CN110418838A - B细胞群的制备方法、以及使用了其的单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

B细胞群的制备方法、以及使用了其的单克隆抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供一种效率良好地制备包含识别特定抗原的B细胞的B细胞群的方法。根据本发明，可以提供一种B细胞群的制备方法，该方法包括：工序c，一边施加CD40及BAFF受体介导的刺激，一边在IL‑21不存在下、IL‑4不存在下、且在除了IL‑21和IL‑4以外的细胞因子的存在下与特定抗原一起培养包含B细胞的细胞群；以及，工序d，一边施加Fas介导的刺激，一边培养所述包含B细胞的细胞群，得到包含识别所述特定抗原的B细胞的B细胞群。

Description

B细胞群的制备方法、以及使用了其的单克隆抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及B细胞群的制备方法、以及使用了其的单克隆抗体的制备方法。
背景技术
对特定的抗原显示出高选择性的单克隆抗体可以期待开发成抗体药物，特别是正在进行以癌细胞为靶标的抗体药物的开发。为了将以单克隆抗体作为有效成分的药物应用于人的治疗，从避免排斥反应的观点出发，最理想的是给药异种抗原量少的人的抗体。因此开发出了多种嵌合抗体、人源化抗体。
在使小鼠等多次免疫抗原后，将脾脏、淋巴结的细胞与骨髓瘤细胞融合而形成杂交瘤，以杂交瘤所产生的小鼠IgG抗体为基础，使用重组技术制作了通常人治疗用的嵌合抗体、人源化抗体。然而，使用小鼠等动物个体方面、对产生显示出高亲和性的抗体的杂交瘤进行选择方面花费时间，需要确认通过重组技术得到的抗体的活性。因此，在上述的方法中，不仅制造目标抗体花费时间，而且直至对人给药为止，无法确定其效果。另外，在免疫抗原显示出个体毒性时难以对个体进行免疫。此外，在以动物物种间保守性高的蛋白抗质抗原作为抗原时，由于免疫耐受而难以产生抗体。
B细胞是来自骨髓的细胞、且是在表面具有B细胞受体(BCR)的免疫细胞，是产生抗体的细胞。B细胞由造血干细胞生成，经过祖B细胞和前B细胞而分化为B细胞。已知在生发中心选择产生对抗原显示出高亲和性的抗体的B细胞，但该选择的机制尚未得到充分阐明。如果能使产生对特定抗原显示出高亲和性的抗体的B细胞进行人工增殖并浓缩，就能够以更短的时间制备对特定抗原显示出高亲和性的单克隆抗体。
专利文献1中记载了一种包含特定抗原特异性的IgG阳性B细胞的抗原特异性B细胞群的制备方法，该方法包括：在IL-21的存在下对IgG阳性B细胞施加CD40、BAFF受体、Fas介导的刺激，并且与上述特定抗原一起进行培养，筛选对上述特定抗原有特异性的抗原特异性B细胞，得到包含对上述特定抗原有特异性的IgG阳性B细胞的抗原特异性B细胞群。
专利文献2中记载了一种B细胞群的制备方法，该方法包括如下工序：在作用于CD40和/或BAFF受体的手段的存在下，对提高了Bach2基因的表达的B细胞进行培养。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第5550132号
专利文献2：国际公开WO2016/002760号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本发明要解决的课题在于提供效率良好地制备包含识别特定抗原的B细胞的B细胞群的方法。
用于解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，一边施加CD40及BAFF受体介导的刺激，一边在IL-21不存在下、IL-4不存在下、且在除了IL-21和IL-4以外的细胞因子的存在下与特定抗原一起培养包含B细胞的细胞群，接着，一边施加Fas介导的刺激，一边培养上述包含B细胞的细胞群，由此，能够效率良好地制备包含识别特定抗原的B细胞的B细胞群，从而完成了本发明。
即，根据本发明可提供以下的发明。
[1]一种B细胞群的制备方法，该方法包括：
工序c：一边施加CD40及BAFF受体介导的刺激，一边在IL-21不存在下、IL-4不存在下、且在除了IL-21和IL-4以外的细胞因子的存在下与特定抗原一起培养包含B细胞的细胞群；以及
工序d：一边施加Fas介导的刺激，一边培养上述包含B细胞的细胞群，得到包含识别上述特定抗原的B细胞的B细胞群。
[2]根据[1]所述的方法，其中，上述细胞因子为除了IL-21和IL-4以外的白细胞介素。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，上述细胞因子为选自IL-2、IL-10家族及IL-12家族中的至少1种细胞因子。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，上述细胞因子为选自IL-2、IL-20、IL-24及IL-27中的至少1种。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，在工序d中，一边施加Fas介导的刺激，一边在IL-21的存在下或在IL-21及IL-2的存在下培养上述包含B细胞的细胞群。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，在特定抗原不存在下进行工序d。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，在工序c之前还包括工序a：一边施加CD40及BAFF受体介导的刺激，一边在IL-4的存在下或在IL-4及IL-2的存在下培养包含B细胞的细胞群。
[8]根据[7]所述的方法，其中，在工序a和工序c之间还包括工序b：一边施加CD40及BAFF受体介导的刺激，一边在IL-21的存在下或在IL-21及IL-2的存在下培养包含B细胞的细胞群。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的方法，其中，上述工序c是使用提呈了CD40L、BAFF及特定抗原的载体来培养包含B细胞的细胞群的工序。
[10]根据[9]所述的方法，其中，提呈了CD40L、BAFF及特定抗原的载体是提呈了CD40L、BAFF及特定抗原的饲养细胞。
[11]根据[1]～[10]中任一项所述的方法，其中，上述工序d是使用提呈了CD40L、BAFF及FasL的载体来培养包含B细胞的细胞群的工序。
[12]根据[11]所述的方法，其中，提呈了CD40L、BAFF及FasL的载体是提呈了CD40L、BAFF及FasL的饲养细胞。
[13]根据[1]～[12]中任一项所述的方法，其中，上述B细胞为人B细胞。
[14]一种单克隆抗体的制备方法，该方法包括如下工序：通过培养利用[1]～[13]中任一项所述的制备方法而得到的B细胞群来制造单克隆抗体。
发明的效果
根据本发明，能够简便且效率良好地制造包含识别特定抗原的B细胞的B细胞群。
附图说明
图1是本发明的实施例中的B细胞群的筛选工序的培养日程。
图2示出了本发明的实施例中的B细胞筛选工序后的细胞群的、使用了抗CD19抗体和Alexa647标记Her2-Tag2的二维染色的结果。
图3示出了本发明的实施例和比较例中的B细胞筛选方法的选择效率。
具体实施方式
以下，对本发明进行说明。
本发明的B细胞群的制备方法包括：工序c，一边施加CD40及BAFF受体介导的刺激，一边在IL-21不存在下、IL-4不存在下、且在除了IL-21和IL-4以外的细胞因子的存在下与特定抗原一起培养包含B细胞的细胞群；以及，工序d，一边施加Fas介导的刺激，一边培养上述包含B细胞的细胞群，得到包含识别上述特定抗原的B细胞的B细胞群。通过本发明的方法制备的识别特定抗原的B细胞优选为对特定抗原具有特异性的B细胞。
＜工序c＞
本发明中的工序c是如下工序：一边施加CD40及BAFF受体介导的刺激，一边在IL-21不存在下、IL-4不存在下、且在除了IL-21和IL-4以外的细胞因子的存在下与特定抗原一起培养包含B细胞的细胞群。
本发明中使用的含有B细胞的细胞群通常可以是来自于外周血细胞、骨髓细胞、或例如脾脏细胞等淋巴系统脏器的细胞群，没有特别限定。另外，作为B细胞，可以是未与抗原反应的初始B细胞，也可以是接触抗原后的记忆B细胞。这里，本说明书中的“初始B细胞”通常是指未与抗原反应的成熟B细胞，是显示出CXCR5阳性且CD40阳性的表面抗原的细胞。
另外，本发明中使用的细胞群只要具有CD40、BAFF受体(BAFF-R)及Fas、且表达了能识别抗原的B细胞受体(BCR)即可，只要在不妨害本发明的范围，就可以包含分化阶段中其它阶段的B细胞。从培养的选择效率的观点出发，优选去除CD138阳性(血浆)细胞、除B细胞以外的细胞、例如T细胞、单核细胞、NK细胞等。
本发明中使用的细胞群只要是来自于已建立了免疫系统的生物的细胞群即可，包括：例如人、猴等灵长类哺乳动物；例如猪、牛、马等有蹄类；例如小鼠、大鼠、兔等啮齿类小型哺乳类；例如鸡、鹌鹑等鸟类。作为本细胞群的来源，优选为灵长类，可以示例出人。即，本发明中使用的B细胞优选为人B细胞。由脾脏等生物体组织制备细胞群的方法可以直接适用通常的制备B细胞群的条件。另外，对于来自生物体的细胞群没有限定，可以是已建立的B细胞株。
B细胞群的培养通常可以是B细胞的培养中使用的培养基的通常培养条件。作为这样的培养基，例如可以列举出：达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，D-MEM)、RPMI-1640等。对于这些培养基，通常还可以添加血清、各种维生素、各种抗生素等能够适于通常的细胞培养的各种添加剂。
培养温度等培养条件可以直接适用对通常的B细胞所使用的培养条件，例如可列举出37℃、5％(v/v)CO2的条件。
细胞群在培养基中的接种密度根据细胞群的来源、由组织制备的细胞的状态、以及在同一培养体系内进行的培养天数而不同，通常可以为1×102个～1×107个/cm2，优选为1×103个～1×106个/cm2，特别是从人B细胞在以高密度开始培养时增殖率良好的观点考虑，可以优选为1×104个～1×106个/cm2。在该范围时，能够预防在培养3天左右后变为增殖状态的情况。
为了在对特定抗原进行刺激的阶段通过CD40、BAFF受体及Fas介导的刺激产生细胞内信号，需要本发明中使用的B细胞具有CD40、BAFF受体(BAFF-R)及Fas。对这些分子的刺激只要从外部识别这些分子并在具有CD40、BAFF受体及Fas的B细胞的内部产生细胞内信号即可，没有限制，可以列举出：识别这些分子的全部或一部分的抗体或抗体片段、CD40配体(CD40L)、BAFF及Fas配体(FasL)。需要说明的是，CD40及BAFF受体介导的刺激也可以是将CD40L及BAFF中的1种以上替换为针对CD40或BAFF受体的抗体或抗体片段而施加的形式(参照专利文献1)。
CD40L是针对CD40的配体，CD40L的氨基酸序列是公知的(例如参照Nature,Vol.357,pp.80-82(1992)和EMBO J.,Vol.11,pp.4313-4321(1992))。在本发明中，CD40L的序列中只要是不失去与受体结合能力相关的活性结构域的结合能力的程度就可以是保守的，例如，只要具有活性结构域的80％以上的氨基酸序列同源性，就能用于本发明。这样的CD40L可以是从天然表达的细胞中分离出的CD40L，也可以是基于已知的氨基酸序列而合成的CD40L。另外，CD40L只要是能够对培养体系中的B细胞给出与CD40L的存在相对应的信号的形式即可，可以是游离型，也可以是膜结合型。
为了形成包含IgG阳性B细胞的细胞群，游离型CD40L等CD40的刺激因子可以以能够保持B细胞增殖的浓度存在于培养体系中，例如为10ng/ml～10μg/ml，考虑到伴随B细胞增殖的相对减少，可以优选设为50ng/ml～10μg/ml。
BAFF(B细胞活化因子：B cell activation factor belonging to the tumornecrosis factor family)是TNF类似分子，且已知是参与与抗原发生反应的B细胞的增殖、分化等的分子，BAFF的氨基酸序列是已知的(例如，J Exp Med,Vol.189,pp.1747-1756(1999)、Science,Vol.285,pp.260-263(1999)和J Bio Chem,Vol.274,pp.15978-15981,(1999))。在本发明中，BAFF的序列中只要是不失去与受体结合能力相关的活性结构域的结合能力的程度就可以是保守的，例如，只要具有活性结构域的80％以上的氨基酸序列同源性，就能用于本发明。这样的BAFF可以是从天然表达的细胞中分离出的BAFF，也可以是基于已知的氨基酸序列而合成的BAFF。另外，BAFF只要是能够对培养体系中的IgG阳性B细胞给出与BAFF的存在相对应的信号的形式即可，可以是游离型(即，分泌型)，也可以是膜结合型。
为了形成包含IgG阳性B细胞的细胞群，游离型BAFF等BAFF受体的刺激因子可以以能够保持B细胞增殖的浓度存在于培养体系中，例如为10ng/ml～10μg/ml，从在高浓度时可以进一步期待生存支撑活性的观点出发，可以优选设为50ng/ml～10μg/ml浓度。
需要说明的是，作为CD40L、BAFF的来源，可以与上述的细胞群同样地列举出哺乳动物的灵长类、有蹄类、小型哺乳类的啮齿类、鸟类等，优选来自于啮齿类和哺乳类，可以示例出小鼠、人。另外，可以主要来自于与成为提呈对象的上述细胞群相同的细胞群，也可以主要来自于不同的细胞群。
针对CD40或BAFF受体的抗体或抗体片段可以按照本领域中已知的方法而得到。只要是对CD40或BAFF受体具有结合能力的抗体即可，没有特别限制。
这些抗体或抗体片段可以是提呈于载体的表面的形态，也可以是未固定化于抗体表面的游离型或可溶解形态。
在工序c中，在IL-21不存在下、IL-4不存在下、且在除了IL-21和IL-4以外的细胞因子的存在下与特定抗原一起培养包含B细胞的细胞群。
作为除了IL-21和IL-4以外的细胞因子，可以使用B细胞活化因子(已知使B细胞活化和/或分化的任意的各种细胞因子或生长因子)。具体而言，可以列举出：白细胞介素(迄今为止包括IL-1～IL-38和IL-17B～IL-17D等亚家族、OSM(制瘤素M)、LIF(白细胞移动抑制因子)、CNTF(睫状神经营养因子)、CT-1)、IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-γ、C型趋化因子XCL1及XCL2、C-C型趋化因子(迄今为止包括CCL1～CCL28)、CXC型趋化因子(迄今为止包括CXCL1～CXCL17)、TNF超家族成员(迄今为止包括TNFSF1～TNFSF18)、Toll样受体激动剂(包括LPS和CpG)、TGF-β超家族(包括TGF-β和活化素)、以及细胞增殖因子(包括通过SCF、Flt3配体、M-CSF、GM-CSF、胰岛素等受体型酪氨酸激酶来传递信号的物质)等，没有特别限定，可以使用上述中在B细胞表面表达了该受体的细胞因子。
作为除了IL-21和IL-4以外的细胞因子，优选为除了IL-21和IL-4以外的白细胞介素。
作为除了IL-21和IL-4以外的细胞因子，优选为选自IL-2、IL-10家族及IL-12家族中的至少1种细胞因子。
属于IL-10家族和IL-12家族的细胞因子可以是来自天然的细胞因子，也可以是利用生物工程得到的重组体。作为属于IL-10家族和IL-12家族的细胞因子的来源，可以与上述的细胞群同样地列举出：哺乳动物的灵长类、有蹄类、小型哺乳类的啮齿类、鸟类等。这些分子分别优选来自于啮齿类和哺乳类，例如可以列举出小鼠、人等。另外，可以是主要来自于与成为提呈对象的上述细胞群相同物种的分子，也可以来自于不同物种的细胞。
IL-10细胞因子家族包括IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-24、IL-26。尽管尚未完全阐明对B细胞的作用机制，但已经报道了抑制B细胞的分化。(非专利文献：Blood,115(9):1718-26(2010))
IL-12细胞因子家族包括IL-12、IL-23、IL-27、IL-30、IL-35。尽管尚未完全阐明对B细胞的作用机制，但报道了通过信号传导及转录激活因子STAT1和STAT3而使人B细胞活化。(非专利文献：Journal of Immunology,176(10):5890-7(2006))
作为除了IL-21和IL-4以外的细胞因子的具体例子，可以列举出选自IL-2、IL-20、IL-24和IL-27中的至少1种。
除了IL-21和IL-4以外的细胞因子(属于IL-10家族或IL-12家族的细胞因子等)的浓度只要是能够使对特定抗原具有亲和性的B细胞增殖的量即可，通常优选设为10ng/mL～1μg/mL，进一步优选设为10ng/mL～100ng/mL。
另外，在除了IL-21和IL-4以外的细胞因子为IL-2的情况下，优选设为1单位/mL～1000单位/mL，进一步优选设为10单位/mL～500单位/mL。
IL-2的1单位以细胞因子的比活性(单位/mg)定义，是仅适用于该细胞因子的反应体积曲线描绘S形曲线的情况的单位。比活性利用下式计算，因此依赖于ED50(ng/mL)。
比活性(单位/mg)＝1×106/ED50(ng/mL)
ED50(ng/mL)定义为引起最大反应的50％的反应的细胞因子浓度，通常由进行了标准化的生物测定的结果确定。在IL-2的情况下，可以采用通过小鼠CTLL-2测定计算出的ED50(ng/mL)。
在工序c中，与特定抗原一起培养包含B细胞的细胞群。
在工序c中，对B细胞提呈的特定抗原是指B细胞显示出亲和性的抗原，可以根据目的而适当选择。作为抗原的种类，只要显示出抗原性即可，没有特别限制，可以列举出：DNA、RNA等核酸、糖链、脂质、氨基酸、肽、蛋白质、半抗原、低分子化合物等。这些物质只要以B细胞能够识别的形态提呈即可，可以是游离型或载体固定型。从可靠地提呈至B细胞的观点出发，抗原优选为固定于载体的形态。
为了提高B细胞的抗原识别性，在使用的抗原中，除了单独使用抗原的形式以外，还可以应用添加了已知的辅助分子的形式、与抗体分子的结合形式等本领域中已知的提高抗原性的形式。
在抗原的提呈中应用了与抗体分子的结合形式的情况、或应用了蛋白质抗原与抗体Fc结构域的融合蛋白的情况下，可以进一步使用用于在载体表面展示抗原的支架、例如Fc受体分子或蛋白A、蛋白G、蛋白L等。
另外，也可以使用与载体的构成成分结合的蛋白质和抗原蛋白的融合蛋白质。另外，在提呈作为抗原的膜型蛋白质的情况下，可以将该基因以表达载体的形式导入作为载体的细胞中进行表达。在除此以外的蛋白质的情况下，可以将能够表达为适当的信号肽(分泌蛋白的情况不需要)与适当的跨膜结构域(例如MHC I类分子)的融合蛋白的表达载体导入作为载体的细胞中进行表达。
在工序c中，优选使用提呈了CD40L、BAFF和特定抗原的载体来培养包含B细胞的细胞群。
从可靠地对培养体系中的B细胞给出细胞内信号的观点出发，CD40L和BAFF优选为提呈在载体表面的形式。
作为用于将各分子提呈于表面的载体，只要是用于将上述分子提呈于表面而通常使用的载体即可，可以没有特别限制地列举出：细胞、人工双层脂质膜、聚苯乙烯或聚对苯二甲酸乙二醇酯等塑料、胶原蛋白、尼龙、硝基纤维素、琼脂、琼脂糖(agarose)、琼脂糖(Sepharose)等多糖、纸、玻璃等。对于载体的形状没有特别限制，可以是片状、平板状、球状、海绵状、纤维状等任意形状。作为载体，从细胞的可靠的选择性的观点出发，优选为细胞。作为可用作载体的细胞，可以列举出：成纤维细胞(例如3T3细胞、L细胞等)、上皮细胞(例如HeLa细胞)、胚胎肾脏细胞(例如HEK293细胞等)、滤泡树突状细胞等。其中，从增殖速度快、细胞表面积大、且去除饲养细胞简便的观点出发，优选为成纤维细胞。
提呈了CD40L、BAFF和特定抗原的载体优选为提呈了CD40L、BAFF和特定抗原的饲养细胞。
将CD40L、BAFF和特定抗原提呈在细胞表面的饲养细胞可以由本领域技术人员基于CD40L、BAFF和特定抗原的已知序列使用基因重组技术等来制备。
作为饲养细胞的来源，可以与上述的细胞群同样地列举出：哺乳动物的灵长类、有蹄类、小型哺乳类的啮齿类、鸟类等，优选来自于啮齿类和哺乳类，可以示例出小鼠、人等。另外，饲养细胞可以是主要来自于与成为提呈对象的上述细胞群相同物种的细胞，也可以是来自于不同物种的细胞。
需要说明的是，CD40L、BAFF和特定抗原只要能够对B细胞产生细胞内信号即可，可以未必存在于同一饲养细胞。
＜工序d＞
本发明中的工序d是如下工序：一边施加Fas介导的刺激，一边培养包含B细胞的细胞群，得到包含识别特定抗原的B细胞的B细胞群。
Fas介导的刺激可以通过Fas配体(FasL)来施加。Fas介导的刺激也可以是赋予针对Fas的抗体或抗体片段的形式(参照专利文献1)。
Fas配体(FasL)是属于TNF家族的死亡因子，即，是显示出细胞凋亡诱导活性的细胞因子，其氨基酸序列是公知的(例如参照Cell,Vol.75,pp.1169-1178(1993))。在本发明中，FasL的序列中只要是不失去与受体结合能力相关的活性结构域的结合能力的程度就可以是保守的，例如，只要具有活性结构域的80％以上的氨基酸序列同源性，就能用于本发明。这样的FasL可以是从天然表达的细胞中分离出的FasL，也可以是基于已知的氨基酸序列而合成的FasL。另外，FasL只要是能够对培养体系中的IgG阳性B细胞给出与Fas的存在相对应的信号的形式即可，只要能产生细胞内信号就可以是游离型，也可以是膜结合型。
FasL通常可以以能够对B细胞诱导细胞凋亡的浓度存在于培养体系中，例如为10ng/ml～10μg/ml，另外，从诱导通过抗原刺激来抑制细胞死亡的观点出发，可以优选设为10ng/ml～1μg/ml的浓度。
需要说明的是，作为FasL的来源，可以与上述的细胞群同样地列举出：哺乳动物的灵长类、有蹄类、小型哺乳类的啮齿类、鸟类等，优选来自于啮齿类和哺乳类，可以示例出小鼠、人。另外，可以主要来自于与成为提呈对象的上述细胞群相同的细胞群，也可以主要来自于不同的细胞群。
针对Fas的抗体或抗体片段可以按照本领域中已知的方法得到。只要是对Fas具有结合能力的抗体即可，没有特别限制。
这些抗体或抗体片段可以是提呈在载体表面的形态，也可以是未固定化于抗体表面的游离型或可溶解形态。
在工序d中，优选可以一边施加Fas介导的刺激，一边在IL-21的存在下或在IL-21和IL-2的存在下培养包含B细胞的细胞群。另外，工序d优选在特定抗原不存在下进行。
在工序d中存在IL-21时，其浓度通常优选设为1ng/mL～1000ng/mL，进一步优选设为1ng/mL～100ng/mL。
在工序d中存在IL-2时，其浓度优选设为1单位/mL～1000单位/mL，进一步优选设为10单位/mL～500单位/mL。
工序d优选使用提呈了CD40L、BAFF及FasL的载体来培养包含B细胞的细胞群。即，从对培养体系中的B细胞可靠地给出细胞内信号的观点出发，CD40L、BAFF或FasL优选为提呈于载体的表面的形式。作为用于将各分子提呈于表面的载体，可以列举出本说明书中上述的载体。
提呈了CD40L、BAFF及FasL的载体特别优选为提呈了CD40L、BAFF及FasL的饲养细胞。将CD40L、BAFF及FasL提呈于细胞表面的饲养细胞可以由本领域技术人员基于CD40L、BAFF及FasL的已知序列使用基因重组技术等来制备。
作为饲养细胞的来源，可以与上述的细胞群同样地列举出：哺乳动物的灵长类、有蹄类、小型哺乳类的啮齿类、鸟类等，优选来自于啮齿类和哺乳类，可以示例出小鼠、人等。另外，饲养细胞可以是主要来自于与成为提呈对象的上述细胞群相同物种的细胞，也可以是来自于不同物种的细胞。
需要说明的是，CD40L、BAFF及FasL只要能对B细胞产生细胞内信号即可，可以未必存在于同一饲养细胞。
＜包括工序c和工序d的筛选工序＞
将包括上述的工序c和工序d的工序称为筛选工序。筛选工序有时根据接种密度和细胞种等条件而不同，从可靠筛选的观点出发，通常设为筛选工序开始后1天以上，从可靠筛选的观点出发，可以设为1天～3天，优选设为1天～2天，只要保持细胞的生存能力，也可以是更长时期，通过更长期地进行培养，能够得到具有更高亲和性的抗原特异性B细胞。
另外，为了提高B细胞对抗原的亲和性，可以在更新饲养细胞的同时重复进行筛选工序。此时，为了提高B细胞对抗原的亲和性，也可以在每次重复工序时改变(减少)抗原的浓度、价数。另外，为了提高B细胞对抗原的亲和性，为了提高B细胞对抗原的亲和性，还可以在进行下一步工序时将前一步工序的培养上清、或培养上清中产生的抗体加入培养体系。由此，产生B细胞受体与抗体的竞争，可以筛选具有亲和性更高的B细胞受体的B细胞。
＜工序a及工序b＞
在本发明中，在进行工序c之前还可以进一步设置工序a：一边施加CD40及BAFF受体介导的刺激，一边在IL-4的存在下或在IL-4及IL-2的存在下培养包含B细胞的细胞群。
在本发明中，在工序a和工序c之间还可以进一步设置工序b：一边施加CD40及BAFF受体介导的刺激，一边在IL-21的存在下或在IL-21及IL-2的存在下培养包含B细胞的细胞群。
工序a和工序b中的CD40及BAFF受体介导的刺激的施加可以与本说明书中上述的方法同样地进行。
在进行工序a时，其培养期间没有特别限定，通常为1～14天，优选为3～10天。
在进行工序b时，其培养期间没有特别限定，通常为1～7天，优选为2～4天。
工序a中的IL-4的浓度通常优选设为1ng/mL～1μg/mL，进一步优选设为10ng/mL～100ng/mL。
工序a中的IL-2的浓度优选设为1单位/mL～1000单位/mL，进一步优选设为10单位/mL～500单位/mL。
工序b中的IL-21的浓度通常优选设为1ng/mL～1000ng/mL，进一步优选设为1ng/mL～100ng/mL。
工序b中的IL-2的浓度优选设为1单位/mL～1000单位/mL，进一步优选设为10单位/mL～500单位/mL。
＜包含识别特定抗原的B细胞的B细胞群＞
利用上述的本发明的方法可以制备包含识别特定抗原的B细胞的B细胞群。上述的包含识别特定抗原的B细胞的B细胞群优选为“抗原特异性B细胞群”。“抗原特异性B细胞群”用于表示统称得到的细胞的意思，对细胞的数量没有限定。即，除了用于指多个细胞的情况以外，也可同样地用于仅存在1个细胞的情况。
在利用本发明的方法制造的包含识别特定抗原的B细胞的B细胞群中，优选主要由对使用的特定抗原具有特异性的B细胞构成。例如，与存在于与同样的抗原初次接触的生物体来源的外周血中的B细胞群相比，这样的抗原特异性B细胞群中对抗原具有特异性的B细胞的密度高。
因此，根据利用本发明的方法制备的抗原特异性B细胞群，可以适宜地用于制备需要大量的对特定抗原具有亲和性的B细胞的单克隆抗体、细胞治疗等。
＜单克隆抗体的制备方法＞
根据本发明，可以提供一种单克隆抗体的制备方法，该方法包括如下工序：通过培养利用上述的本发明的制备方法而得到的B细胞群来制造单克隆抗体。由此，能够简便且迅速地得到针对特定抗原的单克隆抗体。
在本发明的单克隆抗体的制备方法中，可以对上述的B细胞群应用公知的杂交瘤制备方法。具体而言，对于通过本发明得到的包含IgG阳性B细胞的细胞群，可以对骨髓瘤细胞等使用基于公知方法的细胞融合法而得到杂交瘤，使用极限稀释法等从该杂交瘤中分离产生目标抗体的杂交瘤，对分离出的杂交瘤所产生的抗体进行回收。或者，可以是如下方法：从上述的抗原特异性B细胞群分离抗体基因，通过基因重组制备单克隆抗体。
通过以下记载的实施例对本发明进行说明，但本发明的范围并不限定于实施例。
实施例
(1)细胞的培养
在没有特别声明时，使用RPMI-1640(添加10％(v/v)FCS(胎牛血清)、青霉素/链霉素、2mM的L-谷氨酰胺、55nM的2-巯基乙醇、10mM的HEPES和1mM丙酮酸钠)作为B细胞培养培养基，在5％(v/v)CO2、37℃的条件下进行B细胞的培养。
在没有特别声明时，使用D-MEM(添加10％(v/v)FCS、青霉素/链霉素)作为40LB细胞培养培养基，在5％(v/v)CO2、37℃的条件下进行培养B细胞时使用的、将CD40L和BAFF提呈于细胞表面的饲养细胞、40LB细胞的培养。
在进行B细胞培养实验时，将2.7×106个40LB细胞接种于直径90mm的细胞培养板(Sumitomo Bakelite公司制造)中，培养24小时，形成单层，然后，在照射120Gy的X射线后使用。
(2)饲养细胞的制备
为了进行选择抗原特异性B细胞群的FAIS(Fas介导的抗原特异性iGB细胞选择：Fas-mediated Antigen-specific iGB-cell Selection)法(PLoS One,19；9(3):e92732.2014))，使用了40LB-Her2和40LB-FasL细胞。
按照常规方法通过慢病毒载体将人Her2导入40LB细胞，使其组成型表达，克隆制作了40LB-Her2细胞。
与专利文献1的记载同样地，按照常规方法通过逆转录病毒载体将小鼠FasL导入40LB细胞，使其组成型表达，克隆制作了40LB-FasL细胞。
(3)人B细胞的制备
使用Lymphoprep管(AXIS SHIELD公司制造)从健康人的人外周血分离单核细胞，使用FcR Blocking Reagent(Miltenyi Biotec公司制造)，然后进一步使用生物素-抗人CD2抗体(Biolegend公司制造)、生物素-抗人CD235a抗体(eBioscience公司制造)、Streptavidin-Particle Plus-DM(BD Pharmingen公司制造)，并使用BD iMag CellSeparation Magnet(BD Bioscience公司制造)和MACS Separation Columns(MiltenyiBiotec公司制造)回收了CD2阴性细胞和CD235a阴性细胞。使用PE-抗人CD19抗体(Biolegend公司制造)，并使用细胞分选仪(BD FACS AriaIII)回收了回收的细胞内CD19阳性细胞。
上述制备的B细胞按照图1的计划进行了培养。
(4)表达抗原特异性B细胞受体的B细胞群的制备
如下所示，得到了包含抗原特异性B细胞的B细胞群。
即，将CSIV-CMV-MCS-IRES2-Venus载体(Cancer Science,Vol.105,pp.402-408(2014))进行重组，制备重组了Her2抗原特异性B细胞受体(Herceptin抗体基因)的重链和轻链的CSIV-CMV-mGK(Herceptin kappa-Light chain)-IRES2-mGH(Herceptin Heavychain)，构建了Herceptin表达载体。使用该表达慢病毒载体，在回收的CD19阳性B细胞中按照常规方法得到了表达了Her2抗原特异性B细胞受体的B细胞群。
(5)人B细胞的制备(培养工序)
将上述得到的包含抗原特异性B细胞的群体在形成了单层的40LB细胞上原代培养7天。培养时使用含有人IL-4(50ng/mL、PEPROTECH公司制造)、人IL-2(50单位/mL、PEPROTECH公司制造)的B细胞培养基，以1×105个/cm2的细胞密度在CO2培养箱中进行培养(本说明书中记载的工序a)。
在培养第7天，使用包含2mM的EDTA和0.5质量％的BSA的D-PBS连同饲养细胞一起回收了全部细胞。对于回收的培养B细胞而言，使用生物素-抗小鼠H-2Kd抗体(Biolegend公司制造)和生物素抗人CD138抗体(公司制造)和Streptavidin-Particle Plus-DM(BDPharmingen公司制造)，并使用BD iMag Cell Separation Magnet(BD Bioscience公司制造)和MACS Separation Columns(Miltenyi Biotec公司制造)去除了饲养细胞和抗体产生细胞。对于去除了饲养细胞后的B细胞而言，使用含有人IL-21(10ng/mL、PEPROTECH公司制造)、人IL-2(50单位/mL、PEPROTECH公司制造)的B细胞培养基以5×104个/cm2以下的细胞密度接种于新准备的接种有40LB细胞的90mm培养皿，进行培养(本说明书中记载的工序b)。
(6)抗原特异性B细胞的选择培养(选择工序)
在培养第10天，为了进行Her2抗原特异性B细胞的选择培养，与(5)同样地从回收后的培养B细胞中去除了饲养细胞和抗体产生细胞。对于去除了饲养细胞后的B细胞而言，使用含有人IL-2(50单位/mL、PEPROTECH公司制造)的B细胞培养基以2×105个/cm2的细胞密度接种于新准备的接种有40LB细胞的90mm培养皿，进行抗原刺激预培养。此时，存在于B细胞培养基中的细胞因子仅为人IL-2，追加了如下条件：除了人IL-2以外还分别添加作为刺激具有共通/链的受体的细胞因子家族的人IL-4(50ng/mL、PEPROTECH公司制造)和人IL-21(50ng/mL、PEPROTECH公司制造)的条件；除了人IL-2以外还分别添加作为IL-10细胞因子家族的人IL-20(50ng/mL、PEPROTECH公司制造)和人IL-24(100ng/mL、PEPROTECH公司制造)的条件；除了人IL-2以外还分别添加作为IL-12细胞因子家族的人IL-27(50ng/mL、R&DSystems公司制造)的条件。
在48小时后(即，培养第12天)，对于全部细胞使用生物素-抗小鼠H-2Kd抗体(Biolegend公司制造)和生物素抗人CD138抗体(公司制造)和Streptavidin-ParticlePlus-DM(BD Pharmingen公司制造)、并使用BD iMag Cell Separation Magnet(BDBioscience公司制造)和MACS Separation Columns(Miltenyi Biotec公司制造)去除了饲养细胞和抗体产生细胞。将去除饲养细胞和抗体产生细胞且进行了抗原刺激预培养的B细胞群继续悬浮于相同条件的含有细胞因子的B细胞培养基，与形成了单层的40LB-Her2细胞一起培养，由此，对抗原特异性的B细胞施加抗原刺激(本说明书中记载的工序c)。
在48小时后(即，培养第14天)，对于全部细胞利用与上述相同的方法去除了饲养细胞和抗体产生细胞。将去除了40LB-Her2细胞和抗体产生细胞且进行了抗原刺激培养的各条件的B细胞悬浮于含有人IL-21(10ng/mL、PEPROTECH公司制造)和人IL-2(50单位/mL、PEPROTECH公司制造)的B细胞培养基，与形成了单层的40LB-FasL细胞一起培养，由此，对培养B细胞群整体施加细胞死亡刺激(本说明书中记载的工序d)。
在24小时后(即，培养第15天)，对于全部细胞使用生物素-抗小鼠H-2Kd抗体(Biolegend公司制造)和生物素抗人CD178(FasL)抗体(Biolegend公司制造)和Streptavidin-Particle Plus-DM(BD Pharmingen公司制造)、并使用BD iMag CellSeparation Magnet(BD Bioscience公司制造)和MACS Separation Columns(MiltenyiBiotec公司制造)去除了40LB-FasL细胞。进而，对于去除了40LB-FasL细胞的B细胞群，使用ClioCell Pro Kit(ClioCell公司制造)去除了死细胞。将去除了饲养细胞和死细胞后的B细胞群悬浮于含有人IL-21(10ng/mL、PEPROTECH公司制造)和人IL-2(50单位/mL、PEPROTECH公司制造)的B细胞培养基，在新的40LB细胞上进行了恢复培养。
在细胞死亡刺激后进行恢复培养，回收培养6天后的细胞，使用FITC-抗小鼠H-2Kd抗体(Biolegend公司制造)、PE-抗人CD19抗体(Biolegend公司制造)、Alexa647标记Her2-Tag2蛋白、并使用流式细胞仪(BD FACS AriaIII)对Her2抗原特异性B细胞进行了检测。将结果示于图2。
图中所示的数值表示在各区域内含有的细胞的比例(％)。
根据图2所示的未进行选择时的细胞比例和进行了选择时的细胞比例，将选择培养的选择效率(倍数)示于图3。
如图3所示，将选择工序时的细胞因子条件变更为专利文献1中所示的在IL-21不存在下或变更为IL-10细胞因子家族、IL-12细胞因子家族的结果是，确认了抗原特异性B细胞的选择效率提高。

Claims (14)

1.一种B细胞群的制备方法，该方法包括：
工序c：一边施加CD40及BAFF受体介导的刺激，一边在IL-21不存在下、IL-4不存在下、且在除了IL-21和IL-4以外的细胞因子的存在下与特定抗原一起培养包含B细胞的细胞群；以及
工序d：一边施加Fas介导的刺激，一边培养所述包含B细胞的细胞群，得到包含识别所述特定抗原的B细胞的B细胞群。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞因子为除了IL-21和IL-4以外的白细胞介素。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述细胞因子为选自IL-2、IL-10家族及IL-12家族中的至少1种细胞因子。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述细胞因子为选自IL-2、IL-20、IL-24及IL-27中的至少1种。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，在工序d中，一边施加Fas介导的刺激，一边在IL-21的存在下或在IL-21及IL-2的存在下培养所述包含B细胞的细胞群。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，在特定抗原不存在下进行工序d。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，在工序c之前还包括工序a：一边施加CD40及BAFF受体介导的刺激，一边在IL-4的存在下或在IL-4及IL-2的存在下培养包含B细胞的细胞群。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，在工序a和工序c之间还包括工序b：一边施加CD40及BAFF受体介导的刺激，一边在IL-21的存在下或在IL-21及IL-2的存在下培养包含B细胞的细胞群。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述工序c是使用提呈了CD40L、BAFF及特定抗原的载体来培养包含B细胞的细胞群的工序。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，提呈了CD40L、BAFF及特定抗原的载体是提呈了CD40L、BAFF及特定抗原的饲养细胞。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，所述工序d是使用提呈了CD40L、BAFF及FasL的载体来培养包含B细胞的细胞群的工序。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，提呈了CD40L、BAFF及FasL的载体是提呈了CD40L、BAFF及FasL的饲养细胞。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，所述B细胞为人B细胞。
14.一种单克隆抗体的制备方法，该方法包括如下工序：通过培养利用权利要求1～13中任一项所述的制备方法而得到的B细胞群来制造单克隆抗体。
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