JP2018085961A

JP2018085961A - ヒトヘルペスウイルス６型のタイプａ及び／又はタイプｂを検出するためのプローブ

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Publication number: JP2018085961A
Application number: JP2016231375A
Authority: JP
Inventors: 利恵河野; Rie KAWANO; 国昭白尾; Kuniaki Shirao; 正男緒方; Masao Ogata
Original assignee: Oita University
Current assignee: Oita University
Priority date: 2016-11-29
Filing date: 2016-11-29
Publication date: 2018-06-07
Anticipated expiration: 2036-11-29
Also published as: JP6828884B2

Abstract

【課題】効率的にHHV6のタイプＡとタイプＢを識別する手段を提供すること。【解決手段】下記の構造（Ｂ）：（Ｂ）：5’-Q-gacgGcac-F-3’（ここで、Qはクエンチャーであり、小文字アルファベットはDNA分子であり、大文字アルファベットはRNA分子であり、Fは蛍光色素である）を有する、ヒトヘルペスウイルス６（HHV6）タイプＢを検出するためのプローブ。【選択図】なし

Description

ヒトヘルペスウイルス６型（HHV6）のタイプＡ及び／又はタイプＢを検出するためのプローブ、並びにそれを用いた遺伝子型の検出／識別方法が開示される。

HHV6は、突発性発疹の原因ウイルスであり、多くのヒトに潜伏感染している。造血幹細胞移植後のように免疫能が低下した患者ではヒトヘルペスウイルスの増殖による脳炎がしばしば発症し、ときには致死的結末に至る。脳炎の予防には、ヒトヘルペスウイルス量のモニタリングと早期の抗ウイルス薬の投与が必須である。

HHV6にはタイプＡとタイプＢが存在する。両ウイルス遺伝子は高い相同性を有するが、その病原性に顕著な違いがあり、脳炎を起こすのはタイプＢである。よって、HHV6のタイプＡとタイプＢを区別することは重要である。従来のタイプＡとタイプＢを識別する方法はシークエンシングを要し、必ずしも効率的ではなかった。

Ogata et al., Clin. Infect. Dis., 2013 Sep;57(5):671-681

上述のような現状の下、効率的にHHV6のタイプＡとタイプＢを識別する手段を提供することが１つの課題である。

かかる課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の構造を有するプローブを用いること、及び／又はそれと特定のプライマーとを組み合わせることにより、シークエンシングを行うことなく効率的にHHV6のタイプＡとタイプＢとを識別できることを見出した。斯かる知見をもとにさらなる研究を重ね、下記に代表される発明を提供するに至った。

項１．
下記の構造（Ｂ）：
（Ｂ）：5’-Q-gacgGcac-F-3’
（ここで、Qはクエンチャーであり、小文字アルファベットはDNA分子であり、大文字アルファベットはRNA分子であり、Fは蛍光色素である）
を有する、ヒトヘルペスウイルス６（HHV6）タイプＢを検出するためのプローブ。
項２．
配列番号１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーからなるプライマー対と共に用いられることを特徴とする、項１に記載のプローブ。
項３．
項１に記載のプローブ、及び下記の構造（Ａ−１）〜（Ａ−３）のいずれかを有するHHV6タイプＡを検出するためのプローブ
（Ａ−１）：5’-Q-gtgtgAcgt-F-3’
（Ａ−２）：5’ -Q-ggtgtgAcg-F-3’
（Ａ−３）：5’ -Q-gtgtgAcg-F-3’
（ここで、Qはクエンチャーであり、小文字アルファベットはDNA分子であり、大文字アルファベットはRNA分子であり、Fは蛍光色素である）
を含む、HHV6の遺伝子型を識別するためのキット。
項４．
更に、RNaseを含む、項３に記載のキット。
項５．
HHV6タイプＢを検出するためのプローブが有する蛍光色素がHHV6タイプＡを検出するためのプローブが有する蛍光色素と異なる、項３又は４に記載のキット。
項６．
項１のプローブを用いてHHV6タイプＢを検出する方法。
項７．
項１のプローブの存在下で、HHV6のゲノムDNAを鋳型として配列番号１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーを用いてPCRを行う工程（１）、及び
該プローブが有する蛍光色素が発する蛍光を検出する工程（２）
を含む、項６に記載の方法。
項８．
下記の工程（１）及び工程（２）を含むHHV6の遺伝子型を識別する方法：
工程（１）；項１のプローブ（プローブＢ）及び下記の構造（Ａ−１）〜（Ａ−３）のいずれかを有するHHV6タイプＡを検出するためのプローブ（プローブＡ）の存在下で、HHV6のゲノムDNAを鋳型として配列番号１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーを用いてPCRを行う工程
（Ａ−１）：5’-Q-gtgtgAcgt-F-3’
（Ａ−２）：5’ -Q-ggtgtgAcg-F-3’
（Ａ−３）：5’ -Q-gtgtgAcg-F-3’
（ここで、Qはクエンチャーであり、小文字アルファベットはDNA分子であり、大文字アルファベットはRNA分子であり、Fは蛍光色素であり、プローブＡが有する蛍光色素はプローブＢが有する蛍光色素と異なる）
工程（２）；プローブＡ及び／又はプローブＢが有する蛍光色素が発する蛍光を検出する工程。

HHV6の遺伝子型を効率的に（例えば、HHV6のDNAをシークエンシングすることなく）識別することができる。

HHV6の遺伝子型を効率的に識別するためには、下記の構造（Ｂ）を有するプローブ（以下、「プローブＢ」と称する場合もある）を用いることが好ましい。
（Ｂ）：5’-Q-gacgGcac-F-3’
（ここで、「Q」はクエンチャーであり、小文字アルファベットはDNA分子であり、大文字アルファベットはRNA分子であり、「F」は蛍光色素であり、「5’」はプローブの5’末端を意味し、「3’」はプローブの3’末端を意味する）

構造（Ｂ）のような構造を有するプローブは、TaqManプローブの一態様であるサイクリングプローブとして知られている。構造Ｂを構成する塩基配列（gacgGcac）は、HHV6タイプＢのゲノムDNA（Accesssion No (NCBI) AF157706.1）の103978番目〜103985番目の塩基配列に相補的であり、RNA分子であることを示す大文字で示されたＧは、タイプＢに特異的に存在する塩基に対応する。

クエンチャーとしては、種々のものが市販されており、蛍光色素からの蛍光をクエンチできるものであれば特に制限されない。クエンチャーには蛍光色素と非蛍光色素があり、いずれでもよいが、検出の精度の観点から、非蛍光色素が好ましい。具体的なクエンチャーとしては、6-カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、Eclipse Dark Quencher、minor groove binder（MGB）、及び非蛍光クエンチャー（NFQ）等を挙げることができる。

蛍光色素は、TaqManプローブに使用できるものであれば特に制限されず、適宜選択することができる。具体的な蛍光色素としては、6-FAM、TE、HEX、Quasar 670、Quasar 570、Quasar 705、Pulsar 650、TET、HEX、VIC、JOE、CAL Fluor Orenge、CAL Fluor Gold、CAL Fluor Red、Texas Red、Cy、Cy5等を挙げることができる。

プローブＢは、HHV6タイプＢのゲノムDNAとのみ完全に相補的であり、当該DNAにハイブリダイズするとRNaseの働きにより切断され、結果として蛍光色素が発する蛍光が検出可能となる。RNaseとしては、サイクリングプローブ法に用いることができるRNaseであれば特に制限されない。そのようなRNaseとしては、例えば、DNA/RNAハイブリッド二本鎖を形成しているRNAを切断し、一本鎖DNAを生じるRNase Hを挙げることができる。

プローブＢは、サイクリーブ（cycleave）PCR法において用いることが好ましく、配列番号１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーからなるプライマー対と共に用いることが好ましい。このプライマー対は、後述する実施例に示すように、HHV6タイプＢのゲノムDNA（Accesssion No (NCBI) AF157706.1）の103908番目の塩基〜104040番目の塩基で構成される領域を増幅するように設計されている。プローブBとこのプライマー対とを組み合わせて使用することにより高感度にHHV6タイプBを検出することができる。

HHV6のタイプAを検出する場合は、下記の構造（Ａ−１）〜（Ａ−３）のいずれかを有するHHV6タイプＡを検出するためのプローブ（以下、「プローブＡ」と称する場合もある）をもちいることが好ましい。
（Ａ−１）：5’-Q-gtgtgAcgt-F-3’
（Ａ−２）：5’ -Q-ggtgtgAcg-F-3’
（Ａ−３）：5’ -Q-gtgtgAcg-F-3’
（ここで、Qはクエンチャーであり、小文字アルファベットはDNA分子であり、大文字アルファベットはRNA分子であり、Fは蛍光色素であり、「5’」はプローブの5’末端を意味し、「3’」はプローブの3’末端を意味する）

プローブ（Ａ−１）は、HHV6タイプＡのゲノムDNAの103976番目〜103984番目の塩基配列に相補的であり、プローブ（Ａ−２）は、HHV6タイプＡのゲノムDNAの103975番目〜103983番目の塩基配列に相補的であり、プローブ（Ａ−３）は、HHV6タイプＡのゲノムDNAの103976番目〜103983番目の塩基配列に相補的である。いずれのプローブにおいても、大文字で示されたＡはタイプＡに特異的に存在する塩基に対応する。

プローブＡを用いたHHV6のタイプAを検出する場合も、上述の配列番号１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーからなるプライマー対を用いることが好ましい。

一実施形態において、プローブＡとプローブＢとを組み合わせて使用することが好ましい。例えば、遺伝子型が未知であるヘルペスウイルスに感染している（又はそれが疑われる）被検体から取得したサンプルとしてプローブＡ及びプローブＢの存在下でリアルタイムＰＣＲを行うことにより、被検体がHHV6のタイプA又はBに感染しているか否かを効率的に識別することができる。プローブＡとプローブＢとを組み合わせて使用する場合、プローブＡの蛍光色素とプローブＢの蛍光色素は異なる種類であることが好ましい。そうすることにより、検出した光が、遺伝子型Ａ及びＢのいずれに対応するのか判別可能となる。

HHV6の遺伝子型を検出するためのキットは、プローブＡ及び／又はプローブＢを含むことが好ましく、プローブＡ及びＢを含むことがより好ましい。当該キットは、更に上述する配列番号１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーからなるプライマー対を含むことが好ましい。上記キットは、その他、任意の成分、試薬、又は説明書等を含見える。試薬としては、例えばRNase H、dNTPミックス、DNAポリメラーゼ、等を挙げることができる。キットに含まれる各成分は、別個の容器に収容されていてもよく、同一の容器に混合状態で収容されていても良い。また、各成分は、乾燥形態で容器に収容されていてもよく、適当な溶媒中に溶解した形態で容器に収容されていてもよい。

PCR及び蛍光の検出は、サイクリーブPCR法に適した市販される装置を用いて行うことができる。本発明で用いられるポリヌクレオチドは、いずれも通常のDNA自動合成機（例えばアプライドバイオシステム社製）を用いて、公知のDNA合成法（例えばホスホアミダイド法）によって調製することができる。プローブとして用いるDNA/RNAキメラポリヌクレオチドもまた、公知の通常の方法で調製することができる。

PCR法における各条件（反応液の濃度及び量、並びに、変性、アニーリング、伸長の各段階の温度、時間、サイクル数等）は当業者が適宜決定することができる。好ましい条件としては以下のものが挙げられる。PCR法に供する反応液には、各プライマー及びプローブがそれぞれ50-500nMの濃度で含まれていることが好ましい。反応液の全量は好ましくは10〜50μlである。PCR条件の好ましい条件としては、例えば、90〜100℃・10秒〜2分間（より好ましくは95℃・30秒間）のインキュベーション後、90〜100℃・2秒〜１分間（より好ましくは95℃・5秒間）、50〜60℃・5秒〜1分間（より好ましくは55℃・10秒間）、70〜80℃・5〜60秒（75°・20秒）の反応を30〜60サイクル（より好ましくは45サイクル）行うという条件が挙げられる。

PCRの鋳型に用いるDNAは、HHV6のゲノムDNAである限り特に制限されない。一実施形態において、HHV6のDNAは、HHV6に罹患した被験者又はそれが疑われる被験者由来であることが好ましい。HHV6に罹患した被験者又はそれが疑われる被験者から取得する検体の種類は特に制限されず、例えば、血液（全血、血清、又は血漿を含む）を挙げることができる。

以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。

実施例１
下記表１に示す構造を有するHHV6のタイプＡ及びタイプＢを検出するためのDNA−RNAキメラプローブを作製した。

表１において、括弧内に大文字で示される塩基はＲＮＡであり、その他の小文字で示される塩基はDNAである。EclipseとはEclipse Dark Quencherである。結合領域は、HHV6の全遺伝子配列（Accesssion No (NCBI) AF157706.1）において各プローブが結合する領域を示す。

また、下記表２に示す構造を有する、HHV6の遺伝子のうち103982位を含む領域を増幅するための７種類のプライマー対を作製した。

表１のプローブ及び表２のプライマー対を下記表３に示す組み合わせで用い、HHV6のタイプA又はタイプBの遺伝子配列を有するプラスミドDNA（ユーロフィンジェノミクス社製）を鋳型としてPCRを行い、各組み合わせによる遺伝子型の検出を試みた。プラスミドのコピー数を10⁰〜10⁶ copies/mlまでの段階希釈し、Ct値に関する検量線の作成を試みた。PCRには、TaKaRa Cycleve PCR Starter Kit (Cycleave PCR Reaction Mix)、及びABI StepOne Plus Real-Time PCR systemを使用した。PCRは、Takara Cycleave マニュアルに従い下記の表４に示す条件で実施した。

PCRサイクルの温度及び回数は下記の通りである。
Step PCR標準プロトコール。
Hold Cycle:1 95℃ 30秒
Step PCR Cycle:45 95℃ 5秒
55℃ 10秒
72℃ 20秒
Cooling Cycle:1 40℃ 1分

各試験の結果は表３に示すとおりである。タイプBの検出は、タイプB プローブ1とプライマー対１の組み合わせでのみ従来のシークエンシングを用いた試験と同等に高い感度で検出可能であった（試験No.1）。同じプライマー対１を用いてもプローブの構造が僅かに異なるだけでType Bの検出はできないことが判明した（試験No.2及び3）。また、Type Bプローブ1を用いた場合も、異なるプライマー対2〜4ではType Bを検出できないことが判明した。Type Aの検出については、プローブの構造にある程度のバリエーションは許容されたが（試験No.1〜3）、プライマー対5〜7を用いた場合には検出できないことが判明した。

実施例２
ヘルペスウイルス６型に罹患した患者検体１及び２の血漿分離をした。血漿を0.22μｍ（メルク社）のフィルターに通し、不純物を除去した。QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen社）を使用し血漿200μlから100μlのＤＮＡ溶液を回収した。従来のシークエンス法を使いた測定により、患者検体１及び２のいずれについてもＴｙｐｅＢであることを確認した。尚、患者検体１のウイルス量は19048.2 copies /mlであり、患者検体２のウイルス量は9261.28 copies /mlであった。その後、一旦ＤＮＡを凍結保存し、凍結したＤＮＡを再解凍（そのためウイルス量の若干の低下が予測される）して、実施例１と同様に異なるプローブ及びプライマー対の組み合わせでＴｙｐｅＡ及びＢの検出を試みた。その結果、ＴｙｐｅＢプローブ１とプライマー対１の組み合わせでのみ検出が確認された。

Claims

下記の構造（Ｂ）：
（Ｂ）：5’-Q-gacgGcac-F-3’
（ここで、Qはクエンチャーであり、小文字アルファベットはDNA分子であり、大文字アルファベットはRNA分子であり、Fは蛍光色素である）
を有する、ヒトヘルペスウイルス６（HHV6）タイプＢを検出するためのプローブ。
配列番号１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーからなるプライマー対と共に用いられることを特徴とする、請求項１に記載のプローブ。
請求項１に記載のプローブ、及び下記の構造（Ａ−１）〜（Ａ−３）のいずれかを有するＨＨＶ６タイプＡを検出するためのプローブ
（Ａ−１）：5’-Q-gtgtgAcgt-F-3’
（Ａ−２）：5’ -Q-ggtgtgAcg-F-3’
（Ａ−３）：5’ -Q-gtgtgAcg-F-3’
（ここで、Qはクエンチャーであり、小文字アルファベットはDNA分子であり、大文字アルファベットはRNA分子であり、Fは蛍光色素である）
を含む、HHV6の遺伝子型を識別するためのキット。
更に、RNaseを含む、請求項３に記載のキット。
HHV6タイプＢを検出するためのプローブが有する蛍光色素とHHV6タイプＡを検出するためのプローブが有する蛍光色素の種類が互いに異なる、請求項３又は４に記載のキット。
請求項１のプローブを用いてHHV6タイプＢを検出する方法。
請求項１のプローブの存在下で、HHV6のゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーを用いてPCRを行う工程（１）、及び
該プローブが有する蛍光色素が発する蛍光を検出する工程（２）
を含む、請求項７に記載の方法。
下記の工程（１）及び工程（２）を含むHHV6の遺伝子型を識別する方法：
工程（１）；請求項１のプローブ（プローブＢ）及び下記の構造（Ａ−１）〜（Ａ−３）のいずれかを有するHHV6タイプＡを検出するためのプローブ（プローブＡ）の存在下で、HHV6のゲノムDNAを鋳型として配列番号１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーを用いてPCRを行う工程
（Ａ−１）：5’-Q-gtgtgAcgt-F-3’
（Ａ−２）：5’ -Q-ggtgtgAcg-F-3’
（Ａ−３）：5’ -Q-gtgtgAcg-F-3’
（ここで、Qはクエンチャーであり、小文字アルファベットはDNA分子であり、大文字アルファベットはRNA分子であり、Fは蛍光色素であり、プローブＡが有する蛍光色素とプローブＢが有する蛍光色素の種類は互いに異なる）
工程（２）；プローブＡ及び／又はプローブＢが有する蛍光色素が発する蛍光を検出する工程。