WO2016006844A1 - 습식 과립화된 세포 배양 배지 및 그 제조방법 - Google Patents

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WO2016006844A1
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culture medium
aqueous solution
medium
granules
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서희교
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유한책임회사 암브로티아
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2/00—Processes or devices for granulating materials, e.g. fertilisers in general; Rendering particulate materials free flowing in general, e.g. making them hydrophobic
    • B01J2/02—Processes or devices for granulating materials, e.g. fertilisers in general; Rendering particulate materials free flowing in general, e.g. making them hydrophobic by dividing the liquid material into drops, e.g. by spraying, and solidifying the drops
    • B01J2/04—Processes or devices for granulating materials, e.g. fertilisers in general; Rendering particulate materials free flowing in general, e.g. making them hydrophobic by dividing the liquid material into drops, e.g. by spraying, and solidifying the drops in a gaseous medium

Definitions

  • the present invention provides a wet granulated cell culture medium and a method for producing the same, and more particularly, a wet granulated cell culture medium for supporting the growth of mammalian and / or insect and / or plant cells and bacteria and a method for producing the same. It is about.
  • the cell culture medium supports and maintains the growth of cells in an artificial environment.
  • the cell culture medium may comprise more than 10 and sometimes more than one hundred different components.
  • Culture medium required for the growth of mammalian, insect or plant cells can typically be more complex than the minimum medium sufficient to support the growth of bacteria and yeast.
  • chemically defined media include, but are not limited to, amino acids, vitamins, metal ions, antioxidants, chelators, growth factors, buffers, hormones, chlorides, and many other materials known to those skilled in the art.
  • Some cell culture media are provided as sterile aqueous liquids. Disadvantages of liquid cell culture media are their reduced shelf life and difficulties in transport and storage. As a result, many cell culture media are currently provided as a finely milled dry powder mixture. It is prepared to be soluble in water and / or aqueous solutions, which are proposed to be dissolved together with other supplements for the preparation of substantial nutrient bases for growth in biological cells and / or biopharmaceuticals from some of these cells.
  • Handling of finely ground powders has significant disadvantages. For example, this is very difficult to handle in larger quantities, and can cause health problems for workers handling the material, especially if some of each raw material is unhealthy. Even if each component is not directly toxic, there may be health problems caused by workers due to the high levels of dust in the respirable air itself and the amount of dust in the air that is strictly controlled in many countries. In addition, dust from organisms, more particularly fine dust, can cause dust explosions when the quantity is excessive or when the warning measurement is insufficient to prevent sparking by sparks.
  • this may occur under adverse transport conditions, for example long term transport conditions in which one or more lighter components of the dry powder medium move to the surface or one or more heavier components are transported to the bottom of the primary packaging.
  • the result of this localized high concentration, lack of any respective component / s, at the physical center of mass material can be negative in many respects to the production quality of the medium.
  • de-mixing is critical to the biopharmaceutical quality immediately prior to the patient, with physical deficiencies and concentrations of each component, for example, the target biopharmaceutical molecular output per batch or more subtly, the media quality. This could have more impact on oligosaccharide patterning for the biopharmaceutical itself, which makes important media quality.
  • Another aspect when using fine milled dry powder medium is the difficulty of dissolving the fine powder in an aqueous solution for preparing the final aqueous cell culture medium. It is very difficult to wet the fine milled powder and to dissolve it in aqueous solution. Therefore, the handling of the powder medium and its use is very complicated.
  • the medium in dry form usually contains some important supplements, such as carbonates, hydrolysates, growth factors and other trace elements (which end-users can use liquid from the dry powder medium). May be supplemented if manufactured). Additional handling and supplementation will increase the potential for very minor errors and labor.
  • Powdered bacterial cell culture media can be granulated by molding the powder into small granules. The result is a small, uniform particle with advantages in stability, handling and performance.
  • US 6,383,810 B2 by Invitrogen Corporation discloses a method for preparing aggregated eukaryotic cell culture medium powders.
  • the method includes using a solvent to wet the dry powder cell culture medium and then redrying the wet medium to obtain a dry aggregated cell culture medium.
  • a major disadvantage of this process is that the entire medium component is required to be in contact with water, which then needs to be heated to remove the water. This can lead to the destruction or modification of sensitive components with significant side reactions in the components of the medium or unexpected results on medium quality.
  • Figure 1 shows a perspective view of a dry pressing equipment according to the prior art.
  • the roll press is shown as roll R1 and roll R2, and the powder mixture P1 is fed from the reservoir to the roll press.
  • the compacted mixture from the roll press is sized with sieve S. Some of the product is removed for further processing and packaging, and a portion of the powder P2 having a particle size of less than 0.2 mm is continuously reintroduced into the feed of the roll press.
  • patent document 1 solved the problem which a dry powder mixture has as a fine powder to some extent, the result by patent document 1 is not uniform, but has an angular form.
  • Patent Document 1 Republic of Korea Patent Publication No. 10-2014-0032370 (March 14, 2014)
  • an object of the present invention is to provide a medium having a hard and uniform form and size of granular form.
  • pulverization can be made granules in a relatively small single process compared to the conventional method, and can be 100% of the prepared powder can be granulated to improve the productivity significantly.
  • the wet granulated cell culture medium according to the present invention has a superior formulation and strength compared to conventional granulated products, is beautiful in appearance, has moisture resistance, has a long shelf life, is easy to handle, and is easy to pack, It can be prepared under mild conditions so that no side reactions occur due to heating of the media components in the manufacturing process.
  • the present invention relates to a wet granulated cell culture medium and a preparation method thereof.
  • the powder of the medium component is mixed or separately dissolved in purified water at a ratio in purified water
  • the cell culture medium provided in is a bacterial cell culture medium.
  • the cell culture medium provided in may contain one or more saccharide components, one or more amino acids, one or more vitamins, one or more salts, one or more buffer components, one or more cofactors, one or more nucleic acids, tryptone or peptone.
  • step b The cell culture medium provided in may be dissolved in a ratio of 0.5 to 3 of purified water per cell culture medium as an equivalent ratio.
  • step c. Is performed by
  • lysed cell culture medium feed rate to the bottom spray of the pump was between 2 ml / min and 5 ml / min.
  • the temperature of hot air of C. is between 60 and 110 degrees Celsius.
  • the intensity of hot air is between 1m / sec and 3m / sec.
  • wet granulated cell culture medium especially wet granulated cell culture medium that supports the growth of mammalian, and / or insect and / or plant cells and bacteria, wherein the granular form has a firm, uniform shape and size
  • the wet granulated cell culture medium according to the present invention takes all the advantages of the existing dry granulated products, while the formulation is spherical compared to the dry granulated products, and has excellent strength, beautiful appearance, and It has the advantage of having long shelf life, easy handling, and easy packing.
  • the cell culture medium is injected into a fluidized bed dryer, and the aqueous solution of the dissolved cell culture medium is sprayed using only pure purified water as a solvent without using any additional enhancer, pressure-sensitive adhesive, binder, coating agent, or solvent. Since the granules are prepared, the solubility is very high and the flowability is good at the time of dissolution for use of the finished product.
  • pulverization can be made granules in a relatively small single process compared to the conventional method, and 100% of the prepared powder can be granulated, thereby greatly improving the productivity.
  • FIG. 1 shows a perspective view of a dry pressing equipment according to the prior art.
  • FIG. 2 is a process block diagram of the preparation of the wet granulated cell culture medium according to the present invention.
  • Figure 3 is an embodiment of the fluidized bed process in Figure 3 according to the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of the fluidized bed process unit 400.
  • FIG. 5 is an example of an apparatus for producing a wet granulated cell culture medium according to the present invention.
  • FIG. 7 is a real photograph in which FIG. 6 (a) is enlarged.
  • FIG. 8 is an actual photograph enlarged in FIG. 6 (b).
  • FIG. 9 is an actual photograph enlarged in FIG. 6 (c).
  • FIG. 2 is a process block diagram of the preparation of the wet granulated cell culture medium according to the present invention.
  • Figure 2 shows the cell culture medium aqueous solution preparation step 210.
  • the type of cell culture medium is divided into culture medium of mammalian, and / or insect and / or plant cells and bacteria.
  • Examples of the type of animal cell culture medium include DMEM, RPMI-1640, MCDB 131, MCDB 153, MDEM, IDEM, MEM, M199, McCoy s 5A, William's Medium E, Le-15ov's L-15 medium, Grace's insect cells Medium, IPL-41 insect cell medium, cell specific serum-free medium and the like are used to culture keratinocytes, epithelial cells, melanocytes, insect cells and the like.
  • bacterial cell culture media examples include trypsinized soy protein medium, brain-heart crushed medium, yeast extract medium, peptone-yeast extract medium, beef ground medium, indole-nitrate medium, LB medium, YT medium, SB medium. , SOB medium, M9 minimum medium, M63 minimum medium.
  • the cell culture medium means that the content ratio of tryptone, yeast extract, and salt is 2: 1: 2.
  • Cell culture medium aqueous solution is a preferred embodiment, in the case of LB medium, tryptone is dissolved in water, yeast extract is dissolved in the same solution, and salt is also dissolved, but each equivalent ratio of tryptone, yeast extract and salt is 2 To keep 1: 1: 2.
  • the water is a solvent, preferably the water can be distilled and / or deionized water or purified water or water for injection.
  • a bottom spray granulation step 220 is shown.
  • the size of the granule is preferably about 0.5mm to 3.0mm, because if it is larger than the size, it is not well accommodated in water, and if it is smaller, the problem of the prior art is followed.
  • the aqueous cell culture medium should be prepared to be supplied to the fluidized bed process through the pump to be sprayed.
  • the bottom spray granulation step 220 can be broken down as follows.
  • Supplying a cell culture medium aqueous solution to the bottom spray with a pump (2201) means supplying the aqueous medium solution prepared in the medium aqueous solution preparation step 210 to the fluidized bed process.
  • the high pressure hot air is 60 to 110 degrees Celsius in step 2202 of forming a fine particle by the high pressure hot air from which the cell culture medium aqueous solution sprayed by the bottom spray is raised from below, and the intensity of the hot air is from 1 m / sec to It is preferable that it is 3 m / sec. It is preferable that the feed rate of the cell culture medium aqueous solution sprayed by the bottom spray is 2 ml / min-5 ml / min.
  • Forming the spherical granules by the surface tension effect by the bottom spray continuously spraying the cell culture medium aqueous solution foam sprayed by the bottom spray (2203) is the cell culture medium aqueous solution foam sprayed by the bottom spray Layers are further formed on the surface of the cell culture medium aqueous foam in which the fine particles generated in the step 240 of forming the fine particles by the high pressure hot air are continuously sprayed to form a spherical shape.
  • step 2201 of supplying a cell culture medium aqueous solution to the bottom spray to the pump and forming a fine particle by the high pressure hot air from the cell culture medium aqueous solution sprayed by the bottom spray 2202
  • the aqueous solution of the cell culture medium provided in the step 2203 of forming the spherical granules by the surface tension effect by the bottom spray continuously spraying the cell culture medium aqueous solution foam sprayed by the bottom spray is the concentration of the cell culture medium 1 It can be dissolved in a ratio of 0.5 to 3 parts by weight of purified water per part by weight.
  • the medium prepared according to the present invention is prepared by increasing the concentration because it is not possible to add additional seeds or binders, enhancers, pressure-sensitive adhesives, binders, coating agents and the like other than components of the cell culture medium aqueous solution.
  • the reason for the increased concentration is that an aqueous solution foam sprayed and scattered without providing a separate seed is dried by a high pressure hot air, and thus the fine particles in the form of powder are acted as a seed, so that the seed is formed by itself. .
  • the aqueous solution foam is continuously sprayed to adhere to the fine particles formed above to coat the surface to form granular particles from the fine particles.
  • the step 2204 of drying the spherical granules as a result of forming the spherical granules by the surface tension effect of the bottom spray continuously spraying the cell culture medium aqueous solution foam sprayed by the bottom spray (2203) is the same. In the chamber.
  • step 2204 of drying the spherical granules the pump for supplying the aqueous solution of the cell culture medium and the bottom spray for injecting the supplied cell culture medium solution no longer operate, and the water content while fluidizing the granules by high pressure hot air by a blower. Will be adjusted.
  • the water content of the spherical granules is 1 to 2 percent.
  • each of the above steps is to complete the final product in one continuous process in one device, which is the basis for the convenience of work, the efficiency of production, and the reduction of labor.
  • spherical granules are obtained from the chamber and sifted to select granule sizes.
  • the granules of 50 mesh or less may be included in the aqueous solution prepared in the cell culture medium aqueous solution preparation step 210 and used again in the bottom spray granulation step 220.
  • the downward arrow 310 of the fluidized bed process unit 300 indicates a direction in which hot air is blown, and the aqueous medium solution 320 is sprayed in the center of the fluidized bed process unit 300.
  • Figure 330 is shown.
  • the aqueous medium solution is dried by hot air and forms a homogeneously circular shape by surface tension during the drying process.
  • the dried granules medium thus solves the problems of the prior art because the strength is stronger than the granules according to the prior art.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of the fluidized bed process unit 400.
  • a chamber 410 there is a chamber 410, and a chamber is a fluidized area in which a cell culture medium aqueous solution foam continuously flows as a room in which the cell culture medium aqueous solution is injected.
  • a blower 420 located at the bottom of the chamber serves to blow high pressure hot air.
  • the aqueous solution reservoir 430 is a place where the cell culture medium aqueous solution prepared in the medium aqueous solution preparation step 210 is stored.
  • the aqueous solution reservoir 430 is preferably 4 degrees Celsius or less to suppress the growth of microorganisms.
  • the pump 440 functions to pour some pressure to eject the aqueous solution in the aqueous solution reservoir 430 into the chamber.
  • the bottom-spray 450 is located in the lower portion of the chamber is a nozzle is formed so that the aqueous solution ejected by the pump 440 can be foamed.
  • FIG. 5 is an example of an apparatus for producing a wet granulated cell culture medium according to the present invention.
  • FIG. 7 is a real photograph in which FIG. 6 (a) is enlarged.
  • FIG. 8 is an actual photograph enlarged in FIG. 6 (b).
  • FIG. 9 is an actual photograph enlarged in FIG. 6 (c).
  • the present invention is to prepare a granule by spraying a solution of dissolved cell culture medium using only pure purified water as a solvent without using additional enhancer, pressure-sensitive adhesive, binder, coating agent, solvent, etc. in a state in which the cell culture medium is placed in a fluidized bed dryer. Because of the high solubility and good flowability when dissolving for the use of the finished product is expected to greatly improve the usability can be usefully used in the field of cell culture.

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Abstract

본 발명은 습식 과립화된 세포 배양 배지 및 그 제조방법으로서, 더욱 상세하게는 포유동물, 및/또는 곤충 및/또는 식물 세포 및 박테리아의 성장을 지지하는 습식 과립화된 세포 배양 배지 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

습식 과립화된 세포 배양 배지 및 그 제조방법
본 발명은 습식 과립화된 세포 배양 배지 및 그 제조방법으로서, 더욱 상세하게는 포유동물, 및/또는 곤충 및/또는 식물 세포 및 박테리아의 성장을 지지하는 습식 과립화된 세포 배양 배지 및 그 제조방법에 관한 것이다.
세포 배양 배지는 인공적 환경에서의 세포의 성장을 지지하고 유지한다.
성장이 지지되는 유기체의 유형에 따라, 세포 배양 배지는 10 초과, 때로는 백 초과의 상이한 성분을 포함할 수있다.
포유동물, 곤충 또는 식물 세포의 증식에 요구되는 배양 배지는 통상적으로 박테리아 및 효모의 성장을 지지하기에 충분한 최소 배지보다 보다 많이 복잡할 수 있다.
세포 배양의 초기 연구는 미정의된 성분, 예컨대 플라즈마, 혈청, 배아 추출물, 다른 비-제한적인 생물학적 추출물 또는 펩톤으로 이루어지는 배지를 이용하였다. 따라서 주요 발전은 화학적으로 정의된 배지의 개발과함께 이루어졌다. 대개 화학적으로 정의된 배지는 이에 배타적으로 제한되는 것은 아니지만 아미노산, 비타민, 금속 이온, 항산화제, 킬레이터, 성장 인자, 버퍼, 호르몬, 염화물 및 당업자에게 공지된 많은 다른 물질을포함한다.
일부 세포 배양 배지는 살균 수성 액체로서 제공된다. 액체 세포 배양 배지의 단점은 이의 감소된 저장 수명 및 운반 및 저장의 곤란성이다. 결과적으로, 많은 세포 배양 배지는 현재 미세하게 밀링된 건조 분말 혼합물로서 제공된다. 이는 물 및/또는 수성 용액에 용해되도록 제조되고, 이는 생물 세포에 성장을 위한 실질적 영양 베이스 및/또는 일부 상기 세포로부터의 생물 약제의 제조를 위해 다른 보충물과 함께 용해된 상태로 제안된다.
미세하게 분쇄된 분말의 취급은 상당한 단점을 가진다. 예를 들어, 이는 보다 대량으로 취급하기 매우곤란하고, 특히 각 원재료의 일부가 건강에 해로운 경우 물질을 취급하는 근로자의 건강상 문제를 야기할 수 있다. 각 성분이 직접적 독성이 없는 경우라도 호흡가능한 공기에서의 높은 먼지 수준 자체 및 이러한 문제로인해 많은 나라에서 엄격하게 제어하는 공기 중 먼지의 양에 의해 근로자에게 야기되는 건강상 문제가 있을 수있다. 또한 유기체의 먼지, 보다 특히 미세 먼지는 양이 과량이거나 경고성 측정값이 스파크에 의한 발화를예방하기에 불충분한 경우 분진폭발을 초래할 수 있다.
부가적으로, 이는 불리한 운반 조건, 예를 들어 건조 분말 배지 중 하나 이상의 더 가벼운 각 성분이 표면으로이동하거나 하나 이상의 더 무거운 성분이 일차 포장의 바닥으로 이동되는 장기간 운반 조건 하에 일어날 수 있다. 대량 물질의 물리적 중심에서의 이러한 국부적 고농도, 임의의 각 성분/들의 결핍의 결과는 배지의 생산 품질에 대해 여러 면에서 부정적일 수 있다. 부가적으로, 탈혼합 (de-mixing) 은 물리적 결핍 및 각 성분의 농도보다, 예를 들어 배치 당 표적 생물약학적 분자 생산량 또는 보다 미묘하게는 배지 품질을 환자에게바로 전의 생물약제학적 질에 절대적으로 중요한 배지 질을 만드는 생물약제 자체에 대한 올리고당 패턴화에 대해 더 많은 영향을 미칠 수 있다.
미세 밀링된 건조 분말 배지를 사용하는 경우에서의 다른 양태는 최종 수성 세포 배양 배지를 제조하기 위한 수성 용액에서의 미세 분말의 용해의 곤란성이다. 미세 밀링된 분말을 습윤시키고 수용액에서 이를 용해시키는 것은 매우 어렵다. 따라서 분말 배지의 취급 및 이의 용도는 매우 복잡하다.
안정성, 혼합 및 용해에 대한 건조 분말 배지의 제한으로 인해, 건조 형태의 배지는 대개 일부 중요 보충물, 예를 들어 탄산염, 가수분해물, 성장 인자 및 다른 미량 원소 (이는 최종 사용자가 건조 분말 배지로부터 액체를제조하는 경우 보충될 것임) 없이 제조될 수 있다. 부가적인 취급 및 보충은 매우 사소한 과실 및 노동력에대한 잠재성을 증가시킬 것이다.
분말화된 박테리아 세포 배양 배지는 분말을 작은 과립으로 성형하여 과립화될 수 있다. 그 결과는 안정성,취급성 및 성능에서의 이점을 갖는 작고 균일한입자이다.
Invitrogen Corporation 에 의한 US 6,383,810 B2 는 응집된 진핵 세포 배양 배지 분말의 제조 방법을 개시하고 있다. 방법은 용매를 사용하여 건조 분말 세포 배양 배지를 습윤시키고 이후 습윤된 배지를 재건조시켜건조 응집된 세포 배양 배지를 수득하는 것을 포함한다.
본 과정의 큰 단점은 전체 배지 성분이 물과 접촉할 것이 요구되고, 이는 이후 물을 제거하기 위해 가열될 것이요구된다는 것이다. 이는 배지의 성분 중의 상당한 부반응 또는 배지 품질에 대한 예상치 못한 결과를 갖는민감한 성분의 파괴 또는 변형을 야기할 수 있다.
결과적으로, 취급이 용이하고 배지 성분 중의 파괴 및/또는 부반응을 야기하지 않고 제조될 수 있는 포유동물,및/또는 곤충 및/또는 식물 세포 및 박테리아 배양 배지의 신규한 형태를 발굴할 것에 대한 분명한 요구가 존재한다.
또한 기존의 분말형 혹은 건조 과립형 배지의 명확한 단점들을 보충하기 위해 최소한의 가열과 부가재의 함유로서 최대한 원형 배지의 성능을 이끌어 낼 수 있는 방법의 시도가 요구되어 왔다.
도 1은 종래기술에 따른 건조 압착 장비의 사시도를 나타낸다.
도 1을 보면, 롤 프레스는 롤 R1 및 롤 R2 로서 보여지며, 분말 혼합물 P1 은 저장소로부터 롤 프레스로 공급된다.
롤 프레스로부터 나온 압착된 혼합물은 체 S 로규격화된다. 제품 일부는 추가 처리 및 포장을 위해 제거되고, 0.2 mm 미만의 입자 크기를 갖는 분말 일부P2 는 롤 프레스의 공급물로 연속적으로 재도입된다.
상기 특허문헌1은 건조 분말 혼합물이 미세분말로서 가지게 되는 문제를 어느 정도 해결하였으나, 특허문헌1에 의한 결과물은 형태가 균일하지 못하고 각진 형태를 갖게 된다.
따라서 운반 과정 및 취급 과정 중에 서로 부딪혀 깨짐으로 인해 과립형태가 제대로 유지되지 못하고 일부가 미세분말로 재형성되는 단점이 있었다. 즉, 과립형태의 강도가 더 요구되거나 형태를 구형으로 바꾸는 것이 좋을 것으로 사료된다.또한 입자형태가균질하지 못하여 정량의 어려움이 많으므로 적정한 농도의 배지를 이루기 어려운 단점이 있다.
*선행기술문헌*
(특허문헌 1) 대한민국 특허공개번호 10-2014-0032370 (2014년03월14일)
따라서 본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 감안하여 제안된 것으로서, 본 발명의 목적은 과립 형태의 강도가 단단하고 균일한 형태와 크기를 가진 배지를 제공하고자 하는 목적이 있다.
또한, 분무건조기나 혼합, 분쇄 등의 추가적인 공정이 없고 기존 방식에 비해 상대적으로 적은 단일 공정으로 과립을 만들 수 있으며 준비된 분말의 100%를 과립화할 수 있어 생산성이 크게 향상시키고자 하는 목적이 있다.
건조 배지 성분의 혼합되고 미세 밀링된 분말을 정제수에 일정비로 용해시킨 뒤 유동층 건조기에서 분사함으로써 펩톤 함유/무함유, 혹은 화학적으로 정의된 포유동물 및 곤충 및 식물 및 박테리아 세포 배양 배지가 습식 과립의 형태로 제조될 수 있다는 것을 밝혀내었다.
본 발명의 방법을 보조하기 위해 첨가제 혹은 응집제는 별도로 요구되지 않는다.
본 발명에 따른 습식 과립화된 세포 배양 배지는 기존 과립화 제품에 비해 제형과 강도가 우수하고, 외형상 미려하며, 내습성이 있어 긴 저장수명을 갖고, 취급하기 용이하고, 포장이 용이하며,제조 공정 과정에서의 배지 성분의 가열로 인한 부반응이 발생되지 않도록 온화한 조건 하에서 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기에 의한 습식 과립화된 세포 배양 배지와 그 제조법에 관한 것이다.
가. 배지 성분의 분말이 혼합된, 혹은 개별로 세포 배양 배지를 제공하는 단계
나. 배지 성분의 분말이 혼합된, 혹은 개별로 정제수에 일정 비율로 정제수에 용해되는 단계
다. 유동층 과립기의 바텀 스프레이로 상기 용해된 세포 배양 배지를 분무하며 과립화하는 단계
바람직한 구현 예에 있어서, 단계 가. 에서 제공되는 세포 배양 배지는 박테리아 세포 배양 배지이다.
바람직한 구현 예에 있어서, 단계 가. 에서 제공되는 세포 배양 배지는 하나 이상의 당류 성분, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 비타민, 하나 이상의 염, 하나 이상의 버퍼 성분, 하나 이상의 보조 인자, 하나 이상의 핵산, 트립톤 혹은 펩톤을 함유할 수 있다.
바람직한 구현 예에 있어서, 단계 나. 에서 제공되는 세포 배양 배지는 당량비로써 세포 배양 배지 1 당 정제수 0.5에서 3의 비율로 용해될 수 있다.
바람직한 구현 예에 있어서, 단계 다.는 하기에 의해 수행된다.
다1. 펌프로 바텀 스프레이에 세포 배양 배지 수용액을 공급하는 단계.
다2. 바텀 스프레이에 의해 분사된 세포 배양 배지가 아래에서 올라오는 고압 열풍에 의해 미세한 입자를 형성하는 단계.
다3. 바텀 스프레이에 의해 분사된 세포 배양 배지 입자가 지속적으로 분사되는 바텀 스프레이에 의한 표면 장력 효과로 구형의 과립을 형성하는 단계.
바람직한 구현 예에 있어서, 다1. 의 펌프의 바텀 스프레이로의 용해된 세포 배양 배지 공급 속도는 2ml/min에서 5ml/min 사이이다.
바람직한 구현 예에 있어서, 다2.의 열풍의 온도는 섭씨 60도에서 110도 사이이다.
바람직한 구현 예에 있어서, 다2. 의 열풍의 세기는 1m/sec에서 3m/sec 사이이다.
이상의 구성 및 작용을 지니는 본 발명에 따른 습식 과립화된 세포 배양 배지 및 그 제조방법은,
습식 과립화된 세포 배양 배지, 특히 포유동물, 및/또는 곤충 및/또는 식물 세포 및 박테리아의 성장을 지지하는 습식 과립화된 세포 배양 배지에 관한 것으로서 과립 형태의 강도가 단단하고 균일한 형태와 크기를 가진 배지를 제공한다. 본 발명에 따른 습식 과립화된 세포 배양 배지는 기존 건식 과립화 제품이 가진 장점을 모두 취하면서도, 건식 과립화 제품에 비해 제형이 구형으로 일정할뿐더러, 강도가 우수하고, 외형상 미려하며, 내습성이 있어 긴 저장수명을 갖고, 취급하기 용이하고, 포장이 용이한 장점이 있다.
이와 같은 본 발명을 적용하면, 세포 배양 배지를 유동층 건조기에 넣은 상태에서 추가적인 증진제, 점착제, 결착제, 피복제,부용제 등을 사용하지 않고 깨끗한 정제수만을 용매로 한 용해된 세포 배양 배지 수용액을 분사시켜 과립을 제조하기 때문에 완성된 제품 사용을 위한 용해 시 용해도가 매우 높고 흐름성이 양호하여 사용성이크게 향상되는 효과가 기대된다.
또, 분무건조기나 혼합, 분쇄 등의 추가적인 공정이 없고 기존 방식에 비해 상대적으로 적은 단일 공정으로 과립을 만들 수 있으며 준비된 분말의 100%를 과립화할 수 있어 생산성이 크게 향상되는 효과가 있다.
도 1은 종래 기술에 따른 건조 압착 장비의 사시도를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 습식 과립화된 세포 배양 배지의 제조 공정 블록도이다.
도 3은 본 발명에 따른 도 3에 상기 유동층 공정기의 일실시예이다.
도 4는 상기 유동층 공정기(400)의 개략도이다.
도 5는 본 발명에 따른 습식 과립화된 세포 배양 배지의 제조장치의 예이다.
도 6은 세포 배양 배지 과립의 실물 사진이다.
도 7은 도6(a)를 확대한 실물 사진이다.
도 8은 도6(b)를 확대한 실물 사진이다.
도9 는 도6(c)를 확대한 실물 사진이다.
*도면의 주요부호에 대한 상세한 설명*
210 :세포 배양 배지 수용액 제조 단계
2203 :바텀 스프레이에 의해 분사된 세포 배양 배지 수용액 포말이 지속적으로 분사되는 바텀 스프레이에 의한 표면 장력 효과로 구형의 과립을 형성하는 단계
2204 :구형의 과립을 건조하는 단계
300 :유동층 공정기
310 :하방 화살표
330 :열풍에 의하여 대류하는 모습
400 :유동층 공정기
420 :블로어
430 :수용액 저장소
450 :바텀-스프레이
이하, 본 발명에 의한 습식 과립화된 세포 배양 배지 및 그 제조방법에 대한 것을 도면을 참조하여 설명하고자 한다.
도 2는 본 발명에 따른 습식 과립화된 세포 배양 배지의 제조 공정 블록도이다.
도 2를 참조하여 설명하면, 도 2에는 세포 배양 배지 수용액 제조 단계(210)가 도시되어 있다.
세포 배양 배지의 종류는 포유동물, 및/또는 곤충 및/또는 식물 세포 및 박테리아의 배양 배지로 나뉜다.
동물 세포 배양 배지의 종류를 예로 들자면, DMEM, RPMI-1640, MCDB 131, MCDB 153, MDEM, IDEM, MEM, M199, McCoy s 5A, William의배지 E, Leibovitz의 L-15 배지, Grace의곤충 세포 배지, IPL-41 곤충 세포 배지, 세포 특이적 무혈청 배지 등이 케라틴세포, 상피세포, 멜라닌세포, 곤충세포 등을 배양하기 위해 사용된다.
박테리아 세포 배양 배지의 종류를 예로 들자면, 트립신 처리된 대두단백 배지, 뇌-심장 분쇄 배지, 효모 추출물 배지, 펩톤-효모 추출물 배지, 소고기 분쇄 배지, 인돌-질산염 배지, LB 배지, YT 배지, SB 배지, SOB 배지, M9 최소배지, M63 최소배지 등이 있다.
세포 배양 배지의 바람직한 구현 예로서 LB배지의 경우 공개되어 있는 바와 같이 세포 배양 배지에는 트립톤과 효모 추출물, 소금의 함유량 비가 2:1:2로서 구성됨을 의미한다.
세포 배양 배지 수용액이라 함은 바람직한 구현 예로서 LB배지의 경우 물에 트립톤을 녹이고, 또한 동일한 용액에 효모 추출물을 녹이며 또한 소금도 녹이되, 트립톤과 효모 추출물과 소금에 대한 각각의당량비는 2:1:2를 유지함을 말한다.
상기 물은 용매로서, 바람직하게는 상기 물은 증류된 및/또는 탈이온화된 물 또는 정제된 물 또는 주입용 물이 될 수 있다.
도 2에는 바텀스프레이식 과립화 단계(220)가 도시되어 있다.
(과립의 크기는 0.5mm 내지 3.0mm 정도가 바람직하다. 왜냐하면 상기 크기보다 크다면 물에 잘 수용되지 않기 때문이며, 더 작으면 종래기술이 가진 문제점을 그대로 답습하기 때문이다.)
상기 세포 배양 배지 수용액은 펌프를 통하여 유동층 공정기에 공급되어 분사되기 위한 준비가 되어 있어야 한다.
바텀스프레이식 과립화 단계(220)는 하기와 같이 세분화 될 수 있는 바 이를 설명하면 다음과 같다.
펌프로 바텀 스프레이에 세포 배양 배지 수용액을 공급하는 단계(2201)는 상기 배지 수용액 제조 단계(210)에서 제조된 배지 수용액을 유동층 공정기에 공급하는 것을 의미한다.
바텀 스프레이에 의해 분사된 세포 배양 배지 수용액 포말이 아래에서 올라오는 고압 열풍에 의해 미세한 입자를 형성하는 단계(2202)에서 상기 고압 열풍은 섭씨 60도 내지 110도이며, 열풍의 세기는 1m/sec 내지 3m/sec 인 것이 바람직하다.그리고 바텀 스프레이에 의해 분사된 세포 배양 배지 수용액 공급속도는 2ml/min 내지 5ml/min 인 것이 바람직하다.
바텀 스프레이에 의해 분사된 세포 배양 배지 수용액 포말이 지속적으로 분사되는 바텀 스프레이에 의한 표면 장력 효과로 구형의 과립을 형성하는 단계(2203)는 상기 바텀 스프레이에 의해 분사된 세포 배양 배지 수용액 포말이 아래에서 올라오는 고압 열풍에 의해 미세한 입자를 형성하는 단계(240)에서 생성된 미세한 입자가 지속적으로 분사되는 세포 배양 배지 수용액 포말에 의하여 표면에 층이 더욱 형성되며 구형으로 형태를 갖추게 된다.
바람직하게는 상기 펌프로바텀 스프레이에 세포 배양 배지 수용액을 공급하는 단계(2201) 및 바텀 스프레이에 의해 분사된 세포 배양 배지 수용액 포말이 아래에서 올라오는 고압 열풍에 의해 미세한 입자를 형성하는 단계(2202), 바텀 스프레이에 의해 분사된 세포 배양 배지 수용액 포말이 지속적으로 분사되는 바텀 스프레이에 의한 표면 장력 효과로 구형의 과립을 형성하는 단계(2203)에 제공되는 세포 배양 배지 수용액은그 농도가 세포 배양 배지 1중량부 당 정제수 0.5 중량부내지 3중량부의 비율로 용해될 수 있다.
본 발명에 의하여 제조되는 배지는 세포배양 배지 수용액의 성분과 다른 별도의 시드나결합제,증진제, 점착제, 결착제, 피복제등을 부가적으로 첨가할 수 없기 때문에 농도를 높여서 제조하게 되는 것이다.
즉, 농도를 높인 이유는 별도의 시드를 마련하지 않고 분사되어 비산되는 수용액 포말이 고압 열풍에 의해 건조되고 이렇게 형성된 분말 형태의 미세한 입자가 마치 시드처럼 작용하여 시드가자체적으로 형성되는 효과를 가지게 된다.
또한, 지속적으로 분사되는 수용액포말은 상기에서 형성된 미세한입자에 달라붙어 표면을 코팅하게 되어 미세한 입자에서 과립형태의 입자를 형성하게 된다.
상기 바텀 스프레이에 의해 분사된 세포 배양 배지 수용액 포말이 지속적으로 분사되는 바텀 스프레이에 의한 표면 장력 효과로 구형의 과립을 형성하는 단계(2203)의 결과물인 구형의 과립을 건조하는 단계(2204)가 동일한 챔버에서 이루어 지게 된다.
구형의 과립을 건조하는 단계(2204)에서는 세포 배양 배지 수용액을 공급하는 펌프와 공급된 세포 배양 배지 수용액을 분사하는 바텀 스프레이가 더 이상 작동하지 않고, 블로어에 의한 고압 열풍으로 과립을 유동화 시키면서 수분 함유량을 조절하게 된다. 바람직하게는 구형의과립의 수분 함유량은 1 내지 2 퍼센트이다.
유동층 공정기를 사용하면 이론적으로는 초기에 프로덕트 컨테이너에 넣는 시드가 없어도 유동층 흐름 속으로안개처럼 분무되는 세포배양 배지 수용액의 작은 물방울(liquid droplet, 포말)의 수분이 즉시 증발되면서 미세한 분말이형성되고 이것이 시드 역할을 하면서 유동층 기류 속에서 분말 상호 간에 마모 작용을 하므로 세포 배양 배지 과립을 형성시킬 수 있다.
하지만 초기의 유동화 및 분말 형성조건 조절이 어렵고 초기에 많은시간이 소비된다. 그러므로 본 발명에서도 필요한 형태와 크기의 과립을 제조하기 위한 제조 시간이 10시간 정도 소요되게 된다.
그러나 상기의 각 단계는 하나의 장치내에서 한 번의 연속 공정으로 최종 제품까지 완성하게 되는 데 이러한 장점은 작업의 편의성 및 생산의 효율성, 노동력의 절감을 꾀할 수 있는 바탕이 된다.
상기 모든 단계가 끝나고 나면 마지막으로 챔버로부터 구형의 과립을 수득하여 과립 크기를 고르기 위하여 체에 거르게 된다. 바람직하게는 50메시(mesh) 이하의 과립은 다시 세포 배양 배지 수용액 제조 단계(210)에서 제조되는 수용액에 포함되어 바텀스프레이식 과립화 단계(220)에 다시 사용될 수 있다. (챔버로부터 구형의 과립을 수득하여 과립 크기를 고르는 단계(230))
도 3에 상기 유동층 공정기의 일실시예를 볼 수 있다.
도 3을 보면유동층 공정기(300)의하방 화살표(310)는 열풍이 불어가는 방향을 의미하며, 유동층 공정기(300)의 중앙에는 배지 수용액(320)이 분사되고 있으며, 열풍에 의하여 대류하는 모습(330)이 나타나 있다.
그 과정중에 열풍에 의하여 배지 수용액은 건조되게 되며 건조과정에 표면장력에 의하여 균질하게 원형으로 그 형태를 이루게 된다. 이렇게 건조된 과립형태의 배지는 그 강도가 종래의 기술에 따른 과립보다 강하므로 종래의 문제점을 해결하게 된다.
도 4는 상기 유동층 공정기(400)의 개략도이다.
도 4를 보면 챔버(410)가 있으며, 쳄버는 세포배양 배지 수용액이 분사되는 방으로서 지속적으로 분사되는 세포배양 배지 수용액 포말이 유동하는 유동화 영역이다.
도 4에는 상기 챔버의 하부에 위치한 블로어(blower, 420)는 고압 열풍을 불어주는 기능을 수행한다.
수용액 저장소(430)는 상기 배지 수용액 제조 단계(210)에서 제조된 세포 배양 배지 수용액이 저장된 장소이다. 상기 수용액 저장소(430)는 미생물의 증식을 억제하기 위하여 섭씨 4도 이하인 것이 바람직하다.
펌프(440)는 상기 수용액 저장소(430)내의 수용액을 상기 챔버내로 분출하기 위하여 다소간의 압력을 주어 뿜어내는 기능을 한다.
바텀-스프레이(450)는 상기 챔버의 하부에 위치하여 상기 펌프(440)에 의하여 분출되는 수용액이 포말형태가 될 수 있도록 노즐이 형성된 것이다.
도 5에는 본 발명에 따른 습식 과립화된 세포 배양 배지의 제조장치의 예이다.
도 6는 세포 배양 배지 과립의 실물 사진이다.
는 종래의 세포배양배지과립이며, (b)는 특허문헌1에 의해 개선된 것과 같은 방식으로 만들어진 세포 배양 배지 과립이며, (c)는 본 발명에 따른 구형 세포 배양 배지 과립의 실물 사진이다.
(a)는 미세하게 분쇄된 분말된 상태를 볼 수 있으며, (b)는 균일하지 못하고 각진 형태를 볼 수 있으며, (c)는본 발명에 따른 구형의 균질된 형태의 과립을 볼 수 있다.
도 7은 도6(a)를 확대한 실물 사진이다.
도8은 도6(b)를 확대한 실물 사진이다.
도9은 도6(c)를 확대한 실물 사진이다.
상기와 같은 내용의 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시된 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다.
본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구 범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명은 세포 배양 배지를 유동층 건조기에 넣은 상태에서 추가적인 증진제, 점착제, 결착제, 피복제,부용제 등을 사용하지 않고 깨끗한 정제수만을 용매로 한 용해된 세포 배양 배지 수용액을 분사시켜 과립을 제조하기 때문에 완성된 제품 사용을 위한 용해 시 용해도가 매우 높고 흐름성이 양호하여 사용성이크게 향상되는 효과가 기대되어 세포 배양분야에서 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Claims (7)

  1. 세포 배양 배지 제조방법에 있어서,
    세포 배양 배지 수용액 제조 단계(210);와
    바텀스프레이식 과립화 단계(220);로 이루어지는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    챔버로부터 구형의 과립을 수득하여 과립 크기를 고르는 단계(230)가 더 포함되는 것을 특징으로 특징으로 하는 세포 배양 배지 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    과립의 크기는 0.5mm 내지 3.0mm 정도인 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    별도 시드(seed)나 결합제투입없이세포 배양 배지 수용액만으로 과립화하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    세포 배양 배지 수용액은 세포 배양 배지 1중량부 당 정제수 0.5 중량부 내지 3중량부의 비율로 제조된 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    바텀스프레이식 과립화 단계(220)는,
    펌프로바텀 스프레이에 세포 배양 배지 수용액을 공급하는 단계(2201);와
    바텀 스프레이에 의해 분사된 세포 배양 배지 수용액 포말이 아래에서 올라오는 고압 열풍에 의해 미세한 입자를 형성하는 단계(2202);와,
    바텀 스프레이에 의해 분사된 세포 배양 배지 수용액 포말이 지속적으로 분사되는 바텀 스프레이에 의한 표면 장력 효과로 구형의 과립을 형성하는 단계(2203);와,
    구형의 과립을 건조하는 단계(2204);로 구성되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지 제조방법.
  7. 상기 제 1항 내지 제 6항중에 어느 한항의 제조방법으로 제조된 세포배양 배지 과립.
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