WO2015190107A1 - ビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法、及びビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体 - Google Patents

ビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法、及びビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体 Download PDF

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vibrio parahemolyticus
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probe
gene
vibrio
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和輝 中島
隆明 山崎
聡史 古川
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Toyo Seikan Group Holdings Ltd
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Toyo Seikan Group Holdings Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a technique for detecting microorganisms such as food poisoning bacteria, and more particularly to a method for detecting Vibrio parahemolyticus and a carrier for detecting Vibrio parahemolyticus.
  • amplification target regions amplification target gene region, target
  • PCR polymerase chain reaction
  • a DNA fragment in the gene region is amplified and the size of the amplified product is analyzed by electrophoresis.
  • a DNA containing the gene by PCR using a primer capable of amplifying a heat-resistant hemolytic toxin gene (tdh) possessed by pathogenic Vibrio parahemolyticus.
  • Pathogenic Vibrio parahemolyticus is detected using a DNA chip on which a fragment is amplified and a probe that binds complementarily to the amplified product is immobilized.
  • toxin genes of pathogenic Vibrio parahemolyticus there are various types of toxin genes of pathogenic Vibrio parahemolyticus, and it is preferable to identify them and make them detectable.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and simultaneously and highly specifically detects Vibrio parahemolyticus including those having no pathogenicity and pathogenic Vibrio parahemolyticus causing food poisoning. It is an object of the present invention to provide a method for detecting Vibrio parahemolyticus that can be performed by sex, and a carrier for detecting Vibrio parahemolyticus.
  • the method for detecting Vibrio parahemolyticus comprises vibrio parahaemolyticus and vibrio parahemolyticus (including those that are pathogenic) simultaneously.
  • a method for detecting parahemolyticus wherein a genomic DNA extracted from a sample is used as a template and a DNA fragment containing a vibrio parahemolyticus virulence expression regulatory gene (toxR) and a thermostable hemolysin gene (tdh ) And a DNA fragment containing a thermostable hemolysin-like toxin gene (trh) are simultaneously amplified by multiplex PCR, and the presence or absence of each amplification product is detected, thereby causing pathogenic Vibrio in the sample.
  • ToxR vibrio parahemolyticus virulence expression regulatory gene
  • tdh thermostable hemolysin gene
  • trh thermostable hemolysin-like toxin gene
  • the carrier for detecting Vibrio parahemolyticus of the present invention is Vibrio parahemolyticus for simultaneously detecting pathogenic Vibrio parahemolyticus and Vibrio parahemolyticus (including pathogenic ones).
  • a scab detection carrier comprising at least one of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 7 to 10 selected from a pathogenic expression regulatory gene (toxR) of Vibrio parahemolyticus, At least one probe consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 11 to 15 selected from the heat-resistant hemolytic toxin gene (tdh) of the residue, and the heat-resistant hemolytic toxin-like toxin type 1 gene (trh1) of Vibrio parahemolyticus At least one probe consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 16 to 19 and Vibrio parahaemo At least one probe consisting Tikasu heat hemolysin similar toxin type 2 gene nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 20 or
  • ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, it becomes possible to detect simultaneously Vibrio parahemolyticus including what does not have pathogenicity, and pathogenic Vibrio parahemolyticus causing food poisoning with high specificity. .
  • thermostable hemolysin toxin-like toxin gene (trh) region in the method for detecting Vibrio parahemolyticus according to an embodiment of the present invention, and a vibrio according to an embodiment of the present invention
  • a probe selected from the thermostable hemolysin-like toxin type 1 gene (trh1) and a probe selected from the thermostable hemolysin-like toxin type 2 gene (trh2) in the carrier for detection of parahemolyticus (trh2) It is a figure which shows the detection result (fluorescence intensity) of Vibrio parahemolyticus using a probe.
  • the method for detecting Vibrio parahemolyticus according to the present embodiment is a method of vibrio parahemolyticus that simultaneously detects pathogenic Vibrio parahemolyticus and Vibrio parahemolyticus (including pathogenic ones).
  • a detection method using a genomic DNA extracted from a sample as a template, a DNA fragment containing a vibrio parahemolyticus pathogenic expression regulatory gene (toxR), a DNA fragment containing a thermostable hemolysin gene (tdh), , A DNA fragment containing a thermostable hemolysin-like toxin gene (trh), and simultaneously amplified by multiplex PCR, and detecting the presence or absence of each amplified product, thereby detecting pathogenic Vibrio parahemolyticus in the sample. The presence or absence and the presence or absence of Vibrio parahemolyticus are detected simultaneously.
  • toxR vibrio parahemolyticus pathogenic expression regulatory gene
  • tdh DNA fragment containing a thermostable hemolysin gene
  • trh thermostable hemolysin-like toxin gene
  • Vibrio parahaemolyticus is a Gram-negative and halophilic gonococci.
  • pathogenic Vibrio parahemolyticus Vibrio parahaemolyticus
  • non-pathogenic Vibrio parahemolyticus exists.
  • a pathogenic expression regulatory gene (toxR) commonly held in the genomic DNA of Vibrio parahemolyticus is amplified by PCR using the PCR method.
  • ToxR pathogenic expression regulatory gene
  • pathogenic Vibrio parahemolyticus includes a gene having a heat-resistant hemolytic toxin gene (tdh) and / or a heat-resistant hemolytic toxin-like toxin gene (trh) as a gene that produces a toxin.
  • tdh heat-resistant hemolytic toxin gene
  • trh heat-resistant hemolytic toxin-like toxin gene
  • FIG. 1 there are strains in which the state of possession of these toxin genes is known.
  • the heat-resistant hemolytic toxin-like toxin gene (trh) is classified into a heat-resistant hemolytic toxin-like toxin type 1 gene (trh1) and a heat-resistant hemolytic toxin-like toxin type 2 gene (trh2).
  • these strains are used to simultaneously detect three genes, toxR, tdh, and trh, and to further distinguish between trh1 and trh2.
  • the pathogenic expression regulation gene toxR
  • the heat-resistant hemolytic toxin gene tdh
  • the heat-resistant hemolytic toxin-like toxin gene trh
  • Vibrio parahemolyticus for Vibrio parahemolyticus, two types of indicators, hygiene indicator bacteria and food poisoning harmful bacteria, which could not be achieved by the conventional method, are obtained. It is possible to identify at the same time.
  • a primer set for amplifying the pathogenic expression regulatory gene (toxR) region of Vibrio parahemolyticus by PCR It is preferable to use a primer consisting of a base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (F: forward primer) and a primer consisting of a base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (R: reverse primer).
  • a primer set for amplifying the heat-resistant hemolytic venom gene (tdh) region of pathogenic Vibrio parahemolyticus by PCR
  • a primer (F: It is preferable to use a primer composed of a forward primer) and a primer (R: reverse primer) comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • a primer set for amplifying the heat-resistant hemolytic toxin-like toxin gene (trh) region of pathogenic Vibrio parahaemolyticus by PCR
  • a primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 (trh primer set) F: a forward primer) and a primer composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 (R: reverse primer) are preferably used.
  • the PCR reaction solution contains the above-described toxR primer set, tdh primer set, and trh primer set, and other components are general ones. Can be used. Specifically, a buffer solution, a nucleic acid synthesis substrate, a nucleic acid synthesizing enzyme such as Ex Taq, a labeling component such as Cy5, a sample DNA, and water containing water can be used. Then, a part of the genomic DNA in the sample is amplified by a nucleic acid amplification device such as a thermal cycler using such a PCR reaction solution. That is, when genomic DNA having a region to be amplified by the primer set is present in the sample, the region to be amplified is amplified.
  • Primers used in the method for detecting Vibrio parahemolyticus are not limited to the above base sequences, and one or several bases are deleted, substituted, or added in each base sequence. Things can be used. Moreover, what consists of a nucleic acid fragment which can be hybridized on stringent conditions with respect to the nucleic acid fragment which consists of a base sequence complementary to each base sequence can also be used.
  • Stringent conditions refer to conditions in which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • a DNA having high homology (with a homology of 90% or more, preferably 95% or more) with respect to the DNA comprising the sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 6 is determined from the sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • the conditions for hybridizing with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA to be obtained can be mentioned. Usually, it means a case where hybridization occurs at a temperature about 5 ° C. to about 30 ° C., preferably about 10 ° C. to about 25 ° C. lower than the melting temperature (Tm) of the complete hybrid.
  • Tm melting temperature
  • Electrophoresis can be performed by a general method such as agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, or microchip electrophoresis.
  • the PCR amplification product is dropped on the Vibrio parahemolyticus detection carrier (DNA chip) according to this embodiment, and the label of the amplification product hybridized with the probe immobilized on the carrier is detected. It is also preferable to detect the presence or absence of Vibrio parahemolyticus and pathogenic Vibrio parahemolyticus in the sample.
  • the detection of the label can be performed by using a general label detection device such as a fluorescence scanning device, for example, by measuring the fluorescence intensity of the amplification product using BIOSHOT (R) of Toyo Kohan Co., Ltd. Can do.
  • BIOSHOT BIOSHOT
  • the label is not limited to fluorescence, and other labels may be used.
  • the carrier for detecting Vibrio parahemolyticus is represented by SEQ ID NOs: 7 to 10 as probes (toxR probes) selected from the pathogenic expression regulatory gene (toxR) region of Vibrio parahemolyticus. It is preferable that at least one probe consisting of a base sequence is immobilized.
  • the Vibrio parahemolyticus detection carrier according to this embodiment is SEQ ID NO: 11 as a probe (tdh probe) selected from the heat-resistant hemolytic toxin gene (tdh) region of pathogenic Vibrio parahemolyticus. It is preferable that at least one of the probes having the base sequences shown in .about.15 is immobilized.
  • the carrier for detecting Vibrio parahemolyticus is selected from the thermostable hemolysin-like toxin type 1 gene in the thermostable hemolysin-like toxin gene (trh) region of pathogenic Vibrio parahemolyticus It is preferable that at least one of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 16 to 19 is immobilized as the probe (trh1 probe), and the heat-resistant hemolytic toxin-like toxin 2 in the same gene (trh) region As a probe selected from a type gene (trh2 probe), it is preferable to fix at least one of the probes consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 20 or 21.
  • Vibrio parahemolyticus detection carrier By configuring the Vibrio parahemolyticus detection carrier according to the present embodiment in such a configuration, together with Vibrio parahemolyticus (including pathogenic Vibrio parahemolyticus), pathogenic Vibrio parahaemolyticus It becomes possible to specifically detect lyticus simultaneously. It is also possible to identify and detect whether or not a pathogenic Vibrio parahaemolyticus has a heat-resistant hemolytic toxin gene (tdh) and a heat-resistant hemolytic toxin-like toxin gene (trh).
  • tdh heat-resistant hemolytic toxin gene
  • trh heat-resistant hemolytic toxin-like toxin gene
  • thermostable hemolysin-like toxin type 1 gene and the thermostable hemolysin-like toxin type 2 gene are not distinguished from each other by the size of the amplification product using a dedicated primer, but using the same primer. It is possible to reduce the number of primers in multiplex PCR by making each identifiable using a dedicated probe with high specificity after obtaining amplification products, which can improve accuracy and reduce costs. It has become.
  • the probe used in the Vibrio parahemolyticus detection carrier according to the present embodiment is not limited to the above base sequence, and one or several bases are deleted, substituted or added in each base sequence. Things can be used. Moreover, what consists of a nucleic acid fragment which can be hybridized on stringent conditions with respect to the nucleic acid fragment which consists of a base sequence complementary to each base sequence can also be used. Furthermore, probes having a base sequence complementary to these probes can also be used.
  • Vibrio parahemolyticus detection carrier specifically, a predetermined buffer solution is mixed with the PCR amplification product and dropped onto the carrier. Next, the carrier is allowed to stand at 45 ° C. for 1 hour, and then PCR amplification products and the like that have not been hybridized with a predetermined buffer are washed away from the carrier. Then, by detecting the label by applying the carrier to a label detection apparatus, pathogenic Vibrio parahemolyticus and Vibrio parahemolyticus (including pathogenic Vibrio parahemolyticus) exist in the sample. It can be detected at the same time.
  • the vibrio parahemolyticus including those having no pathogenicity It is possible to detect pathogenic Vibrio parahaemolyticus that causes food poisoning at the same time and with high specificity.
  • ⁇ Test 1 Verification of simultaneous amplification using three types of primer sets> DNA was extracted from these Vibrio parahemolyticus by a conventional method using seven types of Vibrio parahemolyticus strains known in FIG. These are all derived from the Osaka University Institute for Microbial Diseases. Next, using the toxR primer set, tdh primer set, and trh primer set shown in FIG. 2, for each strain, the respective amplification target regions can be simultaneously amplified by multiplex PCR, and whether or not the obtained amplification product can be detected. I verified. Specifically, it was performed as follows.
  • Vibrio parahemolyticus is abbreviated as Vibrio.
  • a thermal cycler ep gradient (Eppendorf Co., Ltd.) was used for gene amplification by PCR.
  • the reaction conditions are as follows. (1) 95 ° C for 2 minutes (2) 95 ° C for 10 seconds (DNA strand dissociation step) (3) 68 ° C. 30 seconds (annealing process) (4) 72 ° C. for 30 seconds (DNA synthesis step) (5) 40 cycles of 72 ° C 2 minutes (2) to (4)
  • the PCR reaction solution containing the PCR amplification product thus obtained was subjected to a microchip electrophoresis apparatus MultiNA (Shimadzu Corporation), and size analysis of the PCR amplification product was performed.
  • the result is shown in FIG.
  • amplification products (estimated size 319 bp) by the toxR primer set were detected for all seven types of strains.
  • the amplification product (estimated size 195 bp) by the tdh primer set is detected only for the strains (4), (5) and (6) having the tdh gene, and the amplification product (estimated size 274 bp) by the trh primer set is trh Only the strains (1), (2), (3) and (6) having the gene were detected.
  • each of these regions could be specifically and simultaneously detected by the toxR primer set, tdh primer set, and trh primer set in the method for detecting Vibrio parahemolyticus according to the present embodiment.
  • the Vibrio parahemolyticus detection method according to this embodiment it was confirmed that Vibrio parahemolyticus and pathogenic Vibrio parahemolyticus can be detected simultaneously.
  • ⁇ Test 2 Verification of discrimination between heat-resistant hemolytic toxin-like toxin type 1 and type 2 genes (trh1, trh2)>
  • the trh gene region was amplified by PCR for each strain using 10 ng / ⁇ l of each DNA extract of strains (1), (2), and (3) prepared in Test 1 and the trh primer set.
  • a PCR reaction solution was prepared with the following composition, and the PCR reaction solution containing the PCR amplification product was obtained in the same manner as in Test 1 for other points.
  • a heat-resistant hemolytic toxin-like toxin type 1 gene detection probe consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 16 to 19 shown in FIG. 5 and heat-resistant hemolysis consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 20 to 21 are shown in advance.
  • a DNA chip on which a probe for detecting a toxin-like toxin type 2 gene (trh2 probe) was immobilized was prepared.
  • a mixture of 4 ⁇ L of the PCR reaction solution and 2 ⁇ L of the hybridization buffer solution (3 ⁇ SSC / 0.3% SDS citrate-saline-sodium dodecyl sulfate) was dropped onto the DNA chip. And reacted at 45 ° C. for 1 hour.
  • the DNA chip is immersed in a washing solution (2 ⁇ SSC / 0.2% SDS solution, 2 ⁇ SSC solution in this order) at room temperature for washing, and a cover glass is placed on the fluorescence detector Bioshot (manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.) ) To detect the fluorescence in the spot area of each probe.
  • the label component (Cy5) of the amplification product hybridized with the probe was excited by laser light to emit light, and the amount of light was detected by a CCD camera mounted in the detector.
  • the light intensity was replaced with an electric signal and digitized to obtain fluorescence intensity.
  • This fluorescence intensity is an intensity index in the apparatus, and has a unit, and was calculated by correcting so that the background value becomes zero. The result is shown in FIG.
  • the strains (1) and (2) As shown in the figure, for the strains (1) and (2), a high fluorescence intensity was obtained with the trh1 detection probe, and a low fluorescence intensity was obtained with the trh2 detection probe.
  • the strain (1) and the strain (2) are trh1 gene-bearing bacteria among the pathogenic Vibrio parahemolyticus trh gene-bearing bacteria.
  • the strain (3) a high fluorescence intensity was obtained with the trh2 detection probe, and a relatively low fluorescence intensity was obtained with the trh1 detection probe. From this, it can be seen that the strain (3) is a trh2 gene-bearing bacterium among the pathogenic Vibrio parahemolyticus trh gene-bearing bacterium.
  • the Vibrio parahemolyticus detection carrier according to the present embodiment, by using the trh1 detection probe and the trh2 detection probe in combination, the trh gene possessed by the pathogenic Vibrio parahemolyticus It was found that when bacteria are included in the sample to be detected, trh1 gene-bearing bacteria and trh2 gene-bearing bacteria can be discriminated, and false negative determination for the trh gene can be avoided.
  • ⁇ Test 3 Verification of simultaneous detection by DNA chip> ToxR, tdh, trh in Vibrio parahemolyticus is detected by the carrier for detecting Vibrio parahemolyticus according to this embodiment in which a probe that can bind to a DNA fragment containing toxR, tdh, tr1, and trh2 genes is immobilized. It was verified whether the three types of genes could be specifically detected simultaneously. Specifically, a DNA chip on which each probe consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 to 21 shown in FIG. 5 was immobilized was prepared. Then, using 7 types of Vibrio parahemolyticus strains shown in FIG.
  • the toxR detection probes of SEQ ID NOs: 7 to 10 showed high fluorescence intensity for all seven types of Vibrio parahemolyticus strains.
  • the tdh detection probes of SEQ ID NOs: 11 to 15 show high fluorescence intensity only for the strains (4), (5) and (6) having the tdh gene, and the strains having no tdh gene (1 ), (2), (3), (7) did not show high fluorescence intensity.
  • the trh1 detection probes of SEQ ID NOs: 16 to 19 show high fluorescence intensity only for the strains (1), (2), and (6) that possess trh1, and the strains (3) and (4) that do not possess trh1 , (5) and (7) do not show high fluorescence intensity
  • the trh2 detection probes of SEQ ID NOs: 20 to 21 show high fluorescence intensity only for the strain (3) having trh2, and possess trh2.
  • the strains (1), (2), (4), (5), (6) and (7) which did not show no high fluorescence intensity.
  • the three types of gene regions of toxR, tdh, and trh in Vibrio parahemolyticus can be specifically and simultaneously detected. all right.
  • trh if only one of trh1 and trh2 is present in the sample, it is clear that it can be identified and that false negative determination can be prevented. became.
  • the present invention is not limited to the above embodiments and examples, and various modifications can be made within the scope of the present invention.
  • the PCR reaction solution may contain other components, or the Vibrio parahemolyticus detection carrier according to the present embodiment may have other than the above. It is possible to make appropriate changes such as adding additional probes and fixing them.
  • the present invention can be suitably used for detecting Vibrio parahemolyticus in food inspection, epidemiological environmental inspection, environmental inspection, clinical test, livestock hygiene, and the like.

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Abstract

病原性を持たないものを含むビブリオ・パラヘモリティカス（以下、ビブリオ）と、食中毒の原因となる病原性ビブリオ・パラヘモリティカス（以下、病原性ビブリオ）の検出を同時にかつ高い特異性で行うことを可能とする。病原性ビブリオ及びビブリオ（病原性のものを含む）を同時に検出するビブリオの検出方法であって、試料から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ビブリオの病原性発現調節遺伝子（toxR）を含むＤＮＡ断片と、耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）を含むＤＮＡ断片と、耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）を含むＤＮＡ断片と、をマルチプレックスＰＣＲにより同時に増幅させ、それぞれの増幅産物の有無を検出することによって、試料中における病原性ビブリオの有無及びビブリオの有無を同時に検出する。

Description

ビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法、及びビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体
　本発明は、食中毒菌などの微生物を検出するための技術に関し、特にビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法、及びビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体に関する。
　近年、食品や環境などの公衆衛生の分野における衛生水準の向上により、食中毒の発生には減少傾向が見られるものの、現在でもなお日本国内で毎年２万人以上が食中毒に罹患している。この中には、病原性ビブリオ・パラヘモリティカス（腸炎ビブリオ）を原因とするものも少なからず含まれており、その発生を防止するために、食中毒菌等の検査において、食品や環境中の病原性ビブリオ・パラヘモリティカスを精度高く検出することが重要になっている。
　病原性ビブリオ・パラヘモリティカスを検出する方法としては、例えば特許文献１に記載のように、所定のプライマーを用いて、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法により増幅対象領域（増幅対象遺伝子領域、標的遺伝子領域）のＤＮＡ断片を増幅し、その増幅産物のサイズを電気泳動法で分析することによって行う方法がある。
　また、本出願人による特許文献２に記載の発明では、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスが有する耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）を増幅可能なプライマーを用いて、ＰＣＲ法により当該遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅し、その増幅産物と相補的に結合するプローブを固定化したＤＮＡチップを用いて、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの検出を行っている。
特表２００８－５３８０７５号公報 国際公開第２０１１／１４２１１９号公報
　ところで、公衆衛生の分野においては、食中毒の原因となる病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの有無の検査のみならず、衛生学的指標として、病原性に拘わらず、ビブリオ・パラヘモリティカスの有無を同時に検査できることが望ましい。
　しかしながら、上述した従来の技術では、病原性を持たないものを含むビブリオ・パラヘモリティカスを、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスと同時に検出することはできなかった。
　また、ビブリオ・パラヘモリティカスの検査を行う実際の現場においては、検査試料に食物の遺伝子など様々なＤＮＡが混入することから、特異性に優れた検出精度が求められていた。
　さらに、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの毒素遺伝子には種々のものが存在しているところ、これらを識別して検出可能にすることが好ましい。
　本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、病原性を持たないものを含むビブリオ・パラヘモリティカスと、食中毒の原因となる病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの検出を同時にかつ高い特異性で行うことが可能なビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法、及びビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体の提供を目的とする。
　上記目的を達成するために、本発明のビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法は、病原性ビブリオ・パラヘモリティカス及びビブリオ・パラヘモリティカス（病原性のものを含む）を同時に検出するビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法であって、試料から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ビブリオ・パラヘモリティカスの病原性発現調節遺伝子（toxR）を含むＤＮＡ断片と、耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）を含むＤＮＡ断片と、耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）を含むＤＮＡ断片と、をマルチプレックスＰＣＲにより同時に増幅させ、それぞれの増幅産物の有無を検出することによって、試料中における病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの有無及びビブリオ・パラヘモリティカスの有無を同時に検出する方法としてある。
　また、本発明のビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体は、病原性ビブリオ・パラヘモリティカス及びビブリオ・パラヘモリティカス（病原性のものを含む）を同時に検出するためのビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体であって、ビブリオ・パラヘモリティカスの病原性発現調節遺伝子（toxR）から選択された配列番号７～１０に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）から選択された配列番号１１～１５に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒類似毒素1型遺伝子（trh1）から選択された配列番号１６～１９に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒類似毒素２型遺伝子（trh2）から選択された配列番号２０又は２１に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、を固定化した構成としてある。
　本発明によれば、病原性を持たないものを含むビブリオ・パラヘモリティカスと、食中毒の原因となる病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの検出を同時にかつ高い特異性で行うことが可能となる。
本発明の実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法及びビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体の試験１～３で用いた菌株の毒素遺伝子保有状況を示す図である。 本発明の実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法において用いられる３種類のプライマーセットの塩基配列（プライマー配列）を示す図である。 本発明の実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法におけるマルチプレックスＰＣＲによる増幅産物の電気泳動の結果を示す図である。 本発明の実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法における耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）領域を増幅するためのプライマーセット（trhプライマーセット）と、本発明の実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体における耐熱性溶血毒類似毒素１型遺伝子（trh1）から選択されたプローブ（trh1プローブ）及び耐熱性溶血毒類似毒素２型遺伝子（trh2）から選択されたプローブ（trh2プローブ）を用いたビブリオ・パラヘモリティカスの検出結果（蛍光強度）を示す図である。 本発明の実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体におけるプローブの塩基配列（プローブ配列）を示す図である。 本発明の実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法及びビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体における各プローブによるビブリオ・パラヘモリティカスの検出結果（蛍光強度）を示す図である。
　以下、本発明の実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法、及びビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体について、詳細に説明する。
　本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法は、病原性ビブリオ・パラヘモリティカス及びビブリオ・パラヘモリティカス（病原性のものを含む）を同時に検出するビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法であって、試料から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ビブリオ・パラヘモリティカスの病原性発現調節遺伝子（toxR）を含むＤＮＡ断片と、耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）を含むＤＮＡ断片と、耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）を含むＤＮＡ断片と、をマルチプレックスＰＣＲにより同時に増幅させ、それぞれの増幅産物の有無を検出することによって、試料中における病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの有無及びビブリオ・パラヘモリティカスの有無を同時に検出することを特徴とする。
　ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio　parahaemolyticus）は、グラム陰性で好塩性の桿菌である。主として海水中に生息し、ヒトに感染すると、食中毒を発症させる病原性ビブリオ・パラヘモリティカス（腸炎ビブリオ）が存在する。一方、非病原性ビブリオ・パラヘモリティカスも存在している。しかしながら、公衆衛生の分野においては、衛生学的指標として、このような病原性の有無に拘わらず、ビブリオ・パラヘモリティカスを幅広く検出可能にすることが好ましい。
　そこで、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法では、ビブリオ・パラヘモリティカスのゲノムＤＮＡに共通して保有される病原性発現調節遺伝子（toxR）を増幅対象領域としてＰＣＲ法により増幅し、その増幅産物を検出することによって、試料中における、病原性のあるものとないものとを含むビブリオ・パラヘモリティカスの有無を検出可能にしている。
　また、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスには、毒素を産生する遺伝子として、耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）及び／又は耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）を有するものが存在する。
　具体的には、例えば図１に示すように、これらの毒素遺伝子の保有状況が分っている菌株が存在している。さらに、耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）は、耐熱性溶血毒類似毒素１型遺伝子（trh1）と耐熱性溶血毒類似毒素２型遺伝子（trh2）に区別される。後述する実施例では、これらの菌株を使用して、toxR、tdh、及びtrhの３つの遺伝子を同時に検出すると共に、さらにtrh1とtrh2とを識別可能にしている。
　本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法では、上記の病原性発現調節遺伝子（toxR）と、耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）と、耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）とを増幅対象領域としてＰＣＲ法により同時に増幅し、その増幅産物を検出することによって、試料中における、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスを含むビブリオ・パラヘモリティカスの有無と、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの有無とを同時に検出可能にしている。
　これによって、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法によれば、ビブリオ・パラヘモリティカスについて、従来の方法ではなし得なかった衛生指標菌及び食中毒危害菌の２種類の指標を同時に識別することが可能となっている。
　本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法において、図２に示すように、ビブリオ・パラヘモリティカスの病原性発現調節遺伝子（toxR）領域をＰＣＲ法により増幅するためのプライマーセット（toxRプライマーセット）として、配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー（Ｆ：フォワードプライマー）と、配列番号２に示す塩基配列からなるプライマー（Ｒ：リバースプライマー）とからなるものを用いることが好ましい。
　また、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）領域をＰＣＲ法により増幅するためのプライマーセット（tdhプライマーセット）として、配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー（Ｆ：フォワードプライマー）と、配列番号４に示す塩基配列からなるプライマー（Ｒ：リバースプライマー）とからなるものを用いることが好ましい。
　また、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）領域をＰＣＲ法により増幅するためのプライマーセット（trhプライマーセット）として、配列番号５に示す塩基配列からなるプライマー（Ｆ：フォワードプライマー）と、配列番号６に示す塩基配列からなるプライマー（Ｒ：リバースプライマー）とからなるものを用いることが好ましい。
　本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法において、ＰＣＲ反応液は、上記のtoxRプライマーセット、tdhプライマーセット、及びtrhプライマーセットを含有し、それ以外の成分には、一般的なものを用いることができる。具体的には、緩衝液、核酸合成基質、Ex　Taq等の核酸合成酵素、Cy5等の標識成分、試料のＤＮＡ、及び水を含むものなどを用いることができる。
　そして、このようなＰＣＲ反応液を用いてサーマルサイクラーなどの核酸増幅装置により、試料中のゲノムＤＮＡの一部が増幅される。すなわち、上記プライマーセットによる増幅対象領域を有するゲノムＤＮＡが試料中に存在している場合、その対象領域が増幅される。
　本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法において用いるプライマーは、上記の塩基配列に限定されるものではなく、それぞれの塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたものを用いることができる。また、それぞれの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるものを用いることもできる。
　ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１～６で表される配列からなるＤＮＡに対し高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１～６で表される配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃～約３０℃、好ましくは約１０℃～約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
　次に、ＰＣＲ法により得られた増幅産物（ＰＣＲ増幅産物）を用いて、例えば電気泳動を行うことにより、本実施形態における上記各プライマーセットによる増幅産物が得られているか否かを確認して、試料中におけるビブリオ・パラヘモリティカス及び病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの有無を検出することが好ましい。電気泳動は、アガロースゲル電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動、マイクロチップ電気泳動など一般的な方法により行うことができる。
　また、ＰＣＲ増幅産物を本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体上（ＤＮＡチップ）に滴下して、当該担体に固定化されたプローブにハイブリダイズした増幅産物の標識を検出することにより、試料中におけるビブリオ・パラヘモリティカス及び病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの有無を検出することも好ましい。
　標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴ（Ｒ）を用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。なお、標識は、蛍光に限定されず、その他のものを用いてもよい。
　本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体は、ビブリオ・パラヘモリティカスの病原性発現調節遺伝子（toxR）領域から選択されたプローブ（toxRプローブ）として、配列番号７～１０に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブを固定化したものとすることが好ましい。
　また、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体は、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）領域から選択されたプローブ（tdhプローブ）として、配列番号１１～１５に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブを固定化したものとすることが好ましい。
　さらに、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体は、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）領域における耐熱性溶血毒類似毒素１型遺伝子から選択されたプローブ（trh1プローブ）として、配列番号１６～１９に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブを固定化したものとすることが好ましく、同遺伝子（trh）領域における耐熱性溶血毒類似毒素２型遺伝子から選択されたプローブ（trh2プローブ）として、配列番号２０又は２１に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブを固定化したものとすることが好ましい。
　本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体をこのような構成にすることによって、ビブリオ・パラヘモリティカス（病原性ビブリオ・パラヘモリティカスを含む）と共に、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスを同時に特異的に検出することが可能になる。また、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスとして、耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）と耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）を有するか否かを識別して検出することも可能となる。さらに、耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）として、耐熱性溶血毒類似毒素１型遺伝子と耐熱性溶血毒類似毒素２型遺伝子を識別して検出することも可能となる。
　このように、耐熱性溶血毒類似毒素１型遺伝子と耐熱性溶血毒類似毒素２型遺伝子とを、それぞれ専用のプライマーを用いて増幅産物のサイズで識別するのではなく、同一のプライマーを用いて増幅産物を得た後に、それぞれ専用の特異性の高いプローブを用いて識別可能にすることによって、マルチプレックスＰＣＲにおけるプライマー数を減らすことができ、精度の向上とコストの低減を実現することが可能になっている。
　本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体において用いるプローブも、上記の塩基配列に限定されるものではなく、それぞれの塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたものを用いることができる。また、それぞれの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるものを用いることもできる。さらに、これらのようなプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブを用いることもできる。
　このようなビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体を用いて、具体的には、ＰＣＲ増幅産物に所定の緩衝液を混合し、当該担体に滴下する。次に、当該担体を４５℃で１時間静置し、その後、所定の緩衝液によりハイブリダイズしなかったＰＣＲ増幅産物等を当該担体から洗い流す。そして、当該担体を標識検出装置にかけて標識の検出を行うことにより、試料中に病原性ビブリオ・パラヘモリティカス及びビブリオ・パラヘモリティカス（病原性ビブリオ・パラヘモリティカスを含む）が存在するか否かを同時に検出することができる。
　以上説明したように、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法、及びビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体によれば、病原性を持たないものを含むビブリオ・パラヘモリティカスと、食中毒の原因となる病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの検出を同時にかつ高い特異性で行うことが可能である。
＜試験１：３種類のプライマーセットを用いた同時増幅の検証＞
　図１に示す毒素遺伝子の保有状況が既知の７種類のビブリオ・パラヘモリティカスの菌株を用いて、これらのビブリオ・パラヘモリティカスから常法によりＤＮＡを抽出した。これらは、いずれも大阪大学微生物病研究所からの分譲由来のものである。
　次いで、図２に示すtoxRプライマーセット、tdhプライマーセット、及びtrhプライマーセットを用いて、菌株毎に、それぞれの増幅対象領域をマルチプレックスＰＣＲにより同時に増幅し、得られた増幅産物を検出できるか否かを検証した。具体的には、以下のように行った。
　上記７種類のビブリオ・パラヘモリティカスの菌株を、それぞれ１％塩化ナトリウム添加トリプティックソイブロス（日本ＢＤ製）に接種して、３７℃で一晩培養を行ったのち、培養液をそれぞれ１ｍＬずつ回収し、５０００×ｇで、１０分間の遠心分離を行った。
　次に、上清を廃棄し、得られた沈殿に、２０ｍｇ／ｍＬ濃度のリゾチーム溶液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０／２ｍＭ　ＥＤＴＡ，１．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）を加えて、３７℃で３０分間溶菌処理を行った。さらに、ＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を用いて、カラム精製を行うことにより、ＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液を１０ｐｇ／μＬ濃度に調製したものをＰＣＲにおいて使用する試料とした。
　次に、ＰＣＲ反応液を以下の組成で調製した。プライマーはシグマアルドリッチジャパン合同会社に合成委託し、それ以外の試薬はタカラバイオ株式会社製のものを使用した。以下の組成において、ビブリオ・パラヘモリティカスをビブリオと略称している。
・緩衝液（10×Ex　Taq　buffer）　　　　　　　　　　　　　(2.0μl）
・核酸合成基質（dNTP　Mixture）　　　　　　　　　　　　 （1.6μl）
・ビブリオtoxR増幅用Ｆプライマー　　　　　　　　　　　　(0.2μl）
・ビブリオtoxR増幅用Ｒプライマー（5’末端Cy5修飾）　　（0.2μl）
・ビブリオtdh増幅用Ｆプライマー　　　　　　　　　　　　 (0.2μl）
・ビブリオtdh増幅用Ｒプライマー（5’末端Cy5修飾）　　　(0.2μl）
・ビブリオtrh増幅用Ｆプライマー　　　　　　　　　　　　 (0.2μl）
・ビブリオtrh増幅用Ｒプライマー（5’末端Cy5修飾）　　　(0.2μl）
・TaKaRa　Ex　Taq　Hot　Start　Version　　　　　　　　　（0.2μl）
・試料のＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（1.0μl）
・滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（14.0μl）
（全量　20μl）
　ＰＣＲによる遺伝子の増幅には、サーマルサイクラーｅｐグラジエント（エッペンドルフ株式会社）を使用した。反応条件は、以下の通りである。
（１）９５℃　２分
（２）９５℃　１０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃　３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃　３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃　２分
（２）～（４）を４０サイクル
　次に、このようにして得られたＰＣＲ増幅産物を含むＰＣＲ反応液をマイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡ（株式会社島津製作所）に供し、ＰＣＲ増幅産物のサイズ分析を行った。その結果を図３に示す。
　同図に示すように、電気泳動の結果、toxRプライマーセットによる増幅産物（推定サイズ３１９ｂｐ）は、７種類の菌株の全てについて検出された。
　一方、tdhプライマーセットによる増幅産物（推定サイズ１９５ｂｐ）は、tdh遺伝子を有する菌株(4)、(5)、(6)についてのみ検出され、trhプライマーセットによる増幅産物（推定サイズ２７４ｂｐ）は、trh遺伝子を有する菌株(1)、(2)、(3)、(6)についてのみ検出された。
　以上のことから、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法におけるtoxRプライマーセット、tdhプライマーセット、及びtrhプライマーセットによって、これらの領域をそれぞれ特異的に同時に検出できたことがわかる。このように、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法によれば、ビブリオ・パラヘモリティカスと病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの検出を同時に行えることが確認された。
＜試験２：耐熱性溶血毒類似毒素１型及び２型遺伝子（trh1,trh2）の識別の検証＞
　試験１で調製した菌株(1)、(2)、(3)の各ＤＮＡ抽出液１０ｎｇ／μｌとtrhプライマーセットを用いて、菌株毎に、ＰＣＲによりtrh遺伝子領域の増幅を行った。ＰＣＲ反応液は以下の組成で調製し、その他の点については試験１と同様にして、ＰＣＲ増幅産物を含むＰＣＲ反応液を得た。
・緩衝液（10×Ex　Taq　buffer）　　　　　　　　　　　　(2.0μl）
・核酸合成基質（dNTP　Mixture）　　　　　　　　　　　 （1.6μl）
・ビブリオtrh増幅用Ｆプライマー　　　　　　　　　　　 (0.2μl）
・ビブリオtrh増幅用Ｒプライマー（5’末端Cy5修飾）　 （0.2μl）
・TaKaRa　Ex　Taq　Hot　Start　Version　　　　　　　　（0.2μl）
・試料のＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（1.0μl）
・滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（14.8μl）
（全量　20μl）
　また、予め、図５に示す配列番号１６～１９の塩基配列からなる耐熱性溶血毒類似毒素１型遺伝子検出用のプローブ（trh1プローブ）と、配列番号２０～２１の塩基配列からなる耐熱性溶血毒類似毒素２型遺伝子検出用のプローブ（trh2プローブ）を固定化したＤＮＡチップを作製した。そして、菌株毎に、ＰＣＲ反応液４μＬとハイブリダイゼーション用の緩衝液２μＬ（3×SSC／0.3%SDS　クエン酸－生理食塩水－ドデシル硫酸ナトリウム）を混合したものを、上記ＤＮＡチップに滴下して、４５℃で１時間反応させた。
　反応後、ＤＮＡチップを室温下で洗浄液（2×SSC／0.2%SDS溶液、2×SSC溶液の順に）に浸して洗浄を行い、カバーガラスを載せて蛍光検出器Ｂｉｏｓｈｏｔ(東洋鋼鈑株式会社製)により各プローブのスポット領域の蛍光を検出した。
　具体的には、プローブにハイブリダイズした増幅産物の標識成分（Cy5）をレーザー光により励起して発光させ、その光量を検出器内に取り付けたＣＣＤカメラにより検出した。また、光量を電気信号に置換して数値化し、蛍光強度を得た。この蛍光強度は、当該装置での強度指標であり、単位はなく、バックグラウンドの数値が０になるように補正して算出した。その結果を図４に示す。
　同図に示すように、菌株(1)、菌株(2)については、trh1検出用プローブでは高い蛍光強度が得られ、trh2検出用プローブでは低い蛍光強度しか得られなかった。このことから、菌株(1)、菌株(2)は、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスのtrh遺伝子保有菌のうち、trh1遺伝子保有菌であることがわかる。
　一方、菌株(3)については、trh2検出用プローブでは高い蛍光強度が得られ、trh1検出用プローブでは比較的低い蛍光強度しか得られなかった。このことから、菌株(3)は、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスのtrh遺伝子保有菌のうち、trh2遺伝子保有菌であることがわかる。
　以上のことから、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体によれば、trh1検出用プローブとtrh2検出用プローブを併用することで、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスのtrh遺伝子保有菌が検出対象の試料に含まれている場合に、trh1遺伝子保有菌とtrh2遺伝子保有菌を識別できると共に、trh遺伝子についての偽陰性の判定を回避できることがわかった。
＜試験３：ＤＮＡチップによる同時検出の検証＞
　toxR、tdh、tr1、及びtrh2遺伝子を含むＤＮＡ断片と結合可能なプローブを固定化した本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体によって、ビブリオ・パラヘモリティカスにおけるtoxR、tdh、trhの３種類の遺伝子を、同時に特異的に検出できるか否かを検証した。
　具体的には、図５に示す配列番号７～２１の塩基配列からなる各プローブを固定化したＤＮＡチップを作製した。
　そして、図１に示す７種類のビブリオ・パラヘモリティカスの菌株を用いて、菌株毎に、試験１と同様にして得られたＰＣＲ反応液４μＬと、ハイブリダイゼーション用の緩衝液２μＬ（3×SSC／0.3%SDS　クエン酸－生理食塩水－ドデシル硫酸ナトリウム）を混合したものを、このＤＮＡチップに滴下して、４５℃で１時間反応させた。
　反応後、試験２と同様に、ＤＮＡチップを室温下で洗浄液（2×SSC／0.2%SDS溶液、2×SSC溶液の順に）に浸して洗浄を行い、カバーガラスを載せて蛍光検出器Ｂｉｏｓｈｏｔ(東洋鋼鈑株式会社製)により各プローブのスポット領域の蛍光を検出した。その結果を図６に示す。
　同図に示すように、配列番号７～１０のtoxR検出用プローブでは、７種類全てのビブリオ・パラヘモリティカスの菌株について、高い蛍光強度を示した。
　これに対して、配列番号１１～１５のtdh検出用プローブでは、tdh遺伝子を保有する菌株(4)、(5)、(6)のみについて高い蛍光強度を示し、tdh遺伝子を保有しない菌株(1)、(2)、(3)、(7)については、高い蛍光強度を示さなかった。
　また、配列番号１６～１９のtrh1検出用プローブでは、trh1を保有する菌株(1)、(2)、(6)のみについて高い蛍光強度を示し、trh1を保有しない菌株(3)、(4)、(5)、(7)については、高い蛍光強度を示さず、さらに配列番号２０～２１のtrh2検出用プローブでは、trh2を保有する菌株(3)のみについて高い蛍光強度を示し、trh2を保有しない菌株(1)、(2)、(4)、(5)、(6)、(7)については、高い蛍光強度を示さなかった。
　以上のことから、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体によれば、ビブリオ・パラヘモリティカスにおけるtoxR、tdh、trhの３種類の遺伝子領域を、同時に特異的に検出できることがわかった。特に、trhについては、trh1とtrh2のいずれか一方のタイプのもののみが試料中に存在している場合には、そのいずれであるかを識別できると共に、偽陰性の判定を防止できることが明らかとなった。
　本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能である。例えば、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法において、ＰＣＲ反応液にその他の成分を含有させたり、あるいは本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体に、上記以外のプローブをさらに追加して固定化したりするなど適宜変更することが可能である。
　本発明は、食品検査、疫学的環境検査、環境検査、臨床試験、及び家畜衛生等において、ビブリオ・パラヘモリティカスを検出する場合に好適に利用することが可能である。

Claims (6)

  1. 　病原性ビブリオ・パラヘモリティカス及びビブリオ・パラヘモリティカス（病原性のものを含む）を同時に検出するビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法であって、
    　試料から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ビブリオ・パラヘモリティカスの病原性発現調節遺伝子（toxR）を含むＤＮＡ断片と、耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）を含むＤＮＡ断片と、耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）を含むＤＮＡ断片と、をマルチプレックスＰＣＲにより同時に増幅させ、それぞれの増幅産物の有無を検出することによって、試料中における病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの有無及びビブリオ・パラヘモリティカスの有無を同時に検出するビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法。
  2. 　前記toxRを含むＤＮＡ断片を増幅して得られた増幅産物と相補的に結合するプローブ、前記tdhを含むＤＮＡ断片を増幅して得られた増幅産物と相補的に結合するプローブ、及び前記trhを含むＤＮＡ断片を増幅して得られた増幅産物と相補的に結合するプローブを固定化したビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体を用いて、前記それぞれの増幅産物を同時に検出する
    　ことを特徴とする請求項１記載のビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法。
  3. 　前記toxRを含むＤＮＡ断片を増幅するための配列番号１に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットと、
    　前記tdhを含むＤＮＡ断片を増幅するための配列番号３に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットと、
    　前記trhを含むＤＮＡ断片を増幅するための配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットと、を含むＰＣＲ反応液を用いて、前記マルチプレックスＰＣＲを行い、
    　前記toxRから選択された配列番号７～１０に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、
    　前記tdhから選択された配列番号１１～１５に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、
    　前記trhにおける耐熱性溶血毒類似毒素1型遺伝子（trh1）から選択された配列番号１６～１９に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、
    　前記trhにおける耐熱性溶血毒類似毒素２型遺伝子（trh2）から選択された配列番号２０又は２１に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、を固定化したビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体を用いて、前記それぞれの増幅産物の有無の検出を行う
    　ことを特徴とする請求項１又は２記載のビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法。
  4. 　前記各遺伝子から選択された少なくともいずれかのプローブが、以下の（１）～（３）のいずれかであることを特徴とする請求項３記載のビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法。
    （１）配列番号に示す塩基配列において、１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
    （２）配列番号に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
    （３）（１）又は（２）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
  5. 　病原性ビブリオ・パラヘモリティカス及びビブリオ・パラヘモリティカス（病原性のものを含む）を同時に検出するためのビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体であって、
    　ビブリオ・パラヘモリティカスの病原性発現調節遺伝子（toxR）から選択された配列番号７～１０に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、
    　ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）から選択された配列番号１１～１５に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、
    　ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒類似毒素1型遺伝子（trh1）から選択された配列番号１６～１９に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、
    　ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒類似毒素２型遺伝子（trh2）から選択された配列番号２０又は２１に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、を固定化したことを特徴とするビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体。
  6. 　前記各遺伝子から選択された少なくともいずれかのプローブが、以下の（１）～（３）のいずれかであることを特徴とする請求項５記載のビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体。
    （１）配列番号に示す塩基配列において、１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
    （２）配列番号に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
    （３）（１）又は（２）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107988342A (zh) * 2018-01-03 2018-05-04 北京毅新博创生物科技有限公司 质谱鉴定副溶血性弧菌分型的方法及产品
CN108103171A (zh) * 2018-01-03 2018-06-01 北京毅新博创生物科技有限公司 副溶血性弧菌指纹图谱库的制备方法
RU2668805C1 (ru) * 2017-11-27 2018-10-02 Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Штамм Vibrio parahaemolyticus, используемый в качестве продуцента прямого термостабильного гемолизина (TDH)
CN111876499A (zh) * 2020-06-24 2020-11-03 河北农业大学 副溶血性弧菌的检测的引物、试剂盒及检测方法
CN112239789A (zh) * 2020-11-13 2021-01-19 宁波大学 一种能同时检测副溶血弧菌4个毒力基因的引物以及试剂盒
WO2022095922A1 (en) * 2020-11-05 2022-05-12 Becton, Dickinson And Company Rapid identification and typing of vibrio parahaemolyticus
CN116064851A (zh) * 2022-07-29 2023-05-05 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所） 检测副溶血性弧菌的引物和探针以及试剂盒、应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011142119A1 (ja) * 2010-05-12 2011-11-17 東洋製罐株式会社 食中毒菌検出用担体、及び食中毒菌の検出方法
CN102816842A (zh) * 2012-07-25 2012-12-12 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 副溶血性弧菌多重pcr-dhplc检测引物、试剂盒和检测方法
CN103773858A (zh) * 2014-01-09 2014-05-07 嘉兴市疾病预防控制中心 副溶血性弧菌三重实时荧光pcr检测试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011142119A1 (ja) * 2010-05-12 2011-11-17 東洋製罐株式会社 食中毒菌検出用担体、及び食中毒菌の検出方法
CN102816842A (zh) * 2012-07-25 2012-12-12 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 副溶血性弧菌多重pcr-dhplc检测引物、试剂盒和检测方法
CN103773858A (zh) * 2014-01-09 2014-05-07 嘉兴市疾病预防控制中心 副溶血性弧菌三重实时荧光pcr检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CARIANI, A. ET AL.: "Detection and characterization of pathogenic vibrios in shellfish by a Ligation Detection Reaction- Universal Array approach", INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY, vol. 153, no. 3, 20 November 2011 (2011-11-20), pages 474 - 482, XP028885237 *
HE, P. ET AL.: "Multiplex real-time PCR assay for detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus strains", MOLECULAR AND CELLULAR PROBES, vol. 28, no. 5-6, 9 June 2014 (2014-06-09), pages 246 - 250, XP055242130 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2668805C1 (ru) * 2017-11-27 2018-10-02 Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Штамм Vibrio parahaemolyticus, используемый в качестве продуцента прямого термостабильного гемолизина (TDH)
CN107988342A (zh) * 2018-01-03 2018-05-04 北京毅新博创生物科技有限公司 质谱鉴定副溶血性弧菌分型的方法及产品
CN108103171A (zh) * 2018-01-03 2018-06-01 北京毅新博创生物科技有限公司 副溶血性弧菌指纹图谱库的制备方法
CN107988342B (zh) * 2018-01-03 2021-04-27 北京毅新博创生物科技有限公司 质谱鉴定副溶血性弧菌分型的方法及产品
CN108103171B (zh) * 2018-01-03 2021-05-21 北京毅新博创生物科技有限公司 副溶血性弧菌指纹图谱库的制备方法
CN111876499A (zh) * 2020-06-24 2020-11-03 河北农业大学 副溶血性弧菌的检测的引物、试剂盒及检测方法
WO2022095922A1 (en) * 2020-11-05 2022-05-12 Becton, Dickinson And Company Rapid identification and typing of vibrio parahaemolyticus
JP2023547535A (ja) * 2020-11-05 2023-11-10 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー ビブリオ・パラヘモリティクスの迅速な同定及び分類
CN112239789A (zh) * 2020-11-13 2021-01-19 宁波大学 一种能同时检测副溶血弧菌4个毒力基因的引物以及试剂盒
CN116064851A (zh) * 2022-07-29 2023-05-05 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所） 检测副溶血性弧菌的引物和探针以及试剂盒、应用

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