WO2016013900A1

WO2016013900A1 - Dyrklaa 유전자가 결실된 제브라피쉬 모델 및 이를 이용한 혈관 발생 결함 예방 및 치료제 스크리닝 방법

Info

Publication number: WO2016013900A1
Application number: PCT/KR2015/007714
Authority: WO
Inventors: 이정수; 유권; 조현주; 양세열
Original assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Current assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date: 2014-07-25
Filing date: 2015-07-24
Publication date: 2016-01-28
Anticipated expiration: 2017-01-25
Also published as: KR20160012735A

Abstract

본 발명은 Dyrkla 유전자가 결실된 제브라피쉬 모델 및 이를 이용한 혈관 발생 결함 예방 및 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 본 발명의 돌연변이 제브라피쉬로부터 dyrklaa 유전자는 혈관의 발생 및 유지에서 필수적인 역할을 하는 것을 확인하였으며, 상기 돌연변이 제브라피쉬의 분석은 dyrklaa 유전자에 의한 혈관 발생 및 유지 기작 연구와 저분자 물질 스크리닝에 활용할 수 있다.

Description

[명세서】

[발명의 명칭]

Dyrklaa 유전자가 결실된 제브라피쉬 모델 및 아를 이용한 혈관 발생 결함 예방 및 치료제 스크리닝 방법

【기술분야】

본 발명은 Dyrklaa 유전자가 결실된 제브라피쉬 모델 및 이를 이용한 혈관 발생 결함 예방 및 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다. 【배경기술】

제브라피쉬 (zebraf i sh)는 작은 크기의 열대성 민물 물고기로서， 초기발생와 진행이 빠르교 다량의 배아를 얻을 수 었어 세포 및 유전학 연구에 용이하다. 초기 발생중의 배어 (embryo)가 투명하므로 형광마커를 이용하여 발생과정 증 혈관과 같은 내부 조직의 ᅳ발생 과정 등을 세포수준에서 실시간으로 관찰할 수 있다. 또한 미세주입을 통한 모르폴리노 (morphol ino) 주입， RNA 과발현 또는 형질전환체 제작을 통한 유전자조작이 상대적으로 쉬운 장점이 있으며， 특히 제브라피쉬 배아의 작은 크기와 약물의 침투가 잘 이루어지는 특성을 이용하여 저분자 물질 스크리닝을 수행하여 특정 활성을 보이는 물질을 탐색할 수 있다.

혈관형성에 대한 연구에 있어서 제브라피쉬의 혈관시스템은 포유동물을 포함하는 다른 척추동물과 비교했을 때 구조적， 기능적， 발생학적으로 매우 유사하여 ( Isogai et al . , 2001) 이를 이용한 기초 발생학적 연구와 질병 원인 유전자의 기작연구 등에 매우 활발히 활용되고 있다 (Wi l son et al . , Science 2006； Petente et al . , Genes and Dev. 2007； Hogan et al . , Human Mol . Genet ics 2008； Guar an i et al . , Nature 2011) .

DYRKlA(Dual regulated tYrosinephosphorylat ion-Regulated Kinase 1A)는 세린-트레오닌 인산화효소 (Ser ine-Threonine kinase)의 일종인 Qual regulated t Yros i nephosphory 1 at i on-Regul at ed Kinase family에 속하는 단백질로서 (그람 1A), 이를 암호화하는 유전자 DYRK1A는 다운증후군의 직접적인 원인으로 알려져 있는 공통 삼염색체성 (trisomy) 부위인 Down Syndrome Critical Region(DSCR)에 위치하여 다운증후군을 유발시키는데 결정적인 유전자 중 하나로서 여겨지고 있다. DYRK1A 유전자는 발생시 또는 성체에서 신경계와 혈관계 등을 포함하는 여러 조직들에 발현하며， 신경계에서 DYRK1A는 신경세포와 분화시점， 축색성장 (axon outgrowth)， 수지상 조직 (dentrite) 형성， 시냅스 가소성 (synaptic plasticity) 등을 조절한다고 알려져 있다.

다운증후군 환자들은 고형암의 발생 빈도가 즐어들며 동맥경화나 당뇨병성 망막증 (diabetic ret inopathy)과 같은 혈관관련 질환들이 감소한다는 보고들 (Hasle et a 1. , Lancet, 2000)이 밌으며， 다운증후군을 일으키는 주요 병인 (病因)으로서의 DYRK1A 유전자의 중요성을 고려해 보았을 때， DYRK1A와 ；혈관형성 및 유지， 또한 이와 관련된 고형암 및 뇌졸중 등과의 관련성을 추론해 볼 수 있다. 실제로 DYRK1A는 혈관에서 발현이 관찰되며， 신경 발생 과정 중 DYRK1A에 의한 인산화에 의해 활성이 조절된다고 보고된 SIRT1과 NOTCHKGuarani et al .， Nature, Fernandez-Martinez et al . , J. Cell Sci . ,

2009)은 신생 혈관 형성에 필수적인 유전자들로 알려져 있다. 더불어 면역반웅과 혈관형성에 필수적어면서 다운증후군에 중요한 신호 중 하나로 알려진 NFATCnuclear factor of activated T cells)의 경우 DYRKIA의 직접적인 기질 (substrate)로서 DYRKIA에 의해 기능이 저해됨이 알려져 있다 (Arron et al . , Nature, 2006). 최근의 연구에서는 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)에 의한 혈관 형성시 DSCR의 유전자인 DSCR1/RCAN1의 혈관형성 억제기능을 DYRKIA가 향상시킬 수 있음이 보고되었다 (Baek et al. , Nature, 2009). 따라서 DYRKIA가 혈관 발생 및 유지에 중요한 역할을 하며 고형암 및 뇌졸중과 같은 혈관발생 관련 질환에 기능할 가능성이 매우 높으나 그 기능에 대한 연구는 아직 부족한 실정이다. 최근에 개발된 게놈 조작법인 TALENOYanscription activator-like effector nuclease) 기술을 적용하면 동물모델에서 특정 유전자가 제거된 (Knockout ) 돌연변이체를 고효율로 제작할 수 있다 (Kim et al . , Nature Biotech. , 2013) . TALEN은 표적 염기서열과 결합하는 Tale ef fector와 DNA를 자르는 Fok l nuclease를 포함하는 서로 독립적인 두 도메인으로 이루어진 단백질 쌍으로 이루어져 있으며， Tale effector는 DNA 염기서열 특이적인 RVD( repeat var iable diresidue)를 포함하는 34개의 아미노산 서열이 반복되는 조합을 통해 DNA의 표적 염기서열에 결합하게 된다. 이에 따라 Fok l nuclease가 타겟 DNA를 절단하여 이중가닥의 절단이 일어나면 주로 비상동 말단결합 회복 入 1스템 (non一 homologous end- joining repair system)을 통해 다양한 삽입 ( insert ion) 또는 결손 (delet ion) 기능 저해 돌연변이가 유도될 수 있다 (Hisano et al . Dev. Growth Di ff . , 2013) . 이에, 본 발명자들은 DYRK1A 유전자의 혈관 발생 및 유지에 미치는 기능 연구를 위하여 TALEN 기술을 이용하여 제작된 제브라피쉬 dyrklaa 유전자 넉아웃 돌연변이체를 제작하였으며, 돌연변'.이체 분석을 통하여 ¾관 발생. 및 유지에서의 dyrklaa 유전자의 기능을 분석하고， 이를 가반으로 하여 암 또는 뇌혈관 질환과 같은 혈관 발생 (angiogenesi s) 관련 질환의 예방 또는 치료제 발굴을 위한 스크리닝 시스템 구축에 활용하고자 한다. [발명의 상세한 설명]

[기술적 과제】

본 발명의 목적은 dyrklaa 유전자가 넉아웃된 제브라피쉬 모델 제작과 확립 및 이를 이용한 혈관 발생 관련 질환의 예방 또는 치료제 발굴을 위한 스크리닝 시스템을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】

상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 dyrklaa 유전자가 결실된 돌연변이 제브라피쉬 제조방법을 제공한다.

또한， 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 돌연변이 제브라피쉬를 제공한다.

아울러， 본 발명은 상기 돌연변이 제브라피쉬를 이용한 혈관 발생 결함 및 암 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다. 【유리한 효과】

본 발명은 dyrklaa 유전자가 결실된 제브라피쉬 모델 및 이를 이용한 혈관 발생 결함 예방 및 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 본 발명의 돌연변이 제브라꾀쉬로부터 dyrklaa 유전자는 혈관의 발생 및 유지에서 필수적인 역할을 하는 것을 확인하였으며， 상기 돌연변이 제브라피쉬의 분석은 dyrklaa 유전자에 의한 혈관 발생 및 유지 기작 연구와 저분자 물질 스크리닝에 활용할 수 있다. 【도면의 간단한 설명】

도 1은， 세련-트레오닌 인산화효소 (ser ine/threonine kinase)의 5 ' 말단 부분인 dyrklaa exon 5에 작용하는 TALEN construct의 구조 모식도를 나타낸 도이다.

도 2는， 제작된 dyrklaa TALEN RNA를 제브라피쉬 제 1 세포기 배아에 미세주입한 후 DNA의 T7 엔도뉴클라아제 (endonuc lease) I 또는 제한효소

Stu l을 이용하여 절단한 것을 나타낸 도이다.

도 3은， 야생형 및 dyrklaa 돌연변이 제브라피쉬 발생 배에서 dyrklaa TALEN RNA의 활성을 T7E1 절단에 꾀해 확인한 도이다.

도 4는， 각각 /yr ? TALEN RNA가 미세주입된 제브라피쉬로부터 발생배를 얻어 각각을 Stu l으로 확인한 결과， 총 65마리의 제브라피쉬에서 3마리의 founder를 얻은 결과를 나타낸 도이다.

도 5는， 제브라피쉬 dyrklaa 돌연변이체의 각각 7 및 10 bp 결손 (deletion) 또는 2 bps 삽입 ( insert ion)된 결과를 나타낸 도이다.

도 6은， 제브라피쉬 dyrklaa 돌연변이에 의해 대부분의 아미노산이 결손된 결과를 나타낸 도이다.

도 7은， 야생형 및 dyrklaa 돌연변이 제브라피쉬의 뇌출혈 및 놔혈관 관찰 결과를 나타낸 도이다:

A 및 F: 야생형 제브라피쉬;

C 및 D: 돌연변이 제브라피쉬의 중뇌;

E 및 F: 돌연변이 제브라피쉬의 전뇌;

G 및 H: 야생형 제브라피쉬의 형광 표지된 혈관특이적 형질전환체를 이용한뇌혈관 발생 관찰 결과;

I 및 J: 돌연변이 제브라피쉬의 형광 표지된 혈관특이적 형질전환체를 이용한 뇌혈관 발생 관찰 결과.;

e: 눈 (eye)；

fb: 전뇌 (fore'brain);

mb: 중뇌 (midbrain)；

hb: 후뇌 (liindbrain);

y: yolk; 및

CtAs: central arteries. 【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은，

1) 제브라피쉬 배아에 dtrklaa 유전자의 염기서열에 결합하는 테일 이펙터 (tale effector) 및 상기 염기서열을 자르는 Fok I 뉴클라아제 (nuclease)를 각각 암호화하는 염기서열을 포함하는 정방향 및 역방향 DNA 쌍을 상기 배아에 삽입하여 dyrklaa +/- 유전자 형을 갖는 이형접합체 (heterozygote) 제브라피쉬를 수득하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 이형접합체 제브라피쉬를 교배시키는 단계를 포함하는 dyrklaa -/- 유전자형을 갖는 동형접합체 (homozygote) 돌연변이 제브라피쉬 제조 방법을 제공한다.

상기 단계 1)의 dyrklaa 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하며 , 인간 DYRK1A유전자의 상동 유전자인 것이 바람직하고ᅳ 상기 인간 DYRK1A 유전자 (서열번호 6)는 다운증후군의 직접적인 원인으로 알려져 있는 공통 삼염색체성 부위인 Down Syndrome Critical Region(DSCR)에 위치한 것이 바¾직하다.

상기 쎄브라피쉬 배아는 제 1 세포기인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. _A

상기 단계 1)의 DNA 쌍은 dyrklaa 유전자 다섯번째 엑손 (exon)의 세린 /트레오닌 언산화단백질 도메안 (serine/threonine kinase domain)에 작용하는 것이 바람직하며， 상기 도메인 5' 말단 부분의 오른쪽 및 왼쪽 방향으로 작용하는 DNA쌍안 것이 바람직하다ᅳ

상기 DNA 쌍의 삽입은 미세주입법, 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 '탄화물 위스커 (Silicon carbide whiskers), 초음파 처리 (sonication), 전기천공법 (electroporat ion)， PEG(Polyethylenglycol )에 의한 침전법， 트랜스펙션 서약 (예를 들어， GeneJamer 또는 GenePORTER)을 이용한 직접 ᅵ전달법 (direct del i very) (Sussman, R. Direct DNA delivery into zebraf ish embryos em loying tissue culture techniques. Genesis. 2001 Sep;31(l):l-5), 판트록픽 레트로바이러스 백터 (pantropic retroviral vector)를 이용한 피부를 통한 유전자 전달법 (Paul, et all, Reporter gene expression in fish following cutaneous infect ion with pantropic retroviral vectors. Mar Biotechnol (NY).2001 Jun;3(Supplementl) :S81-7)등을 사용할 수 있으나 미세주입법 (microinjection)인 것이 더욱 바람직하다.

상기 돌연변이 제브라피쉬는 혈관 발생 및 유지와 관련된 표현형 분석용인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 제브라피쉬의 ^' dyrklaa 유전자를 넉아웃 시키기 위해 생명공학기업인 를젠 (Toolgen; http://www.toolgen.com)으로부터 공급받은 TALEN construct DNA를 기반으로 dyrklaa 특이적인 TALEN RNA를 합성하였고， 이를 야생형 제브라피쉬 배아에 미세주입하였다 (도 ² 참조).

또한， 본 발명자들은 dyrklaa TALEN RNA를 제 1 세포기의 야생형 제브라피쉬 배아에 삽입하고 발생 후 약 24시간 뒤 T7E1 assay 또는 Stul 제한효소에 의한 절단 여부를 아가로스 젤 (agarose gel) 상에서 확인하여 i/yrv aa TALEN RNA와 활성을 확인하였으며 그 결과， TALEN RNA가 주입된 돌연변이 제브라피쉬의 경우 T7E1에 의해 PCR. DNA가 절단된 것을 - 확인함으로써 o / aa TALEN RNA의 활성을 확인하였다 (도 3 참조).

또한， dyrklaa의 돌연변이를 지니는 배아 전달 (germl ine transmission) 확인을 위해 ijT ? aa TALEN RNA활성이 확인된 제브라피쉬 배아를 키운 founder 제브라피쉬 (GO)와 야생형 제'브라피쉬 (WT)의 교배를 통해 얻은 발생 배 (F1)의 지노믹 (genomic ) DNA를 얻어 PCR을 수행한 후 Stu l 제한효소 처리를 하였으며， 26번， 21번， 30번 founder 제브라피쉬 (GO) 개체에서 돌연변이에 의해 절단되지 않은 337 bp 밴드와 절단된 266 bp 밴드가 나타나는 것을 확인하였다 (도 4 참조).

또한， dyrklaa TALEN RNA의 배아 전달 (germ line transmission) 확률은 4.61%(3마리의 heterozygotes/genotyping을 수행한 총 65마리 개체)였으며， 각 돌연변이를 배아 (germ-line)에 가지는 founder 제브라피쉬 (GO) F1 발생 배에서의 돌연변이율은 4.16~12.5)(F1 클러치에서 이형접합체 (heterozygote) 개체의 빈도: 26번은 1， 21번은 2， 30번은 3마리 /각각 총 24마리의 genotyping에 사용된 F1 발생 배)임을 확인하였다 (표 3 참조).

또한， 확인된 이형접합체 (heterozyogote) 개체의 상호교배를 통해 다음 세대에서 동형접합체 (homozygote) 돌연변이체를 동일한 방법으로 찾아내었고 (도 4참조)， 최종적으로 염기서열을 확인한 결과 각각 7및 10 bp의 결손 (deletion) 또는 2 bps의 삽입 ( insertion)으로 인한 프레임시프트 ( frameshi ft )를 유발함으로써 (도 5 참조) , 대부분의 아미노산 서열이 손실되어 기능이 없어진 Dyrklaa 단백질을 가지게 되는 것으로 예상하였다 (도 6 참조) .

상기 돌연변이 제브라피쉬의 dyrklaa 돌연변이체에서 뇌출혈 (hemorrhage) 및 혈관 형성 결손을 확인하였으며 그 결과， 제브라피쉬 dyrklaa 돌연변이체에서는 야생형 제브라피쉬에서는 거의 관찰되지 않는 뇌출혈이 실체현미경 하에서 약 20% 이상의 개체에서 관찰되었으며 중뇌나 전뇌， 그 밖에 눈이나 후뇌에서도 확인되었다. 또한， 형광 표지된 혈관 특이적인 형광형질전환체( ^0^/ .ᅳ^ ^)를 이용한 공초점 이미지 (confocal imaging)에 의한 관찰결과， 야생형에 비해 dyrklaa 돌연변이체의 경우 매우 정형화된 뇌혈관의 발생 (특히 central arter ies)이 불규칙적이며 종종 뇌혈관의 소실된 것을 확인하였다 (도 7 참조) .

따라서， dyrklaa 유전자는 혈관의 발생 및 유지에서 필수적인 역할을 하는 것을 확인하였으며， dyrklaa 유전자 돌연변이 제브라피쉬의 분석은 dyrklaa 유전자에 의한 혈관 발생 및 유지 기작 연구와 저분자 물질 스크리닝에 활용할 수 있다. 또한， 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 돌연변이 제브라피쉬를 제공한다.

또한， 본 발명은

1) 실험군으로 상기 돌연변이 제브라피쉬에 피검물질을 처리하는 단계 ;

2) 무처리 대조군과 비교하여 혈관 질환의 표현형을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 혈관 질환 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 혈관 질환은 뇌혈관， 뇌졸중 및 뇌경색으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한， 본 발명은 1) 실험군으로 상기 돌연변이 제브라피쉬에 피검물질을 처리하는 단계; 및 ^' '

2) 무처리 대조군과 비교하여 암을 예방 또는 치료하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 암은 췌장암， 담도암， 신경내분비종양， 폐암， 유방암， 난소암， 간암， 기관지암， 비인두암， 후두암, 위암， 방광암， 대장암， 결장암， 자궁경부암， 뇌암, 전립선암， 골암 두경부암， 피부암， 갑상선암， 부갑상선암 및 요관암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 따라서， dyrklaa 유전자는 혈관의 발생 및 유지에서 필수적인 역할을 하는 것을 확인하였으며， dyrklaa 유전자 돌연변이 제브라피쉬의 분석은 dyrklaa 유전자에 의한 혈관 발생 및 유지 기작 연구와 저분자 물질 스크리닝에 활용할 수 있다. 이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단， 하기 실서예는 본 발'명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>제브라피쉬의 사육 및 dyrklaa유전자의 제거 (knockout) <1-1>제브라피쉬의 사육 및 발생 배와준비

소형 열대어인 제브라피쉬는 적정 생육 온도인 28.5^°C의 수온을 유지한 어항에서 사육하였으며 먹이는 브라인 쉬림프 (Br ine Shrimp)를 부화시켜 사용하였다. 제브라피쉬의 산란과 수정은 빛에 의해 유도되므로 낮 14시간 밤 10시간의 명암을 조절하였다.

제브라피쉬 발생 배를 준바하기 위해， 전날. 오후에 암， 수 1쌍을 전용 메이팅 케이지 (mat ing cage)에 넣고 다음날 아침에 빛으로 자극을 주었으며 수컷과 암컷 사이에 교미를 통해 수백 개의 수정란을 산란시켰다. 수집된 수정란을 E3 egg water (5 mM NaCl , 0.17 mM KCl , 0.33 mM CaCl₂ · 2H₂0, 0.33 mM MgS0₄.7H₂0)로 씻어 페트리디쉬에 옮기고 28.5^°C의 배양기에서 5일 동안 발생시켰다. 5일 이후부터는 28.5^°C를 유지하는 어항에서 발생시켰다.

<1-2> dyrklaa유전자의 제거 (knockout)

DYRK1A는 Serine-Threonine kinase의 일종인 ual regulated t Yr os i nephosphory 1 at i on-Regu 1 at ed Kinase family 에 속하는 단백질로서 이를 암호화하는 유전자 DYRK1A는 다운증후군의 직접적인 원인으로 알려져 있는 공통 삼염색체성 부위인 Down Syndrome Critical Region(DSCR)에 위치하여 다운증후군을 유발시키는데 결정적인 유전자 중 하나로서 여겨지고 있다 (도 1). 본 발명에서는 제브라피쉬의 dyrklaa 유전자를 넉아웃 시키기 위해 생명공학기업인 를젠 (Toolgen; httpV/www. toolgen.com)으로부터 공급받은 TALEN construct DNA를 기'반으로 dyrklaa 특어적언 TALEN RNA를 합성하였고， 이를 야생형 제브라피쉬 배아에 미세주입하기 위해 하기와 같은 실험을 하였다.

구체적으로， dyrklaa 염기서열을 확인하기 위해 genome data base sear ch(http: //www. nc^'bi .nlm.nih.gov/, ht t ： / /www. ensembl .org)¾- ^'통해 제브라피쉬의 dyrklaa의 염기서열정보를 확인하였고 dyrklaa mRNA 서열의 serine/threonine kinase domain의 5'말단 부분에 TALEN이 작용하도록 원하는 염기서열 왼쪽에 결합하는 dyrklaa TALEN plasmid DNA left construct의" 오른쪽에 결합하는 dyrklaa TALEN plasmid DNA right construct를 틀젠 회사를 통하여 제작하였다. 상기 제작한 TALEN construct DNA 쌍 lyg을 주형 DNA로 하여 mRNA synthesis kit(Ambion)의 SP6 RNA polymerase 및 capped RNA mix을 섞은 후 37°C에서 약 2시간의 배양을 통해 미세주입용 dyrklaa TALEN mRNA left/right를 합섟하였다. 합성된 dyrklaa TALEN RNA를 미세주입기 (microinjector， World Precision Instruments)를 이용하여 dyrklaa TALEN RNA L lOOng/ul， dyrklaa TALEN RNA R lOOng/ul의 농도를 가진 용액을 1~2 nl의 부피로 200~300개의 야생형 제브라피쉬 제 1 내지 2 세포기의 발생 배를 1.2% 한천 페트리디쉬 플레이트에 정렬한 후 미세주입하였다 (도 2). <실시예 2> 제브라피쉬 발생 배에서 삽입된 c&rJ aa TALEN RNA의 활성 확인

dyrklaa TALEN RNA를 제 1 세포기의 야생형 제브라피쉬 배아에 삽입하고 발생 후 약 24시간 뒤 dyrklaa TALEN RNA의 활성을 확인하가위해 하기와 같은 실험을 하였다.

구체적으로，삽입된 iy/ aa TALEN RNA의 T7E1 assay또는 S iI제한효소에 의한 절단 여부를 아가로스 젤 (agarose gel ) 상에서 확인하여 dyrklaa TALEN RNA의 활성을 확인하였다. 먼저， 발생 후 24시간 배아의 지노믹 (genomic) DNA를 direct PCR ki t (NanoHel ix)를 이용하여 분리하고 두 차례의 PCR을 각각 F 프라이머 (5' -CCA GCA ACA AGA AGG AGA GG-3 '； 서열번호 2)， R프라이머 (5' -AGC CCT GAT CTT TCC AG GTT-3' ； 서열 '번호 3)， 두 -변째 ^:F프라이머 (5' -TTA CM CGA CGG CTA TGA CG-3' ； 서열번호 4)와 R 프라이머 (5' -TTC ATC TCG GTG TCG TGC T-3' ； 서열번호 5)를 이용하껴 표 1의 조건으로 PCR을 수행하였다. PCR에 의해서 증폭된 DNA는 Stul 제한 효소를 이용하거나 표 2에 나타낸 조건을 수행한 후 T7 엔도뉴클라아제 (endonuclease) I (T7E1)을 어용하여 DNA 절단을 수행하였다. 일치되지 않은 염기서열에 의한 이형이중가닥 (heteroduplex)를 형성하였고 이를 인식하여 절단하는 T7 엔도뉴클라아제 I을 30분 동안 처리하여 확인하였다. Stur제한 효소의 경우, 야생형 DNA는 모두 절단뒤자만 돌연변이 DNA는 일부 절단되지 않은 밴드를 확인할 수 있다 (도 2) . 즉， TALEN RNA에 의해 돌연변이가 유도되면 Stul에 의해 절단이 되지 않거나 T7E1에 의해서 절단이 될 것으로 예상하였다

그 결과， 도 3에 나타낸 바와같이 / ? aa TALEN RNA가주입된 돌연변이 제브라피쉬의 경우 T7E1에 의해 PCR DNA가 절단되었으며 이로써 상기 돌연변이 제브라피쉬 발생 배에서 o r^aa TALEN RNA의 활성을 확인하였다 (도 3) .

【표 1】

제브라피쉬 (zebraf i sh) dyrklaa 유전자의 유전자형 (genotyping) 분석을 위한 PCR조건

【표 2】

<실시예 3>교배를통한 제브라피쉬 dyrklaa돌연변이체 라인의 확립 제브라피쉬의 d rMaa 务전자 돌연변아체ᅳ리쉰을 ·확람하 7:ᅵ 위해 상기 <실시예 2>에서 ijr a TALEN RNA의 활성이 확인된 제브라피쒀 배아를 성체 ( founder 제브라피쉬; GO)까지 키운 후 야생형 제브라피쉬와 교배하여 dyrklaa의 돌연변이를 지니는 배아 전달 (germl ine transmi ssion) 확인을 위해 하기와 같이 실험하였다.

구체적으로， o / aa TALEN RNA를 미세주입한 발생 배를 28.5^°C 배양기에 5일을 두었고, 5일 후부터 28.5^°C를 유지하는 어항에 넣어 성체가 될 때까지 2~3개월 동안 사육하였다. 상기 성체가 된 제브라피쉬 ( founder 제브라피쉬 ; G0)들을 야생형 제브라피쉬들과 교배시켜 발생 배를 얻었고 총 24개의 발생 배에서 각각 지노믹 DNA를 추출한 후 상기 <실시예 2>의 표 1과 같이 PCR을 수행하였다. PCR 산물의 Stu I 제한효소에 의한 절단 여부를 통해 특정 염기서열 부분의 돌연변이 유무를 확인하였다.

그 결과， 도 4에 나타낸 바와 같이 dyrklaa TALEN RNA 활성이 확인된 제브라피쉬 배아를 키운 founder 제브라피쉬 (GO)와 야생형 제브라피쉬 (WT)의 교배를 통해 얻은 발생 배 (F1)의 지노믹 (genomic) DNA를 얻어 PCR을 수행한 후

Stul 제한효소 처리를 하였으며， 26번， 21번， 30번 founder 제브라피쉬 (GO) 개체에서 돌연변이에 의해 절단되지 않은 337 bp 밴드와 절단된 266 bp 밴드가 나타나는 것을 확인하였다 (도 4).

또한，표 3에 나타낸 바와 같이 aaTALENRNA의 배아 전달 (germ line transmission) 확를은 4.61%(3마리의 heterozygotes/genotyping을 수행한 총 65마라 개체)였으며， 각 돌연변이를 배아 (germ-line)에 가지는 founder 제브라피쉬 (GO) F1 발생 배에서의 돌연변이율은 4.16~12.5%(F1 클러치에서 이형접합체 (heterozygote)개체의 빈도: 26번은 1， 21번은 2， 30번은 3마리 /각각 총 24마리의 genotyping에 사용된 F1 발생 배)엄을 확인하였다 (표 3).

또한， 확인된 이형접합체 (heterozyogote) 개체의 상호교배를 통해 다음 세대에서 동형접합체 (homozygote) 돌연변이체를 동일한 방법으로 찾아내었고 (도 4)， 최종적으로 염기서열을 확인한 결과 각각 7 및 10 bp의 결손 (deletion') 또는 2 'bps의 삽 (rinsertion)으로 인한 프레임시프트( 3 5뱌 )를 유발함으로써 (도 5)， 대부분의 아미노산 서열이 손실되어 기능이 없어진 Dyrklaa 단백질을 가지게 되는 것을 확인하였다 (도 6).

【표 3】

dyrklaa M RNA의 배아 전달 (germline transmission) 확률과 돌연변이율

<실시예 3>출혈 및 혈관형성 결손 표현형 기초분석 상기 제브라피쉬의 dyrklaa 돌연변이체에서 뇌출혈 (hemorrhage) 및 혈관 형성 결손을 확인하기 위해 하기와 같이 실험하였다.

구체적으로， 살아있는 제브라피쉬 배아에서 혈관을 형광으로 관찰하기 위하여 2005년 Stainier 연구실에서 개발된 형광형질 전환체 Tg(kdrl :egfp)^ 사용하였다. 간단히， 혈관 특이적으로 발현하는 제브라피쉬 kdrl유전자의 상위 약 6.5 kb 염기서열을 클로닝하고 GFP를 발현할 수 있는 백터에 옮긴 후， 제 1 세포기의 발생배에 주입하고 키운 후 성체의 상호 교배를 통하여 형질전환체를 확립하였다 (J in et al . , Development 2005, "Cel lular and molecular analyses of vascular tube and lumen format ion in zebraf i sh) . 확립된 형질전환체에서 얻어진 배아는 키워서 유지되거나 실험에 사용되었다. 그 결과， 도 7에 나타낸 바와 같이 제브라피쉬 dyrklaa돌연변이체에서는 야생형 제브라괴쉬 (도 7의 A 및 ^,·Β)에서는 거의 관찰쬐지 않는 뇌출혈이 실체현미경 하에서 약 20 이상의 개체에서 관찰되었으며 중뇌 (도 7의 C 및 D)나 전뇌 (도 7의 Ε 및 F) , 그 밖께 눈이나 후뇌에서도 확인되었다 (도 7) . 이는 dyrklaa의 기능결손에 의한 것으로 사료된다.

또한， 형광 표지된 혈관 특이적인 형광형질전환체 (

.·^/ρ )를 이용한 공초점 이미지 (confocal imaging)에 의한 관찰결과， 야생형 (도 7의 G및 H)에 비해 dyrklaa 돌연변이체의 경후 매우 정형화된 뇌혈관의 발생 (특히 central arter ies)이 불규칙적이며 종종 뇌혈관의 소실된 것을 확인하였다 (도 7의 I 및 J) .

Claims

【창구의 범위】

【청구항 1】

1) 제브라피쉬 배아에 dtrklaa 유전자의 염기서열에 결합하는 테일 이펙터 (tale ef fector) 및 상기 염기서열을 자르는 Fok I 뉴클라아제 (nuclease)를 각각 암호화하는 염기서열을 포함하는 정방향 및 역방향 DNA 쌍을 상기 배아에 삽입하여 dyrklaa +/- 유전자 형을 갖는 이형접합체 (heterozygote) 제브라피쉬를 수득하는 단계； 및

2) 상기 단계 1)의 이형접합체 제브라피쉬를 교배시키는 단계를 포함하는 dyrklaa -/- 유전자형을 갖는 동형접합체 (homozygote) 돌연변이 제브라피쉬 제조 방법.

[청구항 2】

제 1항에 있어서， 상기 단계 1)의 dyrklaa 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 돌연변이 제브라피쉬 제조방법 .

[청구항 3】

제 1항에 있어서， 상기 단계 1)의 dyrklaa 유전자는 인간 DYRK1A 유전자의 상동 유전자안 것을 특징으로 하는 돌연변이 제브라피쉬 제조방법. 【청구항 41

제 1항에 있어서， 상기 단계 1)의 DNA 쌍은 dyrklaa 유전자 다섯번째 엑손 (exon)의 세린 /트레오닌 인산화단백질 도메인 (ser ine/threonine kinase domain)에 작용하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 제브라피쉬 제조방법. 【청구항 5】

제 1항에 있어서， 상기 돌연변이 제브라피쉬는 혈관 발생 및 유지와 관련된 표현형 분석용인 것을 특징으로 하는 돌연변이 제브라피쉬 제조방법. 【청구항 6】

제 1항의 제조방법으로 제조된 돌연변이 제브라피쉬.

【청구항 7】

1 ) 실험군으로 제 6항의 돌연변이 제브라피쉬에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 무처리 대조군과 비교하여 혈관 질환의 표현형을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 혈관 질환 예방 및 치료제 스크리닝 방법 .

【청구항 8】

제 7항에 었어서， 상기 혈관 질환은 뇌혈관， 뇌졸중 및 뇌경색으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 혈관 질환 예방 및 처료제 스크리닝 방법 .

【청구항 9】

1) 실험군으로 제 6항의 돌연변이 제브라피쉬에 피검물질을 처리하는 단계; 및

2) 무처리 대조군과 바교하여 암을 예방 또는 치료하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 예방 및 치료제 스크리닝 방법.

【청구항 10】

제 9항에 있어서， 상기 암은 췌장암, 담도암， 신경내분비종양， 폐암， 유방암, 난소암， 간암， 기관지암， 비인두암， 후두암， 위암， 방광암， 대장암, 결장암， 자궁경부암， 뇌암, 전립선암， 골암， 두경부암， 피부암， 갑상선암， 부갑상선암 및 요관암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료제 스크리닝 방법. 【청구항 11】

유효한 양의 항산화 폴리페놀 고함유 쌀 추출물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌질환 예방 방법/

【청구항 12】

퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물의 용도로 사용하기 위한 항산화 폴리페놀 고함유 쌀 추출물.

【청구항 13】

퇴행성 뇌질환의 예방 및 개선용 건강 식품의 용도로 사용하기 위한 항산화 폴리페놀 고함유 쌀 추출물.