KR20140050689A - Pik3ca h1047r 녹-인 비인간 동물 유방암 모델 - Google Patents

Pik3ca h1047r 녹-인 비인간 동물 유방암 모델 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PIK3CA H1047R 녹-인 비인간 동물 유방암 모델의 개발, 및 방추상 세포 종양 형성에 연루된 자발적 기능상실 TP53 돌연변이의 확인을 위한 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이 모델을 사용하는 유방 종양 내 추가적인 체세포 돌연변이 및 복제수 이상의 확인, 및 유방암의 진단 및 치료를 위한 방법 및 수단에 관한 것이다.

Description

PIK3CA H1047R 녹-인 비인간 동물 유방암 모델{PIK3CA H1047R KNOCK-IN NON-HUMAN ANIMAL BREAST CANCER MODEL}
본 발명은 PIK3CA H1047R 녹-인(knock-in) 비인간 유방암 모델의 개발 및 방추상 세포 종양 형성에 수반된 자발적 기능상실 TP53 돌연변이의 확인을 위한 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이 모델을 사용하는 유방 종양에서의 추가적인 체세포 돌연변이 및 복제 수 이상의 확인에 관한 것이다.
클래스 IA PI3K 촉매 서브유닛인 p110α, p110β 및 p110δ는 p85α, p55α, p50α, p85β 또는 p55γ 조절 서브유닛과 복합체로 진성 헤테로다이머(obligate heterodimer)로서 생긴다. 정상 세포에서, PI3K는 기본적 불활성 상태로 유지되고, 성장 인자 자극 및 세포 표면 수용체 진입(engagement) 후 활성으로 된다. 활성화된 PI3K는 인산화되며, 포스파티딜이노시톨 3, 4, 5 트리스포스페이트(PIP3)를 유발하는 포스파티딜이노시톨 4, 5 비스포스페이트(PIP2)로 전환된다. 상승된 세포 PIP3 수준은 PI3K-효과기의 활성화를 촉진하는데, 이는 결국 세포 성장, 증식 및 생존을 포함하는 다수의 세포 과정을 조절한다. (문헌[Cantley, L.C. Science 296, 1655-7 (2002); Hawkins, P.T., et al., Biochem Soc Trans 34, 647-62 (2006); 및 Vanhaesebroeck, B., et al., Trends Biochem Sci 30, 194-204 (2005)] 참조).
p110α을 암호화하는 유전자인 PIK3CA에서 빈번한 체세포 돌연변이가 직장결장암, 유방암 및 간암에서 보고되었다(Samuels, Y. et al . Science 304, 554 (2004); Bachman, K.E. et al . Cancer Biol Ther 3, 772-5 (2004); Lee, J.W. et al . Oncogene 24, 1477-1480 (2004)). 대다수의 보고된 p110α 돌연변이는 3개의 핫 스팟(hotspot) - 나선형 도메인 내 2(E542K 및 E545K) 및 키나제 도메인 내 1(H1047R)에서 발견된다(Bader, A.G., et al., Nat Rev Cancer 5, 921-9 (2005); Zhao, L. & Vogt, P.K. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 2652-7 (2008)). 이들 핫 스팟 돌연변이는 하류 신호전달을 구성적으로 활성화할 수 있는 종양발생 p110α를 야기한다(Zhao, L. & Vogt, 상기 참조). 추가로, p110α 돌연변이체는 세포 내에서 발현될 때, 세포 형질전환을 유발할 수 있으며, 이종이식 모델에서 종양 형성을 지지한다(Samuels et al., 상기 참조; Zhao, L. & Vogt, Oncogene 27, 5486-5496 (2008); Isakoff, S.J. Cancer Research 65, 10992-11000 (2005); Bader, A.G. Proceedings of the National Academy of Sciences 103, 1475-1479 (2006); Horn, S. et al . Oncogene 27, 4096-4106 (2008)).
인간 암의 유전적으로 조작된 마우스 모델(genetically engineered mouse model: GEMM)은 종양 개시 및 진행을 이해하기 위한 중요한 자료로서 작용한다(Walrath, J.C., Hawes, J.J., Van Dyke, T. & Reilly, K.M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv Cancer Res 106, 113-64 (2010)). GEMM은 또한 치료제를 시험하고, 치료 전략을 개발하기 위해 사용되었다(Singh, M. et al . Assessing therapeutic responses in Kras mutant cancers using genetically engineered mouse models. Nat Biotechnol 28, 585-93 (2010)). 돌연변이체 PIK3CA에 의한 종양발생 형질전환을 이해하기 위한 목적의 연구는 주로 사용되는 세포 기반 시스템, 이종이식 모델 및 유전자이식 모델을 주로 사용하였다(Samuels et al. 상기 참조; Isakoff, 상기 참조; Bader, A.G., 상기 참조; Horn, S. et al ., 상기 참조; Engelman, J.A. et al . Nat Med 14, 1351-6 (2008); Adams, J.R. et al . Cancer Research 71, 2706-2717 (2011)'Meyer, D.S. et al . Cancer Research (2011)). 고빈도의 PIK3CA 돌연변이 및 소분자 저해제를 개발하기 위한 진행중인 노력이 주어지면, 그의 천연 프로모터 및 게놈 구조물로부터 돌연변이체 PIK3CA의 내인성 수준을 발현시킬 수 있는 녹-인 마우스 모델은 종양 개시, 진행 및 처리를 연구하기 위한 귀중한 수단이 된다. 또한, 이러한 모델은 그 자체가 종양 발생 동안 돌연변이체 PIK3CA에 협조하는 병변을 확인하는 구실을 한다.
이를 염두에 두고, 본 발명자들은 유전적으로 조작된 마우스 모델을 만들었다. 본 발명자들이 엑손 20을 암호화하는 야생형에 인접하여, H1047R을 암호화하는 종양발생 돌연변이체 PIK3CA 엑손 20의 휴면기 복제물을 위치시킴으로써 내인성 PIK3CA 대립유전자를 변형한 경우, 본 발명자들은 유전적으로 조작된 마우스 모델을 만들었다. 휴면기 돌연변이체 대립유전자의 활성화 전에, 조작된 마우스는 변형된 야생형 PIK3CA(PIK3CA e20mwt )를 발현시킨다. 그러나, Cre-매개 재조합 시, 돌연변이체 PIK3CA H1047R 대립유전자인 PIK3CA e20H1047R 는 그의 발현을 야기하도록 활성화된다. 본 발명자들은 마우스 유방 상피조직 내 PIK3CA H1047R 대립유전자의 조건적 활성화가 돌연변이체 PIK3CA H1047R 발현 및 종양 형성을 유발한다는 것을 보여준다.
차세대 시퀀싱(next generation sequencing)은 그들이 진보되고 진행됨에 따라 인간 종양의 염기쌍 수준 특성규명을 가능하게 하였지만(Shah, S.P. et al . Nature 461, 809-813 (2009); Ding, L. et al . Nature 464, 999-1005 (2010)), 암의 마우스 모델은 그들이 진보됨에 따라 종양의 체계적인 샘플링 및 특성규명을 허용하는 확정된 실험적으로 다루기 쉬운 시스템을 제공한다.
서열 수준에서 종양을 특성 규명하기 위한 노력에서, 본 발명자들은 전체 엑솜 포획 및 종양의 시퀀싱을 수행하였고, 방추상 세포 종양 형성에 수반된 잠재적 협력 사건으로서 자발적 기능상실 TP53 돌연변이의 출현을 확인하였다. 본 발명은 추가로 이 모델로부터의 유방 종양 내 추가적인 체세포 돌연변이 및 복제수 이상의 확인에 관한 것이다. 분자 특성규명에 추가로, PI3K 소분자 저해제의 능력은 효능에 대해 시험되었고, 결과는 종양이 저해제 처리에 반응한다는 것을 나타낸다.
일 양태에서, 본 발명은 변형된 내인성 PIK3CA 좌위(locus)를 포함하는 비인간 유전자이식 동물에 관한 것이되, 상기 변형된 내인성 PIK3CA 좌위는 야생형 엑손 20에 인접한 H1047R을 암호화하는 휴면기 돌연변이체 PIK3CA 엑손 20을 포함하며, 상기 비인간 유전자이식 동물은 PIK3CA H1047R(PIK3CA e20H1047R ) 돌연변이체 대립유전자의 조건적 발현이 가능하다.
일 실시형태에서, 돌연변이체 대립유전자는 PIK3CA 내인성 프로모터의 제어 하에 있다.
다른 실시형태에서, 조건적 발현은 Cre-매개 재조합에 의한 돌연변이체 대립유전자의 활성화에 의해 촉발된다.
또 다른 실시형태에서, 조건적 활성화는 조직 특이적이다.
추가 실시형태에서, 조건적 활성화는 돌연변이체 PIK3CAH1047R 발현 및 종양 형성을 유발한다.
모든 실시형태에서, 비인간 유전자이식 동물은, 예를 들어 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트이다.
다른 양태에서, 본 발명은 PIK3CA 내인성 프로모터 하에서 PIK3CA H1047R (PIK3CA e20H1047R ) 돌연변이체 대립유전자를 조건적으로 발현시키는 종양 보유 비인간 유전자이식 동물에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 동물은 조직 특이적 방식으로 PIK3CA H1047R 돌연변이체 대립유전자를 발현시킨다.
다른 실시형태에서, PIK3CA H1047R 돌연변이체 대립유전자는 동물의 유선에서 발현되며, 종양은 유방 종양이다.
또 다른 실시형태에서, 종양 보유 비인간 유전자이식 동물은 PIK3CA H1047R 돌연변이체 대립유전자에 대해 이형접합성을 가진다.
다른 실시형태에서, 종양 보유 비인간 유전자이식 동물은 PIK3CA H1047R 돌연변이체 대립유전자에 대해 동형접합성을 가진다.
추가 실시형태에서, 유방 종양은 섬유선종, 선암종 및 방추상 세포 신생물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한 추가 실시형태에서, 종양 보유 비인간 유전자이식 동물은 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트이다.
추가 양태에서, 본 발명은 야생형 PIK3CA 대립유전자를 암호화하는 엑손 20에 인접하게 H1047R 돌연변이를 암호화하는 엑손 20의 복제물을 위치시키는 단계를 포함하는, 상기 기재한 유전자이식 동물의 제조방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 야생형 PIK3CA 대립유전자를 암호화하는 엑손 20은 lexP 부위, 다음에 전사 정지 카세트 및 H1047R 돌연변이를 암호화하는 PIK3CA 엑손 20의 복제물에 측접한다.
추가 양태에서, 본 발명은 종양의 존재에 대해 피험체를 선별(screening)하는 방법에 관한 것이되, 해당 방법은 PIK3CA H1047R 대립유전자 또는 대응하는 유전자 산물의 존재에 대해 피험체로부터 얻어진 생물학적 샘플을 시험하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 종양은 섬유선종, 선암종 및 방추상 세포 신생물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 종양은 유방암, 난소암, 결장직장암, 위암, 폐암, 간세포암, 갑상선암, 자궁내막암, 백혈병 및 중추신경계의 악성종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 종양은 유방암이다.
추가 실시형태에서, 해당 방법은 2차 체세포 돌연변이 또는 복제수 이상의 존재에 대해 상기 샘플을 시험하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 2차 체세포 돌연변이는, 예를 들어 TP53 유전자, 예컨대 R248H TP53 돌연변이로 존재할 수 있다. 다른 실시형태에서, 2차 체세포 돌연변이는 Plk1, Tssk2 및/또는 SMG1 유전자로 존재할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 제1항의 종양 보유 비인간 동물에 대해 약물 후보를 투여하는 단계 및 (b) 치료에 대한 종양의 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 종양 치료에 대한 약물 후보의 선별 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 단계 (b)는 종양 세포 수의 감소, 종양 크기 또는 종양 부하의 감소, 주변 기관 내로 종양 세포 침윤의 저해, 종양 전이의 저해 및 종양 성장의 저해로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 반응을 유발하는 약물 후보의 능력을 평가하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, 종양은 섬유선종, 선암종 및 방추상 세포 신생물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 종양은 유방암, 난소암, 결장직장암, 위암, 폐암, 간세포암, 갑상선암, 자궁내막암, 백혈병 및 중추신경계의 악성종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 실시형태에서, 종양은 유방암이다.
상이한 양태에서, 본 발명은 (a) 제1항의 종양 보유 비인간 동물에 대해 약물 후보를 투여하는 단계, (b) 치료에 대한 종양 반응을 측정하는 단계, 및 (c) 종양이 치료에 대해 양성 반응을 나타낸다면, 약물 내성 암의 치료를 위한 항암제로서 약물 후보를 확인하는 단계를 포함하는, 약물 내성 암의 치료를 위해 항암제를 확인하는 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 양성 반응은 종양 세포 수의 감소, 종양 크기 또는 종양 부하의 감소, 주변 기관 내로 종양 세포 침윤의 저해, 종양 전이의 저해 및 종양 성장의 저해로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 종양은 유방암, 난소암, 결장직장암, 위암, 폐암, 간세포암, 갑상선암, 자궁내막암, 백혈병 및 중추신경계의 악성종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 종양은 유방암이다.
도 1 활성화될 수 있는 녹-인 대립유전자 PIK3CA e20H1047R 의 발생을 도시한 도면. a-d. (a) PIK3CA 좌위를 암호화하는 게놈 좌위, (b) 표적 작제물, (c) 표적화된 대립유전자, (d) 네오마이신 카세트의 제조 후 ES 내 표적화된 좌위 및 (e) Cre-매개 활성화 후 PIK3CA e20H1047R 대립유전자. f-g. 5' 프로브(f) 및 3' 프로브(g)에 의한 사우던 블롯을 사용하여 적절하게 표적화된 녹-인(knock-in: ki) 및 야생형(wt) 대립유전자를 확인한다. h-i. Cre-매개 활성화 후 PIK3CA e20H1047R /+ 유선(h) 및 신장(i)으로부터 얻은 cDNA의 생어(Sanger) 시퀀싱은 유선 내 돌연변이체 대립유전자의 발현을 확인한다.
도 2 PIK3CA e20H1047R 마우스가 유방 종양을 발생시키는 것을 도시한 도면. a-b. 복부 유선(a) 및 흉곽 유선(b) 내 종양을 보유하는 마우스. 흰색 화살표 머리부분은 종양의 위치를 표시한다. c. 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 플롯은 잠복형 PIK3CA e20mwt 대립유전자의 MMTV-Cre 매개된 활성화 후 2개의 독립적 PIK3CA e20H1047R 계통의 무종양 생존도. 종말점에서 유방 종양(~2500㎣; 본 연구에서 관찰한 86.4%의 계통 1 및 84.2%의 계통 2 PIK3CAe20H1047R /+ 암컷 마우스는 종양이 발생되었음)을 보유하는 동물만이 플롯 내에 도시된다. 두 대조군, 즉 MMTV-Cre 마우스 및 PIK3CA e20mwt은 연구의 지속기간 동안 종양이 없었다. d-g. PIK3CA e20H1047R 유방 종양의 조직학. H&E 염색 종양 부문의 분석은 섬유선종(d), 선편평세포암종(e), 선암종(f) 및 방추상 세포 종양(g)을 포함하는 다발성 조직 유형의 존재를 나타낸다. h. 조직학적 유형을 표시하는 PIK3CA e20H1047R 유방 종양의 웨스턴 블롯은 상승된 pAKT 수준(레인 3 내지 10)을 나타내고, 모든 종양 유형의 pS6을 대조군 유선(레인 1 내지 2)과 비교하였다. 종양(9, 10)은 SCID 마우스 유방 지방 패드 내에서 원발성 방추상 종양을 계대시키는 것으로부터 유도되었다.
도 3 PIK3CA e20H1047R 유방 종양의 면역형광 염색을 도시한 도면. a 내지 p. H&E(a, e, l 및 m), 항-CK18 및 항-CK5(b, f 및 j), 항-ERα(c, g 및 k), 항-Erα 및 항-PR(o), 항-PR(d, h 및 l), 및 항-CK18 및 항-비멘틴(n, p) 항체로 염색한 섬유선종(a-d), 선암종(e 내지 h 및 i 내지 l) 및 방추상 세포 종양(m 내지 p)의 일련의 부문을 도시한 도면. (p)의 부문을 제3 계대 종양 외식편으로부터 얻었다.
도 4 PIK3CA e20H1047R 구동 유방 종양 내 발현 프로파일 및 게놈 이상을 도시한 도면. a. 표시한 유전자의 세트에 대한 발현 수준을 사용하여 조직학적으로 별개의 유방 종양 유형의 계층적 클러스터링에 의해 유도된 히트맵(Heatmap). 상이한 조직학적 유형의 유방 종양은 별개의 발현 프로파일을 나타낸다. 샘플은 방추상 세포 종양(1-4; 2-4는 1로부터 유도된 연속 계대), 대조군 유선(Mg)(5-10), 섬유선종(11-15) 및 선암종(16-20)으로 도시하였다. 종양 샘플(17 및 18)은 종양(16)의 계대배양에 의해 유도되었다. 유사하게, 종양 샘플(18)은 종양(11)을 계대시키는 것으로부터 유도되었다. 대조군 유선 샘플(6, 9 및 10)은 각각 종양(12, 13 및 14)을 보유하는 동물로부터 샘플과 매칭되었다. b. 전체 엑솜 시퀀싱은 방추상 세포 종양 내 자발적 TP53 돌연변이를 확인한다. 게놈 영역, TP53 엑손(적색으로 나타낸 돌연변이), 관심의 영역으로부터의 판독물(적색 점으로서 나타내는 돌연변이 위치와 함께 실선으로서 도시함) 및 TP53의 도메인 구조 상의 돌연변이를 나타낸다. PR, 프롤린 풍부 도메인; Reg, 카복시 말단 조절 도메인; TA, 전사활성화 도메인; Tet, 테트라머화 도메인 c. CGH 분석은 방추상 세포 종양 내 NF-1의 손실을 나타낸다.
도 5 PI3K 저해제의 생체내 항-종양 활성을 도시한 도면. a. 이종이식편으로서 성장된 PIK3CA e20H1047R 유방 종양 외식편은 GDC-0941에 의한 처리에 반응한다. 각각의 처리 용량(모든 용량에 대해 n=9)에 대한 대조군(n=9)에 대해 종양 성장 저해%는 그래프 상에 나타낸다. b. GDC-0941로 처리한 동물로부터의 종양은 PI3K 경로 저해의 증거를 나타낸다.
도 6 PIK3CA e20H1047R /+ 발현 유선이 과량의 측면 분지 및 종양 결절의 존재를 나타낸다는 것을 도시한 도면. 12주령(a, b) 및 50주령(c, d, e 및 f) MMTV - Cre(a, c 및 e) 또는 PIK3CA e20H1047R /+ (b, d 및 f) 마우스로부터의 복부 유선의 카르민 알륨(Carmine alum) 염색된 전조직표본(whole mount)(a-d) 또는 H&E 염색 부분(e, f).
도 7 다산 및 무산 코호트의 무종양 생존도를 도시한 도면. 다산(465일) 및 무산(492일)에서 중앙값 무종양 생존도의 카플란-마이어 분석은 실질적으로 상이하다(로그 순위(log-rank) 검정 p-값 = 0.0002). 종말점에서 유방 종양을 보유하는 동물만을 플롯에 나타낸다.
도 8 PIK3CA e20mwt (a, c) 또는 PIK3CA e20H1047R /+ (b, d)로부터 정낭(a, b) 및 침샘(c, d)의 조직학을 도시한 도면.
도 9 원발성 및 계대 종양의 조직학적 비교를 도시한 도면. a-f. 계대 시 섬유선종(a)은 (b)에서 나타내는 방추상 세포 종양을 야기하였다. 유사하게, 계대 시 섬유선종(c)은 (d)에서 나타내는 선암종을 야기하였다. 그러나, 계대 시 방추상 세포 종양(e)은 침습성 특징(f)을 지니는 그의 방추상 세포 조직학을 유지하였다.
도 10 원발성 종양 및 계대 종양에서 종양 유형에 의해 예측된 체세포 돌연변이의 히트맵 표현을 도시한 도면. SIFT에 의해 예측되는 바와 같은 유전자 기능에 대해 유해하고, 용인되며, 스코어링되지 않는 돌연변이의 효과(호출되지 않는 효과)(Ng, P.C. & Henikoff, S. Genome Res 12, 436-46 (2002))를 나타낸다. (1, 2 및 3)은 3가지 상이한 섬유선종이며, (4 내지 6)은 선암종이다. (5 및 6)은 마우스에서 계대된 2개의 독립적 종양(4) 외식편으로부터 유도된 종양이다. (7 내지 10)은 방추상 세포 종양이다. 종양(7) 외식편은 종양(8, 9 및 10)을 유도하기 위해 마우스 내에서 연속 계대되었다.
도 11 표시한 용량에서 PI3K 저해제로 처리한 종양 보유 마우스의 진행에 대한 시간의 카플란-메이어 분석을 도시한 도면.
도 12 주형 벡터의 표적화를 도시한 도면. 벡터는 클로닝을 위한 독특한 제한 효소 부위 및 표적화 벡터를 만드는데 필요한 다른 구성요소를 제공하도록 유전자조작된다.
도 13. PIK3CA e20mwt /+ x PIK3CA e20mwt /+ 이종교배로부터 얻은 자손의 게놈형.
도 14. 게놈 분석을 위해 사용된 샘플을 도시한 도면.
표 1. 종양에서 예측된 체세포 돌연변이.
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I. 정의
달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 문헌[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)]. 당업자라면 본 발명의 실행에 사용될 수 있는 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동일한 다수의 방법 및 물질을 인식할 것이다. 게다가, 본 발명은 기재된 방법 및 물질을 결코 제한하지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, 다음의 용어를 이하에 정의한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "대립유전자", "대립유전자 변이체" 또는 "대립유전자 변형"은 상호호환적으로 사용되며, 동일한 염색체 좌위를 점유하는 유전자의 2 이상의 대안의 형태 중 어떤 것을 지칭한다. 대립유전자 변형은 돌연변이를 통해 자연적으로 생기며, 집단 내에서 표현형 다형성을 야기할 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵(또는 암호화된 폴리펩타이드에서 변화 없음)일 수 있거나 또는 변성된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 용어 "대립유전자 변이체"는 또한 유전자의 대립유전자 변이체에 의해 암호화된 단백질을 나타내기 위해 본 명세서에서 사용된다. 전형적으로, 유전자의 기준 형태는 종의 집단 또는 단일 기준 구성원으로부터 폴리펩타이드의 야생형 형태 및/또는 우세한 형태를 암호화한다. 전형적으로, 종 간에 그리고 종 중에서 변이체를 포함하는 대립유전자 변이체는 전형적으로 동일종으로부터 야생형 및/또는 우세한 형태와 적어도 80%, 90% 이상의 아미노산 동일성을 가지며; 동일성의 정도는 유전자 및 비교가 종간 또는 종내인지 여부에 의존한다. 일반적으로, 종내 대립유전자 변이체는 폴리펩타이드의 야생형 및/또는 우세한 형태와 96%, 97%, 98%, 99% 이상을 포함하여, 야생형 및/또는 우세한 형태와 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 동일성 가진다.
대상이 2개의 동일한 대립유전자의 유전자를 가질 때, 대상은 해당 유전자 또는 대립유전자에 대해 동형접합성이 되는 것으로 언급된다. 대상이 2개의 상이한 대립유전자의 유전자를 가질 때, 대상은 유전자에 대해 이형접합성이 되는 것으로 언급된다. 구체적 유전자의 대립유전자는 단일 뉴클레오타이드 또는 몇몇 뉴클레오타이드에서 서로 다를 수 있고, 뉴클레오타이드의 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 유전자의 대립유전자는 또한 돌연변이를 보유하는 유전자의 형태일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 표현 "조건적 발현" 또는 "조건적으로 발현된"은 조건이 충족될 때 유전자가 전사되는 한편, 조건이 충족되지 않을 때 유전자가 전사되지 않는 것을 지칭하도록 의도된다. 조건적 발현은 세포에 의해(즉, 인공적 개재) 자연적으로 달성되거나 또는 수행될 수 있거나 또는 인공적으로(즉, 예를 들어 화학적 작용제 등의 사용에 의해 조절되는 영역 또는 프로모터의 사용과 같은 인공적 개재의 연루에 의해) 달성되거나 또는 수행될 수 있다. 조건적 발현은, 예를 들어 Cre-매개 재조합에 의하는 것과 같은 휴면 유전자의 활성화를 야기하는 부위 특이적 재조합효소에 의해 촉발되는 재조합 사건에 의해 개시될 수 있다.
용어 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA) 및 적절하다면 리보핵산(RNA)과 같은 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 용어는 또한 동등물로서 뉴클레오타이드 유사체로부터 만들어진 DNA 또는 RNA의 유사체 및 적절하다면, 단일(센스 또는 안티센스) 및 이중가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. "단리된" 핵산 분자는 그것이 핵산의 천연 공급원 내에 본래 결합된 적어도 하나의 오염 핵산 분자로부터 확인되고 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 그것이 천연에서 발견되는 형태 또는 설정 이외의 것이다. 따라서 단리된 핵산 분자는 그것이 천연 세포 중에 존재하기 때문에 핵산와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는, 예를 들어 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체에 존재하는 경우, 보통 암호화된 단백질을 발현시키는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 용어 "발현 벡터"는 벡터에 의해 운반되는 각각의 재조합 유전자에 의해 암호화된 대상 단백질을 합성할 수 있는 플라스미드, 코스미드 또는 파지를 포함한다. 바람직한 벡터는 그것이 연결된 핵산의 자율적 복제 및/또는 발현이 가능한 것이다. 본 명세서에서, 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 벡터 형태이기 때문에, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호호환적으로 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 용어 "전사 조절 구성요소" 및 "전사 조절 서열"은 상호호환적으로 사용되며, 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 암호 서열의 발현에 필요한 핵산, 예를 들어 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 대조군 서열은, 예를 들어, 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 인핸서, 스플라이싱 신호 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다. 이들 용어는 RNA 폴리머라제 및 전사 인자, 상류의 구성요소, 인핸서 및 반응 구성요소의 기본적 상호작용에 필요한 프로모터, 코어 구성요소를 포함하는 전사를 촉진하거나 또는 조절하는 모든 구성요소를 포함하도록 의도된다(Lewin, "Genes V" (Oxford University Press, Oxford) 페이지 847-873). 유전자의 전사 조절 구성요소 또는 유전자의 분류에 대한 본 명세서의 언급은 자연적으로 생기는 전사 조절 구성요소의 모든 또는 무결함 영역과 유전자 또는 유전자 그룹의 전사 조절 구성요소의 변형된 형태를 둘 다 포함한다. 이러한 변형된 형태는 구성요소의 재배열, 일부 구성요소의 결실 또는 이질적인 서열 및 이종성 구성요소의 삽입을 포함한다. 전사 조절 구성요소의 모듈 특성 및 인핸서와 같은 일부 조절 구성요소의 기능의 위치 의존도의 부재는 이러한 변형을 가능하게 한다. 유전자의 조절 구성요소를 나누기 위해 그의 위치 및 기능을 결정하는데 수많은 기법이 이용가능하다. 이러한 정보는 원한다면 구성요소의 변형을 지시하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 유전자의 전사 조절 구성요소의 무결함 영역이 사용되는 것이 바람직하다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때, "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 전서열(presequence) 또는 분비 리더에 대한 DNA는 그것이 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현된다면, 폴리펩타이드에 대해 DNA에 작동가능하게 연결되며; 프로모터 또는 인핸서는, 그것이 서열의 전사에 영향을 미친다면 암호 서열에 조작가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는, 그것이 번역을 가능하게 하도록 위치된다면, 암호 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 분비 리더의 경우에 인접해 있고, 판독 단계에서 인접해 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접해서는 안 된다. 결합은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 수행된다. 이러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(adaptor) 또는 링커는 통상적인 실행에 따라 사용된다.
용어 "형질감염"은 핵산 매개 유전자 전달에 의한 수용 세포 내로 핵산, 예를 들어 발현 벡터의 도입을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "형질전환"은 세포 유전자형이 외인성 DNA 또는 RNA의 세포 흡수 결과로서 변화되고, 형질전환된 세포가 원하는 이종성 단백질을 발현시키는 과정을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 용어 "이식유전자"는 그것이 도입되는 유전자이식 동물 또는 세포에 대해 부분적으로 또는 전체적으로 이종성, 즉, 외래이거나, 또는 그것이 도입되지만, 그것이 삽입된(예를 들어, 녹아웃에서 천연 유전자의 위치 또는 그의 삽입 결과와 다른 위치에 삽입됨) 세포의 게놈을 변성시키기 위한 그런 방법으로 동물의 게놈 내로 삽입되도록 설계되거나, 또는 삽입된 유전자이식 동물 또는 세포의 내인성 유전자에 대해 상동성인 핵산 서열을 지칭한다. 이식유전자는 선택된 핵산의 최적의 발현에 필요할 수 있는 하나 이상의 전사 조절 서열 및 임의의 다른 핵산, 예컨대 인트론에 작동가능하게 연결될 수 있다.
따라서, 용어 "이식유전자 작제물"은 전사적 조절 서열, 폴리아데닐화 부위, 복제원점, 마커 유전자 등으로서 이식유전자 및 (선택적으로) 이러한 다른 핵산 서열을 포함하고, 숙주 유기체의 게놈 내 삽입을 위한 이식유전자의 일반적 조작에 유용할 수 있는 핵산을 지칭한다.
용어 "유전자이식의"는, 예를 들어 이식 유전자를 은닉하는 동물 또는 작제물의 특성을 기재하기 위해 본 명세서에서 형용사로서 사용된다. 예를 들어, 본 명세서에 사용되는 바와 같은, "유전자이식 유기체"는 임의의 동물, 바람직하게는 비인간 포유류, 더 바람직하게는 설치류이며, 이때 동물의 한 종 이상의 세포는, 예를 들어 당업계에 잘 공지된 유전자이식 기법에 의하는 것과 같은 인간 개재 방법에 의해 도입된다. 핵산은 미세주입법에 의해 또는 재조합바이러스에 의한 감염에 의하는 것과 같은 의도적인 유전적 조작 방법에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 세포 전구체 내로 도입에 의해 세포 내로 도입된다. 용어 "유전자 조작"은 고전적 이종교배 또는 시험관내 발효를 포함하지 않지만, 오히려 재조합 DNA 분자의 도입에 관한 것이다. 이 분자는 염색체 내에 도입될 수 있거나 또는 DNA를 염색체 외로 복제할 수 있다.
유전자의 "녹아웃"은 표적 유전자의 기능 감소를 야기하는 유전자의 서열 내 변성을 의미하므로, 바람직하게는 표적 유전자 발현은 검출가능하지 않거나 또는 사소하다. 유전자이식 녹아웃 동물은 표적 유전자의 이형접합성 녹아웃, 또는 표적 유전자의 동형접합성 녹아웃을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "녹아웃"은 또한 표적 유전자의 변성이, 예를 들어 표적 유전자 변성, 표적 유전자 부위(예를 들어, Cre-lox 시스템 내 Cre) 재조합을 촉진하는 효소의 도입을 촉진하는 물질에 동물의 노출 또는 출생 후 표적 유전자 변성을 지시하는 다른 방법으로 일어날 수 있는 경우, 조건적 녹아웃을 포함한다.
"녹-인"은 이식유전자의 발현을 야기하는 숙주 세포 게놈에서 및/또는 내인성 표적유전자의 변성된 발현에서(예를 들어, 증가된(이소성(ectopic)을 포함) 또는 감소된 발현), 예를 들어 표적 유전자의 추가적인 복제의 도입에 의해 또는 표적 유전자의 내인성 복제의 향상된 발현을 제공하는 조절 서열을 작동가능하게 삽입하는 것에 의한 이식유전자의 표적화된 삽입을 지칭한다. "녹-인" 유전자이식은 이식유전자의 이형접합성 녹-인 또는 이식유전자의 동형접합성 녹-인을 포함할 수 있다. "녹-인"은 또한, 이식유전자의 발현 및/또는 내인성 표적 유전자의 변성된 발현이, 예를 들어 이러한 발현을 촉진시키는 물질에 동물의 노출에 의해, 표적화된 삽입 부위(예를 들어, Cre-lox 시스템 내 Cre)에서 재조합을 촉진하는 효소를 도입함으로써, 또는 표적화된 삽입 부위를 변성하기 위한 일부 다른 방법에 의해 생길 수 있다면, 조건적 녹-인을 포함한다.
"동형접합적" 상태는 동일한 대립유전자가 상동성 염색체 상의 대응하는 좌위에 존재할 때 나타나는 유전적 조건을 의미한다. 대조적으로, "이형접합성" 상태는 상이한 대립유전자가 상동성 염색체 상의 대응하는 좌위에 존재할 때 나타내는 유전적 조건을 의미한다.
"부위 특이적 재조합효소"는 일부 바이러스 및 박테리아에 존재하며, 엔도뉴클레아제와 리가제 특성을 둘 다 갖는 것을 특징으로 하는 효소이다. 부위 특이적 재조합효소는 적어도 다음의 4가지 사건 (a) 동일 배향으로(예를 들어, 머리-대-꼬리 또는 꼬리-대-머리)에서 "양립가능한 부위 특이적 재조합효소 표적 부위"(site-specific recombinase targeting site: SSRTS)에 측접하는 DNA 단편의 결실; (b) 반대 배향으로(예를 들어, 머리-대-머리 또는 꼬리-대-꼬리) 양립가능한 SSRTS에 측접한 DNA 단편의 반전; (c) 양립가능한 SSRTS 내로 SSRTS를 함유하는 사이클릭 DNA 단편의 통합; 및 (d) 상이한 염색체 상에 위치된 양립가능한 SSRTS 간의 염색체 전좌을 촉매한다. 해당 반응을 수행하기 위해, 부위-특이적 재조합효소는 전형적으로 적어도 다음의 4가지 활성을 가진다: (1) 1 또는 2개의 특이적 DNA 서열의 인식; (2) 상기 DNA 서열 또는 서열들의 절단; (3) 가닥 교환에 수반된 DNA 토포아이소머라제 활성; 및 (4) DNA의 절단된 가닥을 재봉합하기 위한 DNA 리가제 활성(Sauer, B., Cur . Opin . Biotech. 5: 521-527, 1994).
용어 "재조합효소" 또는 "부위-특이적 재조합효소"는 DNA 구조를 변성시키는 부위 특이적 재조합(SSR)을 수행하는 효소(들)를 지칭한다. 이 정의는 유전자전위효소, 람다 통합/절제 효소 및 부위 특이적 재조합효소를 포함한다. 잘 공지된 재조합효소의 예는 Cre-lox, FLP/FRT, R/RS, Gin/gix, a pSR1 시스템, cer 시스템 및 fim 시스템을 제한 없이 포함한다(예를 들어, 문헌[N. L. Craig, Annu . Rev . Genet . 22:17, 1988]); 문헌[Odell et al., Homologous Recomb. Gene Silencing Plants, 1994, pp. 219-270, Paszkowski, Jerzy, ed. Kluwer: Dordrecht, Germany]). 추가적으로, SSR 시스템은 미생물유기체, 예컨대 파지, 박테리아(예를 들어, 이콜라이(E. coli)), 효소 등에서 확인되었다. 이는 통합 및 절제를 위한 이콜라이 람다 att P 시스템(Zubko et al. Nature Biotechnology 18:442, 2000) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 파지 C31 인테그라제(Groth et al. Proc . Natl . Acad. Sci . USA 97:5995, 2000)를 포함한다. 이들 미생물유기체로부터 SSR 시스템이 이 시스템이 유래된 유기체와 상이한 유기체(식물을 포함) 내로 도입될 때, 이는 본래의 유기체에서와 동일한 방법으로 거동한다.
"재조합효소 부위" 또는 "부위-특이적 재조합 서열"은 재조합효소가 재조합 사건을 가능하게 하는 것으로 인식될 DNA 서열을 의미한다. 이는 작용기가 유지되고, 재조합효소가 여전히 부위를 인식하며, DNA 서열에 결합하고, 두 인접한 재조합효소 부위 간의 재조합을 촉매한다면, 야생형 또는 돌연변이체 재조합 부위일 수 있는 것으로 인식될 것이다.
용어 "플록스된(floxed)"은 유전적 구성요소 또는 이의 부분이 직렬의(tandem) 부위-특이적 서열에 측접하는 것을 지칭한다. 부위-특이적 서열은 동일한 배향으로, 즉, 직접적으로 반복되거나(DNA 구성요소가 SSR에 대해 제거되도록) 또는 서로 마주보는 배향으로(DNA 구성요소가 SSR에 대해 반전되도록) 배향될 수 있다. 플록스된 구성요소는 단일 프로모터, 전사 '정지' 차단 구성요소, 표적 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 또는 이들 및 다른 유전자 구성요소의 조합일 수 있다.
"부위-특이적 재조합 기질" 또는 "SSR 기질"은 재조합효소 부위 상의 부위-특이적 재조합효소로부터 초래되는 SSR의 기질인 임의의 DNA를 지칭한다. 용어는 플록스된 DNA 구성요소, 즉, 재조합효소 부위에 측접한 해당 DNA 구성요소를 포함한다.
용어 "시조(founder) 계통" 및 "시조 동물"은 이식유전자가 첨가된 배아의 성숙 산물인 해당 동물, 즉, DNA가 삽입되고, 하나 이상의 대용 숙주 내로 이식된 배아로부터 성장된 해당 동물을 지칭한다.
용어 "자손" 및 "유전자이식 동물의 자손"은 본래 형질전환된 포유류에 후속하는 세대마다의 임의의 및 모든 새끼를 지칭한다.
용어 "포유류"는 인간, 고등 영장류, 가축 및 농장 동물, 예컨대 토끼, 돼지, 양, 염소, 소 및 동물원, 운동 또는 애완 동물, 및 설치류, 예컨대 마우스 및 래트를 포함하는 포유류의 모든 구성원을 지칭한다.
용어 "비인간 포유류"는 인간을 제외한 포유류의 모든 구성원을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호 호환적으로 사용되고, 모든 이러한 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 전달되는 수와 상관없이 주된 대상 세포 및 그로부터 유도된 배양물을 포함한다. 또한 모든 자손은 의도적 또는 우연한 돌연변이 때문에 DNA 함량이 정확하게 동일하지 않을 수 있다는 것이 이해된다. 본래 형질전환된 세포에서 선별되는 바와 같은 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 포함된다. 별개의 설계가 의도되는 경우, 이는 문맥으로부터 명백하게 될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "종양"은 악성이든 또는 양성이든 모든 신생물 세포 성장 및 증식 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류 내 생리학적 조건을 지칭하거나 또는 기재한다. 암의 예는, 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프 악성종양을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 암의 더 특별한 예는 편평상피세포암(예를 들어, 상피 편평상피세포암), 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평상피 암종을 포함하는 폐암, 복막암, 간세포암, 위장관암을 포함하는 위암 또는 위암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장 또는 신세포암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암종, 항문 암종, 음경 암종뿐만 아니라 두경부암을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 저해하거나 또는 방지하고/하거나 세포 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 용어는 방사성 동위원소(예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학치료제 및 단편 및/또는 이의 변이체를 포함하는, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 유래의 독소, 예컨대 소분자 독소 또는 효소적으로 활성인 독소를 포함하는 것으로 의도된다.
"화학치료제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로포스파마이드(사이톡산(CYTOXAN)(등록상표)); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온(carboquone), 메투레도파 및 유레도파; 에틸렌이민 및 알트레타민을 포함하는 메틸아멜라민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌포스포르아마이드, 트라이에틸렌티오포스포르아마이드 및 트라이메틸올로멜라민; 아세토제닌(특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라하이드로카나비놀(드로나비놀, 마리놀(MARINOL)(등록상표)); 베타-라파촌; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄토테신(합성 유사체 토포테칸(하이캄틴(HYCAMTIN)(등록상표)), CPT-11(이리노테칸, 캄토사르(CAMPTOSAR)(등록상표)), 아세틸캄토테신, 스코폴레틴 및 9-아미노캄토테신)을 포함; 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(그의 아도젤레신, 칼젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포사이드; 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함); 엘류테로빈(eleutherobin); 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람뷰실, 클로르나파진, 클로로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 유라실 머스타드; 나이트로소유레사, 예컨대 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴; 항생제, 예컨대 엔다이인 항생제(예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1(예를 들어, 문헌[Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)] 참조); 다인에미신 A를 포함하는 다인에미신; 에스페라마이신;뿐만 아니라, 네오카지노스타틴 발색단 및 관련된 색소 단백질 엔다이인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(아드리아마이신(ADRIAMYCIN)(등록상표), 모폴리노-독소루비신, 사이아노모폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포좀 주사(독실(DOXIL)(등록상표)), 리포좀 독소루비신 TLC D-99(마이오세트(MYOCET)(등록상표)), 페길화된 리포좀 독소루비신(카엘릭스(CAELYX)(등록상표)) 및 데옥시독소루비신을 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 퀄라마이신(quelamycin), 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 대사길항물질, 예컨대 메토트렉세이트, 젬시타빈(젬자르(GEMZAR)(등록상표)), 테가푸르(유프토랄(UFTORAL)(등록상표)), 카페시타빈(젤로다(XELODA)(등록상표)), 에포틸론 및 5-플루오로유라실(5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트라이메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 다이데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 항부신성 물질, 예컨대 아미노글루테티마이드, 미토탄, 트라이로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글라이코사이드; 아미노레불린산; 에닐유라실; 암사크린; 베스트람부실; 비산트렌; 에다트라세이트; 데포파민; 데메콜신; 다이아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 하이드시유레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK(등록상표) 다당류 복합체(오리건주 유겐에 소재한 JHS 네츄럴 프로덕츠(Natural Products)); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트라이아지쿠온; 2,2',2''-트라이클로로트라이에틸아민; 트라이코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 유레탄; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀(탁솔(TAXOL)(등록상표)), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형(아브락산(ABRAXANE)(등록상표)) 및 도세탁셀(탁소테르(TAXOTERE)(등록상표)); 클로람뷰실; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 작용제, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴(벨반(VELBAN)(등록상표)), 빈크리스틴(온코빈(ONCOVIN)(등록상표)), 빈데신(엘디신(ELDISINE)(등록상표), 필데신(FILDESIN)(등록상표)), 및 비노렐빈(나벨빈(NAVELBINE)(등록상표))을 포함하는, 미세소관 형성으로부터의 튜불린 중합을 방지하는 빈카; 에토포사이드(VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 류코보빈; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포아이소머라제 저해제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예컨대, 벡사로텐(타르그레틴(TARGRETIN)(등록상표))을 포함하는 레티노산; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트(예를 들어, BONEFOSO(등록상표) 또는 OSTAC(R)), 에티드로네이트(DIDROCAL(등록상표)), NE-58095, 졸레드론산(zoledronic acid)/졸레드로네이트(zoledronate)(조메타(ZOMETA)(등록상표)), 알렌드로네이트(포사맥스(FOSAMAX)(등록상표)), 파미드로네이트(아레디아(AREDIA)(등록상표)), 틸루드로네이트(스켈리드(SKELID)(등록상표)), 또는 리세드로네이트(악토넬(ACTONEL)(등록상표)); 트록사시타빈(1,3-다이옥살란 뉴클레오사이드 사이토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 특히 이상 세포증식에 연루된 신호전달 경로에서 유전자 발현을 저해하는 것, 예를 들어, PKC-α, Raf, H-Ras 및 상피 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGF-R); 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE)(등록상표) 백신 및 유전자 치료 백신, 예를 들어, 알로벡틴(ALLOVECTIN)(등록상표) 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)(등록상표) 백신 및 백시드(VAXID)(등록상표) 백신; 토포아이소머라제 1 저해제(예를 들어, 루토테칸(LURTOTECAN)(등록상표)); rmRH(예를 들어, 아바렐릭스(ABARELIX)(등록상표)); BAY439006(소라페닙; 바이엘(Bayer)); SU-11248(화이자(Pfizer)); 페리포신, COX-2 저해제(예를 들어, 셀렉콕십 또는 에토리콕십), 프로테오좀 저해제(예를 들어, PS341); 보테조밉(VELCADE(등록상표)); CCI-779; 티피파닙(R11577); 오라페닙, ABT510; Bcl-2 저해제, 예컨대 오블리머센 나트륨(게나센스(GENASENSE)(등록상표)); 픽산트론; EGFR 저해제(이하의 정의 참조); 티로신 키나제 저해제(이하의 정의 참조); 및 상기 중 어떤 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체;뿐만 아니라 상기 중 2 이상의 조합물, 예컨대 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 치료에 대한 약어인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴(엘록사틴(ELOXATIN)(등록상표))에 의한 치료 요법에 대한 약어인 FOLFOX를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "프로드러그"는 모 약물에 비해 종양 세포에 대해 덜 세포독성이고, 더 활성인 모 형태로 효소적으로 활성화되거나 또는 전환될 수 있는 약제학적으로 활성인 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다. 예를 들어, 문헌[Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) 및 Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)] 참조. 본 발명의 프로드러그는, 포스페이트-함유 프로드러그, 티오포스페이트-함유 프로드러그, 설페이트-함유 프로드러그, 펩타이드-함유 프로드러그, D-아미노산-변형 프로드러그, 글라이코실화된 프로드러그, β-락탐-함유 프로드러그, 선택적으로 치환된 페녹시아세트아마이드-함유 프로드러그 또는 선택적으로 치환된 페닐아세트아마이드-함유 프로드러그, 5-플루오로사이토신 및 더 활성의 무세포독성 약물로 전환될 수 있는 다른 5-플루오로유리딘 프로드러그를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용을 위한 프로드러그 형태로 유도될 수 있는 세포독성 약물의 예는 상기 기재된 해당 화학치료제를 포함한다.
"리포좀"은 포유류에 대한 약물(예컨대 본 명세서에 개시된 항-ErbB2 항체 및 선택적으로 화학치료제)의 전달에 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포이다. 리포좀의 성분은 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 이중층 형성에서 흔히 배열된다.
"소분자"는 약 500 달톤 미만의 분자량을 갖는 것으로 본 명세서에서 정의된다.
본 명세서의 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 그것이 원하는 항원-결합 활성을 나타낸다면, 적어도 2개의 무결함 항체 및 항체 단편으로부터 형성된 무결함 항체, 다클론성 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체)를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어진 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 포함하는 개개의 항체는 부수적 양으로 존재할 수 있는 가능한 자연적으로 생기는 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단클론성 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위로 향한다. 더 나아가, 대조적으로 상이한 결정 요인(에피토프)으로 향하는 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 제제에 대해, 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 결정요인으로 향한다. 그들의 특이성에 추가로, 단클론성 항체는 그들이 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 균일한 집단으로부터 얻어지는 것과 같은 항체의 특징을 나타내고, 어떤 구체적 방법에 의해 항체의 생성에 필요한 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론성 항체는 문헌[Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음으로 기재된 혼성 방법에 의해 만들어질 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 만들어질 수 있다(예를 들어, 미국특허 제4,816,567호 참조). "단클론성 항체"는 또한 예를 들어 문헌[Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기법을 사용하여 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본 명세서의 단클론성 항체는 구체적으로는 중 및/또는 경쇄의 부분이 특정 종으로부터 유래된 항체 내 대응하는 서열에 대해 동일하거나 또는 상동성이거나 또는 특정 항체 분류 또는 하위분류에 속하는 "키메라" 항체를 포함하는 한편, 쇄(들)의 나머지는, 그들이 원하는 생물학적 활성을 나타낸다면, 다른 종으로부터 유래된 항체 내 대응하는 서열에 대해 동일하거나 또는 상동성이거나 또는 다른 항체 분류 또는 하위분류에 속한다(미국특허 제4,816,567호; 및 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]). 본 명세서의 관심의 키메라 항체는 비인간 영장류(예를 들어, 긴꼬리 원숭이, 유인원 등) 및 인간 불변 영역 서열로부터 유래된 가변 도메인 항원 결합 서열을 포함하는 영장류화된 항체를 포함한다.
"항체 단편"은 무결함 항체의 부분을 포함하며, 바람직하게는 항원-결합 또는 이의 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 다이아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편(들)으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
"무결함" 항체는 항원-결합 가변 영역뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인(CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 무결함 항체는 하나 이상의 효과기 기능을 가진다.
비인간(예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 면역글로뷸린으로 유래된 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대개, 인간화된 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 용량을 갖는 마우스, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종의 초가변 영역(공여체 항체)으로부터의 잔기에 의해 대체되는 인간 면역글로뷸린(수용 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로뷸린의 프레임워크 영역(framework region: FR) 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 대체된다. 더 나아가, 인간화된 항체는 수용 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정제하도록 만들어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 모두 적어도 하나의, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 초가변루프는 비인간 면역글로뷸린의 초가변루프에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로뷸린 서열의 프레임워크 영역이다. 인간화된 항체는 선택적으로 또한 면역글로뷸린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로뷸린의 일부를 포함할 것이다. 추가 설명을 위해, 문헌[Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
II. 상세한 설명
암의 조건적 PIK3CA H1047R 비인간 동물 모델의 발생
상기 논의한 바와 같이, 분류 IA PI3K 촉매 서브유닛, p110α, p110β 및 p110
Figure pct00003
는 p85α, p55α, p50α, p85β 또는 p55γ 조절 서브유닛과 복합체로 진성 헤테로다이머로서 생긴다. 정상 세포에서, PI3K는 기본적 불활성 상태로 유지되고, 성장 인자 자극 및 세포 표면 수용체 진입 후 활성으로 된다. 활성화된 PI3K는 인산화되고, 포스파티딜이노시톨 4, 5 비스포스페이트(PIP2)를 전환시켜 포스파티딜이노시톨 3, 4, 5 트리스포스페이트(PIP3)를 야기한다. 상승된 세포 PIP3 수준은 PI3K-효과기의 활성화를 촉진하는데, 이는 결국 세포 성장, 증식 및 생존을 포함하는 다수의 세포 과정을 조절한다.
포스포이노시타이드 3-키나제(PI3K) 촉매적 서브유닛 p110α을 암호화하는 PIK3CA 내 종양 형성 돌연변이는 인간 유방암의 25% 이상으로 생긴다. PIK3CA 유전자에서 빈번한 돌연변이는 또한 난소암, 결장직장암, 위암, 폐암, 간세포암, 갑상선암 및 자궁내막암, 급성 백혈병 및 중추신경계의 악성종양과 같은 다른 유형의 인간 암에서 보고되었다.
본 발명은 유방암에 대해 녹-인 마우스 모델의 발생에 적어도 부분적으로 기반하며, 여기서 내인성 PIK3CA 대립유전자는 빈번하게 발견되는 PIK3CA H1047R (PIK3CA e20H1047R ) 돌연변이체 대립유전자의 조직 특이적 조건적 발현을 허용하도록 변형되었다. 특히, 내인성 PIK3CA 대립유전자는 야생형 암호 엑손에 인접하여 H1047R을 포함하는 종양발생 돌연변이체 PIK3CA 엑손의 휴면 복제를 위치시킴으로써 변형되었다. 휴면기 돌연변이체 대립유전자의 활성화 전, 유전자조작된 마우스는 변형된 야생형 PIK3CA(PIK3CA e20mwt )를 발현시켰다. 그러나, Cre-매개 재조합 시, 돌연변이체 PIK3CA H1047R 대립유전자(PIK3CA e20H1047R )는 활성화되었고, 이는 그의 발현을 유발하였다. 본 명세서에 제시된 결과는 마우스 유방 상피조직 내 PIK3CA H1047R 대립유전자의 조건적 활성화가 돌연변이체 PIK3CAH1047R 발현 및 종양 형성을 유발한다는 것을 나타낸다. 추가로, 이 모델로부터 방추상 세포 종양의 전체 엑솜 분석을 수행하는 것에서, 자발적 기능상실 TP53 돌연변이의 출현은 종양 형성에 연루된 잠재적 협력 사건으로서 확인되었다.
잠복형 PIK3CA H1047R 대립유전자의 활성화는 다수의 조직학적 유형을 지니는 유방 종양을 야기하는 것으로 발견되었다. PIK3CA e20H1047R 의 발현과 일치되게, 모든 종양은 PI3K 경로의 활성화를 나타내었다. 추가로, PIK3CA H1047R 구동 유방 종양의 전체 엑솜 분석은 방추상 세포 유형 종양의 발생 동안 자발적으로 나타난 잘 특성규명된 TP53 핫 스팟 돌연변이를 포함하는 다수의 돌연변이를 확인하였다. 종양 형성 동안 2차 돌연변이의 출현을 연구하는 것에서 모델의 이용성을 입증하는 것 외에도, 임상적 개발에서 PI3K-저해제인 GDC-0941의 효능을 이 마우스 모델을 사용하여 시험하였고, 이는 종양이 PI3K 저해에 대해 반응하였다는 것을 나타내었다. 따라서, 본 명세서에서 개발된 유전자이식 비인간 동물 모델은 종양 개시, 진행 및 처리를 연구하는데 유용한 도구이고, 또한 그 자체로 종양 발생 동안 돌연변이체 PIK3CA와 협력하는 병변의 확인을 제공한다. 특히, 본 발명의 비인간 유전자이식 동물 모델은 항암제의 선별에서 이용성을 발견하며, PIK3CA e20H1047R 및 2차 돌연변이는 단독으로 또는 임의의 조합으로 진단, 분류, 예후 및 유방암을 포함하지만 이것으로 제한되지 않는 암의 치료에서 이용성을 발견한다.
본 발명의 유전자이식 마우스를 만드는 것에서, Cre-lox 재조합 시스템이 사용되었다. Cre 단백질은 부위-특이적 DNA 재조합효소인데, 이는 DNA 분자 내 특이적 부위 사이의 DNA 재조합을 촉매할 수 있다. loxP 서열로서 알려진 이들 부위는 재조합이 일어날 수 있는 방향성 코어 서열을 둘러싸는 Cre에 대해 특이적 결합 부위를 포함한다. 세포 게놈 내에서 loxP 부위를 갖는 세포가 Cre를 발현시킬 때, 재조합 사건은 loxP 부위 사이에서 일어날 수 있다. 이중 가닥 DNA는 Cre 단백질에 의해 loxP 부위 둘 다에서 절단된다. 그 다음에 가닥은 DNA 리가제와 재결합된다. 재조합 결과는 loxP 부위의 배향에 의존한다. 동일 염색체 암 상의 두 lox 부위에 대해, 반전된 loxP 부위는 삽입을 야기하는 한편, loxP 부위의 직접 반복은 결실 사건을 야기할 것이다.
Cre-lox 재조합 시스템은 포유류 세포주 및 유전자이식 마우스 내 유전자 발현을 활성화시키는데 사용을 위해 처음으로 개발되었지만, 이는 Cre-Lox 재조합이 유전자이식 동물의 다양하게 선택된 세포 유형에서 고효율로 loxP-측접 염색체 DNA 서열을 결실시키는데 사용될 수 있고, Cre-lox 재조합이 생체내에서 표적화하는 조건적 유전자에 대해 사용될 수 있기 때문이다. 추가로, 앞서 열거된 것을 포함하는 다른 부위-지정 재조합 시스템은 본 명세서에 구체적으로 예시된 마우스 모델과 유사한 비인간 유전자이식 동물을 만들기 위해 사용될 수 있다.
유방암 내 PIK3CA 돌연변이의 중요성 때문에, PIK3CA H1047R 대립유전자의 역할은 PIK3CA e20mwt 마우스 대 MMTV-Cre 유전자이식 마우스를 사육함으로써 유방 종양 형성에서 시험되었는데, Cre 재조합효소는 유선 허용 MMTV LTR 프로모터의 제어 하에 발현되었다. 다른 유형의 종양에 대해, 조직 허용 또는 조직 특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 특이적 조직 유형 또는 기관, 예컨대 간, 췌장, 신장, 간, 폐, 고환의 발현을 야기하는 조절 구성요소를 포함하는 조직 특이적 프로모터는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 일부 기능적 특징이 공지되어 있는 인간 프로모터 서열의 TiProD 데이터베이스로부터 입수가능하다. 데이터베이스는 사용자가 개개의 프로모터 및 그것이 매개하는 발현 패턴을 질의하고, 그의 조직-특이적 활성에 따른 프로모터의 세트를 검색하게 한다. PIK3CA 돌연변이가 어떤 역할을 하는 다른 암 유형의 비인간 유전자이식 동물 모델은, 당업계에 공지된 적절한 조직 특이적 프로모터 중 하나를 사용함으로써 만들어질 수 있다.
본 발명의 유전자이식 비인간 동물은 그의 자손을 포함하며, 임의의 적합한 방법에 의해 이식유전자의 존재 및/또는 발현에 대해 선별될 수 있다. 선별은 이식유전자의 적어도 일부에 대해 상보적인 프로브를 사용하여 꼬리 조직으로부터 제조된 DNA의 PCR 또는 사우던 블롯에 의해 종종 수행된다. 이식유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 항체를 사용하는 면역조직화학 또는 웨스턴 블롯 분석은 이식유전자 산물의 존재에 대해 선별을 위한 대안의 또는 추가적인 방법으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 가장 높은 수준에서 이식유전자를 발현시키는 것으로 믿어지는 조직 또는 세포는 노던 블롯 또는 RT-PCR을 사용하여 이식유전자의 RNA 발현에 대해 시험된다.
이식유전자의 존재를 평가하기 위한 대안의 또는 추가적인 방법은 적합한 생화학적 분석, 예컨대 효소 및/또는 면역학적 분석, 특정 마커 또는 효소 활성에 대한 조직학적 균주, 유세포 분석 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 혈액 분석은 또한 혈액 내 이식유전자 산물의 존재를 검출하는데 뿐만 아니라 다양한 유형의 혈액 세포 및 다른 혈액 구성요소 수준에 대한 이식유전자의 효과를 평가하는데 유용할 수 있다.
후보 항암제의 선별
본 발명의 비인간 유전자이식 동물 모델은 항암 활성을 위한 후보 작용제를 선별하는 것에서 이용성을 발견한다. 용어 "항암 활성"은 가장 넓은 의미로 사용되며, 숙주에 유리한 효과를 제공할 수 있는 종양 발생 및/또는 성장을 방지하거나, 지연시키거나, 늦추거나 또는 저해하는 것에서 어떤 효과를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 것에서의 활성을 포함한다. 따라서 "항암 활성"은 직접적으로 또는 간접적으로 암 세포 수를 감소시키고, 종양 크기 또는 종양 부하를 감소시키며, 주위 기관 내로 암 세포 침윤을 저해하고(즉, 일정한 정도로 늦추고, 바람직하게는 중단시킴), 종양 전이를 저해하며(즉, 일정한 정도로 늦추고, 바람직하게는 중단시킴), 일정한 정도로 종양 성장을 저해하고/하거나 암과 관련된 하나 이상의 증상을 일정한 정도로 완화시키는 능력을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
암의 치료에서 임상적 사용을 발견하는 항암 활성을 갖는 작용제에 특히 관심이 있다. 본 개시내용에서 PIK3CA 내 종양 형성 돌연변이, 및 특히 돌연변이체 PIK3CA H1047R 대립유전자의 활성화 또는 2차 돌연변이를 특징으로 하는 암을 치료하는데 임상적 이점을 제공할 수 있는 항암 활성을 갖는 작용제의 확인에 특히 관심이 있다.
일반적으로, 항암 활성은 암 표현형에 대한 효과가 후보 작용제의 항암 활성을 표시하는, 비인간 유전자이식 동물은 모델에서 암 표현형에 대한 효과의 존재 또는 부재를 평가함으로써 평가된다.
본 발명의 비인간 동물을 사용하여 항암 활성에 대해 선별할 수 있는 후보 항암제는 소분자, 펩타이드, 항체 및 다른 폴리펩타이드를 포함하여, 합성, 자연적으로 생기거나 또는 재조합적으로 생성된 분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
후보 작용제는 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함하는 매우 다수의 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 수많은 수단이 무작위화된 올리고뉴클레오타이드 및 올리고펩타이드의 발현을 포함하는 매우 다수의 유기 화합물 및 생체 분자의 무작위 및 단방향 합성을 위해 이용가능하다. 대안적으로 박테리아, 진균, 식물 및 동물 추출물의 형태에서 천연 화합물의 라이브러리는 이용가능하거나 또는 용이하게 생성된다. 추가적으로, 천연 또는 합성적으로 생성된 라이브러리 및 화합물은 통상적인 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 용이하게 변형되고, 조합 라이브러리를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 공지된 약리학적 작용제는 아실화, 알킬화, 에스터화, 아미드화 등과 같은 단방향 또는 무작위 화학적 변형으로 구조적 유사체를 생성할 수 있다.
후보 작용제는 항암 활성을 시험하기 위해 작용제의 전달을 위한 원하는/원하거나 적합한 임의의 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 후보 작용제는 주사에 의해(예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하 등으로 주사에 의해), 인퓨전, 경구로 또는 임의의 다른 바람직한 수단에 의해 투여될 수 있다.
선별 방법은 후보 작용제의 양을 달리해서 투여하는 단계(작용제가 전혀 없음으로부터, 예를 들어 독성 한계 내에서 동물에 성공적으로 전달될 수 있는 양의 상한에 접근하는 작용제의 양)을 수반할 수 있으며, 상이한 제형 및 경로로 작용제의 전달을 포함할 수 있다. 작용제는 단일로 투여될 수 있거나 또는 특히 작용제의 조합 투여가 상승적 효과를 야기할 수 있는 경우, 둘 이상의 조합으로 조합될 수 있다.
사전에 존재하는 암을 치료하기 위한 후보 작용제의 능력은 유전자이식 동물에 대해 후보 작용제를 투여하는 단계 및 암 표현형의 조절을 평가하는 단계에 의해 평가될 수 있다. 암 표현형의 조절은, 예를 들어 종양 부하, 종양 수, 종양 크기, 종양 세포의 대사 활성, 무진행 생존율(progression-free survival: PFS), 전반적인 생존도(overall survival: OFS) 등에 대한 효과의 존재 또는 부재를 평가하는 단계에 의하는 것과 같이 평가될 수 있다.
암 예방을 가능하게 하는 후보 작용제의 능력은 종양 발생을 초래하는 돌연변이의 유발 전 후보 작용제를 투여하는 단계에 의해 평가될 수 있다. 암 예방은 개재가 없을 때(예를 들어, 항암 활성을 갖는 작용제의 투여가 없을 때) 예상된 암의 이환수 및/또는 종양 중증도에 비해 동물에서 종양의 이환수 및/또는 중증도의 감소를 지칭한다.
본 발명의 추가적인 상세한 설명은 다음의 비제한적 실시예에 의해 설명된다.
실시예
조건적으로 활성가능한 PIK3CAH1047R 마우스 모델
재료 및 방법
조건적으로 활성가능한 PIK3CA H1047R 마우스의 발생
본 발명자들은 최종 표적화 벡터를 조립하기 위해 표적화 벡터 주형을 사용하였다(도 1). 주형으로서 C57B/6N ES 세포로부터의 마우스 게놈 DNA를 사용하여, PIK3CA 엑손 18 내지 19를 포함하는 2.045kb 단편(왼쪽 암(arm)), PIK3CA 야생형 엑손 20을 포함하는 588bp 영역(중간 암) 및 또한 엑손 20 및 추가적인 3개의 인트론 서열을 포함하는 3.137kb 게놈 DNA(왼쪽 암)을 PCR 증폭시켰고, 벡터를 구성하기 위해 사용하였다. 왼쪽 암 내에서 엑손 20에 의해 암호화된 벡터 코돈 1047을 표적화하는 주형 내로 클로닝하기 전에 표준 돌연변이유발 기법을 사용하여 히스티딘(R1047H)에 대한 암호화를 위해 돌연변이시켰다. 표적화 주형 벡터 내로 중간-암의 클로닝에서, 야생형 엑손 20 영역을 벡터 내에 존재하는 높은 폴리A 신호의 첨가에 의해 변형시켰다. 네오마이신 발현 카세트인 4x 전사 중단 카세트(Jackson, E.L. et al . Genes Dev 15, 3243-8 (2001))를 또한 벡터에 의해 제공하였다. 최종 구성에서, 네오마이신 카세트는 ES 세포의 변형 후 네오마이신 카세트의 절개를 가능하게 하는 'frt'에 측접하였다. 또한, 변형된 야생형 엑손은 돌연변이 엑손 20이 활성화될 때, 변형된 야생형 엑손의 제거를 가능하게 하는 'loxP' 부위에 측접하였다(도 1). 표적화 벡터의 정확성을 생거 시퀀싱에 의해 입증하였다. 표적 작제물을 C57B/6N ES 세포 내로 전기천공시켰고, 네오마이신 저항을 위해 선택하였다. 적절하게 표적화된 ES 클론을 5 및 3 사우던 블롯팅에 의해 확인하였다. 적절하게 표적화된 게놈 DNA를 AflII 분해 및 사우던 블롯팅 후 시험하였을 때, 5' 프로브는 6.6kb 야생형 단편 및 9.1kb 단편을 인식하였다. 유사하게, 3' 프로브는 SacI 분해 후 적절하게 변형된 게놈 영역에서 6.9 kb 야생형 단편 및 4.8 kb 단편을 인식하였다(도 1c). PCR 및 시퀀싱을 사용하여 PIK3CA를 암호화하는 변형된 게놈 영역 구조의 확인 및 neo 카세트의 제거 후, ES 클론을 배반포 내로 주사하여 키메라 마우스를 만들었다. 야생형 마우스에서 201bp 단편과 반대로, 프라이머 20F(AGCCAGCAGACAATAATTCTTAGCACA)(서열번호 1) 및 20R(CAGTGCTTGAACATTGGAGGTCAGT)(서열번호 2)을 사용하여 만든 290bp PCR 산물을 사용하여 생식선 전달 그리고 또한 유전자형 변형된 PIK3CA 대립유전자 보유 마우스를 수반하였다. 유선 내 잠복형 PIK3CA H1047R 돌연변이체 대립유전자를 활성화하기 위해, 본 발명자들은 MMTV-Cre(잭슨 랩스(Jackson labs) # 003551) 계통을 지니는 이 마우스를 사육하였다. 종말점 연구를 위해서, 감지할 수 있는 종양을 지니는 마우스를, 종양이 ~2500㎣에 도달된 다음, 안락사시킬 때까지 지켜보았다. 또한, <2의 임의의 신체 조건 스코어(Ullman-Cullere, M.H. & Foltz, C.J. B Lab Anim Sci 49, 319-23 (1999), 구부정한 자세 및 체중의 >20% 손실을 나타내는 마우스를 안락사시켰다. 모든 마우스를 동물실험 윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC) 가이드라인에 따라 본 발명자들의 동물 시설에서 유지시켰다.
DNA / RNA 제조
종양/조직으로부터의 DNA를 퀴아젠(Qiagen) AllPrep DNA/RNA 키트(캘리포니아에 소재한 퀴아젠)를 사용하여 제조하였다. RNA 샘플을 RNeasy 미니 키트(Mini Kit)(캘리포니아주에 소재한 퀴아젠)를 사용하여 제조하였다.
발현 분석
전체 RNA 샘플의 양 및 품질을 각각 ND-1000 분광광도계(독일에 소재한 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)) 및 바이오어날라이저(Bioanalyzer) 2100(캘리포니아주에 소재한 애질런트 테크놀로지스)을 사용하여 결정하였다. Cy-염료 표지된 cRNA 및 어레이 혼성화를 제조업자(캘리포니아주에 소재한 애질런트 테크놀로지스)의 설명서로서 제조하였다. 간략하게, 전체 RNA 샘플을 이중 가닥 cDNA로 전환시킨 다음, 애질런트의 퀵 Amp 표지(Quick Amp Labeling) 키트를 사용하여 Cy-염료로 cRNA를 표지하였다. 표지한 cRNA를 RNeasy 미니 키트(캘리포니아주에 소재한 퀴아젠)를 사용하여 정제하였다. ND-1000 분광광도계(독일 윌밍턴에 소재한 써모 사이언티픽)를 사용하여 cRNA 수율 및 Cy-염료 포함을 결정하였다. 750ng의 표지한 cRNA를 단편화시켰고, 애질런트 전체 마우스 게놈 4x44K 어레이에 혼성화시켰다. 모든 샘플을 Cy5-염료로 표지하였고, Cy3-염료 표지된 보편적 마우스 기준(캘리포니아주 스트라테이진(Stratagene)에 대해 혼성화시켰다. 샘플을 Pro 혼성화 스테이션(Pro Hybridization station) HS 4800(미국 노스캐롤라이나주에 소재한 테칸(Tecan)) 상에서 일정한 교반에 의해 65℃에서 17시간 동안 혼성화시켰다. 혼성화 후, 어레이를 세척하였고, 건조시켰으며, 애질런트 스캐너 상에서 스캔하였다. 애질런트의 특징 추출(Feature Extraction) 소프트웨어 10.7을 사용하여 어레이 영상을 분석하였다.
유전자 발현 데이터를 보통의 기준 설계 실험에서 사용한 2색 애질런트 마이크로어레이로부터 얻었다. 보통의 기준 샘플을 Cy3 채널에서 측정하였고, 관심의 샘플을 Cy5 채널에서 측정하였다. 림마(limma) R 패키지에서 수행한 방법을 사용하여 데이터를 처리하였다(Smyth, G.K. Stat Appl Genet Mol Biol 3, Article3 (2004)). 우선 어레이 내 뢰스(loess)가 정규화에 적합하게 된 후 데이터를 배경 보정하였고, 어레이 간의 분위(quantile) 정규화를 적용하였다(Smyth, G.K. & Speed, T. Methods 31, 265-73 (2003)). 차별적으로 발현된 유전자 발현 표지(gene signature)를 림마 선형 모델 적합도를 사용하여 얻었고, FDR을 지니는 프로브를 0.05 이하의 p-값으로 조절하였으며, 적어도 2의 log2 변화를 차별적으로 발현되는 것으로 여겼다. 샘플 및 EMT 관련 유전자의 계층적 클러스터링을 유클리드 거리 척도 및 완전 연결 클러스터링을 사용하여 평균 집중 유전자 발현 프로파일에 대해 계산하였다.
비교 게놈 혼성화 ( Comparative Genomic Hybridization : CGH ) 어레이
PIK3CA e20H1047R 마우스로부터의 유방 종양 샘플을 제조업자의 프로토콜(캘리포니아주 애질런트 테크놀로지스)에 따라 애질런트(Agilent) CGH 어레이 상에서 프로파일링하였다. 간략하게, 종양과 기준 샘플(C57BL/6J 마우스, 메인주에 소재한 잭슨 래버러토리(Jackson Laboratory)) 둘 다의 500ng DNA를 Alu I 및 Rsa I(위스콘신주에 소재한 프로메가(Promega))로 분해시켰고, 후속하여 퀴아프렙 스핀 미니프렙(QIAprep Spin Miniprep) 키트(독일에 소재한 퀴아젠 게엠베하)로 정제하였다. 분해한 샘플을 게놈 DNA 표지 키트 플러스(Genomic DNA Labeling Kit Plus)(캘리포니아주에 소재한 애질런트 테크놀로지스)를 사용하여 Cy5-dUTP(시험 샘플) 또는 Cy3-dUTP(기준 샘플)로 표지하였다. 시험 샘플을 기준에 의해 풀링시켰고, 후속적으로 마이크로콘(MicroCon) YM-30(매사추세츠주 빌러리카에 소재한 밀리포어(Millipore))을 사용하여 정제하였다. 표지한 프로브를 Cot-1 DNA(캘리포니아주에 소재한 인비트로젠), 10x 차단제 및 2x Hi-RPM 혼성화 완충제(캘리포니아주에 소재한 애질런트 테크놀로지스)와 혼합하였고, 애질런트의 244K 마우스 게놈 CGH 마이크로어레이에 대해 혼성화하였다. 샘플을 Pro 혼성화 스테이션 HS 4800(미국 노스캐롤라이나주에 소재한 테칸) 상에서 일정한 교반에 의해 67℃에서 24시간 동안 혼성화시켰다. 어레이를 세척하였고, 건조시켰으며, 제조업자의 프로토콜(캘리포니아주에 소재한 애질런트 테크놀로지스)에 따라 애질런트 스캐너 상에서 스캔하였다. 배경 추출 신호 강도의 개개의 log2 비를 애질런트의 특징 추출소프트웨어 10.7로부터 얻었다. log2 비를 0의 중앙값에 집중시켰고, 각 프로브에 대해 얻어진 log2 비 값을 GLAD를 사용하여 세그먼트화하였다(Hupe, P., et al. Bioinformatics 20, 3413-22 (2004)). 주어진 GLAD-유도 세그먼트의 게놈 경계 내에서 모든 유전자는 해당 세그먼트 내에서 프로브의 평균 복제 수 값으로 주어진다. 복제 수 값 >= 0.4 log2 비 단위는 획득을 나타내며, 값 <= -0.4 log2 비 단위는 손실을 나타낸다.
엑솜 포획 및 시퀀싱
제조업자의 프로토콜(캘리포니아주에 소재한 애질런트 테크놀로지스)에 따라 3㎍의 게놈 DNA 및 SureSelectXT 마우스 All 엑손 키트를 사용하여 표적화된 서열 포획을 수행하였다. 49.6Mb의 표적화된 영역을 포획하고, 24,306 유전자 내에서 221,784개 엑손을 포함하도록 마우스 All 엑손 키트를 설계하였다. 4회의 PCR 주기를 사용하여 사전 포획 라이브러리를 증폭시킨 한편, 포획 후 증폭에서 12회 PCR 주기를 사용하였다. 포획 후 증폭된 라이브러리의 단편 크기 분포를 DNA 고 민감도 칩(캘리포니아주에 소재한 애질런트 테크놀로지스)을 사용하여 바이오어날라이저(Bioanalyzer) 2100 상에서 결정하였다. 라이브러리의 농도를 카파 라이브러리 정량화 키트(매사추세츠주에 소재한 카파 바이오시스템즈(Kapa Biosystems))에 의해 측정하였다. 각각의 라이브러리를 HiSeq 2000 상에서 시퀀싱하여 제조업자 설명서(캘리포니아주에 소재한 일루미나(Illumina))마다 2 x 75 bp 판독을 만들었다. 디폴트 변수를 설정한 BWA 소프트웨어를 사용하여 시퀀싱 판독을 UCSC 마우스 게놈(NCBI37/mm9)에 대해 맵핑하였다(Li, H. & Durbin, R. Bioinformatics 25, 1754-60 (2009)). 국소 재정렬, 이중 마킹 및 미가공 변이체 호출을 앞서 기재한 바와 같이 수행하였다(DePristo, M.A. et al . Nature Genetics 43, 491-498 (2011)). dbSNP Build 131에 나타난 SNP(Sherry, S.T. et al . Nucleic Acids Res 29, 308-11 (2001))를 사용하여 생식선 변형으로서 제거하였다. 추가로 종양과 정상 샘플 둘 다에 존재하는 변이체를 생식선 변형으로서 제거하였다. 종양 샘플 내 존재하지만 매칭된 표준에는 없는 남아있는 변형은 체세포가 되는 것으로 예측되었다. 예측된 체세포 변형을 추가적으로 여과시켜 종양과 매칭된 표준 둘 다에서 최소 10x 적용범위를 지니는 유일한 위치뿐만 아니라 매칭된 표준에서 <1%의 관찰된 변이체 대립유전자 빈도를 포함하였다. 유전자 기능에 대한 단백질 체세포 돌연변이의 효과를 SIFT(Ng, P.C. & Henikoff, S. Genome Res 12, 436-46 (2002)) 및 폴리펜( PolyPhen)(Ramensky, V., Bork, P. & Sunyaev, S. H, Nucleic Acids Res 30, 3894-900 (2002))(표 1)을 사용하여 예측하였다.
조직학적, 면역화학적 및 전조직표본 분석
일상적인 헤모톡실린 및 에오신(Hematoxylin and Eosin: H&E) 염색 및 조직 평가를 위해 5 마이크론, 포르말린 고정된 파라핀 포매 표본을 사용하였다.
전조직표본 분석을 위해, 유선을 해부하였고, 펼쳤으며, 2 내지 4시간 동안 카르누아 고정액(Carnoy's fixative)으로 고정시켰다. 이 조직을 수화시켰고, 카르민 알륨 중에서 밤새 염색하였다.
10 마이크론 절편 티슈-테크(Tissue-Tek) OCT(캘리포니아주에 소재한 사쿠라 파인테크(Sakura Finetek)) 포매 냉동 샘플을 사용하여 면역형광 염색을 수행하였다. 절편화된 샘플을 10분 동안 4% 파라포름알데하이드 중에서 고정시킨 다음, 1% BSA를 함유하는 PBT(0.1% 트리톤(Triton)을 지니는 PBS)로 30분 동안 차단시켰다. 그 다음에 차단시킨 절편을 습한 챔버 내 4℃에서 밤새 0.1% BSA를 지니는 PBT 중에서 희석시킨 적절한 1차 항체로 염색하였다. 슬라이드를 PBT 중에서 3회 세척한 다음, 습한 챔버 내 실온에서 60분 동안 적절한 2차 항체로 인큐베이션시켰다. 미결합 2차 항체를 PBT로 세척함으로써 제거하였다. 프롤로그 골드(Prolong Gold) 페이드 방지(anti-fade) 시약(캘리포니아주에 소재한 인비트로젠)을 사용하여 슬라이드를 장착하였다. 연구에서 사용한 1차 항체는 사이토케라틴 5(Abcam, ab53121), 사이토케라틴18(Abcam, ab668), ERα(써모 사이언티픽, Ab-21), PR(Abcam, ab2764) 및 비멘틴(Vimentin)(Abcam, ab45939)이다. 결합된 1차 항체를 검출하기 위해 Alexa 488 또는 647(몰레큘러 프로브(Molecular probes))로 컨쥬게이트한 적절한 2차 항체를 사용하였다.
웨스턴 블롯 분석
냉동 종양을 칭량하였고, 프로테아제 저해제(독일에 소재한 호프만-라 로슈 리미티드(F. Hoffman-La Roche, Ltd)), 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 및 포스파타제 저해제 칵테일 1 및 2(미주리주에 소재한 시그마(Sigma))로 보충한 세포 추출물 완충제(캘리포니아주에 소재한 인비트로젠) 중에서 막자 PP(뉴저지주에 소재한 사이언스웨어(Scienceware))로 용해시켰다. 피어스(Pierce) BCA 단백질 분석 키트(일리노이주에 소재한 락포드(Rockford))를 사용하여 단백질 농도를 결정하였다. 웨스턴 블롯을 위해, 동일한 양의 단백질을 누페이저 비스-트리스(NuPage Bis-Tris) 4 내지 12% 구배 겔(캘리포니아주에 소재한 인비트로젠)을 통해 전기영동에 의해 분리시켰고, iBlot 시스템(캘리포니아주에 소재한 인비트로젠)을 사용하여 단백질을 나이트로셀룰로스 포어 막에 옮겼다. 블롯팅을 위해 사용한 1차 항체는 pAkt(Ser473), pAkt(Thr308), 전체 Akt, pS6(Ser235/236)를 포함하고, pS6(Ser240/242) 및 전체 S6 항체를 세포 신호전달 기법(Cell Signaling Technology: 매사추세츠주 댄버스에 소재)으로부터 얻었고, 항액틴 항체를 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(미주리주 세인트루이스에 소재)로부터 구입하였다. 적절한 2차 호스래디쉬 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 2차 IgG 항체와 결합된 화학발광 웨스턴 블롯팅 검출(펜실베니아주에 소재한 에머샴 바이오사이언스(Amersham Biosciences))을 사용하여 1차 항체 결합된 단백질을 검출하였다.
약물 효능 연구
유방 종양 조각을 20 내지 25g의 무게가 나가는 8 내지 10주 암컷 C.B-17 SCID 베이지 마우스(매사추세츠주에 소재한 찰스 리버 래버러토리즈(Charles River Laboratories))의 유방 지방 패드 근처에 피하로 주입하였다. 그들이 200 내지 300㎣의 평균 종양 용적에 도달될 때까지, 종양을 모니터링하였고, 동물을 투약 개시 전 4그룹의 9마리 동물로 각각 무작위 분포시켰다. GDC-0941을 0.2% Tween 80(MCT) 비히클과 함께 0.5% 메틸셀룰로스 중에 용해시켰고, 3개의 투약 그룹: 50, 100 및 150㎎/㎏으로 위관영양법에 의해 13일 동안 매일 투약하였다. 종양 크기 및 마우스 체중을 연구 과정에 걸쳐 매주 2회 기록하였다. 종양 용적을 캘리퍼에 의해 2차원으로 측정하였고, 다음의 식으로 계산하였다: 종양 크기(㎜3)　= (더 긴 측정× 더 짧은 측정2)×0.5. 다음의 식을 사용하여 백분율 중량 변화를 계산하였다: 그룹 백분율 중량 변화 　=　(새로운 중량 -　초기 중량)/초기 중량)×100. 평균 종양 용적(+/-SEM) 및 백분율 중량 변화를 계산하였고, 칼레이더그래프(Kaleidagraph)(시너지 소프트웨어(Synergy Software) 버전 4.03)를 사용하여 플롯팅하였다. ≥2,000㎣의 종양 용적을 지니거나 또는 그의 초기 체중으로부터 ≥20%의 상실을 지니는 마우스를 IACUC 가이드라인에 기반하여 즉시 안락사사켰다. 시간에 걸쳐 동일 동물로부터 종양 용적의 반복된 측정을 분석하기 위해, 혼합 모델 접근을 사용하였다(Pinheiro, J., Bates, D., DebRoy, S., Sarkar, D. & The R Core team. nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models. R package version 3.1-89. (2008)). 이 접근은 연구 종결 전 어떤 미처리 관련 동물 사망에 기인하는 보통의 중도탈락과 반복된 측정 둘 다를 처리하였다. 각 투약 수준에서 log2 종양 용적의 시간 과정에 비선형 프로파일을 적합화시키기 위해 입방체 회귀 스플라인을 사용하였다. 그 다음에 이들 비선형 프로파일을 혼합 모델 내에서 용량과 관련지었다. 비히클의 백분율(%TGI)로서 종양 성장 저해를, 식 %TGI　=　100×(1　-　AUC용량/AUC비히클)을 사용하여 비히클에 대해 1일 당 각각의 투약 그룹에 대한 적합 곡선하 면적(AUC)의 백분율로서 계산하였다. %TGI에 대해 불확실한 간격(uncertainty interval: UI)을 얻기 위해, 적합화된 곡선 및 적합화된 공분산 매트릭스를 사용하여 %TGI의 분포에 대한 근사값으로서 무작위 샘플을 만들었다. %TGI가 각 실현을 위해 재계산된 경우, 무작위 샘플을 적합-혼합 모델의 적합-혼합 모델의 1000회 모의 실현으로 구성하였다. 본 발명자들의 보고 UI는 95%의 시간, 재계산된 값의 %TGI가 적합 모델로 주어진 이 영역에 속할 값이다. 2.5 및 97.5　퍼센트의 모의 분포를 상부 및 하부 UI로서 사용하였다. R(버전 2.8.1, R　Development Core Team 2008; 통계학적 계산을 위한 R 재단; 오스트리아 비엔나에 소재) 및 엑셀을 사용하여 플롯을 만들었다. R을 사용하여 데이터를 분석하였고, 혼합 모델을 nlme 패키지를 사용하여 R 내에서 적합화하였다(Pinheiro et al., 상기 참조).
결과
조건적으로 활성인 PIK3CA H1047R 마우스의 유전자조작
종양 개시, 발생 및 진행에서 PIK3CA 돌연변이의 역할을 연구하기 위해, 본 발명자들은 천연 프로모터에 의해 구동되는 돌연변이체 PIK3CA H1047R 대립유전자를 조건적으로 발현시킬 수 있는 마우스를 유전자조작하였다. 유전자조작된 마우스인 PIK3CA e20mwt 는 측접 loxP 부위를 포함하도록 변형된 야생형 PIK3CA 엑손 20을 가진다. 변형된 야생형 엑손 다음에 전사 중단 카세트 및 H1047R 돌연변이를 암호화하는 PIK3CA 엑손 20의 복제물이 있다(도 1a 내지 도 1d). 표적 벡터(도 1b)를 사용하여 마우스 배아 줄기(embryonic stem: ES) 세포 내 내인성 PIK3CA 좌위를 변형시켰다. 사우던 블롯에 의해 확인한(도 1f 및 도 1g) 적절한 변형을 포함하는 2개의 독립 ES 세포 클론을 사용하여 PIK3CA e20mwt 대립유전자의 생식선 전달을 나타낸 키메라 마우스를 만들었다. 이형접합성 PIK3CA e20mwt /+ 마우스와 연루된 이종교배는 예상된 멘델(Mendelian) 비로 적절한 유전자형을 지니는 자손을 야기하였다(도 13). Cre-매개 재조합 전 PIK3CA -/- 널(null) 마우스에서 관찰된 배아 치사율과 달리(Bi, L., Okabe, et al., J Biol Chem 274, 10963-8 (1999)), 본 발명자들은 동형접합성 PIK3CA e20mwt/e20mwt 동물이 예상된 멘델 빈도로 태어난다는 것을 발견하였는데, 이는 변형된 PIK3CA e20mwt 가 야생형 PIK3CA 대립유전자와 유사하게 기능한다는 것을 나타낸다.
PIK3CA e20H1047R 대립유전자의 유선 특이적 발현
PIK3CA가 인간 유방암의 25% 이상으로 돌연변이되기 때문에(Zhao & Voigt, Oncogene 27, 5486-5496 (2008)), 본 발명자들은 PIK3CA e20mwt 마우스 대 MMTV-Cre 유전자이식 마우스를 사육함으로써 유방 종양 형성에서 PIK3CA H1047R의 역할을 시험하였다(Wagner, K.U. et al . Nucleic Acids Res 25, 4323-30 (1997); Wagner, K.U. et al . Transgenic Res 10, 545-53 (2001)). MMTV-Cre 균주는 유선 허용 MMTV LTR 프로모터의 제어 하에 P1 Cre 재조합효소를 발현시키는데, 이는 PIK3CA e20H1047R 을 재조합하고 발현시킨다. 본 발명자들은 PIK3CA e20H1047R /+ 마우스의 유선으로부터 추출된 PIK3CA mRNA와 대응하는 cDNA를 시퀀싱함으로써 PIK3CA e20H1047R 돌연변이체 대립유전자 및 천연 야생형 PIK3CA 대립유전자의 발현을 확인하였다(도 1h). 대조적으로, 신장으로부터 추출된 RNA는 PIK3CA e20mwt 대립유전자로부터 야생형 PIK3CA의 발현만을 나타내었고(도 1i), 돌연변이체 PIK3CA e20H1047R 대립유전자의 유선-특이적 발현을 확인하였다.
PIK3CA e20H1047R 의 발현은 향상된 유선 분지 형태형성을 야기한다
이전의 연구는 PTEN과 유사하게 발암 유전자의 발현 또는 종양 억제자의 손실이 마우스 유전의 분지 및 형태형성에 영향을 미친다는 것을 나타내었다(Meyer, D.S. et al . Cancer Research (2011); Li, G. et al ., Development 129, 4159-70 (2002); Fishler, T. et al ., Oncogene 29, 4007-17 (2010). 따라서, 본 발명자들은 전조직표본 염색을 사용하여 유선 발생에 대한 PIK3CA e20H1047R 의 발현 효과를 연구하였다. 12주에, PIK3CA e20H1047R 돌연변이체 유선은 대조군 유선 내 정상 종말구(terminal end bud)에 비해 초분지 유관 및 말단 구조를 나타내었다(도 6a 및 도 6b). 50주까지, PIK3CA e20H1047R 돌연변이체 유선은 대조군 유선에 비해 깃털같은 초분지 형태를 나타내었다(도 6c 및 도 6d). 추가로, PIK3CA e20H1047R 돌연변이체 유선의 조직학적 절편은 50주령에 종양 결절의 증거를 나타내었다(도 6e 및 도 6f). 이는 PI3K 경로 활성화를 지니는 PTEN 조건적 널 마우스 및 다른 유선 특이적 유전자이식 모델과 연루된 이전의 연구에서 보고된 유선 분지 형태형성과 유사하다(Meyer et al., 상기 참조; Li et al., 상기 참조).
PIK3CA e20H1047R 발현은 유선 종양 형성 을 촉진한다
암컷 PIK3CA e20H1047R /+, PIK3CA e20mwt /+ 및 MMTV-Cre 마우스는 80주 기간에 걸쳐 유방 종양 발생에 따랐다. 본 발명자들은 이형접합성 PIK3CA e20H1047R /+ 동물이 478.5일의 중앙값 무종양 생존도를 지니는 유선 종양(도 2a 내지 도 2c)이 발생하였다는 것을 발견하였다. 대다수의 동물은 흉곽 유선에서 종양이 발생하였지만(# 1, 2, 3, 6 7 및 8), 일부는 서혜부-복부 유선 내 종양이 발생하였고(# 4, 5, 9 및 10), 몇몇은 흉곽과 서혜부-복부 유선 둘 다에서 종양이 발생하였다. PIK3CA e20H1047R /+와 대조적으로, 대조군 PIK3CA e20mwt /+ 및 MMTV-Cre 동물은 연구 지속기간 동안 무종양으로 남아있었다. 유사한 잠복을 지니는 유선 종양 표현형을 제2의 독립적 표적화 ES 클론으로부터 유래된 PIK3CA e20H1047R /+ 마우스에서 관찰하였고(도 2c), 추가로 PIK3CA e20H1047R 발현 구동 종양 표현형의 특이성을 확인하였다.
MMTV 프로모터는 처녀와 수유중인 유선 둘 다에서 그의 제어 하에 유전자의 발현을 구동한다(Wagner, K.U. et al . Nucleic Acids Res 25, 4323-30 (2010). 이것이 주어지면, 본 발명자들은 무산 및 다산 마우스에서 종양 이환수를 비교하였고, 잠복이 제492일 내지 제465일에 무산 PIK3CA e20H1047R 동물에 비해 다산 PIK3CA e20H1047R 에서 유의하게 단축되었다는 것을 발견하였는데(p=0.0002)(도 7), 이는 임신 관련 유선 변화가 가속화된 종양 형성에 기여한다는 것을 시사한다.
MMTV 프로모터는 유선 상피 세포에서 주로 출생 후 제6일에 시작되는 Cre 발현을 지시하지만, 이는 또한 침샘 및 정낭에서 발현을 구동하는 것으로 알려져 있다(Wagner, K.U. et al . Transgenic Res 10, 545-53 (2001)). 35주령 내지 41주령의 수컷에서 유방 종양 및 정낭을 보유하는 마우스로부터의 침샘의 조직학적 분석을 수행하함에 있어서, 본 발명자들은 종양 증거가 없음을 발견하였다(도 8a 및 도 8b). 그러나, 형태학적으로 정낭은 대조군 동물에 비해 PIK3CA e20H1047R /+ 마우스에서 더 컸다(n=3). 절편을 가로지르는 정낭의 조직학적 분석은 도관 팽창 및 확장을 야기하는 정낭 유체 분비의 양을 증가시키는 것을 나타내었다(도 8c 및 도 8d). 그러나, 이는 PIK3CA e20H1047R/+ 수컷의 사육 및 생식력에 영향을 미치지 않았다.
PIK3CA e20H1047R 구동 종양에서의 조직학 및 신호전달 활성화
본 발명자들은 PIK3CA e20H1047R 종양의 병리학적 특징을 이해하기 위해 그의 조직학적 분석을 수행하였고, 대다수의 종양이 섬유선종과 일치되는 특징을 나타내었다는 것을 발견한 한편(76.9% [20/26])(도 2d), 몇몇은 선암종(15.4% [4/26])(도 2e 및 도 2f) 또는 방추상 세포 신생물(7.7% [2/26])(도 2g)의 조직병리학적 특징을 나타내었다.
종양을 추가로 특성규명하기 위해, 본 발명자들은 조직학적으로 별개인 종양 유형의 PI3K 경로 활성화 상태를 시험하였다. 모든 종양 유형에서, 본 발명자들은 PI3K의 하류 둘 다에서 상승된 pAKT 및 pS6-키나제(도 2h)를 관찰하였는데, 이는 이들 종양 내 경로의 구성적 활성화를 표시한다.
관찰된 유방 종양 유형을 추가로 이해하기 위한 노력에서, 본 발명자들은 조직학적으로 별개의 유방 종양 유형에서 기저 사이토케라틴 5(CK5), 루미날 사이토케라틴 18(CK18), 에스트로겐 수용체(estrogen receptor: ER), 프로게스테론 수용체(progesterone receptor: PR), 및 비멘틴, 간충직 마커의 발현을 연구하였다. 본 발명자들은 섬유선종 및 선암종이 둘 다 CK5, CK18, ER 및 PR에 대해 양성이라는 것을 발견하였지만, 방추상 세포 종양은 ER-/PR-(도 3n 및 도 3o) 및 CK5(데이터는 도시하지 않음)였다. 흥미롭게도, 이는 또한 ER/PR 음성인 인간 유선 방추상 세포 종양을 연상시킨다. 추가로, 방추상 세포 종양은 CK18+/비멘틴+(도 3n 및 도 3p)이었는데, 이는 세포가 상피세포에서 간질세포로의 변이(epithelial-mesenchymal transition: EMT)를 겪고 있다는 것을 나타낸다.
PIK3CA e20H1047R 구동 유방 종양의 게놈 분석
PIK3CA H1047R 유방 종양의 게놈 분석을 수행하기 전, 종양 형성을 위한 긴 잠복기가 주어졌고, 본 발명자들은 유방 종양으로부터 유래된 종양 외식편이 SCID 마우스에서 이종이식편으로서 성장되는지 여부를 우선 시험하였다. 시험한 대다수의 섬유선종, 선암종 및 방추상 세포 종양은 종양을 형성하였다. 흥미롭게도, 섬유선종 외식편으로부터 유래된 조직학은 선암종 또는 방추상 세포 신생물의 특징을 나타내었는데, 이는 섬유선종이 양성이며, 계대 시 종양 발생에 기여하는 종양 형성의 잠재력을 지니는 본래의 외식편 내에서 단지 세포의 서브세트일 가능성이 있다는 것을 나타낸다(도 9a 내지 도 9d). 그러나, 방추상 세포 종양 외식편은 계대 동안 그의 조직학적 특징을 유지하였다(도 9e 및 도 9f).
본 발명자들은 종양의 분자적 특징을 추가로 이해하기 위해 상이한 유방 종양 서브세트 및 대조군 유선의 마이크로어레이 기반 유전자 발현 분석을 수행하였다. 상피 세포, 줄기 세포 및 EMT에 대해 마커를 사용하는 발현 데이터의 계급에 따른 클러스터링(Weigelt, B. & Reis-Filho, Nature Reviews Clinical Oncology 6, 718-730 (2009); Taube, J.H. et al . Proceedings of the National Academy of Sciences 107, 15449-15454 (2010))은 1차 섬유선종, 선암종 및 종양이 함께 클러스터링된 이들 종양 유형으로부터의 외식편을 계대시키는 것으로부터 유래된다는 것을 나타내는데, 이는 보통의 유래을 나타내며, 유전자 발현 변화의 설정을 공유한다(도 4a). 대조적으로, 방추상 세포 유형, 즉, 원발성 종양과 계대된 종양 둘 다는 함께 클러스터링되어 EMT의 특징을 나타내는데, 이는 별개의 세포 유래를 시사한다(도 4a).
게놈의 암호 영역 내 체세포 돌연변이를 확인하는데 전체 엑솜 포획 및 시퀀싱을 적용하였다(Varela, I. et al . Nature 469, 539-542 (2011)). 본 발명자들의 모델에서 다양한 유방 종양 유형 내 2차 돌연변이 출현을 이해하기 위해, 본 발명자들은 선택된 샘플 세트의 전체 엑솜 포획 및 시퀀싱을 수행하였다(도 14). 유전자조작된 PIK3CA H1047R 돌연변이의 존재 외에, 종양은 몇몇 추가적인 체세포 변화를 포함하였다(표 1). 본 발명자들은 섬유선종이 낮은 수준의 체세포 돌연변이(2 내지 5) 다음에 선암종(22 돌연변이) 및 방추상 세포 종양(61 돌연변이)을 가진다는 것을 발견하였다. 명백히, 방추상 세포 종양에서, 본 발명자들은 Arg을 His으로 대체하는 코돈 245에서 Trp53(TP53 ) 내 돌연변이를 확인하였다(도 4b). 이 돌연변이는 코돈 248(R248H)에서 인간 TP53 핫 스팟 돌연변이의 동등물이며, 휴면 음성 단백질로서 작용하도록 제공하는 TP53의 DNA-결합 도메인 내의 기능 상실 돌연변이를 잘 특성규명한다(Olivier, M., Hollstein, M. & Hainaut, P. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 2, a001008-a001008 (2010)). 추가로, 1차 방추상 세포 종양에서 확인된 TP53 돌연변이 및 대다수의 돌연변이가 또한 계대 후 외식편-유래 종양에서 발견되었는데, 이는 원발성 방추상 종양이 덜 이종성일 가능성이 있다는 것을 나타낸다(도 10). 방추상 세포 종양에서 관찰된 바와 같이, 원발성 선암종에 존재하는 대다수의 돌연변이는 이식 후 유래된 종양에 존재하였다(도 10). 22개의 돌연변이가 관찰된 선암종에서, Plk1, Tssk2 및 SMG1 키나제의 돌연변이를 포함하는 12개는 기능적 효과를 가지는 것으로 예측되었고, 따라서 구동자로서 작용할 수 있다(표 1 및 도 10). 흥미롭게도, 인간 유방암에서 SMG1 돌연변이는 이전에 보고되었다(Stephens, P. et al ., Nature Genetics 37, 590-592 (2005)).
전체 엑솜 돌연변이 분석에 추가로, 본 발명자들은 염색체 복제수 이상을 이해하기 위해 CGH 어레이 상의 종양을 프로파일링하였다. 흥미롭게도, 섬유선종과 섬암종에서 관찰된 체세포 돌연변이의 낮은 수준을 반영하는 것에서, 이들 종양 유형은 둘 다 복제 수 이상 영역을 매우 드물게 가진다. 섬유선종 및 선암종과 대조적으로, 방추상 세포 종양 샘플에서, 본 발명자들은 정상 유선과 비교할 때 복제수 이상을 지니는 몇몇 영역을 발견하였다. 본 발명자들은 ~3Mb 영역 내 염색체 11의 넓은 증폭 및 염색체 1 및 4의 초점 획득을 관찰하였다. 추가적인 상세한 설명을 위해, 발암유전자(Oncogene) 웹사이트(http://www.nature.com/onc) 상의 논문을 수반하는 보충적 정보를 포함하는, 문헌[Yuan W. et al., Oncogene (2012), 1-9] 참조하며, 이들 모두는 본 명세서에 명확하게 참조로서 포함된다. 방추상 세포 종양은 염색체 11 및 12에 속하는 두 영역의 염색체 손실을 특징으로 하며, 이들 둘 다 몇 개의 암호 유전자를 보유한다. 특히, 염색체 11의 결실은 Nf1의 손실을 야기하였고(도 4c), 그의 하향 조절된 발현과 일치되는데(log2 비 -2.09; p = 8.338e-05, 도 4a), 이는 Ras-MAPK 경로가 이들 종양에 관계될 수 있다는 것을 시사한다.
PIK3CA e20H1047R 유방 종양은 PI3K 저해제에 반응한다
유전적으로 조작된 마우스 모델은 전임상 설정에서 후보 약물 시험을 위한 이상적인 플랫폼을 제공한다(Singh, M. et al . Nat Biotechnol 28, 585-93 (2010)). 이 연구에서 마우스는 긴 잠복 후 유방 종양이 발생되었기 때문에, 본 발명자들은 종양 외식편-유래 종양 모델을 사용하여 약물 효능의 평가에서 그의 이용성을 시험하였다. 일단 종양이 적어도 ~ 200㎣에 도달되면, TP53 돌연변이를 지니는 방추상 세포 종양으로부터 유래된 외식편을 유방 지방 패드 근처의 피하로 이식하였고, PI3KCA 저해제, GDC-0941로 처리하였다(Edgar, K.A. et al . Cancer Research 70, 1164-1172 (2010); Folkes, A. et al . WO 2007127175). 종양 보유 마우스를 각각 9마리 동물의 4개 그룹에서 50, 100 및 150㎎/㎏의 GDC-0941 또는 비히클로 처리하였다. 또한 비히클 처리군에 비해 시험한 다른 용량에서 종양 성장 저해가 관찰되었지만(도 5a), 본 발명자들은 GDC-0941로 처리한 동물이 150㎎/㎏에서 85%의 가장 높은 종양 성장 저해(tumor growth inhibition: TGI)를 나타낸다는 것을 발견하였는데, 이는 이들 종양이 그들의 성장을 위해 돌연변이체 PIK3CA 신호전달에 여전히 의존하였다는 것을 나타낸다. 추가로, 시간 대 진행에 대한 이 데이터의 로그-순위 시험은 모든 약물 처리군이 모든 시험 용량에서 비히클 대조군 처리 동물에 비해 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다는 것을 나타내었다(150㎎/㎏에서 p <0.0001; 도 12). 관찰한 TGI와 일치되게, GDC-0941로 처리한 마우스로부터의 종양은 처리 후 적어도 10시간까지 pAKT 및 pS6의 상당한 감소를 나타내었는데(도 5b), 이는 종양 성장 저해에서 PI3K 저해의 기여를 확인한다.
논의
암의 유전적으로 조작된 마우스 모델은 종양 개시, 진행 및 치료 평가를 이해하는데 매우 유용하다(Tuveson, D. & Hanahan, D. Nature 471, 316-7 (2011)). 추가로, 이들 모델에 대한 차세대 시퀀싱 기법의 적용은 종양 진화 동안 생기는 분자적 이상에 대한 가치있는 정보를 제공할 수 있다. 본 명세서에서 본 발명자들은 유방암의 조건적으로 활동성인 PIK3CA H1047R 마우스 모델을 설명하며, 이들 마우스는 섬유선종, 선암종 및 방추상 세포 신생물을 포함하는 다수의 조직학적 유형의 유방 종양이 발생한다는 것을 나타낸다. 본 발명자들은 선암종이 호르몬 수용체 및 사이토케라틴(CK5+/CK18+)에 대해 양성이라는 것을 발견하였는데, 이는 그들이 본래 상피라는 것을 나타낸다. 대조적으로, 방추상 세포 종양이지만, 사이토케라틴 18에 대해 양성은 별개이며, 즉, 그들은 ER/PR 음성이지만, 비멘틴 양성이었다. 이는 인간 유방 방추 종양을 연상시킨다(Khan, H. European Journal of Surgical Oncology 29, 600-603 (2003); Carter, M.R., et al. Am J Surg Pathol 30, 300-9 (2006)). 본 발명자들의 유방암 모델에서 관찰된 다수의 조직학적 유형은 마우스에서 PIK3CA H1047R 구동 유방암의 유전자이식 모델과 연루된 이전의 연구와 일치한다(Adams, J.R. et al . Cancer Research 71, 2706-2717 (2011); Meyer, D.S. et al. Cancer Research (2011)). 그러나, 본 발명자들의 모델에서 유방 종양 발생에 대한 잠복은, PIK3CA H1047R 돌연변이체 cDNA가 MMT-Cre를 사용하는 그의 발현 후 ROSA26 좌위 프로모터(계통 A에서 중앙값 생존 150일; 계통 NLST에서 >500 일) 또는 닭 β-액틴 프로모터(평균 214 ± 22.6일) 중 하나의 제어 하에 발현되는 두 연구에 비해 더 길다. 이는 본 발명자들의 녹-인 모델이 그의 정상 게놈 구성으로부터 존재하는 그의 내인성 프로모터로부터의 돌연변이체 PIK3CA 대립유전자를 발현시키며, 따라서 생체내 PIK3CA H1047R 구동 종양 형성을 더 정확하게 모방한다는 사실을 반영할 가능성이 있다.
차세대 시퀀싱 기법의 출현은 서열 수준에서 암의 포괄적인 특성규명을 허용하였다(Stratton, M.R., et al., Nature 458, 719-724 (2009)). 차세대 시퀀싱 기법을 적용하는 것에서, 본 발명자들은 PIK3CA H1047R 돌연변이체 대립유전자의 발현 후 유방종양 발생에 필요한 추가적인 충격을 이해하기 위해 본 발명자들의 마우스 모델로부터 유래된 종양을 특성규명하였다. PIK3CA H1047R 와 협력할 수 있는 몇몇 후보 2차 충격 중에서, 본 발명자들은 방추상 세포 종양에서 TP53 R245H 돌연변이의 발생을 보고한다. R245H 돌연변이는 인간 암에서 관찰된 R248H 핫 스팟 우위-음성 돌연변이의 동등물이다. 기능상실 TP53 R245H 돌연변이의 자발적 외관, 즉, TP53 돌연변이가 유방암 내 PIK3CA 돌연변이와 함께 생기고(Boyault, S. et al . Breast Cancer Research and Treatment (2011)) TP53의 손실이 유전자이식 마우스 모델에서 종양 형성 PIK3CA와 협력하는 것으로 나타난 사실은(Adams, J.R. et al . Cancer Research 71, 2706-2717 (2011)) 이것이 협력 구동자 돌연변이가 될 가능성이 있다는 것을 시사한다. 이는 본 발명자들의 모델이 인간 유방 종양 형성에 기여하는 병변을 모방하며, 따라서 돌연변이체 PIK3CA 구동 유방 종양에서 치료적 개입을 연구하기 위한 이상적인 모델이 된다는 것을 나타낸다. 이와 비슷하게, 본 발명자들은 EMT 특징을 지니는 유방 종양의 서브세트에서 GDC-0941, PI3K 저해제의 효능을 검사하는 것에서 상기 모델의 이용을 증명한다. 이전의 보고는 PIK3CA H1047R 유전자이식 폐 종양 모델에서 NVP-BEZ235의 효능, 이중 pan-PI3K 및 라파마이신의 포유류 표적(mammalian target of rapamycin: mTOR) 저해제의 효능을 연구하였다. 그러나, PIK3CA 돌연변이는 인간 유방암에서 더 빈번하게 주어지며, 본 발명자들의 모델은 유방암 내 PI3K 저해제의 효능을 시험하기 위해 유전적으로 정의된 시스템으로서 작용할 수 있으며, 임상적 약물 시험을 위한 모델 처리 섭생을 잠재적으로 돕는다.
유방 종양 형성을 연구하는 것에서 그의 이용성 이외에, PIK3CA 돌연변이가 적절한 조직 특이적 Cre 계통을 사용하여 돌연변이체 PIK3CA 대립유전자를 활성화시키는 것에 의해 관찰되는 경우, 상기 모델을 사용하여 다른 암을 연구할 수 있다. 추가로 돌연변이 PIK3CA 추가 종양 유형과 협력하는 다른 구동 유전자를 발견하고 이해하기 위해 차세대 시퀀싱 기법과 함께 상기 모델을 사용할 수 있다. PI3K 경로 활성화가 치료에 대한 내성과 연루된 것으로 주어지면, 약물 내성을 모델링하고, 내성을 극복하기 위한 치료적 전략을 연구하기 위해 PI3KCA H1047R 마우스를 사용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. <120> PIK3CA H1047R KNOCK-IN NON-HUMAN ANIMAL BREAST CANCER MODEL <130> GNE-0387 PCT <140> <141> <150> 61/574,161 <151> 2011-07-28 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1 agccagcaga caataattct tagcaca 27 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2 cagtgcttga acattggagg tcagt 25

Claims (41)

  1. 변형된 내인성 PIK3CA 좌위(locus)를 포함하는 비인간 유전자이식 동물로서, 상기 변형된 내인성 PIK3CA 좌위는 야생형 엑손 20에 인접하여 H1047R을 암호화하는 휴면기 돌연변이체 PIK3CA 엑손 20을 포함하고, 상기 비인간 유전자이식 동물은 PIK3CA H1047R(PIK3CA e20H1047R ) 돌연변이체 대립유전자의 조건적 발현을 가능하게 하는 것인 비인간 유전자이식 동물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이체 대립유전자의 조건적 발현은 상기 PIK3CA 내인성 프로모터의 제어 하에 있는 것인 비인간 유전자이식 동물.
  3. 제3항에 있어서, 상기 조건적 발현은 Cre-매개 재조합에 의한 상기 돌연변이체 대립유전자의 활성화에 의해 촉발되는 것인 비인간 유전자이식 동물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조건적 발현은 조직-특이적인 것인 비인간 유전자이식 동물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조건적 발현은 유선-특이적인 것인 비인간 유전자이식 동물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조건적 발현은 돌연변이체 PIK3CAH1047R 발현 및 종양 형성을 유발하는 것인 비인간 유전자이식 동물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류인 것인 비인간 유전자이식 동물.
  8. 제7항에 있어서, 마우스 또는 래트인 것인 비인간 유전자이식 동물.
  9. PIK3CA 내인성 프로모터의 제어 하에 PIK3CA H1047R(PIK3CA e20H1047R ) 돌연변이체 대립유전자를 조건적으로 발현시키는 종양 보유 비인간 유전자이식 동물.
  10. 제9항에 있어서, 조직-특이적 방식으로 상기 PIK3CA H1047R 돌연변이체 대립유전자를 발현시키는 것인 종양 보유 비인간 유전자이식 동물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 PIK3CA H1047R 돌연변이체 대립유전자는 상기 동물의 상기 유선 내에서 발현되고, 상기 종양은 유방 종양인 것인 종양 보유 비인간 유전자이식 동물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 PIK3CA H1047R 돌연변이체 대립유전자에 대해 이형접합성인 것인 종양 보유 비인간 유전자이식 동물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 PIK3CA H1047R 돌연변이체 대립유전자에 대해 동형접합성인 것인 종양 보유 비인간 유전자이식 동물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 유방 종양은 섬유선종, 선암종 및 방추상 세포 신생물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 종양 보유 비인간 유전자이식 동물.
  15. 제9항에 있어서, 설치류인 것인 종양 보유 비인간 유전자이식 동물.
  16. 제15항에 있어서, 마우스 또는 래트인 것인 종양 보유 비인간 유전자이식 동물.
  17. 제1항의 유전자이식 동물을 제조하는 방법으로서, 야생형 PIK3CA 대립유전자를 암호화하는 엑손 20에 인접하여 H1047R 돌연변이를 암호화하는 엑손 20의 복제물을 위치시키는 단계를 포함하는, 유전자이식 동물의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 야생형 PIK3CA 대립유전자를 암호화하는 상기 엑손 20은, lexP 부위에 이어서, 전사 중단 카세트 및 상기 H1047R 돌연변이를 암호화하는 PIK3CA 엑손 20의 복제물에 측접하는 것인 유전자이식 동물의 제조방법.
  19. 종양 존재에 대해 피험체를 선별(screening)하는 방법으로서, 상기 방법은 PIK3CA H1047R 대립유전자 또는 대응하는 유전자 산물의 존재에 대해 상기 피험체로부터 얻은 생물학적 샘플을 시험하는 단계를 포함하는, 피험체의 선별 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 종양은 섬유선종, 선암종 및 방추상 세포 신생물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 피험체의 선별 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 종양은 유방암, 난소암, 결장직장암, 위암, 폐암, 간세포암, 갑상선암, 자궁내막암, 백혈병 및 중추신경계의 악성종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 피험체의 선별 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 종양은 유방암인 것인 피험체의 선별 방법.
  23. 제19항에 있어서, 2차 체세포 돌연변이 또는 복제수 이상의 존재에 대해 상기 샘플을 시험하는 단계를 더 포함하는 것인 피험체의 선별 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 2차 체세포 돌연변이는 상기 TP53 유전자에 존재하는 것인 피험체의 선별 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 2차 체세포 돌연변이는 R248H, A135V 또는 I195N TP53 돌연변이인 것인 피험체의 선별 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 2차 체세포 돌연변이는 R248H TP53 돌연변이인 것인 피험체의 선별 방법.
  27. 제23항에 있어서, 상기 2차 체세포 돌연변이는 Plk1, Tssk2 또는 SMG1 유전자에 존재하는 것인 피험체의 선별 방법.
  28. 종양의 치료를 위한 약물 후보를 선별하는 방법으로서, (a) 제9항의 종양 보유 비인간 동물에 대해 약물 후보를 투여하는 단계, 및 (b) 상기 치료에 대한 상기 종양의 상기 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 약물 후보의 선별 방법.
  29. 제28항에 있어서, 단계 (b)는 종양 세포 수의 감소, 종양 크기 또는 종양 부하의 감소, 주변 기관 내로의 종양 세포 침윤의 저해, 종양 전이의 저해 및 종양 성장의 저해로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 반응을 유발하는 약물 후보의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 것인 약물 후보의 선별 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 종양은 섬유선종, 선암종 및 방추상 세포 신생물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 약물 후보의 선별 방법.
  31. 제28항에 있어서, 상기 종양은 유방암, 난소암, 결장직장암, 위암, 폐암, 간세포암, 갑상선암, 자궁내막암, 백혈병 및 중추신경계의 악성종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 약물 후보의 선별 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 종양은 유방암인 것인 약물 후보의 선별 방법.
  33. 제28항에 있어서, 상기 약물 후보는 소분자, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 항체인 것인 약물 후보의 선별 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 약물 후보는 항체인 것인 약물 후보의 선별 방법.
  35. 약물-내성 암의 치료를 위한 항암제를 확인하기 위한 방법으로서, (a) 제9항의 종양 보유 비인간 동물에 대해 약물을 투여하는 단계, (b) 상기 치료에 대한 상기 종양의 반응을 측정하는 단계, 및 (c) 상기 종양이 상기 치료에 대해 양성 반응을 나타낸다면, 상기 약물 후보를 상기 약물-내성 암의 치료를 위한 항암제로서 확인하는 단계를 포함하는, 약물 내성 암의 치료를 위한 항암제의 확인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 양성 반응은 종양 세포 수의 감소, 종양 크기 또는 종양 부하의 감소, 주변 기관 내로의 종양 세포 침윤의 저해, 종양 전이의 저해 및 종양 성장의 저해로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 약물 내성 암의 치료를 위한 항암제의 확인 방법.
  37. PI3K 저해제를 확인하는 방법으로서, (a) 제9항의 종양 보유 비인간 동물에 대해 PI13K 저해제 후보를 투여하는 단계, (b) 상기 치료에 대해 상기 종양의 상기 반응을 측정하는 단계, 및 (c) 상기 종양이 상기 치료에 대해 양성 반응을 나타낸다면, 상기 후보를 PI13K 저해제로서 확인하는 단계를 포함하는, PI3K 저해제의 확인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 암은 유방암인 것인 PI3K 저해제의 확인 방법.
  39. 종양 치료를 위한 약물 후보의 선별 방법에서의 제9항의 종양 보유 비인간 동물의 용도로서, (a) 제9항의 종양 보유 비인간 동물에 대해 약물 후보를 투여하는 단계, 및 (b) 상기 치료에 대한 상기 종양의 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 종양 보유 비인간 동물의 용도.
  40. 약물 내성 암의 치료를 위해 항암제를 확인하기 위한 방법에서의 제9항의 종양 보유 비인간 동물의 용도로서, (a) 제9항의 종양 보유 비인간 동물에 대해 약물 후보를 투여하는 단계, (b) 상기 치료에 대한 상기 종양의 반응을 측정하는 단계, 및 (c) 상기 종양이 상기 치료에 대해 양성 반응을 나타낸다면, 상기 약물 후보를 상기 약물-내성 암의 치료를 위한 항암제로서 확인하는 단계를 포함하는 종양 보유 비인간 동물의 용도.
  41. PI3K 저해제를 확인하기 위한 방법에서의 제9항의 종양 보유 비인간 동물의 용도로서, (a) 상기 종양 보유 동물에 대해 PI13K 저해제 후보를 투여하는 단계, (b) 상기 치료에 대한 상기 종양의 반응을 측정하는 단계, 및 (c) 상기 종양이 상기 치료에 대해 양성 반응을 나타낸다면, 상기 후보를 PI13K 저해제로서 확인하는 단계를 포함하는, 종양 보유 비인간 동물의 용도.
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