WO2016054708A1 - Oligonucleotídeos, conjunto de oligonucleotídeos, kit para diagnóstico e discriminação de infecção por htlv-1/2, polinucleotídeo adequado para uso como alvo de referência para o desenho de iniciadores e sondas para detecção e diferenciação de htlv-1 e htlv- 2, amplicon, e, método para detecção de pelo menos um alvo de htlv - Google Patents

Oligonucleotídeos, conjunto de oligonucleotídeos, kit para diagnóstico e discriminação de infecção por htlv-1/2, polinucleotídeo adequado para uso como alvo de referência para o desenho de iniciadores e sondas para detecção e diferenciação de htlv-1 e htlv- 2, amplicon, e, método para detecção de pelo menos um alvo de htlv Download PDF

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JUNIOR Maurício Cristiano ROCHA
Simone Kashima HADDAD
Dimas Tadeu Covas
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Definitions

  • OLIGONUCLEOTIDES OLIGONUCLEOTIDE SET, HTLV-1/2 INFECTION DIAGNOSTIC DIAGNOSIS AND DISCRIMINATION KIT
  • POLYNUCLEOTIDE APPROPRIATE FOR USE AS A REFERENCE TARGET FOR DESIGN AND HTV DEPLANE ELLERI 1 DEDIATION EHEDI 2 , AND, METHOD FOR DETECTION AT LEAST ONE HTLV TARGET.
  • the invention relates generally to the amplification and detection of nucleic acids. More specifically, methods, oligonucleotides and diagnostic kit are provided to confirm, quantify and discriminate HTLV-1 and / or HTLV-2 infections from patient samples.
  • HTLV-1 type 1 human T-cell lymphotropic virus
  • HTLV-2 Shortly after its identification, a second human retrovirus was described, HTLV-2, which in turn was isolated from a T cell line obtained from a hairy cell leukemia patient (Kalyanaraman et al., Science, see 218, No. 4572, pp. 571-3, 1982).
  • HTLV-1 is associated with two main clinical manifestations: i) an acute haematological disease involving T cells called adult T-cell leukemia / lymphoma (ATLL) (Poiesz et ah, Proc Natl Acad Sci USA, v. 77). , No. 12, pp. 7415-9, 1980; Yoshida et al., Proc Natl Acad Sci USA, v. 79, No.
  • ATLL adult T-cell leukemia / lymphoma
  • HTLV-1 associated myelopathy / Tropical Spastic Paraparesis a degenerative and progressive neuroinflammatory disease called HTLV-1 associated myelopathy / Tropical Spastic Paraparesis (HAM / TSP).
  • the risk for developing both ATLL and HAM / TSP is about 3 to 5%, which makes most individuals with this retro virus asymptomatic.
  • HTLV-2 infection has been associated with sporadic cases of neurological diseases resembling HAM / TSP.
  • two new types of HTLV were identified in Cameroonian primate hunters: HTLV-3 and HTLV-4 (Calattini et al., Retrovirology, v. 2, p. 30, 2005; Wolfe et al., Proc Natl Acad Sci USA, v.
  • HTLV-1 and HTLV-2 are also transmitted through sexual contact (Murphy et al. Ann. Intern. Med. 111 : 555-560, 1989); from mother to child through breastfeeding (Hino et al. Jpn. J. Cancer. Res. 1985, 76: 474-480, 1985; Vitek et al. J. Infect. Dis. 171: 1022-1026, 1995) and sharing of intravenous syringes by drug users (Van Brussel et al. Rev. Med. Virol. 9: 155-170, 1999).
  • it is important to use appropriate methodologies for safe and effective diagnosis especially to increase the safety of solid and transfusion organ transplantation, the correct counseling of patients and the adoption of preventive measures regarding HTLV-1 transmission. / 2, directly impacting the reduction of transmission of this retrovirus.
  • HTLV infection For illustrative purposes, in Brazil, the diagnosis of HTLV infection is carried out in two stages: screening and confirmation.
  • serological tests are used to detect the presence of antibodies directed against the virus, such as enzyme-linked immunosorbent assay (EIA), chemiluminescence and agglutination of sensitized latex microparticles (Verdier et al., J Clin Microbiol, v. 28, n. 9, pp. 1988-93, 1990; Thorstensson et al., Transfusion, v. 42, no. 6, p. 780-91, 2002).
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the antigens frequently used in commercially available assays are those found in the HTLV-1 and HTLV-2 viral lysate plus recombinant viral envelope-derived proteins, which increase the sensitivity of the assay.
  • WB Western Blot
  • PCR polymerase chain reaction
  • RIPA radioimmunoprecipitation
  • IFA indirect immunoflorescence
  • WB is used as a confirmatory method, but often presents inconclusive results due to nonspecific reactivity (Kwok et al, Transfusion, v. 30, no. 6, p. 491-4, 1990; Lai, J Acquir Immune). Defic Syndr Hum Retro virol, v. 13 Suppl 1, pp. 170-8, 1996; Thorstensson et al., Transfusion, v. 42, no. 6, pp. 780-91, 2002; Abrams et al, Viruses, v. 3, no. 8, pp. 1320-31, 2011).
  • the test still has a high cost, which makes it unfeasible to implement it in the diagnostic routine (Carneiro-Proietti et al Rev Panam Salud Publica, v. 19, n.1, pp. 44-53, 2006; Andrade et al Rev Soc Bras Med Trop, v. 43, no. 2, pp. 111-5, 2010).
  • HTLV infection cannot be detected during the pre-seroconversion period (immunological window), which can range from 36 to 72 days, or when the immune response is deficient.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the HTLV-1/2 viral DNA can be detected and / or quantified by amplifying different regions of the viral genome.
  • the gag, pol, env, tax and rex regions are commonly used in this procedure (Gabbai et al, Am J Trop Med Hyg, v. 49, no. 6, p. 664-71, 1993; Poiesz et al. Transfusion, v. 40, No. 8, pp. 924-30, 2000; Thorstensson et al., Transfusion, v. 42, no. 6, pp. 780-91, 2002; Vitone et al., BMC Infect Dis, v. 6, p. 41, 2006).
  • nested-V R In order to increase sensitivity and specificity, nested-V R.
  • qPCR real-time PCR
  • the set of probes and primers were evaluated in silico, as well as in vitro, through reactions that contemplated the HAV, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2, B 19 viruses, besides 30 patients with HBV, HCV and HIV.
  • the inventors note that the developed methodologies use restricted and inadequate number of positive samples for both viral types. Still, other works simulate positive samples by adding DNA extracted from infected cells to blood samples obtained from uninfected individuals, which does not reflect the true status of infection. The inadequate sample space of positive samples may overestimate or underestimate the value of the diagnostic sensitivity of the test and may generate inconsistent results when applied in the diagnostic routine. Finally, the available methodologies or did not evaluate the specificity of the test with samples from uninfected individuals or used an inadequate number of samples, which may mask the absence of false positive results, jeopardizing the safe conclusion of the diagnosis.
  • the invention provides an oligonucleotide capable of binding to the HTLV pol region and being suitable as a primer, comprising at least 10 to 15 consecutive nucleotides of the selected sequences of SEQ ID Nos: 1, 2, 4, 5 and 6.
  • the oligonucleotide suitable as primer comprises the sequences of SEQ ID Nos: 1, 2, 4, 5 and 6.
  • the suitable oligonucleotide as primer consists of SEQ ID Nos: 1, 2, 4, 5 and 6.
  • an oligonucleotide capable of binding to the HTLV pol region and suitable as a probe, said probe oligonucleotide comprising at least 8 to 15 consecutive nucleotides of the selected sequences of SEQ ID Nos: 3 and 7.
  • this oligonucleotide comprises the SEQ ID Nos: 3 and 7 sequences. In another embodiment, this oligonucleotide consists of the sequences of SEQ ID Nos: 3 and 7.
  • the suitable probe oligonucleotide is labeled with a detectable label, preferably a fluorescent group, comprising a donor fluorophore pair and a quencher.
  • the invention also relates to an oligonucleotide set comprising at least two oligonucleotides selected from sequences comprising SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.
  • a method for detecting at least one HTLV target comprising the steps of:
  • oligonucleotides being suitable primers for amplification of at least one reference target selected from the group consisting of the sequence located between positions 3340 and 3414 of SEQ ID NO: 11 and sequence between positions 4483 and 4563 of SEQ ID NO: 12, and
  • such a method is performed with at least one primer comprising at least 10 to 15 consecutive nucleotides of the selected sequences of SEQ ID Nos: 1, 2, 4, 5 and 6; or an primer comprising the sequences of SEQ ID Nos: 1, 2, 4, 5 and 6; or an initiator consisting of SEQ ID Nos: 1, 2, 4, 5 and 6.
  • the method is performed with the primers of SEQ ID Nos: 1 and 2.
  • the method is performed with primer sets selected from SEQ ID Nos: 4 and 5, SEQ ID Nos: 4 and 6 or SEQ ID Nos: 4, 5 and 6.
  • the method step for detecting amplicon is performed with at least one probe as defined above.
  • said step of producing at least one amplicon comprises at least one of quantitative, qualitative, conventional, or real-time multiplex PCR multiplex amplification.
  • the method discriminates between HTLV-1 and HTLV-2 infections.
  • kits for diagnosing and discriminating HTLV-1/2 infection comprising: a) at least one suitable oligonucleotide as primer as defined above; and / or b) at least one suitable set of oligonucleotides as a probe as defined above; and c) optionally, instructions for use.
  • the kit of the invention further includes a negative control and / or a positive reaction control.
  • a polynucleotide suitable for use as a reference target for the design of primers and probes for detection and differentiation of HTLV-1 and HTLV-2 selected from the group consisting of the sequence located between the positions 3340 and 3414 of SEQ ID NO: 11 and sequence located between positions 4483 and 4563 of SEQ ID NO: 12.
  • the invention provides an amplicon obtainable by the method described above from a sample containing HTLV.
  • the amplicon is obtained with a pair of primers selected from: one primer of SEQ ID NO: 1 and one primer of SEQ ID NO: 2; or a primer of SEQ ID NO: 4 and a primer of SEQ ID NO: 5, or a primer of SEQ ID NO: 4 and a primer of SEQ ID NO: 6.
  • Figure 1 HTLV-1 and HTLV-2 isolates used in multiple alignment.
  • Figure 2 Partial alignment of the HTLV-1 and HTLV-2 pol gene.
  • A Primers and probe for detection of HTLV-1.
  • B Initiators and probe for HTLV-2 detection.
  • the yellow boxes represent the sites chosen for primer design.
  • the green box represents the HTLV-1 probe design site and the red box represents the HTLV-2 probe design site.
  • Figure 3 Amplification curves and standard curves in singleplex format. Serial decimal dilutions ranging from 10 5 to 10 ° viral copies / reaction from the MT-2 (HTLV-1) and Gu (HTLV-2) positive controls were used in the qPCR reactions.
  • A Amplification curves for HTLV-1.
  • B Standard curve for HTLV-1.
  • C Amplification curves for HTLV-2.
  • D Standard curve for HTLV-2.
  • E Amplification curves for internal control.
  • F Standard curve for internal control.
  • Figure 4 Amplification curves in singleplex and multiplex formats (biplex and triplex). Serial decimal dilutions ranging from 10 5 to 10 ° viral copies / reaction of the MT-2 (HTLV-1) and Gu (HTLV-2) positive controls were used in the reactions.
  • A Amplification curves in singleplex format for HTLV-1.
  • B Amplification curves in biplex format for HTLV-1 and internal control.
  • C Singleplex amplification curves for the HTLV-2.
  • D HTLV-2 biplex amplification curves and internal control.
  • E Biplex format amplification curves for HTLV-1 and HTLV-2.
  • F HTLV-1, HTLV-2 triplex format amplification curves and internal control.
  • Figure 5 Amplification curves in singleplex format for HTLV-2. Each reaction was performed in duplicate and contained 10 5 , 10 3 and 10 1 viral copies / reaction. The red curve represents the concentration of 100 probe nM, 200 nM yellow and 300 nM green. Note that there is an increase in fluorescence intensity (ARn) as the probe concentration is increased.
  • ARn fluorescence intensity
  • Figure 6 Schematic of the second reverse primer for HTLV-2. Note that by using two reverse primers, two different sized amplicons are generated, and these are targets of a single probe. As the number of amplicons generated increases, more probes will be annealed to them, increasing fluorescence, reducing Ct, and consequently increasing sensitivity.
  • Figure 7 Comparison between amplification curves in singleplex format using one or two HTLV-2 reverse primers.
  • Red amplification curves refer to reactions containing a reverse primer.
  • Green amplification curves refer to reactions containing two reverse primers.
  • Figure 8 Singleplex amplification curves using different primer and probe concentrations. Three dilutions (10 5 , 10 3 , and 10 1 ) of the MT-2 (HTLV-1) and Gu (HTLV-2) positive controls were used in the qPCR reactions.
  • A Amplification curves for internal control.
  • B Amplification curves for HTLV-1.
  • C Amplification curves for HTLV-2.
  • D Amplification curves for HTLV-2.
  • Figure 9 Multiplex format amplification curve with the presence of three targets (HTLV-1, HTLV-2 and internal control). Dilution of 10 5 viral copies / reaction from MT-2 (HTLV-1) and Gu (HTLV-2) positive controls was used in the qPCR reaction.
  • Figure 10 Amplification curves and standard curves in multiplex format with the presence of three targets (HTLV-1, HTLV-2 and internal control). Serial decimal dilutions ranging from 10 5 to 10 1 viral copies / reaction of Positive controls MT-2 (HTLV-1) and Gu (HTLV-2) were used in qPCR reactions.
  • Figure 11 Reaction plate assembly diagram for robustness test. HTLV-1 positive samples were pipetted side by side with targetless samples throughout the "chess table" plate.
  • the invention described herein relates to novel oligonucleotides for amplification, detection, differentiation and quantitation of HTLV subtypes, and related methods and kits. More specifically, the present invention provides oligonucleotides, including primers and probes, which are suitable for the detection and discrimination of HTLV-1 and HTLV-2. Oligonucleotides and Diagnostic Kits
  • Oligonucleotide refers to any short nucleotide polymer, wherein the nucleotides may be ribonucleotides, deoxyribonucleotides, dideoxyribonucleotides, degenerate nucleotides, and the like. Said oligonucleotides are preferably single stranded. The length of said oligonucleotides may vary, and is usually less than 150 nucleotides (nt), preferably in the range of 10-100 nt, more preferably at 10-60 nt, even more preferably 13-50 nt.
  • oligonucleotides of the invention may be either forward (sense) or reverse (antisense).
  • oligonucleotides according to the present invention include primers and probes. Unless otherwise noted, sequences are presented in the 5 'to 3' direction. Said oligonucleotides may be in various forms, for example, in solution / suspension in a suitable solvent and at a desired concentration, dried or lyophilized. The person skilled in the art is aware of the suitable solvents, concentrations and storage conditions for the oligonucleotides of the invention. In particular, the person skilled in the art is aware of how to prepare said oligonucleotides as stock solutions. Oligonucleotides according to the invention may be of varying degrees of purity, which may be assessed by one of ordinary skill in the art, for example by HPLC chromatography.
  • oligonucleotides may assume various functions, and may be used in different forms according to the present invention.
  • an initiator may be used as a probe and vice versa and may be applicable in hybridization, detection, etc. procedures.
  • the products according to the present invention especially, inter alia, oligonucleotides, are not limited to the uses shown herein, but, on the contrary, the uses should be interpreted broadly regardless of the use indicated herein. .
  • oligonucleotide when described as being useful as a probe capable of binding to an amplicon, the skilled artisan also understands that the complementary sequence of this oligonucleotide is equally useful as a probe for binding to the same amplicon. The same is true for sequences described as useful as primers. Additionally, it is also obvious that any suitable primer for a multiplex protocol may also, within the meaning and scope of the present invention, be used in a singleplex protocol. The same applies to a primer suitable for a real time PCR protocol that can be used in a conventional PCR protocol within the meaning of the present invention.
  • hybridize and “annular” are used interchangeably and mean the base pairing interaction of one nucleic acid with another nucleic acid that results in the formation of a biplex, triplex, or other more complex structures.
  • the primary interaction is specific, for example, C / G and A / T, by hydrogen bonding.
  • the oligonucleotides of the present invention need not be completely complementary to a portion of the target sequence.
  • the primer may exhibit sufficient complementarity to hybridize to the target sequence and perform the intrinsic functions of a primer.
  • a probe ie a probe can have sufficient complementarity to hybridize to the target sequence and perform the intrinsic functions of a probe. Therefore, a primer or a probe, in one embodiment, need not be completely complementary to the target sequence.
  • the primer or probe may hybridize or anneal to a portion of the target to form a double strand. Hybridization conditions of a nucleic acid are described by Joseph Sambrook et al.
  • primer includes any single stranded oligonucleotide capable of annealing to a complementary target template under conditions of appropriate stringency and serving as a starting point for the synthesis of an extension product (amplicon) from the primer by elongating the strip by a DNA polymerase under appropriate conditions. These conditions include 4 different types of deoxynucleoside triphosphates and DNA polymerase or reverse transcriptase at appropriate temperature conditions and in a suitable buffer solution.
  • the length of the primer may vary according to several factors, but the typical length of a primer is 5-50 nt, preferably 15-30 nt, more preferably 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 nt.
  • each primer is 10-30 nt.
  • Forward and reverse primers are primers that bind, respectively, to a 3 'end and a 5' end of a specific region of the target that is amplified. by the PCR reaction.
  • Primers provided by the present invention are designed based on the consensus sequences of the HTLV-1 and HTLV-2 genomes resulting from the analysis of various isolates of HTLV-1 and HTLV-2 (see Figure 1, and SEQ ID Nos. : Ile 12). More specifically, the pol region of HLTV-1 and HTLV-2 was the target.
  • these primers are, but are not limited particularly to a primer comprising at least 10 to 15 consecutive nucleotides of any of the sequences described in SEQ ID Nos: 1-2 and 4-6, and their complementary sequences, capable of amplifying a region. of the HTLV-1 and HTLV-2 pol gene.
  • the primer may also consist of any of the sequences of SEQ ID Nos: 1-2 and 4-6, and their complementary sequences.
  • probe is also known to one of ordinary skill in the art, and includes any oligonucleotide that is capable of hybridizing to a complementary target sequence under suitable hybridization conditions. Once the probe is labeled, it can be used to detect the presence of certain nucleotide sequences. Probes can be prepared as single stranded DNA, double stranded DNA, RNA or hybrid DNA-RNA. The typical length of a probe is 10-60 nt, preferably 15-55 nt, more preferably 20-50 nt, more preferably 30-45 nt, even more preferably 10-30 nt.
  • the probes provided by the present invention are also designed based on the consensus sequences of the HTLV-1 and HTLV-2 genomes resulting from sequence analysis of various HTLV-1 and HTLV-2 isolates, more specifically binding to the pol region.
  • the probe may include or comprise at least 8-15 consecutive nucleotides of any of the sequences described in SEQ ID Nos: 3 or 7.
  • the probe may also comprise or consist of any of the sequences of SEQ ID Nos: 3 or 7, and their complementary sequences.
  • Various probe formats can be used to perform a real time PCR, such as fluorescence labeled probes.
  • the probes may be of the fluorescence resonance energy transfer (FRET) type which include, but are not limited to, TaqMan TM, Molecular Beacon TM, Scorpion TM, and LUX TM probes.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • probes according to the invention are of the TaqMan TM type.
  • an oligonucleotide whose 5 'terminal region is modified with a fluorophore and the 3' terminal region is modified with a quencher is added to the PCR reaction. It is also understood that it is possible to bind the fluorophore in the 3 'terminal region and the quencher in the 5' terminal region. Reaction products are detected by fluorescence generated after 5 '-> 3' exonuclease activity of DNA polymerase.
  • Fluorophores which refer to light-excited fluorescent compounds having light excitation having a shorter wavelength than the light that is emitted, may be, but are not limited to, FAM, TAMRA, VIC, JOE, TET, HEX, ROX, RED610, RED670, NED, Cy3, Cy5, and Texas Red.
  • Quenchers may be, but are not limited to, 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 and MGB-NFQ.
  • the choice of the fluorophore-quencher pair can be made such that the quencher excitation spectrum overlaps with the fluorophore emission spectrum.
  • An example is the pair FAM-TAMRA, FAM-MGB, VIC-MGB, and so on.
  • FAM-TAMRA FAM-MGB
  • VIC-MGB HEX
  • ROX RED610
  • RED670 NED
  • Cy3, Cy5 Texas Red
  • Texas Red Texas Red
  • Quenchers may be, but are not limited to, 6-
  • the spectrum properties of said probes are chosen such that one probe does not interfere with the other.
  • each probe will have its own fluorophore being spectral and significantly different from another probe, that is, the absorption / emission spectra of the different probes are essentially non-overlapping. This advantageously allows the detection of each probe individually, as the individual signals do not interfere with each other during detection.
  • the fluorescence emitted during the target nucleic acid amplification reaction is measured to monitor the accumulation of specific amplification products.
  • the fluorescence signal is proportional to the amount of specific amplicon produced.
  • fluorescence will increase.
  • fluorescence will remain consistently low throughout the reaction.
  • An increase in fluorescence or an unchanged level of fluorescence indicates the presence or absence of HTLV-1 and / or HTLV-2 targets, respectively.
  • primers capable of amplifying capable of detecting amplicons resulting from the amplification of human sequences.
  • Non-limiting example is an primer comprising or consisting of the sequence of SEQ ID Nos: 8 and 9 and a probe comprising or consisting of SEQ ID NO: 10 which targets the human beta-globin gene. It should be noted here that one skilled in the art can determine other suitable primers and probes directed to other sequences useful for this purpose.
  • a positive control may be incorporated.
  • a nucleic acid sample containing HTLV-1 and / or HTLV-2 target copies may be used, for example, a cassette or vector comprising the target sequence to be amplified, or a certain amount of sample of nucleic acid from a cell line containing a known number of viral sequence inserts.
  • Non-limiting examples include, for example, MT-2 and Gu cell lines.
  • a negative reaction control can be incorporated.
  • This control can be a nucleic acid sample that contains no copy of the HTLV-1 and HTLV-2 target, for example, human cell line DNA that has no HTLV-1 and HTLV viral sequence insertions. -2.
  • kits used to simultaneously diagnose, differentiate and quantify infections caused by HTLV subtypes comprising at least one set of oligonucleotides.
  • oligonucleotide set is meant any combination comprising at least one oligonucleotide, preferably at least two, for example from 2 to 20 oligonucleotides.
  • Said set may, for example, comprise at least one primer and at least one probe, or at least one pair of primers and at least one probe, and so on.
  • Said oligonucleotides may be kept separate, or partially mixed, or fully mixed.
  • said kit comprises at least one set of oligonucleotides according to the invention designed specifically for HTLV-1 and HTLV-2.
  • Said oligonucleotides may be kept either separately, or partially mixed, or fully mixed.
  • Oligonucleotides may be provided in dry form or solubilized in a suitable solvent according to the knowledge of the art.
  • suitable solvents include TE, ultrapure water, and the like.
  • the kit according to the invention may also contain additional reagents suitable for the amplification reaction, including water, nuclease free water, RNase free water, DNase free water, ultrapure water, salts (such as magnesium, potassium salts), buffers (such as conventional PCR buffers known in the art), enzymes including thermostable polymerases such as Taq, Vent, Pwo, Pfu, reverse transcriptase , and the like, nucleotides such as deoxynucleotides, dideoxynucleotides, dNTPs, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dUTP, other reagents, such as additives, RNase or DNase inhibitors, and polynucleotides such as polyT, polidT, and other oligonucleotides, as primers and probes for other pathogens eg HIV, HBV, HCV and for internal controls such as human beta-globin.
  • Said reagents may be housed in containers, which for the purposes of the present invention include, but are not limited to, microtubes, tubes, PCR plates with different amounts of wells, chips, or any other suitable inert medium where the amplification reaction may occur, and that does not react with the fluids and solutions of the present invention.
  • the container may be further labeled and identified, for example, with colors, to avoid confusion and provide ease of use for a laboratory technician.
  • the kit according to the invention contains instructions for the use thereof.
  • Such instructions may be on a brochure, card, or the like. These instructions can be in two forms: one detailed, providing exhaustive information regarding the kit and its use, possibly also including literature data; and a simple one, in the form of a quick guide, providing essential information needed to use the kit.
  • said kit is a diagnostic kit, especially an in vitro diagnostic kit, for example, a diagnostic kit.
  • HTLV diagnosis More preferably, said kit is a kit for diagnosing and differentiating HTLV-1 and HTLV-2.
  • the diagnostic kit may further include a kit for extracting and isolating nucleic acids from a biological sample.
  • Said extraction kit may comprise a lysis buffer, a wash buffer and an elution buffer.
  • the extraction kit may further be provided with empty containers and adsorption columns for extraction and isolation of nucleic acids.
  • HTLV polynucleotides are the targets or target source for the amplification reaction of the present invention.
  • target sequence or simply “target” refers to a nucleic acid sequence that serves as a template for amplification in a PCR reaction.
  • These nucleic acid sequences may contain deoxyribonucleotides, ribonucleotides, and / or their analogues.
  • the sequence may be a gene or gene fragment, mRNA, cDNA, isolated total DNA, isolated total RNA, and the like.
  • target sequences include, but are not limited to, integrated HTLV provirus DNA, HTLV cDNA present in a cell prior to viral integration into the host genome, viral RNA extracted from viral particles or from host cells during replication. viral, HTLV primary RNA transcripts, splicing-processed mRNA, etc.
  • the target sequences of the present invention are located in the pol gene of the HTLV-1 and HTLV-2 genomic sequences.
  • the HTLV-1 target sequence is located between bases 3340 and 3414 of the genome consensus sequence of HTLV-1 as set forth in SEQ ID NO: 11.
  • the HTLV-2 target sequence is located between bases 4483 and 4563 of the HTLV-2 genome consensus sequence as set forth in SEQ ID NO: 12.
  • These sequences are, for purposes of this invention, reference template sequences, that is, suitable primers according to the present invention are capable of amplifying at least these reference sequences.
  • suitable probes according to the present invention are also capable of hybridizing to at least these reference sequences.
  • a human target sequence can be used as a standard or control for nucleic acid extraction from a biological sample.
  • target control is the human beta-globin gene.
  • the person skilled in the art will surely be able to determine other suitable control targets, which may consist of other human genes.
  • the target sequence is present in a sample of biological material collected from an individual.
  • sample any biological substance or material that may contain an HTLV, an HTLV infected cell, or an HTLV target sequence, and includes, but is not limited to, blood, plasma, serum, cells, blood, seminal fluid, vaginal secretions, breast milk, saliva, and the like. More preferably, the sample comprises or consists of human blood cells and / or whole blood.
  • kits are available for the isolation of nucleic acids from whole blood. Examples of kits include, but are not limited to, QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen); Spin Plus ReliaPrep TM Blood gDNA Miniprep System (Promega) and BIOPUR Mini Spin Plus Extraction Kit (Biopur). PCR target sequence amplification and diagnostic methods
  • target nucleic acid amplification can be performed by a variety of methods including, but not limited to, conventional PCR, real-time PCR, RT-PCR, nested-PCR, Semi-quantitative PCR and others.
  • the method used is real time PCR.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription reaction
  • amplicon or “PCR product”, the terms being used interchangeably, refers to a nucleic acid (or collectively, the plurality of nucleic acid molecules) that has been synthesized during amplification procedures.
  • An amplicon is typically, but not exclusively, a DNA fragment.
  • Real-time PCR means any PCR-based method for monitoring the fluorescence emitted during the reaction as an indicator of the production of the PCR or amplicon product during each PCR cycle, as opposed to detection by completion of all cycles in conventional PCR methods.
  • Quantitative PCR means any PCR-based method that allows the initial quantity of a given target sequence to be estimated in a given sample.
  • multiplex PCR refers to any reaction PCR aimed at amplifying more than one target.
  • multiplex PCR includes biplex PCR (two targets), triple PCR (three targets), and so on.
  • Multiplex PCR includes PCR reactions with more than one primer pair, for example, two primer pairs. In this case, there may be four different primers, but there may also be one common initiator, for example, the forward primer, and two distinct reverse primers.
  • Multiplex PCR also includes PCR reactions with a single primer pair but with more than one probe.
  • multiplex amplification includes amplification reactions of different genes, different alleles of a single gene and / or different fragments of a single gene.
  • a “buffer” is a composition added to the amplification reaction, comprising a buffering agent, which modifies the stability, activity and / or longevity of one or more amplification reaction components by regulating the pH of the amplification reaction.
  • the buffering agents of the invention are compatible with the polymerase activity to be used, namely a DNA polymerase. Buffering agents are well known in the art and include, but are not limited to Tris, Tricine, MOPS (3- (N-morpholino) propanesulfonic acid), and HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine acid). ethanesulfonic).
  • PCR buffers can generally contain up to about 70 mM KC1 and about 1.5 mM or more of MgCi 2 at about 50-500 ⁇ of each of the dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
  • the buffers of the invention may further contain additives.
  • An additive is a compound added to a composition that modifies the stability, activity and / or longevity of one or more components of the composition.
  • the composition is an amplification composition.
  • an additive inactivates contaminating enzymes, stabilizes protein folding and / or decreases protein aggregation.
  • additives may be added to improve the selectivity of the tempo of a primer and / or a probe, provided that the additive does not interfere with DNA polymerase activity.
  • additives are, but are not limited to, betaine, glycerol, formamide, KCl, CaCl 2 , MgOAc, MgCl 2 , NaCl, NH 4 OAc, Nal, Na (CO 3 ) 2 , LiCl, MnOAc, NMP , trehalose, DMSO, ethylene glycol, dithiothreitol ("DTT"), pyrophosphatase (including but not limited to inorganic Thermoplasma acidophilum (“TAP”) pyrophosphatase), bovine serum albumin ("BSA”), propylene glycol, glycinamide, CHES, Percoll TM, Aurintricarboxylic Acid, Tween 20, Tween 21, Tween 40, Tween 60, Tween 85, Brij 30, NP-40, Triton X-100, CHAPS, CHAPSO, Mackernium, LDAO (N-dodecyl-N, N,
  • coli SSB RecA, 7- deazaG, dUTP, UNG, anionic detergents , cationic detergents, nonionic detergents, zwittergents, sterols, cations, and any other chemicals, proteins, or cofactors that may alter the efficiency of amplification.
  • thermalostable when applied to the enzyme, refers to an enzyme that retains its biological activity at elevated temperatures (e.g., at 55 ° C or above), or retains its biological activity after repeated heating and cooling cycles.
  • Thermostable nucleotide polymerases are particularly preferred for the present invention as they eliminate the need to add enzyme before each PCR cycle.
  • Polymerase activity refers to an enzymatic activity that catalyzes the polymerization of deoxyribonucleotides. Generally, the enzyme will initiate synthesis at the 3 'end of the annealed primer to the target sequence, and will proceed toward the 5' end of the template tape. In certain embodiments, this enzyme is a DNA polymerase. thermostable.
  • thermostable DNA polymerases include, but are not limited to, polymerases isolated from Thermus aquaticus (Taq polymerase), Thermus thermophilus (Tth polymerase), Thermococcus litoralis (Tli or VENT TM polymerase), Pyrococcus furiosus (Pfu or DEEPVENT TM polymerase), Pyrococcus woosii (Pwo polymerase) and other Pyrococcus species, Bacillus stearothermophilus (Bst polymerase), Sulfolobus acidocaldarius (Sac polymerase), Thermoplasma acidophilum (Tac polymerase), Thermus rubber (Tru polymerase) polymerase) (Tne polymerase), Thermotoga maritime (Tma) and other species of Thermotoga genus (Tsp polymerase), and Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth polymerase).
  • the PCR reaction may contain more than one thermostable polymerase enzyme with complementary properties, resulting in more efficient amplification of the target sequences.
  • a polymerase with high ability to amplify large nucleotide segments can be complemented with another polymerase that can correct errors during elongation of the target nucleic acid sequence, thus creating a PCR reaction that can amplify a long target sequence with high Fidelity.
  • the thermostable polymerase may be used in its wild form or, alternatively, the polymerase may be modified to contain a fragment of an enzyme or to contain a mutation that provides beneficial properties to facilitate the PCR reaction.
  • the polymerase may be Taq polymerase.
  • Taq polymerase with improved properties include, but are not limited to AmpliTaq TM, Stoffel fragment, SuperTaq TM, SuperTaq TM plus, LA Taq TM, LApro Taq TM, and EX Taq TM.
  • hybridization conditions refers to conditions that allow the primer or probe ring to the nucleotide sequence of interest. These conditions are dependent on the temperature and ionic strength of the solution in which hybridization occurs. These are the stringency conditions. As understood by one of ordinary skill in the art, tempo stringency may be altered to identify or detect identical or related polynucleotide sequences.
  • the melting temperature, Tm can be calculated by formulas known in the art, depending on a number of parameters, such as primer length or nucleotide probe length, or ingredients present in the buffer and conditions. For this, see, for example, T.
  • Tm 64.9 + 41 * ( y G + zC-16.4) / (wA + xT + yG + zC)
  • Tm 100.5 + (41 * (yG + zC) / (wA + xT + yG + zC)) - (820 / (wA + xT + yG + zC)) + 16.6 * log10 ([Na + ])
  • the running temperature ranges may range from about 50 ° C to 62 ° C, but primers can be designed to be optimal at about 58 ° C to 60 ° C.
  • An additional consideration when designing primers is the guanine and cytosine content.
  • the GC content for a primer may be about 30-70%, but may be smaller and may be adjusted appropriately by one of ordinary skill in the art.
  • the progression of oligonucleotides complementary or partially complementary to a given target can be achieved by modifying the driving conditions to increase or decrease stringency, for example by adjusting the temperature or salt concentration in the buffer. Such modifications to maintain HTLV-1 and HTLV-2 specificity may be routinely performed by one of ordinary skill in the art.
  • a pair of primers of a specific type may be used alone (for example, a forward primer and a HTLV-1 reverse primer; a forward primer and a HTLV-2 reverse primer; or a primer). forward and one or two HTLV-2 reverse primers, and so on).
  • Multiplex amplification can be used to amplify HTLV-1 and HTLV-2 regions concomitantly.
  • the final concentrations of the primers may be adjusted accordingly, ranging from about 50 nM to about 2000 nM, preferably from about 100 nM to about 1000 nM, more preferably from about 200 nM to about 600 nM, plus preferably from about 250 nM to about 500 nM, from each of the primers represented by SEQ ID Nos: 1-2, 4-6 and 8-9.
  • Final probe concentrations can also be adjusted appropriately by one of ordinary skill in the art, ranging from about 50 nM to 1000 nM. More preferably, the final concentration ranges from about 100 to about 300 nM, more preferably from 150 to 250 nM of each of the probes represented by SEQ ID Nos: 3, 7 and 10.
  • a method for detecting the presence of HTLV from nucleic acids extracted from a biological sample comprising the step of mixing dNTPs, DNA polymerase, buffer, in a suitable container. At least one primer and at least one probe as described herein, the nucleic acid extracted from the biological sample, and subjecting the container containing the mixture to incubation in a thermocycler.
  • the invention provides a method for detecting the presence of HTLV, comprising performing a polymerase chain reaction using at least one or a set of primers selected from the forward primer group of SEQ ID Nos: 1 and 2. 4, and at least one or a set of primers selected from the reverse primer group of SEQ ID Nos: 2, 5 and 6.
  • PCR reaction conditions include conditions suitable for a multiplex PCR.
  • said conditions include those suitable for quantitative real time multiplex PCR.
  • said method comprises the step of placing the sample in the presence of probe (s) under conditions suitable for annealing said probe (s) to the amplicon.
  • the method comprises the step of detecting at least one amplicon in real time, allowing assessment of the presence or absence of HTLV-1 and / or HTLV-2 in the sample. This is advantageously achieved by fluorescence intensity measurements.
  • Fluorescence measurement procedures are known in the art. Briefly, the sample is illuminated around the excitation wave. fluorophore, and the emission intensity is measured.
  • said method comprises the step of measuring at least once, and more preferably in real time, the amount of probe that annexes to the amplicon.
  • said method comprises the step of estimating at least once the copy number of the target initially present in the sample. The person skilled in the art knows how to perform this step. For example, this can be accomplished using calibration standards and / or internal controls.
  • this step includes determining the so-called cycle threshold (CT) for each sample, which correlates with the number of copies of the template target initially present in each sample.
  • CT cycle threshold
  • At least one step, preferably several steps, most preferably most steps, are performed on a PCR plate, including those with 24 wells, 48 wells, 96 wells and 384 wells.
  • the use of plates advantageously ensures that samples can be processed in parallel during the reaction. In addition, it allows the method to be performed on a large scale, which saves time.
  • thermocycler In another preferred form, at least one step, preferably several steps, more preferably most steps are performed on a thermocycler.
  • Said thermocycler may be equipped with a spectrophoorophotometer, for example, Mx3000p (Stratagene), Chromo 4 (BioRad), RocheLightcycler 480, ABI 7900, 7500 and 7300r Real-time PCR Systems (Applied Biosystems).
  • Primers of the present invention for the detection and differentiation of HTLV-1 and HTLV-2 are identified in Table 1 as SEQ ID Nos: 1-2 and 4-6, respectively. These primers were designed to ring in a region located in the HTLV-1 and HTLV-2 pol gene (see Figure 2).
  • Example 1 In silico analysis for target region definition - Design of primers and probes
  • the melting temperature (Tm) was between 58 and 60 ° C, and was approximately 10 ° C below the probe Tm, to ensure that the probe attaches to the mold before the primers.
  • the last 3 'end bases were composed of as few cytosine (C) and / or guanine (G) bases as possible, which reduces the formation of non-specific products.
  • G / C content was between 61 and 71%, within the recommended range (30 to 80%).
  • the probes were designed as close as possible to the binding region of the forward or reverse primers to improve reaction efficiency. Tm was defined between 68 ° C and 70 ° C and the G / C content was between 47 and 69%.
  • MGB minor groove binder
  • TaqMan TM primers and probes directed to the viral region were suitable.
  • the nucleotide sequences of the primers and probes used herein are shown in Table 1.
  • the probe of SEQ ID NO: 3 was labeled with FAM at the 5'end end and MGB at the 3 'end, and the probe of SEQ ID NO: 7 was labeled with VIC at the 5' end and MGB at the end. 3 'end.
  • the amplicon generated for HTLV-1 is 75 base pairs and for HTLV-2, 81 base pairs.
  • Example 2 Cultivation and expansion of MT-2 and Gu cell lines (positive controls)
  • MT-2 cell line consists of lymphoblasts isolated from an individual with ATLL (catalog number 93121518 / ECACC). This strain contains HTLV-1 integrated into its genome, presenting 2.1 viral copies per cell (Albrecht et al, J Virol Methods, v. 75, no. 2, pp. 123-40, 1998). The Gu strain, derived from the in vitro infection of the BJAB cell line, contains 8.3 copies of the HTLV-2 integrated into its genome (Moens et al., J Clin Microbiol, v. 47, no. 11, p. 3682. -91, 2009). This strain was kindly provided by the Rega Institute for Medical Research - Katholieke Universiteit, Leuven, Belgium.
  • MT-2 and Gu cell lines were grown in 15 cm 2 (Greiner Bio One) bottles with 15 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture medium (Sigma-Aldrich) supplemented with 10% inactivated fetal bovine serum. (Hyclone); 100 U / ml penicillin and 100 U / ml streptomycin (Invitrogen). Cultures were maintained in Steri-cult 200 Thermoform (Forma Scientific) incubators at 37 ° C, 5% CO 2 and 85% relative humidity.
  • RPMI Roswell Park Memorial Institute
  • DNA extraction was performed using the Gentra Puregene cell kit (Gentra Systems) following the manufacturer's instructions. 3 ml of cell lysis solution was added and vortexed for 10 seconds. 15 ⁇ l of RNase was added, homogenizing by inversion about 25 times. This mixture was incubated at 37 ° C for 5 minutes and rapidly cooled on ice for 3 minutes. Then 1 mL of protein precipitating solution was added followed by vigorous vortexing for 20 seconds and subsequent centrifugation at 2000 x g for 10 minutes. After centrifugation, the supernatant was transferred to a new 15 mL polypropylene tube to which 3 mL of isopropanol was added and inverted homogenized about 50 times for DNA precipitation.
  • the samples were centrifuged for 3 minutes at 2000 x g and the supernatants were discarded.
  • 3 mL of 70% ethanol was added and the system was homogenized several times for efficient washing.
  • the DNA was collected and transferred to a sterile 1.5 mL tube. After evaporation of ethanol, the DNA was resuspended in 300 ⁇ l deionized water and incubated at 65 ° C for 1 hour for complete DNA elution. After extraction, DNA was quantified by spectrophotometry (UV) at a wavelength of 260 nm and 280 nm on the Nanodrop 2000c spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific).
  • UV spectrophotometry
  • Positive controls were prepared from DNA extracted from the MT-2 and Gu cell lines as described above.
  • Internal control is a DNA sequence that is present in the same qPCR reaction in which test samples are amplified. This sequence is co-amplified simultaneously with the target sequence and aims to monitor the entire process from nucleic acid extraction to final data analysis, validating negative reactions and demonstrating the presence of inhibitors or failures in pre-analytical processes. and analytical samples.
  • the beta-globin gene was used as Cl in qPCR reactions.
  • the probe of SEQ ID NO: 10 was labeled NED at the 5 'end and MGB at the 3' end.
  • the amplicon generated for beta-globin internal control is 54 base pairs.
  • Example 6 Standardization of qPCR Reactions in Singleplex Format - Preparation of the Standard Curve from Positive Controls Considering that the haploid human genome weighs 3.3 pg and the MT-2 cell line has approximately one copy of HTLV-1 integrated into its genome, calculations were made to obtain a stock solution containing 10 5 copies. viral infections every 5 ⁇ . of solution. Similarly, calculations were performed for the Gu cell line, however, this cell has approximately four copies of HTLV-2 integrated into its genome. These calculations were based on Avogadro's constant and DNA concentration of specimens evaluated by spectrophotometry. Stock solutions were stored at -20 ° C until time of use.
  • the reactions were performed in the following formats: i) biplex containing targets and probes for HTLV-1 or HTLV-2 and Cl; ii) triplex containing targets and probes for HTLV-1, HTLV-2 and CL Biplex format reactions (HTLV-1 and Cl) were found to be adequate ( Figure 4).
  • the HTLV-2 curves of the biplex reactions (HTLV-1 and HTLV-2; HTLV-2 and Cl) have changed in shape, becoming more linear than sigmoid ( Figure 4).
  • the curves for HTLV-1 and Cl were adequate, however, the curves for HTLV-2 were markedly changed in shape and significantly reduced fluorescence as observed. in figure 4.
  • HTLV human T-cell lymphotropic virus
  • SD standard deviation
  • Ct cycle threshold
  • ND not detected.
  • Real-time singleplex PCR reactions were standardized using the TaqMan TM Universal PCR Master Mix kit (Applied Biosystems) and thermal cycling, amplification, and data acquisition conditions were performed according to Example 7.
  • Each Amplification reaction consisted of 5 ⁇ , DNA obtained from the MT-2 and Gu positive controls, 12.5 ⁇ , TaqMan TM Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems).
  • the concentration of probes for HTLV-1 (fluorochrome FAM TM labeled) and HTLV-2 (fluorochrome VIC TM labeled) ranged from 100 to 300 nM, while for internal control (Cl) (labeled NED TM fluorochrome) ) ranged from 50 to 200 nM.
  • Primer concentrations ranged from 250 to 500 nM for HTLV-1 and HTLV-2 and 125 to 250 nM for CL Water volume was adjusted for each reaction to a final volume of 25 ⁇ L / reaction. Subsequently, the best performing reagent concentrations were evaluated in multiplex format.
  • MT-2 Positive Control Dilutions (HTLV-1) and Gu (HTLV-2) containing 10 5 , 10 3 , and 10 1 viral copies / reaction were used in qPCR reactions. The reactions were performed in singleplex and multiplex formats (biplex and triplex). Figure 5 shows the concentrations of probes evaluated which were 100, 200 and 300 nM.
  • HTLV-1 and HTLV-2 MT-2 (HTLV-1) and Gu (HTLV-2) cell lines containing 10 5 , 10 3 , and 10 1 viral copies / reaction were used.
  • concentration of the primers tested for HTLV-1 and HTLV-2 reactions were 250 and 500 nM and 100 and 200 nM probes, and for Cl, 125 and 250 nM primers and 50 and 100 nM probe.
  • HTLV-1 The best conditions observed for HTLV-1 were 500 nM primers and 200 nM probes, for 500 nM forward primer HTLV-2, 250 nM reverse primers and 200 nM probe and for Cl, 250 nM primers and 100 nM nM probe ( Figure 8).
  • the HTLV-1 primers were used at concentrations of 250 and 500 nM and the probe 100, 125, 150, 175, and 200 nM for HTLV-2, primers at concentrations of 250 and 500 nM and probe 200, 225 and 250 nM and for Cl, primers at the concentration of 250 and 100, 125, 150 and 200 nM probe.
  • the best condition observed was when using for HTLV-1, 500 nM primers and 200 nM probe; for HTLV-2, 500 nM forward primer, 250 nM reverse primer and 225 nM probe, and for Cl, 250 nM primer and 200 nM probe as can be seen in Figure 9.
  • a mixture composed of all probes and mixers used in the qPCR reactions was produced.
  • the forward and reverse primers for HTLV-1 were diluted to 25 ⁇ concentration.
  • the fo rward primer for HTLV-2 was diluted to the 25 ⁇ concentration, while the reverse and reverse 'primers were diluted to 12.5 ⁇ .
  • the forward and reverse primers for internal control (Cl) were diluted to a concentration of 12.5 ⁇ .
  • the HTLV-1 and IC probes were diluted to 10 ⁇ and the HTLV-2 probe was diluted to 11.25 ⁇ . All oligonucleotides were mixed in a 12 mL polypropylene tube. free from DNAse, RNAse and pyrogens to form a unique mix.
  • Ultrapure water was used so that the final oligonucleotide concentrations were 500 nM for the forward and reverse primers for HTLV-1, 500 nM for the forward primer for HTLV-2, 250 nM for the reverse and reverse primers for HTLV-2 and 250 nM of Cl forward and reverse primers, 200 nM of HTLV-1 and IC probe and 225 nM of HTLV-2 probe.
  • the oligonucleotide mix was aliquoted. At each aliquot dispensed, the mix was vortexed for 10 seconds. The aliquots were wrapped in aluminum foil and stored at -20 ° C until use. Thawing of the stock oligonucleotides used for the preparation of the mix was performed on ice and homogenized for 10 seconds before dilution procedures.
  • SD standard deviation
  • CV coefficient of variation
  • Ct cycle threshold
  • HTLV human T-cell lymphotropic virus.
  • SD standard deviation
  • CV coefficient of variation
  • Ct cycle threshold
  • HTLV human T-cell lymphotropic virus.
  • repeatability refers to the maximum agreement between repeated tests of the same sample under the same operating conditions. This test was performed from three positive control dilutions ( ⁇ -2 + Gu) containing 10 5 , 10 4 , 10 3 viral copies / reaction with five replicates of each dilution. Three qPCR runs were performed on the same day using the same reagent lot and prepared by a single operator.
  • Reproducibility assesses the maximum agreement between successive results of the same analyte under different operating conditions. This test was performed from three positive control dilutions ( ⁇ -2 + Gu) containing 10 5 , 10 4 , 10 3 viral copies / reaction with five replicates of each dilution. Three races were held on alternate days, using the same batch of reagents and prepared by three separate operators. (Tables 6 and 7).
  • HTLV human T-cell lymphotropic virus
  • Ct cycle threshold
  • CV coefficient of variation
  • HTLV human T-cell lymphotropic virus
  • Ct cycle threshold
  • CV coefficient of variation
  • HTLV-1 positive samples were pipetted side by side with targetless samples (reaction blank). No reaction blanks showed an amplification curve, indicating that there was no cross contamination during reaction preparation.
  • Analytical sensitivity or lower limit of detection assesses the lowest concentration or amount that a diagnostic method can detect.
  • positive control dilutions ⁇ -3 + Gu
  • the positive control stock dilution ( ⁇ -2 + Gu) containing 10 5 viral copies was subjected to a first 10-ratio dilution to obtain a solution containing 10 4 viral copies, followed by a 5-ratio dilution, resulting in a solution containing 2000 viral copies. From this solution, 11 serial two ratio dilutions were performed until a solution containing 0.976 viral copies was obtained. At each dilution performed, the sample was vortexed for 10 seconds, followed by rapid centrifugation to minimize aerosol formation.
  • HTLV-1 and HTLV-2 positive controls were tested, ranging from 62.5 to 0.975 viral copies / reaction. All reactions were performed in multiplex format in eight replicates of each dilution. Two tests were performed on different days using different batches of primers and probes, pipetted by three different operators (Tables 8 and 9).
  • the analytical sensitivity (lot 01) obtained by the average between operators was 4.64 copies / reaction for HTLV-1 (ranging from 3.83 to 5.54 copies / reaction) and 10.77 copies / reaction for HTLV-2 ( ranging from 7.02 to 17.21 copies / reaction).
  • the analytical sensitivity (lot 02) was 3.06 copies / reaction for HTLV-1 (ranging from 2.81 to 3.55 copies / reaction) and 10.99 copies / reaction for HTLV-2 (ranging from 8.62 to 13.53 copies / reaction).
  • the average detection between experiments was 3.85 copies / reaction for HTLV-1 (ranging from 2.81 to 5.54 copies / reaction) and 10.88 copies / reaction for HTLV-2 (ranging from 7.02 to 17.21 copies / reaction).
  • HTLV human T-cell lymphoid virus
  • no number
  • OP operator
  • CI confidence interval
  • HTLV human T-cell lymphotropic virus
  • no number
  • OP operator
  • CI confidence interval
  • Analytical specificity corresponds to the ability of the test to uniquely identify the target substance or organism rather than similar substances or organisms in a sample.
  • in vitro and in silico tests were performed.
  • qPCR reactions contemplating HAV, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2, B 19 viruses were performed with panels purchased from the National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC).
  • NIBSC National Institute for Biological Standards and Control
  • 30 samples from HIV-infected individuals, 30 samples from HBV-infected individuals, and 30 samples from HCV-infected individuals were evaluated in qPCR reactions.
  • In silico validation was performed by comparing primer and probe sequences against a public BLAST database to verify possible homologies with other organisms.
  • TaqMan® primers and probes sets targeting the HTLV-1, HTLV-2 and internal control (IC) viral region pol were tested in vitro from nucleic acids extracted from a panel purchased from the National Institute for Biological Stantadards and Control (NIBSC) covering the HAV, HBV, HCV, HIV and B viruses 19.
  • NEBSC National Institute for Biological Stantadards and Control
  • 30 samples from patients with Human Immunodeficiency Virus (HIV) 30 samples from patients with Hepatitis B virus (HBV).
  • HCV hepatitis C virus
  • In silico evaluation was performed by comparing probe sequences and primers with the public BLAST database to verify homology with other microorganisms. The reactions did not cross react with the viral types tested and the primer and probe sequences showed 100%. similarity to HTLV and beta globin (Cl), therefore suitable for the assay.
  • the diagnostic sensitivity of a method refers to the likelihood of a positive result in the presence of infection, ie it evaluates the test's ability to detect an infected (true positive) individual as positive.
  • the samples used for this test were positive serology reagents, Western Blot and / or nested PCR positive. Thus, 320 samples from HTLV-1/2 infected individuals were tested, among them 278 samples from HTLV-1 and 42 samples from HTLV-2.
  • the formula for calculating diagnostic sensitivity is described below:
  • the diagnostic specificity of a method refers to the likelihood of a negative result in the absence of infection, ie assesses the ability of the test to identify a healthy individual (true negative) as negative.
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the cycling, amplification and data acquisition conditions of the entire validation process were performed according to Example 7.
  • the concentration of probes used for HTLV-1 (FAM) and Cl was 200 nM and HTLV-2 ( VIC) 225 nM.
  • Primer concentrations for HTLV-1 were 500 nM, 250 nM HTLV-2 and 250 nM IC, except for the 'HTLV-2 reverse primer' which was used at the 500 nM concentration. All reactions were performed in duplicate and in multiplex format.
  • the primer and probe set was subjected to the diagnostic specificity test.
  • 288 nonreactive samples for HTLV-1/2 serology were submitted to qPCR reaction in multiplex format. No amplification of the samples was observed, showing 100% of diagnostic specificity. All reactions were performed in duplicate.
  • Example 20 Resolution of undetermined and undetermined cases of the Western Blot (WB) test Western Blot testing in some cases does not discriminate HTLV-1 infection from HTLV-2. Still, there are times when the band pattern does not set the infection status, but remains with an indeterminate result. A total of 11 samples evaluated by WB remained undefined for the viral type and 14 samples were undetermined. The developed platform was able to define the viral type in 10 of 11 untyped samples and conclude the infection status in six of 14 samples evaluated (Table 10).
  • WB Western Blot
  • the threshold of qPCR reactions has been set based on the automatic choice of thresholds by the 7500 software version 2.0.5 (Applied Biosystems) obtained from the HTLV-1 and HTLV-2 positive controls in 21 qPCR runs. performed on alternate days. After median calculation, the threshold for HTLV-1 was set at 0.518759 and for HTLV- 2 0.409368. These values were used throughout the validation process.

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Abstract

A presença do vírus linfotrópico de células T humanas (HTLV) pode ser detectada e vírus pode ser tipado como tipo 1 ou 2 pelo método aqui descrito, que envolve a amplificação de sequências de DNA do HTLV por reação de polimerase em cadeia em tempo real. Para isto, foram desenvolvidos iniciadores utilizados para amplificar uma região particular do genoma do HTLVl e 2. A presença do HTLV-1 e/ou do HTLV-2 em uma amostra é indicada pela formação de fluorescência liberada pelas sondas específicas para cada subtipo.

Description

"OLIGONUCLEOTÍDEOS, CONJUNTO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS, KIT PARA DIAGNÓSTICO E DISCRIMINAÇÃO DE INFECÇÃO POR HTLV-1/2, POLINUCLEOTÍDEO ADEQUADO PARA USO COMO ALVO DE REFERÊNCIA PARA O DESENHO DE INICIADORES E SONDAS PARA DETECÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DE HTLV-1 E HTLV- 2, AMPLICON, E, MÉTODO PARA DETECÇÃO DE PELO MENOS UM ALVO DE HTLV."
Campo da invenção
[0001] A invenção refere-se de forma geral à amplificação e detecção de ácidos nucleicos. Mais especificamente, são providos métodos, oligonucleotídeos e kit de diagnóstico para confirmar, quantificar e discriminar infecções por HTLV-1 e/ou HTLV-2 a partir de amostras do paciente.
Antecedentes da Invenção
[0002] O primeiro indício de que as infecções virais poderiam ser a causa de neoplasias em humanos foi documentado por Rous (J Exp Med, v. 13, n. 4, p. 397-411, 1911). Em 1979, o isolamento do vírus linfotrópico de células T humanas do tipo 1 (HTLV-1), a partir de células cancerígenas de um paciente com linfoma cutâneo de células T (Poiesz et al. , Proc Natl Acad Sei U S A, v. 77, n. 12, p. 7415-9, 1980) confirmou a hipótese da existência de um retrovírus como agente etiológico do desenvolvimento do câncer. O HTLV-1 foi o primeiro retrovírus humano descrito, estabelecendo definitivamente o envolvimento dos retrovírus nas infecções humanas. Pouco tempo após sua identificação, um segundo retrovírus humano foi descrito, o HTLV-2, que por sua vez, foi isolado a partir de uma linhagem de células T obtidas de um paciente com leucemia de células pilosas (Kalyanaraman et al. , Science, v. 218, n. 4572, p. 571-3, 1982.). [0003] O HTLV-1 está associado a duas principais manifestações clínicas: i) uma doença hematológica aguda envolvendo células T denominada leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL) (Poiesz et ah, Proc Natl Acad Sci U S A, v. 77, n. 12, p. 7415-9, 1980; Yoshida et ai, Proc Natl Acad Sci U S A, v. 79, n. 6, p. 2031-5, 1982); ii) uma doença de caráter neuroinflamatório degenerativa e progressiva denominada mielopatia associada ao HTLV-l/Paraparesia Espástica Tropical (HAM/TSP). O risco para o desenvolvimento tanto da ATLL quanto HAM/TSP é cerca de 3 a 5%, o que torna assintomática a maioria dos indivíduos portadores deste retro vírus. A infecção pelo HTLV-2 tem sido associada a casos esporádicos de doenças neurológicas que se assemelham a HAM/TSP. Em 2005, dois novos tipos de HTLV foram identificados em caçadores camaroneses de primatas: HTLV-3 e HTLV-4 (Calattini et ai, Retrovirology, v. 2, p. 30, 2005; Wolfe et ai, Proc Natl Acad Sci U S A, v. 102, n. 22, p. 7994-9, 2005). No entanto, as informações sobre estes novos tipos virais não são suficientes para determinar se estes retrovírus são transmissíveis, ou ainda, se são capazes de desencadear doenças em seus portadores (Mahieux e Gessain, Pathol Biol (Paris), v. 57, n. 2, p. 161-6, 2009).
[0004] O potencial da disseminação do HTLV- 1/2 por meio da transfusão sanguínea incitou a triagem sorológica em bancos de sangue, inicialmente no Japão em 1986, seguida dos Estados Unidos em 1988, sendo gradativamente implantada em outros países (Vrielink et ai, Transfus Med Rev, v. 11, n. 3, p. 173-9, 1997). No Brasil, a triagem sorológica em doadores de sangue tornou-se compulsória a partir de 1993, de acordo com a Portaria n° 1.376 (19/11/1993) do Ministério da Saúde.
[0005] Hoje, sabe-se que, além da transmissão via transfusão de sangue e/ou hemoderivados, o HTLV-1 e o HTLV-2 também são transmitidos através de contato sexual (Murphy et al. Ann. Intern. Med. 111 :555-560, 1989); de mãe para filho através da amamentação (Hino et ai. Jpn. J. Câncer. Res. 1985, 76:474-480, 1985; Vitek et al. J. Infect. Dis. 171 : 1022-1026, 1995) e compartilhamento de seringas intravenosas por usuários de drogas (Van Brussel et al. Rev. Med. Virol. 9: 155-170, 1999). Assim, faz-se importante o uso de metodologias adequadas para o diagnóstico eficaz e seguro, para aumentar principalmente a segurança de transplante de órgãos sólidos e transfusional, o correto aconselhamento dos pacientes e a adoção de medidas preventivas em relação à transmissão de HTLV-1/2, impactando diretamente na redução da transmissão deste retrovírus.
[0006] Atualmente, no mundo, os procedimentos de testes diagnósticos requerem, em adição aos testes de triagem, a condução testes confirmatórios adicionais, todos baseados em testes sorológicos, que apresentam altos custos e ainda assim, mostram-se insuficientes para a diferenciação entre infecções causadas pelo HTLV-1 e HTLV-2. Assim, notam-se problemas relacionados à conclusão do diagnóstico, como o elevado número de resultados indeterminados.
[0007] Para fins ilustrativos, no Brasil, o diagnóstico da infecção pelo HTLV é realizado em duas etapas: triagem e confirmação. Na triagem, são utilizados testes sorológicos que detectam a presença de anticorpos dirigidos contra o vírus, tais como testes imunoenzimáticos (EIA), quimioluminescência e aglutinação de micropartículas de látex sensibilizadas (Verdier et al., J Clin Microbiol, v. 28, n. 9, p. 1988-93, 1990; Thorstensson et al., Transfusion, v. 42, n. 6, p. 780-91, 2002). Os antígenos frequentemente utilizados nos testes disponíveis no mercado são aqueles encontrados no lisado virai do HTLV-1 e HTLV-2 acrescidos das proteínas recombinantes derivadas do envelope virai, as quais aumentam a sensibilidade do teste. Para a confirmação, podem ser utilizados o Western Blot (WB), a reação em cadeia da polimerase (PCR), a radioimunoprecipitação (RIPA) e a imunoflorescência indireta (IFA) (Verdier et al., J Virol Methods, v. 30, n. 3, p. 283-9, Dec 1990; Thorstensson et al., Transfusion, v. 42, n. 6, p. 780-91, 2002; Costa et al, J Virol Methods, v. 173, n. 2, p. 280-6, 2011).
[0008] Rotineiramente, o WB é utilizado como método confirmatório, porém apresenta frequentemente resultados inconclusivos devido a reatividades inespecíficas (Kwok et al, Transfusion, v. 30, n. 6, p. 491-4, 1990; Lai, J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retro virol, v. 13 Suppl 1, p. S170-8, 1996; Thorstensson et al, Transfusion, v. 42, n. 6, p. 780-91, 2002; Abrams et ai, Viruses, v. 3, n. 8, p. 1320-31, 2011). O teste ainda apresenta elevado custo, o que o torna inviável para implementação do mesmo na rotina diagnostica (Carneiro-Proietti et al Rev Panam Salud Publica, v. 19, n. 1, p. 44-53, 2006; Andrade et al Rev Soe Bras Med Trop, v. 43, n. 2, p. 111-5, 2010). Ainda, a infecção por HTLV não pode ser detectada durante o período de pré-soroconversão (janela imunológica), que pode variar de 36 a 72 dias, ou quando a resposta imunológica é deficiente.
[0009] Por este motivo, apesar dos algoritmos para a triagem sorológica em doadores de sangue, inclusive o algoritmo brasileiro, preconizarem a utilização de um método altamente sensível como o EIA, a confirmação dos resultados positivos da triagem sorológica por outro método, como o WB, ainda apresentam problemas de ineficiência do teste, associado ao alto custo. No Brasil, ainda há a agravante de que o WB não é obrigatório devido a estes problemas.
[00010] Diante dessas dificuldades, o desenvolvimento de ferramentas moleculares altamente sensíveis e específicas para a conclusão segura do diagnóstico da infecção pelo HTLV, em complemento ou substituição ao teste de WB, torna-se necessário.
[00011] O diagnóstico molecular realizado por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) para a pesquisa de sequências genômicas provirais do HTLV no espécime clínico apresenta alta sensibilidade e especificidade devido à amplificação de fragmentos de DNA pré-determinados. Desta forma, a PCR possibilita a identificação de cepas divergentes que não estão incluídas nos testes sorológicos, bem como a identificação da infecção em pacientes que se encontram no período de janela imunológica (Madeleine et al. Int J Câncer, v. 54, n. 2, p. 255-60, 1993; Ishak et al. Rev Soe Bras Med Trop, v. 31, n. 2, p. 193-7, 1998).
[00012] O DNA pro virai do HTLV-1/2 pode ser detectado e/ou quantificado por meio da amplificação de diferentes regiões do genoma virai. As regiões gag, pol, env, tax e rex são comumente utilizadas neste procedimento (Gabbai et al, Am J Trop Med Hyg, v. 49, n. 6, p. 664-71, 1993; Poiesz et al. Transfusion, v. 40, n. 8, p. 924-30, 2000; Thorstensson et al. Transfusion, v. 42, n. 6, p. 780-91, 2002; Vitone et al, BMC Infect Dis, v. 6, p. 41, 2006). Com o objetivo de aumentar a sensibilidade e especificidade, a nested-V R. pode ser realizada, na qual uma segunda reação de amplificação é realizada com o produto da primeira reação. Em 1992, Higuchi e colaboradores (Biotechnology (N Y), v. 10, n. 4, p. 413-7, 1992) introduziram a ideia da PCR em tempo real (qPCR). Esta técnica é capaz de detectar e quantificar em tempo real os produtos da PCR durante a reação de amplificação, medindo o aumento da intensidade de fluorescência durante a reação. Esta tecnologia detecta os produtos específicos de uma reação de PCR por meio da clivagem de uma sonda duplamente marcada com fluoróforo, a qual se hibridiza na região do DNA entre os sítios de ligação dos iniciadores. Pela característica de apresentar alta sensibilidade e especificidade, a qPCR é um método capaz de esclarecer estados sorológicos indeterminados, e de discriminar a infecção causada pelo HTLV-1 e HTLV-2.
[00013] Diversos autores descrevem diferentes protocolos de qPCR para o diagnóstico do HTLV-1/2 (Dehee et al. J Virol Methods, v. 102, n. 1-2, p. 37-51, 2002; Adaui et al, J Neurovirol, v. 12, n. 6, p. 456-65, 2006; Estes e Sevall, Mol Celi Probes, v. 17, n. 2-3, p. 59-68, 2003; Besson e Kazanji, J Clin Microbiol, v. 47, n. 4, p. 1129-35, 2009; Moens et al, J Clin Microbiol, v. 47, n. 11, p. 3682-91, 2009; Waters et al, J Clin Virol, v. 52, n. 1, p. 38-44, 2011 ; Besson et ah, Blood, 99: 88-94, 2002; Tamegão-Lopes et ah, Rev. Soe. Bras. Med. Trop., 39 (6): 548-552, 2006; Andrade et ai, Rev. Soe. Bras. Med. Trop., 43 (2): 111-115, 2010; Costa et ai, J. Virol. Methods, 173: 280-286, 2011 ; US Patent Application No. 2012052501). Contudo, estes e outros protocolos descritos utilizam regiões gênicas virais e/ou iniciadores e/ou sondas e/ou métodos de detecção distintos daqueles descritos na presente invenção. De forma mais importante, importa informar que as metodologias por eles propostos apresentam deficiências na padronização, e os seus processos de validação são considerados incompletos, impactando diretamente tanto na confiabilidade quanto na sensibilidade e especificidade dos testes .
[00014] Adicionalmente, os inventores, até o presente momento, não têm conhecimento da existência de testes diagnósticos comerciais baseados em tecnologia de amplificação de ácidos nucleicos para HTLV-1/2. A implementação da tecnologia aqui descrita poderia sobrepor-se a todas as desvantagens metodológicas mencionadas anteriormente, permitindo a conclusão segura do diagnóstico.
[00015] A este respeito, os inventores apontam como vantagens da presente invenção:
[00016] 1) E uma metodologia capaz de detectar e discriminar a infecção pelo HTLV-1/2 em uma única reação, além da presença do controle endógeno, mandatório em testes diagnósticos que utilizam a metodologia da PCR.
[00017] 2) Métodos de PCR em tempo real no formato singleplex são descritos para o diagnóstico do HTLV, no entanto, a maioria destes é direcionada apenas para o HTLV- 1. A discriminação entre os tipos virais é de fundamental importância, pois as manifestações clínicas da infecção estão principalmente associadas ao HTLV-1. Além disso, como os dois tipos virais compartilham as mesmas vias de transmissão, a não detecção do HTLV-2 implicaria na contínua disseminação deste retrovírus. Ainda, os protocolos singleplex, além de agregar custo, necessitam de um maior tempo execução, pois ao menos duas reações são necessárias para a definição do diagnóstico. Na plataforma aqui desenvolvida, apenas uma reação é necessária para conclusão o diagnóstico, reduzindo significativamente o custo e tempo de realização do teste.
[00018] 3) Foi realizado um processo de validação abrangente e completo. Assim:
[00019] 3.1) Além das metodologias singleplex para o diagnóstico do HTLV-1, um restrito número de métodos multiplex capaz de detectar e discriminar o HTLV-1 e HTLV-2 em uma mesma reação é descrito. Mais restrito ainda são os métodos que incluem no multiplex o controle endógeno, mandatório em métodos diagnósticos baseados na PCR. Contudo, estes testes apresentam falhas graves nos processos de validação analíticos e diagnósticos, que por sua vez comprometem a acurácia e confiabilidade dos resultados. Em relação aos parâmetros analíticos, a definição da sensibilidade ou limite de detecção (LoD) dos testes disponíveis é realizada por meio de diluições seriadas de controles positivos, nas quais o LoD é definido como o última diluição que apresentou curva de amplificação. Esta estratégia é inadequada, pois não representa o valor real deste parâmetro. Segundo o Colégio Americano de Patologistas, o LoD deve ser calculado por meio de uma regressão linear (Probit) na qual o LoD será definido em uma probabilidade entre 0 e 100% de se obter um resultado positivo. Na processo de validação da plataforma aqui proposta, foi obtido o LoD utilizando este modelo.
[00020] 3.2) A especificidade de métodos baseados na PCR deve ser realizada tanto in vitro, quanto in silico. A maioria dos métodos encontrados não avaliou este parâmetro, ou realizaram somente a avaliação da especificidade in silico, confrontando a sequência das sondas e iniciadores contra uma base de dados pública (BLAST). Outro problema da técnica é que, quando há avaliação deste parâmetro, a grande maioria dos métodos realizam testes em um número estatisticamente muito pequeno de indivíduos. Não existe um número mínimo de amostras ou microrganismos a serem avaliados, entretanto, organismos geneticamente similares devem ser testados. A avaliação inadequada deste parâmetro pode não identificar possíveis reações cruzadas com outros organismos não investigados, reduzindo drasticamente a especificidade do ensaio. No teste desenvolvido, o conjunto de sondas e iniciadores foram avaliados in silico, bem como in vitro, por meio de reações que contemplavam os vírus HAV, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2, B 19, além de 30 pacientes portadores de HBV, HCV e HIV.
[00021] 3.3) Outro parâmetro que deve ser contemplado nos testes diagnósticos é a reprodutibilidade. A maioria dos ensaios descritos, quando avaliam este parâmetro, o faz de maneira não sistematizada e, muitas vezes inadequada. No teste proposto, a reprodutibilidade foi avaliada por meio de inter-ensaios e intra-ensaios, utilizando diferentes concentrações do analito (alta, média e baixa).
[00022] 3.4) O parâmetro robustez, convencionado como o potencial da contaminação cruzada de uma amostra positiva para uma amostra negativa avaliado nesta plataforma, não foi contemplado em nenhuma das metodologias anteriormente descritas.
[00023] 3.5) Quanto aos parâmetros diagnósticos, os inventores observam que as metodologias desenvolvidas utilizam restrito e inadequado número de amostras positivas para ambos os tipos virais. Ainda, outros trabalhos simulam amostras positivas adicionando DNA extraído de células infectadas a amostras de sangue, obtidas a partir de indivíduos não infectados, o que não reflete o verdadeiro status de infecção. O inadequado espaço amostrai de amostras positivas pode superestimar ou subestimar o valor da sensibilidade diagnostica do teste, podendo gerar resultados inconsistentes quando aplicados na rotina diagnostica. Por fim, as metodologias disponíveis ou não avaliaram a especificidade do teste com amostras de indivíduos não infectados ou utilizaram um número inadequado de amostras, podendo mascarar a inexistência de resultados falsos positivos, colocando em risco a conclusão segura do diagnóstico.
[00024] Assim, é altamente desejável prover um método melhorado para detectar e diferenciar simultaneamente em uma única reação, infecções por HTLV-1 e/ou HTLV-2. Ainda, é altamente desejável que este método seja rápido e fácil de executar em larga escala, em qualquer laboratório de biologia molecular, com alta sensibilidade e especificidade, tendo sido realizados de forma acurada os testes de padronização e validação. Em particular, o teste melhorado deve ser capaz de detectar todas as amostras positivas, com um número mínimo de falsos positivos, e ainda ser capaz de distinguir HTLV-1 de HTLV-2.
Sumário da Invenção
[00025] Em um aspecto, a invenção provê um oligonucleotídeo capaz de se ligar à região pol de HTLV e ser adequado como iniciador, compreendendo pelo menos de 10 a 15 nucleotídeos consecutivos das sequências selecionadas de SEQ ID Nos: 1, 2, 4, 5 e 6.
[00026] Em uma concretização, o oligonucleotídeo adequado como iniciador compreende as sequências de SEQ ID Nos: 1 , 2, 4, 5 e 6.
[00027] Em uma outra concretização, o oligonucleotídeo adequado como iniciador consiste nas SEQ ID Nos: 1, 2, 4, 5 e 6.
[00028] Em um outro aspecto da invenção, é provido um oligonucleotídeo capaz de ser ligar à região pol de HTLV e ser adequado como sonda, dito oligonucleotídeo sonda compreendendo pelo menos de 8 a 15 nucleotídeos consecutivos das sequências selecionadas de SEQ ID Nos: 3 e 7.
[00029] Em uma concretização, este oligonucleotídeo compreende as sequências de SEQ ID Nos: 3 e 7. Em uma outra concretização, este oligonucleotídeo consistir nas sequências de SEQ ID Nos: 3 e 7.
[00030] Em uma concretização adicional, o oligonucleotídeo adequado como sonda é marcado com uma marcação detectável, preferencialmente, um grupamento fluorescente, compreendendo um par de fluoróforo doador e um quencher.
[00031] Em um aspecto adicional, a invenção também se refere a um conjunto de oligonucleotídeos, que compreende pelo menos dois oligonucleotídeos selecionados de sequências compreendendo SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.
[00032] Em um outro aspecto adicional, é provido um método para detecção de pelo menos um alvo de HTLV, compreendendo as etapas de:
a) produzir pelo menos um amplicon usando pelo menos dois oligonucleotídeos, ditos oligonucleotídeos sendo iniciadores adequados para a amplificação de pelo menos um alvo de referência selecionado do grupo que consiste da sequência localizada entre as posições 3340 e 3414 da SEQ ID NO: 11 e sequência localizada entre as posições 4483 e 4563 da SEQ ID NO: 12, e
b) detectar o amplicon através de pelo menos uma sonda,
[00033] Em uma concretização, tal método é realizado com pelo menos um iniciador compreendendo pelo menos de 10 a 15 nucleotídeos consecutivos das sequências selecionadas de SEQ ID Nos: 1, 2, 4, 5 e 6; ou um iniciador compreendendo as sequências de SEQ ID Nos: 1, 2, 4, 5 e 6; ou um iniciador consistindo nas SEQ ID Nos: 1 , 2, 4, 5 e 6.
[00034] Em uma concretização, o método é realizado com os iniciadores de SEQ ID Nos: 1 e 2.
[00035] Em uma outra concretização, o método é realizado com os conjuntos de iniciadores selecionados de SEQ ID Nos: 4 e 5, SEQ ID Nos: 4 e 6 ou SEQ ID Nos: 4, 5 e 6. [00036] Em uma outra concretização, e etapa do método referente a detectar o amplicon é realizada com pelo menos uma sonda como acima definida.
[00037] Em uma outra concretização, a dita etapa de produzir pelo menos um amplicon compreende pelo menos um de amplificação por PCR multiplex, singleplex, quantitativo, qualitativo, convencional ou em tempo real.
[00038] Em outra concretização adicional, o método permite discriminar entre infecções por HTLV-1 e HTLV-2.
[00039] Um outro aspecto da invenção diz respeito a um kit para diagnóstico e discriminação de infecção por HTLV-1/2, compreendendo: a) pelo menos um oligonucleotídeo adequado como iniciador como acima definido; e/ou b) pelo menos um conjunto de oligonucleotídeos adequando como sonda como definido acima; e c) opcionalmente, instruções para uso.
[00040] Adicionalmente, em uma concretização, o kit da invenção ainda inclui um controle negativo e/ou um controle positivo de reação.
[00041] Em outro aspecto da invenção, é provido um polinucleotídeo adequado para uso como alvo de referência para o desenho de iniciadores e sondas para detecção e diferenciação de HTLV-1 e HTLV-2, selecionado do grupo que consiste da sequência localizada entre as posições 3340 e 3414 da SEQ ID NO: 11 e sequência localizada entre as posições 4483 e 4563 da SEQ ID NO: 12.
[00042] Em um aspecto adicional, a invenção provê um amplicon obtenível pelo método acima descrito, a partir de uma amostra contendo HTLV.
[00043] Em uma concretização, o amplicon é obtido com um par de iniciadores selecionado de: um iniciador de SEQ ID No: 1 e um iniciador de SEQ ID NO: 2; ou um iniciador de SEQ ID NO: 4 e um iniciador de SEQ ID NO: 5, ou um iniciador de SEQ ID NO: 4 e um iniciador de SEQ ID NO: 6. Breve Descrição das Figuras
[00044] Figura 1: Isolados de HTLV-1 e HTLV-2 utilizados no múltiplo alinhamento.
[00045] Figura 2: Alinhamento parcial do gene pol do HTLV-1 e HTLV- 2. (A) Iniciadores e sonda para detecção do HTLV-1. (B) Iniciadores e sonda para detecção do HTLV-2. As caixas amarelas representam os sítios escolhidos para desenho dos iniciadores. A caixa em verde representa o sítio para desenho da sonda para HTLV- 1 e a caixa em vermelho representa o sítio para desenho da sonda para HTLV-2.
[00046] Figura 3: Curvas de amplificação e curvas padrão no formato singleplex. Diluições decimais seriadas variando de 105 a 10° cópias virais/reação dos controles positivos MT-2 (HTLV-1) e Gu (HTLV-2) foram utilizadas nas reações de qPCR. (A) Curvas de amplificação para o HTLV- 1. (B) Curva padrão para HTLV-1. (C) Curvas de amplificação para o HTLV-2. (D) Curva padrão para HTLV-2. (E) Curvas de amplificação para o controle interno. (F) Curva padrão para o controle interno.
[00047] Figura 4: Curvas de amplificação nos formatos singleplex e multiplex {biplex e triplex). Diluições decimais seriadas variando de 105 a 10° cópias virais/reação dos controles positivos MT-2 (HTLV-1) e Gu (HTLV-2) foram utilizadas nas reações. (A) Curvas de amplificação no formato singleplex para o HTLV-1. (B) Curvas de amplificação no formato biplex para o HTLV-1 e controle interno. (C) Curvas de amplificação no formato singleplex para o HTLV-2. (D) Curvas de amplificação no formato biplex para o HTLV-2 e controle interno. (E) Curvas de amplificação no formato biplex para HTLV-1 e HTLV-2. (F) Curvas de amplificação no formato triplex para HTLV-1, HTLV-2 e controle interno.
[00048] Figura 5: Curvas de amplificação no formato singleplex para HTLV-2. Cada reação foi realizada em duplicata e continha 105, 103 e 101 cópias virais/reação. A curva em vermelho representa a concentração de 100 nM da sonda, em amarelo, 200 nM e em verde, 300 nM. Nota-se que há aumento na intensidade de fluorescência (ARn) à medida que a concentração da sonda é aumentada.
[00049] Figura 6: Esquema do segundo iniciador reverso para HTLV-2. Nota-se que com a utilização de dois iniciadores reversos, dois amplicons de tamanho diferentes são gerados, e estes são alvos de uma única sonda. Com o aumento do número de amplicons gerados, mais sondas serão aneladas aos mesmos, proporcionando o aumento da fluorescência, redução no Ct, e consequentemente, aumento da sensibilidade.
[00050] Figura 7: Comparação entre as curvas de amplificação no formato singleplex utilizando um ou dois iniciadores reversos para HTLV-2. As curvas de amplificação em vermelho são referente às reações contendo um iniciador reverso. As curvas de amplificação em verde referem-se a reações contendo dois iniciadores reversos. Ao adicionar o segundo iniciador reverso à reação, notou-se o aumento da fluorescência associado a uma ligeira redução nos valores de cycle threshold (Ct).
[00051] Figura 8: Curvas de amplificação no formato singleplex utilizando diferentes concentrações de iniciadores e sondas. Três diluições (105, 103, e 101) dos controles positivos MT-2 (HTLV-1) e Gu (HTLV-2) foram utilizandas nas reações de qPCR. (A) Curvas de amplificação para o controle interno. (B) Curvas de amplificação para HTLV-1. (C) Curvas de amplificação para HTLV-2. (D) Curvas de amplificação para HTLV-2.
[00052] Figura 9: Curva de amplificação no formato multiplex com a presença de três alvos (HTLV-1, HTLV-2 e controle interno). A diluição de 105 cópias virais/reação dos controles positivos MT-2 (HTLV-1) e Gu (HTLV-2) foi utilizada na reação de qPCR.
[00053] Figura 10: Curvas de amplificação e curvas padrão no formato multiplex com a presença de três alvos (HTLV-1, HTLV-2 e controle interno). Diluições decimais seriadas variando de 105 a 101 cópias virais/reação dos controles positivos MT-2 (HTLV-1) e Gu (HTLV-2) foram utilizadas nas reações de qPCR.
[00054] Figura 11: Esquema da montagem da placa de reação para o ensaio de robustez. Amostras positivas para HTLV-1 foram pipetadas lado a lado com amostras sem alvo por toda a placa em forma de "mesa de xadrez".
Descrição Detalhada da Invenção
[00055] A não ser que sejam definidos de maneira diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado entendido por um técnico no assunto ao qual a invenção pertence. As técnicas convencionais de biologia molecular são bem conhecidas de um técnico no assunto, podendo ser encontradas, por exemplo, em Ausubel et ah, eds. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. N.Y. (1987- 2008), incluindo todos os suplementos; Sambrook et ah, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). O relatório descritivo também provê definições de termos para auxiliar na interpretação daquilo que é aqui descrito e das reivindicações. A não ser que seja indicado de forma diferente, todos os números expressando quantidades, porcentagens e proporções, e outros valores numéricos usados no relatório descritivo e nas reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados, em todos os casos, pelo termo "cerca de". Assim, a não ser que seja indicado o contrário, os parâmetros numéricos mostrados no relatório descritivo e nas reivindicações são aproximações que podem variar, dependendo das propriedades a serem obtidas.
[00056] A invenção aqui descrita refere- se a novos oligonucleotídeos para amplificação, detecção, diferenciação e quantificação de subtipos de HTLV, e métodos e kits relacionados. Mais especificamente, a presente invenção provê oligonucleotídeos, incluindo iniciadores e sondas, que são adequados para a detecção e discriminação de HTLV-1 e HTLV-2. Oligonucleotídeos e kits de diagnóstico
[00057] "Oligonucleotídeo" refere-se a qualquer polímero curto de nucleotídeos, em que os nucleotídeos podem ser ribonucleotídeos, deoxirribonucleotídeos, dideoxirribonucleotídeos, nucleotídeos degenerados, e similares. Ditos oligonucleotídeos são preferencialmente fita simples. O comprimento de ditos oligonucleotídeos pode variar, e é usualmente menor que 150 nucleotídeos (nt), preferencialmente na faixa de 10-100 nt, mais preferencialmente na 10-60 nt, ainda mais preferencialmente de 13-50 nt. Podem ainda apresentar modificações químicas, tais como uma etiqueta ("tag") ou uma marcação, por exemplo, fluorescente, radioativa, biotinilada, DIG (digoxigenina), e similares. Os oligonucleotídeos da invenção podem ser tanto fo rward (senso) quanto reverso (antisenso).
[00058] Em um aspecto, os oligonucleotídeos de acordo com a presente invenção incluem iniciadores e sondas. A não ser que seja informado do contrário, as sequências são apresentadas na direção de 5' para 3'. Ditos oligonucleotídeos podem estar em várias formas, por exemplo, em solução/suspensão em um solvente adequado e em uma concentração desejada, secos ou liofilizados. O técnico no assunto tem conhecimento dos solventes, concentrações e condições de estocagem adequadas para os oligonucleotídeos da invenção. Em particular, o técnico no assunto tem conhecimento de como preparar ditos oligonucleotídeos como soluções de estoque. Os oligonucleotídeos de acordo com a invenção podem apresentar vários graus de pureza, que podem ser avaliados por um técnico no assunto, por exemplo, através de cromatografia por HPLC.
[00059] Além disto, deve ser aqui lembrado que, apesar das funções preferidas poderem ser mencionadas em relação a alguns oligonucleotídeos, é óbvio que um dado oligonucleotídeo pode assumir diversas funções, e pode ser utilizado em diferentes formas de acordo com a presente invenção. Como é de conhecimento do técnico no assunto, em algumas situações, um iniciador pode ser usado como sonda e vice-versa, além de ser aplicável em procedimentos de hibridização, detecção etc. Assim, observa-se que os produtos de acordo com a presente invenção, especialmente, inter alia, os oligonucleotídeos, não estão limitados aos usos aqui mostrados, mas, ao contrário, os usos devem ser interpretados de forma ampla, independente do uso aqui indicado. Além disto, quando um oligonucleotídeo é descrito como sendo útil como sonda capaz de se ligar a um amplicon, o técnico no assunto também entende que a sequência complementar deste oligonucleotídeo é igualmente útil como uma sonda para se ligar ao mesmo amplicon. O mesmo ocorre com as sequências descritas como úteis como iniciadores. Adicionalmente, é também óbvio que qualquer iniciador adequado para um protocolo multiplex pode ser também, dentro do significado e escopo da presente invenção, ser utilizado em um protocolo singleplex. O mesmo se aplica a um iniciador adequado para um protocolo de PCR em tempo real, que pode ser usado em um protocolo de PCR convencional, dentro do significado da presente invenção.
[00060] Os termos "hibridizar" e "anelar" são usados de forma intercambiável e significam a interação de pareamento de bases de um ácido nucleico com outro ácido nucleico que resulta na formação de um biplex, triplex, ou outras estruturas mais complexas. Em algumas concretizações, a interação primária é específica, por exemplo, C/G e A/T, pela ligação por pontes de hidrogénio.
[00061] O técnico no assunto, a este respeito, entende que os oligonucleotídeos da presente invenção, isto é, os iniciadores e sondas, não precisam ser completamente complementares a uma parte da sequência do alvo. O iniciador pode apresentar complementaridade suficiente para hibridizar com a sequência alvo e desempenhar as funções intrínsecas de um iniciador. O mesmo se aplica a uma sonda, ou seja, uma sonda pode apresentar complementaridade suficiente para hibridizar com a sequência alvo e desempenhar as funções intrínsecas de uma sonda. Portanto, um iniciador ou uma sonda, em uma concretização, não necessita ser completamente complementar à sequência alvo. Em uma concretização, o iniciador ou a sonda pode se hibridizar ou anelar com uma parte do alvo para formar uma fita dupla. As condições de hibridização de um ácido nucleico são descritas por Joseph Sambrook et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) e Haymes et al, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985). Assim, uma vez que não é necessário haver complementariedade completa para ocorrer andamento, um técnico no assunto entenderá que as sequências de iniciadores e de sondas aqui descritas podem ser modificadas até certo grau sem a perda de suas utilidades como iniciadores e sondas específicas para HTLV-1 e HTVL-2.
[00062] Com relação à definição de "iniciador", um técnico no assunto sabe que inclui qualquer oligonucleotídeo fita simples capaz de se anelar a um molde alvo complementar, em condições de estringência adequada, e que serve como ponto de início para a síntese de um produto de extensão (amplicon) a partir do iniciador, pela elongação da fita por uma DNA polimerase em condições adequadas. Estas condições incluem 4 tipos diferentes de deoxinucleosídeos trifosfatos e DNA polimerase ou transcriptase reversa em condições de temperatura adequadas e em uma solução tampão adequada. O comprimento do iniciador pode variar de acordo com diversos fatores, mas o comprimento típico de um iniciador é de 5-50 nt, preferencialmente 15-30 nt, mais preferencialmente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nt. De acordo com a presente invenção, é preferível que cada iniciador tenha de 10-30 nt. Os iniciadores forward e reverso são iniciadores que se ligam, respectivamente, a uma extremidade 3' e a uma extremidade 5' de uma região específica do alvo que é amplificado pela reação de PCR.
[00063] Os iniciadores providos pela presente invenção são desenhados baseados nas sequências consensos dos genomas do HTLV-1 e do HTLV-2, resultantes da análise de vários isolados de HTLV-1 e HTLV-2 (vide Figura 1, e SEQ ID Nos: l i e 12). Mais especificamente, a região pol de HLTV-1 e de HTLV-2 foi o alvo. Preferencialmente, estes iniciadores são, mas não limitados particularmente a um iniciador compreendendo pelo menos 10 a 15 nucleotídeos consecutivos de qualquer uma das sequências descritas nas SEQ ID Nos: 1-2 e 4-6, e suas sequências complementares, capaz de amplificar uma região do gene pol de HTLV-1 e HTLV-2. O iniciador também pode consistir de qualquer uma das sequências de SEQ ID Nos: 1-2 e 4-6, e suas sequências complementares.
[00064] A definição de sonda também é conhecida por um técnico no assunto, e inclui qualquer oligonucleotídeo que seja capaz de hibridizar com uma sequência alvo complementar em condições de hibridização adequadas. Uma vez que a sonda é marcada, ela pode ser usada para detectar a presença de determinadas sequências nucleotídicas. As sondas podem ser preparadas na forma de fita simples de DNA, fita dupla de DNA, de RNA ou híbrido DNA- RNA. O comprimento típico de uma sonda é de 10-60 nt, preferencialmente 15-55 nt, mais preferencialmente 20-50 nt, mais preferencialmente 30-45 nt, ainda mais preferencialmente 10-30 nt. As sondas providas pela presente invenção também são desenhadas baseadas nas sequências consensos dos genomas do HTLV-1 e do HTLV-2, resultantes da análise de sequências de vários isolados de HTLV-1 e HTLV-2, mais especificamente se ligando à região pol de HTLV-1 e HTLV-2 Assim, de acordo com a presente invenção, a sonda pode incluir ou compreender pelo menos 8-15 nucleotídeos consecutivos de qualquer uma das sequências descritas nas SEQ ID Nos: 3 ou 7. A sonda também pode compreender ou consistir de qualquer uma das sequências de SEQ ID Nos: 3 ou 7, e suas sequências complementares. [00065] Vários formatos de sondas podem ser utilizadas para realizar uma PCR em tempo real, como as sondas marcadas com fluorescência. Mais especificamente, as sondas podem ser do tipo FRET (fluorescence resonance energy transfer) que incluem, mas não estão limitadas a sondas do tipo TaqMan™, Molecular Beacon™, Scorpion™, e LUX™. Em uma forma de concretização preferida, as sondas de acordo com a invenção são do tipo TaqMan™.
[00066] Mais especificamente, com relação à sonda TaqMan™, um oligonucleotídeo, cuja região 5' terminal é modificada com um fluoróforo e a região 3' terminal é modificada com um quencher, é adicionada à reação de PCR. Também se entende que é possível ligar o fluoróforo na região 3' terminal e o quencher na região 5' terminal. Os produtos de reação são detectados pela fluorescência gerada após a atividade exonuclease 5' -> 3' da DNA polimerase. Os fluoróforos, que se referem a compostos fluorescentes que emitem luz com a excitação por luz tendo um comprimento de onda mais curto que a luz que é emitida, podem ser, mas não estão limitados a, FAM, TAMRA, VIC, JOE, TET, HEX, ROX, RED610, RED670, NED, Cy3, Cy5, e Texas Red. Os quenchers podem ser, mas não estão limitados ao, 6- TAMRA, BHQ- 1,2,3 e MGB-NFQ. A escolha do par fluoróforo-quencher pode ser feita de forma que o espectro de excitação do quencher tenha uma sobreposição com o espectro de emissão do fluoróforo. Um exemplo é o par FAM-TAMRA, FAM-MGB, VIC-MGB e assim por diante. Um técnico no assunto saberá reconhecer outros pares apropriados.
[00067] Em uma forma de concretização preferencial de acordo com a invenção, as propriedades de espectro de ditas sondas são escolhidas de forma que uma sonda não interfira com a outra. Em particular, quando as sondas são usadas em reações multiplex, cada sonda terá o seu próprio fluoróforo sendo espectral e significativamente diferente de outra sonda, isto é, os espectros de absorção/emissão das diferentes sondas são essencialmente não-sobrepostos. Isto permite, de forma vantajosa, a detecção de cada sonda individualmente, já que os sinais individuais não interferem uns com os outros durante a detecção.
[00068] A fluorescência emitida durante a reação de amplificação do ácido nucleico alvo é medida com o objetivo de monitorar o acúmulo de produtos de amplificação específicos. O sinal de fluorescência é proporcional à quantidade do amplicon específico produzido. Na presença das sequências alvos de HTLV-1 e/ou HTLV-2, a fluorescência irá aumentar. Na ausência das sequências alvos, a fluorescência manter-se-á consistentemente baixa ao longo da reação. Um aumento na fluorescência ou um nível inalterado de fluorescência indicam a presença ou ausência dos alvos de HTLV-1 e/ou HTLV-2, respectivamente.
[00069] Além disto, para prover um padrão para determinar a extração do ácido nucleico de uma amostra biológica compreendendo a sequência alvo de HTLV ou para determinar a presença ou ausência de potenciais inibidores de reação, podem-se utilizar iniciadores capazes de amplificar, e sondas capazes de detectar, amplicons resultantes da amplificação de sequências humanas. Exemplo não-limitante é um iniciador compreendendo ou consistindo da sequência de SEQ ID Nos: 8 e 9 e uma sonda compreendendo ou consistindo da SEQ ID NO: 10, que têm como alvo o gene da beta-globina humana. Cabe aqui salientar que um técnico no assunto pode determinar outros iniciadores e sondas adequados direcionados a outras sequências úteis para este fim.
[00070] Ainda, para prover um meio de servir como controle positivo e/ou para facilitar a quantificação de uma carga virai em uma dada amostra biológica a ser analisada, um controle positivo pode ser incorporado. Na presente invenção, pode-se utilizar uma amostra de ácido nucleico contendo cópias do alvo de HTLV-1 e/ou de HTLV-2, por exemplo, um cassete ou vetor compreendendo a sequência alvo a ser amplificada, ou uma determinada quantidade de amostra de ácido nucleico proveniente de uma linhagem celular humana contendo um número conhecido de inserções de sequências virais. Exemplos não limitantes incluem, por exemplo, as linhagens celulares MT-2 e Gu.
[00071] Da mesma forma, pode-se incorporar um controle negativo de reação. Este controle pode ser uma amostra de ácido nucleico que não contém nenhuma cópia do alvo de HTLV-1 e nem de HTLV-2, por exemplo, DNA de linhagem celular humana que não apresente inserções de sequências virais de HTLV-1 e nem de HTLV-2.
[00072] Um outro aspecto da invenção é um kit usado para diagnosticar, diferenciar e quantificar infecções causadas por subtipos de HTLV, preferencialmente HTLV-1 e HTLV-2, de forma simultânea, compreendendo pelo menos um conjunto de oligonucleotídeos. Por "conjunto de oligonucleotídeos" entende-se qualquer combinação compreendendo pelo menos um oligonucleotídeo, preferencialmente pelo menos dois, por exemplo, de 2 a 20 oligonucleotídeos. Dito conjunto pode, por exemplo, compreender pelo menos um iniciador e pelo menos uma sonda, ou pelo menos um par de iniciadores e pelo menos uma sonda, e assim por diante. Ditos oligonucleotídeos podem ser mantidos separados, ou parcialmente misturados, ou totalmente misturados.
[00073] Preferencialmente, dito kit compreende pelo menos um conjunto de oligonucleotídeos de acordo com a invenção, desenhados especificamente para HTLV-1 e HTLV-2. Ditos oligonucleotídeos podem ser mantidos tanto separadamente, ou parcialmente misturados, ou totalmente misturados. Os oligonucleotídeos podem ser providos na forma seca, ou solubilizados em um solvente adequado, de acordo com o conhecimento da arte. Por exemplo, solventes adequados incluem TE, água ultrapura, e similares.
[00074] Em uma forma de concretização, o kit de acordo com a invenção pode também conter reagentes adicionais adequados para a reação de amplificação, incluindo água, água livre de nuclease, água livre de RNase, água livre de DNase, água ultrapura, sais (tais como sais de magnésio, potássio), tampões (como os tampões convencionais de PCR, conhecidos na arte), enzimas, incluindo polimerases termoestáveis, como Taq, Vent, Pwo, Pfu, transcriptase reversa, e similares, nucleotídeos como deoxinucleotídeos, dideoxinucleotídeos, dNTPs, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dUTP, outros reagentes, como aditivos, inibidores de RNase ou DNase, e polinucleotídeos tais como poliT, polidT, e outros oligonucleotídeos, como iniciadores e sondas para outros patógenos, por exemplo, HIV, HBV, HCV e para controles internos, como beta-globina humana. Os reagentes podem ser providos em uma forma concentrada para diluição para uma concentração apropriada pelo usuário final. Ainda, pelo menos parte dos reagentes pode ser provida na forma de pré-mix.
[00075] Ditos reagentes podem estar acomodados em recipientes, que para os fins da presente invenção incluem, mas não se limitam a, microtubos, tubos, placas de PCR com diferentes quantidades de poços, chips, ou qualquer outro meio adequado e inerte onde a reação de amplificação possa ocorrer, e que não reaja com os fluidos e soluções da presente invenção. Além disto, o recipiente pode ser ainda rotulado e identificado, por exemplo, com cores, para evitar a confusão e prover facilidade de uso para um técnico no laboratório.
[00076] Ainda, em uma forma de concretização, o kit de acordo com a invenção contém instruções para o uso do mesmo. Ditas instruções podem ser estar em um folheto, cartão, ou similares. Ditas instruções podem estar sob duas formas: uma detalhada, trazendo informações exaustivas com relação ao kit e ao uso do mesmo, possivelmente também incluindo dados de literatura; e outra simples, na forma de uma guia rápido, trazendo informações essenciais necessárias para o uso do kit.
[00077] Em uma forma preferida, dito kit é um kit de diagnóstico, especialmente um kit de diagnóstico in vitro, por exemplo, um kit de diagnóstico de HTLV. Mais preferencialmente, o dito kit é um kit para diagnóstico e diferenciação de HTLV-1 e HTLV-2.
[00078] Em uma outra forma de concretização da presente invenção, o kit diagnóstico pode ainda incluir um kit para extração e isolamento de ácidos nucleicos a partir de uma amostra biológica. Dito kit para extração pode compreender um tampão de lise, um tampão de lavagem e um tampão de eluição. O kit de extração pode ainda ser provido com recipientes vazios e colunas de adsorção para extração e isolamento de ácidos nucleicos.
Extração do ácido nucleico a partir de amostras biológicas
[00079] Polinucleotídeos de HTLV, mais preferencialmente, de HTLV-1 e HTLV-2, são os alvos ou a fonte do alvo para a reação de amplificação da presente invenção. A expressão "sequência alvo", ou simplesmente "alvo", se refere a uma sequência de ácido nucleico que serve como um molde para a amplificação em uma reação de PCR. Estas sequências de ácido nucleico podem conter deoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, e/ou seus análogos. A sequência pode ser um gene ou fragmento de gene, mRNA, cDNA, DNA total isolado, RNA total isolado, e similares. Exemplos de sequências alvos incluem, mas não estão limitados a, DNA do provírus integrado de HTLV, cDNA de HTLV presente em uma célula antes da integração virai no genoma do hospedeiro, RNA virai extraído de partículas virais ou a partir de células hospedeiras durante a replicação virai, transcritos de RNA primários de HTLV, mRNA processado por splicing, etc.
[00080] Mais especificamente, as sequências alvos da presente invenção estão localizadas no gene pol das sequências genômicas de HTLV-1 e HTLV- 2. A sequência alvo de HTLV-1 está localizada entre as bases 3340 e 3414 da sequência consenso do genoma de HTLV- 1 conforme apresentada na SEQ ID NO: 11. A sequência alvo de HTLV-2 está localizada entre as bases 4483 e 4563 da sequência consenso do genoma de HTLV-2 conforme apresentada na SEQ ID NO: 12. Estas sequências são, para fins desta invenção, sequências moldes de referência, isto é, os iniciadores adequados de acordo com a presente invenção são capazes de amplificar pelo menos estas sequências referências. Da mesma forma, as sondas adequadas de acordo com a presente invenção são capazes igualmente de hibridizar com pelo menos estas sequências referências.
[00081] Além disto, é possível utilizar uma sequência alvo humana como padrão ou controle da extração do ácido nucleico de uma amostra biológica. Exemplo não-limitante de alvo controle é o gene da beta-globina humana. O técnico no assunto certamente saberá determinar outros alvos controles adequados, que podem consistir de outros genes humanos.
[00082] Em uma concretização, a sequência alvo está presente em uma amostra de material biológico coletada a partir de um indivíduo. Por "amostra", portanto, entende-se qualquer substância ou material biológico que possa conter um HTLV, uma célula infectada pelo HTLV, ou uma sequência alvo de HTLV, e inclui, mas não está limitada a, sangue, plasma, soro, células sanguíneas, fluido seminal, secreções vaginais, leite materno, saliva, e similares. Mais preferencialmente, a amostra compreende ou consiste de células sanguíneas humanas e/ou sangue total.
[00083] Os procedimentos para a extração e purificação de ácidos nucleicos são bem conhecidos na técnica. Exemplos de métodos para extrair ácidos nucleicos a partir de sangue total são ensinados, por exemplo, em Casareale et ai. (Genome Res., 2: 149-153, 1992) e na Patente U.S. n° 5,334,499.
[00084] Além disto, vários kits comerciais estão disponíveis para o isolamento de ácidos nucleicos a partir de sangue total. Exemplos de kits incluem, mas não estão limitados a, QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen); Spin Plus ReliaPrep™ Blood gDNA Miniprep System (Promega) e BIOPUR Kit Extração Mini Spin Plus (Biopur). Amplificação de sequências alvos por PCR e métodos de diagnóstico
[00085] Uma vez que os iniciadores estão preparados, a amplificação de ácido nucleico alvo pode ser realizada por uma variedade de métodos, incluindo, mas não se limitando a, PCR convencional, PCR em tempo real, RT-PCR, nested-PCR, PCR semi-quantitivo e outros. De forma preferencial, o método utilizado é PCR em tempo real.
[00086] "Amplificação" refere-se aos procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos utilizando iniciadores e polimerases que geram múltiplas cópias de um ácido nucleico alvo. Tais reações de amplificação são conhecidas pelo técnico no assunto como "PCR" (reação de polimerase em cadeia), que por sua vez, inclui, para fins desta invenção, qualquer método baseado em PCR, incluindo PCR convencional, qualitativo, semi-quantitativo, em tempo real, reação de transcrição reversa (RT-PCR), PCR singleplex, multiplex, e similares.
[00087] Um "amplicon" ou "produto de PCR", os termos sendo usados de forma intercambiável, referem-se ao um ácido nucleico (ou coletivamente, a pluralidade de moléculas de ácido nucleico) que foi sintetizado durante os procedimentos de amplificação. Um amplicon é tipicamente, mas não exclusivamente, um fragmento de DNA.
[00088] Por "PCR em tempo real" compreende-se qualquer método baseado em PCR que permita monitorar a fluorescência emitida durante a reação, como um indicador da produção do produto de PCR ou amplicon durante cada ciclo de PCR, ao contrário da detecção ao final da realização de todos os ciclos nos métodos de PCR convencionais.
[00089] Por "PCR quantitativo" (qPCR), entende-se qualquer método baseado em PCR que permita a estimativa da quantidade inicial de uma determinada sequência alvo em uma dada amostra.
[00090] Como usado aqui, "PCR multiplex" refere-se a qualquer reação de PCR que tenha por objetivo a amplificação de mais de um alvo. Por exemplo, a PCR multiplex inclui PCR biplex (dois alvos), PCR tríplex (três alvos), e assim por diante. PCR multiplex inclui reações de PCR com mais do que um par de iniciadores, por exemplo, dois pares de iniciadores. Neste caso, poderá haver quatro iniciadores diferentes, mas também é possível que haja um iniciador em comum, por exemplo, o iniciador fo rward, e dois iniciadores reversos distintos. PCR multiplex também inclui reações de PCR com um único par de iniciadores, mas com mais de uma sonda. Ainda, como exemplos não limitantes, a amplificação multiplex inclui reações de amplificação de diferentes genes, diferentes alelos de um único gene e/ou diferentes fragmentos de um único gene.
[00091] Um "tampão" é uma composição adicionada à reação de amplificação, compreendendo um agente tamponante, que modifica a estabilidade, atividade e/ou longevidade de um ou mais componentes da reação de amplificação, através da regulagem do pH da reação de amplificação. Os agentes tamponantes da invenção são compatíveis com a atividade da polimerase a ser utilizada, qual seja, uma DNA polimerase. Agentes tamponantes são bem conhecimentos na arte e incluem, mas não estão limitados a Tris, Tricina, MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propano- sulfônico), e HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-l-piperazina-etanosulfônico).
[00092] Além disto, os tampões de PCR podem geralmente conter até cerca de 70 mM KC1 e cerca de 1 ,5 mM ou mais de MgCi2, a cerca de 50-500 μΜ de cada um dos nucleotídeos dATP, dCTP, dGTP e dTTP.
[00093] Os tampões da invenção podem ainda conter aditivos. Um aditivo é um composto adicionado a uma composição que modifica a estabilidade, a atividade e/ou a longevidade de um ou mais componentes da composição. Em algumas concretizações, a composição é uma composição de amplificação. Em algumas concretizações, um aditivo inativa enzimas contaminantes, estabiliza o dobramento de proteínas e/ou diminui a agregação. De acordo com a invenção, aditivos podem ser adicionados para melhorar a seletividade do andamento de um iniciador e/ou de uma sonda, desde que o aditivo não interfira com a atividade da DNA polimerase.
[00094] Exemplos de aditivos são, mas não estão limitados a, betaína, glicerol, formamida, KC1, CaCl2, MgOAc, MgCl2, NaCl, NH4OAc, Nal, Na(C03)2, LiCl, MnOAc, NMP, trealose, DMSO, etileno glicol, ditiotreitol ("DTT"), pirofosfatase (incluindo, mas não limitado a pirofosfatase inorgânica de Thermoplasma acidophilum ("TAP")), albumina de soro bovino ("BSA"), propileno glicol, glicinamida, CHES, Percoll™, ácido aurintricarboxílico, Tween 20, Tween 21, Tween 40, Tween 60, Tween 85, Brij 30, NP-40, Triton X-100, CHAPS, CHAPSO, Mackernium, LDAO (N- dodecil-N,N-dimetilamino-N-óxido), Zwittergente 3-10, Xwittergente 3-14, Xwittergente SB 3-16, Empigen, NDSB-20, T4G32, SSB de E. coli, RecA, 7- deazaG, dUTP, UNG, detergentes aniônicos, detergentes catiônicos, detergentes não-iônicos, zwittergente, esteróis, cátions, e quaisquer outros químicos, proteínas, ou cofatores que podem alterar a eficiência da amplificação.
[00095] Como aqui usado, o termo "termoestável", quando aplicado à enzima, refere- se a uma enzima que retém sua atividade biológica em temperaturas elevadas (por exemplo, a 55°C ou mais), ou retém sua atividade biológica após ciclos repetidos de aquecimento e resfriamento. Polimerases de nucleotídeos termoestáveis são particularmente preferidos para a presente invenção, uma vez que eliminam a necessidade de adicionar enzima antes de cada ciclo de PCR.
[00096] A "atividade de polimerase" refere-se a uma atividade enzimática que catalisa a polimerização de deoxirribonucleotídeos. Geralmente, a enzima irá iniciar a síntese na extremidade 3' do iniciador anelado à sequência alvo, e irá prosseguir em direção à extremidade 5' da fita molde. Em determinadas concretizações, essa enzima é uma DNA polimerase termoestável.
[00097] Exemplos não limitantes de DNA polimerases termoestáveis incluem, mas não se limitam a, polimerases isoladas de Thermus aquaticus (Taq polimerase), Thermus thermophilus (Tth polimerase), Thermococcus litoralis (Tli ou VENT™ polimerase), Pyrococcus furiosus (Pfu ou DEEPVENT™ polimerase), Pyrococcus woosii (Pwo polimerase) e outras espécies de Pyrococcus, Bacillus stearothermophilus (Bst polimerase), Sulfolobus acidocaldarius (Sac polimerase), Thermoplasma acidophilum (Tac polimerase), Thermus rubber (Tru polimerase), Thermus brockianus (DYNAZYME™ polimerase) (Tne polimerase), Thermotoga maritime (Tma) e outras espécies de Thermotoga genus (Tsp polimerase), e Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth polimerase).
[00098] A reação de PCR pode conter mais do que uma enzima polimerase termoestável com propriedades complementares, resultando em amplificação mais eficiente das sequências alvos. Por exemplo, uma polimerase com alta habilidade de amplificar segmentos grandes de nucleotídeos pode ser complementada com outra polimerase com capacidade de corrigir erros ocorridos durante a elongação da sequência de ácido nucleico alvo, assim criando uma reação de PCR que pode amplificar uma sequência alvo longa com alta fidelidade. A polimerase termoestável pode ser usada em sua forma selvagem, ou, alternativamente, a polimerase pode ser modificada para conter um fragmento de uma enzima ou para conter uma mutação que forneça propriedades benéficas para facilitar a reação de PCR. Em uma concretização, a polimerase pode ser a Taq polimerase. Muitos variantes da Taq polimerase com propriedades melhoradas são conhecidas e incluem, mas não são limitadas a AmpliTaq™, fragmento Stoffel, SuperTaq™, SuperTaq™ plus, LA Taq™, LApro Taq™, e EX Taq™.
[00099] Como já mencionado mais acima, a expressão "condições de hibridização" refere-se às condições que permitem que o iniciador ou sonda se anelem à sequência nucleotídica de interesse. Estas condições são dependentes da temperatura e da força iônica da solução na qual a hibridização ocorre. Estas são as condições de estringência. Como é compreendido por um técnico no assunto, a estringência de andamento pode ser alterada de forma a identificar ou detectar sequências de polinucleotídeo idênticas ou relacionadas. Como será apreciado por um técnico no assunto, a temperatura de melting, Tm, pode ser calculada por fórmulas conhecidas na arte, dependendo de diversos parâmetros, como o comprimento do iniciador ou sonda em número de nucleotídeos, ou ingredientes presentes no tampão e condições. Para tanto, ver, por exemplo, T. Maniatis et ah, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982 e J. Sambrook et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
[000100] De forma ilustrativa, para a determinação de condições de hibridização, basicamente as seguintes fórmulas são usadas: para o cálculo básico de Tm para sequências mais longas que 13 nt, a seguinte fórmula pode ser usada:
Tm=64.9+41 *(yG+zC-16.4)/(wA+xT+yG+zC)
[000101] em que "w", "x", "y" e "z" são os números de bases A, T, G e C na sequência, respectivamente (Marmur e Doty. J Mol Biol 5: 109-118, 1962). Esta equação assume que o andamento ocorre sob condições padrões de 50 nM iniciador, 50 mM Na+, e pH 7,0.
[000102] Para o cálculo básico de Tm ajustado por sal, a seguinte equação pode ser usada:
Tm=100.5+(41 *(yG+zC)/(wA+xT+yG+zC))- (820/(wA+xT+yG+zC))+16.6*loglO([Na+])
[000103] em que "w", "x", "y" e "z" são os números de bases A, T, G e C na sequência, respectivamente.
[000104] O termo 16.6*loglO([Na+]) ajusta a Tm para mudanças na concentração de sal (vide para informações adicionais, por exemplo, Howley et al., J. Biol. Chem. 254, 4876-4883, 1979).
[000105] As faixas de temperatura de andamento podem variar de cerca de 50°C e 62°C, mas os iniciadores podem ser desenhados para serem ótimos em cerca de 58°C a 60°C. Uma consideração adicional ao desenhar os iniciadores é o conteúdo de guanina e de citosina. Geralmente, o conteúdo de GC para um iniciador pode ser de cerca de 30-70%, mas pode ser menor e pode ser ajustado de forma apropriada por um técnico no assunto. O andamento de oligonucleotídeos complementares ou parcialmente complementares a um determinado alvo pode ser obtido pela modificação das condições de andamento visando o aumento ou diminuição da estringência, por exemplo, ajustando a temperatura ou a concentração de sal no tampão. Tais modificações para manter a especificidade ao HTLV-1 e HTLV-2 podem ser realizadas de forma rotineira por um técnico no assunto.
[000106] Para a amplificação, um par de iniciadores de um tipo específico pode ser usado sozinho (por exemplo, um iniciador forward e um iniciador reverso de HTLV-1 ; um iniciador forward e um iniciador reverso de HTLV- 2; ou um iniciador forward e um ou dois iniciadores reversos de HTLV-2, e assim por diante). A amplificação multiplex pode ser usada para amplificar regiões de HTLV-1 e HTLV-2 de forma concomitante. As concentrações finais dos iniciadores podem ser ajustadas de forma apropriada, variando de cerca de 50 nM a cerca de 2000 nM, preferencialmente de cerca de 100 nM a cerca de 1000 nM, mais preferencialmente de cerca de 200 nM a cerca de 600 nM, mais preferencialmente de cerca de 250 nM a cerca de 500 nM, de cada um dos iniciadores representados por SEQ ID Nos: 1-2, 4-6 e 8-9.
[000107] As concentrações finais das sondas também podem ser ajustadas de forma apropriada por um técnico no assunto, variando de cerca de 50 nM a 1000 nM. Mais preferencialmente, a concentração final varia de cerca de 100 cerca de 300 nM, mais preferencialmente, de 150 a 250 nM de cada uma das sondas representadas por SEQ ID Nos: 3, 7 e 10.
[000108] Em um outro aspecto da invenção, é provido um método para detectar a presença de HTLV a partir de ácidos nucleicos extraídos de uma amostra biológica, compreendendo a etapa de misturar em um recipiente adequado os dNTPs, a DNA polimerase, tampão, pelo menos um iniciador e pelo menos uma sonda conforme descritos no presente pedido, o ácido nucleico extraído da amostra biológica, e submeter o recipiente contendo a mistura a incubação em um termociclador.
[000109] Em um outro aspecto, a invenção provê um método para detectar a presença de HTLV, compreendendo realizar uma reação de polimerase em cadeia usando pelo menos um ou um conjunto de iniciadores selecionados do grupo de iniciadores forward de SEQ ID Nos: 1 e 4, e pelo menos um ou um conjunto de iniciadores selecionados do grupo de iniciadores reversos de SEQ ID Nos: 2, 5 e 6.
[000110] O técnico no assunto tem conhecimento das condições de reação de PCR, em particular, as condições de ciclagem termal, por exemplo, temperaturas, duração, número de ciclos, taxa de aquecimento/resfriamento, etc. Em uma concretização preferida, as condições de reação de PCR incluem condições adequadas para uma PCR multiplex. Em uma outra concretização preferida, ditas condições incluem aquelas adequadas para uma PCR multiplex quantitativa em tempo real. Em outra concretização, dito método compreende a etapa de colocar a amostra na presença de sonda(s) em condições adequadas ao anelamento de dita(s) sonda(s) ao amplicon. Em outra concretização preferida, o método compreende a etapa de detectar pelo menos um amplicon em tempo real, permitindo a avaliação da presença ou ausência de HTLV-1 e/ou HTLV-2 na amostra. Isto é atingido de forma vantajosa pelas medições de intensidade de fluorescência.
[000111] Os procedimentos de medição de fluorescência são conhecidos na arte. Resumidamente, a amostra é iluminada em cerca da onda de excitação do fluoróforo, e a intensidade de emissão é medida. Em outra concretização, dito método compreende a etapa de medir pelo menos uma vez, e mais preferivelmente em tempo real, a quantidade de sonda que se anela ao amplicon. Em outra concretização preferida, dito método compreende a etapa de estimar pelo menos uma vez o número de cópias do alvo inicialmente presente na amostra. O técnico no assunto sabe como realizar dita etapa. Por exemplo, isto pode ser realizada usando padrões de calibração e/ou controles internos. Preferivelmente, esta etapa inclui a determinação do chamado cycle threshold (CT) para cada amostra, que correlaciona com o número de cópias do alvo molde inicialmente presente em cada amostra.
[000112] Em uma concretização preferida, pelo menos uma etapa, preferencialmente várias etapas, mais preferencialmente a maioria das etapas, é realizada em uma placa de PCR, incluindo aquelas com 24 poços, 48 poços, 96 poços e 384 poços. O uso de placas garante, de forma vantajosa, que as amostras possam ser processadas em paralelo durante a reação. Além disto, permite que o método seja realizado em larga escala, o que economiza tempo.
[000113] Em outra forma preferida, pelo menos uma etapa, preferivelmente várias etapas, mais preferivelmente a maioria das etapas é realizada em um termociclador. Dito termociclador pode ser equipado com um espectrofluorofotômetro, por exemplo, Mx3000p (Stratagene), Chromo 4 (BioRad), RocheLightcycler 480, ABI 7900, 7500 e 7300r Real-time PCR Systems (Applied Biosystems).
[000114] Os iniciadores da presente invenção para a detecção e diferenciação de HTLV-1 e HTLV-2 estão identificados na Tabela 1 como SEQ ID Nos: 1-2 e 4-6, respectivamente. Estes iniciadores foram desenhados de forma a anelarem em uma região localizada no gene pol de HTLV-1 e HTLV-2 (vide figura 2).
[000115] A presente invenção é ilustrada pelos exemplos abaixo, que têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo, sem limitar o escopo da mesma. As várias modificações ou sugestões à luz dos mesmos que podem ser sugeridas por um técnico no assunto estão incluídas no espírito e no escopo das reivindicações. Em particular, apesar de serem adequados para a detecção via protocolos multiplex e/ou em tempo real, os métodos, oligonucleotídeos, conjuntos de oligonucleotídeos e kits da presente invenção são, obviamente, também adequados para protocolos singleplex, duplex, tríplex e similares, qualitativo, quantitativo, PCR convencional e combinações dos mesmos.
EXEMPLOS
Exemplo 1 : Análise in silico para definição da região alvo - Desenho dos iniciadores e sondas
[000116] Para definição da região gênica virai foram realizados alinhamentos múltiplos com as sequências do genoma total do HTLV-1 e HTLV-2 disponíveis em um banco de dados público com auxílio do software BioEdit (versão 7.0.5.3), e Mega (versão 5-1993/2011), os quais utilizam o algoritmo Clustal W. Os números de acesso das sequências utilizadas estão descritos na Figura 1.
[000117] Todos os genomas completos depositados no GenBank até a data do depósito foram utilizados para o alinhamento.
[000118] Os iniciadores e sondas foram confeccionados com base nas recomendações descritas a seguir. Para os iniciadores, a temperatura de melting (Tm) foi entre 58 e 60°C, além de ser aproximadamente 10°C abaixo da Tm das sondas, a fim de garantir que a sonda se ligue ao molde antes dos iniciadores. As últimas bases da extremidade 3' foram compostas com o menor número possível de bases citosina (C) e/ou guanina(G), o que reduz a formação de produtos não específicos. O conteúdo de G/C ficou ente 61 e 71%, dentro da faixa recomendada (30 a 80%). As sondas foram desenhadas o mais próximo possível da região de ligação dos iniciadores forward ou reverso para melhorar a eficiência das reações. A Tm foi definida entre 68°C e 70° C e o conteúdo de G/C ficou entre 47 e 69%. Com a finalidade de evitar o efeito quencher, sondas que continham G na extremidade 5' foram descartadas. O sistema minor groove binder (MGB) foi utilizado para desenho das sondas. Este sistema permite o aumento da Tm da sonda sem aumentar o tamanho da mesma, o que permitiu a obtenção de sondas mais curtas (13 a 20 bases).
[000119] Um total de quatro conjuntos de iniciadores desenhados para a metodologia de SYBR™ Green dirigidos para as regiões tax e env, e seis conjuntos de iniciadores e sondas confeccionados para metodologia TaqMan™ com alvo nas regiões tax, gag, pol, e env foram avaliados. Esses ensaios foram padronizados, no entanto, apresentaram resultados insatisfatórios no processo de validação (dados não mostrados).
[000120] Os iniciadores e sondas TaqMan™ dirigidos para a região virai ol mostraram-se adequados. As sequências nucleotídicas dos iniciadores e sondas aqui usados são mostrados na Tabela 1.
Tabela 1. Iniciadores e sondas para a detecção do HTLV-1 e HTLV-2.
Figure imgf000036_0001
[000121] Na Tabela 1, a sonda de SEQ ID NO: 3 foi marcada com FAM na extremidade 5'e MGB na extremidade 3', e a sonda de SEQ ID NO: 7 foi marcada com VIC na extremidade 5' e MGB na extremidade 3'. O amplicon gerado para HTLV-1 tem 75 pares de bases e para HTLV-2, 81 pares de bases.
Exemplo 2: Cultivo e expansão das linhagens celulares MT-2 e Gu (controles positivos)
[000122] A linhagem celular MT-2 consiste em linfoblastos isolados a partir de um indivíduo portador de ATLL (número de catálogo 93121518/ECACC). Esta linhagem contém o HTLV-1 integrado ao seu genoma, apresentando 2,1 cópias virais por células (Albrecht et ah, J Virol Methods, v. 75, n. 2, p. 123-40, 1998). A linhagem Gu, originada a partir da infecção in vitro da linhagem celular BJAB, contém 8,3 cópias do HTLV-2 integrado ao seu genoma (Moens et al., J Clin Microbiol, v. 47, n. 11, p. 3682-91, 2009). Esta linhagem foi cedida gentilmente pelo Rega Institute for Medicai Research - Katholieke Universiteit, Leuven, Bélgica. As linhagens celulares MT-2 e Gu foram cultivadas em garrafas de 15 cm2 (Greiner Bio One) com 15 mL de meio de cultura Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Sigma- Aldrich) suplementado com soro fetal bovino inativado a 10 % (Hyclone); 100 U/mL de penicilina e 100 U/mL de estreptomicina (Invitrogen). As culturas foram mantidas em incubadoras Steri-cult 200 Thermoform (Forma Scientific) à temperatura de 37°C, 5% C02 e 85% de umidade relativa do ar. Após a expansão, as células foram coletadas em tubos de polipropileno de 15 mL, lavadas com tampão PBS (IX) por centrifugação a 200 x g durante 10 minutos, ressuspensas em PBS (IX) e contadas em câmara de Neubauer.
Exemplo 3: Extração de DNA a partir das linhagens celulares e produção de controles positivos
[000123] Para a extração de DNA, foram utilizadas aproximadamente 2 x IO7 células ressuspensas em 1 mL de PBS (IX). As células foram transferidas para um tubo de polipropileno de 1,5 mL e submetidas à centrifugação durante 5 minutos a 300 x g. Após centrifugação, retirou-se o sobrenadante, permanecendo 200 no tubo, que em seguida foi transferido para um tubo de polipropileno de 15 mL.
[000124] A extração do DNA foi realizada utilizando-se o kit Gentra Puregene cell (Gentra Systems), seguindo as instruções do fabricante. Adicionou-se 3 mL de solução de lise de células e, homogeneizou-se em vortex por 10 segundos. Foram adicionados 15 de RNase, homogeneizando-se por inversão cerca de 25 vezes. Essa mistura foi incubada a 37°C durante 5 minutos e rapidamente resfriada em gelo durante 3 minutos. Em seguida, 1 mL de solução precipitante de proteínas foi adicionado seguida de agitação vigorosa em vortex durante 20 segundos e posterior centrifugação a 2000 x g durante 10 minutos. Após centrifugação, o sobrenadante foi transferido para um novo tubo de polipropileno de 15 mL, ao qual foram adicionados 3 mL de isopropanol e homogeneizado por inversão cerca de 50 vezes para a precipitação do DNA. As amostras foram centrifugadas durante 3 minutos a 2000 x g e os sobrenadantes foram descartados. Para a lavagem do pellet de DNA, foi acrescentado 3 mL de etanol a 70% e o sistema foi homogeneizado várias vezes para uma eficiente lavagem. O DNA foi coletado e transferido para tubo de 1,5 mL estéril. Após a evaporação do etanol, o DNA foi ressuspenso em 300 de água deionizada e incubado a 65 °C por 1 hora para completa eluição do DNA. Após a extração, o DNA foi quantificado por meio de espectrofotometria (UV) em comprimento de onda de 260 nm e 280 nm no equipamento Nanodrop 2000c spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific).
[000125] Os controles positivos foram preparados a partir do DNA extraído das linhagens celular MT-2 e Gu, de acordo com o descrito acima.
[000126] Para tanto, quatro alíquotas contendo 200 μΐ, de DNA da linhagem celular MT-2 foram transferidas para um tubo de polipropileno, livre de DNAse, RN Ase e pirógenos, para obtenção de uma alíquota única. A concentração de DNA foi ajustada para aproximadamente 500 ng^L. Devido à heterogeneidade e viscosidade elevada da amostra, a mesma foi transferida para uma coluna composta por uma membrana de sílica e submetida à centrifugação a 16.900 x g durante 3 minutos. Após a centrifugação, a amostra foi quantificada por meio de espectrofotometria (UV) em comprimento de onda de 260 nm e 280 nm no equipamento Nanodrop 2000c spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific). Os mesmos procedimentos foram adotados para a linhagem celular Gu. As alíquotas, únicas, obtidas a partir das linhagens MT-2 e Gu foram misturadas para a composição de um pool de controles positivos (ΜΤ-2+Gu). A partir deste pool foram preparadas 192 alíquotas de 15 μΐ. e 192 alíquotas de 50 μΐ. do controle positivo contendo 103 cópias virais a cada 5μΙ., e 60 alíquotas de 50 μΐ. do controle positivo contendo 105 cópias virais a cada 5 μΐ^. As alíquotas foram armazenadas a -20°C até o momento do uso.
Exemplo 4: Produção de controles negativos
[000127] Para o controle negativo das reações de qPCR, cinco amostras de sangue total obtidas a partir de candidatos à doação de sangue foram misturadas (pool) e homogeneizadas durante 5 minutos em homogeneizador circular de sangue durante 5 minutos. Essas amostras não apresentaram reatividade sorológica ao teste imunoenzimático (EIA) para HTLV-1/2.
[000128] Após homogeneização, foram feitas alíquotas do pool negativo em tubos de polipropileno de 1,5 mL de maneira que cada tubo permanecesse com 200 μL de pool, totalizando 20 tubos. A cada alíquota dispensada, o pool foi homogeneizado durante 30 segundos a fim de manter a homogeneidade do controle. As alíquotas foram armazenadas a -20°C. A cada extração de DNA das amostras, o controle negativo foi incluído no processo. Exemplo 5: Controle interno de amplificação (Cl)
[000129] O controle interno (Cl) é uma sequência de DNA que está presente na mesma reação de qPCR, na qual as amostras teste são amplificadas. Esta sequência é co-amplificada simultaneamente com a sequência alvo e tem como objetivo monitorar todo o processo, desde a extração de ácidos nucleicos até a análise final dos dados, validando as reações negativas e demonstrando a presença de inibidores ou falhas nos processos pré-analíticos e analíticos das amostras. O gene da beta-globina foi utilizado como Cl nas reações de qPCR.
[000130] Baseado na sequência do gene da beta-globina humana com o número de acesso GU324922 e com o auxílio do software Primer Express™3.0 (Applied Biosystems), foram desenhados um par de iniciadores e uma sonda no sistema TaqMan™MGB. As mesmas recomendações descritas no exemplo 1 foram utilizadas para a confecção destes oligonucleotídeos. As sequências dos iniciadores e da sonda do controle interno estão apresentadas na Tabela 2.
Tabela 2. Iniciadores e sondas para a detecção do controle interno beta- globina humana.
Figure imgf000040_0001
[000131] Na Tabela 2, a sonda de SEQ ID NO: 10 foi marcada com NED na extremidade 5'e MGB na extremidade 3'. O amplicon gerado para o controle interno beta-globina tem 54 pares de base.
Exemplo 6: Padronização das reações de qPCR no formato singleplex - Preparo da curva padrão a partir dos controles positivos [000132] Considerando que o genoma humano haplóide pesa 3,3 pg e que a linhagem celular MT-2 possui aproximadamente uma cópia do HTLV-1 integrada ao seu genoma, procederam-se aos cálculos para obtenção de uma solução estoque contendo 105 cópias virais a cada 5μΙ. de solução. Da mesma maneira, foram realizados os cálculos para a linhagem celular Gu, no entanto, esta linhagem possui aproximadamente quatro cópias do HTLV-2 integradas ao seu genoma. Estes cálculos foram baseados na constante de Avogadro e na concentração de DNA das amostras avaliadas por espectrofotometria. As soluções estoques foram armazenadas a -20°C até o momento do uso.
[000133] Com o objetivo de avaliar a cinética de reação e a qualidade dos iniciadores e sondas, as eficiências e correlações lineares (R2) das reações de amplificação foram avaliadas no formato singleplex (uma sonda e um alvo por reação). Para tanto, foram construídas curvas padrão por meio de diluições decimais seriadas (105 a 10° cópias virais/reação) dos controles positivos MT-2 (HTLV-1) e Gu (HTLV-2). As eficiências para o conjunto de sondas e iniciadores para o HTLV-1, HTLV-2 e controle interno (Cl) foram superiores a 95% e as correlações (R2) mostraram-se superiores a 0,99 (Figura 3).
Exemplo 7: Padronização das reações de qPCR nos formatos singleplex e multiplex (biplex e tríplex)
[000134] Para avaliar a eficiência e correlação linear (R2) das reações de qPCR no formato singleplex (presença de um alvo e uma sonda por reação) e multiplex (presença de mais de um alvo e mais de uma sonda por reação), foram realizadas diluições decimais seriadas (105 a 10° cópias virais/reação) dos controles positivos MT-2 (HTLV-1) e Gu (HTLV-2). Estas diluições foram utilizadas nas reações de PCR em tempo real no formato de curva padrão. As reações apresentavam como alvo somente HTLV-1 ou HTLV-2 ou controle interno (Cl) (singleplex), HTLV-1 e IC ou HTLV-2 e ICI (biplex) ou HTLV-1, HTLV-2 e Cl co-amplificados simultaneamente (triplex). As reações de PCR em tempo real foram padronizadas utilizando o kit TaqMan™ Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) e a amplificação e aquisição dos dados foram realizadas no ABI 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems). Assim, cada reação de amplificação consistiu em 5μΙ. de DNA dos controles positivos e 12,5 TaqMan™ Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). A concentração utilizada das sondas foi 100 nM e a dos iniciadores 250 nM. O volume de água foi ajustado a cada reação para um volume final de 25 μL/reação. As condições térmicas de ciclagem consistiram em um primeiro passo de ativação a 50°C por 2 minutos seguidos de 45 ciclos a 95 °C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto.
[000135] As reações foram realizadas nos seguintes formatos: i) biplex contendo alvos e sondas para HTLV-1 ou HTLV-2 e Cl; ii) triplex contendo alvos e sondas para HTLV-1, HTLV-2 e CL As reações no formato biplex (HTLV-1 e Cl) mostraram-se adequadas (Figura 4). As curvas para HTLV-2 das reações biplex (HTLV-1 e HTLV-2; HTLV-2 e Cl) sofreram uma mudança em seu formato, tornando-se mais linear que sigmoide (Figura 4). No formato triplex (HTLV-1, HTLV-2 e Cl), as curvas para HTLV-1 e Cl mostraram-se adequadas, no entanto, as curvas para HTLV-2 sofreram acentuada mudança em sua forma e redução sensível da fluorescência como observado na figura 4.
[000136] O cycle threshold (Ct) das reações nos formatos singleplex e multiplex {triplex) foram similares (Tabela 3).
Tabela 3. Comparação das reações de qPCR nos formatos singleplex e triplex {multiplex). Valores de cycle threshold e desvio padrão das diluições dos controles positivos MT-2 (HTLV-1) e Gu (HTLV-2). As diluições variaram de 105 a 10° cópias/reação.
Alvo Valor de Ct IO5 IO4 IO3 IO2 IO1 10°
HTLV-1
20.362 23.894 27.318 31.067 34,041 36.705
Singleplex
20.422 23.992 27.402 31.256 35.233 37.015
Triplex
0.042 0.069 0.059 0.133 0.842 0.2194
DP
HTLV-2
23,765 27.042 30.761 34,041 37.67032 ND
Singleplex
23.629 27.243 30.766 35.07 36.53651 ND
Tríplex
0.096 0.142 0.003288 0.728 0.801726 ND
DP
HTLV: vírus linfotrópico de células T humanas; DP: desvio padrão; Ct: cycle threshold; ND: não detectado.
Exemplo 8: Padronização das concentrações de sondas e iniciadores utilizadas nas reações de qPCR
[000137] As reações de PCR em tempo real no formato singleplex foram padronizadas utilizando o kit TaqMan™ Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) e as condições térmicas de ciclagem, amplificação e aquisição dos dados foram realizadas de acordo com o exemplo 7. Cada reação de amplificação consistiu em 5μί, de DNA obtido a partir dos controles positivos MT-2 e Gu, 12,5μί, TaqMan™ Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). A concentração das sondas para HTLV-1 (marcada com o fluorocromo FAM™) e HTLV-2 (marcada com o fluorocromo VIC™) variou de 100 a 300 nM, já para o controle interno (Cl) (marcada com o fluorocromo NED™), variou de 50 a 200 nM. As concentrações dos iniciadores variaram de 250 a 500 nM para HTLV-1 e HTLV-2 e 125 a 250 nM para o CL O volume de água foi ajustado a cada reação para um volume final de 25 μL/reação. Posteriormente, as concentrações de reagentes que apresentaram melhor desempenho foram avaliadas no formato multiplex.
[000138] Ainda, diferentes concentrações de sondas foram testadas visando aprimorar as curvas e fluorescência no formato multiplex, com foco na curva para HTLV-2. As diluições dos controles positivos MT-2 (HTLV-1) e Gu (HTLV-2) contendo 105, 103, e 101 cópias virais/reação foram utilizadas nas reações de qPCR. As reações foram realizadas nos formatos singleplex e multiplex (biplex e triplex). A figura 5 demonstra as concentrações de sondas avaliadas, que foram 100, 200 e 300 nM.
Exemplo 9: Desenho de um iniciador reverso extra (reverso') para HTLV-2
[000139] Ainda, foi testada a possibilidade de utilização de mais de um iniciador reverso em adição ao iniciador de SEQ ID NO: 5, com vistas à verificação de aumento de sensibilidade da reação para HTLV-2. Dito iniciador está apresentado sob SEQ ID NO: 6.
[000140] Assim, dois amplicons de tamanhos diferentes são gerados (Figura 6) aumentando os alvos para ligação da sonda, o que gera um aumento na fluorescência e redução de Ct, como pode ser observado na Figura 7.
Exemplo 10: Teste de concentração de iniciadores e sondas para as reações de qPCR no formato singleplex
[000141] Utilizando o formato singleplex, diferentes condições das reações de qPCR foram testadas. Como controle positivo as diluições das linhagens celulares MT-2 (HTLV-1) e Gu (HTLV-2) contendo 105, 103, e 101 cópias virais/reação foram utilizadas. A concentração dos iniciadores testados para as reações HTLV-1 e HTLV-2 foram 250 e 500 nM e sondas 100 e 200 nM e, para Cl, 125 e 250 nM de iniciadores e 50 e 100 nM de sonda. As melhores condições observadas para HTLV-1 foram 500 nM de iniciadores e 200 nM de sondas, para HTLV-2 500 nM de iniciador forward, 250 nM dos iniciadores reversos e 200 nM de sonda e para o Cl, 250 nM de iniciadores e 100 nM de sonda (Figura 8).
Exemplo 11 : Teste de concentração de iniciadores e sondas para as reações de qPCR no formato multiplex
[000142] Utilizando o formato multiplex, diferentes condições das reações de qPCR foram testadas. Para tanto, os iniciadores para HTLV-1 foram utilizados nas concentrações de 250 e 500 nM e a sonda 100, 125, 150, 175, e 200 nM, para HTLV-2, iniciadores nas concentrações de 250 e 500 nM e sonda 200, 225 e 250 nM e para o Cl, iniciadores na concentração de 250 e sonda 100, 125, 150 e 200 nM. A melhor condição observada foi ao utilizar para HTLV-1, 500 nM de iniciadores e 200 nM de sonda; para HTLV-2, 500 nM de iniciador forward, 250 nM dos iniciadores reversos e 225 nM de sonda, e para o Cl, 250 nM de iniciadores e 200 nM de sonda como pode ser observado na figura 9.
[000143] Assim, a partir das concentrações ideais de sondas e iniciadores definidas, foram avaliadas as eficiências e correlações lineares das reações de qPCR por meio de curvas padrão a partir dos controles positivos para HTLV- 1 e HTLV-2. As eficiências para o conjunto de sondas e iniciadores para o HTLV-1, HTLV-2 e controle interno (Cl) foram superiores a 95% e as correlações (R2) mostraram-se superiores a 0,99 (Figura 10).
Exemplo 12: Produção de lote de mix (iniciadores + sondas) para as reações de qPCR
[000144] Uma mistura composta por todas as sondas e iniciadores {mix) utilizados nas reações de qPCR foi produzida. Para tanto, os iniciadores forward e reverso para HTLV-1 foram diluídos para a concentração de 25 μΜ. O iniciador fo rward para HTLV-2 foi diluído para a concentração de 25μΜ, enquanto os iniciadores reverso e reverso' foram diluídos para 12,5 μΜ. Os iniciadores forward e reverso para o controle interno (Cl) foram diluídos para a concentração de 12,5 μΜ. As sondas para HTLV-1 e IC foram diluídas para 10 μΜ e a sonda para HTLV-2 foi diluída para 11,25 μΜ. Todos os oligonucleotídeos foram misturados em um tubo de polipropileno de 12 mL livre de DNAse, RNAse e pirógenos a fim de constituir um mix único. Foi utilizada uma quantidade de água ultrapura para que as concentrações finais dos oligonucleotídeos fossem 500 nM dos iniciadores forward e reverso para HTLV-1, 500 nM do iniciador forward para HTLV-2, 250 nM dos iniciadores reverso e reverso' para HTLV-2 e 250 nM dos iniciadores forward e reverso para o Cl, 200 nM da sonda para HTLV-1 e IC e 225 nM da sonda para HTLV-2. O mix de oligonucleotídeos foi distribuído em alíquotas. A cada alíquota dispensada, o mix foi homogeneizado em vortex durante 10 segundos. As alíquotas foram envolvidas por papel alumínio e acondicionadas a -20°C até o momento do uso. O descongelamento dos oligonucleotídeos estoque, utilizados para a preparação do mix, foi realizado sobre gelo, e os mesmos foram homogeneizados durante 10 segundos antes dos procedimentos de diluição.
Exemplo 13: Avaliação da homogeneidade do mix (sondas+iniciadores)
[000145] Para a avaliação da homogeneidade do mix (sondas+iniciadores), cinco alíquotas foram escolhidas aleatoriamente e avaliadas em reações de qPCR contendo 103 cópias virais do controle positivo, em que os valores de cycle threshold (Ct) para HTLV-1 e HTLV-2 foram analisados.
[000146] Para tanto, cinco de 20 alíquotas dos controles positivos contendo 103 cópias virais/reação foram escolhidas aleatoriamente e avaliadas nas reações de qPCR. A média, desvio padrão e o coeficiente de variação (CV) entre as alíquotas estão descritos na Tabela 4.
Tabela 4. Avaliação da homogeneidade do mix (iniciadores+sondas).
HTLV-1 (alíquotas) Média dos Ct HTLV-2 (alíquotas) Média dos Ct
1 31,942 1 31,723
5 31,968 5 31,839
2 32,084 2 31,750 7 31 ,989 7 31 ,805
3 31 ,893 3 31 ,707
Média 31 ,975 Média 31 ,765
DP 0,071 DP 0,056
CV% 0,2 CV % 0,2
DP: desvio padrão; CV: coeficiente de variação; Ct: cycle threshold; HTLV: vírus linfotrópico de células T humanas.
[000147] O baixo valor de desvio padrão dos Ct entre as alíquotas avaliadas demonstra que o processo de produção e aliquotagem do mix foram homogéneos.
Exemplo 14: Avaliação da estabilidade do mix (sondas+iniciadores)
[000148] Para avaliar a degradação ou degeneração do mix, uma alíquota foi submetida a processos de descongelamento e congelamento por 18 vezes em um intervalo de 120 dias. A cada descongelamento, o mix foi avaliado por reações de qPCR nas quais foram analisadas os Ct dos controles positivos. Como controle, paralelamente, 18 alíquotas do mix foram descongeladas, utilizadas e descartadas a cada dia. Os valores de Ct para HTLV- 1 e HTLV-2 obtidos foram submetidos ao cálculo da média, desvio padrão e CV. Não houve diferenças significativas a média dos Ct dos controles e das alíquotas avaliadas. Portanto, o mix mostrou-se estável, sem alterações significativas durante toda a avaliação (Tabela 5).
Tabela 5. Avaliação da estabilidade do mix (iniciadores+sondas).
Data do Média dos Ct do Estabilidade do Média dos Ct do Estabilidade do qPCR controle (HTLV-1) mix (Ct HTLV-1) controle (HTLV-2) mix (Ct HTLV-2)
Dia 01 30,334 30,235 31,017 30,834
Dia 02 30,311 30,236 30,894 30,89
Dia 03 30,817 30,688 31,507 31,374
Dia 04 30,106 30,13 30,629 30,7 Dia 05 30,236 29,922 30,795 30,576
Dia 06 29,894 30,32 30,525 30,921
Dia 07 30,397 30,348 30,885 30,788
Dia 08 30,157 29,985 30,686 30,743
Dia 09 30,106 30,045 30,504 30,694
Dia 10 30,461 30,362 30,843 31,004
Dia 11 30,159 30,219 30,699 30,847
Dia 12 30,082 30,058 30,58 30,655
Dia 13 30,573 30,365 30,94 31,001
Dia 14 30,361 30,287 30,955 30,847
Dia 15 30,653 30,494 31,272 31,178
Dia 16 30,28 30, 154 30,845 30,929
Dia 17 30,21 30,209 30,731 30,743
Dia 18 30,559 30,518 31,217 31
Média 30,316 30,254 30,862 30,873
DP 0,231 0,195 0,266 0, 194
CV% 0,762 0,645 0,862 0,628
DP: desvio padrão; CV: coeficiente de variação; Ct: cycle threshold; HTLV: vírus linfotrópico de células T humanas.
Exemplo 15: Processo de validação aplicado a testes diagnósticos: precisão
[000149] Nos testes de precisão são avaliados os parâmetros de repetibilidade (intra-ensaio) e reprodutibilidade (inter-ensaio). A repetibilidade refere-se à máxima concordância entre testes repetidos da mesma amostra sob as mesmas condições operacionais. Este teste foi realizado a partir de três diluições do controle positivo (ΜΤ-2+Gu) contendo 105, IO4, 103 cópias virais/reação com cinco réplicas de cada diluição. Três corridas de qPCR foram realizadas no mesmo dia, utilizando o mesmo lote de reagentes e preparadas por um único operador.
[000150] A reprodutibilidade avalia a máxima concordância entre resultados sucessivos do mesmo analito sob diferentes condições operacionais. Este teste foi realizado a partir de três diluições do controle positivo (ΜΤ-2+Gu) contendo 105, IO4, 103 cópias virais/reação com cinco réplicas de cada diluição. Três corridas foram realizadas em dias alternados, utilizando o mesmo lote de reagentes e preparadas por três operadores distintos. (Tabelas 6 e 7).
Tabela 6. Intra-ensaio para HTLV-1 e HTLV-2.
HTLV-1 HTLV-2
Diluição
Média dos Ct CV Média dos Ct CV
IO5 24,496 0,113 24,179 0,181
Corrida 1 104 27,847 0,150 27,593 0,331
103 31,076 0,131 30,970 0,370
IO5 24,445 0,254 24,129 0,219
Corrida 2 104 27,791 0,137 27,539 0,192
103 31,008 0,225 30,887 0,240
IO5 24,428 0,157 24,172 0,177
Corrida 3 104 27,687 0,181 27,538 0,343
103 30,969 0,033 30,942 0,408
HTLV: vírus linfotrópico de células T humanas; Ct: cycle threshold; CV: coeficiente de variação
Tabela 7. Inter-ensaio para HTLV-1 e HTLV-2.
HTLV-l
diluição Média dos Ct CV (%) Média dos Ct CV (%)
IO5 24,404 0,643 24,176 0,475
104 27,722 0,553 27,593 0,340
103 31,020 0,478 30,996 0,408
HTLV: vírus linfotrópico de células T humanas; Ct: cycle threshold; CV: coeficiente de variação.
[000151] Os coeficientes de variação (CV) dos testes não ultrapassaram 0,653%, resultado dentro do limite proposto pelo National Virus Reference Laboratory, Irlanda (Moens et al., J Clin Microbiol, v. 47, n. 11, p. 3682-91, 2009; Waters et al, J Clin Virol, v. 52, n. 1, p. 38-44, 2011). Exemplo 16: Processo de validação aplicado a testes diagnósticos: robustez
[000152] A robustez de um teste refere-se ao potencial de contaminação cruzada das amostras negativas com amostras positivas por carry-over. Este parâmetro foi avaliado pelo método de "mesa de xadrez" (Figura 11), no qual uma amostra positiva é pipetada ao lado de uma amostra negativa ao longo da placa de reações de qPCR. As reações foram pipetadas tanto manualmente quanto por uma estação de trabalho autimatizada de pipetagem {liquid handling).
[000153] Em uma placa foram pipetadas amostras positivas para HTLV-1 lado a lado com amostras sem alvo (branco de reação). Nenhum branco de reação apresentou curva de amplificação, indicando que não houve contaminação cruzada durante o preparo das reações.
Exemplo 16: Processo de validação aplicado a testes diagnósticos: Sensibilidade analítica
[000154] A sensibilidade analítica ou limite mínimo de detecção avalia a menor concentração ou quantidade que um método diagnóstico é capaz de detectar. Para atender a este parâmetro foram realizadas diluições do controle positivo (ΜΤ-3+Gu). A diluição estoque do controle positivo (ΜΤ-2+Gu) contendo 105 cópias viras foi submetida a uma primeira diluição de razão 10 para a obtenção de uma solução contendo IO4 cópias virais, seguida de uma diluição de razão cinco, resultando em uma solução contendo 2000 cópias virais. A partir dessa solução, foram realizadas 11 diluições seriadas de razão dois, até a obtenção de uma solução contendo 0,976 cópias virais. A cada diluição realizada, a amostra foi homogeneizada em vortex durante 10 segundo, seguida de rápida centrifugação para minimizar a formação de aerossóis. Durante o processo das diluições, as ponteiras utilizadas nos pipetadores automáticos não foram trocadas. As diluições contendo 62,5, 31,25, 15,625, 7,81, 3,9, 1,95 e 0,975 cópias virais, em oito réplicas de cada diluição, foram submetidas às reações de qPCR as quais foram pipetadas por três operadores distintos em um único dia. Os resultados obtidos foram utilizados para o cálculo da sensibilidade analítica pelo método estatístico de regressão linear Probit em um intervalo de confiança de 95%, com o auxílio do Software Statistical Package for Social Science (SPSS) versão 17.0 (SPSS Inc.). Dois lotes diferentes de iniciadores e sondas foram submetidos à análise.
[000155] Assim, com o objetivo de avaliar o limite de detecção mínima do teste, sete níveis de diluições seriadas, de razão dois, (controles positivos para HTLV-1 e HTLV-2) foram testados, variando de 62,5 a 0,975 cópias virais/reação. Todas as reações foram realizadas no formato multiplex, em oito réplicas de cada diluição. Dois testes foram realizados em dias distintos utilizando lotes diferentes de iniciadores e sondas, pipetados por três diferentes operadores (Tabela 8 e 9). A sensibilidade analítica (lote 01) obtida pela média entre os operadores foi 4,64 cópias/reação para HTLV-1 (variando de 3,83 a 5,54 cópias/reação) e 10,77 cópias/reação para HTLV-2 (variando de 7,02 a 17,21 cópias/reação). A sensibilidade analítica (lote 02) foi 3,06 cópias/reação para HTLV-1 (variando de 2,81 a 3,55 cópias/reação) e 10,99 cópias/reação para HTLV-2 (variando de 8,62 a 13,53 cópias/reação). A média de detecção entre os experimentos foi 3,85 cópias/reação para HTLV-1 (variando de 2,81 a 5,54 cópias/reação) e 10,88 cópias/reação para HTLV-2 (variado de 7,02 a 17,21 cópias/reação).
Tabela 8. Avaliação da Sensibilidade analítica para HTLV-1 e HTLV-2 (lote 01) utilizando o método de regressão linear Probit (IC 95%).
n° de réplicas detectadas
Cópias/reação OP 01 OP 02 OP 03 Limite de detecção (IC 95%)
HTLV-1
62,5 8/8 8/8 8/8 4,64 (3,83 - 5,54) 31,25 8/8 8/8 8/8
15,625 8/8 8/8 8/8
7,81 8/8 8/8 8/8
3,9 7/8 8/8 7/8
1,95 4/8 3/8 6/8
0,975 5/8 3/8 3/8
HTLV-2
62,5 8/8 8/8 8/8
31,25 8/8 8/8 8/8
15,625 8/8 7/8 8/8
7,81 8/8 5/8 7/8 10,77 (7,02 - 17,21)
3,9 5/8 6/8 7/8
1,95 3/8 3/8 3/8
0,975 3/8 0/8 2/8
HTLV: vírus linfo trópico de células T humanas; n°: número; OP: operador; IC: intervalo de confiança.
Tabela 9. Avaliação da Sensibilidade analítica para HTLV-1 e HTLV-2 (lote 02) utilizando o método de regressão linear Probit (IC de 95%)
n° de réplicas detectadas
Cópias/reação OP 01 OP 02 OP 03 Limite de detecção (IC 95%)
HTLV-1
62,5 8/8 8/8 8/8
31,25 8/8 8/8 8/8
15,625 8/8 8/8 8/8
3,06 (2,81 - 3,55) 7,81 8/8 8/8 8/8
3,9 7/8 8/8 8/8
1,95 6/8 5/8 4/8
0,975 1/8 1/8 3/8
HTLV-2
62,5 8/8 8/8 8/8
31,25 8/8 8/8 8/8
15,625 7/8 8/8 8/8
10,99 (8,62 - 13,53) 7,81 8/8 7/8 6/8
3,9 5/8 6/8 6/8
1,95 1/8 2/8 2/8 0,975 ϊ/8 2/8 ϊ/8
HTLV: vírus linfotrópico de células T humanas; n°: número; OP: operador; IC intervalo de confiança.
Exemplo 17: Processo de validação aplicado a testes diagnósticos: Especificidade analítica
[000156] A especificidade analítica corresponde à habilidade do teste em identificar exclusivamente a substância alvo ou organismo ao invés de substâncias ou organismos semelhantes em uma amostra. Para tanto, testes in vitro e in silico foram realizados. Para a validação in vitro, reações de qPCR contemplando os vírus HAV, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2, B 19 foram realizados com painéis adquiridos do National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). Além do painel testado, 30 amostras de indivíduos infectados pelo HIV, 30 amostras de indivíduos infectados pelo HBV e 30 amostras de indivíduos infectados pelo HCV foram avaliadas em reações de qPCR. A validação in silico foi realizada pelo confronto das sequências dos iniciadores e sondas contra um banco de dados público BLAST, a fim de verificar possíveis homologias com outros organismos.
[000157] Os conjuntos de iniciadores e sondas TaqMan® com alvo na região virai pol do HTLV-1, HTLV-2 e controle interno (IC) foram testados in vitro, a partir de ácidos nucleicos extraídos de um painel adquirido do National Institute for Biological Stantadards and Control (NIBSC) que contempla os vírus HAV, HBV, HCV, HIV e B 19. Ainda, 30 amostras de pacientes portadores do vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), 30 amostras de pacientes portadores do vírus da Hepatite B (HBV) e 30 amostras de pacientes portadores do vírus da Hepatite C (HCV) também foram analisadas em reações de qPCR. A avaliação in silico foi realizada por meio da comparação das sequências de sonda e primers com o banco de dados público BLAST, para a verificação de homologia com outros microrganismos. As reações não apresentaram reatividade cruzada com os tipos virais testados e as sequências de primers e sondas apresentaram 100% de similaridade com HTLV e beta globina (Cl), portanto adequados para o ensaio.
Exemplo 18: Processo de validação aplicado a testes diagnósticos: Sensibilidade diagnóstica
[000158] A sensibilidade diagnóstica de um método refere-se à probabilidade de um resultado positivo na presença da infecção, ou seja, avalia a capacidade do teste em detectar como positivo um indivíduo infectado (verdadeiro positivo). As amostras utilizadas para este teste mostraram-se reagentes na sorologia, Western Blot e/ou nested PCR positivas. Assim, 320 amostras de indivíduos infectados pelo HTLV- 1/2 foram testadas, dentre elas, 278 amostras HTLV-1 e 42 amostras HTLV-2. A fórmula para o cálculo da sensibilidade diagnóstica está descrita abaixo:
Sensibilidade diagnóstica = Indivíduos verdadeiros positivos
Indivíduos falsos negativos + Indivíduos verdadeiros positivos
[000159] As amostras que apresentaram cycle threshold (Ct) superior a 40 ou amplificação em somente uma das duplicatas foram consideradas negativas.
[000160] Para avaliar este parâmetro, 278 amostras de pacientes infectados pelo HTLV-1 e 42 amostras de pacientes infectados pelo HTLV-2 foram testadas. O teste, executado no formato multiplex, apresentou de 94,6% de sensibilidade para HTLV-1, e 78,6% para HTLV-2. Todas as reações foram realizadas em duplicata.
Exemplo 19: Processo de validação aplicado a testes diagnósticos: Especificidade diagnóstica
[000161] A especificidade diagnóstica de um método refere-se à probabilidade de um resultado negativo na ausência de infecção, ou seja, avalia a capacidade do teste em identificar como negativo um indivíduo sadio (verdadeiro negativo). Para tanto, 288 amostras de indivíduos que apresentaram perfil sorológico não reagente para HTLV-1/2 pelo teste imunoenzimático (EIA), foram submetidas às reações de qPCR. A fórmula para o cálculo da sensibilidade diagnostica está descrita abaixo:
Especificidade diagnóstica= Indivíduos verdadeiros negativos
Indivíduos falsos positivos + Indivíduos verdadeiros negativos
[000162] As amostras que apresentaram cycle threshold superior a 40 foram consideradas negativas.
[000163] As condições de ciclagem, amplificação e aquisição dos dados de todo o processo de validação foram realizadas de acordo com o Exemplo 7. A concentração utilizada das sondas para HTLV-1 (FAM) e Cl foi 200 nM e HTLV-2 (VIC) 225 nM. As concentrações dos iniciadores para HTLV-1 foram 500 nM, HTLV-2 250 nM e IC 250 nM, com exceção do iniciador reverso' para HTLV-2 que foi utilizado na concentração de 500 nM. Todas as reações foram realizadas em duplicata e no formato multiplex.
[000164] Todas a reações de PCR em tempo real (qPCR) realizadas no processo de validação continham de 80 a 500 ng de DNA, com valor médio de aproximadamente 200 ng por reação.
[000165] O conjunto de iniciadores e sondas foi submetido ao teste de especificidade diagnostica. Para tanto, 288 amostras não reagentes para sorologia para HTLV-1/2 foram submetidas à reação de qPCR no formato multiplex. Não foi observado amplificação das amostras, exibindo 100% de especificidade diagnostica. Todas as reações foram realizadas em duplicata.
Exemplo 20: Resolução de casos sem definição de tipo virai e indeterminados no teste de Western Blot (WB) [000166] O teste de Western Blot em alguns casos não permite discriminar a infecção pelo HTLV-1 do HTLV-2. Ainda, existem ocasiões em que o padrão de bandas não define o status de infecção, permanecendo com resultado indeterminado. Um total de 11 amostras avaliadas pelo WB permaneceram sem definição do tipo virai e 14 amostras mostraram-se indeterminadas. A plataforma desenvolvida, foi capaz de definir o tipo virai em 10 de 11 amostras não tipadas e concluir o estado de infecção em seis, de 14 amostras avaliadas (Tabela 10).
Tabela 10. Amostras que apresentaram padrão indeterminado e não tipadas no método de WB avaliadas pela plataforma de PCR em tempo real desenvolvida.
Western Blot Plataforma qPCR
Classificação n° de amostras HTLV-2
HTLV-1
Indeterminadas 14 4 2
Não tipadas 11 10 0 qPCR: PCR em tempo real; HTLV: vírus linfotrópico de células T humana.
[000167] Uma amostra apresentou um padrão de bandas referente à dupla infecção pelo HTLV-1 e HTLV-2, a qual foi corretamente identificada pelo teste de qPCR desenvolvido.
Exemplo 21 : Definição do Threshold para as reações de qPCR
[000168] O threshold das reações de qPCR foi definido com base na escolha automática dos threshold pelo software 7500 versão 2.0.5 (Applied Biosystems), obtidos a partir dos controles positivos para HTLV-1 e HTLV-2, em 21 corridas de qPCR realizadas em dias alternados. Após o cálculo da mediana, o threshold para HTLV-1 foi definido em 0,518759 e para o HTLV- 2 0,409368. Estes valores foram utilizados durante todo o processo de validação.
Exemplo 22: Definição do cut o ff para as reações de qPCR
[000169] Todas as corridas de qPCR foram realizadas em por meio de 45 ciclos de amplificação. Após o teste das amostras e controles negativos, observou-se raras amplificações tardias (cycle threshold > 40). Desta forma, amplificações acima deste valor de Ct foram consideradas negativas.
Exemplo 23: Análises estatísticas
[000170] A análise da precisão e a comparação dos formatos singleplex e multiplex das reações de PCR em tempo real (qPCR) foi realizada por meio do cálculo da média, o desvio padrão e o coeficiente de variação dos cycle threshold (Ct). A definição do threshold foi realizada por meio da avaliação da mediana dos Ct. O teste one-way ANO VA com pós teste de Bonferroni foi utilizado para avaliar a eficiência dos métodos de extração, enquanto o teste t foi utilizado para avaliar a estabilidade dos controles e reagentes. Além disso, o método de regressão linear Probit foi utilizado para avaliar a sensibilidade analítica desta plataforma. O software GraphPad Prism 5 e o SPSS foram utilizados nas análises estatísticas.
[000171] E evidente que os exemplos acima foram apresentados apenas em caráter ilustrativo, e que modificações e variações dos mesmos, óbvias para os técnicos no assunto, são consideradas como inclusas no escopo da presente invenção, tal como definida nas reivindicações a seguir.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Oligonucleotídeo, caracterizado pelo fato de ser capaz de se ligar à região pol de HTLV e ser adequado como iniciador, dito oligonucleotídeo compreendendo pelo menos de 10 a 15 nucleotídeos consecutivos das sequências selecionadas de SEQ ID Nos: 1, 2, 4, 5 e 6.
2. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de compreender as sequências de SEQ ID Nos: 1 , 2, 4, 5 e 6.
3. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de consistir nas SEQ ID Nos: 1, 2, 4, 5 e 6,
4. Oligonucleotídeo, caracterizado pelo fato de ser capaz de ser ligar à região pol de HTLV e ser adequado como sonda, dito oligonucleotídeo sonda compreendendo pelo menos de 8 a 15 nucleotídeos consecutivos das sequências selecionadas de SEQ ID Nos: 3 e 7.
5. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de compreender as sequências de SEQ ID Nos: 3 e 7.
6. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de consistir nas sequências de SEQ ID Nos: 3 e 7.
7. Oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de ser marcado com uma marcação detectável, preferencialmente, um grupamento fluorescente.
8. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato e que o grupamento fluorescente compreende um par de fluoróforo doador e um quencher.
9. Conjunto de oligonucleotídeos, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos dois oligonucleotídeos selecionados de sequências compreendendo SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.
10. Método para detecção de pelo menos um alvo de HTLV, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) produzir pelo menos um amplicon usando pelo menos dois oligonucleotídeos, ditos oligonucleotídeos sendo iniciadores adequados para a amplificação de pelo menos um alvo de referência selecionado do grupo que consiste da sequência localizada entre as posições 3340 e 3414 da SEQ ID NO: 11 e sequência localizada entre as posições 4483 e 4563 da SEQ ID NO: 12, e
b) detectar o amplicon através de pelo menos uma sonda,
1 1. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que dito método é realizado com pelo menos um iniciador como definido na reivindicação 1, 2 ou 3.
12. Método de acordo com a reivindicação 11 , caracterizado pelo fato de que dito método é realizado com os iniciadores de SEQ ID Nos: 1 e 2.
13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que é realizado com os conjuntos de iniciadores selecionados de SEQ ID Nos: 4 e 5, SEQ ID Nos: 4 e 6 ou SEQ ID Nos: 4, 5 e 6.
14. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de detectar o amplicon é realizada com pelo menos uma sonda como definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 8.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de produzir pelo menos um amplicon compreende pelo menos um de amplificação por PCR multiplex, singleplex, quantitativo, qualitativo, convencional ou em tempo real.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11 , 14 ou 15, caracterizado pelo fato de permitir discriminar entre infecções por HTLV-1 e HTLV-2.
17. Kit para diagnóstico e discriminação de infecção por HTLV- /2, caracterizado pelo fato de compreender: a) pelo menos um oligonucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-3; e/ou b) pelo menos um conjunto de oligonucleotídeos como definido em qualquer uma das reivindicações 4-8; e c) opcionalmente, instruções para uso,
18. Kit de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de ainda incluir um controle negativo e/ou um controle positivo de reação.
19, Polinucleotídeo adequado para uso como alvo de referência para o desenho de iniciadores e sondas para detecção e diferenciação de HTLV-1 e HTLV-2, caracterizado pelo fato de ser selecionado do grupo que consiste da sequência localizada entre as posições 3340 e 3414 da SEQ ID NO: 1 1 e sequência localizada entre as posições 4483 e 4563 da SEQ ID NO: 12.
20, Amplicon, caracterizado pelo fato de ser obtenível pelo método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16 em uma amostra contendo HTLV,
21 . Amplicon de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de ser obtido com um par de iniciadores selecionado de: um iniciador de SEQ ID No: 1 e um iniciador de SEQ ID NO: 2; ou um iniciador de SEQ ID NO: 4 e um iniciador de SEQ ID NO: 5, ou um iniciador de SEQ ID NO: 4 e um iniciador de SEQ ID NO: 6.
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