан посредством амидной связи между С1и11 одной мономерной пептидной цепи и Ьук16 второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-695: связан посредством цистеинового мостика между Сук6 одной мономерной пептидной цепи и Сук6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-696: связан посредством цистеинового мостика между Сук6 одной мономерной пептидной цепи и Сук6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-697: связан посредством цистеинового мостика между Сук7 одной мономерной пептидной цепи и Сук7 второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-698: связан посредством цистеинового мостика между Сук7 одной мономерной пептидной цепи и Сук7 второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΤΚ-699: связан посредством цистеинового мостика между Сук6 одной мономерной пептидной цепи и Сук6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-700: связан посредством цистеинового мостика между Сук6 одной мономерной пептидной цепи и Сук6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-701: связан посредством цистеинового мостика между Сук6 одной мономерной пептидной цепи и Сук6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.

νΐΚ-702: связан посредством цистеинового мостика между Сук6 одной мономерной пептидной це

- 13 011037 пи и Сукб второй идентичной мономерной пептидной цепи.

У1К-703: связан посредством цистеинового мостика между Сукб одной мономерной пептидной цепи и Сукб второй идентичной мономерной пептидной цепи.

У1К.-704: связан посредством цистеинового мостика между Сукб одной мономерной пептидной цепи и Сукб второй идентичной мономерной пептидной цепи.

У1К.-705: связан посредством цистеинового мостика между Сукб одной мономерной пептидной цепи и Сукб второй идентичной мономерной пептидной цепи.

УТК-70б: связан посредством цистеинового мостика между Сукб одной мономерной пептидной цепи и Сукб второй идентичной мономерной пептидной цепи.

У1К-707: связан посредством цистеинового мостика между Сукб одной мономерной пептидной цепи и Сукб второй идентичной мономерной пептидной цепи.

У1К-708: связан посредством цистеинового мостика между Сукб одной мономерной пептидной цепи и Сукб второй идентичной мономерной пептидной цепи.

У1К-709: связан посредством цистеинового мостика между Сукб одной мономерной пептидной цепи и Сукб второй идентичной мономерной пептидной цепи.

У1К-710: связан посредством цистеинового мостика между Сукб одной мономерной пептидной цепи и Сукб второй идентичной мономерной пептидной цепи.

УТК-711: связан посредством цистеинового мостика между Сукб одной мономерной пептидной цепи и Сукб второй идентичной мономерной пептидной цепи.

У1К-712: связан посредством цистеинового мостика между Сукб одной мономерной пептидной цепи и Сукб второй идентичной мономерной пептидной цепи.

У1К-713: связан посредством цистеинового мостика между Сук8 одной мономерной пептидной цепи и Сук8 второй идентичной мономерной пептидной цепи.

У1К-714: связан посредством цистеинового мостика между Сукб одной мономерной пептидной цепи и Сукб второй идентичной мономерной пептидной цепи.

У1К-715: связан посредством цистеинового мостика между Сукб одной мономерной пептидной цепи и Сукб второй идентичной мономерной пептидной цепи.

У1К-71б: связан посредством цистеинового мостика между Сукб одной мономерной пептидной цепи и Сукб второй идентичной мономерной пептидной цепи.

У1К-717: связан посредством цистеинового мостика между Сукб одной мономерной пептидной цепи и Сукб второй идентичной мономерной пептидной цепи.

У1К-718: связан посредством дендримера на основе лизина.

У1К-719: связан посредством цистеинового мостика между Сукб одной мономерной пептидной цепи и Сукб второй идентичной мономерной пептидной цепи.

У1К-720: связан посредством цистеинового мостика между остатками Сук карбоксильных концов двух мономерных пептидных цепей.

У1К-721: связан посредством цистеинового мостика между Сук7 одной мономерной пептидной цепи, которая в дополнение к указанному цистеиновому мостику содержит внутримолекулярный цистеиновый мостик между Сукб и Сук11, и Сук7 второй мономерной пептидной цепи, которая также содержит внутримолекулярный цистеиновый мостик между Сукб и Сук11.

У1К-722: связан посредством цистеинового мостика между остатками Сук карбоксильных концов двух мономерных пептидных цепей, обе из которых содержат внутримолекулярный цистеиновый мостик между их Сукб и Сук11.

У1К-723: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Сукб и остатком Сук карбоксильного конца одной мономерной пептидной цепи и Сукб и остатком Сук карбоксильного конца, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи. Если данные олигомерные пептиды должны содержать дополнительные модификации, мономерные пептидные цепи модифицируют, как описывается ниже, до димеризации или в более общем случае до олигомеризации.

Амидированные пептидные мономеры получают твердофазным синтезом пептидов с применением смол, содержащих амидный линкер, на котором происходит сборка пептидной цепи. Кислотное отщепление соответствующим образом синтезированных пептидов дает амиды пептидов. При жидкофазном синтезе амидированные пептиды получают при использовании С-концевой аминокислоты в качестве строительного блока, который содержит на С-конце заранее образованный карбоксамид (Сбап А.С. (еб1ΐοΓδ) Ртос кобб рбаке рерббе куп!бек1к: А ргасбса1 арргоасб, ОхГогб Ишуегкбу Ргекк, ОхГогб 2000).

Ацилированные пептидные мономеры могут быть получены специалистами путем превращения пептида со свободными амино- или гидроксильными группами с применением активированных реагентов ацилирования, полученных из карбоновых кислот, таких как ацилгалогениды или карбоксильный ангидрид или другие реакционные карбонильные соединения для соответствующего ацилированного пептида. В качестве альтернативы, ацилирование может быть осуществлено с применением свободных карбоновых кислот, которые активируют ίη кби соединениями типа фосфония или урония (Сгеепе Т.А., Рго1есбуе дгоирк ίη огдашс сбетббу, 1обп Абеу & 8опк, Νονν Уогк, 1991; Коаепкк1 Р., РгсИесбпд дгоирк, Тб1ете-Уег1ад, ЕШйдаП 1994; 8ее\\'а1б Ν. е1 а1., Рерббек: Ью1оду апб сбетщбу, Абеу-УСН, Ае1пбе1т,

- 14 011037

2002).

Алкилированные пептидные мономеры могут быть получены путем включения предварительно алкилированных аминокислотных строительных блоков при проведении пептидного синтеза на твердой основе или в растворе. Такие аминокислоты присоединяют к пептидным цепям с применением стандартных протоколов активации, известных специалисту (Скал XV.С. (ебк:огз) Ттое зо11б рказе рерйбе зуи!кез1з: А ргас11са1 арргоаск, ОхГогб ишуегзку Ргезз. ОхГогб 2000). Алкилирование может быть также осуществлено после сборки пептидной цепи с помощью подходящих способов алкилирования. известных специалисту (Сгееие Τ.ν.. Рго1есйуе дгоирз ίη огдашс скеш1зйу. 1оки νίΚν & 8оиз. Ыете Уогк. 1991; Кос1еизк1 Р.. Рго1ес1тд дгоирз. ТЫете-Уегкщ. 8ЦЩдаП 1994). Такие способы могут быть применены в отношении реакционных групп. таких как амино-. гидроксильные-. тио- и пептидные связи в пептидном скелете частично защищенного пептида.

Сульфатированные пептиды получают с применением предварительно сульфатированных строительных блоков тирозина или производных тирозина при твердофазном пептидном синтезе или синтезе в растворе. О-сульфаты остаются присоединенными к гидроксильной группе при отщеплении пептида от смолы при применении для синтеза очень кислотолабильных смол. таких как 2-хлортритиловая смола (8еетеа1б N. е1 а1.. РерИПез: Ыо1оду аиб скеиизЦу. ΧνίΚν-νί'Ή. Vе^ηке^т. 2002).

Пэгилированные пептиды содержат остатки полиэтиленгликоля. связанные с функциональными группами пептида. Остатки полиэтиленгликоля отличаются гидрофильными линейными или разветвленными полимерными цепями с повторяющейся единицей -СН₂-СН₂О-. Остатки полиэтиленгликоля вводят в пептид после сборки пептидной цепи с помощью соответствующим образом функционально модифицированных и реакционных содержащих полиэтиленгликоль веществ. Различные активированные полиэтиленгликолевые группы могут быть присоединены к пептидам специалистом с применением различных способов активации к различным боковым цепям или концевым функциональным группам пептида. таким как амино. карбоксильная. гидрокси или тио ^егоиезе Т.М. е1 а1.. Вюсоищд. Скет.. 2001. 12. 6270; Vе^оиезе Р.М.. Вюта1епа1з. 2001. 22. 405-417).

Фосфорилированные пептиды можно синтезировать с помощью твердофазного пептидного синтеза или жидкофазного синтеза. Синтез фосфорилированных пептидов обычно обеспечивается специалистом путем применения фосфорилированных гидроксиаминокислотных строительных блоков и/или фосфорилирования защищенных пептидов. содержащих одну или более свободных гидроксильных групп. после сборки цепи (Миггау 1.8.. Вюро1утегз. 2001. 60. 3-31; Скаи Χν.Ο е1 а1. (ебкогз). Ртос зокб рказе реркбе зуп1кез1з: А ргасПса1 арргоаск. ОхГогб ишуегзку Ргезз. ОхГогб. 2000; 8ее\\'а1б N. е1 а1.. Рер11без: Ыо1оду аиб ске1шз1гу. ΧνίΚν-νί'Ή. Vе^ηке^т. 2002).

Гликозилированные пептиды могут быть получены специалистом путем применения гликозилированных аминокислотных строительных блоков. которые могут быть введены в твердофазный синтез или в жидкофазный синтез пептидов или с помощью общего способа гликозилирования после сборки цепи (Иау1з В.С.. Скет. Рсу.. 2002. 102. 579-602; Скаи Χν.Ο е1 а1. (еб11огз). Ртос зокб рказе рерИбе зуШкез1з: А ргас!1са1 арргоаск. ОхГогб ишуегзку Ргезз. ОхГогб. 2000; 8ее\\'а1б N. е1 а1.. Рер11без: Ыо1оду аиб скеикзЦу. №беу^СН. Уеткеи. 2002).

Изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот. кодирующим мономерные пептидные цепи олигомерных пептидов согласно изобретению. Предпочтительными нуклеиновыми кислотами являются ДНК и РНК. особенно кДНК и мРНК.

Предметом изобретения также являются антитела. специфически связывающие пептиды изобретения. Термин «специфически» хорошо понятен специалисту. В частности. он означает. что антитела не связывают или по существу не связывают родственные пептиды. подобные У1К1Р. которые не являются пептидами изобретения. Специалист в данной области техники получает антитела против пептидов изобретения с помощью традиционных способов. и он должен отобрать специфичные антитела изобретения с помощью известных способов скрининга.

Изобретение относится к олигомерным пептидам. которые специфически взаимодействуют с Νконцевой областью белка оболочки др41 ВИЧ и связывают ее. Термин «взаимодействовать с» и «связываться с» легко понятен специалисту. Путем такого связывания и взаимодействия олигомерные пептиды изобретения блокируют инфекцию клеток-хозяев частицами ВИЧ. Настоящее изобретение также относится к олигомерным пептидам. которые связываются с синтетическими пептидами. соответствующими гибридному пептиду др41 ВИЧ. Специалист в данной области техники определяет связывание и взаимодействие любого из олигомерных пептидов изобретения с синтетическим гибридным пептидом др41 ВИЧ путем применения количественных тестов для соотношения структура/активность (О8АР). Эти тесты включают. но не ограничиваются этим. определение подавления гемолитического действия синтетического гибридного пептида (МоЫеу Р/ν. е1 а1.. ВюсЫт. Вюркуз. Ас1а. 1992. 1139. 251-256; Согбои Ь.. ВюсЫт. Вюркуз. Ас1а. 1992. 1139. 257-274). микрокалориметрию (Сок1ке Н. е1 а1.. Аидете. Скет. кН. Еб. Еид1.. 2002. 41. 2644-2 676) или ЯМР-спектроскопические способы. которые могут представлять собой эксперименты по титрованию химического сдвига. спектроскопию разности переноса насыщения или двумерные способы (Меуег е1 а1.. Егпз1 8скегшд Вез. Роииб. Vо^кзкор. 2004. 44. 149-167).

Изобретение также относится к лекарственному средству. содержащему олигомерные пептиды.

- 15 011037 нуклеиновые кислоты или антитела изобретения. Лекарственное средство предпочтительно предлагается в виде лекарственных средств для перорального, внутривенного, внутримышечного, внутрикожного, подкожного и/или интратекального введения.

В предпочтительном осуществлении лекарственное средство включает по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент. Указанный по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент может представлять собой ингибитор вирусной протеазы, ингибитор обратной транскриптазы, ингибитор слияния, цитокин, ингибитор цитокина, ингибитор гликозилирования или ингибитор вирусной мРНК и т.д. Предпочтительно такие ингибиторы направлены против ВИЧ. Такие сочетанные лекарства очень эффективны в лечении СПИДа. Пептиды, нуклеиновые кислоты и антитела изобретения предпочтительно применяют при производстве лекарства для лечения инфекций ВИЧ. ВИЧ включает все известные штаммы ретровируса ВИЧ (вируса иммунодефицита человека), в особенности наиболее распространенные штаммы ВИЧ-1. ВИЧ-1 связан с вспышкой СПИДа.

Изобретение также относится к диагностическому средству, включающему олигомерные пептиды, нуклеиновые кислоты и/или антитела изобретения. Диагностическое средство может быть использовано в аналитических системах для тестирования выделенных плазмы, сыворотки, ткани, мочи, семенной и/или спинномозговой жидкости на предмет инфекции ВИЧ.

Изобретение также относится к аналитическим системам, в которые включен по меньшей мере один из олигомерных пептидов изобретения, в качестве инструмента для идентификации веществ, которые связываются с белком оболочки др41 ВИЧ, в особенности с Ν-концевым гибридным пептидом др41. Такие анализы могут представлять собой любую систему, которая пригодна для измерения связывания любого вещества с гибридным пептидом, либо включенным в природный белок др41 в выделенной, вирусной или любой другой форме, либо находящимся в синтетической форме с длиной до 35 аминокислотных остатков, начиная с самого Ν-конца др41. В таких анализах, которые могут быть любым спектроскопическим, клеточным или радиолигандным анализом, измеряют связывание вещества, конкурентное по отношению по меньшей мере к одному олигомерному пептиду изобретения. В результате таких конкурентных анализов с применением в качестве инструмента олигомерных пептидов изобретения достигается идентификация веществ с повышенными сродством и специфичностью к сайтам связывания др41 ВИЧ. Такие вещества обладают повышенной способностью блокировать инфекцию клеток частицами ВИЧ. Их можно использовать в качестве улучшенных терапевтических агентов для лечения СПИДа.

После химического синтеза нескольких олигомерных пептидов настоящего изобретения определяли выход и молекулярную массу полученных продуктов. Для всех пептидов был получен высокий выход, и была подтверждена ожидаемая молекулярная масса (см. таблицу 1), что отражает правильность процесса синтеза. Пептиды настоящего изобретения подвергали различным тестам.

В первой серии экспериментов была подтверждена эффективность пептидов настоящего изобретения в ингибировании инфекции ВИЧ (см. табл. 2). Пептиды тестировали на штамме ΝΌ4-3 ВИЧ-1, и были рассчитаны величины Ι^₀. Пептидами со значительной активностью были те, которые имели Ι^₀, равную или ниже 2000 нМ (νΙΚ-673, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 4), и ТС₅₀, равную или ниже 6500 нМ (νΙΚ-574, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2; νΙΚ,-577. 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3). Тестированные олигомерные пептиды обладали повышенной активностью по сравнению с природным νΙΚΙΡ (8ΕΟ Ш ΝΟ. 1); было обнаружено, что природный νΙΚΙΡ (8ΕΟ Ш ΝΟ: 1) обладает Щ₅₀, равной 15000, при тестировании со штаммом ΝΌ4-3 ВИЧ, соответственно. Из таблицы 2 можно заключить, что пептиды настоящего изобретения обладают от 5- до 22-кратно повышенной активностью против ВИЧ по сравнению с природным νΙΚΙΡ.

Вторая серия экспериментов касалась стабильности пептидов настоящего изобретения в плазме млекопитающих. К выделенной от различных животных и человека плазме добавляли различные пептиды настоящего изобретения в определенной концентрации. В плазме человека пептиды проявляли значительно улучшенные период полужизни и метаболизм. Пептиды также проявляют повышенную стабильность в плазме живых животных.

По существу пептиды настоящего изобретения отличаются своей активностью против ВИЧ, которая при представлении в виде ΙΟ₅₀ равна 6500 нМ или ниже, благодаря чему наиболее активные пептиды обладают ΙΟ₅₀ ниже 2000 нМ. Было обнаружено, что отдельные пептиды настоящего изобретения обладают ΙΟ₅₀ ниже 800 нМ (см. табл. 1). Пептиды изобретения также отличаются повышенным периодом полужизни в плазме.

Пример 1. Химический синтез пептидов настоящего изобретения.

А. Синтез мономерных пептидных цепей.

Мономерные пептидные цепи олигомерных цепей согласно изобретению синтезировали химически на основе принципа твердофазного химического синтеза и стратегии защитной группы Етос или ВоС (А111сг1оп апб 8йеррагб, 1989, 8ойб Ρ1ι;·ΐ50 Берубе δνηίΒοδίδ, ΙΚΌ Ρκ88; МеггШе1б, 1986, 8о11б рйаке 8уШЬе818, 8с1спсс 232, 341-347), но их можно также синтезировать с помощью синтеза в фазе раствора или путем соединения защищенных или незащищенных фрагментов пептидов согласно изобретению.

В качестве примера здесь описывается синтез мономерной пептидной цепи олигомерного пептида νΙΚ-577 [аминокислотная последовательность: ΕΕΑΙΡΜΟΙΡΡΕΕΕΕΟΚΡΕνΕ| (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ. 55) с применением защищенных флуоренилметоксикарбонилом (Етос) аминокислот на автоматизированном синтеза

- 16 011037 торе пептидов 433А (Άρρίίβά ВюууЧепъ). Синтез мономерного пептида проводили с применением предварительно загруженной смолы Етос-Рйе-Аапд с емкостью загрузки 1 ммоль/г смолы при стандартной активации ΗΒΤϋ [(2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат]/НОВ1 (1гидроксибензотриазол) и циклами кепирования с применением уксусного ангидрида в Ν-метилпирролидоне (ЛМР) в масштабе 0,1 нмоль. Боковые цепи примененных аминокислотных строительных блоков защищали следующим образом: 61и(О1Ви), ЬуЦВос), Су5(Тг1). Стадии ацилирования сборки пептидной цепи проводили в течение 15-60 мин, и после каждого ацилирования производили удаление защитных групп Етос с помощью пиперидина в ΝΜ^. После снятия защиты с остатка лейцина в положении 1 полученную защищенную пептидильную смолу промывали ЛМР, 2-пропанолом и дихлорметаном и сушили. Высушенную смолу обрабатывали при комнатной температуре свежей смесью трифторуксусная кислота/этандитиол/вода (94:3:3, об./об./об., 40 мл/г смолы) в течение 2-4,5 ч. Смесь фильтровали в охлажденный на льду трет-бутилметиловый простой эфир (ТВМЕ) для облегчения преципитации пептида. Полученный осадок отделяли центрифугированием, промывали ТВМЕ и сушили в вакууме. Сырой пептид анализировали с помощью аналитической ВЭЖХ на С18 и масс-спектрометрии с электрораспылением (АР1 100, Регкш Е1тег) (фиг. 1 + 2).

B. Олигомвризация мономерных пептидных цепей в димерный νΐΚ-577.

Сырые мономерные пептидные цепи νΐΚ-577 растворяли в смеси СН₃СН/Н₂О (1:4) при концентрации пептида 4 мг/мл. К раствору добавляли 8% ДМСО, и рН доводили до ~8 разбавленным аммиаком. Раствор интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Через 18 ч сырую смесь подкисляли уксусной кислотой и наносили на препаративную колонку УуЕас С18 (47x300 мм, 15-20 мкм, скорость потока 40 мл/мин; растворитель А, 0,07% по объему ТФУ; растворитель В, 0,07% по объему ТФУ в смеси ацетонитрил/Н₂О 80:20 (об.%); УФ определение при 215 нм; при следующем градиенте: 4570 об.% В за 50 мин. Фракции, содержащие желаемый олигомерный пептид, выявляемые массспектрометрией (АР1 100, Регкш Е1тег) и аналитической ВЭЖХ С18 или, альтернативно, капиллярным зональным электрофорезом, объединяли и сушили путем лиофилизации. Лиофилизированный олигомерный пептид использовали для анализа чистоты и молекулярной массы с помощью аналитической ВЭЖХ С18 (фиг. 3), капиллярного зонального электрофореза и масс-спектрометрии (фиг. 4). Выход пептида (ЬЕА1РМС1РРЕЕЬЕ6КРЕУЕ)₂ (ЛЕС) ΙΌ ^: 3) составил 7 мг.

C. Синтез дендримеров на основе лизина.

Для синтеза дендримеров на основе лизина применяют смолу Етос-С1у-Аапд или смолу ЕтосАапд-А1а. К первой аминокислоте присоединяют производное Етос-ЬуЦЕтос) или производное ЕтосОт (Етос). После снятия защиты Етос с помощью 20% пиперидина в NΜΡ смола содержит две функциональные аминогруппы, на которых проводят синтез линейных УТКЕР-пептидов с помощью стандартных циклов Етос. Данную лизиновую основу можно легко расширить путем присоединения к основе другого производного Етос-Ьук (Етос) или Етос-От(Етос) с получением четырех свободных аминогрупп для синтеза линейных пептидов. В качестве примера описан синтез νΐΒ-574 [аминокислотная последовательность: (ЬЕА1РМ81РРЕЕЬЕ6КРЕУЕ)₂-К-6] (8ЕЦ ΙΌ NО. 2) с применением флуоренилметоксикарбонил (Етос)-защищенных аминокислот на автоматизированном пептидном синтезаторе 433А (Аррйеб ВюууЧепъ). Синтез проводили с применением предварительно загруженной смолы Етос-61уАапд с емкостью загрузки 0,68 ммоль/г смолы при стандартной активации ΗΒΤϋ [(2-(1Н-бензотриазол1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат]/НОВ1 (1-гидроксибензотриазол) и циклами кепирования с применением уксусного ангидрида в Ν-метилпирролидоне (ЛМР) в масштабе 0,1 нмоль. Боковые цепи использованных аминокислотных строительных блоков были защищены следующим образом: 61и(О1Ви), Ьу§(Вос), ЬуЦЕтос), 8ег(1Ви). Стадии ацилирования для сборки пептидных цепей проводили в течение 15-60 мин, и защитные группы Етос удаляли с помощью пиперидина в ЛМР после каждого ацилирования. После снятия защиты с остатка лейцина в положении 1 полученную защищенную пептидильную смолу промывали ЛМР. 2-пропанолом и дихлорметаном и затем сушили. Сухую смолу обрабатывали при комнатной температуре свежей смесью трифторуксусная кислота/этандитиол/вода (94:3:3, об./об./об., 40 мл/г смолы) в течение 2-4,5 ч. Смесь фильтровали в охлажденный на льду третбутилметиловый простой эфир (ТВМЕ) для облегчения преципитации пептида. Полученный осадок отделяли центрифугированием, промывали ТВМЕ и сушили в вакууме. Сырой олигомерный пептид растворяли в разбавленной уксусной кислоте и наносили на препаративную колонку УуЕас С18 (47х 300 мм, 15-20 мкм, скорость потока 40 мл/мин; растворитель А, 0,07 об.% ТФУ; растворитель В, 0,07 об.% ТФУ в смеси ацетонитрил/Н₂О 80:20 (об.%); УФ определение при 215 нм; при следующем градиенте: 45-70 об.% В за 50 мин. Фракции, содержащие желаемый чистый олигомерный пептид, выявляемые массспектрометрией (АР1 100, Регкш Е1тег) и аналитической ВЭЖХ С18 или, альтернативно, капиллярным зональным электрофорезом, объединяли и сушили путем лиофилизации. Лиофилизированный олигомерный пептид использовали для анализа чистоты и молекулярной массы с помощью аналитической ВЭЖХ С18 (фиг. 5), капиллярного зонального электрофореза и масс-спектрометрии (фиг. 6).

Процесс синтеза адаптировали также для пептидного синтеза множества пептидов в малом масштабе. Олигомерные пептиды согласно изобретению, содержащие две межмолекулярные дисульфидные свя

- 17 011037 зи, обрабатывали воздухом при рН 7,5-8,5 в присутствии или в отсутствие диметилсульфоксида, а затем йодом для облегчения образования цистеинового мостика при использовании предшественников с одним цистеином, защищенным ацетамидометилом, и одним незащищенным цистеином для образования димеров.

I). Синтез мономерных пептидных цепей с защитой цистеинов с помощью Аст.

Мономерные пептидные цепи олигомерных пептидов согласно изобретению синтезировали химически на основе принципа твердофазного химического синтеза и стратегии защитной группы Ртос или Вос (А1Еег1оп апб 8Ееррагб, 1989, 8о11б РЬазе РерИбе 8уп1Ее818, ΙΕΡ Рге88; МетПеМ, 1986, 8о11б рРазе 8уп1Ре818, 8с1епсе 232, 341-347), но их можно также синтезировать с помощью жидкофазного синтеза или путем соединения защищенных или незащищенных фрагментов пептидов согласно изобретению.

В качестве примера здесь описывается синтез защищенной Аст мономерной пептидной цепи олигомерного пептида УП<-705 [аминокислотная последовательность: ЕЕК1РС(Аст)81РрЕУАРХКРРУР] (8Е^ II) ΝΟ. 36) с применением защищенных флуоренилметоксикарбонилом (Ртос) аминокислот на автоматизированном пептидном синтезаторе 433А (АррЕеб Вю8у81ет8). Синтез мономерного пептида проводили с применением предварительно загруженной смолы Ртос-РЕе-^апд с емкостью загрузки 1 ммоль/г смолы при стандартной активации НВТИ [(2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат]/НОВ1 (1-гидроксибензотриазол) и циклами кепирования с применением уксусного ангидрида в Ν-метилпирролидоне (ΝΜ₽) в масштабе 0,1 нмоль. Боковые цепи примененных аминокислотных строительных блоков защищали следующим образом: О1и(О1Ви), А8п(Тг1), Еу8(Вос), 8ег(1Ви), Су8(Аст). Стадии ацилирования сборки пептидной цепи проводили в течение 15-60 мин, и после каждого ацилирования производили удаление защитных групп Ртос с помощью пиперидина в NМР. После снятия защиты с остатка лейцина в положении 1 полученную защищенную пептидильную смолу промывали NМР, 2-пропанолом и дихлорметаном и сушили. Высушенную смолу обрабатывали при комнатной температуре свежей смесью трифторуксусная кислота/этандитиол/вода (94:3:3, об./об./об., 40 мл/г смолы) в течение 2-4,5 ч. Смесь фильтровали в охлажденный на льду трет-бутилметиловый простой эфир (ТВМЕ) для облегчения преципитации пептида. Полученный осадок отделяли центрифугированием, промывали ТВМЕ и сушили в вакууме. Сырой пептид анализировали с помощью аналитической ВЭЖХ на С18 и масс-спектрометрии с электрораспылением (АР1 100, Регкт Е1тег) (фигуры 8 + 9).

Е. Олигомеризациия мономерных защищенных Аст пептидных цепей в димерный У1Е-705.

Сырые мономерные пептидные цепи У1Е-577 растворяли в смеси НОАс/ЩО (4:1) при концентрации пептида 6 мг/мл. К раствору добавляли 4 эквивалента йода из 0,05 М раствора 1г в НОАс. Раствор интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 60 мин, и оставшийся 1 г восстанавливали с помощью раствора аскорбиновой кислоты. Сырую смесь разбавляли 5 объемами Н2О и наносили на препаративную колонку Уубас С18 (47х 300 мм, 15-20 мкм, скорость потока 40 мл/мин; растворитель А, 0,07% по объему ТФУ; растворитель В, 0,07% по объему ТФУ в смеси ацетонитрил/ЩО 80:20 (об.%); УФ определение при 215 нм; при следующем градиенте: 45-70 об.% В за 50 мин. Фракции, содержащие желаемый чистый олигомерный пептид, выявляемые масс-спектрометрией (АР1 100, Регкт Е1тег) и аналитической ВЭЖХ С18 или, альтернативно, капиллярным зональным электрофорезом, объединяли и сушили путем лиофилизации. Лиофилизированный олигомерный пептид использовали для анализа чистоты и молекулярной массы с помощью аналитической ВЭЖХ С18 (фиг. 10), капиллярного зонального электрофореза и масс-спектрометрии (фиг. 11). Выход пептида (^ЕКIРС8IРрЕУАРNКРРУР)2 (8Е^ II) ΝΟ. 36) составил 97 мг.

Процесс синтеза олигомерных пептидов согласно изобретению адаптировали для большего масштаба в диапазоне от 0,5 до 20 ммоль, что обеспечивало выход очищенных пептидов настоящего изобретения в количестве от 1 до 5 г.

С помощью данных общих подходов к синтезу наряду с другими были синтезированы, очищены с помощью способов хроматографии до 98% чистоты и проанализированы олигомерные пептиды, показанные в табл. 1.

Таблица 1. Выход и молекулярная масса синтетических олигомерных пептидов

Пептид	Выход [мг]	Молекулярная масса (рассчитанная)	Молекулярная масса (определенная с помощью массспектрометрии)
νΐΚ-574	5	4726,4	4726,8
νΐΚ-577	7	4589,6	4590,0
νΐΚ-673	4	5052,0	5052,9
νΐΚ-705	95	4549,5	4549,9
νΐΚ-706	70	4551,4	4551,3
νΐΚ-712	69	4529,5	4529,7
νΐΚ-716	68	4643,7	4644,3
νΐΚ-717	73	4617,5	4617,7

У1К-577 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цис- 18 011037 теином в аминокислотном положении 7. VI К.-574 представляет собой гомодимер, связанный лизиновой основой. VIК-673 представляет собой дисульфидно связанный гомодимер с остатком цистеина и ПЭГспейсером между цистеином и пептидной последовательностью. νΐΚ-705 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 6. νΐΚ-7 06 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 6. νΐΚ-712 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 6. νΐΚ-716 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 6. νΤΚ-717 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 6.

Пример 2. Ингибирование инфекции ВИЧ олигомерными пептидами настоящего изобретения.

Для оценки того, являются ли олигомерные пептиды согласно изобретению эффективными ингибиторами инфекции ВИЧ-1, использовали индикаторные клетки Р4-ССК5 (СНагпеаи е! а1., 1994; 1оигпа1 оГ Мо1еси1аг Вю1оду 241,651-662), экспрессирующие основной рецептор СЭ4 и оба главных кофактора входа ВИЧ-1, СХСК4 и ССК5. Данные клетки содержат β-галактозидазный репортерный ген под контролем промотора ВИЧ-1. Таким образом, активация β -галактозидазного репортерного гена позволяет измерять эффективность инфекции ВИЧ-1 и, соответственно, количественно оценивать эффективность ингибиторов ВИЧ-1 (Ое!11еих М. е! а1., 2000; 1оигпа1 оГ Е.хрептеп!а1 Мебкте 192, 1501-1508; Мипс11 е! а1., 2002; Лп11т1сгоЫа1 Адеп48 апб СНето!Негару 46, 982-990).

Для проведения типичного анализа инфекции клетки Р4-ССК8 (СНагпеаи е! а1., 1994; 1оигпа1 оГ Мо1еси1аг Вю1оду 241, 651-662; СНагпеаи е! а1., ^го1оду. 1994 205, 247-53) поддерживали в среде КРМ1 1640 с добавлением 10% по объему РС8. Эта линия клеток совместно экспрессирует СЭ4 и оба корецептора ВИЧ-1, ССК5 и СХСК4, и содержит ген β-галактозидазы под контролем промотора ВИЧ-1. Запас вирусов получали способом копреципитации кальцием, как описано (ОеШеих е! а1. , 1 Ехр Меб. 192: 1501-8; 2000), и количественно измеряли уровень антигена р24 с помощью набора ИФА для р24 ВИЧ, полученного по программе ΝΙΗ АШ8 Кеадеп! Ргодгат. Клетки высевали в плоскодонные 96-луночные планшеты, культивировали в течение ночи и инкубировали с различными дозами в течение 2 ч перед инфекцией вирусом, содержащим 1 нг антигена р24 в суммарном объеме среды 50 мл. После инкубации в течение ночи клетки дважды промывали свежей культуральной средой без ингибиторного пептида. Через три дня после инфекции клетки лизировали, и инфективность количественно определяли с помощью набора Са1ас!о-Ы§11! Р1и8^Тт для хемилюминесцентного репортерного анализа (Тгроьх, ВебГогб. МА) в соответствии с рекомендацией производителя. Инфекцию проводили в пяти параллелях.

Результаты данного анализа показывают, что олигомерные пептиды согласно изобретению обладают существенно повышенной активностью против ВИЧ-1 по сравнению с У!К1Р. Олигомерные пептиды изобретения ингибировали инфекцию Х4-тропным ΝΣ4-3 ВИЧ-1 до 22-кратной степени (табл. 2). Эти данные показывают, что олигомеризация и специфические модификации последовательности νίΚΦ дикого типа значительно повышают эффективность против ВИЧ-1 олигомерных пептидов согласно изобретению. Ниже представлены величины 1С₅₀ пептидов изобретения, полученные с помощью описанного анализа инфекции.

Таблица 2. Аминокислотная последовательность и активность против ВИЧ

Пептид	Аминокислотная последовательность	5ΕΩ ΙΟ N0.	1С_М N14-3 [ НМ1
νΐΚ-574	(ίΕΑΙΡΜ3ΙΡΡΕΡίΡσΚΡΡνΡ)₂-Κ-σ	2	3085 '
νΐΚ-577	(ГЕА1РМС1РРЕРГРСКРРУР)₂	3	3270
νΐΚ-673	(1ЕА1РМ51РРЕР1_ЕСКРРУР-миниРЕС-С-амид )₂	4	664
νΐΚ-705	(Ι_ΕΚΙΡ05ΙΡρΕνΑΡΝΚΡΡνΡ) ₂	36	484
νΐΚ-706	(1ЕА1РСЩРрЕУ(О-Т\|С)РЦКРРУР)₂	37	74
νΐΚ-712	( Ν- Μ е- ЕЕ АIРС51ΡΡΕ ЕЬЕС К РРУР) ?	43	195
νΐΚ-716	(М-Ме-ЕЕК1РС51РРЕРЕР6КРР\/Р)₂	47	182
νΐΚ-717	(Ν-Μθ-Ι.ΕΟΙΡ05ΙΡΡΕΡ!.Ρ3ΚΡΡνΡ)₂	48	635

νΐΚ-577 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 7. νΐΚ-574 представляет собой гомодимер, связанный лизиновой основой. νΐ К-673 представляет собой дисульфидно связанный гомодимер с остатком цистеина и ПЭГспейсером между цистеином и пептидной последовательностью. νΐΚ-705 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 6. νΤΚ-706 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 6. νΐΚ-712 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 6. νΐΚ-716 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положе

- 19 011037 нии 6. νΙΒ-717 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 6.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - запись С18 ВЭЖХ νΙΒ-577 мономера [ЬЕАШМаРРЕЕЬЕСХРЕ’УЕ] (ΞΕΕ) ΙΌ N0. 55). Условия: Уубас С18 (4,6х 250 мм, 300 А, 5 мкм, скорость потока: 0,8 мл/мин, градиент: 10-70% по объему В в течение 30 мин, буфер А: 0,07% по объему ТФУ, буфер В: 0,0 5% по объему ТФУ, 80% по объему ацетонитрил).

Фиг. 2 - масс-спектр с электрораспылением-ионизацией (ΕΞΙ-МС) мономера νΙΒ-577 [ЬЕАШМОРРВΕ^ΕСКРΕУΕ] (ΞΕΟ ΙΌ N0. 55). Масс-спектр записывали с помощью масс-спектрометра 8с1ех ΑΓΙ 100. Показаны молекулярные ионы для [М+2Н]²⁺ (т/ζ 1148,5) и [М+1Н]¹⁺ (т/ζ 2296,5).

Фиг. 3 - запись С18 ВЭЖХ νΙΒ-577 [(ЬВАШМаРРВЕЬЕбКРЕ’УЕЬ] (ΞΕΕ) ΙΌ N0. 3). Условия: Уубас С18 (4,6x250 мм, 300 А , 5 мкм, скорость потока: 0,8 мл/мин, градиент: 10-70% по объему В в течение 30 мин, буфер А: 0,07% по объему ТФУ, буфер В: 0,05% по объему ТФУ, 80% по объему ацетонитрил).

Фиг. 4 - масс-спектр с электрораспылением-ионизацией (ΕΞΙ-МС) νΙΒ-577 [(^ВΑIРМСIРРВΕ^ΕСКРΕУΕ)₂] (ΞΕΟ ΙΌ N0. 3). Масс-спектр записывали с помощью масс-спектрометра Ξ№χ ΑΓΙ 100. Показаны молекулярные ионы для [М+4Н]⁴⁺ (т/ζ 1148,5), [М+3Н]³⁺ (т/ζ 1531,0) и [М+2Н]²⁺ (т/ζ 2294,5).

Фиг. 5 - запись С18 ВЭЖХ νΙΒ-574 [(^ВΑIРМΞIРРВΕ^Ε6КРΕVΕ)₂-К-6] (ΞΕΕ) ΙΌ N0. 2). Условия: Уубас С18 (4,6x250 мм, 300 А, 5 мкм, скорость потока: 0,8 мл/мин, градиент: 10-70% по объему В в течение 30 мин, буфер А: 0,07% по объему ТФУ, буфер В: 0,05% по объему ТФУ, 80% по объему ацетонитрил).

Фиг. 6 - масс-спектр с электрораспылением-ионизацией (ΕΞΙ-МС) νΙΒ-577 [(ΓΕΑΜ^^РВΕ^ΕСКРΕУΕ) 2-К-С] (ΞΕΟ ΙΌ N0. 2). Масс-спектр записывали с помощью масс-спектрометра Ξ№χ ΑРI 100. Показаны молекулярные ионы для [М+4Н]⁴⁺ (т/ζ 1183,0), [М+3Н]³⁴ (т/ζ 1576,5) и [М+2Н]²⁺(т/ζ 2364,0).

Фиг. 7 - химическое изображение νΙΒ-574 [(^ВΑIРМΞIРРВΕ^Ε6КРΕVΕ)₂-К-6] (ΞΕΕ) ΙΌ N0. 2) в качестве примера дендримера на основе лизина.

Фиг. 8 - запись С18 ВЭЖХ νΙΒ-7 05 мономера [^ВКIРС(Αст)ΞIРрВУΑΕNКРΕVΕ] (ΞΕΕ) ΙΌ N0. 36). Условия: Уубас С18 (4,6x250 мм, 300 А, 5 мкм, скорость потока: 0,8 мл/мин, градиент: 10-7 0% по объему В в течение 60 мин, буфер А: 0,07% по объему ТФУ, буфер В: 0,05% по объему ТФУ, 80% по объему ацетонитрил).

фиг. 9 - масс-спектр с электрораспылением-ионизацией (ΕΞΙ-МС) νΙΒ-705 мономера ΙΕΕΚΙΓΕ (Αст)ΞIРрВУΑΕNКРΕУΕ] (ΞΕΟ ΙΌ N0. 36). Масс-спектр записывали с помощью масс-спектрометра Ξ№χ Α₽Ι 100. Показаны молекулярные ионы для [М+3Н]³⁺ (т/ζ 696,5), [М+2Н] (т/ζ 1174,5) и [М+1Н]¹⁺(т/ζ 2347,5).

Фиг. 10 - запись С18 ВЭЖХ νΙΒ-705 димера [(^ВКIРСΞIРрВУΑΕNКРΕVΕ)₂] (ΞΕΕ) ΙΌ N0. 36). Условия: Уубас С18 (4,6х 250 мм, 300 А, 5 мкм, скорость потока: 0,8 мл/мин, градиент: 10-7 0% по объему В в течение 30 мин, буфер А: 0,07% по объему ТФУ, буфер В: 0,05% по объему ТФУ, 80% по объему ацетонитрил).

Фиг. 11 масс-спектр с электрораспылением-ионизацией (ΕΞΙ-МС) νΙΒ-705 димера [(^ВКIРСΞIРрВУΑΕNКРΕУΕ) ₂] (ΞΕΟ ΙΌ N0. 36). Масс-спектр записывали с помощью масс-спектрометра Ξ№χ Α₽Ι 100. Показаны молекулярные ионы для [М+4Н]⁴⁺ (т/ζ 1138,5), [М+3Н] (т/ζ 1517,5) и [М+2Н]²⁺ (т/ζ 2276,0).

Фиг. 12 - графическое отображение результатов определения величины ΙΕ\₀ для олигомерных пептидов изобретения. Для сравнения представлены данные, полученные для гибридного ингибитора Т-20 (энфувирид).

Сокращения:

СПИД: синдром приобретенного иммунодефицита;

Вос: трет-бутилоксикарбонил;

СXСΒ4: рецептор СХС хемокинов 4;

ССВ5: рецептор СС хемокинов 5;

ΕΞΙ-МС: масс-спектроскопия с электрораспылением-ионизацией;

ЕР: гибридный пептид;

ВИЧ: вирус иммунодефицита человека;

ВЭЖХ: высокоэффективная жидкостная хроматография;

ΗΒ-1, ΗΒ-2: семичленный повтор 1,2;

МΑ^^I-ТОΕ: время пролета при лазерной десорбции/ионизации с применением матрикса;

Мини-ПЭГ: -МН-(СН₂)₂-0-(СН₂)₂-0-СН₂-С0-МН-(СН₂)₂-0-(СН₂)₂-0-СН₂-С0-МН₂;

ЯМР: ядерный магнитный резонанс;

01с: октагидроиндолил-2-карбоновая кислота;

- 20 011037

ПЭГ: пэгил, полиоксиэтиленгликоль;

О8АР: количественное соотношение структура-активность;

1Ви: трет-бутил;

ТФУ: трифторуксусная кислота;

Т1с: 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота;

Тг1: тритил.

Claims

1. Олигомерные пептиды с биологической активностью против инфицирования ВИЧ, включающие мономерные пептидные цепи с аминокислотной последовательностью (Ζι-ΕΕ-Χι-ΙΡ-Χ2-Χ3-Χ4-Ρ-Χ5-Χ6-Χ7-Χ₈-Χ9-Χ10-Κ-Χ11-Χ12-Χ13-Χ14-Χ15-Ζ2)η, где η указывает число мономерных пептидных цепей, причем η равно 2, 3 или 4;

Χ1 представляет собой лизин, аланин или аспарагиновую кислоту;

Х₅ представляет собой пролин, Ό-пролин или замещенный Ь- или Ό-иролин;

Х7 представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или цисте ин;

Х₈ представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или цистеин;

Х10 представляет собой глицин, аланин или аспарагин;

Х11 представляет собой пролин, аспарагиновую кислоту, октагидроиндолил-2-карбоновую кислоту или О-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту;

Χ₁₂ представляет собой фенилаланин, аланин, глицин, глутаминовую кислоту или П-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту;

Х13 представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью;

Χ14 представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью;

Χ15 представляет собой фенилаланин или удален;

Ζ₁ представляет собой ΝΗ₂ или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;

Ζ₂ представляет собой СООН или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;

и олигомерные пептиды с биологической активностью против инфицирования ВИЧ, которые представляют собой их фрагменты и/или производные, в частности амидированные, алкилированные, ацилированные, сульфатированные, пэгилированные, фосфорилированные и/или гликозилированные произ водные и их мутанты;

и при условии, что:

(a) если Χ₁₂ представляет собой аланин, глицин, глутаминовую кислоту или Ό-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту, то Х₁₃, Х₁₄ и Χ₁₅ представляют собой фенилаланин, валин и фенилаланин, соответственно; и/или (b) если Χ₁₂ представляет собой фенилаланин, то Х₁₃, Χ₁₄ и Χ₁₅ представляют собой валин, фенила ланин и удаление, соответственно; и (с) в любой мономерной пептидной цепи олигомерного пептида имеется максимально три цистеиновых остатка; и (б) олигомерный пептид не представляет собой (ЬЕА1РС81РРЕЕЕЕ6КРЕУЕ)₂ (У1К.-576); и (е) мономерные пептидные цепи не связаны пептидными связями между Ν-концом одной пептидной цепи и С-концом другой пептидной цепи.

2. Олигомерные пептиды по п.1 с биологической активностью против инфицирования ВИЧ, имею щие аминокислотную последовательность (Ζ₁-ΕΕ-Χ₁-ΙΡ-Χ2-Χ₃-Χ4-Ρ-Χ5-Χ6-Χ7-Χ₈-Χ9-Χ1ο-Κ-Χ_π-ΕνΓ-Ζ2)η, где η указывает число мономерных пептидов, причем η равно 2, 3 или 4; Χ1 представляет собой лизин, аланин или аспарагиновую кислоту; Х2 представляет собой цистеин, метионин или изолейцин; Х3 представляет собой серин, цистеин или глицин; Х₄ представляет собой изолейцин или цистеин;

Х₈ представляет собой фенилаланин, лейцин, аланин, глицин, цистеин, Ό-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту или Ь-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту;

- 21 011037

Х₁₁ представляет собой пролин или П-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту;

и олигомерные пептиды с биологической активностью против инфицирования ВИЧ, которые представляют собой их фрагменты и/или производные, особенно амидированные, алкилированные, ацилированные, сульфатированные, пэгилированные, фосфорилированные и/или гликозилированные производные и их мутанты.

3. Олигомерные пептиды по п.1 или 2 с биологической активностью против инфицирования ВИЧ, имеющие аминокислотную последовательность (Ζ1 -ЬЕ-Х1 -ΙΡ-Χ2-Χ3-ΙΡ-Χ5-Χ6-Χ7-Χ₈-Ε-Χ10-ΚΡΕνΕ-Ζ2)η, где п указывает число мономерных пептидных цепей, прчем п равно 2, 3 или 4;

Χ₁ представляет собой лизин, аланин или аспарагиновую кислоту;

Х3 представляет собой серии или глицин;

Х7 представляет собой фенилаланин или валин;

Х₈ представляет собой фенилаланин, лейцин, аланин или Ь-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3карбоновую кислоту;

Ζ1 представляет собой ΝΗ2 или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;

Ζ2 представляет собой СООН или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков, и олигомерные пептиды с биологической активностью против инфицирования ВИЧ, которые представляют собой фрагменты и/или производные, особенно амидированные, алкилированные, ацилированные, сульфатированные, пэгилированные, фосфорилированные и/или гликозилированные производные и их мутанты.

4. Олигомерные пептиды по любому из пп.1-3, имеющие аминокислотную последовательность (Ζ1-ΕΕΑΙΡ-Χ2-8ΙΡ-Χ5-Χ6-ν-Χ₈-ΡΝΚΡΡνΡ-Ζ2)η, где п указывает число мономерных пептидных цепей, причем п равно 2, 3 или 4;

Х2 и Х6 представляют собой цистеины или Х2 представляет собой метионин и Х6 представляет собой глутаминовую кислоту;

Χ₈ представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или лизин;

и олигомерные пептиды, которые представляют собой фрагменты и/или производные, особенно амидированные, алкилированные, ацилированные, сульфатированные, пэгилированные, фосфорилированные и/или гликозилированные производные и их мутанты с биологической активностью против инфицирования ВИЧ, при условии, что, по меньшей мере, имеет место одно из следующего:

Х2 и Х6 представляют собой цистеины;

Х₅ представляет собой Ό-пролин или

Х8 не является лизином.

5. Олигомерные пептиды по любому из пп.1-4, где мономерные пептидные цепи поперечно сшиты.

6. Олигомерные пептиды по любому из пп.1-5, где цистеиновые остатки в положениях 6 и 11, 6 и 12, 7 и 12 или 8 и 13 связаны с помощью межмолекулярной дисульфидной связи.

7. Олигомерный пептид по любому из пп.1-6, где остаток лейцина в аминокислотном положении 1 и глутаминовая кислота в аминокислотном положении 2 ковалентно связаны Ν-алкилированной амидной связью, или сложной эфирной связью, или восстановленной пептидной связью, или ретроинверсной пептидной связью, или Ν-алкилированной ретроинверсной пептидной связью.

8. Олигомерный пептид по любому из пп.1-5 или 7, где по меньшей мере две мономерные пептидные цепи, обе имеют по меньшей мере один единственный цистеиновый остаток, которые ковалентно связаны друг с другом посредством дисульфидной связи.

9. Олигомерный пептид по любому из пп.1-7, где мономерные пептидные цепи ковалентно связаны друг с другом через по меньшей мере одну амидную связь между СООН-группой боковой цепи кислой аминокислоты и ИН₂-группой боковой цепи основной аминокислоты.

10. Олигомерный пептид по любому из пп.1-9, где мономерные пептидные цепи связаны друг с другом через бифункциональную спейсерную молекулу, выбранную из группы органических спейсеров с двумя тиоловыми группами, органических спейсеров с двумя аминогруппами, органических спейсеров с двумя карбоксильными группами и органических спейсеров с одной карбоксильной группой и одной аминогруппой.

- 22 011037

11. Олигомерный пептид по любому из пп.1-10, включающий две или четыре мономерные пептидные цепи и по меньшей мере один остов лизина, который ковалентно связывает мономерные пептидные цепи.

12. Пептиды по любому из пп.1-11 с одной из следующих аминокислотных последовательностей

7ΪΚ-574 (кЕА1РМ31РРЕЕкРСКРРУР)₂-К-С ЗЕЧ ГО N0. 2 νΐβ-577 (1ΕΑ1ΡΜ С1 РРЕРкЕСКРРУР)₂ ЗЕЧ 10 N0, 3 ИК-673 (ίΕΑΙΡΜ5ΙΡΡΕΕίΕσΚΡΕνΕ-ΜΗΗΗ рЕС-С-аиид)_г ЗЕЧ 10 N0. 4 νΐΚ-674 (кЕА1РС51РРС7А(0-Т1с)МК₽(0-Т|с)Р7Е)₂ ЗЕЧ ГО N0. 5 У1К-675 (ίΕΑΙΡΜ3ΙΡΡΕΡΕΡ6ΚΡΡνΕ)₂ ЗЕЧ ГО МО. 6 νΙΚ-676 (кЕА1РМ31РрЕ(3,3-ДифенИлалании )ΑΡΝΚΡΡνΡ)₂ ЗЕЧ ГО N0. 7 У£К-677 (ΕΕΑΙΡΜεΐΡΡΕΕΡΡΝΚΡΡνΡ)₂ ЗЕЧ 10 N0. 8 ЩК-678 (1ЕА1РМС1РРЕСЬР6КРЕУЕ)₂ ЗЕЧ 10 N0. 9 У1К-679 (1_ЕА1РС51РРСТЕЕСКРРУР)_г ЗЕЧ ΙΟ МО. 19 ν1Κ-68θ (кЕА1РСЗТРРСЕЕР(ЗКРРУЕ)₂ ЗЕЧ ГО N0. 11 νΐΚ-681 (1_ЕА!РС51РрСУеРСКРП/Р)_г ЗЕЧ Ю МО. 12 νΐΚ-582 (ΙΕΑΙΡ45ΙΡρθνΡΡΝΚΡ!=νΕ)₂ ЗЕЧ ГО ΝΟ. 13 νΙΒ-683 (ΕΕΑΙΡΟ3ΙΡρΟΡΕΡΝΚΡΡνΕ)₂ ЗЕЧ ГО N0. 14 νΐΚ-684 {кЕО1РС51РрС'7АРМКРР'/Е)₂ ЗЕЧ ГО N0. 15 ν1Κ-685 (1_ЕКЛРС51РрСУАРЖРЕУг); ЗЕЧ ГО МО. 16 У1К-686 (ΕΕΑΙΡΜ41ΡρΕν(Ο-Όσ)ΕΝΚΡΡνΡ)₂ 5ЕЧ ГО N0. 17 νΐΚ-687 (ΕΕΑΙΡΜ6ΙΡρΕν(Ε-Τϊε)ΡΝΚΡΕνΡ)₂ ЗЕЧ ГО N0. 18 718-688 (Ι_ΕΚΙΡΜ5ΙΡρΕν(Ο-ΤΊε)ΕΝΚΡΡνΡ)₂ ЗЕЧ ГО N0. 19 νΐΚ-689 (ЕЕК1РМ5ХРрЕ7(к-Т1С)РМКРР7Р}₂ ЗЕЧ ГО N0. 20 У1К-690 (кЕК1Р1С1РрЕУ(0-Т1с)НЧКРРЛ=)_г ЗЕЧ ГО N0. 21 718-691 (ЕЕКХР1С1РрЕ7(к-Т1с)ЕМКРЕ7Е)₂ ЗЕЧ ГО ΝΟ. 22 νΐΚ-692 (М-Ме-кЕА1РМ51РРЕРкРСКРП/Е)_г ЗЕЧ ГО ΝΟ. 23 νΐΚ-693 (кЕА!РМ5СРРЕРСРСКРРУР)₂ 5ЕЧ 10 ΝΟ. 24 7ΙΚ-694 (кЕАХРМЗХРРЕРкРЗКРЕУЕ-миниРЕС); 5ЕЧ 10 МО. 25 71Κ-695 (кЕА1РС51РРЕУА(0-Тгс)ККР(0-Т1С)РУР)_г 5ЕЧ ГО N0. 26 7ΙΡ.-696 (кЕАХРС51РрЕ(3,3-дифенилаланин )ΑΡΝΚΡΡνΡ)₂ 5ЕЧ ГО N0. 27 718-697 (кЕА1РМС1РРЕ7ЕРМКРРУЕ)₂ ЗЕЧ ГО N0. 28 1/18-698 (кЕА1РМС1РРЕУкРСКРРУЕ)₂ ЗЕЧ ГО МО. 29 νΐΚ-699 (кЕА1РС51РРЕУРР(ЗКРт)₂ 5ЕЧ ГО ΝΟ. 30 νΐΚ-700 (кЕА1РС21РРЕЕкР6КРН/Е)₂ ЗЕЧ ГО N0. 31 νΐΚ-701 (кЕА1РС51РрЕУСРеКРРУР)₂ ЗЕЧ ГО N0. 32 νΐΚ-702 (кЕА1РС5!РрЕУРРР1КРР7Р)₂ ЗЕЧ ГО N0. 33 νΐΚ-703 (ΕΕΑΙΡ43ΧΡρΕΡΕΡΝΚΡΡνΡ)₂ ЗЕЧ ГО МО. 34 У18-704 (кЕ01РСЕ1РрЕУАРМКРРУР)₂ ЗЕЧ ГО N0. 35 718-705 (кЕКХРСЗГРрЕУАЕМКРЕУр) _г 5ЕЧ ГО N0. 36 νΐΚ-706 (кЕА1РСС1РрЕУ(Р-Т!с)ЕМКРРУР)₂ ЗЕЧ ГО МО. 37 νΐΚ-707 (ΕΕΑΙΡσ3ΙΡρΕν(Ε-ΤϊΡ)ΕΝΚΡΡνΕ)₂ ЗЕЧ Ю ΝΟ. 38 У1Р-70В {кЕК1РС31РрЕУ(О--Пс)РНКРРУР) ₂ ЗЕЧ ГО МО. 39 ХЛЙ-709 (кЕК1РС51РрЕУ(к-Т1с)РМКРРУР)₂ ЗЕЧ ГО ΝΟ. 40 νΐΚ-710 (кЕК1РСН1РрЕ\/(С-Т1с)РМКРЕУР)₂ ЗЕЧ ГО N0. 41 У18-711 (ΕΕΚΙΡΟΞΙΡρΕν(Ε'Τίο)ΡΝΚΡΡνΡ)₂ ЗЕЧ ГО МО. 42 У18-712 (Ν-Μθ-ΕΕΑΙΡΕ5ΙΡΡΕΡΕΡ(3ΚΡΡνΡ)₂ ЗЕЧ ГО МО. 43 У18-713 (кЕАХРМЗСРРЕРкР0КРР7Е)₂ ЗЕЧ ГО N0. 44 718-714 (кЕА1РС51РРЕРкреКРЕУР-^ИНИ РЕб)2-амид)_г ЗЕЧ Ю N0, 45 718-715 (М'Ме-кЕА1РС51РРЕРкРСКРРУР-(миниРЕС)2-амИД)₂ ЗЕЧ ГО МО. 46 νΐΚ-716 (М-Ме-кЕК1РС51РРЕЕкР<ЗКРЕУР)₂ ЗЕЧ ГО МО. 47 718-717 (1Ч-Ме-кЕ01РС51РРЕЕкРЕКРРУР)_г ЗЕЧ ГО ΝΟ. 48 718-718 (ΡΕΚΙΡΐεΐΡρΕν(Ε-ΤίήΡΝΚΡΡνΡ) _г-КА ЗЕЧ ГО N0. 49 718-719 (М-Ме-кЕА1РС51РрЕРкЕеКРРУР)_г ЗЕЧ ГО МО 50 718-720 (кЕК1Р1Е1РрЕУ(к-Т|с)РЦКРРУР-миниРЕС-С)₂ ЗЕЧ ГО N0 51 νΐΚ-721 (кЕК1РСС1РрСУАРЦКРРУР)₂ ЗЕЧ ГО МО 52 718-722 (ММе-ЕЕ01РС51РрСТАРГ'1КРРУЕ-МИНИРЕС-С)_г ЗЕЧ ГО N0 53 νΐΚ-723 (кЕА1РС51РРЕРкРеКРРУР-(миНИРЕС)2-С)₂ ЗЕЧ ГО N0. 54

13. Олигомерные пептиды по любому из пп.1-12, которые взаимодействуют с гибридным пептидом ВИЧ.

14. Олигомерные пептиды по любому из пп.1-13, которые имеют 1С₅₀, равную или ниже 6500 нМ,

- 23 011037 такие как νΙΒ-574, νΙΒ-577 и νΙΒ-673.

15. Нуклеиновые кислоты, кодирующие мономерные пептидные цепи любого из мономерных пептидов по п.12, за исключением нуклеиновых кислот, кодирующих мономерные пептидные цепи νΙΒ-674, νΙΒ-675, νΙΒ-676, νΙΒ-677, νΙΒ-678, νΙΒ-679, νΙΒ-680, νΙΒ-681, νΙΒ-682, νΙΒ-683, νΙΒ-684, νΙΒ-685, νΙΒ-686, νΙΒ-687, νΙΒ-688, νΙΒ-689, νΙΒ-690, νΙΒ-691, νΙΒ-692, νΙΒ-693 и νΙΒ-694.

16. Антитела, специфически связывающие олигомерные пептиды по любому из пп.1-12.

17. Лекарственное средство, включающее по меньшей мере один из олигомерных пептидов по любому из пп.1-14, нуклеиновые кислоты по п.15 и/или антитела по п.16.

18. Лекарственное средство по п.17 в фармацевтических составах для перорального, внутривенного, внутримышечного, внутрикожного, подкожного и/или внутриоболочечного введения.

19. Лекарственное средство по п.17 или 18, включающее по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент.

20. Лекарственное средство по п.19, где указанный по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент представляет собой ингибитор вирусных протеаз, ингибитор обратной транскриптазы, ингибитор слияния, цитокин, ингибитор цитокинов, ингибитор гликозилирования или ингибитор мРНК вируса.

21. Применение олигомерных пептидов по любому из пп.1-12 для получения лекарственного средства для лечения ВИЧ инфекций.

22. Тест для определения молекул, способных взаимодействовать с гибридным белком ВИЧ, включающий по меньшей мере один олигомерный пептид по любому из пп.1-12.

23. Применение олигомерных пептидов по любому из пп.1-12 для теста по п.22.

24. Диагностическое средство, включающее по меньшей мере один олигомерный пептид по любому из пп.1-12, нуклеиновые кислоты по п.15 или антитела по п.16.

25. Применение диагностического средства по п.24 для тестирования выделенных крови, плазмы, ткани, мочи, семенной жидкости и/или цереброспинальной жидкости на ВИЧ инфекцию.