WO2016002760A1 - Ｂ細胞集団の製造方法 - Google Patents

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大介 北村
智之 中石
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学校法人東京理科大学
株式会社カネカ
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    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a B cell population, a B cell population produced by the method for producing a B cell population described above, and a method for producing a monoclonal antibody using the same.
  • Monoclonal antibodies exhibiting high selectivity for specific antigens are expected to be developed as antibody drugs, and in particular, antibody drugs targeting cancer cells are being developed.
  • a medicine containing a monoclonal antibody as an active ingredient to human treatment it is most ideal from the viewpoint of avoiding rejection reaction to administer a human antibody with a small amount of foreign antigen. For this reason, many chimeric antibodies and humanized antibodies have been developed.
  • chimeric antibodies and humanized antibodies for human therapy use mouse IgG antibodies produced by hybridomas after the immunization of mice with an antigen multiple times and then fusion of spleen and lymph node cells with myeloma cells to form hybridomas. Based on this, it is produced using recombinant technology.
  • an immunizing antigen shows individual toxicity, immunization to an individual is difficult.
  • a protein antigen that is highly conserved among animal species is used as an antigen, antibodies are hardly produced due to immunological tolerance.
  • B cells are cells derived from bone marrow and are immune cells having a B cell receptor (BCR) on the surface, and are cells that produce antibodies.
  • B cells arise from hematopoietic stem cells and differentiate into B cells via pro-B cells and pre-B cells.
  • B cells producing antibodies with high affinity for antigen are known to be selected at the germinal center, but the mechanism of this selection has not been fully elucidated. If B cells that produce antibodies with high affinity for a specific antigen can be artificially grown and concentrated, monoclonal antibodies with high affinity for a specific antigen can be produced in a shorter time. .
  • the germinal center is a histological structure formed as a result of proliferation of naive B cells not contacted with an antigen in contact with the antigen, and class switching and somatic hypermutation occur in the germinal center B cells. It has been known.
  • Non-Patent Document 2 when splenic B cells are cultured together with IL-4 and anti- ⁇ Hc antibody in the presence of fibroblasts in which BAFF and CD40L are coexpressed, most B cells have a germinal center-like phenotype. It is disclosed that about half of them class-switch to IgG1, and subsequently switch IL-4 to IL-21 to increase IgE-positive cells.
  • Patent Document 2 discloses a method for producing an antigen-specific B cell population containing IgG-positive B cells specific for a specific antigen, wherein the IgG-positive B cells are treated with CD40, BAFF receptor in the presence of IL-21. And antigen-specific B cells specific to the specific antigen are selected by culturing with the specific antigen while applying stimulation via Fas, and antigen-specific including an IgG-positive B cell specific to the specific antigen Such a method of production comprising obtaining a B cell population is described.
  • Patent Document 3 discloses a method for stabilizing a B cell line, comprising the steps of obtaining B cells, increasing the expression of BCL-6 in the cells, and maintaining the cells in a replicable environment. Are listed.
  • Patent Document 4 discloses a method for affecting the stability of an antibody-producing cell, including a step of directly or indirectly affecting the amount of an expression product of BCL6 and / or Blimp-1 in the antibody-producing cell.
  • Patent Document 5 describes a non-human animal characterized in that the expression of the bach2 gene is artificially suppressed, and that IgM or / and an IgM-producing hybridoma can be generated with high frequency using the animal. Is described.
  • an object of the present invention is to provide a method for easily producing an antigen-specific B cell population containing IgG-positive B cells specific for a specific antigen. Furthermore, the present invention provides a problem to be solved by providing a B cell population produced by the above-described method for producing a B cell population and a method for producing a monoclonal antibody using the above method for producing a B cell population. To do.
  • the present inventors have determined that B cells whose Bach2 gene expression is increased by introducing the Bach2 gene into B cells are treated with CD40 and / or ⁇ ⁇ BAFF receptor. By culturing in the presence of the B cell population, it was found that the B cell population can be cultured for a long time at a high growth rate, and the present invention has been completed.
  • a method for producing a B cell population comprising a step of culturing B cells in which expression of a Bach2 gene is elevated in the presence of an action means for CD40 and / or BAFF receptors.
  • the method for producing a B cell population according to [1], wherein the B cell in which the expression of the Bach2 gene is increased is a cell obtained by introducing the Bach2 gene into the B cell.
  • the Bach2 gene is any one of the following genes (a) to (d): (A) a gene comprising a base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2; (B) a gene comprising a base sequence encoding an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2, and having a function equivalent to that of the Bach2 gene; (C) a gene comprising a base sequence encoding an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, inserted, substituted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2, A gene having a function equivalent to that of the Bach2 gene; or (d) hybridizing under stringent conditions with a gene having a base sequence complementary to the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and
  • [4] The method for producing a B cell population according to [2] or [3], wherein a Bach2 gene is introduced into B cells using a viral vector.
  • [5] The method for producing a B cell population according to [4], wherein the viral vector is a retroviral vector, a lentiviral vector, an adenoviral vector, or an adeno-associated viral vector.
  • the B cell is a mouse cell, and the specific growth rate on day 9 to day 13 after introducing the Bach2 gene into the B cell is 0.6 (1 / day) or more, [1] to [5 ] The manufacturing method of the B cell population in any one of.
  • the B cell is a mouse cell, and after introducing the Bach2 gene into the B cell, the 9th to 17th day, the 9th to 22nd day, the 9th to 27th day, and the 9th to 32nd day
  • the B cell is a mouse cell, and any one or more of the 13th to 17th day, the 17th to 22nd day, and the 22nd to 27th day after introducing the Bach2 gene into the B cell
  • the specific growth rate is 0.6 (1 / day) or more, and the specific growth rate on any one or more of the 27th to 32nd days and the 32nd to 38th days after introducing the Bach2 gene into B cells
  • the B cell is a human cell, and the specific growth rate on day 12 to day 18 after introducing the Bach2 gene into the B cell is 0.1 (1 / day) or more, [1] to [5 ]
  • the specific proliferation rate in any one or more of the 12th to 24th day and the 12th to 30th day after introducing the Bach2 gene into the B cell is 0.2 ( 1 / day) or more, The method for producing a B cell population according to [6B].
  • the specific proliferation rate at any one or more of the 18th to 24th days and the 24th to 30th days after the introduction of the Bach2 gene into the B cells is 0.15 (1 / Day)
  • the action means for CD40 and / or BAFF receptor is one or more of any of a structure presenting CD40L and / or BAFF, a stimulating factor of CD40, or a stimulating factor of BAFF receptor, [1 ]
  • a structure presenting CD40L and / or BAFF
  • a stimulating factor of CD40 or a stimulating factor of BAFF receptor
  • the structure is any one of a carrier, a feeder cell, an extracellular matrix, a living tissue, or an organ.
  • the CD40 stimulating factor or BAFF receptor stimulating factor is any one of an anti-CD40 antibody, a secreted CD40L, an anti-BAFF receptor antibody, or a secreted BAFF.
  • a method for producing the described B cell population [12] The method for producing a B cell population according to any one of [9] to [11], wherein the concentration of a CD40 stimulating factor contained in a medium for culturing B cells is 10 ng / mL or more. [13] The method for producing a B cell population according to any one of [9] to [12], wherein the concentration of the stimulating factor of the BAFF receptor contained in the medium for culturing B cells is 10 ng / mL or more.
  • the step of culturing B cells in which the expression of the Bach2 gene is elevated in the presence of an action means for CD40 and / or BAFF receptor comprises the action means for CD40 and / or BAFF receptor and IL-21 reception
  • the step of culturing B cells in which the expression of the Bach2 gene is elevated in the presence of an action means for CD40 and / or BAFF receptor comprises an action means for CD40 and / or BAFF receptor, IL-21 reception
  • the B cells Prior to introducing the Bach2 gene into B cells, the B cells are cultured in the presence of means for acting on CD40 and / or BAFF receptors and in the presence of IL-4 or IL-4 and IL-2.
  • the production method of [20] or [21], wherein the concentration of IL-2 contained in the medium for culturing B cells is 2.5 U / mL or more.
  • the step of culturing B cells in which the expression of the Bach2 gene is elevated in the presence of means for acting on CD40 and / or BAFF receptors is a step of culturing in the absence of stimulation via FAS.
  • the B cell population according to [25] wherein the B cell has a Bach2 gene incorporated into a viral vector.
  • the B cell is a mouse cell, and the specific growth rate from day 9 to day 13 after introducing the Bach2 gene into the B cell is 0.6 (1 / day) or more, [25] or [26 ] B cell population as described in.
  • the B cell is a human cell, and the specific growth rate on day 12 to day 18 after introducing the Bach2 gene into the B cell is 0.1 (1 / day) or more, [25] or [26 ] B cell population as described in.
  • a method for producing a monoclonal antibody which uses the B cell population produced by the production method according to any one of [1] to [24].
  • an antigen-specific B cell population containing IgG-positive B cells specific for a specific antigen can be easily produced.
  • FIG. 1 shows the cumulative increase rate of B cells on the fifth day in long-term culture of mouse B cells using a retroviral vector.
  • FIG. 2 shows the specific growth rate of B cells after 9 days in long-term culture of mouse B cells using a retroviral vector.
  • FIG. 3 shows the specific growth rate for each period of B cells in long-term culture of mouse B cells using a retroviral vector.
  • FIG. 4 shows the cumulative increase rate of B cells on the 6th day in long-term culture of human B cells using a retroviral vector.
  • FIG. 5 shows the specific growth rate of B cells after 12 days in long-term culture of human B cells using a retroviral vector.
  • FIG. 6 shows the specific growth rate for each period of B cells in long-term culture of human B cells using a retroviral vector.
  • the method for producing a B cell population of the present invention is a method comprising a step of culturing B cells in which Bach2 gene expression is elevated in the presence of means for acting on CD40 and / or BAFF receptors.
  • B cells with increased expression of the Bach2 gene can be obtained by increasing the expression level or abundance of the Bach2 gene originally possessed by the B cell, or cells obtained by introducing the Bach2 gene into the B cell. Any of the cells can be used.
  • Methods for increasing the expression level or abundance of the Bach2 gene originally possessed by the B cell include a method of introducing the Menin gene (Nature Communications, 5: 3555, DOI: 10: 1038.ncomms4555) into the B cell, Lept Examples thereof include a method of inhibiting the nuclear export of Bach2 by adding mycin B (LMB) and localizing it to the nucleus, or a method of adding an inhibitor of ubiquitination and degradation by proteasome of Bach2. It is not limited.
  • the Bach2 gene is preferably any of the following genes (a) to (d).
  • A a gene comprising a base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2
  • B a gene comprising a base sequence encoding an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2, and having a function equivalent to that of the Bach2 gene
  • C a gene comprising a base sequence encoding an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, inserted, substituted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2, A gene having a function equivalent to that of the Bach2 gene; or (d) hybridizing under stringent conditions with a gene having a base sequence complementary to the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO:
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of mouse Bach2, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of human Bach2.
  • sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2 is preferably 90% or more, more preferably 93% or more, still more preferably 95% or more, and particularly preferably 98% or more.
  • sequence identity of amino acid sequences is determined by comparing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2 with the amino acid sequence to be evaluated, and dividing the number of positions where the amino acid matches in both sequences by the total number of amino acids compared. Further, it is expressed by a value obtained by multiplying by 100.
  • having a function equivalent to the Bach2 gene means having a function equivalent to a gene consisting of a base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2, for example, When introduced into B cells, it means that the same cell proliferating function is exhibited. Also, as one of the functions of the Bach2 gene, the expression product of the Bach2 gene binds to the MARE (Maf-recognition element) upstream of the Blimp1 gene promoter and the IRF binding sequence in the fifth intron, thereby transcription of the Blimp1 gene. It is known to suppress. Having a function equivalent to that of the Bach2 gene may have a function of suppressing transcription of the Blimp1 gene as in the case of the Bach2 gene.
  • MARE Micro-recognition element
  • amino acid sequence modified by deletion, insertion, substitution and / or addition may include only one type (for example, substitution) of modification or two or more modifications (for example, substitution and substitution). Insertion).
  • the amino acid to be substituted is preferably an amino acid having a property similar to that of the amino acid before substitution (cognate amino acid).
  • amino acids in the same group of the following groups are regarded as homologous amino acids.
  • the plurality of amino acids is, for example, 60, preferably 20, more preferably 15, more preferably 10, still more preferably 5, 4, 3, particularly preferably 2 or less. Of amino acids.
  • a gene that hybridizes under stringent conditions with a gene having a base sequence complementary to the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2 is SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2.
  • Colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern hybridization method, etc. under stringent conditions using DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence encoding the amino acid sequence shown in FIG. Means DNA obtained by using
  • Hybridization can be performed according to the method described in “Molecular Cloning, A Laboratories manual, second seconds edition (Cold Spring, Harbor Laboratory Press, 1989)” and the like.
  • the DNA that hybridizes under stringent conditions is, for example, hybridization at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which colony or plaque-derived DNA is immobilized.
  • DNA that can be obtained by washing the filter under a condition of 65 ° C. using a 2 ⁇ concentration SSC solution (the composition of the 1 ⁇ concentration SSC solution consists of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate) Can be mentioned. It is preferably washed at 65 ° C.
  • hybridization conditions have been described as described above, the hybridization conditions are not particularly limited to these conditions.
  • a plurality of factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art can realize optimum stringency by appropriately selecting these factors.
  • a recombinant vector having the Bach2 gene may be constructed, and this recombinant vector may be introduced into the B cell.
  • the vector include a viral vector, a plasmid vector, a liposome vector (for example, a cationic liposome vector) and the like.
  • virus vectors include retrovirus vectors (eg, lentivirus vectors such as HIV vectors), adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes virus vectors, Sendai virus vectors, baculovirus vectors, and the like.
  • the vector is preferably a viral vector, more preferably a retroviral vector (for example, a lentiviral vector such as an HIV vector), an adenoviral vector or an adeno-associated viral vector, and particularly preferably a retroviral vector (for example, Lentiviral vectors such as HIV vectors).
  • a retroviral vector for example, a lentiviral vector such as an HIV vector
  • an adenoviral vector or an adeno-associated viral vector and particularly preferably a retroviral vector (for example, Lentiviral vectors such as HIV vectors).
  • vectors include sequences that control Bach2 gene expression (eg, promoter sequences, terminator sequences, enhancer sequences) and gene markers for selecting host cells (eg, neomycin resistance gene, kanamycin resistance gene) Etc. may be included.
  • sequences that control Bach2 gene expression eg, promoter sequences, terminator sequences, enhancer sequences
  • gene markers for selecting host cells eg, neomycin resistance gene, kanamycin resistance gene
  • Etc e.g, those conventionally used in the field of genetic engineering can be used.
  • a method for introducing a vector containing the Bach2 gene into a B cell for example, in the case of a viral vector, it can be performed by infection, and in the case of a plasmid vector, an electroporation method, a calcium phosphate method, a lipofection method or the like can be mentioned. It is done.
  • the level of increase in the expression of the Bach2 gene is not particularly limited as long as the effect of the present invention can be obtained.
  • the expression level of the Bach2 gene is preferably 1.5 times or more as compared with the original B cell. More preferably, it is the above.
  • the B cell used in the present invention is preferably an IgG positive B cell, that is, a B cell having IgG on its surface.
  • IgG-positive B cells can be obtained from the cell population containing B cells based on the presence or absence of IgG antibodies.
  • the cell population containing B cells used in the present invention is not particularly limited as long as it is generally derived from peripheral blood cells, bone marrow cells or lymphoid organs such as spleen cells.
  • the IgG positive B cell may be a naive B cell that has not yet reacted with an antigen, or a B cell that has been contacted with an antigen.
  • “naive B cells” generally refer to mature B cells that have not reacted with the antigen, and correspond to cells that exhibit CXCR5-positive and CD40-positive surface antigens.
  • the cell population used in the present invention preferably has IL-21 receptor (IL-21R), CD40, BAFF receptor (BAFF-R), preferably has Fas, and further recognizes an antigen.
  • IgG positive B cells those containing possible IgG positive B cells are preferred. As long as the object of the present invention is not hindered, other stages of B cells and various cells in the differentiation stage may be included. From the viewpoint of the efficiency of selection by culture, B cells other than IgG positive B cells, such as IgE positive cells, CD138 positive (plasma) cells, and cells other than B cells, such as T cells, monocytes, and NK cells are removed. It is preferable to do.
  • the cell population may be a cell population derived from an organism with an established immune system, such as mammalian primates such as humans and monkeys, ungulates such as pigs, cows and horses. Rodents such as mice, rats, rabbits and the like, birds such as chickens and quails are included.
  • the origin of this cell population is preferably rodents and primates, and examples thereof include mice and humans.
  • a condition for preparing a normal B cell population may be applied as it is.
  • it is not limited to a cell population derived from a living body, and may be an established B cell line.
  • the culture of the cell population containing B cells can be performed under normal culture conditions using a medium usually used for B cell culture.
  • a medium usually used for B cell culture examples include Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) and RPMI 1640.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • RPMI 1640 a medium usually used for B cell culture.
  • the culture conditions such as the culture temperature
  • the culture conditions used for general B cells can be applied as they are, for example, a condition of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the seeding density of the cell population in the medium varies depending on the origin of the cell population, the state of the cells prepared from the tissue, and the number of culture days performed in the same culture system, but generally 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 7 cells / cm 2 , preferably 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 7 cells / cm 2 , and human B cells, in particular, have a higher proliferation rate when they are cultured at a high density. It may be 4 to 1 ⁇ 10 7 pieces / cm 2 . Within this range, it is possible to prevent a hyperproliferative state after culturing for about 4 days.
  • B cells used in the present invention When B cells used in the present invention generate intracellular signals by stimulation via CD40, BAFF receptor in the presence of IL-21, IL-21 receptor (IL-21R), CD40, And a BAFF receptor (BAFF-R). Stimulation of these molecules is not limited as long as these molecules are recognized from the outside and an intracellular signal is generated inside an IgG positive B cell having CD40 and BAFF receptors.
  • the action means for CD40 and / or BAFF receptor includes one or more of CD40 ligand (CD40L) and / or a structure presenting BAFF, CD40 stimulating factor, or BAFF receptor stimulating factor. Is mentioned.
  • CD40 stimulating factors include anti-CD40 antibodies and secretory CD40L.
  • CD40L is a ligand for CD40, and the amino acid sequence of CD40L is known (for example, Nature, Vol.357, pp.80-82 (1992) and EMBO J., Vol.11, pp.4313- 4321 (1992)).
  • the CD40L sequence may be conserved to such an extent that the binding ability of the active domain involved in the receptor binding ability is not lost.
  • the amino acid sequence homology of 80% or more of the active domain may be present.
  • Such CD40L may be isolated from cells that naturally express, or may be synthesized based on a known amino acid sequence.
  • CD40L should just be a form which can give the signal corresponding to presence of CD40L with respect to B cell in a culture system, and may be a free type or a membrane bound type.
  • the CD40 stimulating factor such as free CD40L may be present in the culture system at a concentration at which B cells can maintain proliferation.
  • a concentration at which B cells can maintain proliferation for example, 10 ng / ml to Although it is 10 ⁇ g / ml, it can be preferably 50 ng / ml to 10 ⁇ g / ml in consideration of the relative decrease accompanying the proliferation of B cells.
  • BAFF receptor stimulating factor examples include anti-BAFF receptor antibodies and secreted BAFF.
  • BAFF B-cell activation factor: belonging-to-the-tumor-necrosis-factor-family
  • BAFF B-cell activation factor: belonging-to-the-tumor-necrosis-factor-family
  • the amino acid sequence of BAFF is already known (for example, J (Exp Med, Vol.189, pp.1747-1756 (1999) and Science, Vol. 285, pp.260-263 (1999) And J Bio Bio Chem, Vol. 274, pp. 15978-15981, (1999)).
  • the BAFF sequence need only be conserved to such an extent that the binding ability of the active domain involved in the receptor binding ability is not lost.
  • BAFF amino acid sequence homology of the active domain.
  • Such BAFF may be isolated from cells that naturally express, or may be synthesized based on a known amino acid sequence. BAFF may be in any form that can give a signal corresponding to the presence of BAFF to IgG-positive B cells in the culture system, and it is membrane-bound even if it is free (ie, secreted). It may be.
  • the BAFF receptor stimulating factor such as free BAFF may be present in the culture system at a concentration at which B cells can maintain proliferation.
  • concentration 10 ng /
  • the concentration can be preferably 50 ng / ml to 10 ⁇ g / ml.
  • the step of culturing B cells in which the expression of the Bach2 gene is elevated in the presence of means for acting on CD40 and / or BAFF receptor may be a step of culturing in the absence of stimulation via FAS, or FAS. It may be a step of culturing in the presence of a stimulus via the. Alternatively, B cells cultured in the absence of stimulation via FAS may be subsequently cultured in the presence of stimulation via FAS. In order to selectively enrich B cells, it is preferable to carry out a step of culturing in the presence of a means for acting on CD40 and / or BABA receptor before culturing in the presence of stimulation via FAS.
  • Fas ligand is a death factor belonging to the TNF family, that is, a cytokine showing apoptosis-inducing activity, and its amino acid sequence is known (for example, Cell, Vol. 75, pp. 1169-1178 (1993)). )reference.
  • the FasL sequence need only be conserved to such an extent that the binding ability of the active domain involved in the receptor binding ability is not lost.
  • the amino acid sequence homology is 80% or more of the active domain.
  • Such FasL may be isolated from a naturally expressed cell or may be synthesized based on a known amino acid sequence.
  • FasL may be in any form that can give a signal corresponding to the presence of Fas to IgG-positive B cells in the culture system, and even if it can generate an intracellular signal, It may be a membrane-bound type. FasL is generally required to be present in the culture system at a concentration capable of inducing apoptosis of B cells. For example, 10 ng / ml to 10 ⁇ g / ml, and a viewpoint of inducing suppression of cell death by antigen stimulation Therefore, the concentration can be preferably 10 ng / ml to 1 ⁇ g / ml.
  • CD40L, BAFF and FasL examples include mammalian primates, ungulates, small mammal rodents, birds and the like, preferably rodents and It is derived from mammals, and humans and mice can be exemplified. Moreover, it may be derived from the same species as the cell population to be presented, or may be derived from a different species.
  • An antibody or antibody fragment against CD40, BAFF receptor (BAFF-R) or Fas can be obtained according to a method known in the art. There is no particular limitation as long as it is an antibody capable of binding to CD40, BAFF receptor (BAFFR) or Fas. These antibodies or antibody fragments may be in the form presented on the surface of the carrier, or in free or solubilized form that is not immobilized on the antibody surface.
  • CD40L, BAFF, or FasL is preferably in the form presented on the surface of the structure from the viewpoint of reliably giving an intracellular signal to B cells in the culture system.
  • the structure is preferably a carrier, feeder cell, extracellular matrix, biological tissue or organ.
  • Carriers used to present each molecule on the surface include artificial lipid bilayer membranes, plastics such as polystyrene or polyethylene terephthalate, collagen, nylon, nitrocellulose, agar, agarose, sepharose and other polysaccharides, paper, glass, etc. As long as it is usually used for presenting the molecule on the surface, it can be mentioned without particular limitation.
  • the shape of the carrier is not particularly limited, and may be any shape such as a sheet shape, a flat plate shape, a spherical shape, a sponge shape, and a fiber shape.
  • the structure is preferably a feeder cell from the viewpoint of reliable cell selectivity.
  • cells that can be used as feeder cells include fibroblasts, epithelial cells (for example, HeLa cells), fetal kidney cells (for example, HEK293), and follicular dendritic cells. Of these, fibroblasts are preferred from the viewpoints of high growth rate, large cell surface area, and easy removal of feeder cells.
  • a feeder cell in which CD40L, BAFF, and optionally FasL is displayed on the cell surface can be prepared by a person skilled in the art using a gene recombination technique based on the known sequences of CD40L, BAFF, and FasL.
  • Examples of the origin of feeder cells include mammalian primates, ungulates, small mammal rodents, birds and the like, preferably those derived from rodents and mammals. Yes, examples include mice and humans.
  • the feeder cells may be cells derived from the same species as the cell population to be presented, or may be cells derived from different species.
  • B cells producing desired IgG may be selected by presenting a specific antigen to IgG-positive B cells.
  • the specific antigen means an antigen having affinity for the target antigen-specific IgG-positive B cell, and is appropriately selected according to the purpose.
  • the type of antigen is not particularly limited as long as it exhibits antigenicity, and examples thereof include nucleic acids such as DNA and RNA, sugar chains, lipids, amino acids, peptides, proteins, haptens, and low molecular compounds. These substances are only required to be presented in a form that can be recognized by B cells, and may be free or carrier-fixed. From the viewpoint of reliable presentation to B cells, the antigen is preferably in a form immobilized on a carrier.
  • the antigen used is known in the art such as a form in which an antigen is added alone, a form in which a known auxiliary molecule is added, and a form in which it binds to an antibody molecule.
  • a form that enhances the antigenicity of may be applied.
  • a scaffold for displaying the antigen on the carrier surface such as an Fc receptor molecule or protein A or protein G may be further used.
  • a protein that binds to a component of the carrier and an antigen protein fusion protein may be used.
  • the gene may be introduced into a cell as a carrier in the form of an expression vector for expression.
  • an expression vector that can be expressed as a fusion protein of an appropriate signal peptide (not required in the case of a secreted protein) and an appropriate transmembrane region (for example, MHC class I) is transferred to a cell as a carrier. It may be introduced and expressed.
  • CD40L, BAFF or FasL, and the antigen are more preferably presented to the feeder cell. It should be noted that CD40L, BAFF, and optionally FasL and an antigen may not necessarily be present on the same feeder cell as long as an intracellular signal can be generated for IgG-positive B cells.
  • B cells with increased expression of the Bach2 gene are cultured in the presence of an action means for CD40 and / or BAFF receptor, in the presence of an action means for IL-21 receptor Incubate.
  • IL-12 or an anti-IL-21 receptor antibody can be used as a means for acting on the IL-21 receptor.
  • IL-21 may be of natural origin or a recombinant obtained by biotechnology. Examples of the origin of IL-21 include mammalian primates, ungulates, small mammal rodents, and birds, as in the cell population described above. Each of these molecules is preferably derived from rodents and mammals, and examples thereof include mice and humans. Further, it may be a molecule derived from the same species as the cell population to be presented, or may be a cell derived from a different species.
  • the concentration of IL-21 and / or anti-IL-21 receptor antibody contained in the medium for culturing B cells may be an amount that allows proliferation of IgG-positive B cells having affinity for a specific antigen, In general, it is preferably 1 ng / ml to 1 ⁇ g / ml, more preferably 100 ng / ml to 1 ⁇ g / ml.
  • the sorting process may vary depending on conditions such as seeding density and cell type, but generally from the viewpoint of reliable sorting, it is generally at least the second half of the start of the sorting process, and may be 1 to 3 days from the viewpoint of reliable sorting. Although it is preferable that the cell viability is maintained, it may be longer as long as the cell viability is maintained. By culturing for a longer period, antigen-specific IgG-positive B cells having higher affinity Can be obtained.
  • the selection step may be repeated while updating the feeder cells. In that case, in order to proliferate IgG positive B cells after each selection step, it is preferable to perform secondary culture described later.
  • the concentration and valence of the antigen may be changed (decreased) each time the process is repeated.
  • the culture supernatant of the previous step or the antibody produced in the culture supernatant may be added to the culture system when performing the next step. As a result, competition between the B cell receptor and the antibody occurs, and B cells having a higher affinity B cell receptor can be selected.
  • B cells in which Bach2 gene expression is elevated are cultured in the presence of a means for acting on CD40 and / or BAFF receptor, in the presence of IL-4 and / or IL-2 May be cultured.
  • the culture system does not contain IL-4.
  • the cell population containing B cells can be stimulated through stimulation with CD40 and BAFF receptors while giving IL- 4 is preferably obtained by a method including culturing in a primary culturing step in the presence of 4 and a secondary culturing step in the presence of IL-21 (culturing step).
  • both primary culture and secondary culture can be performed while applying stimulation via CD40 and BAFF receptors.
  • Stimulation via CD40 and BAFF receptors may be carried out using antibodies against these molecules as in the selection step, or CD40L and BAFF may be used.
  • a carrier having these antibodies or CD40L and BAFF, such as feeder cells may be used.
  • the carrier or feeder cell used in the culturing step may be referred to as a culture carrier or a culture feeder cell, respectively.
  • IL-4 used for primary culture may be naturally derived or may be a recombinant obtained by biotechnology.
  • concentration of IL-4 is preferably 1 ng / ml to 100 ng / ml, more preferably 5 ng / ml to 100 ng / ml, from the viewpoint of effective proliferation of B cells, more preferably 10 ng / ml to 50 ng / ml. More preferably, it is ml.
  • cytokines may be used together with IL-4 depending on the type and origin of the B cell population to be cultured.
  • concentration of IL-2 is preferably 1 unit / ml to 1000 units / ml, more preferably 2.5 units / ml to 1000 units / ml, More preferably, it is 2.5 units / ml to 500 units / ml, and particularly preferably 10 units / ml to 100 units / ml.
  • the seeding density of the cells at the start of primary culture is not particularly limited, but generally varies depending on the origin of the cell population, the state of the cells prepared from the tissue, and the number of days of culture performed in the same culture system. 2 to 1 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , preferably 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 .
  • the primary culture may vary depending on the seeding density, it may generally be 2 to 8 days after the start of the culture from the viewpoint of the proliferation rate of the B cell population, and 3 from the viewpoint of the density of IgG-positive B cells in the cell population.
  • the period is preferably from 6 days to 6 days, and more preferably from 3 days to 5 days.
  • a predetermined amount of IL-21 may be added to the culture system after the primary culture, and the cells are recovered from the culture system after the primary culture to obtain an IL that does not contain IL-4. You may start by transferring to -21 containing media. From the viewpoint of suppressing the growth rate of IgG-positive B cells in the secondary culture and contamination of IgE-positive B cells in the obtained cell population, the secondary culture is performed with a medium containing IL-21 and not containing IL-4. Most preferably.
  • the origins of IL-4 and IL-21 used in the present invention include mammalian primates, ungulates, small mammal rodents, birds and the like, as in the cell population described above.
  • Each of these molecules is preferably derived from rodents and mammals, and examples thereof include mice and humans. Further, it may be a molecule derived from the same species as the cell population to be presented, or may be a cell derived from a different species.
  • cells other than IgG-positive B cells After completion of the secondary culture, it is preferable to remove cells other than IgG-positive B cells in order to reliably increase the target B cell concentration.
  • Examples of cells to be removed include IgE positive B cells, CD138 positive plasma cells, feeder cells (if present), and the like. These cells can be removed by a known technique using an antibody against a specific surface antigen present on the surface.
  • cytokines may be used together with IL-21 depending on the type and origin of the B cell population to be cultured.
  • concentration of IL-2 is preferably 1 unit / ml to 1000 units / ml, and more preferably 2.5 units / ml to 1000 units / ml. Further, it is more preferably 2.5 units / ml to 500 units / ml, and particularly preferably 10 units / ml to 100 units / ml.
  • the method for producing a B cell population of the present invention may be carried out for a period necessary for selecting a target antigen-specific IgG-positive cell, and the number of IgG-positive B cells at the start of the selection process, It can be appropriately changed depending on the type or the state of the feeder cells.
  • the selection step may be performed for 1 day to 2 days.
  • the primary culture is performed for 3 days to 5 days, and the secondary culture is performed for 2 days to 2 days.
  • the selection process may be performed for 1 to 2 days.
  • the production method of the present invention may include a growth step for further growing the sorted antigen-specific IgG positive B cells after the sorting step.
  • This proliferation step may be performed under culture conditions that allow the antigen-specific IgG-positive B cells to proliferate against the specific antigen selected in the selection step. From the viewpoint of efficient proliferation of the selected IgG-positive B cells. Therefore, it is preferable to culture with CD40L and BAFF in the presence of IL-21.
  • the conditions applied in the secondary culture or selection step described above can be applied as they are.
  • the above-mentioned matters can be applied as they are to CD40L and BAFF that are preferably used in the proliferation step.
  • the proliferation step may be continued for a period according to the number of target IgG-positive B cells in the obtained cell population, and can generally be 1 day or more, preferably 3 days or more, but is included in the culture system. What is necessary is just to adjust suitably according to the growth rate and density of a cell population to be.
  • a B cell population produced by the method for producing a B cell population described above is provided.
  • the B cell of the present invention preferably has a Bach2 gene incorporated into a viral vector.
  • the B cell population of the present invention preferably has a high specific growth rate as described herein below.
  • the B cell population of the present invention preferably has a high specific growth rate, but the definition of the specific growth rate by a numerical value defines a preferred embodiment of the B cell population.
  • the B cell population of the present invention is produced by the production method (ie, A method of producing a B cell population comprising a step of culturing B cells with increased expression of the Bach2 gene in the presence of a means for acting on CD40 and / or BAFF receptors.
  • Proliferation of the B cell population of the present invention can be assessed using specific growth rates.
  • m t1 is the number of cells on day t1
  • the preferable range of the specific growth rate will be described for the case where the B cell is a mouse cell and the case where the B cell is a human cell.
  • the specific growth rate on days 9 to 13 after introducing the Bach2 gene into the B cells is preferably 0.6. (1 / day) or more, more preferably 0.8 (1 / day) or more, and particularly preferably 1.0 (1 / day) or more. Also, after introducing the Bach2 gene into B cells, the 9th to 17th day, the 9th to 22nd day, the 9th to 27th day, the 9th to 32nd day, and the 9th to 38th day
  • the specific growth rate in any one or more of the eyes is preferably 0.6 (1 / day) or more.
  • the specific growth rate in any one or more of day 9 to day 17, day 9 to day 22, day 9 to day 27 is preferably 0.6 (1 / day) or more, more preferably Is 0.8 (1 / day) or more.
  • all the specific growth rates on the 9th to 17th day, the 9th to 22nd day, and the 9th to 27th day are preferably 0.6 (1 / day) or more, more preferably 0.8 (1 / day) or more.
  • the specific growth rates on the 9th to 32nd days and on the 9th to 38th days are both 0.6 (1 / day) or more.
  • the specific growth rate at any one or more of the 13th to 17th day, the 17th to 22nd day, and the 22nd to 27th day after introducing the Bach2 gene into the B cell is 0.6 (1 / Day) and the specific growth rate of all of the 13th to 17th, 17th to 22nd, and 22nd to 27th days is 0.6 (1 / day) or more. Is preferred.
  • the specific growth rate at any one or more of the 27th to 32nd days and the 32nd to 38th days after the introduction of the Bach2 gene into B cells is preferably 0.4 (1 / day) or more.
  • the specific growth rates on the 27th to 32nd days and the 32nd to 38th days are preferably 0.4 (1 / day) or more.
  • the upper limit of the specific growth rate for mouse B cells is not particularly limited, but is generally 2.3 (1 / day) or less or 1.6 (1 / day) or less.
  • the specific growth rate on days 12 to 18 after introducing the Bach2 gene into the B cells is preferably 0.1. (1 / day) or more, more preferably 0.13 (1 / day) or more, and particularly preferably 0.15 (1 / day) or more.
  • the specific growth rate in any one or more of the 12th to 24th days and the 12th to 30th days after the introduction of the Bach2 gene into the B cells is preferably 0.1 (1 / day) or more. Yes, more preferably 0.13 (1 / day) or more, and still more preferably 0.15 (1 / day) or more.
  • the specific growth rate in the 12th to 30th days after the introduction of the Bach2 gene into B cells is more preferably 0.15 (1 / day) or more, and particularly preferably 0.2 (1 / day) or more. is there.
  • the specific growth rate on the 12th to 24th days and on the 12th to 30th days is preferably 0.1 (1 / day) or more, and both are 0.15 (1 / day) or more. Are more preferable, and both are more preferably 0.2 (1 / day) or more.
  • the specific growth rate at any one or more of the 18th to 24th days and the 24th to 30th days after the introduction of the Bach2 gene into B cells is preferably 0.15 (1 / day) or more. 0.20 (1 / day) or more is more preferable.
  • the specific growth rates on the 18th to 24th days and the 24th to 30th days are both preferably 0.15 (1 / day) or more, more preferably 0.20 (1 / day) or more. More preferred.
  • the upper limit of the specific growth rate for the human B cells is not particularly limited, but is generally 1.5 (1 / day) or less, or 1.0 (1 / day) or less.
  • the term “antigen-specific IgG-positive B cell population” used for the cells obtained after the above-described sorting step is used in the sense of summarizing the obtained cells. It is not limited to. That is, in addition to being used when referring to a plurality of cells, it is also used when only one cell is present.
  • the antigen-specific IgG-positive B cell population of the present invention is a cell population obtained by the production method described above. In this cell population, it is mainly composed of IgG-positive B cells having specificity for the specific antigen used, for example, than a cell population derived from a spleen tissue derived from a living body in primary contact with the same antigen, The density of IgG positive B cells with specificity for antigen is high. Therefore, this antigen-specific IgG-positive B cell population can be suitably used for the production of monoclonal antibodies that require a large amount of IgG-positive B cells having affinity for a specific antigen, cell therapy, and the like. .
  • mutations may be introduced into antibody molecules to obtain B cells having various antigen specificities.
  • mutation introduction include introduction of mutation into the V region.
  • the affinity for the antigen can be further improved.
  • a method for introducing a mutation into the V region a known method can be applied. From the viewpoint of certainty of mutation introduction, somatic mutation (SHM) of an antibody gene and antibody constant region region gene
  • SHM somatic mutation
  • AID activationAinduced cytidine deaminase
  • CSR class switch recombination
  • a cytokine that enhances the expression of AID may be used.
  • mice B cells in a medium containing mouse IL-4 on feeder cells presenting CD40L and BAFF on the cell surface Culturing mouse B cells in a medium containing mouse IL-4 on feeder cells presenting CD40L and BAFF on the cell surface; Infecting the mouse B cells with a retroviral vector containing a Bach2 gene; and culturing the infected mouse B cells in a medium containing mouse IL-21.
  • a method is provided.
  • a mouse B cell population produced by the method for producing a mouse B cell population described above.
  • a method is provided.
  • the human B cell population manufactured by the manufacturing method of the above-mentioned human B cell population is provided.
  • the method for producing a monoclonal antibody of the present invention includes producing a monoclonal antibody using the cell population obtained by the above-described method for producing a B cell population. Thereby, the monoclonal antibody with respect to a specific antigen can be obtained simply and rapidly.
  • a well-known hybridoma production method may be applied to the antigen-specific B cell population.
  • a hybridoma is obtained from a cell population containing IgG-positive B cells obtained according to the present invention using a cell fusion method using a well-known method such as myeloma cells.
  • the hybridoma producing the antibody to be isolated may be isolated using a limiting dilution method or the like, and the antibody produced by the isolated hybridoma may be recovered.
  • a method may be used in which an antibody gene is isolated from the above antigen-specific B cell population and a monoclonal antibody is produced by gene recombination.
  • Example 1 Long-term culture of mouse B cells (1) Cell culture Unless otherwise stated, culture of B cell preparations and other cells is RPMI-1640 (10% (v / v) FCS, penicillin / streptomycin. Using 2 mM L-glutamine, 55 nM 2-ME, 10 mM HEPES and 1 mM sodium pyruvate) as a B cell culture medium, the reaction was performed under conditions of 5% (v / v) CO 2 and 37 ° C.
  • mice (C57BL / 6, female 8 weeks old) and biotin-anti-mouse CD43 antibody (BD Pharmingen), biotin-anti-mouse CD4 antibody ( Biolegend), biotin-anti-mouse Ter-119 antibody (eBioscience) and biotin-anti-mouse CD11c antibody (eBioscience) were reacted, and CD43, CD4, Ter-119 and CD11c-negative B cells were treated with Streptavidin. -Recovered using Particle Plus-DM and BD IMagnet (BD Bioscience Pharmingen) to obtain mouse B cells.
  • biotin-anti-mouse CD43 antibody Biolegend
  • biotin-anti-mouse Ter-119 antibody eBioscience
  • CD11c antibody eBioscience
  • FIG. 1 shows the cumulative increase rate of the number of cells, where the number of each B cell seeded on day 5 is 1.
  • Specific proliferation on days 5-9, 9-13, 9-17, 9-22, 9-27, 9-32, and 9-38 for each B cell The speed is shown in FIG.
  • the growth rate is shown in FIG.
  • the vertical axis of the graphs in FIGS. 2 and 3 indicates (1 / day), which is a unit of specific growth rate. As shown in FIG.
  • B cells transformed with mock or Bcl2 have a specific growth rate (1 / day) of about 0.2, whereas Bach2 maintains a specific growth rate of 0.4 or more even on days 32-38. Yes.
  • Retrovirus vectors were prepared from these vectors according to a conventional method.
  • FIG. 4 shows the cumulative increase rate of the number of cells when the number of seeded B cells on day 6 is 1.
  • the specific growth rate on days 6-12, 12-18, 12-24, and 12-30 is shown in FIG.
  • the specific growth rate of each B cell on days 6-12, 12-18, 18-24, and 24-30 is shown in FIG.
  • the vertical axes of the graphs of FIGS. 5 and 6 indicate (1 / day), which is a unit of specific growth rate.
  • Example 3 Long-term culture of human B cells using lentiviral vectors (1) Preparation of lentiviral vectors Multiple cloning of CS2-CMV-MCS (Virology. 2009 Oct 25; 393 (2): 198-209.) Human Bach2 (Oncogene. 2000 Aug 3; 19 (33): 3739-49.) Was subcloned in each site.
  • the lentiviral vector was prepared according to the method described in Virology. 2009 Oct 25; 393 (2): 198-209. An empty vector (mock) was obtained that did not subclone human Bach2.

Abstract

　本発明の課題は、特定抗原に対して特異的なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む抗原特異的Ｂ細胞集団を簡便に製造する方法を提供することである。本発明によれば、Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞を、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下において培養する工程を含む、Ｂ細胞集団の製造方法が提供される。

Description

Ｂ細胞集団の製造方法
　本発明は、Ｂ細胞集団の製造方法、上記したＢ細胞集団の製造方法により製造されるＢ細胞集団、及びそれを用いたモノクローナル抗体の製造方法に関する。
　特定の抗原に対して高い選択性を示すモノクローナル抗体は、抗体医薬としての開発が期待され、特に癌細胞を標的とする抗体医薬の開発が進んでいる。モノクローナル抗体を有効成分とする医薬をヒトの治療に適用するには、異種抗原の量が少ないヒトの抗体を投与することが、拒絶反応回避の観点から最も理想的である。このため多くのキメラ抗体やヒト化抗体が開発されている。
　一般にヒト治療用のキメラ抗体やヒト化抗体は、抗原をマウス等に複数回免疫した後に、脾臓やリンパ節の細胞をミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを形成し、ハイブリドーマが産生するマウスＩｇＧ抗体を基に、組換え技術を用いて作製している。しかしながら、マウス等の動物個体を用いることや、高い親和性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択することには時間がかかり、組換え技術により得られた抗体の活性を確認する必要がある。このため、上記の方法では、目的とする抗体の作製に時間がかかる上に、その効果はヒトに投与するまで確定できない。また、免疫抗原が個体毒性を示す場合には個体への免疫は困難である。さらに、動物種間で保存性の高いタンパク抗原を抗原とする場合、免疫学的寛容のために抗体が産生されにくい。
　Ｂ細胞は、骨髄に由来する細胞で表面にＢ細胞レセプター(BCR)をもつ免疫細胞であり、抗体を産生する細胞である。Ｂ細胞は、造血幹細胞から発生し、プロＢ細胞及びプレＢ細胞を経て、Ｂ細胞へと分化する。抗原に対する高い親和性を示す抗体を産生するＢ細胞は胚中心で選択されることが知られているが、この選択の機構は充分には解明されていない。特定の抗原に対して高い親和性を示す抗体を産生するＢ細胞を人為的に増殖させて濃縮することができれば、特定の抗原に対して高い親和性を示すモノクローナル抗体をより短時間で作製できる。
　Ｂ細胞を増殖させる方法として、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）とインターロイキン（ＩＬ）－４等のサイトカインの存在下でＢ細胞を培養する方法が知られている（例えば、特許文献１及び非特許文献１）。
　また、胚中心は、抗原未接触のナイーブＢ細胞が抗原と接触して増殖した結果形成される組織学的構造であり、胚中心のＢ細胞にはクラススイッチや体細胞超突然変異が起こることが知られている。例えば、非特許文献２では、ＢＡＦＦとＣＤ４０Ｌを同時発現させた線維芽細胞の存在下で、ＩＬ－４及び抗μＨｃ抗体と共に脾臓Ｂ細胞を培養すると、殆どのＢ細胞が胚中心様の表現型を示すようになり、その約半数はＩｇＧ１へクラススイッチすること、及びその後にＩＬ－４をＩＬ－２１に切り替えると、ＩｇＥ陽性細胞が増加することが開示されている。
　特許文献２には、特定抗原に特異的なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む抗原特異的Ｂ細胞集団の製造方法であって、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を、ＩＬ－２１の存在下で、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体、Ｆａｓを介した刺激を付与しながら、前記特定抗原と共に培養して前記特定抗原に特異的な抗原特異的Ｂ細胞を選別し、前記特定抗原に特異的なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む抗原特異的Ｂ細胞集団を得ることを含む当該製造方法が記載されている。
　特許文献３には、Ｂ細胞を得る工程、前記細胞中のＢＣＬ－６の発現を増加させる工程、および複製できる環境中に前記細胞を維持する工程を含む、Ｂ細胞系を安定化させる方法が記載されている。
　特許文献４には、抗体産生細胞内におけるBCL6および/またはBlimp-1の発現産物の量に直接的または間接的に影響を与える段階を含む、該抗体産生細胞の安定性に影響を与える方法が記載されている。
　特許文献５には、bach2遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする非ヒト動物が記載されており、当該動物を用いてIgMまたは／およびIgM産生ハイブリドーマを高頻度で作成できることが記載されている。
特表平９－５１２４４１号公報 特開２０１１－９２１４２号公報 特開２００９－１４２２９２号公報 特開２０１３－９９３５８号公報 国際公開ＷＯ２００５／１１０４３３号
J Exp Med. 1992 Vol.176(6): pp.1543-1550 日本免疫学会学術集会記録、２００７年、第３７巻、第２５９頁、３－Ｆ－Ｗ４１－１６－Ｏ／Ｐ
　ナイーブＢ細胞および抗原接触後のＢ細胞に関わらず、特定の抗原に対して高い親和性を示すＩｇＧ抗体を産生可能なＢ細胞のみを高い選択性で且つ短時間に得ることには、未だに至っていない。従って、本発明は、特定抗原に対して特異的なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む抗原特異的Ｂ細胞集団を簡便に製造する方法を提供することを解決すべき課題とする。さらに本発明は、上記したＢ細胞集団の製造方法により製造されるＢ細胞集団、及び上記したＢ細胞集団の製造方法を使用してモノクローナル抗体を製造する方法を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入することによってＢａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞を、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下において培養することによって、Ｂ細胞集団を高い増殖速度で長期間培養できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］　Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞を、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下において培養する工程を含む、Ｂ細胞集団の製造方法。
［２］　Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞が、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入することによって得られる細胞である、［１］　に記載のＢ細胞集団の製造方法。
［３］　Ｂａｃｈ２遺伝子が、下記（ａ）～（ｄ）の何れかの遺伝子である、［２］に記載のＢ細胞集団の製造方法。
（ａ）配列番号１及び／又は配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号１及び／又は配列番号２に示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子であって、Ｂａｃｈ２遺伝子と同等の機能を有する遺伝子；
（ｃ）配列番号１及び／又は配列番号２に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子であって、Ｂａｃｈ２遺伝子と同等の機能を有する遺伝子；又は
（ｄ）配列番号１及び／又は配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、Ｂａｃｈ２遺伝子と同等の機能を有する遺伝子。
［４］　ウイルスベクターを用いてＢ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入する、［２］又は［３］　に記載のＢ細胞集団の製造方法。
［５］　前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである、［４］に記載のＢ細胞集団の製造方法。
［６Ａ］　Ｂ細胞がマウス細胞であり、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後９日目～１３日目における比増殖速度が０．６（１／日）以上である、［１］から［５］の何れかに記載のＢ細胞集団の製造方法。
［７Ａ］　Ｂ細胞がマウス細胞であり、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後９日目～１７日目、９日目～２２日目、９日目～２７日目、９日目～３２日目、及び９日目～３８日目の何れか１以上における比増殖速度が０．６（１／日）以上である、［６Ａ］に記載のＢ細胞集団の製造方法。
［８Ａ］　Ｂ細胞がマウス細胞であり、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後１３日目～１７日目、１７日目～２２日目、及び２２日目～２７日目の何れか１以上における比増殖速度が０．６（１／日）以上であり、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後２７日目～３２日目、及び３２日目～３８日目の何れか１以上における比増殖速度が０．４（１／日）以上である、［６Ａ］又は［７Ａ］に記載のＢ細胞集団の製造方法。
［６Ｂ］　Ｂ細胞がヒト細胞であり、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後１２日目～１８日目における比増殖速度が０．１（１／日）以上である、［１］から［５］の何れかに記載のＢ細胞集団の製造方法。
［７Ｂ］　Ｂ細胞がヒト細胞であり、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後１２日目～２４日目、及び１２日目～３０日目の何れか１以上における比増殖速度が０．２（１／日）以上である、［６Ｂ］に記載のＢ細胞集団の製造方法。
［８Ｂ］　Ｂ細胞がヒト細胞であり、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後１８日目～２４日目及び２４日目～３０日目の何れか１以上における比増殖速度が０．１５（１／日）以上である、［６Ｂ］又は［７Ｂ］に記載のＢ細胞集団の製造方法。
［９］　前記ＣＤ４０及び／又はＢＡＦＦ受容体に対する作用手段が、ＣＤ４０Ｌ及び／又はＢＡＦＦを提示した構造物、ＣＤ４０の刺激因子、又はＢＡＦＦ受容体の刺激因子の何れかで１以上である、［１］から［８］の何れかに記載のＢ細胞集団の製造方法。
［１０］　前記構造物が、担体、フィーダー細胞、細胞外マトリックス、生体組織または臓器の何れかである、［９］に記載のＢ細胞集団の製造方法。
［１１］　前記のＣＤ４０の刺激因子又はＢＡＦＦ受容体の刺激因子が、抗ＣＤ４０抗体、分泌型ＣＤ４０Ｌ、抗ＢＡＦＦ受容体抗体、又は分泌型ＢＡＦＦのいずれかである、［９］又は［１０］に記載のＢ細胞集団の製造方法。
［１２］　Ｂ細胞を培養する培地中に含まれるＣＤ４０の刺激因子の濃度が１０ｎｇ／ｍL以上である、［９］から［１１］の何れかに記載のＢ細胞集団の製造方法。
［１３］　Ｂ細胞を培養する培地中に含まれるＢＡＦＦ受容体の刺激因子の濃度が１０ｎｇ／ｍL以上である、［９］から［１２］の何れかに記載のＢ細胞集団の製造方法。
［１４］　Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞を、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下において培養する工程が、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段及びＩＬ－２１受容体に対する作用手段の存在下においてＢ細胞を培養する工程である、［１］から［１３］の何れかに記載のＢ細胞集団の製造方法。
［１５］　Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞を、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下において培養する工程が、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段、ＩＬ－２１受容体に対する作用手段、並びにＩＬ－４及び／又はＩＬ－２の存在下においてＢ細胞を培養する工程である、［１］から［１３］の何れかに記載のＢ細胞集団の製造方法。
［１６］　ＩＬ－２１受容体に対する作用手段が、ＩＬ－２１及び／又は抗ＩＬ－２１受容体抗体である、［１４］又は［１５］に記載のＢ細胞集団の製造方法。
［１７］　Ｂ細胞を培養する培地中に含まれるＩＬ－２１及び／又は抗ＩＬ－２１受容体抗体の濃度が１ ｎｇ／ｍL以上である、［１６］に記載のＢ細胞集団の製造方法。
［１８］　Ｂ細胞を培養する培地中に含まれるＩＬ－４の濃度が５ｎｇ／ｍL以上である［１５］に記載のＢ細胞集団の製造方法。
［１９］　Ｂ細胞を培養する培地中に含まれるＩＬ－２の濃度が２．５Ｕ／ｍL以上である、［１５］又は［１８］に記載の製造方法。
［２０］　Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入する前に、Ｂ細胞を、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下、かつＩＬ－４あるいはＩＬ－４及びＩＬ－２の存在下で培養する、［２］から［５］の何れかに記載のＢ細胞集団の製造方法。
［２１］　Ｂ細胞を培養する培地中に含まれるＩＬ－４の濃度が５ｎｇ／ｍL以上である［２０］に記載のＢ細胞集団の製造方法。
［２２］　Ｂ細胞を培養する培地中に含まれるＩＬ－２の濃度が２．５Ｕ／ｍL以上である、［２０］又は［２１］に記載の製造方法。
［２３］　Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞を、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下において培養する工程が、ＦＡＳを介した刺激の非存在下において培養する工程である、［１］から［２２］の何れかに記載のＢ細胞集団の製造方法。
［２４］　ＦＡＳを介した刺激の非存在下において培養した前記Ｂ細胞を、ＦＡＳを介した刺激の存在下において培養する工程をさらに含む、［２３］に記載のＢ細胞集団の製造方法。
［２５］　［１］から［２４］のいずれかに記載の製造方法により製造されるＢ細胞集団。
［２６］　Ｂ細胞が、ウイルスベクターに組み込まれたＢａｃｈ２遺伝子を有する、［２５］に記載のＢ細胞集団。
［２７］　Ｂ細胞がマウス細胞であり、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後９日目～１３日目における比増殖速度が０．６（１／日）以上である、［２５］又は［２６］に記載のＢ細胞集団。
［２８］　Ｂ細胞がヒト細胞であり、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後１２日目～１８日目における比増殖速度が０．１（１／日）以上である、［２５］又は［２６］に記載のＢ細胞集団。
［２９］　［１］から［２４］のいずれかに記載の製造方法により製造されたＢ細胞集団を使用する、モノクローナル抗体の製造方法。
　本発明によれば、特定抗原に対して特異的なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む抗原特異的Ｂ細胞集団を簡便に製造することができる。
図１は、レトロウイルスベクターを用いたマウスＢ細胞の長期培養におけるＢ細胞の５日目を１とした累積増加率を示す。 図２は、レトロウイルスベクターを用いたマウスＢ細胞の長期培養におけるＢ細胞の９日目以降の比増殖速度を示す。 図３は、レトロウイルスベクターを用いたマウスＢ細胞の長期培養におけるＢ細胞の期間毎の比増殖速度を示す。 図４は、レトロウイルスベクターを用いたヒトＢ細胞の長期培養におけるＢ細胞の６日目を１とした累積増加率を示す。 図５は、レトロウイルスベクターを用いたヒトＢ細胞の長期培養におけるＢ細胞の１２日目以降の比増殖速度を示す。 図６は、レトロウイルスベクターを用いたヒトＢ細胞の長期培養におけるＢ細胞の期間毎の比増殖速度を示す。
　以下、本発明について更に詳細に説明する。
　本発明のＢ細胞集団の製造方法は、Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞を、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下において培養する工程を含む方法である。
　Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞は、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入することによって得られる細胞、またはＢ細胞が元々有しているＢａｃｈ２遺伝子の発現量又は存在量を増大させることにより得られる細胞の何れでもよい。
　Ｂ細胞が元々有しているＢａｃｈ２遺伝子の発現量又は存在量を増大させる手法としては、Menin遺伝子（Nature Communications, 5:3555, DOI:10:1038.ncomms4555）をＢ細胞に導入する方法、レプトマイシンＢ（ＬＭＢ）の添加によりＢａｃｈ２の核外輸送を阻害して核に局在化させる方法、またはＢａｃｈ２のユビキチン化とプロテアソ－ムによる分解の阻害剤を添加する方法などが挙げられるが、特に限定されない。
　Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入する場合におけるＢａｃｈ２遺伝子としては、下記（ａ）～（ｄ）の何れかの遺伝子であることが好ましい。
（ａ）配列番号１及び／又は配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号１及び／又は配列番号２に示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子であって、Ｂａｃｈ２遺伝子と同等の機能を有する遺伝子；
（ｃ）配列番号１及び／又は配列番号２に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子であって、Ｂａｃｈ２遺伝子と同等の機能を有する遺伝子；又は
（ｄ）配列番号１及び／又は配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、Ｂａｃｈ２遺伝子と同等の機能を有する遺伝子。
　配列番号１に示すアミノ酸配列は、マウスＢａｃｈ２のアミノ酸配列であり、配列番号２に示すアミノ酸配列は、ヒトＢａｃｈ２のアミノ酸配列である。
　配列番号１及び／又は配列番号２に示すアミノ酸配列との配列同一性は、９０％以上が好ましいが、９３％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９８％以上が特に好ましい。アミノ酸配列の配列同一性は、配列番号１及び／又は配列番号２に示すアミノ酸配列と評価したいアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除して、さらに１００を乗じた値で表される。
　配列番号１及び／又は配列番号２に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９８９）」等に記載の公知の方法に準じて調製することができる。
　本明細書において、Ｂａｃｈ２遺伝子と同等の機能を有するとは、配列番号１及び／又は配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子と同等の機能を有することを意味し、例えば、Ｂ細胞に導入した場合に、同等の細胞増殖機能を発揮することなどを意味する。また、Ｂａｃｈ２遺伝子の機能の一つとしては、Ｂａｃｈ２遺伝子の発現産物が、Blimp1遺伝子のプロモーター上流のMARE(Maf-recognition element)と第5イントロン中のIRF結合配列に結合して、Blimp1遺伝子の転写を抑制することが知られている。Ｂａｃｈ２遺伝子と同等の機能を有するとは、Ｂａｃｈ２遺伝子の場合と同様に、Blimp1遺伝子の転写を抑制する機能を有するものでもよい。
　欠失、挿入、置換および／または付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。
（第１群：中性非極性アミノ酸）Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｍｅｔ，Ｃｙｓ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ
（第２群：中性極性アミノ酸）Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ
（第３群：酸性アミノ酸）Ｇｌｕ，Ａｓｐ
（第４群：塩基性アミノ酸）Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ。
　前記の複数個のアミノ酸とは、例えば、６０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらにより好ましくは５個、４個、３個、特に好ましくは２個以下のアミノ酸を意味する。
　配列番号１及び／又は配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子とは、配列番号１及び／又は配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡまたはその一部をプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。
　ハイブリダイゼーションは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）」等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡを挙げることができる。好ましくは６５℃で１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、さらに好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、最も好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。
　以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、ハイブリダイゼーション条件はこれらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
　Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入するためには、Ｂａｃｈ２遺伝子を有する組み換えベクターを構築し、この組み換えベクターをＢ細胞に導入すればよい。ベクターとしては、ウイルスベクター、プラスミドベクター、またはリポソームベクター（例えば、カチオニックリポソームベクター）等が挙げられる。ウイルスベクターの具体例としては、レトロウイルスベクター（例えば、ＨＩＶベクターなどのレンチウイルスベクター）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、バキュロウイルスベクター等が挙げられる。ベクターは、好ましくは、ウイルスベクターであり、さらに好ましくは、レトロウイルスベクター（例えば、ＨＩＶベクターなどのレンチウイルスベクター）、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターであり、特に好ましくはレトロウイルスベクター（例えば、ＨＩＶベクターなどのレンチウイルスベクター）である。
　ベクターには、Ｂａｃｈ２遺伝子以外に、Ｂａｃｈ２遺伝子の発現を制御する配列（例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列、エンハンサー配列）や宿主細胞を選択するための遺伝子マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子）等を含んでいてもよい。ベクターの構築方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
　Ｂａｃｈ２遺伝子を含むベクターのＢ細胞への導入方法としては、例えば、ウイルスベクターの場合には感染により行うことができ、プラスミドベクターの場合にはエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、又はリポフェクション法等が挙げられる。
　Ｂａｃｈ２遺伝子の発現の上昇のレベルについては本発明の効果が得られる限り特に限定されないが、元々のＢ細胞と比べて、Ｂａｃｈ２遺伝子の発現量が１．５倍以上であることが好ましく、２倍以上であることがさらに好ましい。
　本発明に用いられるＢ細胞は、好ましくはＩｇＧ陽性Ｂ細胞、即ち、表面にＩｇＧを有するＢ細胞である。ＩｇＧ陽性Ｂ細胞は、Ｂ細胞を含有する細胞集団からＩｇＧ抗体の有無に基づいて得ることができる。
　本発明に用いられるＢ細胞を含有する細胞集団は、一般には末梢血細胞、骨髄細胞又はリンパ系臓器、例えば脾臓細胞などに由来する細胞集団であればよく、特に限定されない。またＩｇＧ陽性Ｂ細胞としては、抗原未反応のナイーブＢ細胞であっても、抗原接触後のＢ細胞であってもよい。ここで本明細書における「ナイーブＢ細胞」とは、抗原と未反応の成熟Ｂ細胞を一般に指し、ＣＸＣＲ５陽性且つＣＤ４０陽性の表面抗原を示す細胞が該当する。また、本発明に用いられる細胞集団は、ＩＬ－２１受容体（ＩＬ－２１Ｒ）、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ－Ｒ）を有するものが好ましく、またＦａｓを有することも好ましく、さらに抗原を認識可能なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含むものが好ましい。本発明の目的を妨げない範囲で分化段階における他のステージのＢ細胞や多種の細胞が含まれていてもよい。培養による選択の効率の観点から、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞以外のＢ細胞、例えば、ＩｇＥ陽性細胞、ＣＤ１３８陽性（プラズマ）細胞や、Ｂ細胞以外の細胞、例えば、Ｔ細胞、単球、ＮＫ細胞を除去することが好ましい。
　本発明において細胞集団は、免疫系が確立された生物由来の細胞集団であればよく、哺乳動物の霊長類、例えばヒト、サルなど、有蹄類、例えばブタ、ウシ、ウマなど、小型哺乳類の齧歯類、例えばマウス、ラット、ウサギなど、鳥類、例えはニワトリ、ウズラなどが含まれる。本細胞集団の由来としては、齧歯類及び霊長類であることが好ましく、マウス、ヒトを例示することができる。脾臓等の生体組織から細胞集団を調製する方法は、通常のＢ細胞集団を調製する条件をそのまま適用すればよい。また、生体由来の細胞集団に限定されず、確立されたＢ細胞株であってもよい。
　Ｂ細胞を含む細胞集団の培養は、通常、Ｂ細胞の培養に用いられる培地による通常の培養条件であればよい。このような培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）や、ＲＰＭＩ１６４０などを挙げることができる。これらの培地に対しては、通常、血清、各種ビタミン、各種抗生物質等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。　培養温度などの培養条件は、一般的なＢ細胞に対して用いられる培養条件をそのまま適用することができ、例えば、３７℃５％ＣＯ2の条件が挙げられる。　細胞集団の培地への播種密度は、細胞集団の由来や組織から調製した細胞の状態、また同一培養系内で行う培養日数によって異なるが、一般に、１×１０2個～１×１０7個／ｃｍ2、好ましくは１×１０3個～１×１０7個／ｃｍ2とすればよく、特にヒトＢ細胞は高密度で培養を開始した方が増殖率が良いことから、好ましくは１×１０4個～１×１０7個／ｃｍ2とすればよい。この範囲内であれば、４日間程度の培養後に、過増殖状態になることを予防できる。
　本発明に用いられるＢ細胞は、ＩＬ－２１の存在下で、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体を介した刺激により細胞内シグナルを生じさせる場合には、ＩＬ－２１受容体（ＩＬ－２１Ｒ）、ＣＤ４０、及びＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ－Ｒ）を有することが好ましい。これらの分子に対する刺激は、これらの分子を外部から認識してＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を有するＩｇＧ陽性Ｂ細胞の内部に細胞内シグナルを生じさせるものであれば制限はない。
　本発明においてＣＤ４０及び／又はＢＡＦＦ受容体に対する作用手段としては、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）及び／又はＢＡＦＦを提示した構造物、ＣＤ４０の刺激因子、又はＢＡＦＦ受容体の刺激因子の何れかで１以上などが挙げられる。
　ＣＤ４０の刺激因子としては、抗ＣＤ４０抗体、又は分泌型ＣＤ４０Ｌなどが挙げられる。ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０に対するリガンドであり、ＣＤ４０Ｌのアミノ酸配列は公知となっている（例えば、Nature, Vol.357, pp.80-82 (1992)及び、EMBO J., Vol.11, pp.4313-4321 (1992)参照）。本発明では、ＣＤ４０Ｌの配列のうち、受容体結合能に関与する活性ドメインの結合能が失われない程度に保存されていればよく、例えば、活性ドメインの８０％以上のアミノ酸配列相同性があれば、本発明において利用可能である。このようなＣＤ４０Ｌは、自然に発現する細胞から単離したものであってもよく、既知のアミノ酸配列に基づいて合成したものであってもよい。また、ＣＤ４０Ｌは、培養系中のＢ細胞に対してＣＤ４０Ｌの存在に対応したシグナルを与えることができる形態であればよく、遊離型であっても、膜結合型であってもよい。
　遊離型ＣＤ４０ＬなどのＣＤ４０の刺激因子は、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む細胞集団を形成するためには、Ｂ細胞が増殖を維持可能な濃度で培養系に存在すればよく、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌだが、Ｂ細胞の増殖に伴う相対的な減少を考慮して好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌとすることができる。
　ＢＡＦＦ受容体の刺激因子としては、抗ＢＡＦＦ受容体抗体、又は分泌型ＢＡＦＦなどが挙げられる。
　ＢＡＦＦ（Ｂ細胞活性化因子：B cell activation factor belonging to the tumor necrosis factor family）は、ＴＮＦ類縁分子であって抗原と反応したＢ細胞の増殖、分化等に関与していることが知られている分子であり、ＢＡＦＦのアミノ酸配列は既に公知となっている（例えば、J Exp Med, Vol.189, pp.1747-1756 (1999)及び、Science, Vol. 285, pp.260-263 (1999)及び、J Bio Chem, Vol.274, pp.15978-15981, (1999)）。本発明では、ＢＡＦＦの配列のうち、受容体結合能に関与する活性ドメインの結合能が失われない程度に保存されていればよく、例えば、活性ドメインの８０％以上のアミノ酸配列相同性があれば、本発明において利用可能である。このようなＢＡＦＦは、自然に発現する細胞から単離したものであってもよく、既知のアミノ酸配列に基づいて合成したものであってもよい。また、ＢＡＦＦは、培養系中のＩｇＧ陽性Ｂ細胞に対してＢＡＦＦの存在に対応したシグナルを与えることができる形態であればよく、遊離型（即ち、分泌型）であっても、膜結合型であってもよい。
　遊離型ＢＡＦＦなどのＢＡＦＦ受容体の刺激因子は、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む細胞集団を形成するためには、Ｂ細胞が増殖を維持可能な濃度で培養系に存在すればよく、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、高濃度であればより生存支持活性が期待できるとの観点から好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ濃度とすることができる。
　Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞を、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下において培養する工程は、ＦＡＳを介した刺激の非存在下において培養する工程でもよいし、ＦＡＳを介した刺激の存在下において培養する工程でもよい。また、ＦＡＳを介した刺激の非存在下において培養したＢ細胞を、その後に、ＦＡＳを介した刺激の存在下において培養してもよい。Ｂ細胞を選択濃縮するためには、ＦＡＳを介した刺激の存在下において培養する前に、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下において培養する工程を行うことが好ましい。
　Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）は、ＴＮＦファミリーに属するデス因子、即ちアポトーシス誘導活性を示すサイトカインであり、そのアミノ酸配列は公知となっている（例えば、Cell, Vol.75, pp.1169-1178 (1993)）参照。本発明では、ＦａｓＬの配列のうち、受容体結合能に関与する活性ドメインの結合能が失われない程度に保存されていればよく、例えば、活性ドメインの８０％以上のアミノ酸配列相同性があれば、本発明において利用可能である。このようなＦａｓＬは、自然に発現する細胞から単離したものであってもよく、既知のアミノ酸配列に基づいて合成したものであってもよい。また、ＦａｓＬは、培養系中のＩｇＧ陽性Ｂ細胞に対してＦａｓの存在に対応したシグナルを与えることができる形態であればよく、細胞内シグナルを生じさせることができれば遊離型であっても、膜結合型であってもよい。　ＦａｓＬは、一般的にＢ細胞に対してアポトーシスを誘導可能な濃度で培養系に存在していればよく、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、また抗原刺激による細胞死の抑制を誘導する観点から、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌの濃度とすることができる。
　なお、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及びＦａｓＬの由来としては、上述した細胞集団と同様に、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、ヒト、マウスを例示することができる。また、提示対象となる上記細胞集団と同一の種に由来するものであってもよく、異なる種に由来するものであってもよい。
　ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ－Ｒ）又はＦａｓに対する抗体又は抗体断片は、当業界で既知の方法に従って得ることができる。ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦＲ）又はＦａｓに対して結合能を有する抗体であれば、特に制限はない。これらの抗体又は抗体断片は、担体の表面に提示された形態であっても、抗体表面に固定化されていない遊離型又は可溶化形態であってもよい。
　ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ又はＦａｓＬは、培養系中のＢ細胞に対して確実に細胞内シグナルを与える観点から、構造物の表面に提示された形態であることが好ましい。構造物としては、担体、フィーダー細胞、細胞外マトリックス、生体組織または臓器の何れかであることが好ましい。各分子を表面に提示するために用いられる担体としては、人工脂質二重膜、ポリスチレン若しくはポリエチレンテレフタレートなどのプラスチック、コラーゲン、ナイロン、ニトロセルロース、寒天、アガロース、セファロースなどの多糖、紙、ガラスなどを、上記分子を表面に提示するために通常用いられるものであれば、特に制限されることなく挙げることができる。担体の形状には特に限定はなく、シート状、平板状、球状、スポンジ状、繊維状などのいずれの形状としてもよい。構造物としては、細胞の確実な選択性の観点から、フィーダー細胞であることが好ましい。フィーダー細胞として使用可能な細胞としては、線維芽細胞、上皮細胞（例えばＨｅＬａ細胞）、胎児腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３など）、濾胞樹状細胞などを挙げることができる。なかでも、増殖速度が速く、細胞表面積が大きい、フィーダー細胞の除去が簡便であるとの観点から、線維芽細胞が好ましい。
　ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、及び所望によりＦａｓＬを細胞表面に提示されたフィーダー細胞は、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、及びＦａｓＬの既知の配列に基づいて、当業者であれば遺伝子組み換え技術等を用いて作製することができる。　フィーダー細胞の由来としては、上述した細胞集団と同様に、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、マウス、ヒトなどを例示することができる。また、フィーダー細胞は、提示対象となる上記細胞集団と同一の種に由来する細胞であってもよく、異なる種に由来する細胞であってもよい。
　本発明においては、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞に対して、特定抗原を提示することにより、所望のＩｇＧを産生するＢ細胞を選別してもよい。特定抗原とは、目的とする抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞が親和性を示す抗原を意味し、目的に応じて適宜選択される。抗原の種類としては、抗原性を示すものであれば特に制限はなく、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、糖鎖、脂質、アミノ酸、ペプチド、タンパク、ハプテン、低分子化合物などを挙げることができる。これらの物質は、Ｂ細胞が認識できる形態で提示されていればよく、遊離型であっても担体固定型であってもよい。Ｂ細胞への確実な提示の観点から、抗原は、担体に固定された形態であることが好ましい。
　ＩｇＧ陽性Ｂ細胞による抗原認識性を高めるために、用いられる抗原には、抗原単独で用いられる形態の他に、既知の補助分子を付加した形態、抗体分子との結合形態など、当業界で既知の抗原性を高める形態を適用してもよい。
　抗原の提示に抗体分子との結合形態を適用した場合あるいはタンパク抗原と抗体Ｆｃ領域との融合タンパクを適用した場合には、担体表面に抗原を展示させるための足場、例えばＦｃレセプター分子又は、プロテインＡまたはプロテインＧなどを更に用いればよい。また担体の構成成分に対して結合するタンパク質と、抗原蛋白の融合タンパク質を用いてもよい。また、抗原として膜型タンパク質を提示する場合はその遺伝子を発現ベクターの形で担体としての細胞に導入して発現させてもよい。それ以外のタンパクの場合は適当なシグナルペプチド（分泌タンパクの場合は不要）と適当な膜貫通領域（例えばＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩのもの）との融合タンパクとして発現させることのできる発現ベクターを担体としての細胞に導入して発現させてもよい。
　目的とする抗原特異的Ｂ細胞の選択効率の観点から、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ又はＦａｓＬと、抗原とは、フィーダー細胞に提示されていることが更に好ましい。なお、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、そして所望によりＦａｓＬ及び抗原は、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞に対して細胞内シグナルを生じさせることができれば、必ずしも同一のフィーダー細胞上に存在していなくてもよい。
　本発明において好ましくは、Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞を、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下において培養する際に、ＩＬ－２１受容体に対する作用手段の存在下において培養を行う。
　ＩＬ－２１受容体に対する作用手段としては、ＩＬ－１２または抗ＩＬ－２１受容体抗体を使用することができる。
　ＩＬ－２１は、天然由来のものであってもよく、生物工学的に得られた組換え体のものであってもよい。ＩＬ－２１の由来としては、上述した細胞集団と同様に、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられる。これらの分子はそれぞれ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、例えばマウス、ヒトなどを挙げることができる。また、提示対象となる上記細胞集団と同一の種に由来する分子であってもよく、異なる種に由来する細胞であってもよい。
　Ｂ細胞を培養する培地中に含まれるＩＬ－２１及び／又は抗ＩＬ－２１受容体抗体の濃度は、特定抗原に対して親和性を有するＩｇＧ陽性Ｂ細胞を増殖可能な量であればよく、一般に、１ｎｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌとすることが好ましく、１００ｎｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌとすることが更に好ましい。
　選別工程は、播種密度及び細胞種などの条件によって異なる場合もあるが、確実な選別の観点から一般に選別工程開始後半日以上とし、確実な選別の観点から１日～３日としてもよく、１日～２日とすることが好ましいが、細胞の生存能が維持されれば、より長期であってもよく、より長期に培養することによって、より高い親和性を有する抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を得ることができる。
　また、Ｂ細胞の抗原に対する親和性を向上させるために、選別工程はフィーダー細胞を更新しながら、繰り返し行ってもよい。その場合、各選別工程の後にＩｇＧ陽性Ｂ細胞を増殖させるために、後述する二次培養を行うことが好ましい。Ｂ細胞の抗原に対する親和性を向上させるために、工程を繰り返す毎に抗原の濃度や価数を変化（減少）させてもよい。さらに、Ｂ細胞の抗原に対する親和性を向上させるために、直前の工程の培養上澄、または培養上澄中に産生された抗体を次の工程を行う際に培養系へ加えてもよい。これにより、Ｂ細胞受容体と抗体との競合が生じて、より高い親和性のＢ細胞受容体をもつＢ細胞が選別され得る。
　本発明において好ましくは、Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞を、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下において培養する際に、ＩＬ－４及び／又はＩＬ－２の存在下において培養してもよい。但し、得られる細胞集団におけるＩｇＧ陽性Ｂ細胞の割合の観点から、培養系にはＩＬ－４が含まれていない方が好ましい。
　本発明におけるＩＬ－２１受容体（ＩＬ－２１Ｒ）、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ－Ｒ）を有するＩｇＧ陽性Ｂ細胞は、これらの分子の存在を、例えば抗体等を用いたときの反応性等に基づいて得てもよいが、調製時間及び目的とするＩｇＧ陽性Ｂ細胞の細胞密度の観点から、Ｂ細胞を含む細胞集団を、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら、ＩＬ－４の存在下で培養する一次培養工程及びＩＬ－２１の存在下で培養する二次培養工程により培養すること（培養工程）を含む方法によって得たものであることが好ましい。
　上記培養工程では、一次培養及び二次培養とも、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら行うことができる。ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激としては、選別工程と同様に、これらの分子に対する抗体を用いて行ってもよく、ＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦを用いてもよい。またこれらの抗体及び分子からの刺激を確実に培養対象となる細胞集団に対して付与する観点から、これらの抗体またはＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦを有する担体、例えばフィーダー細胞等を用いてもよい。ＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦと、担体等については、選別工程において記載した事項をそのまま適用することができる。培養工程で用いられる担体又はフィーダー細胞については、それぞれ培養用担体または培養用フィーダー細胞とよぶことがある。
　一次培養に用いられるＩＬ－４は、天然由来のものであってもよく、生物工学的に得られた組換え体のものであってもよい。ＩＬ－４の濃度は、Ｂ細胞の効果的な増殖の観点から１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌとすることが好ましく、５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌとすることがより好ましく、１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌとすることがさらに好ましい。
　また一次培養では、培養対象となるＢ細胞集団の種類や由来に応じて、ＩＬ－４とともに他のサイトカインも使用してもよい。例えばＩＬ－２をＩＬ－４と併用する場合には、ＩＬ－２の濃度は１ｕｎｉｔ／ｍｌ～１０００ｕｎｉｔ／ｍｌであることが好ましく、２．５ｕｎｉｔ／ｍｌ～１０００ｕｎｉｔ／ｍｌであることがより好ましく、２．５ｕｎｉｔ／ｍｌ～５００ｕｎｉｔ／ｍｌであることがさらに好ましく、１０ｕｎｉｔ／ｍｌ～１００ｕｎｉｔ／ｍｌであることが特に好ましい。
　一次培養を開始するときの細胞の播種密度は、特に制限はないが、細胞集団の由来や組織から調製した細胞の状態、また同一培養系内で行う培養日数によって異なるが、一般に、１×１０2個～１×１０6個／ｃｍ2、好ましくは１×１０3個～１×１０6個／ｃｍ2とすればよい。　また一次培養は、播種密度によって異なる場合もあるが、Ｂ細胞集団の増殖速度の観点から一般に培養開始後２日～８日としてもよく、細胞集団中のＩｇＧ陽性Ｂ細胞の密度の観点から３日～６日とすることが好ましく、３日～５日とすることがより好ましい。
　二次培養を開始する際には、一次培養後の培養系に所定量のＩＬ－２１を添加してもよく、一次培養後の培養系から細胞を回収して、ＩＬ－４を含まないＩＬ－２１含有培地に移して開始してもよい。二次培養におけるＩｇＧ陽性Ｂ細胞の増殖速度及び得られた細胞集団中におけるＩｇＥ陽性Ｂ細胞の混入を抑制する観点から、ＩＬ－２１を含有し且つＩＬ－４を含まない培地により二次培養を行うことが最も好ましい。
　なお、本発明で用いられるＩＬ－４及びＩＬ－２１の由来としては、上述した細胞集団と同様に、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられる。これらの分子はそれぞれ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、マウス、ヒトなどを例示することができる。また、提示対象となる上記細胞集団と同一の種に由来する分子であってもよく、異なる種に由来する細胞であってもよい。
　二次培養終了後には、目的とするＢ細胞の濃度を確実に高めるために、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞以外の細胞を除去することが好ましい。除去対象となる細胞としては、ＩｇＥ陽性Ｂ細胞、ＣＤ１３８陽性の形質細胞、フィーダー細胞（存在する場合）などを挙げることができる。これらの細胞は、表面に存在する固有の表面抗原に対する抗体等を用いた既知の技術で除去することができる。
　また二次培養では、培養対象となるＢ細胞集団の種類や由来に応じて、ＩＬ－２１とともに他のサイトカインも使用してもよい。例えば、ＩＬ－２をＩＬ－２１と併用する場合には、ＩＬ－２の濃度は１ｕｎｉｔ／ｍｌ～１０００ｕｎｉｔ／ｍｌであることが好ましく、２．５ｕｎｉｔ／ｍｌ～１０００ｕｎｉｔ／ｍｌであることがより好ましく、２．５ｕｎｉｔ／ｍｌ～５００ｕｎｉｔ／ｍｌであることがさらに好ましく、１０ｕｎｉｔ／ｍｌ～１００ｕｎｉｔ／ｍｌであることが特に好ましい。
　本発明のＢ細胞集団の製造方法では、目的とする抗原特異的ＩｇＧ陽性細胞を選別するために必要な期間行えばよく、選別工程を開始するときのＩｇＧ陽性Ｂ細胞の数、用いられる抗原の種類又はフィーダー細胞の状態などによって適宜変更することができる。例えば、効率よく目的とする細胞集団を得るために、選別工程を１日～２日間としてもよく、培養工程を含む場合には、一次培養を３日～５日間、二次培養を２日～５日間とし、選別工程を１日～２日間としてもよい。
　本発明の製造方法では、選別工程の後に、選別された抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を更に増殖させるための増殖工程を含んでもよい。この増殖工程は、選別工程で選別された特定抗原に対して抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を増殖させることができる培養条件で行えばよいが、選別されたＩｇＧ陽性Ｂ細胞の効率よい増殖の観点から、ＩＬ－２１の存在下で、ＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦと共に培養するものであることが好ましい。増殖工程で好ましく用いられるＩＬ－２１については、前述した二次培養又は選別工程で適用した条件をそのまま適用することができる。また、増殖工程に好ましく用いられるＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦについても、前述した事項をそのまま適用することができる。
　増殖工程は、得られた細胞集団中の目的とするＩｇＧ陽性Ｂ細胞の数に応じた期間継続すればよく、一般に１日以上、好ましくは３日以上とすることができるが、培養系に含まれる細胞集団の増殖速度及び密度に応じて適宜調整すればよい。
　本発明によれば、上記したＢ細胞集団の製造方法により製造されるＢ細胞集団が提供される。本発明のＢ細胞は好ましくは、ウイルスベクターに組み込まれたＢａｃｈ２遺伝子を有している。本発明のＢ細胞集団は、好ましくは、本明細書中後記する通りの高い比増殖速度を有している。上記の通り、本発明のＢ細胞集団は好ましくは、高い比増殖速度を有するものではあるが、比増殖速度の数値による規定は、Ｂ細胞集団の好ましい態様を規定するものである。本発明のＢ細胞集団の構造自体を製造方法によらずに特定することは、不可能又は非実際的であるという事情が存在することから、本発明のＢ細胞集団は、製造方法（即ち、Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞を、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下において培養する工程を含む、Ｂ細胞集団の製造方法）により規定されるものである。
　本発明のＢ細胞集団の増殖は比増殖速度を用いて評価することができる。比増殖速度は、単位時間あたりの細胞量の増加として定義され、比増殖速度：μ＝ｌｎ（ｍt2／ｍt1）／（ｔ２－ｔ１） で表される。ここで、ｍt1 はｔ１日目における細胞数、ｍt2はｔ２日目における細胞数である（ただし、ｔ２＞ｔ１）。したがって、比増殖速度の単位は、（個/個/日）＝（１/日）である。
　以下、Ｂ細胞がマウス細胞である場合と、Ｂ細胞がヒト細胞である場合について、比増殖速度の好ましい範囲について説明する。
（Ｂ細胞がマウス細胞である場合）
　本発明によるＢ細胞集団の製造方法及び上記製造方法から得られたＢ細胞集団においては、好ましくは、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後９日目～１３日目における比増殖速度が０．６（１／日）以上であり、より好ましくは０．８（１／日）以上であり、特に好ましくは１．０（１／日）以上である。
　また、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後９日目～１７日目、９日目～２２日目、９日目～２７日目、９日目～３２日目、及び９日目～３８日目の何れか１以上における比増殖速度は、好ましくは０．６（１／日）以上である。９日目～１７日目、９日目～２２日目、９日目～２７日目の何れか１以上における比増殖速度は、好ましくは０．６（１／日）以上であり、より好ましくは０．８（１／日）以上である。好ましくは９日目～１７日目、９日目～２２日目、９日目～２７日目のすべての比増殖速度は、好ましくは０．６（１／日）以上であり、より好ましくは０．８（１／日）以上である。
　９日目～３２日目及び９日目～３８日目の比増殖速度はともに０．６（１／日）以上であることが好ましい。
　また、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後１３日目～１７日目、１７日目～２２日目、及び２２日目～２７日目の何れか１以上における比増殖速度が０．６（１／日）以上であり、１３日目～１７日目、１７日目～２２日目、及び２２日目～２７日目のすべての比増殖速度が０．６（１／日）以上であることが好ましい。
　また、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後２７日目～３２日目及び３２日目～３８日目の何れか１以上における比増殖速度が０．４（１／日）以上であることが好ましく、２７日目～３２日目及び３２日目～３８日目の比増殖速度がともに０．４（１／日）以上であることが好ましい。
　なお、上記したマウスＢ細胞についての比増殖速度の上限は特に限定されないが、一般的には２．３（１／日）以下、又は１．６（１／日）以下である。
（Ｂ細胞がヒト細胞である場合）
　本発明によるＢ細胞集団の製造方法及び上記製造方法から得られたＢ細胞集団においては、好ましくは、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後１２日目～１８日目における比増殖速度が０．１（１／日）以上であり、より好ましくは０．１３（１／日）以上であり、特に好ましくは０．１５（１／日）以上である。
　また、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後１２日目～２４日目、及び１２日目～３０日目の何れか１以上における比増殖速度は、好ましくは０．１（１／日）以上であり、より好ましくは０．１３（１／日）以上であり、さらに好ましくは０．１５（１／日）以上である。Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後１２日目～３０日目における比増殖速度は、より好ましくは０．１５（１／日）以上であり、特に好ましくは０．２（１／日）以上である。
　１２日目～２４日目、及び１２日目～３０日目の比増殖速度はともに０．１（１／日）以上であることが好ましく、ともに０．１５（１／日）以上であることがより好ましく、ともに０．２（１／日）以上であることがさらに好ましい。
　また、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後１８日目～２４日目及び２４日目～３０日目の何れか１以上における比増殖速度が０．１５（１／日）以上であることが好ましく、０．２０（１／日）以上であることがより好ましい。１８日目～２４日目及び２４日目～３０日目の比増殖速度がともに、０．１５（１／日）以上であることが好ましく、０．２０（１／日）以上であることがより好ましい。
　なお、上記したヒトＢ細胞についての比増殖速度の上限は特に限定されないが、一般的には１．５（１／日）以下、又は１．０（１／日）以下である。
　なお、本発明では、上述した選別工程後に得られた細胞に対して用いられる「抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞集団」との用語は、得られた細胞を総括する意味で用いられ、細胞の数に限定されない。即ち、複数個の細胞を指す場合に用いられる他、１個の細胞のみが存在する場合にも同様に用いられる。
　本発明の抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞集団は、上述した製造方法により得られた細胞集団である。この細胞集団では、用いられた特定抗原に対して特異性を有するＩｇＧ陽性Ｂ細胞で主として構成されており、例えば、同様の抗原と一次接触した生体由来の脾臓組織に由来する細胞集団よりも、抗原に対して特異性を有するＩｇＧ陽性Ｂ細胞の密度が高い。従って、本抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞集団であれば、特定抗原に対して親和性を有するＩｇＧ陽性Ｂ細胞を大量に必要とするモノクローナル抗体の製造や、細胞治療等に好適に用いることができる。
　なお、本発明の製造方法により得られたＩｇＧ陽性Ｂ細胞集団を構成するＢ細胞に対しては、抗体分子に変異を導入して、更に多様な抗原特異性を有するＢ細胞を得てもよい。このような変異の導入としては、例えば、Ｖ領域に対する変異の導入が挙げられる。これにより、抗原に対する親和性を更に改良することができる。Ｖ領域に対して変異を導入する方法としては、公知の方法を適用することができるが、変異導入の確実性の観点から、抗体遺伝子の体細胞突然変異（ＳＨＭ）と抗体定常部領域遺伝子のクラススイッチ組み換え（ＣＳＲ）の双方に寄与するＡＩＤ(activation induced cytidine deaminase)の利用が挙げられる。あるいは、ＡＩＤの発現を増強するサイトカインなどを用いてもよい。
　本発明の一例としては、
　ＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦを細胞表面に提示するフィーダー細胞上においてマウスＩＬ－４を含有する培地中においてマウスＢ細胞を培養する工程；
　Ｂａｃｈ２遺伝子を含むレトロウイルスベクターを前記マウスＢ細胞に感染させる工程；及び
　前記感染されたマウスＢ細胞を、マウスＩＬ－２１を含有する培地中で培養する工程：を含む、マウスＢ細胞集団の製造方法が提供される。さらに本発明によれば、上記したマウスＢ細胞集団の製造方法により製造されるマウスＢ細胞集団が提供される。
　本発明の別の例としては、
　ＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦを細胞表面に提示するフィーダー細胞上においてヒトＩＬ－４及びヒトＩＬ－２を含有する培地中においてヒトＢ細胞を培養する工程；
　Ｂａｃｈ２遺伝子を含むレトロウイルスベクターを前記ヒトＢ細胞に感染させる工程；及び
　前記感染されたヒトＢ細胞を、ヒトＩＬ－２１を含有する培地中で培養する工程：を含む、ヒトＢ細胞集団の製造方法が提供される。さらに本発明によれば、上記したヒトＢ細胞集団の製造方法により製造されるヒトＢ細胞集団が提供される。
　本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、上述したＢ細胞集団の製造方法により得られた細胞集団を用いてモノクローナル抗体を製造することを含む。これにより、特定抗原に対するモノクローナル抗体を簡便に且つ迅速に得ることができる。
　本モノクローナル抗体の製造方法では、周知のハイブリドーマ作製方法を、上記の抗原特異的Ｂ細胞集団に対して適用すればよい。具体的には、本発明により得られたＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む細胞集団に対して、ミエローマ細胞等を周知の方法による細胞融合法を用いてハイブリドーマを得て、このハイブリドーマの中から、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法等を用いて単離し、単離されたハイブリドーマが産生する抗体を回収すればよい。あるいは、上記の抗原特異的Ｂ細胞集団から抗体遺伝子を単離して、遺伝子組み換えによりモノクローナル抗体を作製する方法でもよい。
　以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
［実施例１］マウスＢ細胞の長期培養
（１）細胞の培養
　Ｂ細胞調製物及び他の細胞の培養は、特に断らない限り、ＲＰＭＩ－１６４０（１０％(v/v) ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、５５ｎＭ ２－ＭＥ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム添加）をＢ細胞培養培地として用いて、５％（v/v）ＣＯ2、３７℃の条件下で行った。
（２）マウスＢ細胞の調製
　マウス（C57BL/6、メス8週齢）から脾臓細胞を得て、常法により、ビオチン－抗マウスＣＤ４３抗体(BD Pharmingen社製)、ビオチン－抗マウスＣＤ４抗体(Biolegend社製）、ビオチン－抗マウスＴｅｒ－１１９抗体(eBioscience社製)、ビオチン－抗マウスＣＤ１１ｃ抗体(eBioscience社製）を反応させ、ＣＤ４３、ＣＤ４、Ｔｅｒ－１１９及びＣＤ１１ｃ陰性のＢ細胞を、Streptavidin-Particle Plus-DM、BD IMagnet(BD Bioscience Pharmingen社製）を用いて回収し、マウスＢ細胞を得た。
（３）レトロウイルスベクターの調製
　pMX-IRES-GFPベクター（Proc Natl Acad Sci U S A, Vol.97, pp.3062-3066 (2000)）のマルチクローニングサイトにマウスＢｃｌ－６(Oncogene. 1995 Oct 19;11(8):1657-63.)、マウスＢａｃｈ２（Mol Cell Biol. 1996 Nov;16(11):6083-95.）、マウスＢｃｌ－２（Cell. 1987 May 22;49(4):455-63.）をそれぞれサブクローニングした。また、何も組み込まないベクターを空ベクター（ｍｏｃｋ）とした。これらのベクターから定法に従ってそれぞれレトロウイルスベクターを作製した。
（４）マウスＢ細胞への遺伝子導入
　ＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦを細胞表面に提示するフィーダー細胞、４０ＬＢ細胞は、特開２０１１－９２１４２号公報に記載の細胞を用いた。実験には、直径１０ｃｍ細胞培養プレート（BD Falcon社製）に、４０ＬＢ細胞を３×１０6個播種し、２４時間培養して単一層を形成させた後、１２０Ｇｙのγ線を照射してからフィーダー細胞として使用した。上記（２）で調製したＢ細胞をフィーダー細胞上に、１．２５×１０4個／ｍｌの細胞密度で播種し、マウスＩＬ－４（１０　ｎｇ／ｍｌ、PEPRO TECH社製）を含有するＢ細胞培養培地で培養した。培養３日目に上記（３）で調製したレトロウイルスベクターのそれぞれをＢ細胞に感染させた。
　培養５日目に全細胞を、２ｍＭのＥＤＴＡと０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳを用いてフィーダー細胞ごと剥がし、ピペットでフラッシュして回収した。新たに準備された４０ＬＢ細胞が播種されたプレートに、マウスＩＬ－２１（１０　ｎｇ／ｍｌ、PEPRO TECH社製）を含有するＢ細胞培養培地に、回収された細胞集団を、２．５×１０3個／ｍｌ以下の細胞密度で播種して、培養を行った。
　各Ｂ細胞の５日目に播種した数を１とした細胞数の累積増加率を図１に示す。
　各Ｂ細胞について、５～９日目、９～１３日目、９～１７日目、９～２２日目、９～２７日目、９～３２日目、及び９～３８日目の比増殖速度を図２に示す。
　また各Ｂ細胞について、５～９日目、９～１３日目、１３～１７日目、１７～２２日目、２２～２７日目、２７～３２日目、及び３２～３３日目の比増殖速度を図３に示す。
　図２及び図３のグラフの縦軸は、比増殖速度の単位である（１／日）を示す。
　図１に示されるように、ｍｏｃｋやＢｃｌ２により形質転換したＢ細胞では、９日目以降ほとんど細胞が増殖しなくなる。また、Ｂｃｌ６により形質転換したＢ細胞では、比増殖速度（１／日）は０．２程度であるのに対しＢａｃｈ２では、３２－３８日目でも０．４以上の比増殖速度を維持している。
［実施例２］ヒトＢ細胞の長期培養
（１）レトロウイルスベクターの調製
　ｐＭＸ－ＩＲＥＳ－ｈＣＤ８（Nat Commun. 2011 Sep 6;2:465.）よりＮｃｏＩ－ＳａｌＩでｈＣＤ８断片を調製し、ｐＭＸｓ-ＩＧベクター（EMBO J. 1999 Sep 1;18(17):4754-65.）のＮｃｏＩ－ＳａｌＩにサブクローニングし、ｐＭＸｓ－ＩＲＥＳ－ｈＣＤ８とした。これを空ベクター（ｍｏｃｋ）とした。ｐＭＸｓ－ＩＲＥＳ－ｈＣＤ８のＢａｍＨＩ－ＮｏｔＩ間にコザック配列を含む形で、ヒトＢａｃｈ２（Oncogene. 2000 Aug 3;19(33):3739-49.）をサブクローニングし、ｐＭＸｓ－ｈＢａｃｈ２－ＩＲＥＳ－ｈＣＤ８とした。これをヒトＢａｃｈ２発現ベクターとした。これらのベクターから定法に従ってそれぞれレトロウイルスベクターを作製した。
（２）ヒトＢ細胞の調製
　健常人のヒト末梢血からＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥヘルスケア株式会社製）を用いてリンパ球を分離した。常法により、ビオチン－抗ヒトＣＤ２抗体(Biolegend社製）、ビオチン－抗ヒトＣＤ２３５ａ抗体(eBioscience社製)を反応させ、ＣＤ２、ＣＤ２３５陰性の細胞を、Streptavidin-Particle Plus-DM、BD IMagnet(BD Bioscience Pharmingen社製）を用いて回収した。これに常法により、ＰＥ/Ｃｙ７抗ヒトＣＤ１９抗体を反応させ、ＡＲＩＡII（BD バイオサイエンス社製）でＣＤ１９陽性の細胞ソーティングし、ヒトＢ細胞を得た。
（３）ヒトＢ細胞への遺伝子導入
　回収したＢ細胞を、実施例１と同様に準備した４０ＬＢ上で、ヒトＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍｌ、PEPRO TECH社製）、ヒトＩＬ－２（２５　unit／ｍｌ、PEPRO TECH社製）を含有するＢ細胞培養培地で培養した。培養４日目に上記（１）で調製したレトロウイルスベクターのそれぞれをＢ細胞に感染させた。培養６日目に全細胞を、２ｍＭのＥＤＴＡと０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳを用いてフィーダー細胞ごと剥がし、ピペットでフラッシュして回収した。新たに準備された４０ＬＢ細胞が播種されたプレートに、ヒトＩＬ－２１（１０　ｎｇ／ｍｌ、PEPRO TECH社製）を含有するＢ細胞培養培地に、回収された細胞集団を、１×１０5個／ｍｌ以下の細胞密度で播種して、培養を行った。
　各Ｂ細胞の６日目に播種した数を１とした細胞数の累積増加率を図４に示す。
　各Ｂ細胞について、６～１２日目、１２～１８日目、１２～２４日目、及び１２～３０日目の比増殖速度を図５に示す。
　また各Ｂ細胞について、６～１２日目、１２～１８日目、１８～２４日目、及び２４～３０日目の比増殖速度を図６に示す。
　図５及び図６のグラフの縦軸は、比増殖速度の単位である（１／日）を示す。
　上記方法により、ヒトＢ細胞を長期培養することができる。
［実施例３］レンチウイルスベクターを用いたヒトＢ細胞の長期培養
（１）レンチウイルスベクターの調製
　ＣＳ２－ＣＭＶ－ＭＣＳ（Virology. 2009 Oct 25;393(2):198-209.）のマルチクローニングサイトにヒトＢａｃｈ２（Oncogene. 2000 Aug 3;19(33):3739-49.）をそれぞれサブクローニングした。レンチウイルスベクターの調製はVirology. 2009 Oct 25;393(2):198-209.に記載の方法に従った。ヒトＢａｃｈ２をサブクローニングしないものを空ベクター（ｍｏｃｋ）とした。
（２）ヒトＢ細胞の調製
　健常人のヒト末梢血からＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ　Ｔｕｂｅ（Axis-Shield PoC AS社製）を用いて単核球を分離し、さらにＢ　Ｃｅｌｌ　アイソレーションキットII, ヒト（Miltenyi Biotec社製）を用いてヒトＢ細胞を得た。
（３）ヒトＢ細胞への遺伝子導入
　回収したＢ細胞に、上記（１）で調製したレトロウイルスベクターのそれぞれを、感染させた。感染後、直径１０ｃｍ細胞培養プレート（BD Falcon社製）に、１．２５×１０4個／ｍｌの細胞密度で播種し、抗ＣＤ４０抗体（１　μｇ／ｍｌ、Beckman Coulter社製）、分泌型ヒトＢＡＦＦ（１　μｇ／ｍｌ、PEPRO TECH社製）、ヒトＩＬ－４（５０　ｎｇ／ｍｌ、PEPRO TECH社製）、ヒトＩＬ－２（２５　unit／ｍｌ、PEPRO TECH社製）を含有するＢ細胞培養培地で培養した。培養５日目に全細胞を回収し、抗ＣＤ４０抗体（１　μｇ／ｍｌ、Beckman Coulter社製）、分泌型ヒトＢＡＦＦ（１　μｇ／ｍｌ、PEPRO TECH社製）、ヒトＩＬ－２１（１０　ｎｇ／ｍｌ、PEPRO TECH社製）、ヒトＩＬ－２（２５　unit／ｍｌ、PEPRO TECH社製）を含有するＢ細胞培養培地で培養した。
　上記方法により、ヒトＢ細胞を長期培養することができる。

Claims (15)

  1. Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞を、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下において培養する工程を含む、Ｂ細胞集団の製造方法。
  2. Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞が、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入することによって得られる細胞である、請求項１に記載のＢ細胞集団の製造方法。
  3. ウイルスベクターを用いてＢ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入する、請求項２に記載のＢ細胞集団の製造方法。
  4. Ｂ細胞がマウス細胞であり、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後９日目～１３日目における比増殖速度が０．６（１／日）以上である、請求項１から３の何れか１項に記載のＢ細胞集団の製造方法。
  5. Ｂ細胞がヒト細胞であり、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後１２日目～１８日目における比増殖速度が０．１（１／日）以上である、請求項１から３の何れか１項に記載のＢ細胞集団の製造方法。
  6. 前記ＣＤ４０及び／又はＢＡＦＦ受容体に対する作用手段が、ＣＤ４０Ｌ及び／又はＢＡＦＦを提示した構造物、ＣＤ４０の刺激因子、又はＢＡＦＦ受容体の刺激因子の何れかで１以上である、請求項１から５の何れか１項に記載のＢ細胞集団の製造方法。
  7. Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞を、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下において培養する工程が、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段及びＩＬ－２１受容体に対する作用手段の存在下においてＢ細胞を培養する工程である、請求項１から６の何れか１項に記載のＢ細胞集団の製造方法。
  8. Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞を、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下において培養する工程が、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段、ＩＬ－２１受容体に対する作用手段、並びにＩＬ－４及び／又はＩＬ－２の存在下においてＢ細胞を培養する工程である、請求項１から７の何れか１項に記載のＢ細胞集団の製造方法。
  9. ＩＬ－２１受容体に対する作用手段が、ＩＬ－２１及び／又は抗ＩＬ－２１受容体抗体である、請求項７又は８に記載のＢ細胞集団の製造方法。
  10. Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入する前に、Ｂ細胞を、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下、かつＩＬ－４あるいはＩＬ－４及びＩＬ－２の存在下で培養する、請求項２又は３に記載のＢ細胞集団の製造方法。
  11. 請求項１から１０のいずれか１項に記載の製造方法により製造されるＢ細胞集団。
  12. Ｂ細胞が、ウイルスベクターに組み込まれたＢａｃｈ２遺伝子を有する、請求項１１に記載のＢ細胞集団。
  13. Ｂ細胞がマウス細胞であり、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後９日目～１３日目における比増殖速度が０．６（１／日）以上である、請求項１１又は１２に記載のＢ細胞集団。
  14. Ｂ細胞がヒト細胞であり、Ｂ細胞にＢａｃｈ２遺伝子を導入した後１２日目～１８日目における比増殖速度が０．１（１／日）以上である、請求項１１又は１２に記載のＢ細胞集団。
  15. 請求項１から１０のいずれか１項に記載の製造方法により製造されたＢ細胞集団を使用する、モノクローナル抗体の製造方法。
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