WO2016039293A1 - 固相担体、リガンド結合固相担体、標的物質の検出又は分離方法、及び前記固相担体の製造方法 - Google Patents

固相担体、リガンド結合固相担体、標的物質の検出又は分離方法、及び前記固相担体の製造方法 Download PDF

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    • C08F2438/00—Living radical polymerisation
    • C08F2438/01—Atom Transfer Radical Polymerization [ATRP] or reverse ATRP

Definitions

  • the present invention relates to a solid phase carrier, a ligand-bound solid phase carrier, a method for detecting or separating a target substance, and a method for producing the solid phase carrier.
  • Solid phase carriers are used for the purpose of detecting and separating target substances such as proteins, nucleic acids and cells from samples such as blood.
  • a detection / separation method using a solid phase carrier a method in which a ligand is immobilized on a solid phase carrier and a sample is brought into contact therewith to react a target substance with the ligand.
  • the target substance or impurities in the sample are adsorbed nonspecifically on the surface of the solid support, not the ligand, and this may cause noise.
  • ATRP initiation group atom transfer radical polymerization initiation group
  • magnetic particles have recently attracted attention as diagnostic reagents for enzyme immunoassay in clinical tests, and solid phase carriers used for cell separation including cell therapy and nucleic acid extraction.
  • magnetic particles are relatively easy to separate from a specimen sample or the like, they tend to aggregate in water, and therefore development of a technique for improving the water dispersibility of magnetic particles is required.
  • the target particles can be sufficiently captured by the magnetic particles used for the diagnostic agent.
  • magnetic particles used for cell separation are required to specifically capture only target cells.
  • Patent Document 2 magnetic particles in which a polymer brush is formed by bonding a poly (hydroxyethylmethacrylamide) / poly (methacrylic acid) block copolymer or the like to the surface by ATRP have been proposed (Patent Document 2). ), The magnetic particles easily adsorb target substances and impurities in the sample nonspecifically on the particle surface, and there is room for improvement in this respect.
  • the problems to be solved by the present invention include high water dispersibility, easy binding of a ligand to a reactive functional group, suppression of non-specific adsorption, and high sensitivity when used by binding a ligand.
  • An object of the present invention is to provide a solid phase carrier capable of detecting a target substance with low noise.
  • a solid phase carrier formed by binding a polymer containing a specific structural unit having a zwitterionic structure and a specific structural unit having a reactive functional group has high water dispersion.
  • the ligand is easy to bind to the reactive functional group, non-specific adsorption is suppressed, and the target substance can be detected with high sensitivity and low noise when the ligand is bound.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention includes ⁇ 1> a structural unit represented by the following formula (1) (hereinafter also referred to as structural unit (1)) and a structural unit represented by the following formula (2) (hereinafter structural unit (2). And a solid phase carrier obtained by binding a polymer containing
  • R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R 2 represents an organic group having a zwitterionic structure.
  • R 3 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R 4 represents — (C ⁇ O) —O— *, — (C ⁇ O) —NR 6 — *
  • R 6 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • * represents R 5 in the formula (2).
  • R 4 is — (C ⁇ O) —O— *
  • R 5 represents a hydrogen atom or an organic group having a reactive functional group
  • R 4 represents — (C ⁇ O) —NR 6 — *.
  • R ⁇ 5 > shows the organic group which has a reactive functional group.
  • R 5 is not an organic group having a zwitterionic structure.
  • the present invention provides a ligand-bound solid phase carrier obtained by binding a ligand to the solid phase carrier of ⁇ 2> above ⁇ 1>.
  • the present invention provides a method for detecting or separating a target substance in a sample, characterized by using ⁇ 3> the ligand-bound solid phase carrier of ⁇ 2> above.
  • the present invention provides a method for producing a solid phase carrier comprising a polymer comprising ⁇ 4> structural unit (1) and structural unit (2), (Step 1) preparing a carrier having a polymerization initiating group; (Step 2) The present invention provides a production method comprising a step of polymerizing a monomer starting from the polymerization initiating group.
  • the solid support of the present invention has high water dispersibility, the ligand is easy to bind to the reactive functional group, non-specific adsorption is suppressed, and high sensitivity and low noise are obtained when the ligand is bound. Can be used to detect a target substance. Further, according to the production method of the present invention, the solid phase carrier of the present invention can be easily produced.
  • Solid phase carrier of the present invention is obtained by bonding a polymer containing a structural unit represented by the following formula (1) and a structural unit represented by the following formula (2). First, the solid phase carrier of the present invention will be described in detail.
  • R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R 2 represents an organic group having a zwitterionic structure.
  • R 3 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R 4 represents — (C ⁇ O) —O— *, — (C ⁇ O) —NR 6 — *
  • R 6 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • * represents R 5 in the formula (2).
  • R 4 is — (C ⁇ O) —O— *
  • R 5 represents a hydrogen atom or an organic group having a reactive functional group
  • R 4 represents — (C ⁇ O) —NR 6 — *.
  • R ⁇ 5 > shows the organic group which has a reactive functional group.
  • R 5 is not an organic group having a zwitterionic structure.
  • R 2 represents an organic group having a zwitterionic structure.
  • Such an organic group means an organic group having a cationic functional group and an anionic functional group.
  • R 2 an organic group represented by the following formula (3) or (4) is more preferable from the viewpoint of suppressing nonspecific adsorption, and from the viewpoint of easy monomer synthesis, the following formula (3) The organic group represented by is particularly preferable.
  • R 7 represents — (C ⁇ O) —O— *, — (C ⁇ O) —NR 13 — * (R 13 represents a hydrogen atom or a methyl group, and * represents R 8 in the formula (3).
  • R 8 and R 9 each independently represents a single bond or a divalent organic group having 1 to 10 carbon atoms
  • R 10 represents — (C ⁇ O) O 2 — or —SO 3 —
  • R 11 and R 12 each independently represent a methyl group or an ethyl group.
  • R 14 represents — (C ⁇ O) —O— *, — (C ⁇ O) —NR 20 — * (R 20 represents a hydrogen atom or a methyl group, and * represents R 15 in the formula (4).
  • R 15 and R 16 each independently represents a single bond or a divalent organic group having 1 to 10 carbon atoms;
  • R 17 , R 18 and R 19 each independently represent a methyl group or an ethyl group.
  • R 10 represents — (C ⁇ O) O 2 — or —SO 3 — , and — (C ⁇ O) O 2 — is preferable from the viewpoint of achieving both high detection sensitivity and low noise.
  • R 13 represents a hydrogen atom or a methyl group, and is preferably a hydrogen atom.
  • R 8 and R 9 in the formula (3) and R 15 and R 16 in the formula (4) each independently represent a single bond or a divalent organic group having 1 to 10 carbon atoms.
  • a divalent organic group having 1 to 10 carbon atoms is preferable, and a carbon-carbon of a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms or a divalent hydrocarbon group having 2 to 10 carbon atoms.
  • a group having at least one selected from an ether bond, an imino group, an amide bond and an ester bond between atoms is more preferable, and a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms is particularly preferable.
  • the carbon number thereof is preferably 1 to 8, more preferably 1 to 6, still more preferably 1 to 4, and particularly preferably 1 to 3.
  • the divalent organic group is a group having one or more selected from an ether bond, an imino group, an amide bond and an ester bond between carbon-carbon atoms of the divalent hydrocarbon group
  • the carbon number of the valent hydrocarbon group is preferably 2 to 8, more preferably 2 to 6, further preferably 2 to 4, and particularly preferably 2 or 3.
  • the “divalent hydrocarbon group” in R 8 , R 9 , R 15 and R 16 is preferably a divalent aliphatic hydrocarbon group.
  • the divalent aliphatic hydrocarbon group may be linear or branched.
  • the divalent aliphatic hydrocarbon group is preferably an alkanediyl group, specifically, a methane-1,1-diyl group, an ethane-1,1-diyl group, an ethane-1,2-diyl group, Propane-1,1-diyl group, propane-1,2-diyl group, propane-1,3-diyl group, propane-2,2-diyl group, butane-1,2-diyl group, butane-1,3 -Diyl group, butane-1,4-diyl group, pentane-1,4-diyl group, pentane-1,5-diyl group, hexane-1,5-diyl group
  • R 20 represents a hydrogen atom or a methyl group, preferably a hydrogen atom.
  • R 4 represents — (C ⁇ O) —O— *, — (C ⁇ O) —NR 6 — * from the viewpoint of increasing affinity with water and suppressing nonspecific adsorption. Is preferred.
  • R 6 represents a hydrogen atom or a methyl group, preferably a hydrogen atom.
  • R 4 When R 4 is — (C ⁇ O) —O— *, R 5 represents a hydrogen atom or an organic group having a reactive functional group, and R 4 represents — (C ⁇ O) —NR 6. When it is — * or a phenylene group, R 5 represents an organic group having a reactive functional group. When R 4 is — (C ⁇ O) —O— * and R 5 is a hydrogen atom, the combination of R 4 and R 5 becomes a reactive functional group (carboxy group).
  • R 5 is not an organic group having a zwitterionic structure as shown by R 2 , and in this specification, the reactive functional group in R 5 is a concept that does not include a zwitterionic structure.
  • Examples of the reactive functional group include a carboxy group, a tosyl group, an amino group, an epoxy group, an acyl group, and an azide group, and the organic group may have one of these, and may contain two or more. You may have.
  • the organic group may have one of these, and may contain two or more. You may have.
  • a carboxy group, a tosyl group, an amino group, and an epoxy group are preferable, and a carboxy group is more preferable because a ligand can be easily and quickly bound to a solid phase carrier.
  • the content of the reactive functional group contained in the structural unit (2) is determined from the viewpoint of the amount of ligand binding, the viewpoint of achieving both high detection sensitivity and low noise, and from the viewpoint of cell separation performance.
  • it is 1 ⁇ mol or more, more preferably 5 ⁇ mol or more, more preferably 10 ⁇ mol or more, further preferably 15 ⁇ mol or more, further preferably 20 ⁇ mol or more, further preferably 25 ⁇ mol or more, particularly preferably 30 ⁇ mol or more per gram of solid content.
  • the reactive functional group is a carboxy group
  • the content of the reactive functional group can be measured by an electric conductivity measurement method or the like, and specifically, can be measured according to the method described in the examples described later.
  • the reactive functional group is a tosyl group
  • it can be obtained by measuring the ultraviolet-visible light absorption of the tosyl group introduced into the solid phase carrier.
  • the reactive functional group is an amino group
  • It can be determined by reacting N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate with the group, followed by reduction, and measuring the absorbance of the free thiopyridyl group.
  • organic group which has a reactive functional group shown by R ⁇ 5 > the organic group represented by following formula (5) is preferable.
  • R 21 represents a divalent organic group
  • Y represents a reactive functional group
  • Examples of the divalent organic group represented by R 21 include a divalent hydrocarbon group, an ether bond, an imino group, an amide bond and an ester bond between carbon-carbon atoms of a divalent hydrocarbon group having 2 or more carbon atoms. Examples include groups having one or more selected.
  • the carbon number is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 8, and particularly preferably 1 to 6.
  • the divalent organic group is a group having at least one selected from an ether bond, an imino group, an amide bond and an ester bond between carbon-carbon atoms of a divalent hydrocarbon group having 2 or more carbon atoms
  • the carbon number of the divalent hydrocarbon group in such a group is preferably 2 to 10, more preferably 2 to 8, and particularly preferably 2 to 6.
  • the “divalent hydrocarbon group” for R 21 is preferably a divalent aliphatic hydrocarbon group.
  • the divalent aliphatic hydrocarbon group may be linear or branched.
  • the divalent aliphatic hydrocarbon group is preferably an alkanediyl group, specifically, a methane-1,1-diyl group, an ethane-1,1-diyl group, an ethane-1,2-diyl group, Propane-1,1-diyl group, propane-1,2-diyl group, propane-1,3-diyl group, propane-2,2-diyl group, butane-1,2-diyl group, butane-1,3 -Diyl group, butane-1,4-diyl group, pentane-1,4-diyl group, pentane-1,5-diyl group, hexane-1,5-diyl group, hexane-1,6-d
  • a polymer can be easily obtained as a group having one or more selected from an ether bond, an imino group, an amide bond and an ester bond between carbon-carbon atoms of a divalent hydrocarbon group having 2 or more carbon atoms. From the above, a group having an ester bond between carbon-carbon atoms of a divalent hydrocarbon group having 2 or more carbon atoms is preferred, and a divalent group represented by —R a —O (C ⁇ O) —R b — * (R a and R b each independently represents an alkanediyl group having 2 to 4 carbon atoms, and * represents a bonding position with Y in the formula (5)).
  • alkanediyl group As carbon number of alkanediyl group, 2 or 3 is preferable and 2 is more preferable.
  • the alkanediyl group may be linear or branched, and examples thereof include ethane-1,2-diyl group, propane-1,2-diyl group, and propane-1,3-diyl group.
  • Examples of the reactive functional group represented by Y include a carboxy group, a tosyl group, an amino group, an epoxy group, an acyl group, and an azide group as described above.
  • a carboxy group a tosyl group, an amino group, an epoxy group, an acyl group, and an azide group as described above.
  • Group, tosyl group, amino group, and epoxy group are preferable, and a carboxy group is more preferable because a ligand can be easily and quickly bound to a solid phase carrier.
  • R 4 and R 5 As a combination of the above R 4 and R 5 , a combination in which R 4 is — (C ⁇ O) —O— *, R 5 is a hydrogen atom or an organic group having a reactive functional group, R A combination in which 4 is — (C ⁇ O) —NR 6 — *, R 5 is an organic group having a reactive functional group, and R 4 is — (C ⁇ O) —O— * or A combination in which — (C ⁇ O) —NR 6 — * and R 5 is an organic group having a reactive functional group is more preferable.
  • the polymer may have a structural unit other than the structural units (1) and (2) (hereinafter also referred to as other structural units).
  • other structural units include those derived from (meth) acrylates, styrenes, (meth) acrylonitriles, vinyl acetate and the like.
  • the structural units (1) and (2) may be contained in the same polymer bonded to the solid phase carrier, and may be contained in different polymers, but are contained in the same polymer. It is preferable.
  • the average degree of polymerization n of the structural unit (1) per polymer is preferably 1 or more, more preferably 3 or more, further preferably 5 or more, particularly preferably 10 or more. From the viewpoint of achieving both high sensitivity and low noise detection, and from the viewpoint of cell separation performance, it is preferably 500 or less, more preferably 300 or less, still more preferably 200 or less, even more preferably 100 or less, and even more preferably. 70 or less, particularly preferably 62 or less.
  • the average degree of polymerization m of the structural unit (2) per polymer is preferably 1 or more, more preferably 3 or more, still more preferably 5 or more, particularly preferably 10 or more, from the viewpoint of the amount of ligand binding.
  • the polymerization rate [m / (m + n)] calculated from the average degree of polymerization n and the average degree of polymerization m is preferably 0.01 or more, more preferably from the viewpoint of suppressing non-specific adsorption and the amount of ligand binding.
  • the polymer is a block polymer, from the viewpoint of suppressing non-specific adsorption, the viewpoint of the amount of ligand binding, the high sensitivity of detection and the reduction of noise at the same time, and from the viewpoint of being particularly suitable for diagnostic use, It is preferably 0.1 to 0.5, more preferably 0.1 to 0.35, and particularly preferably 0.15 to 0.3.
  • the polymer when it is a random polymer, it is more preferably 0.2 to 0.7, particularly preferably from the viewpoint of achieving both high detection sensitivity and low noise, and particularly suitable for diagnostic use. Is 0.35 to 0.7.
  • the average degree of polymerization n and m mean the average degree of polymerization of the structural units (1) and (2) per polymer, respectively. X-ray photoelectron spectroscopic analysis, weight of polymer bonded per 1 g of solid support, It can be calculated from the molecular weight of the polymer and the amount of reactive functional groups. Specifically, it can be measured according to the method described in Examples described later.
  • the polymer is preferably a chain polymer.
  • the chain polymer refers to a polymer having a linear molecular structure, and is a concept including a polymer having a structure composed of a long linear main chain and a relatively short side chain bonded thereto.
  • the polymer is preferably a vinyl polymer.
  • the arrangement of the structural units in the polymer is not particularly limited and may be any of random copolymers, block copolymers, copolymers having random copolymer blocks and block copolymer units, and alternating copolymers. However, a random copolymer and a block copolymer are preferable from the viewpoint that a polymer can be easily formed.
  • the polymer When the polymer is a random copolymer, nonspecific adsorption of cells and the like is easily suppressed.
  • a ligand such as an antibody when the polymer is a block copolymer, a ligand such as an antibody is easily bound, and it is easy to achieve both high sensitivity and low noise in detection using an antigen-antibody reaction.
  • the reactive functional group is locally present, so that the antibody is easily bound, and a sandwich structure (primary antibody-antigen-secondary
  • the present inventor infers that it is easy to take a higher order structure such as an antibody.
  • the block copolymer When the polymer is a block copolymer, the block copolymer includes a first block composed of repeating structural units (1) and a second block composed of repeating structural units (2). Block.
  • a block copolymer represented by the following formula (6) is preferable from the viewpoint of further facilitating the binding of a ligand and the compatibility between high detection sensitivity and low noise.
  • one end of the polymer is not particularly limited as long as it is bound to the solid phase carrier, but it is preferably bound to the solid phase carrier via a divalent linking group containing a residue of a polymerization initiating group.
  • the polymerization initiating group is preferably a polymerization initiating group capable of living polymerization, more preferably a living radical polymerization initiating group, more preferably an atom transfer radical polymerization initiating group, a reversible addition-cleavage chain transfer polymerization initiating group, and an atom transfer radical polymerization initiating group.
  • the group is particularly preferred.
  • Examples of the divalent linking group containing the residue of the atom transfer radical polymerization initiating group include a divalent group represented by the following formula (7-1) or (7-2).
  • R 25 and R 29 represent —O— or —NH—
  • R 26 and R 30 each independently represents a single bond or a phenylene group
  • R 27 and R 28 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group
  • ** indicates a position where the polymer ends are bonded.
  • R 25 and R 29 are preferably —O—, R 26 and R 30 are preferably single bonds, and R 27 and R 28 are preferably alkyl groups.
  • the carbon number of the alkyl group represented by R 27 and R 28 is preferably 1 to 8, more preferably 1 to 4, and particularly preferably 1 or 2.
  • the alkyl group may be linear or branched. Specifically, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, A pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, an octyl group, etc. are mentioned.
  • the other end of the polymer is not particularly limited, but a halogen atom is preferred.
  • the halogen atom include a bromine atom, a chlorine atom, and a fluorine atom.
  • the polymer preferably forms a polymer brush on the solid support surface.
  • the density occupied by the polymer with respect to the surface of the solid phase carrier of the present invention is preferably from the viewpoint of suppressing non-specific adsorption, from the viewpoint of the amount of ligand binding, from the viewpoint of achieving both high detection sensitivity and low noise. 0.01 lines / nm 2 or more, more preferably 0.05 lines / nm 2 or more, still more preferably 0.1 lines / nm 2 or more, still more preferably 0.3 lines / nm 2 or more, still more preferably 0.00.
  • the number is preferably 2 / nm 2 or less, more preferably 1.6 / nm 2 or less, and still more preferably 1.2 / nm 2 or less.
  • the number average molecular weight (Mn) of the polymer is preferably 1,000 to 100,000, more preferably 3,000 to 50,000, and still more preferably 5,000 to 30,000.
  • the weight average molecular weight (Mw) of the polymer is preferably 1,000 to 100,000, more preferably 3,000 to 50,000, and particularly preferably 5,000 to 30,000.
  • the molecular weight distribution (Mw / Mn) is preferably 1.0 to 2.5, preferably 1.0 to 2.0, from the viewpoint of suppressing nonspecific adsorption and increasing the activity of the ligand bound to the solid phase carrier. Is more preferable, and 1.0 to 1.5 is more preferable.
  • the number average molecular weight and the weight average molecular weight mean the average molecular weight in terms of polyethylene glycol measured by gel permeation chromatography after releasing the polymer from the solid phase carrier by hydrolysis or the like.
  • the molecular weight of the polymer before introduction of the reactive functional group is measured by a method as described in the examples described later, the molecular weight, the number of moles of the structural unit into which the reactive functional group is introduced, and the reaction It can be calculated by calculating from the structure of the compound used for the introduction of the functional group.
  • the portion other than the polymer constituting the solid phase carrier of the present invention may be an organic substance or an inorganic substance such as a metal or metal oxide, and is not particularly limited.
  • the solid phase carrier of the present invention includes a resin in addition to the polymer. Is preferred.
  • the resin may be a natural polymer composed of a polysaccharide such as agarose, dextran, or cellulose, or may be a synthetic polymer.
  • the form of the solid phase carrier of the present invention is not particularly limited and may be any of particles, monoliths, membranes, fibers, chips, etc. From the viewpoint of easy detection or separation of the target substance, the particles Preferably, magnetic particles are more preferable.
  • magnetic particle means a particle having a magnetic material.
  • the solid phase carrier of the present invention has high water dispersibility even in the form of magnetic particles. Further, when magnetic particles are used, they can be separated using a magnet or the like without using a centrifuge or the like, so that the separation of the solid phase carrier from the sample can be simplified or automated.
  • the magnetic material may be ferromagnetic, paramagnetic, or superparamagnetic, but is preferably superparamagnetic from the viewpoint of facilitating separation by a magnetic field and redispersion after removing the magnetic field.
  • the magnetic material examples include metals such as ferrite, iron oxide, iron, manganese oxide, manganese, nickel oxide, nickel, cobalt oxide, and cobalt, or alloys.
  • Specific examples of the magnetic particles include those obtained by bonding the polymer to any one of the following particles (i) to (iv). Porous or non-porous magnetic polymer particles are preferred.
  • a non-magnetic material such as a resin
  • Core particles having core particles composed of a non-magnetic material such as a resin and a magnetic layer (secondary aggregate layer) containing magnetic fine particles provided on the surface of the core particles are used as a core.
  • a nonmagnetic layer such as resin is provided as a shell (hereinafter also referred to as outermost layer shell) on the outermost layer of the mother particle (iv)
  • a nonmagnetic layer such as resin is provided as a shell in the outermost layer of the particle Particles in which magnetic fine particles are dispersed in the pores of porous particles made of resin, silica, etc., which are all known, and the particles (i) to (iv) are all known and manufactured according to conventional methods. Is possible.
  • Examples of the resin in the core particle (iii) and the porous particle (iv) include resins derived from one or more selected from monofunctional monomers and crosslinkable monomers.
  • Examples of the monofunctional monomer include monofunctional aromatic vinyl monomers such as styrene, ⁇ -methylstyrene, and halogenated styrene; methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, stearyl (meth) acrylate, and cyclohexyl.
  • monofunctional (meth) acrylate monomers such as (meth) acrylate and isobornyl (meth) acrylate.
  • crosslinkable monomer examples include polyfunctional aromatic vinyl monomers such as divinylbenzene; ethylene glycol di (meth) acrylate, trimethylolpropane tri (meth) acrylate, dipentaerythritol hexa (meth) methacrylate, allyl ( Examples thereof include polyfunctional (meth) acrylate monomers such as (meth) acrylate; conjugated diolefins such as butadiene and isoprene.
  • polyfunctional aromatic vinyl monomers such as divinylbenzene
  • polyfunctional (meth) acrylate monomers such as (meth) acrylate
  • conjugated diolefins such as butadiene and isoprene.
  • one or more functional groups selected from glycidyl group, amino group and hydroxyl group are used as the resin in the above (i) and (ii) and the resin in the outermost shell of the above (iii) and (iv).
  • the resin it has is preferred.
  • the functional group may be introduced by chemical modification to the resin, or may be introduced by polymerization of a monomer composition containing at least one or more monomers having the functional group. Examples of the chemical modification include generation of a hydroxyl group by hydrolysis of a glycidyl group and generation of an amino group by reduction of a nitro group.
  • the monomer composition having the functional group is more preferably a monomer composition containing at least a glycidyl group-containing monomer (hereinafter, the resin in the outermost shell is a resin formed by a monomer composition containing at least a glycidyl group-containing monomer) Is also referred to as glycidyl group-containing magnetic particles).
  • Examples of the glycidyl group-containing monomer include glycidyl (meth) acrylate and allyl glycidyl ether.
  • Examples of amino group-containing monomers include 2-aminoethyl (meth) acrylate.
  • Examples of the hydroxyl group-containing monomer include 1,4-cyclohexanedimethanol mono (meth) acrylate.
  • the average particle size (volume average particle size) is preferably 0.1 to 500 ⁇ m, more preferably 0.2 to 50 ⁇ m, still more preferably 0.8. 3 to 10 ⁇ m.
  • the coefficient of variation of the average particle diameter may be about 20% or less.
  • the specific surface area may be about 1.0 to 2.0 m 2 / g. The average particle size and specific surface area can be measured by laser diffraction / scattered particle size distribution measurement or the like.
  • the solid phase carrier of the present invention can be produced by appropriately combining conventional methods.
  • the solid phase carrier of the present invention can be produced by increasing the density occupied by the polymer on the surface of the solid phase carrier and further non-specifically. From the viewpoint of suppressing adsorption, from the viewpoint of binding a polymer with a narrow molecular weight distribution to a solid support and further suppressing non-specific adsorption, from the viewpoint of enhancing the function of a ligand binding to the solid support, etc.
  • Step 1 A method comprising a step of preparing a carrier having a polymerization initiating group (hereinafter also referred to as a polymerization initiating group-containing carrier) and (Step 2) a step of polymerizing a monomer starting from the polymerization initiating group is preferred.
  • Specific examples of the production method include the following methods ⁇ PR-1> and ⁇ PR-2>. Hereinafter, these methods will be described by taking as an example the case where the reactive functional group contained in the structural unit (2) is a carboxy group, an amino group, or a tosyl group.
  • Step 1 Prepare a polymerization initiating group-containing carrier, (Step 2-1-1) Introduce monomer (11) constituting structural unit (1) and carboxy group, amino group or tosyl group A monomer (12) having a possible functional group (for example, a hydroxyl group, an epoxy group, an ester group, an amino group, a carboxylic acid protecting group, etc.) is polymerized starting from the polymerization initiating group (Step 2-1-2). ) A method of introducing a carboxy group, an amino group or a tosyl group into the polymer (14) introduced into the solid phase carrier by addition reaction, substitution reaction, condensation reaction or deprotection reaction.
  • a monomer (12) having a possible functional group for example, a hydroxyl group, an epoxy group, an ester group, an amino group, a carboxylic acid protecting group, etc.
  • Step 1 Prepare a polymerization initiating group-containing carrier, (Step 2-2-1) Addition reaction to monomer (12) having a functional group capable of introducing a carboxy group, amino group or tosyl group A monomer (13) constituting the structural unit (2) by introducing a carboxy group, an amino group or a tosyl group by a substitution reaction, a condensation reaction or a deprotection reaction (step 2-2-2) 13) A method in which the monomer (11) is polymerized starting from the polymerization initiating group.
  • a monomer having a carboxy group, an amino group, or a tosyl group it can be produced without performing (Step 2-2-1).
  • the monomer having a carboxy group, an amino group, or a tosyl group include (meth) acrylic acid, (meth) acrylate, aminoethyl (meth) acrylate, and the like.
  • the polymerization initiating group-containing carrier may be a commercially available product or may be synthesized and used. For example, polymerization is started on a raw material carrier (hereinafter also referred to as a raw material carrier) having one or more selected from a hydroxyl group, an amino group, an epoxy group, and a carboxy group (hereinafter collectively referred to as a hydroxyl group). It can be obtained by contacting a compound having a group and converting a hydrogen atom contained in the hydroxyl group or the like into a polymerization initiating group (hereinafter, this reaction is also referred to as a polymerization initiating group introduction reaction).
  • the raw material carrier having a hydroxyl group can be obtained, for example, by bringing the glycidyl group-containing magnetic particles into contact with an acid such as an inorganic acid or an organic acid, thereby opening the glycidyl group.
  • the polymerization initiating group-containing carrier can also be obtained by polymerizing a monomer composition containing a monomer having a polymerization initiating group. Examples of the monomer having a polymerization initiating group include 2- (2-bromoisobutyryloxy) ethyl methacrylate.
  • the compound having a polymerization initiating group is preferably a compound having a polymerization initiating group capable of living polymerization, more preferably a compound having a living radical polymerization initiating group, a compound having an atom transfer radical polymerization initiating group, a reversible addition cleavage chain.
  • a compound having a transfer polymerization initiating group is more preferred, and a compound having an atom transfer radical polymerization initiating group is particularly preferred.
  • Examples of the compound having an atom transfer radical polymerization initiating group include 2-bromoisobutyryl bromide, 4- (bromomethyl) benzoic acid, ethyl 2-bromoisobutyrate, 2-bromopropionyl bromide, and tosyl chloride.
  • the total amount of the compound having a polymerization initiating group is usually about 0.001 to 100 times by mass, preferably about 0.01 to 50 times by mass with respect to the raw material carrier.
  • the polymerization initiation group introduction reaction is preferably performed in the presence of a basic catalyst such as triethylamine, N, N-dimethyl-4-aminopyridine, diisopropylethylamine, pyridine or the like. In addition, you may use 1 type in these basic catalysts individually or in combination of 2 or more types.
  • the total amount of the basic catalyst used is usually about 1 to 10 molar equivalents, preferably about 1 to 5 molar equivalents, relative to the compound having a polymerization initiating group.
  • the polymerization initiating group introduction reaction is preferably performed in the presence of a solvent.
  • the solvent examples include ether solvents such as tetrahydrofuran, 1,4-dioxane and 1,3-dioxane; protic solvents such as dimethylformamide and dimethyl sulfoxide. These solvents may be used alone or in combination of two or more. Can be used in combination.
  • the reaction time for the polymerization initiating group introduction reaction is usually about 30 minutes to 24 hours, and the reaction temperature may be appropriately selected below the boiling point of the solvent.
  • Step 2-1-1-1 The polymerization method of the polymerization reaction in Step 2-1-1 may be selected according to the type of the polymerization initiating group, but from the viewpoint of obtaining the target product easily and easily, living polymerization is preferable, and living radical polymerization is more preferable. Further, atom transfer radical polymerization (ATRP polymerization) and reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization (RAFT polymerization) are more preferable, and atom transfer radical polymerization is particularly preferable.
  • ATRP polymerization atom transfer radical polymerization
  • RAFT polymerization reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization
  • atom transfer radical polymerization is particularly preferable.
  • the monomer (12) is polymerized starting from the polymerization initiation group at the terminal of the formed polymer, or the polymer terminal is formed after polymerizing the monomer (12).
  • the block copolymer can be introduced into the solid phase carrier by polymerizing the monomer (11) starting from the polymerization initiating group.
  • the monomer (12) examples include 2-hydroxyethyl (meth) acrylamide, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, glycidyl (meth) acrylate, aminoethyl (meth) acrylate, tert-butyl (meth) acrylate, and the like.
  • the total amount of each of the monomers (11) and (12) is usually about 5 to 10000 molar equivalents, preferably about 10 to 5000 molar equivalents, relative to the polymerization initiating group bonded to the carrier.
  • the polymerization reaction in Step 2-1-1 is performed by atom transfer radical polymerization, it is preferable to perform the reaction in the presence of a transition metal compound and a ligand from the viewpoint of reaction efficiency.
  • a transition metal compound a copper compound is preferable. Copper compounds include copper halides such as copper (I) bromide, copper (II) bromide, copper (I) chloride, copper (II), copper (I) triflate, copper (II) trif Rate and the like. In addition, you may use 1 type in these individually or in combination of 2 or more types. The total amount of the transition metal compound used is usually about 1 to 10,000 ppm in the reaction system.
  • a ligand containing two or more nitrogen atoms in the same molecule is preferable.
  • the ligand containing two or more nitrogen atoms in the same molecule include tris (2-pyridylmethyl) amine, bipyridine, a bipyridine derivative, and tris [2- (dimethylamino) ethyl] amine.
  • the total amount of ligand used is usually about 0.5 to 10 molar equivalents relative to the transition metal compound.
  • the polymerization reaction in Step 2-1-1 is preferably performed in the presence of a reducing agent and a solvent from the viewpoint of reaction efficiency.
  • a reducing agent include ascorbic acid, glucose, hydrazine, copper and the like, and these reducing agents can be used alone or in combination of two or more.
  • the solvent include water; amide solvents such as dimethylformamide; alcohol solvents such as methanol and ethanol. These solvents can be used alone or in combination of two or more.
  • the pH of the reaction system for the polymerization reaction is preferably 3 to 10.
  • the reaction time of the polymerization reaction is usually about 30 minutes to 12 hours, and the reaction temperature may be appropriately selected below the boiling point of the solvent.
  • the polymerization reaction proceeds even under mild conditions of about 25 to 60 ° C.
  • Step 2-1-2 is a step of introducing a carboxy group, an amino group or a tosyl group into the polymer (14) introduced into the solid phase carrier by an addition reaction, a substitution reaction, a condensation reaction or a deprotection reaction.
  • a method for introducing a carboxy group a monomer having a hydroxyl group or an amino group is used as the monomer (12), and a carboxylic acid anhydride is added to the obtained polymer (14), or an epoxy is used as the monomer (12).
  • a monomer having a group hydrolyzing the resulting polymer (14) to form a hydroxyl group, then adding a carboxylic acid anhydride, and using a monomer having an epoxy group as the monomer (12)
  • a method in which a compound having a carboxy group and a nucleophilic group such as a mercapto group or an amino group is added to the obtained polymer (14), a monomer having a carboxy group protected as the monomer (12), 14) and the like.
  • the carboxylic acid anhydride include succinic anhydride, maleic anhydride, glutaric anhydride, phthalic anhydride, hexahydrophthalic anhydride, and the like.
  • succinic anhydride is preferable from the viewpoint of easy reaction with a hydroxyl group or an amino group.
  • the total amount of carboxylic acid anhydride and the like is usually about 0.1 to 2000 molar equivalents, preferably 1 to 1000 molar equivalents, relative to the structural unit derived from the monomer (12).
  • Examples of the compound having a nucleophilic group such as a mercapto group or amino group and a carboxy group include mercaptopropionic acid and amino acids.
  • the monomer in which the carboxy group is protected include tert-butyl (meth) acrylate and N-hydroxysuccinimide (meth) acrylate.
  • the deprotection method can be implemented by a well-known method according to a protective group, and a hydrolysis etc. are mentioned.
  • Examples of the method for introducing an amino group include a method in which a monomer having an epoxy group is used as the monomer (12) and ammonia or a compound having two or more amino groups is added to the obtained polymer (14). .
  • Examples of the compound having two or more amino groups include ethylenediamine.
  • a method for introducing a tosyl group a monomer having a hydroxyl group or an amino group is used as the monomer (12), and a tosyl chloride is added to the obtained polymer (14), or an epoxy group is contained as the monomer (12). Examples thereof include a method of adding tosyl chloride after hydrolyzing the polymer (14) obtained by using a monomer to form a hydroxyl group.
  • Step 2-1-2 is preferably performed in the presence of the same basic catalyst and solvent as in Step 1.
  • the reaction time in Step 2-1-2 is usually about 30 minutes to 24 hours, and the reaction temperature may be appropriately selected below the boiling point of the solvent.
  • the process 2-2-1 may be performed according to the process 2-1-2, and the process 2-2-2 may be performed according to the process 2-1-1.
  • the solid phase carrier of the present invention obtained as described above has high water dispersibility, the ligand easily binds to the reactive functional group, and nonspecific adsorption is suppressed. Moreover, when a ligand is bound and used, the S / N (signal / noise) ratio in detection of the target substance can be increased, and detection and the like can be performed with high sensitivity and low noise. In addition, the separation of the target substance can be highly purified. Further, when a ligand is bound and used, target cells can be specifically captured at a high rate.
  • the solid phase carrier of the present invention as an affinity carrier, immunoassay utilizing antigen-antibody reaction such as enzyme immunoassay, radioimmunoassay, chemiluminescence immunoassay; detection of protein, nucleic acid, etc .; cell, protein, nucleic acid It can be widely used for in-vitro diagnosis and research in the field of biochemistry such as bioseparation of bio-related substances such as;
  • the solid phase carriers of the present invention are particularly suitable for use in immunoassays, for bioseparation (particularly cell separation) and for nucleic acid detection.
  • the ligand-bound solid phase carrier of the present invention is obtained by binding a ligand to the solid phase carrier of the present invention.
  • the ligand may be a molecule that binds to a target substance.
  • a target substance for example, antibody; antigen; nucleic acid such as DNA and RNA; nucleotide; nucleoside; protein such as protein A, protein G, (strept) avidin, enzyme, and lectin Peptides such as insulin, amino acids, sugars or polysaccharides such as heparin, lipids, vitamins such as biotin, drugs, substrates, hormones, neurotransmitters, synthetic molecules, and the like.
  • antibodies and antigens are preferable from the viewpoint of forming a ligand-bound solid phase carrier suitable for diagnostic drugs and the like.
  • the antibody and the antigen may be any substance that binds to a target substance.
  • Anticoagulant / fibrinolysis-related test antibody or antigen thereto Anti-BFP antibody, anti-CEA antibody, anti-AFP antibody, anti-TSH antibody, anti-ferritin antibody, anti-CA19-9 antibody or other anti-tumor-related test antibody or antigen thereto
  • Serum protein-related test antibodies such as apolipoprotein antibodies, anti- ⁇ 2-microbrovulin antibodies, anti- ⁇ 1-microglobulin antibodies, anti-immunoglobulin antibodies, anti-CRP antibodies, anti-EpCAM antibodies, and antigens thereto; endocrine secretion such as anti-HCG antibodies Antibody for functional test or antigen thereto; antibody for drug analysis such as anti-digoxin antibody and anti-lidocaine antibody or the like
  • Ligand binding may be performed according to a conventional method, but is preferably performed by a covalent bond method.
  • the reactive functional group is a carboxy group and the ligand has an amino group, it may be bonded using a dehydrating condensing agent.
  • the ligand-bound solid phase carrier of the present invention can be widely used for in vitro diagnosis and research in the biochemical field.
  • the ligand-bound solid phase carriers of the invention are particularly suitable for use for immunoassays, for bioseparation (particularly cell separation) and for nucleic acid detection.
  • a method for detecting or separating a target substance in a sample of the present invention is characterized by using the ligand-bound solid phase carrier of the present invention.
  • the target substance may be any substance that binds to a ligand. Specifically, antigens; antibodies such as monoclonal antibodies and polyclonal antibodies; cells (normal cells, colon cancer cells, circulating cancer cells in the blood, etc.) Cells); nucleic acids such as DNA and RNA; bio-related substances such as proteins, peptides, amino acids, sugars, polysaccharides, lipids, and vitamins. Drugs that are drug targets, and small molecule compounds such as biotin.
  • the target substance may be labeled with a fluorescent substance or the like. The sample only needs to contain the target substance or may contain the target substance, and specifically, blood, plasma, serum, a buffer solution containing the target substance, and the like.
  • the detection or separation method of the present invention may be performed according to a conventional method except that the ligand-bound solid phase carrier of the present invention is used.
  • the step of bringing the sample containing the ligand-binding solid phase carrier of the present invention and the target substance into contact with each other (contacting step), and the ligand-binding solid phase carrier capturing the target substance using a magnet or the like The method including the process (separation process) which isolate
  • ⁇ Measurement of molecular weight of chain polymer> The molecular weight of the chain polymer was measured after the chain polymer was released from the particles by hydrolysis using an aqueous sodium hydroxide solution. That is, 1 g of the particles was dispersed in 4 g of an aqueous sodium hydroxide solution (1N, pH 14) and stirred at 25 ° C. for 3 hours to release the chain polymer from the particles. The particles were separated using magnetism, and the supernatant in which the chain polymer was dissolved was collected. Next, the chain polymer solution was neutralized by adding 1 M hydrochloric acid until the pH of the solution reached 7.
  • the weight of sodium chloride to be generated is calculated from the weight of the added 1M hydrochloric acid, and the neutralized solution is lyophilized to obtain sodium chloride as a powder.
  • a chain polymer containing was obtained. Further, the weight of the powder was measured for use in calculating the weight of the chain polymer.
  • particles were measured by gel permeation chromatography (GPC) under the following conditions using a TSKgel G3000PWXL column manufactured by Tosoh Corporation and a Chrom NAV chromatography data station program manufactured by JASCO Corporation. Mn and Mw of the chain polymer formed on the surface were measured.
  • the polymer density was calculated from the following formula from the weight of the chain polymer released from the particles, the number average molecular weight of the chain polymer, and the surface area of the particles.
  • [Density of chain polymer occupying surface of particles (lines / nm 2 )] [Number of chain polymers bonded to 1 g of particles (lines)] / [Total surface area per 1 g of particles (nm 2 )]
  • the method for calculating the number of chain polymers bonded to 1 g of particles and the total surface area of 1 g of particles is as follows.
  • the specific gravity of the particles in the formula ( ⁇ ) was calculated from the specific gravity of the polymer, the specific gravity of the magnetic material, and the ratio of the polymer to the magnetic material in the particles.
  • ( ⁇ ): Volume per particle ( ⁇ m 3 ) 4/3 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ volume average radius of particle ( ⁇ m) ⁇ 3
  • Reactive functional group content By measuring the content of the reactive functional group (carboxy group) contained in the chain polymer released from the particles using an electrical conductivity measurement method (Metrohm, 794 Basic Titrino), The content of the reactive functional group was determined.
  • (A): Weight of structural unit (2) per gram of particle (g) reactive functional group amount per 1 g of particle (mol) ⁇ molecular weight of structural unit (2) (g / mol)
  • (B): Weight of structural unit (1) per gram of particle (g) weight of chain polymer per gram of particle (g) ⁇ weight of structural unit (2) per gram of particle (g)
  • (C): n ⁇ weight (g) of structural unit (1) per 1 g of particle / molecular weight (g / mol) of structural unit (1) ⁇ / number of polymers per 1 g of particle (number)
  • D): m reactive functional group amount per 1 g of particles (mol) / number of polymers per 1 g of particles (pieces)
  • volume average particle diameter The volume average particle size of each particle was measured with a laser diffraction / scattered particle size distribution measuring apparatus (Beckman Coulter LS13 320).
  • 96 g of styrene and 4 g of divinylbenzene were emulsified with 400 g of a 0.1% by weight aqueous solution of sodium dodecyl sulfate, put in the reactor, stirred at 40 ° C. for 2 hours, and then heated to 75 ° C. For 8 hours. After cooling to room temperature, the particles taken out by centrifugation were washed with water and dried. These particles are core particles (number average particle size: 1.5 ⁇ m).
  • acetone is added to the oil-based magnetic fluid (“EXP series, EMG”, manufactured by Ferrotec Co., Ltd.) to precipitate and precipitate the particles, and then the particles are dried to be hydrophobized. Ferrite-based magnetic fine particles (average primary particle size: 0.01 ⁇ m) were obtained.
  • a 0.50 mass% aqueous solution of sodium dodecyl sulfate was put into a 500 mL separable flask, then 10 g of mother particles having the above magnetic layer were added, dispersed with a homogenizer, and heated to 60 ° C. to maintain the temperature. did.
  • MMA methyl methacrylate
  • TMP trimethylolpropane trimethacrylate
  • a pre-emulsion was obtained by adding 0.15 g of a 75% peroxide solution (“Perroyl 355-75 (S)”, manufactured by NOF Corporation) and dispersing it. The entire amount of this pre-emulsion was dropped into the 500 mL separable flask maintained at 60 ° C. over 1 hour and 20 minutes.
  • GMA glycidyl methacrylate
  • particle (A) After magnetic separation and redispersion were further performed several times, the particles were dispersed in a 0.10% by mass aqueous solution of sodium dodecyl sulfate. Fluorine X-ray analysis detected Br contained in the atom transfer radical polymerization initiation group (2-bromoisobutyryl group). Thus, magnetic particles having an atom transfer radical polymerization initiating group (2-bromoisobutyryl group) on the surface were obtained. This particle is referred to as particle (A).
  • particle (C) After magnetic separation and redispersion were further performed several times, the particles were dispersed in a 0.10% by mass aqueous solution of sodium dodecyl sulfate. Fluorine X-ray analysis detected Br contained in the atom transfer radical polymerization initiation group (2-bromoisobutyryl group). Thus, magnetic particles having an atom transfer radical polymerization initiating group (2-bromoisobutyryl group) on the surface were obtained. This particle (C).
  • Example 1 (Chain polymer elongation reaction (1)) A chain polymer elongation reaction was performed according to the following synthesis route.
  • the particles obtained above were dispersed in 6 mL of sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.8), and 0.5 g of 2-hydroxyethyl acrylamide (hereinafter referred to as “HEAA”) was added thereto.
  • 0.40 mL of a mixed aqueous solution of 0.05 mol / L tris (2-pyridylmethyl) amine and 0.05 mol / L copper (II) bromide was added.
  • 1.0 mL of a 0.2 mol / L aqueous solution of L-ascorbic acid was added, and the reaction was started after sealing. After stirring at 45 ° C. for 3 hours, the reaction was stopped by opening and exposing to air.
  • the particles were separated using magnetism, and unreacted monomers and catalysts were removed to obtain magnetic particles in which a block copolymer of CBMA and HEAA was bonded to the surface.
  • the volume average particle size was 3.0 ⁇ m.
  • the Mn, Mw, Mw / Mn of the block copolymer of CBMA and HEAA, and the polymer density of the block copolymer were measured. The measurement results are shown in Table 1.
  • Example 2 The same procedure as in Example 1 was performed except that the reaction time of the chain polymer extension reaction (2) for extending the chain polymer with HEAA was changed from 3 hours to 1 hour, and the hydroxyl group at the end of HEAA was a reactive functional group. Magnetic particles 2 converted to (carboxy group) were obtained. The volume average particle size was 3.0 ⁇ m. In addition, each measurement result other than the volume average particle diameter performed in the same manner as in Example 1 is shown in Table 1.
  • Example 3 The same procedure as in Example 1 was performed except that the reaction time of the chain polymer extension reaction (2) in which the chain polymer was extended with HEAA was changed from 3 hours to 30 minutes, and the hydroxyl group at the HEAA terminal was a reactive functional group. Magnetic particles 3 converted to (carboxy group) were obtained. The volume average particle size was 3.0 ⁇ m. In addition, each measurement result other than the volume average particle diameter performed in the same manner as in Example 1 is shown in Table 1.
  • Example 4 The same procedure as in Example 1 was performed except that the reaction time of the chain polymer extension reaction (2) for extending the chain polymer with HEAA was changed from 3 hours to 15 minutes, and the hydroxyl group at the HEAA terminal was a reactive functional group. The magnetic particle 4 converted into (carboxy group) was obtained. The volume average particle size was 3.0 ⁇ m. In addition, each measurement result other than the volume average particle diameter performed in the same manner as in Example 1 is shown in Table 1.
  • Example 5 2 g of particles (A) obtained in Synthesis Example 2 were dispersed in 6 mL of sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.8), and 0.5 g of CBMA, 0.5 g of HEAA, and 0.05 mol / L Tris ( 0.40 mL of a mixed aqueous solution of 2-pyridylmethyl) amine and 0.05 mol / L copper (II) bromide was added. Subsequently, 1.0 mL of a 0.2 mol / L aqueous solution of L-ascorbic acid was added, and the reaction was started after sealing. After stirring at 45 ° C. for 4 hours, the reaction was stopped by opening and exposing to air.
  • the particles were separated using magnetism, and unreacted monomers and catalysts were removed to obtain magnetic particles in which a random copolymer of CBMA and HEAA was bonded to the surface.
  • Mn, Mw, Mw / Mn of the random copolymer of CBMA and HEAA, and the polymer density of the random copolymer were measured.
  • the measurement results are shown in Table 1.
  • 1.5 g of the particles obtained above were dispersed in 8 mL of dimethyl sulfoxide (DMSO), and 7.2 mL of DMSO solution in which 1.5 g of succinic anhydride was dissolved and 0.3 mL of triethylamine were added to start the reaction. . After stirring at 25 ° C.
  • Example 6 The same procedure as in Example 5 was performed except that the amount of CBMA used was changed from 0.5 g to 0.8 g, and the amount of HEAA used was changed from 0.5 g to 0.2 g. Magnetic particles 6 converted into functional groups (carboxy groups) were obtained. The volume average particle size was 3.0 ⁇ m. The measurement results other than the volume average particle diameter obtained in the same manner as in Example 5 are shown in Table 1.
  • Example 7 Magnetic particle 7 in which the same operation as in Example 2 was performed except that the particle (A) was changed to the particle (B) obtained in Synthesis Example 3, and the hydroxyl group at the HEAA terminal was converted to a reactive functional group (carboxy group). Got.
  • the volume average particle size was 3.0 ⁇ m.
  • each measurement result other than the volume average particle diameter performed in the same manner as in Example 1 is shown in Table 1.
  • Example 8 Chain polymer chain extension reaction (1) 2 g of the particles (A) obtained in Synthesis Example 2 were dispersed in 6 mL of sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.8), and 2- (methacryloyloxy) ethyl] dimethyl- (3-sulfopropyl) ammonium hydroxy was added thereto.
  • 0.5 g of a mixed solution (hereinafter referred to as “SBMA”) and 0.40 mL of a mixed aqueous solution of 0.05 mol / L tris (2-pyridylmethyl) amine and 0.05 mol / L copper (II) bromide added.
  • the particles were separated using magnetism, and unreacted monomers and catalysts were removed to obtain magnetic particles having a block copolymer of SBMA and HEAA bound to the surface.
  • the volume average particle size was 3.0 ⁇ m.
  • the Mn, Mw, Mw / Mn of the block copolymer of SBMA and HEAA, and the polymer density of the block copolymer were measured. The measurement results are shown in Table 1.
  • Example 2 The same operation as in Example 2 was conducted except that CBMA was changed to dimethylaminoethyl methacrylate quaternized product (Light Ester DQ-100, manufactured by Kyoeisha Chemical Co., Ltd. (dimethylaminoethyl methacrylate quaternized with methyl chloride)).
  • the magnetic particle 10 in which the hydroxyl group at the end of HEAA was converted to a reactive functional group (carboxy group) was obtained.
  • the volume average particle size was 3.0 ⁇ m.
  • each measurement result other than the volume average particle diameter performed in the same manner as in Example 1 is shown in Table 1.
  • Example 3 The same operation as in Example 6 was carried out except that CBMA was changed to dimethylaminoethyl methacrylate quaternized product (light ester DQ-100 manufactured by Kyoeisha Chemical Co., Ltd. (dimethylaminoethyl methacrylate quaternized with methyl chloride)).
  • the magnetic particle 11 in which the hydroxyl group at the end of HEAA was converted to a reactive functional group (carboxy group) was obtained.
  • the volume average particle size was 3.0 ⁇ m.
  • the measurement results other than the volume average particle diameter obtained in the same manner as in Example 5 are shown in Table 1.
  • Test Example 4 (CLEIA) A 5 ⁇ L dispersion of antibody-bound particles obtained in Test Example 3 (corresponding to 50 ⁇ g of particles) is placed in a test tube, and a 200 ⁇ IU / mL TSH antigen solution (Lumipulse TSH manufactured by Fujirebio Inc.) to which 50 ⁇ L of fetal calf serum (FCS) is added. -III standard TSH solution) 50 ⁇ L was mixed and reacted at 25 ° C. for 10 minutes.
  • TSH antigen solution Lipulse TSH manufactured by Fujirebio Inc.
  • FCS fetal calf serum
  • the amount of chemiluminescence was measured as a signal.
  • a chemiluminescence measuring apparatus Liat LB9507 manufactured by Bertol Japan was used.
  • the chemiluminescence amount was measured as noise in the same manner except that a 0 ⁇ IU / mL TSH calibrator was used instead of the 200 ⁇ IU / mL TSH antigen solution.
  • a value S / N obtained by dividing the signal (S) by the noise (N) was calculated. The results are shown in Table 2.
  • Particles were separated using magnetism, the supernatant was removed, dispersed in 1 mL of MES buffer (100 mM, pH 5.0), and 5 ⁇ g of anti-EpCAM antibody was added. After incubation for 12 hours at room temperature, the particles were separated using magnetism and the supernatant was removed. The antibody-bound particles were obtained by washing 5 times with TBS-T (0.05 mass% Tween 20) buffer. The antibody-bound particles were washed 4 times with PBS ( ⁇ ) buffer, and then dispersed in 250 ⁇ L of PBS ( ⁇ ) buffer.
  • TBS-T 0.05 mass% Tween 20
  • PCR was performed by adding a PCR cocktail targeting ⁇ -globin, and the specific cell capture rate was calculated from the number of captured cells determined from the Ct value. The results are shown in Table 2.
  • the same operation as described above was performed except that the EpCAM antibody was not bound to the particles, and the nonspecific cell capture rate was calculated from the number of captured cells. The results are shown in Table 2.
  • the magnetic particles of Examples 1 to 8 had high water dispersibility, non-specific adsorption was suppressed, and the ligand was easy to bind to the reactive functional group.
  • the S / N (signal / noise) ratio was high, and the antigen could be detected with high sensitivity and low noise.
  • the magnetic particles of Examples 1 to 8 were able to specifically capture target cells at a high rate and could suppress nonspecific adsorption.

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Abstract

　高い水分散性を有し、リガンドが反応性官能基に結合しやすく、非特異吸着が抑制されており、リガンドを結合して用いた場合に高感度且つ低ノイズで標的物質の検出等を行うことができる固相担体を提供すること。　下記式（１）で表される構造単位と下記式（２）で表される構造単位とを含むポリマーが結合してなる固相担体。〔式（１）中、　Ｒ1は、水素原子又はメチル基を示し、　Ｒ2は、双性イオン構造を有する有機基を示す。〕〔式（２）中、　Ｒ3は、水素原子又はメチル基を示し、　Ｒ4は、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ6－＊（Ｒ6は、水素原子又はメチル基を示し、＊は、式（２）中のＲ5と結合する位置を示す）又はフェニレン基を示し、　Ｒ4が－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊である場合、Ｒ5は、水素原子、又は反応性官能基を有する有機基を示し、Ｒ4が－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ6－＊又はフェニレン基である場合、Ｒ5は、反応性官能基を有する有機基を示す。　但し、Ｒ5は、双性イオン構造を有する有機基でない。〕

Description

固相担体、リガンド結合固相担体、標的物質の検出又は分離方法、及び前記固相担体の製造方法
　本発明は、固相担体、リガンド結合固相担体、標的物質の検出又は分離方法、及び前記固相担体の製造方法に関する。
　タンパク質、核酸、細胞等の標的物質を血液等の試料から検出・分離することを目的として固相担体が利用されている。固相担体を用いた検出・分離法としては、固相担体にリガンドを固定し、これに試料を接触させることによって標的物質をリガンドと反応させる方法が一般的であるが、上記接触の際に、試料中の標的物質や不純物が、リガンドではなく固相担体の表面に非特異的に吸着し、これがノイズとなる場合がある。
　そのため、上記非特異吸着を抑制することを目的として、磁気バイオセンサーの金膜チップ表面上に原子移動ラジカル重合開始基（ＡＴＲＰ開始基）を一定量導入し、斯かるＡＴＲＰ開始基を起点として特定のカルボキシベタインモノマーを重合させることで、ポリマーブラシを形成させる技術が提案されている（特許文献１）。
　しかしながら、上記ポリマーブラシを備えた金膜チップはリガンドが結合しにくく、標的物質の捕捉が不充分となり、標的物質のシグナルが検出されにくい場合がある。
　一方、臨床検査の酵素免疫測定法の診断薬や、細胞治療をはじめとした細胞分離、核酸抽出等に用いる固相担体として磁性粒子が近年注目されている。磁性粒子は検体試料等からの分離が比較的容易であるものの、水中で凝集しやすい傾向があるため、磁性粒子の水分散性を改善する技術の開発が求められている。
　また、疾病の早期発見等の要求があるため、診断薬に用いる磁性粒子には標的物質を充分に捕捉できることも求められる。また、細胞分離に用いる磁性粒子においても標的細胞のみを特異的に捕捉できることが要求される。斯様な背景の下、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリルアミド）・ポリ（メタクリル酸）ブロックコポリマー等をＡＴＲＰにより表面に結合させることでポリマーブラシを形成させた磁性粒子が提案されているが（特許文献２）、当該磁性粒子は、試料中の標的物質や不純物が粒子表面に非特異的に吸着しやすく、この点で改善の余地があった。
特開２００９－６９１４１号公報 特表２００９－５４２８６２号公報
　本発明が解決しようとする課題は、高い水分散性を有し、リガンドが反応性官能基に結合しやすく、非特異吸着が抑制されており、リガンドを結合して用いた場合に高感度且つ低ノイズで標的物質の検出等を行うことができる固相担体を提供することにある。
　そこで、本発明者は鋭意検討した結果、双性イオン構造を有する特定の構造単位と、反応性官能基を有する特定の構造単位とを含むポリマーが結合してなる固相担体が、高い水分散性を有し、リガンドが反応性官能基に結合しやすく、非特異吸着が抑制されており、リガンドを結合して用いた場合に高感度且つ低ノイズで標的物質の検出等を行うことができることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、＜１＞下記式（１）で表される構造単位（以下、構造単位（１）とも称する）と下記式（２）で表される構造単位（以下、構造単位（２）とも称する）とを含むポリマーが結合してなる固相担体を提供するものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
〔式（１）中、
　Ｒ1は、水素原子又はメチル基を示し、
　Ｒ2は、双性イオン構造を有する有機基を示す。〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
〔式（２）中、
　Ｒ3は、水素原子又はメチル基を示し、
　Ｒ4は、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ6－＊（Ｒ6は、水素原子又はメチル基を示し、＊は、式（２）中のＲ5と結合する位置を示す）又はフェニレン基を示し、
　Ｒ4が－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊である場合、Ｒ5は、水素原子、又は反応性官能基を有する有機基を示し、Ｒ4が－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ6－＊又はフェニレン基である場合、Ｒ5は、反応性官能基を有する有機基を示す。
　但し、Ｒ5は、双性イオン構造を有する有機基でない。〕
　また、本発明は、＜２＞上記＜１＞の固相担体にリガンドを結合させてなる、リガンド結合固相担体を提供するものである。
　さらに、本発明は、＜３＞上記＜２＞のリガンド結合固相担体を用いることを特徴とする、試料中の標的物質を検出又は分離する方法を提供するものである。
　さらに、本発明は、＜４＞構造単位（１）と構造単位（２）とを含むポリマーが結合してなる固相担体の製造方法であって、
　（工程１）重合開始基を有する担体を準備する工程と、
　（工程２）前記重合開始基を起点としてモノマーを重合させる工程を含むことを特徴とする、製造方法を提供するものである。
　本発明の固相担体は、高い水分散性を有し、リガンドが反応性官能基に結合しやすく、非特異吸着が抑制されており、リガンドを結合して用いた場合に高感度且つ低ノイズで標的物質の検出等を行うことができる。
　また、本発明の製造方法によれば、上記本発明の固相担体を簡便に製造できる。
＜固相担体＞
　本発明の固相担体は、下記式（１）で表される構造単位と下記式（２）で表される構造単位とを含むポリマーが結合してなるものである。まず、本発明の固相担体について詳細に説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
〔式（１）中、
　Ｒ1は、水素原子又はメチル基を示し、
　Ｒ2は、双性イオン構造を有する有機基を示す。〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
〔式（２）中、
　Ｒ3は、水素原子又はメチル基を示し、
　Ｒ4は、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ6－＊（Ｒ6は、水素原子又はメチル基を示し、＊は、式（２）中のＲ5と結合する位置を示す）又はフェニレン基を示し、
　Ｒ4が－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊である場合、Ｒ5は、水素原子、又は反応性官能基を有する有機基を示し、Ｒ4が－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ6－＊又はフェニレン基である場合、Ｒ5は、反応性官能基を有する有機基を示す。
　但し、Ｒ5は、双性イオン構造を有する有機基でない。〕
　（構造単位（１））
　式（１）中、Ｒ2は、双性イオン構造を有する有機基を示す。斯かる有機基は、カチオン性官能基とアニオン性官能基とを有する有機基を意味する。双性イオン構造を有する有機基としては、第４級アンモニウム塩型カチオン性官能基とアニオン性官能基とを有する有機基が好ましく、第４級アンモニウム塩型カチオン性官能基と、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ-、－ＳＯ3 -及び－Ｏ－（Ｏ＝Ｐ－Ｏ-）－Ｏ－から選ばれる１価又は２価のアニオン性官能基とを有する有機基がより好ましい。中でも、Ｒ2としては、非特異吸着を抑制する観点から、下記式（３）又は（４）で表される有機基がより好ましく、モノマー合成が容易である観点等から、下記式（３）で表される有機基が特に好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
〔式（３）中、
　Ｒ7は、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ13－＊（Ｒ13は、水素原子又はメチル基を示し、＊は、式（３）中のＲ8と結合する位置を示す）又はフェニレン基を示し、
　Ｒ8及びＲ9は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１～１０の２価の有機基を示し、
　Ｒ10は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ-又は－ＳＯ3 -を示し、
　Ｒ11及びＲ12は、それぞれ独立して、メチル基又はエチル基を示す。〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
〔式（４）中、
　Ｒ14は、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ20－＊（Ｒ20は、水素原子又はメチル基を示し、＊は、式（４）中のＲ15と結合する位置を示す）又はフェニレン基を示し、
　Ｒ15及びＲ16は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１～１０の２価の有機基を示し、
　Ｒ17、Ｒ18及びＲ19は、それぞれ独立して、メチル基又はエチル基を示す。〕
　式（３）中、Ｒ7としては、水との親和性を高め、非特異吸着を抑制する観点から、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ13－＊が好ましく、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊がより好ましい。
　Ｒ10は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ-又は－ＳＯ3 -を示すが、検出の高感度化と低ノイズ化を両立する観点から、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ-が好ましい。
　Ｒ13は、水素原子又はメチル基を示すが、水素原子が好ましい。
　式（３）中のＲ8及びＲ9、式（４）中のＲ15及びＲ16は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１～１０の２価の有機基を示すが、非特異吸着を抑制する観点から、炭素数１～１０の２価の有機基が好ましく、炭素数１～１０の２価の炭化水素基、炭素数２～１０の２価の炭化水素基の炭素－炭素原子間にエーテル結合、イミノ基、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基がより好ましく、炭素数１～１０の２価の炭化水素基が特に好ましい。
　２価の有機基が２価の炭化水素基である場合、その炭素数としては、１～８が好ましく、１～６がより好ましく、１～４がさらに好ましく、１～３が特に好ましい。一方、２価の有機基が２価の炭化水素基の炭素－炭素原子間にエーテル結合、イミノ基、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基である場合、斯かる基における２価の炭化水素基の炭素数としては、２～８が好ましく、２～６がより好ましく、２～４がさらに好ましく、２又は３が特に好ましい。
　Ｒ8、Ｒ9、Ｒ15及びＲ16における「２価の炭化水素基」としては、２価の脂肪族炭化水素基が好ましい。当該２価の脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
　上記２価の脂肪族炭化水素基としては、アルカンジイル基が好ましく、具体的には、メタン－１，１－ジイル基、エタン－１，１－ジイル基、エタン－１，２－ジイル基、プロパン－１，１－ジイル基、プロパン－１，２－ジイル基、プロパン－１，３－ジイル基、プロパン－２，２－ジイル基、ブタン－１，２－ジイル基、ブタン－１，３－ジイル基、ブタン－１，４－ジイル基、ペンタン－１，４－ジイル基、ペンタン－１，５－ジイル基、ヘキサン－１，５－ジイル基、ヘキサン－１，６－ジイル基等が挙げられる。
　式（３）中のＲ11及びＲ12、式（４）中のＲ17、Ｒ18及びＲ19としては、メチル基が好ましい。
　式（４）中、Ｒ14としては、水との親和性を高め、非特異吸着を抑制する観点から、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ20－＊が好ましく、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊がより好ましい。Ｒ20は、水素原子又はメチル基を示すが、水素原子が好ましい。
　（構造単位（２））
　式（２）中、Ｒ4としては、水との親和性を高め、非特異吸着を抑制する観点から、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ6－＊が好ましい。Ｒ6は、水素原子又はメチル基を示すが、水素原子が好ましい。
　また、Ｒ4が－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊である場合、Ｒ5は、水素原子、又は反応性官能基を有する有機基を示し、Ｒ4が－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ6－＊又はフェニレン基である場合、Ｒ5は、反応性官能基を有する有機基を示す。Ｒ4が、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊であり、且つＲ5が、水素原子である場合は、Ｒ4とＲ5の組み合わせが反応性官能基（カルボキシ基）となる。但し、Ｒ5は、Ｒ2で示されるような双性イオン構造を有する有機基ではなく、本明細書において、Ｒ5における反応性官能基は、双性イオン構造を含まない概念である。
　反応性官能基としては、カルボキシ基、トシル基、アミノ基、エポキシ基、アシル基、アジド基が挙げられ、上記有機基は、これらのうち１種を有していてもよく、２種以上を有していてもよい。これらの中でも、結合したリガンドが外れにくくする観点や、リガンドとしてタンパク質や核酸等の分子を使用する場合に、リガンドが元来有している官能基を使用して固相担体と結合できる点から、カルボキシ基、トシル基、アミノ基、エポキシ基が好ましく、固相担体に対しリガンドを簡便且つ迅速に結合させやすい点等から、カルボキシ基がより好ましい。
　また、構造単位（２）に含まれる反応性官能基の含有量は、リガンド結合量の観点や検出の高感度化と低ノイズ化を両立する観点、細胞分離性能の観点からは、固相担体の固形分１ｇあたり、好ましくは１μｍｏｌ以上、より好ましくは５μｍｏｌ以上、さらに好ましくは１０μｍｏｌ以上、さらに好ましくは１５μｍｏｌ以上、さらに好ましくは２０μｍｏｌ以上、さらに好ましくは２５μｍｏｌ以上、特に好ましくは３０μｍｏｌ以上であり、また、非特異吸着を抑制する観点や検出の高感度化と低ノイズ化を両立する観点からは、好ましくは３００μｍｏｌ以下、より好ましくは２００μｍｏｌ以下、さらに好ましくは１９０μｍｏｌ以下、特に好ましくは１８０μｍｏｌ以下である。
　反応性官能基の含有量は、例えば、反応性官能基がカルボキシ基の場合、電気伝導度測定法等により測定可能であり、具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い測定できる。また、反応性官能基がトシル基の場合は、固相担体に導入されたトシル基の紫外可視光吸収を測定するなどして求めることができ、反応性官能基がアミノ基の場合は、アミノ基にＮ－スクシイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナートを反応させた後、還元し、遊離のチオピリジル基の吸光度を測定するなどして求めることができる。
　また、Ｒ5で示される反応性官能基を有する有機基としては、下記式（５）で表される有機基が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
〔式（５）中、
　Ｒ21は、２価の有機基を示し、
　Ｙは、反応性官能基を示す。〕
　Ｒ21で示される２価の有機基としては、２価の炭化水素基、炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素－炭素原子間にエーテル結合、イミノ基、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基が挙げられる。
　２価の有機基が２価の炭化水素基である場合、その炭素数としては、１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、１～６が特に好ましい。一方、２価の有機基が炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素－炭素原子間にエーテル結合、イミノ基、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基である場合、斯かる基における２価の炭化水素基の炭素数としては、２～１０が好ましく、２～８がより好ましく、２～６が特に好ましい。
　Ｒ21における「２価の炭化水素基」としては、２価の脂肪族炭化水素基が好ましい。当該２価の脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
　上記２価の脂肪族炭化水素基としては、アルカンジイル基が好ましく、具体的には、メタン－１，１－ジイル基、エタン－１，１－ジイル基、エタン－１，２－ジイル基、プロパン－１，１－ジイル基、プロパン－１，２－ジイル基、プロパン－１，３－ジイル基、プロパン－２，２－ジイル基、ブタン－１，２－ジイル基、ブタン－１，３－ジイル基、ブタン－１，４－ジイル基、ペンタン－１，４－ジイル基、ペンタン－１，５－ジイル基、ヘキサン－１，５－ジイル基、ヘキサン－１，６－ジイル基等が挙げられる。
　また、炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素－炭素原子間にエーテル結合、イミノ基、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基としては、簡便にポリマーが得られる観点等から、炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素－炭素原子間にエステル結合を有する基が好ましく、－Ｒa－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－Ｒb－＊で表される２価の基がより好ましい（Ｒa及びＲbは、それぞれ独立して、炭素数２～４のアルカンジイル基を示し、＊は、式（５）中のＹとの結合位置を示す）。アルカンジイル基の炭素数としては、２又は３が好ましく、２がより好ましい。アルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、例えば、エタン－１，２－ジイル基、プロパン－１，２－ジイル基、プロパン－１，３－ジイル基が挙げられる。
　Ｙで示される反応性官能基としては、上記と同様に、カルボキシ基、トシル基、アミノ基、エポキシ基、アシル基、アジド基が挙げられる。中でも、結合したリガンドが外れにくくする観点や、リガンドとしてタンパク質や核酸等の分子を使用する場合に、リガンドが元来有している官能基を使用して固相担体と結合できる点から、カルボキシ基、トシル基、アミノ基、エポキシ基が好ましく、固相担体に対しリガンドを簡便且つ迅速に結合させやすい点等から、カルボキシ基がより好ましい。
　上記Ｒ4とＲ5との組み合わせとしては、Ｒ4が、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊であり、Ｒ5が、水素原子、又は反応性官能基を有する有機基である組み合わせ、Ｒ4が、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ6－＊であり、Ｒ5が、反応性官能基を有する有機基である組み合わせが好ましく、Ｒ4が、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊又は－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ6－＊であり、Ｒ5が、反応性官能基を有する有機基である組み合わせがより好ましい。
　また、ポリマーは、上記構造単位（１）及び（２）以外の構造単位（以下、他の構造単位とも称する）を有していてもよい。他の構造単位としては、（メタ）アクリレート類、スチレン類、（メタ）アクリロニトリル類、酢酸ビニル等に由来するものが挙げられる。
　構造単位（１）及び（２）は、固相担体に結合している同一のポリマーに含まれていてもよく、また、異なるポリマーに含まれていてもよいが、同一のポリマーに含まれているのが好ましい。
　また、ポリマー１本あたりの構造単位（１）の平均重合度ｎは、好ましくは１以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは５以上、特に好ましくは１０以上であり、また、リガンド結合量の観点や検出の高感度化と低ノイズ化を両立する観点、細胞分離性能の観点からは、好ましくは５００以下、より好ましくは３００以下、さらに好ましくは２００以下、さらに好ましくは１００以下、さらに好ましくは７０以下、特に好ましくは６２以下である。
　ポリマー１本あたりの構造単位（２）の平均重合度ｍは、リガンド結合量の観点からは、好ましくは１以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは５以上、特に好ましくは１０以上であり、また、非特異吸着を抑制する観点や検出の高感度化と低ノイズ化を両立する観点からは、好ましくは５００以下、より好ましくは３００以下、さらに好ましくは２００以下、さらに好ましくは１００以下、さらに好ましくは７０以下、特に好ましくは６５以下である。
　また、平均重合度ｎ及び平均重合度ｍから算出される重合割合〔ｍ／（ｍ＋ｎ）〕は、非特異吸着を抑制する観点及びリガンド結合量の観点から、好ましくは０．０１以上、より好ましくは０．０３以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１以上、特に好ましくは０．１５以上であり、また、非特異吸着を抑制する観点及びリガンド結合量の観点から、好ましくは０．７５以下、より好ましくは０．７４以下、特に好ましくは０．７以下である。ポリマーがブロックポリマーである場合、非特異吸着を抑制する観点、リガンド結合量の観点及び検出の高感度化と低ノイズ化を両立させ、特に診断薬用途に適したものとする観点からは、さらに好ましくは０．１～０．５、さらに好ましくは０．１～０．３５、特に好ましくは０．１５～０．３である。一方、ポリマーがランダムポリマーである場合、検出の高感度化と低ノイズ化を両立させ、特に診断薬用途に適したものとする観点からは、さらに好ましくは０．２～０．７、特に好ましくは０．３５～０．７である。
　平均重合度ｎ、ｍは、ポリマー１本あたりの構造単位（１）、（２）の平均重合度をそれぞれ意味し、Ｘ線光電子分光分析や、固相担体１ｇあたりに結合したポリマーの重量、ポリマーの分子量及び反応性官能基量等から算出可能である。具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い測定できる。
　また、ポリマーとしては、鎖状ポリマーが好ましい。鎖状ポリマーとは、線状の分子構造をもつポリマーをいい、長い直鎖状の主鎖とそれに結合した比較的短い側鎖とから構成される構造をもつポリマーを含む概念である。
　また、ポリマーとしては、ビニルポリマーが好ましい。また、ポリマー中の構造単位の配列の態様は特に限定されず、ランダム共重合体、ブロック共重合体、ランダム共重合ユニットとブロック共重合ユニットを有する共重合体、交互共重合体のいずれであってもよいが、ポリマーを簡便に形成できる点等から、ランダム共重合体、ブロック共重合体が好ましい。ポリマーがランダム共重合体である場合、細胞等の非特異吸着が抑制されやすくなる。また、ポリマーがブロック共重合体である場合、抗体等のリガンドが結合しやすくなり、抗原抗体反応を利用した検出における高感度化と低ノイズ化を両立しやすくなる。斯様な効果が得られる理由は必ずしも明らかではないが、ブロック共重合体の場合は、反応性官能基が局所的に存在するため抗体が結合しやすく、サンドイッチ構造（一次抗体－抗原―二次抗体）等の高次構造をとりやすくなるためであると、本発明者は推察する。
　また、ポリマーがブロック共重合体である場合、このブロック共重合体は、構造単位（１）の繰り返しから構成される第１のブロックと、構造単位（２）の繰り返しから構成される第２のブロックとを含むものである。斯様なブロック共重合体としては、リガンドをさらに結合しやすくする観点や検出の高感度化と低ノイズ化を両立させる観点から、下記式（６）で表されるブロック共重合体が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
〔式（６）中、＊＊は、固相担体側の結合位置を示し、その他の記号は前記と同義である。〕
　また、ポリマーの片方の末端は、固相担体に結合していれば特に限定されないが、重合開始基の残基を含む２価の連結基を介して固相担体に結合しているのが好ましい。重合開始基としては、リビング重合可能な重合開始基が好ましく、リビングラジカル重合開始基がより好ましく、原子移動ラジカル重合開始基、可逆的付加開裂連鎖移動重合開始基がさらに好ましく、原子移動ラジカル重合開始基が特に好ましい。原子移動ラジカル重合開始基の残基を含む２価の連結基としては、下記式（７－１）又は（７－２）で表される２価の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
〔上記式中、
　Ｒ25及びＲ29は、－Ｏ－又は－ＮＨ－を示し、
　Ｒ26及びＲ30は、それぞれ独立して、単結合又はフェニレン基を示し、
　Ｒ27及びＲ28は、それぞれ独立して、水素原子又はアルキル基を示し、
　＊＊は、ポリマーの末端と結合する位置を示す。〕
　Ｒ25及びＲ29としては、－Ｏ－が好ましく、Ｒ26及びＲ30としては、単結合が好ましく、Ｒ27及びＲ28としては、アルキル基が好ましい。
　Ｒ27及びＲ28で示されるアルキル基の炭素数としては、１～８が好ましく、１～４がより好ましく、１又は２が特に好ましい。アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等が挙げられる。
　一方、ポリマーの他方の末端は特に限定されないが、ハロゲン原子が好ましい。ハロゲン原子としては、臭素原子、塩素原子、フッ素原子等が挙げられる。
　ポリマーは固相担体表面上でポリマーブラシを形成しているのが好ましい。本発明の固相担体の表面に対して上記ポリマーが占有する密度は、非特異吸着を抑制する観点やリガンド結合量の観点、検出の高感度化と低ノイズ化を両立させる観点から、好ましくは０．０１本／ｎｍ2以上、より好ましくは０．０５本／ｎｍ2以上、さらに好ましくは０．１本／ｎｍ2以上、さらに好ましくは０．３本／ｎｍ2以上、さらに好ましくは０．４本／ｎｍ2以上、さらに好ましくは０．５本／ｎｍ2以上、さらに好ましくは０．６本／ｎｍ2以上、特に好ましくは０．７本／ｎｍ2以上であり、また、ポリマーブラシの形成が簡便な点で、好ましくは２本／ｎｍ2以下、より好ましくは１．６本／ｎｍ2以下、さらに好ましくは１．２本／ｎｍ2以下である。
　上記ポリマーの密度は、例えば、下記式で算出可能である。具体的には、加水分解等により固相担体からポリマーを遊離させ、後述する実施例に記載の方法に従い測定できる。
　ポリマーの密度（本／ｎｍ2）＝担体１ｇに結合したポリマーの本数（本）／担体１ｇの総表面積（ｎｍ2）
　また、ポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）としては、１，０００～１００，０００が好ましく、３，０００～５０，０００がより好ましく、５，０００～３０，０００がさらに好ましい。
　また、ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）としては、１，０００～１００，０００が好ましく、３，０００～５０，０００がより好ましく、５，０００～３０，０００が特に好ましい。
　また、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）としては、非特異吸着の抑制及び固相担体に結合されたリガンドの活性を高める観点から、１．０～２．５が好ましく、１．０～２．０がより好ましく、１．０～１．５がさらに好ましい。
　なお、数平均分子量、重量平均分子量は、加水分解等により固相担体からポリマーを遊離させ、ゲル浸透クロマトグラフィーで測定したポリエチレングリコール換算の平均分子量を意味する。例えば、後述する実施例に記載のような方法で反応性官能基導入前のポリマーの分子量を測定しておき、斯かる分子量と、反応性官能基が導入される構造単位のモル数と、反応性官能基の導入に用いる化合物の構造から計算するなどして算出可能である。
　本発明の固相担体を構成する上記ポリマー以外の部分は、有機物でも金属や金属酸化物等の無機物でもよく特に限定されないが、本発明の固相担体は、上記ポリマーの他に樹脂を含むものが好ましい。樹脂としては、アガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類で構成される天然高分子でもよく、合成高分子でもよい。
　また、本発明の固相担体の形態は特に限定されるものではなく、粒子、モノリス、膜、繊維、チップ等のいずれでもよいが、標的物質の検出又は分離の容易性の観点から、粒子が好ましく、磁性粒子がより好ましい。
　本明細書において「磁性粒子」とは、磁性体を有する粒子を意味する。本発明の固相担体は、磁性粒子の形態でも高い水分散性を有する。また、磁性粒子とした場合には、遠心分離器等を用いずに磁石等を用いて分離することができるため、試料からの固相担体の分離を簡素化又は自動化することができる。
　また、磁性体は、強磁性、常磁性、超常磁性のいずれであってもよいが、磁場による分離と磁場を取り除いた後の再分散を容易にする観点から、超常磁性であることが好ましい。磁性体としては、フェライト、酸化鉄、鉄、酸化マンガン、マンガン、酸化ニッケル、ニッケル、酸化コバルト、コバルト等の金属、又は合金が挙げられる。
　また、磁性粒子としては、具体的には、以下の（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかの粒子に、上記ポリマーを結合してなるものが挙げられる。好ましくは多孔質又は非多孔質の磁性ポリマー粒子である。
　（ｉ）樹脂等の非磁性体を含む連続相中に磁性体微粒子が分散している粒子
　（ｉｉ）磁性体微粒子の２次凝集体をコアとし、樹脂等の非磁性体をシェルとする粒子
　（ｉｉｉ）樹脂等の非磁性体で構成される核粒子と、該核粒子の表面に設けられた磁性体微粒子を含む磁性体層（２次凝集体層）とを有する母粒子をコアとし、該母粒子の最外層に、樹脂等の非磁性体層がシェル（以下、最外層シェルとも称する）として設けられた粒子
　（ｉｖ）粒子の最外層に樹脂等の非磁性体層がシェルとして設けられていてもよい、樹脂やシリカ等からなる多孔質粒子の孔内に磁性体微粒子が分散している粒子
　なお、（ｉ）～（ｉｖ）の粒子はいずれも公知であり、常法に従い製造可能である。
　上記（ｉｉｉ）の核粒子及び（ｉｖ）の多孔質粒子における樹脂としては、単官能性モノマー及び架橋性モノマーから選ばれる１種又は２種以上に由来する樹脂が挙げられる。
　上記単官能性モノマーとしては、例えば、スチレン、α－メチルスチレン、ハロゲン化スチレン等の単官能性芳香族ビニル系モノマー；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレート等の単官能性（メタ）アクリレート系モノマーが挙げられる。
　上記架橋性モノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン等の多官能性芳香族ビニル系モノマー；エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）メタクリレート、アリル（メタ）アクリレート等の多官能性（メタ）アクリレート系モノマー；ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフィン等が挙げられる。
　また、上記（ｉ）及び（ｉｉ）における樹脂並びに上記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の最外層シェルにおける樹脂としては、グリシジル基、アミノ基及び水酸基から選ばれる１種又は２種以上の官能基を有している樹脂が好ましい。上記官能基は、樹脂への化学修飾により導入してもよいし、上記官能基を有するモノマー１種又は２種以上を少なくとも含むモノマー組成の重合により導入してもよい。上記化学修飾としては、例えばグリシジル基の加水分解による水酸基の生成や、ニトロ基の還元によるアミノ基の生成が挙げられる。上記官能基を有するモノマー組成としては、グリシジル基含有モノマーを少なくとも含むモノマー組成がより好ましい（以下、上記最外層シェルにおける樹脂が、グリシジル基含有モノマーを少なくとも含むモノマー組成により形成された樹脂である粒子を、グリシジル基含有磁性粒子とも称する）。なお、上記単官能性モノマー及び架橋性モノマーから選ばれる１種又は２種以上をさらに含んでいてもよい。
　グリシジル基含有モノマーとしては、グリシジル（メタ）アクリレート、アリルグリシジルエーテル等が挙げられる。アミノ基含有モノマーとしては、２－アミノエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。水酸基含有モノマーとしては、１，４－シクロヘキサンジメタノールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
　また、本発明の固相担体が粒子の場合の平均粒径（体積平均粒径）は、好ましくは０．１～５００μｍであり、より好ましくは０．２～５０μｍであり、さらに好ましくは０．３～１０μｍである。斯様な範囲とすることにより、固相担体が磁性粒子である場合に集磁速度が速くなりハンドリング性が改善され、また、リガンド結合量が大きくなり、検出感度等が良好になる。また、平均粒径の変動係数は、２０％以下程度であればよい。
　また、比表面積は、１．０～２．０ｍ2／ｇ程度であればよい。
　なお、上記平均粒径及び比表面積は、レーザー回析・散乱粒子径分布測定等により測定できる。
＜固相担体の製造方法＞
　本発明の固相担体は常法を適宜組み合わせて製造することができるが、本発明の固相担体の製造方法としては、固相担体の表面に対するポリマーが占有する密度を高密度化しさらに非特異吸着が抑制されたものとする観点や、分子量分布の狭いポリマーを固相担体に結合しさらに非特異吸着が抑制されたものとする観点、固相担体に結合するリガンドの働きを高める観点等から、（工程１）重合開始基を有する担体（以下、重合開始基含有担体とも称する）を準備する工程と、（工程２）前記重合開始基を起点としてモノマーを重合させる工程を含む方法が好ましい。
　上記製造方法としては、具体的には、以下の方法＜ＰＲ－１＞及び＜ＰＲ－２＞が挙げられる。以下、これら方法について、構造単位（２）に含まれる反応性官能基がカルボキシ基、アミノ基又はトシル基である場合を例に挙げて説明する。
　＜ＰＲ－１＞（工程１）重合開始基含有担体を準備し、（工程２－１－１）構造単位（１）を構成するモノマー（１１）と、カルボキシ基、アミノ基又はトシル基を導入可能な官能基（例えば、水酸基、エポキシ基、エステル基、アミノ基、カルボン酸保護基等）を有するモノマー（１２）とを、前記重合開始基を起点として重合させ、（工程２－１－２）固相担体に導入されたポリマー（１４）に、付加反応、置換反応、縮合反応又は脱保護反応によってカルボキシ基、アミノ基又はトシル基を導入する方法。
　＜ＰＲ－２＞（工程１）重合開始基含有担体を準備し、（工程２－２－１）カルボキシ基、アミノ基又はトシル基を導入可能な官能基を有するモノマー（１２）に、付加反応、置換反応、縮合反応又は脱保護反応によってカルボキシ基、アミノ基又はトシル基を導入して構造単位（２）を構成するモノマー（１３）を得て、（工程２－２－２）このモノマー（１３）とモノマー（１１）とを、前記重合開始基を起点として重合させる方法。なお、カルボキシ基、アミノ基又はトシル基を有するモノマーを使用する際は、（工程２－２－１）を行わずに製造できる。カルボキシ基、アミノ基又はトシル基を有するモノマーとしては、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸塩、アミノエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
　（工程１）
　重合開始基含有担体は、市販品を用いても合成して用いてもよい。例えば、水酸基、アミノ基、エポキシ基及びカルボキシ基から選ばれる１種又は２種以上（以下、これを総称して水酸基等とも称する）を有する原料担体（以下、原料担体とも称する）に、重合開始基を有する化合物を接触させ、上記水酸基等に含まれる水素原子を重合開始基に変換することで得ることができる（以下、この反応を重合開始基導入反応とも称する）。なお、上記原料担体のうち、水酸基を有する原料担体は、例えば、上記グリシジル基含有磁性粒子と無機酸、有機酸等の酸とを接触させ、グリシジル基を開環するなどして得ることができる。
　また、重合開始基含有担体は、重合開始基を有するモノマーを含むモノマー組成を重合しても得ることもできる。重合開始基を有するモノマーとしては、２－（２－ブロモイソブチリルオキシ）エチルメタクリレート等が挙げられる。
　上記重合開始基を有する化合物としては、リビング重合可能な重合開始基を有する化合物が好ましく、リビングラジカル重合開始基を有する化合物がより好ましく、原子移動ラジカル重合開始基を有する化合物、可逆的付加開裂連鎖移動重合開始基を有する化合物がさらに好ましく、原子移動ラジカル重合開始基を有する化合物が特に好ましい。原子移動ラジカル重合開始基を有する化合物としては、例えば、２－ブロモイソブチリルブロミド、４－（ブロモメチル）安息香酸、２－ブロモイソ酪酸エチル、２－ブロモプロピオニルブロミド、トシルクロリド等が挙げられる。
　重合開始基導入反応において、重合開始基を有する化合物の合計使用量は、原料担体に対し、通常０．００１～１００質量倍程度であり、好ましくは０．０１～５０質量倍程度である。
　重合開始基導入反応は、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン等の塩基性触媒存在下で行うのが好ましい。なお、これら塩基性触媒のうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。
　塩基性触媒の合計使用量は、重合開始基を有する化合物に対し、通常１～１０モル当量程度であり、好ましくは１～５モル当量程度である。
　また、重合開始基導入反応は、溶媒存在下で行うのが好ましい。溶媒としては、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、１，３－ジオキサン等のエーテル系溶媒；ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等のプロトン性溶媒が挙げられ、これら溶媒は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
　また、重合開始基導入反応の反応時間は、通常３０分～２４時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよい。
　（工程２－１－１）
　工程２－１－１における重合反応の重合法は、重合開始基の種類に応じて選択すればよいが、目的物を簡便且つ容易に得る観点から、リビング重合が好ましく、リビングラジカル重合がより好ましく、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ重合）、可逆的付加開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ重合）がさらに好ましく、原子移動ラジカル重合が特に好ましい。原子移動ラジカル重合で重合させることにより、幅広い種類の担体にポリマーを簡便に結合させることができ、しかも、生体適合性や高圧縮弾性、低摩擦特性、サイズ排除特性が、得られる固相担体に付与され、且つ固相担体の表面に対するポリマーが占有する密度を高密度化されるため非特異吸着しにくくなる。
　なお、モノマー（１１）を重合させた後に、形成されたポリマーの末端の重合開始基を起点としてモノマー（１２）を重合させること、或いはモノマー（１２）を重合させた後に、形成されたポリマー末端の重合開始基を起点としてモノマー（１１）を重合させることにより、固相担体にブロック共重合体を導入することができる。
　モノマー（１１）としては、［２－（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］（カルボキシラトメチル）ジメチルアミニウム、［２－（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］（カルボキシラトエチル）ジメチルアミニウム、［２－（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］（カルボキシラトプロピル）ジメチルアミニウム、［２－（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］ジメチル－（３－スルホメチル）アンモニウムヒドロキシド、［２－（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］ジメチル－（３－スルホエチル）アンモニウムヒドロキシド、［２－（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］ジメチル－（３－スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド、Ｏ－［２－（（メタ）アクリロイルオキシ）エトキシ（オキシラト）ホスフィニル］コリン等が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。
　モノマー（１２）としては、２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド、２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、アミノエチル（メタ）アクリレート、ｔｅｒｔ－ブチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。
　モノマー（１１）、（１２）の各合計使用量は、それぞれ、担体に結合している重合開始基に対し、通常５～１００００モル当量程度であり、好ましくは１０～５０００モル当量程度である。
　また、工程２－１－１における重合反応を、原子移動ラジカル重合により行う場合は、反応効率の観点から、遷移金属化合物及び配位子の存在下で反応を行うのが好ましい。
　遷移金属化合物としては、銅化合物が好ましい。銅化合物としては、臭化銅（Ｉ）、臭化銅（ＩＩ）、塩化銅（Ｉ）、塩化銅（ＩＩ）等のハロゲン化銅の他、銅（Ｉ）トリフレート、銅（ＩＩ）トリフレート等が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。遷移金属化合物の合計使用量は、反応系中、通常１～１０，０００ｐｐｍ程度である。
　配位子としては、同一分子内に２つ以上の窒素原子を含む配位子が好ましい。同一分子内に２つ以上の窒素原子を含む配位子としては、トリス（２－ピリジルメチル）アミン、ビピリジン、ビピリジン誘導体、トリス［２－（ジメチルアミノ）エチル］アミン等が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。配位子の合計使用量は、遷移金属化合物に対し、通常０．５～１０モル当量程度である。
　また、工程２－１－１における重合反応は、反応効率の観点から、還元剤、溶媒存在下で行うのが好ましい。
　還元剤としては、アスコルビン酸、グルコース、ヒドラジン、銅等が挙げられ、これら還元剤は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
　溶媒としては、水；ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒；メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒等が挙げられ、これら溶媒は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
　また、重合反応の反応系のｐＨとしては、３～１０が好ましい。重合反応の反応時間は、通常３０分～１２時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよい。重合反応は、２５～６０℃程度の温和な条件でも進行する。
　（工程２－１－２）
　工程２－１－２は、固相担体に導入されたポリマー（１４）に、付加反応、置換反応、縮合反応又は脱保護反応によってカルボキシ基、アミノ基又はトシル基を導入する工程である。
　カルボキシ基を導入する方法としては、モノマー（１２）として水酸基又はアミノ基を有するモノマーを使用し、得られたポリマー（１４）にカルボン酸無水物を付加反応させる方法や、モノマー（１２）としてエポキシ基を有するモノマーを使用し、得られたポリマー（１４）を加水分解し水酸基を生成した後に、カルボン酸無水物を付加反応させる方法、モノマー（１２）としてエポキシ基を有するモノマーを使用し、得られたポリマー（１４）にメルカプト基やアミノ基等の求核基及びカルボキシ基を有する化合物を付加反応させる方法、モノマー（１２）としてカルボキシ基が保護されたモノマーを使用し、得られたポリマー（１４）を脱保護する方法等が挙げられる。
　カルボン酸無水物としては、例えば、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水グルタル酸、無水フタル酸、ヘキサヒドロ無水フタル酸等が挙げられる。中でも、水酸基やアミノ基との反応が容易に進行する観点から、無水コハク酸が好ましい。カルボン酸無水物等の合計使用量は、モノマー（１２）由来の構造単位に対し、通常０．１～２０００モル当量程度であり、好ましくは１～１０００モル当量である。
　メルカプト基やアミノ基等の求核基及びカルボキシ基を有する化合物としては、メルカプトプロピオン酸やアミノ酸が挙げられる。カルボキシ基が保護されたモノマーとしては、ｔｅｒｔ－ブチル（メタ）アクリレート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（メタ）アクリレートが挙げられる。なお、脱保護方法は、保護基に応じて周知の方法で実施でき、加水分解等が挙げられる。
　アミノ基を導入する方法としては、モノマー（１２）としてエポキシ基を有するモノマーを使用し、得られたポリマー（１４）にアンモニア又は２つ以上のアミノ基を有する化合物を付加反応させる方法が挙げられる。２つ以上のアミノ基を有する化合物としては、エチレンジアミンが挙げられる。
　トシル基を導入する方法としては、モノマー（１２）として水酸基又はアミノ基を有するモノマーを使用し、得られたポリマー（１４）にトシルクロライドを付加させる方法や、モノマー（１２）としてエポキシ基を有するモノマーを使用し、得られたポリマー（１４）を加水分解し水酸基を生成した後にトシルクロライドを付加させる方法等が挙げられる。
　また、工程２－１－２は、工程１と同様の塩基性触媒、溶媒存在下で行うのが好ましい。工程２－１－２の反応時間は、通常３０分～２４時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよい。
　なお、工程２－２－１は、工程２－１－２に準じて行えばよく、工程２－２－２は、工程２－１－１に準じて行えばよい。
　そして、上記のようにして得られる本発明の固相担体は、高い水分散性を有し、リガンドが反応性官能基に結合しやすく、非特異吸着が抑制されたものである。しかも、リガンドを結合して用いた場合に標的物質の検出等におけるＳ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比を高めることができ、検出等を高感度且つ低ノイズ化できる。また、標的物質の分離を高純度化することができる。また、リガンドを結合して用いた場合に標的細胞を高い割合で特異的に捕捉することができる。
　したがって、本発明の固相担体をアフィニティー担体とすることで、酵素免疫測定、放射免疫測定、化学発光免疫測定等の抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ；タンパク質、核酸等の検出；細胞、タンパク質、核酸等の生体関連物質のバイオセパレーション；薬物探索；バイオセンサー等をはじめとする、体外診断や生化学分野における研究等に広く利用できる。本発明の固相担体は、イムノアッセイのため、バイオセパレーション（特に細胞分離）のため、及び核酸検出のための使用に特に適する。
＜リガンド結合固相担体＞
　本発明のリガンド結合固相担体は、本発明の固相担体にリガンドを結合させてなるものである。
　上記リガンドは、標的物質と結合する分子であればよいが、例えば、抗体；抗原；ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸；ヌクレオチド；ヌクレオシド；プロテインＡ、プロテインＧ、（ストレプト）アビジン、酵素、レクチン等のタンパク質；インシュリン等のペプチド；アミノ酸；ヘパリン等の糖又は多糖；脂質；ビオチン等のビタミン；薬物；基質；ホルモン；神経伝達物質；合成分子等が挙げられる。
　これらの中でも、診断薬用等に適したリガンド結合固相担体とする観点からは、抗体、抗原が好ましい。抗体、抗原は標的物質と結合するものであればよいが、例えば、抗アンチプラスミン抗体、抗Ｄダイマー抗体、抗ＦＤＰ抗体、抗ｔＰＡ抗体、抗トロンビン・アンチトロンビン複合体抗体、抗ＦＰＡ抗体等の凝固線溶関連検査用抗体又はこれに対する抗原；抗ＢＦＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＴＳＨ抗体、抗フェリチン抗体、抗ＣＡ１９－９抗体等の腫瘍関連検査用抗体又はこれに対する抗原；抗アポリポタンパク抗体、抗β２－ミクロブロブリン抗体、抗α１―ミクログロブリン抗体、抗免疫グロブリン抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体等の血清蛋白関連検査用抗体又はこれに対する抗原；抗ＨＣＧ抗体等の内分泌機能検査用抗体又はこれに対する抗原；抗ジゴキシン抗体、抗リドカイン抗体等の薬物分析用抗体又はこれに対する抗原；ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ－１抗原、ＨＩＶ－２抗原、ＨＴＬＶ－１抗原、マイコプラズマ抗原、トキソプラズマ抗原、ストレプトリジンＯ抗原等の感染症関連検査用抗原又はこれに対する抗体；ＤＮＡ抗原、熱変成ヒトＩｇＧ等の自己免疫関連検査用抗原又はこれに対する抗体等が挙げられる。なお、抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。
　リガンドの結合は常法に従い行えばよいが、共有結合法で行うのが好ましい。例えば、反応性官能基がカルボキシ基であり、リガンドがアミノ基を有するものである場合は、脱水縮合剤を用いて結合させればよい。
　本発明のリガンド結合固相担体は、体外診断や生化学分野における研究等に広く利用できる。本発明のリガンド結合固相担体は、イムノアッセイのため、バイオセパレーション（特に細胞分離）のため、及び核酸検出のための使用に特に適する。
＜標的物質の検出又は分離方法＞
　本発明の試料中の標的物質を検出又は分離する方法は、本発明のリガンド結合固相担体を用いることを特徴とするものである。
　標的物質はリガンドと結合するものであればよいが、具体的には、抗原；モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等の抗体；細胞（正常細胞、及び大腸がん細胞、血中循環がん細胞等のがん細胞）；ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸；タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖、多糖、脂質、ビタミン等の生体関連物質が挙げられ、創薬ターゲットとなる薬物、ビオチン等の小分子化合物でもよい。なお、標的物質は、蛍光物質などにより標識化されたものでもよい。
　なお、試料は、上記標的物質を含むもの又は標的物質を含む可能性があるものであればよく、具体的には、血液、血漿、血清、標的物質を含有するバッファー溶液等である。
　本発明の検出又は分離方法は、本発明のリガンド結合固相担体を用いる以外は常法にしたがって行えばよい。例えば、本発明のリガンド結合固相担体と標的物質を含む試料を、混合するなどして接触させる工程（接触工程）、及び標的物質を捕捉したリガンド結合固相担体を、磁石などを用いて試料から分離する工程（分離工程）を含む方法が挙げられる。なお、当該分離工程の後に、標的物質を検出する工程、又はリガンドと標的物質を解離させる工程を含んでいてもよい。
　以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。実施例における各分析条件は以下に示すとおりである。
＜鎖状ポリマーの分子量測定＞
　鎖状ポリマーの分子量は、水酸化ナトリウム水溶液を用いて加水分解することで、鎖状ポリマーを粒子から遊離させてから測定した。
　すなわち、水酸化ナトリウム水溶液（１Ｎ、ｐＨ１４）４ｇに粒子１ｇを分散し、２５℃で３時間撹拌して、鎖状ポリマーを粒子から遊離した。磁気を用いて粒子を分離し、鎖状ポリマーが溶解した上清を回収した。次に、この鎖状ポリマー溶液に、溶液のｐＨが７になるまで１Ｍの塩酸を加え中和した。鎖状ポリマーの重量の算出に用いるために、加えた１Ｍ塩酸の重量から、生成する塩化ナトリウムの重量を計算しておき、中和後の溶液を凍結乾燥することで、粉末として、塩化ナトリウムを含む鎖状ポリマーを得た。また、鎖状ポリマーの重量の算出に用いるために、粉末の重量を測定しておいた。
　上記粉体を検体とし、東ソー社製　ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００ＰＷＸＬカラム及び日本分光社製　Ｃｈｒｏｍ　ＮＡＶ　クロマトグラフィデータステーションプログラムを使用して、ゲル浸透クロマトグラフィー（Ｇｅｌ　ＰｅｒｍｅａｔｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：　ＧＰＣ）により以下の条件で測定することで、粒子表面に形成された鎖状ポリマーのＭｎ及びＭｗを測定した。
　（測定条件）
　流量：０．８ｍＬ／分
　溶出溶媒：０．２Ｍ　りん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
　カラム温度：２５℃
　標準物質：東ソー社製　ＴＳＫｇｅｌ　ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｏｘｉｄｅ）　ＳＥ－ｋｉｔ　及び和光純薬工業社製　ＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅＧｌｙｃｏｌ　４，０００
＜粒子表面を占める鎖状ポリマーのポリマー密度＞
　粒子から遊離させた鎖状ポリマーの重量、鎖状ポリマーの数平均分子量、及び粒子の表面積から、下記式よりポリマー密度を算出した。
　〔粒子表面を占める鎖状ポリマーの密度（本／ｎｍ2）〕＝〔粒子１ｇに結合した鎖状ポリマーの本数（本）〕／〔粒子１ｇあたりの総表面積（ｎｍ2）〕
　なお、粒子１ｇに結合した鎖状ポリマーの本数と粒子１ｇの総表面積の算出法は以下のとおりである。
　（粒子１ｇに結合した鎖状ポリマーの本数）
　粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマー重量を下記式（α）により算出し、得られた値から、粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマーの本数を下記式（β）及び（γ）により算出した。
　（α）：　粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマー重量（ｍｇ）　＝　凍結乾燥後の粉末の重量（ｍｇ）　－　塩化ナトリウムの重量（ｍｇ）
　（β）：　粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマーの本数（ｍｏｌ）　＝　｛粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマー重量（ｍｇ）　÷　鎖状ポリマーの数平均分子量（ｇ／ｍｏｌ）｝÷１０００
　（γ）：　粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマーの本数（本）　＝　粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマーの本数（ｍｏｌ）　×　６．０２×１０23（アボガドロ数）
　（粒子１ｇあたりの総表面積）
　下記式（δ）～（θ）により算出した。なお、式（ε）中の粒子の比重は、ポリマーの比重、磁性体の比重及び粒子に占めるポリマーと磁性体の比率から計算した。
　（δ）：　粒子１個あたりの体積（μｍ3）　＝　４／３　×　π　×　｛粒子の体積平均半径（μｍ）｝3
　（ε）：　粒子１個あたりの質量（ｇ）　＝　粒子１個あたりの体積（μｍ3）×粒子の比重（ｇ／μｍ3）
　（ζ）：　粒子１ｇあたりの粒子数（個）　＝　１ｇ　／　粒子１個あたりの質量（ｇ）
　（η）：　粒子１個あたりの表面積（ｎｍ2）　＝　４　×　π　×　｛粒子の半径（ｎｍ）｝2
　（θ）：　粒子１ｇあたりの総表面積（ｎｍ2）　＝　粒子１個あたりの表面積（ｎｍ2）　×　粒子１ｇあたりの粒子数（個）
＜反応性官能基含有量＞
　粒子から遊離させた鎖状ポリマーに含まれる反応性官能基（カルボキシ基）の含有量を、電気伝導度測定法（Ｍｅｔｒｏｈｍ社、７９４　Ｂａｓｉｃ　Ｔｉｔｒｉｎｏ）を用いて測定することで、粒子固形分１ｇあたりの反応性官能基の含有量を求めた。
＜重合割合〔ｍ／（ｍ＋ｎ）〕＞
　ｍ／（ｍ＋ｎ）の値は、下記式（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）から得られる平均重合度ｎと、下記式（Ｄ）から得られる平均重合度ｍから算出した。
　（Ａ）：　粒子１ｇあたりの構造単位（２）の重量（ｇ）　＝　粒子１ｇあたりの反応性官能基量（ｍｏｌ）　×　構造単位（２）の分子量（ｇ／ｍｏｌ）
　（Ｂ）：　粒子１ｇあたりの構造単位（１）の重量（ｇ）　＝　粒子１ｇあたりの鎖状ポリマーの重量（ｇ）　―　粒子１ｇあたりの構造単位（２）の重量（ｇ）
　（Ｃ）：　ｎ　＝　｛粒子１ｇあたりの構造単位（１）の重量（ｇ）　／　構造単位（１）の分子量（ｇ／ｍｏｌ）｝　／　粒子１ｇあたりのポリマー本数（本）
　（Ｄ）：　ｍ　＝　粒子１ｇあたりの反応性官能基量（ｍｏｌ）　／　粒子１ｇあたりのポリマー本数（本）
＜体積平均粒径＞
　各粒子の体積平均粒径は、レーザー回析・散乱粒子径分布測定装置（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ　ＬＳ１３　３２０）にて測定した。
〔合成例１　水酸基を表面に有する磁性粒子の合成〕
　ジ（３，５，５－トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド７５％溶液（「パーロイル３５５－７５（Ｓ）」、日油（株）製）２ｇをドデシル硫酸ナトリウム１質量％水溶液２０ｇと混合し、超音波分散機にて微細乳化した。これを、ポリスチレン粒子（数平均粒子径：０．７７μｍ）１３ｇ及び水４１ｇの入った反応器に入れ、２５℃で１２時間撹拌した。
　次いで別の容器にて、スチレン９６ｇ及びジビニルベンゼン４ｇをドデシル硫酸ナトリウム０．１質量％水溶液４００ｇで乳化させ、これを上記反応器に入れ、４０℃で２時間撹拌した後、７５℃に昇温して８時間重合した。室温まで冷却した後、遠心分離により粒子のみ取り出したものを水洗し、乾燥した。この粒子を核粒子（数平均粒径：１．５μｍ）とする。
　次に別の容器にて、油性磁性流体（「ＥＸＰシリーズ、ＥＭＧ」、（株）フェローテック製）にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の磁性体微粒子（平均一次粒子径：０．０１μｍ）を得た。
　次いで、上記核粒子１５ｇ及び上記疎水化処理された磁性体微粒子１５ｇをミキサーでよく混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ－０型（（株）奈良機械製作所製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ／秒（１６，２００ｒｐｍ）で５分間処理し、磁性体微粒子からなる磁性体層を表面に有する母粒子（数平均粒子径：２．０μｍ）を得た。
　次に、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液２５０ｇを５００ｍＬセパラブルフラスコに投入し、次いで、上記磁性体層を有する母粒子１０ｇを加え、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱し温度を保持した。
　次いで別の容器に、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液７５ｇ、メタクリル酸メチル（以下、「ＭＭＡ」という。）１３．５ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート（以下、「ＴＭＰ」という。）１．５ｇ及びジ（３，５，５－トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド７５％溶液（「パーロイル３５５－７５（Ｓ）」、日油（株）製）０．３ｇを入れて分散させプレエマルジョンを得た。このプレエマルジョンを、６０℃に保持した上記５００ｍＬセパラブルフラスコに２時間かけて全量滴下した。滴下終了後、６０℃に保持し１時間撹拌した。
　その後別の容器に、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液３７．５ｇ、グリシジルメタクリレート（以下、「ＧＭＡ」という。）６．５６ｇ、ＴＭＰ０．９４ｇ及びジ（３，５，５－トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド７５％溶液（「パーロイル３５５－７５（Ｓ）」、日油（株）製）０．１５ｇを入れて分散させプレエマルジョンを得た。このプレエマルジョンを、６０℃に保持した上記５００ｍＬセパラブルフラスコに１時間２０分かけて全量滴下した。その後７５℃に昇温した後さらに２時間重合を続けて、反応を完了させた。続けて、この５００ｍＬセパラブルフラスコに１ｍｏｌ／Ｌの硫酸水溶液１０ｍＬを入れ、６０℃で６時間撹拌した。次いで、上記５００ｍＬセパラブルフラスコ中の粒子を、磁気を用いて分離した後、蒸留水を用いて繰り返し洗浄した。
　以上により、水酸基を表面に有する磁性粒子を得た。
〔合成例２　原子移動ラジカル重合開始基を表面に有する磁性粒子の合成（１）〕
　合成例１で得た水酸基を表面に有する磁性粒子１０ｇをフラスコに投入し、窒素フロー下、脱水テトラヒドロフラン３２ｍＬとトリエチルアミン７．５ｍＬとを加え、撹拌した。このフラスコを氷浴に浸し、２－ブロモイソブチリルブロミド６．３ｍＬを３０分かけて滴下した。室温で６時間反応後、フラスコ内の粒子を、磁気を用いて分離した後、粒子をアセトンに再分散させた。磁気分離と再分散をさらに複数回行った後、ドデシル硫酸ナトリウム０．１０質量％水溶液に粒子を分散した。蛍光Ｘ線分析により、原子移動ラジカル重合開始基（２－ブロモイソブチリル基）に含まれるＢｒを検出した。
　以上により、原子移動ラジカル重合開始基（２－ブロモイソブチリル基）を表面に有する磁性粒子を得た。この粒子を、粒子（Ａ）とする。
〔合成例３　原子移動ラジカル重合開始基を表面に有する磁性粒子の合成（２）〕
　合成例１で得た水酸基を表面に有する磁性粒子１０ｇをフラスコに投入し、窒素フロー下、脱水テトラヒドロフラン３２ｍＬとトリエチルアミン０．４ｍＬとを加え、撹拌した。このフラスコを氷浴に浸し、２－ブロモイソブチリルブロミド０．２ｍＬを加えた。室温で６時間反応後、フラスコ内の粒子を、磁気を用いて分離した後、粒子をアセトンに再分散させた。磁気分離と再分散をさらに複数回行った後、ドデシル硫酸ナトリウム０．１０質量％水溶液に粒子を分散した。蛍光Ｘ線分析により、原子移動ラジカル重合開始基（２－ブロモイソブチリル基）に含まれるＢｒを検出した。
　以上により、原子移動ラジカル重合開始基（２－ブロモイソブチリル基）を表面に有する磁性粒子を得た。この粒子を、粒子（Ｂ）とする。
〔合成例４　原子移動ラジカル重合開始基を表面に有する磁性粒子の合成（３）〕
　合成例１で得た水酸基を表面に有する磁性粒子１０ｇをフラスコに投入し、窒素フロー下、脱水テトラヒドロフラン３２ｍＬとトリエチルアミン０．２ｍＬとを加え、撹拌した。このフラスコを氷浴に浸し、２－ブロモイソブチリルブロミド０．１ｍＬを３０分かけて滴下した。室温で６時間反応後、フラスコ内の粒子を、磁気を用いて分離した後、粒子をアセトンに再分散させた。磁気分離と再分散をさらに複数回行った後、ドデシル硫酸ナトリウム０．１０質量％水溶液に粒子を分散した。蛍光Ｘ線分析により、原子移動ラジカル重合開始基（２－ブロモイソブチリル基）に含まれるＢｒを検出した。
　以上により、原子移動ラジカル重合開始基（２－ブロモイソブチリル基）を表面に有する磁性粒子を得た。この粒子を、粒子（Ｃ）とする。
〔実施例１〕
　（鎖状ポリマー伸長反応（１））
　以下の合成経路に従い、鎖状ポリマー伸長反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　すなわち、合成例２で得た粒子（Ａ）２ｇを、りん酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．８）６ｍＬに分散させ、これに、［２－（メタクリロイルオキシ）エチル］（カルボキシラトメチル）ジメチルアミニウム（以下、「ＣＢＭＡ」という。）０．５ｇ、及び０．０５ｍｏｌ／Ｌのトリス（２－ピリジルメチル）アミンと０．０５ｍｏｌ／Ｌの臭化銅（ＩＩ）との混合水溶液０．４０ｍＬを加えた。続いて、Ｌ－アスコルビン酸０．２ｍｏｌ／Ｌ水溶液１．０ｍＬを加え、密栓し反応を開始した。４５℃で４時間撹拌後、開封し空気にばく露することで反応を停止させた。磁気を用いて粒子を分離し、未反応のモノマーや触媒等を除去した。
　（鎖状ポリマー伸長反応（２））
　次いで、以下の合成経路に従い鎖状ポリマー伸長反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　すなわち、上記で得られた粒子を、りん酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．８）６ｍＬに分散させ、これに、２－ヒドロキシエチルアクリルアミド（以下、「ＨＥＡＡ」という。）０．５ｇ、及び０．０５ｍｏｌ／Ｌのトリス（２－ピリジルメチル）アミンと０．０５ｍｏｌ／Ｌの臭化銅（ＩＩ）との混合水溶液０．４０ｍＬを加えた。続いて、Ｌ－アスコルビン酸０．２ｍｏｌ／Ｌ水溶液１．０ｍＬを加え、密栓し反応を開始した。４５℃で３時間撹拌後、開封し空気にばく露することで反応を停止させた。磁気を用いて粒子を分離し、未反応のモノマーや触媒等を除去することで、ＣＢＭＡとＨＥＡＡのブロック共重合体が表面に結合した磁性粒子を得た。体積平均粒径は、３．０μｍであった。ＣＢＭＡとＨＥＡＡのブロック共重合体のＭｎ、Ｍｗ、Ｍｗ／Ｍｎ、及びブロック共重合体のポリマー密度を測定した。測定結果は表１に示す。
　（縮合反応）
　次に、以下の合成経路に従い、縮合反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　すなわち、上記で得られた粒子１．５ｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）８ｍＬに分散させ、これに、無水コハク酸１．５ｇを溶解したＤＭＳＯ溶液７．２ｍＬ、及びトリエチルアミン０．３ｍＬを加え反応を開始した。２５℃で４時間撹拌後、磁気を用いて粒子を分離し、過剰の原料を除去した。
　以上で、ＨＥＡＡ末端の水酸基が反応性官能基（カルボキシ基）に変換された磁性粒子１を得た。カルボキシ基含有量と重合割合〔ｍ／（ｍ＋ｎ）〕を測定した。測定結果は表１に示す。
〔実施例２〕
　ＨＥＡＡで鎖状ポリマーを伸長させる鎖状ポリマー伸長反応（２）の反応時間を、３時間から１時間に変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、ＨＥＡＡ末端の水酸基が反応性官能基（カルボキシ基）に変換された磁性粒子２を得た。体積平均粒径は、３．０μｍであった。
　なお、実施例１と同様にして行った体積平均粒径以外の各測定結果は表１に示す。
〔実施例３〕
　ＨＥＡＡで鎖状ポリマーを伸長させる鎖状ポリマー伸長反応（２）の反応時間を、３時間から３０分間に変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、ＨＥＡＡ末端の水酸基が反応性官能基（カルボキシ基）に変換された磁性粒子３を得た。体積平均粒径は、３．０μｍであった。
　なお、実施例１と同様にして行った体積平均粒径以外の各測定結果は表１に示す。
〔実施例４〕
　ＨＥＡＡで鎖状ポリマーを伸長させる鎖状ポリマー伸長反応（２）の反応時間を、３時間から１５分間に変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、ＨＥＡＡ末端の水酸基が反応性官能基（カルボキシ基）に変換された磁性粒子４を得た。体積平均粒径は、３．０μｍであった。
　なお、実施例１と同様にして行った体積平均粒径以外の各測定結果は表１に示す。
〔実施例５〕
　合成例２で得た粒子（Ａ）２ｇを、りん酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．８）６ｍＬに分散させ、これに、ＣＢＭＡ０．５ｇ、ＨＥＡＡ０．５ｇ、及び０．０５ｍｏｌ／Ｌのトリス（２－ピリジルメチル）アミンと０．０５ｍｏｌ／Ｌの臭化銅（ＩＩ）との混合水溶液０．４０ｍＬを加えた。続いて、Ｌ－アスコルビン酸０．２ｍｏｌ／Ｌ水溶液１．０ｍＬを加え、密栓し反応を開始した。４５℃で４時間撹拌後、開封し空気にばく露することで反応を停止させた。磁気を用いて粒子を分離し、未反応のモノマーや触媒等を除去することで、ＣＢＭＡとＨＥＡＡのランダム共重合体が表面に結合した磁性粒子を得た。ＣＢＭＡとＨＥＡＡのランダム共重合体のＭｎ、Ｍｗ、Ｍｗ／Ｍｎ、及びランダム共重合体のポリマー密度を測定した。測定結果は表１に示す。
　上記で得られた粒子１．５ｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）８ｍＬに分散させ、これに、無水コハク酸１．５ｇを溶解したＤＭＳＯ溶液７．２ｍＬ、及びトリエチルアミン０．３ｍＬを加え反応を開始した。２５℃で４時間撹拌後、磁気を用いて粒子を分離し、過剰の原料を除去した。
　以上で、ＨＥＡＡ末端の水酸基が反応性官能基（カルボキシ基）に変換された磁性粒子５を得た。体積平均粒径は、３．０μｍであった。カルボキシ基含有量と重合割合〔ｍ／（ｍ＋ｎ）〕を測定した。測定結果は表１に示す。
〔実施例６〕
　ＣＢＭＡの使用量を０．５ｇから０．８ｇに、ＨＥＡＡの使用量を０．５ｇから０．２ｇに、それぞれ変更した以外は実施例５と同様の操作を行い、ＨＥＡＡ末端の水酸基が反応性官能基（カルボキシ基）に変換された磁性粒子６を得た。体積平均粒径は、３．０μｍであった。
　なお、実施例５と同様にして行った体積平均粒径以外の各測定結果は表１に示す。
〔実施例７〕
　粒子（Ａ）を合成例３で得た粒子（Ｂ）に変更した以外は実施例２と同様の操作を行い、ＨＥＡＡ末端の水酸基が反応性官能基（カルボキシ基）に変換された磁性粒子７を得た。体積平均粒径は、３．０μｍであった。
　なお、実施例１と同様にして行った体積平均粒径以外の各測定結果は表１に示す。
〔実施例８〕
　（鎖状ポリマー鎖伸長反応（１））
　合成例２で得た粒子（Ａ）２ｇを、りん酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．８）６ｍＬに分散させ、これに２－（メタクリロイルオキシ）エチル］ジメチル－（３－スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド（以下、「ＳＢＭＡ」という。）０．５ｇ、及び０．０５ｍｏｌ／Ｌのトリス（２－ピリジルメチル）アミンと０．０５ｍｏｌ／Ｌの臭化銅（ＩＩ）との混合水溶液０．４０ｍＬを加えた。続いて、Ｌ－アスコルビン酸０．２ｍｏｌ／Ｌ水溶液１．０ｍＬを加え、密栓し反応を開始した。４５℃で４時間撹拌後、開封し空気にばく露することで反応を停止させた。磁気を用いて粒子を分離し、未反応のモノマーや触媒等を除去した。
　（鎖状ポリマー伸長反応（２））
　次に、上記で得られた粒子を、りん酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．８）６ｍＬに分散させ、これに、ＨＥＡＡ０．５ｇ、及び０．０５ｍｏｌ／Ｌのトリス（２－ピリジルメチル）アミンと０．０５ｍｏｌ／Ｌの臭化銅（ＩＩ）との混合水溶液０．４０ｍＬを加えた。続いて、Ｌ－アスコルビン酸０．２ｍｏｌ／Ｌ水溶液１．０ｍＬを加え、密栓し反応を開始した。４５℃で３０分間撹拌後、開封し空気にばく露することで反応を停止させた。磁気を用いて粒子を分離し、未反応のモノマーや触媒等を除去することで、ＳＢＭＡとＨＥＡＡのブロック共重合体が表面に結合した磁性粒子を得た。体積平均粒径は、３．０μｍであった。ＳＢＭＡとＨＥＡＡのブロック共重合体のＭｎ、Ｍｗ、Ｍｗ／Ｍｎ、及びブロック共重合体のポリマー密度を測定した。測定結果は表１に示す。
　（縮合反応）
　次に、上記で得られた粒子１．５ｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）８ｍＬに分散させ、これに、無水コハク酸１．５ｇを溶解したＤＭＳＯ溶液７．２ｍＬ、及びトリエチルアミン０．３ｍＬを加え反応を開始した。２５℃で４時間撹拌後、磁気を用いて粒子を分離し、過剰の原料を除去した。
　以上で、ＨＥＡＡ末端の水酸基が反応性官能基（カルボキシ基）に変換された磁性粒子８を得た。カルボキシ基含有量と重合割合〔ｍ／（ｍ＋ｎ）〕を測定した。測定結果は表１に示す。
〔比較例１〕
　合成例２で得た粒子（Ａ）２ｇを、りん酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．８）６ｍＬに分散させ、これに、２－ヒドロキシエチルメタクリレート（以下、「ＨＥＭＡ」という。）０．５ｇ、及び０．０５ｍｏｌ／Ｌのトリス（２－ピリジルメチル）アミンと０．０５ｍｏｌ／Ｌの臭化銅（ＩＩ）との混合水溶液０．４０ｍＬを加えた。続いて、Ｌ－アスコルビン酸０．２ｍｏｌ／Ｌ水溶液１．０ｍＬを加え、密栓し反応を開始した。４５℃で４時間撹拌後、開封し空気にばく露することで反応を停止させた。磁気を用いて粒子を分離し、未反応のモノマーや触媒等を除去した。以上で、ＨＥＭＡのホモポリマーが表面に結合した磁性粒子９を得た。体積平均粒径は、３．０μｍであった。
〔比較例２〕
　ＣＢＭＡをジメチルアミノエチルメタクリレート四級化物（ライトエステルＤＱ－１００　共栄社化学（株）製（ジメチルアミノエチルメタクリレートをメチルクロライドで四級化したもの））に変更した以外は実施例２と同様の操作を行い、ＨＥＡＡ末端の水酸基が反応性官能基（カルボキシ基）に変換された磁性粒子１０を得た。体積平均粒径は、３．０μｍであった。
　なお、実施例１と同様にして行った体積平均粒径以外の各測定結果は表１に示す。
〔比較例３〕
　ＣＢＭＡをジメチルアミノエチルメタクリレート四級化物（ライトエステルＤＱ－１００　共栄社化学（株）製（ジメチルアミノエチルメタクリレートをメチルクロライドで四級化したもの））に変更した以外は実施例６と同様の操作を行い、ＨＥＡＡ末端の水酸基が反応性官能基（カルボキシ基）に変換された磁性粒子１１を得た。体積平均粒径は、３．０μｍであった。
　なお、実施例５と同様にして行った体積平均粒径以外の各測定結果は表１に示す。
〔比較例４〕
　合成例１で得た水酸基を表面に有する磁性粒子１ｇを１，３－ジオキソラン４．８ｍＬに分散させ、これに、トリエチルアミン０．２ｍＬと無水コハク酸０．０８ｇを１，３－ジオキソラン４．８ｍＬに溶解させた溶液を加えた。２５℃で４時間反応後、磁気を用いて粒子を分離し、粒子を水に分散した。以上により、鎖状ポリマーを有さない反応性官能基含有磁性粒子１２を得た。カルボキシ基含有量を測定した。測定結果は表１に示す。
〔比較例５〕
　合成例２で得た粒子（Ａ）２ｇを、りん酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．８）６ｍＬに分散させ、これに、ＣＢＭＡ０．５ｇ、及び０．０５ｍｏｌ／Ｌのトリス（２－ピリジルメチル）アミンと０．０５ｍｏｌ／Ｌの臭化銅（ＩＩ）との混合水溶液０．４０ｍＬを加えた。続いて、Ｌ－アスコルビン酸０．２ｍｏｌ／Ｌ水溶液１．０ｍＬを加え、密栓し反応を開始した。４５℃で４時間撹拌後、開封し空気にばく露することで反応を停止させた。磁気を用いて粒子を分離し、未反応のモノマーや触媒等を除去した。以上で、ＣＢＭＡのホモポリマーが表面に結合した磁性粒子１３を得た。体積平均粒径は、３．０μｍであった。
〔試験例１　（水分散性）〕
　各実施例及び比較例で得られた磁性粒子１００ｍｇを、水１ｍＬにそれぞれ分散させた。比較例１で得られた磁性粒子は水への分散性が悪く、凝集した。他の磁性粒子については凝集することなく分散された。評価結果を表２に示す。
〔試験例２　（非特異吸着抑制効果）〕
　各実施例及び比較例２～５で得られた磁性粒子１ｍｇを、水２ｍＬにそれぞれ分散させた。この水分散液をエッペンドルフチューブに投入し、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した。次いで、粒子にＪｕｒｋａｔ細胞破砕液（タンパク質夾雑物１００μｇが含まれる）１００μＬを加え、３０分間インキュベートした後、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去し、粒子をＴＢＳ－Ｔ（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０）緩衝液で５回洗浄した。さらに磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した後、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液（０．５質量％）を加え、非特異吸着したタンパク質夾雑物を粒子から剥離した。この剥離溶液をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ゲルをＣＢＢ染色して粒子に非特異吸着したタンパク質の量を目視にて確認し、以下の基準により評価した。タンパク質の量が少ない粒子ほど非特異吸着の少ない良好な粒子といえる。評価結果は表２に示す。
　（評価基準）
　◎：タンパク質の吸着がほとんどみられず、非常に良好
　○：タンパク質の吸着があまりみられず、良好
　△：タンパク質の吸着がわずかにみられるが、やや良好
　×：タンパク質の吸着がはっきりと確認され、不良
〔試験例３　（抗体結合量）〕
　各実施例及び比較例２～５で得られた磁性粒子１ｍｇを、水２ｍＬにそれぞれ分散させた。この水分散液をエッペンドルフチューブに投入し、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した。次いで、粒子をＭＥＳ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ５．０）９９０μＬに分散させ、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを加え、室温で３０分間インキュベートした。磁気を用いて粒子を分離して上清を除去し、ＭＥＳ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ５．０）１ｍＬに分散させ、抗ＴＳＨ抗体（フナコシ社製）１５μｇを加えた。室温で１２時間インキュベートした後、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した。ＴＢＳ－Ｔ（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０）緩衝液で５回洗浄し、抗体結合粒子を得た。
　次に、抗体結合量をＢＣＡ　Ａｓｓａｙにより求めた。すなわち、抗体結合粒子１ｍｇをＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製）のＡ／Ｂ混合液１ｍＬに分散させ、３７℃で３０分間転倒混和させた。磁気を用いて粒子を分離して上清を除去し、５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。別途、抗ＴＳＨ抗体０μｇ、２μｇ、４μｇ、８μｇ、１６μｇが溶解した抗体溶液と、上記Ａ／Ｂ混合液１ｍＬとをそれぞれ混合し、３７℃で３０分間転倒混和させた後、反応溶液の５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた検量線から磁性粒子に結合した抗体結合量を求めた。結果を表２に示す。
〔試験例４　（ＣＬＥＩＡ）〕
　試験例３で得られた抗体結合粒子の分散液５μＬ（粒子５０μｇ相当）をテストチューブに取り、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）５０μＬが添加された２００μＩＵ／ｍＬのＴＳＨ抗原溶液（富士レビオ社製ルミパルスＴＳＨ－ＩＩＩ標準ＴＳＨ溶液）５０μＬを混合し、２５℃で１０分間反応させた。磁気を用いて粒子を分離し上清を除いた後、２次抗体としてアルカリフォスフォターゼで標識した抗ＴＳＨ抗体（富士レビオ社製ルミパルスＴＳＨ－ＩＩＩ免疫反応カートリッジ付属）４０μＬを添加し、２５℃で１０分間反応させた。磁気を用いて粒子を分離し上清を除いた後、ＰＢＳで３回洗浄を繰り返して得られた粒子を、５０μＬの０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００に分散させ、新しいチューブに移し替えた。アルカリフォスフォターゼの基質液（富士レビオ社製ルミパルス基質液）１００μＬを加え、３７℃で１０分間反応させた後、シグナルとして化学発光量を測定した。化学発光の測定には、ベルトールジャパン社製の化学発光測定装置（Ｌｕｍａｔ　ＬＢ９５０７）を用いた。また上記で、２００μＩＵ／ｍＬのＴＳＨ抗原溶液の代わりに、０μＩＵ／ｍＬのＴＳＨキャリブレータとした以外は同様にして、ノイズとして化学発光量を測定した。さらに、シグナル（Ｓ）をノイズ（Ｎ）で割った値Ｓ／Ｎを算出した。結果を表２に示す。
〔試験例５　（細胞捕捉率）〕
　各実施例及び比較例２～５で得られた磁性粒子１ｍｇを、水２ｍＬにそれぞれ分散させた。この水分散液をエッペンドルフチューブに投入し、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した。次いで、粒子をＭＥＳ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ５．０）９９０μＬに分散させ、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを加え、室温で３０分間インキュベートした。磁気を用いて粒子を分離して上清を除去し、ＭＥＳ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ５．０）１ｍＬに分散させ、抗ＥｐＣＡＭ抗体５μｇを加えた。室温で１２時間インキュベートした後、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した。ＴＢＳ－Ｔ（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０）緩衝液で５回洗浄し、抗体結合粒子を得た。
　この抗体結合粒子をＰＢＳ（－）緩衝液で４回洗浄した後、ＰＢＳ（－）緩衝液２５０μＬに分散させた。次いで、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＰＢＳ（－）緩衝液５０μＬに分散した大腸がん細胞（ＨＴ－２９）９００００ｃｅｌｌｓを抗体結合粒子と混合し、４℃で３０分間撹拌して細胞捕捉を行った。磁気を用いて粒子を分離して上清を除去し、ＰＢＳ（－）緩衝液で４回洗浄することで、細胞捕捉粒子を得た。次に、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ　５０μＬを細胞捕捉粒子に加え５５℃で１５分間、続いて１００℃で２０分間反応させることで細胞内部のＤＮＡを溶出した。磁気を用いて粒子を分離して上清を回収後、β－グロビンを標的としたＰＣＲカクテルを加えＰＣＲを実施し、Ｃｔ値から求められる捕捉細胞数から特異的細胞捕捉率を算出した。結果を表２に示す。
　また、粒子にＥｐＣＡＭ抗体を結合させない以外は上記と同様の操作を行い、捕捉細胞数から非特異的細胞捕捉率を算出した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　表１及び２に示すとおり、実施例１～８の磁性粒子は、高い水分散性を有し、非特異吸着が抑制されており、且つリガンドが反応性官能基に結合しやすいものだった。また、Ｓ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比が高く、高感度且つ低ノイズ化で抗原を検出できた。また、実施例１～８の磁性粒子は、標的細胞を高い割合で特異的に捕捉することができ且つ非特異的な吸着を抑制できた。

Claims (21)

  1. 　下記式（１）で表される構造単位と下記式（２）で表される構造単位とを含むポリマーが結合してなる固相担体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     〔式（１）中、
    　Ｒ1は、水素原子又はメチル基を示し、
    　Ｒ2は、双性イオン構造を有する有機基を示す。〕
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     〔式（２）中、
    　Ｒ3は、水素原子又はメチル基を示し、
    　Ｒ4は、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ6－＊（Ｒ6は、水素原子又はメチル基を示し、＊は、式（２）中のＲ5と結合する位置を示す）又はフェニレン基を示し、
    　Ｒ4が－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊である場合、Ｒ5は、水素原子、又は反応性官能基を有する有機基を示し、Ｒ4が－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ6－＊又はフェニレン基である場合、Ｒ5は、反応性官能基を有する有機基を示す。
    　但し、Ｒ5は、双性イオン構造を有する有機基でない。〕
  2. 　Ｒ2が、第４級アンモニウム塩型カチオン性官能基と、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ-、－ＳＯ3 -及び－Ｏ－（Ｏ＝Ｐ－Ｏ-）－Ｏ－から選ばれる１価又は２価のアニオン性官能基とを有する有機基である、請求項１に記載の固相担体。
  3. 　Ｒ2が、下記式（３）又は（４）で表される有機基である、請求項１又は２に記載の固相担体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     〔式（３）中、
    　Ｒ7は、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ13－＊（Ｒ13は、水素原子又はメチル基を示し、＊は、式（３）中のＲ8と結合する位置を示す）又はフェニレン基を示し、
    　Ｒ8及びＲ9は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１～１０の２価の有機基を示し、
    　Ｒ10は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ-又は－ＳＯ3 -を示し、
    　Ｒ11及びＲ12は、それぞれ独立して、メチル基又はエチル基を示す。〕
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     〔式（４）中、
    　Ｒ14は、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ20－＊（Ｒ20は、水素原子又はメチル基を示し、＊は、式（４）中のＲ15と結合する位置を示す）又はフェニレン基を示し、
    　Ｒ15及びＲ16は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１～１０の２価の有機基を示し、
    　Ｒ17、Ｒ18及びＲ19は、それぞれ独立して、メチル基又はエチル基を示す。〕
  4. 　粒子である、請求項１～３のいずれか１項に記載の固相担体。
  5. 　磁性粒子である、請求項４に記載の固相担体。
  6. 　前記固相担体の表面に対して前記ポリマーが占有する密度が、０．１～１．２本／ｎｍ2である、請求項１～５のいずれか１項に記載の固相担体。
  7. 　前記ポリマーの重量平均分子量が、１，０００～１００，０００である、請求項１～６のいずれか１項に記載の固相担体。
  8. 　前記ポリマーの分子量分布が、１．０～２．５である、請求項１～７のいずれか１項に記載の固相担体。
  9. 　前記式（１）で表される構造単位の平均重合度ｎ、及び前記式（２）で表される構造単位の平均重合度ｍが、いずれも１以上であり、且つ重合割合〔ｍ／（ｍ＋ｎ）〕が、０．０１～０．７５である、請求項１～８のいずれか１項に記載の固相担体。
  10. 　前記ポリマーが、前記式（１）で表される構造単位の繰り返しから構成される第１のブロックと、前記式（２）で表される構造単位の繰り返しから構成される第２のブロックとを含むブロックポリマーである、請求項１～９のいずれか１項に記載の固相担体。
  11. 　前記ポリマーが、ランダムポリマーである、請求項１～９のいずれか１項に記載の固相担体。
  12. 　前記反応性官能基が、カルボキシ基、トシル基、アミノ基、エポキシ基、アシル基又はアジド基である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の固相担体。
  13. 　前記反応性官能基の含有量が、固相担体の固形分１ｇあたり１～２００μｍｏｌである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の固相担体。
  14. 　重合開始基を有する担体を準備する工程と、前記重合開始基を起点としてモノマーを重合させる工程とを少なくとも含む固相担体の製造方法により得られるものである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の固相担体。
  15. 　前記重合開始基が、原子移動ラジカル重合開始基である、請求項１４に記載の固相担体。
  16. 　請求項１～１５のいずれか１項に記載の固相担体にリガンドを結合させてなる、リガンド結合固相担体。
  17. 　前記リガンドが、抗体、抗原、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、多糖、糖、脂質、ビタミン、薬物、基質、ホルモン、神経伝達物質又は合成分子である、請求項１６に記載のリガンド結合固相担体。
  18. 　イムノアッセイ用、細胞分離用又は核酸検出用である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の固相担体又はリガンド結合固相担体。
  19. 　請求項１６又は１７に記載のリガンド結合固相担体を用いることを特徴とする、試料中の標的物質を検出又は分離する方法。
  20. 　下記式（１）で表される構造単位と下記式（２）で表される構造単位とを含むポリマーが結合してなる固相担体の製造方法であって、
    　（工程１）重合開始基を有する担体を準備する工程と、
    　（工程２）前記重合開始基を起点としてモノマーを重合させる工程を含むことを特徴とする、製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     〔式（１）中、
    　Ｒ1は、水素原子又はメチル基を示し、
    　Ｒ2は、双性イオン構造を有する有機基を示す。〕
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     〔式（２）中、
    　Ｒ3は、水素原子又はメチル基を示し、
    　Ｒ4は、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊、－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ6－＊（Ｒ6は、水素原子又はメチル基を示し、＊は、式（２）中のＲ5と結合する位置を示す）又はフェニレン基を示し、
    　Ｒ4が－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊である場合、Ｒ5は、水素原子、又は反応性官能基を有する有機基を示し、Ｒ4が－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ6－＊又はフェニレン基である場合、Ｒ5は、反応性官能基を有する有機基を示す。
    　但し、Ｒ5は、双性イオン構造を有する有機基でない。〕
  21. 　前記重合開始基が、原子移動ラジカル重合開始基である、請求項２０に記載の製造方法。
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