WO2015166128A1 - Método para diagnosticar y monitorizar la presencia de cáncer en un sujeto humano. - Google Patents

Método para diagnosticar y monitorizar la presencia de cáncer en un sujeto humano. Download PDF

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Manuel Vicente Salinas Martín
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    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Definitions

  • the present invention is within the field of medicine, pharmacy and molecular biology, and more specifically in the field of oncology. Specifically, it is related to a method to diagnose the presence of a cancer, monitor the progression of a cancer or its response to treatment in a human subject, as well as to the kit or device that comprises the elements necessary to carry out said method and its use.
  • NK1 receptors Neurokinin 1 receptors or neuropeptide receptors of Substance P and tachykinins
  • NK1 receptors are receptors of the type of receptors coupled to protein G.
  • NK1 receptor is overexpressed in tumor cells and that the use of various antagonists thereof can inhibit cell proliferation (Singh et al., 2000; Bigioni et al., 2005) and more specifically, of lung carcinoma cells (Orosz et al., 1995; Bunn et al., 1994; Mu ⁇ oz et al., 2012), brain tumors (Palma et al., 2000), enterochromaffin cell tumors (patent EP 773026 -Pfizer- ), prosthetic carcinomas (WO 2001001922), colon and stomach carcinoma (Rosso et al., 2008) or melanoma (Mu ⁇ oz et al., 2010).
  • Patent ES 2246687 claims the use of non-peptide antagonists of NK1 receptors in the preparation of a pharmaceutical composition for the production of apoptosis in mammalian cancer tumor cells.
  • Spanish patent application P201101311 (PCT / ES2012 / 070865) claims the use of peritumoral microenvironment modifying agents, in particular antagonists of NK1 receptors, for the treatment of cancer.
  • patent application WO2012020162 describes the use of antibodies or fragments thereof, against NK1, NK2 and / or NK3 receptors, useful in the treatment of cancer.
  • the TAC1R gene is the gene that codes for the N K1 receptor. It has been described that in the cells that make up the tissues the NK1 receptor has two forms: a long form containing 407 amino acids and a short (truncated) form containing 31 1 amino acids in which said receptor lacks its cytoplasmic c-terminal end (Kage et al., 1993; Guillespie et al., 201 1). Both forms are the result of a splicing variant of the TAC1R gene that encodes the NK1 receptor.
  • This truncated form of the NK1 receptor is present in cancerous tumor cells (Guillespie et al., 201 1). Spanish patent P201330174 claims a method that includes the detection of this truncated form in tumor tissue to be used to predict the response of these tumors to treatment with NK1 receptor antagonists.
  • That NK1 receptors are widely spread in the body of the human being.
  • non-peptide antagonists of the NK1 receptor may be useful in the treatment of cancerous tumors, by inducing death in tumor cells by apoptosis (ES 2246687), modification of the tumor microenvironment (PCT / ES2012 / 070865) or by using antibodies or fragments thereof, against these receptors (WO2012020162).
  • That tumor cells may have a short or truncated form of the N K1 receptor.
  • NK1 receptor antagonists P201330174
  • a first aspect of the present invention relates to the use of the short (or truncated) form of the NK1 receptor, or of the mRNA encoding it, for:
  • the short (or truncated) form of the NK1 receptor, and / or the mRNA encoding it is detected in blood, and even more preferably in the blood plasma.
  • the diagnosis is an early diagnosis.
  • This report means early diagnosis of cancer disease or cancer, when other symptoms or signs of said disease have not yet been revealed, or these symptoms or signs are neither specific nor sufficient for the diagnosis of the disease.
  • the diagnosis may be complementary to other tests, such as, but not limited to, clinical, exploratory, radiological, biochemical (blood or other body fluids) and / or pathological data.
  • the cancer treatment of which the individual's response is predicted is a treatment with N K1 receptor antagonists.
  • diagnosis may be complementary to other tests, such as, but not limited to, clinical, exploratory, radiological, biochemical (blood or other body fluids) and / or pathological data.
  • a second aspect of the invention relates to an in vitro method of obtaining useful data for diagnosing an individual from cancer, from now on first method of the invention, comprising detecting the expression levels of the short (or truncated) form of the NK1 receptor, or of the mRNA encoding it, in a biological sample isolated from said individual.
  • the first method of the invention further comprises detecting levels of NK1 receptor expression or levels of mRNA encoding it in a biological sample of the individual.
  • the isolated biological sample is blood, and even more preferably, the biological sample is the blood plasma of said individual.
  • the first method of the invention comprises measuring the relationship between the levels of the whole and truncated form of the NK1 receptor and / or the mRNA encoding it.
  • a third aspect of the invention relates to an in vitro method for diagnosing cancer of an individual, hereafter referred to as the second method of the invention, which comprises:
  • NK1 or the mRNA that encodes it, in the biological sample from step (a), and c) assign said individual to the group of individuals suffering from cancer when the short (or truncated) form of the NK1 receptor or its mRNA has a superior expression , or overexpression, with respect to a reference sample.
  • the first method of the invention further comprises detecting levels of NK1 receptor expression or levels of mRNA encoding it in a biological sample of the individual.
  • the isolated biological sample is blood, and even more preferably, the biological sample is the blood plasma of said individual.
  • the first method of the invention comprises measuring the relationship between the levels of the whole and truncated form of the NK1 receptor and / or the mRNA encoding it.
  • the superior expression, or overexpression is defined as:
  • overexpression is defined as an expression level of the truncated form of the NK1 receptor, or of the mRNA encoding the truncated form of the NK1 receptor relative to the level of expression of the complete form of the NK1 receptor, or of the mRNA encoding the complete NK1 receptor form, respectively, increased by more than at least one:
  • the in vitro method for diagnosing cancer to an individual comprises:
  • step (a) simultaneously detect the expression levels of the NK1 receptor and of its short or truncated form, or of the mRNA encoding them, in the biological sample of step (a), and c) assign said individual to the group of individuals suffering from cancer when the relationship between the expression levels of the NK1 receptor and the expression levels of its truncated form, or the relationship between the ANRm that encodes them respectively, has a value greater than one
  • a genetic profile procedure such as a microarray, and / or
  • the detection of gene expression levels is performed by Q-RT-PCR.
  • the detection of protein levels, of the complete form of the NK1 receptor and / or of the truncated form of the NK1 receptor is performed by immunological techniques. More preferably, the immunological techniques are based on precipitation reactions, based on agglutination reactions, immunostaining, radioimmunoassay and radioimmunometric techniques, ELISA (Enzyme Linked ImmunoadSorbent Assay), or any combination thereof. More preferably, immunological techniques comprise immunomarking. Even more preferably, the immunomarking is selected from immunomarking with enzyme conjugated antibodies, immunomarking with fluorochrome conjugated antibodies, or cytometry.
  • the biological sample is plasma from the blood drawn from an individual.
  • the cancer is selected from the following: gastric cancer, preferably gastric adenocarcinoma; colon cancer, preferably colon adenocarcinoma; pancreatic cancer, preferably pancreatic adenocarcinoma; renal cancer, breast cancer, ovarian cancer, preferably ovarian adenocarcinoma; endometrial cancer; uterine cervix cancer; lung cancer, preferably non-small cell lung carcinoma and / or small cell lung carcinoma; thyroid cancer, preferably papillary thyroid carcinoma and / or follicular thyroid carcinoma; bladder carcinoma, preferably transitional bladder carinoma of the urine; prostate carcinoma; Glial line cancer of the central nervous system (glioma); sarcomas, preferably fibrosarcoma, malignant fibrous histiocytoma and Edwing sarcoma; melanoma; embryonic cancers, preferably neuroblastoma; and
  • a fourth aspect of the invention relates to an in vitro method for classifying an individual suffering from cancer at a certain tumor stage, hereafter referred to as the third method of the invention, which comprises steps steps a) -c) according to the first or second method of the invention, and also comprises classifying the individual in the group of individuals suffering from stage I, II, III or IV cancer according to:
  • the third method of the invention further comprises classifying the individual in the group of individuals suffering from stage I cancer when:
  • the value of the relationship between the sum of the levels of the integer and the truncated form of the NK1 receptor and the level of the complete form of said receptor is greater than 1 and less than 1, 5 and / or
  • the value of the relationship between the level of mRNA encoding the truncated form and the level of mRNA encoding the complete form of said receptor is greater than 0 and less than 1, 2.
  • the third method of the invention further comprises classifying the individual in the group of individuals suffering from stage I I cancer when:
  • the value of the relationship between the level of mRNA encoding the truncated form and the level of mRNA encoding the complete form of said receptor is greater than 1, 2 and less than 1, 9.
  • the third method of the invention further comprises classifying the individual in the group of individuals suffering from stage II I cancer when;
  • the value of the relationship between the sum of the levels of the integer and truncated form of the NK1 receptor and the level of the integer form of said receiver is greater than 1, 6 and less than 1, 9 and / or
  • the value of the relationship between the level of mRNA encoding the truncated form and the level of mRNA encoding the entire form of said receptor is greater than 1, 9 and less than 3.9.
  • the third method of the invention further comprises classifying the individual in the group of individuals suffering from stage IV cancer when: a) the value of the relationship between the sum of the levels of the integer and the truncated form of the NK1 receiver and the level of the complete form of said receiver, is greater than 1, 9 and / or
  • a genetic profile procedure such as a microarray, and / or
  • the detection of gene expression levels is performed by Q-RT-PCR.
  • the detection of protein levels, of the complete form of the NK1 receptor and / or of the truncated form of the NK1 receptor is performed by immunological techniques. More preferably, the immunological techniques are based on precipitation reactions, based on agglutination reactions, immunostaining, radioimmunoassay and radioimmunometric techniques, ELISA (Enzyme Linked ImmunoadSorbent Assay), or any combination thereof. More preferably, immunological techniques comprise immunomarking. Even more preferably, the immunomarking is selected from immunomarking with enzyme conjugated antibodies, immunomarking with fluorochrome conjugated antibodies, or cytometry.
  • the biological sample is plasma from the blood drawn from the individual.
  • the cancer is selected from the following: gastric cancer, preferably gastric adenocarcinoma; colon cancer, preferably colon adenocarcinoma; pancreatic cancer, preferably pancreatic adenocarcinoma; renal cancer, breast cancer, ovarian cancer, preferably ovarian adenocarcinoma; endometrial cancer; uterine cervix cancer; lung cancer, preferably non-small cell lung carcinoma and / or small cell lung carcinoma; thyroid cancer, preferably papillary thyroid carcinoma and / or follicular thyroid carcinoma; bladder carcinoma, preferably transitional bladder carinoma of the urine; prostate carcinoma; Glial line cancer of the central nervous system (glioma); sarcomas, preferably fibrosarcoma, malignant fibrous histiocytoma and Edwing sarcoma; melanoma; embryonic cancers, preferably neuroblastoma; and
  • a fifth aspect of the present invention relates to the use of a marker that is selected from:
  • the markers are used simultaneously.
  • a genetic profile procedure such as a microarray, and / or
  • the detection of gene expression levels is performed by Q-RT-PCR.
  • the detection of protein levels, of the complete form of the NK1 receptor and / or of the truncated form of the NK1 receptor is performed by immunological techniques. More preferably, the immunological techniques are based on precipitation reactions, based on agglutination reactions, immunostaining, radioimmunoassay and radioimmunometric techniques, ELISA (Enzyme Linked ImmunoadSorbent Assay), or any combination thereof. More preferably, immunological techniques comprise immunomarking. Even more preferably, the immunomarking is selected from immunomarking with enzyme conjugated antibodies, immunomarking with fluorochrome conjugated antibodies, or cytometry.
  • the cancer is selected from the following: gastric cancer, preferably gastric adenocarcinoma; colon cancer, preferably colon adenocarcinoma; pancreatic cancer, preferably pancreatic adenocarcinoma; renal cancer, breast cancer, ovarian cancer, preferably ovarian adenocarcinoma; endometrial cancer; uterine cervix cancer; lung cancer, preferably non-small cell lung carcinoma and / or small cell lung carcinoma; thyroid cancer, preferably papillary thyroid carcinoma and / or follicular thyroid carcinoma; bladder carcinoma, preferably transitional bladder carinoma of the urine; prostate carcinoma; Glial line cancer of the central nervous system (glioma); sarcomas, preferably fibrosarcoma, malignant fibrous histiocytoma and Edwing sarcoma; melanoma; embryonic cancers, preferably neuroblastoma; and hematological cancers, preferably leukemia of line B or line T
  • a sixth aspect of the invention relates to an in vitro method for evaluating the evolution of an individual diagnosed with cancer which comprises detecting levels of the NK1 receptor and / or its short (or truncated) form and / or a combination thereof or of the mRNA that encodes them in a biological sample of said individual, at two or more different times.
  • the detection comprises detecting levels of the NK1 receptor and / or its short (or truncated) form and / or a combination thereof or of the mRNA that encodes them in a biological sample of said individual, at two or more different times.
  • a genetic profile procedure such as a microarray, and / or
  • the detection of gene expression levels is performed by Q-RT-PCR.
  • the detection of protein levels, of the complete form of the NK1 receptor and / or of the truncated form of the NK1 receptor is performed by immunological techniques. More preferably, the immunological techniques are based on precipitation reactions, based on agglutination reactions, immunostaining, radioimmunoassay and radioimmunometric techniques, ELISA (Enzyme Linked ImmunoadSorbent Assay), or any combination thereof. More preferably, immunological techniques comprise immunomarking. Even more preferably, the immunomarking is selected from immunomarking with enzyme conjugated antibodies, immunomarking with fluorochrome conjugated antibodies, or cytometry. More preferably, the biological sample is plasma from the blood drawn from an individual.
  • the cancer is selected from the following: gastric cancer, preferably gastric adenocarcinoma; colon cancer, preferably colon adenocarcinoma; pancreatic cancer, preferably pancreatic adenocarcinoma; renal cancer, breast cancer, ovarian cancer, preferably ovarian adenocarcinoma; endometrial cancer; uterine cervix cancer; lung cancer, preferably non-small cell lung carcinoma and / or small cell lung carcinoma; thyroid cancer, preferably papillary thyroid carcinoma and / or follicular thyroid carcinoma; bladder carcinoma, preferably transitional bladder carinoma of the urine; prostate carcinoma; Glial line cancer of the central nervous system (glioma); sarcomas, preferably fibrosarcoma, malignant fibrous histiocytoma and Edwing sarcoma; melanoma; embryonic cancers, preferably neuroblastoma; and hematological cancers, preferably leukemia of line B or line T
  • a seventh aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising an NK1 agonist in the preparation of a medicament for the treatment of an individual identifiable by the first, second or third method of the invention, as individuals suffering from cancer, or They can be classified at a certain stage of cancer.
  • the antagonist is a non-peptide antagonist. More preferably, the non-peptide antagonist is selected from the list consisting of: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant, Lanepitant, LY-686017, L-733,060, L-732, 138, L-703,606, WIN 62,577, CP - 122721,, TAK-637, and R673, CP-100263, WIN 51708, CP-96345, L-760735, CP-122721, L-758298, L-741671, L-742694, CP-99994, T-2328, or any of its combinations.
  • the NK1 non-peptide receptor antagonist is selected from: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant and Lanepitant, or any combination thereof.
  • the antagonist is a peptide antagonist. More preferably, the peptide antagonist is an antibody or a fragment thereof, specific against NK1, NK2 and / or NK3 cell receptors, or combinations thereof.
  • NK1, NK2 or NK3 receptors selected from: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7, or a fragment thereof, or against amino acid sequences that have a degree of identity with said amino acid sequences of at least 85%, typically of at least 90%, preferably of at least 95%, more preferably of at less than 98%, even more preferably, at least 99%.
  • kits or devices comprising primers, probes and / or antibodies, or fragments thereof, capable of detecting or binding to the truncated form of the NK1 receptor, or the mRNA that encodes it, and preferably also comprises primers, probes and / or antibodies capable of detecting the entire form of the NK1 receptor, or the mRNA encoding it and where:
  • the primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 pairs of bases, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and even more preferably about 20 pairs. of bases, which have an identity of at least 80%, more preferably of at least 90%, even more preferably of at least 95%, still much more preferably of at least 98%, and particularly of 100% , with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO: 4 (short form of NK1 receptor) and / or SEQ ID NO: 2 (long form of NK1 receptor),
  • the probes are polynucleotide sequences of between 80 and 1100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 200 and 500 base pairs, which have an identity of at least 80% , more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO : 4 (short form of NK1 receiver) and / or SEQ ID NO: 2 (long form of NK1 receiver), - the antibodies or fragments thereof are capable of specifically binding to a region formed by any of the amino acid sequences SEQ ID NO: 1 (long form of the NK1 receptor), SEQ ID NO: 3 (short form of the NK1 receptor), or a fragment thereof, or against amino acid sequences that have a degree of identity with said amino acid sequences of at least 85%, typically of at least 90%, preferably of at least 95%, more preferably of , at least 98%, even more preferably, at least preferably
  • the oligonucleotides have modifications in some of their nucleotides, such as, but not limited to, nucleotides having any of their atoms with a radioactive isotope, usually 32 P or tritium, immunologically labeled nucleotides, such as with a molecule of digoxigenin, and / or immobilized in a membrane.
  • nucleotides having any of their atoms with a radioactive isotope usually 32 P or tritium
  • immunologically labeled nucleotides such as with a molecule of digoxigenin, and / or immobilized in a membrane.
  • kit or device of the invention comprises at least one antibody that is selected from:
  • an anti-NK1 antibody in its complete form, preferably recognizing an epitope located at the c-terminal ends of the receptor.
  • an anti-NK1 antibody in its truncated form, preferably that recognizes an epitope in one of the transmembrane bridges of the receptor.
  • the antibody comprises at least one anti-NK1 antibody in its complete form and an anti-NK1 antibody in its truncated form, and even more preferably the antibody is monoclonal.
  • the antibody is polyclonal.
  • the antibody is labeled with a fluorochrome, and even more preferably, the fluorochrome is selected from the list comprising: Fluorescein (FITC), Tetramethylrodamine and derivatives, Phycoerythrin (PE), PerCP, Cy5, Texas, allophycocyanin , or any of its combinations.
  • a ninth aspect of the invention relates to the use of the kit or device of the invention to carry out a method as described in any of the objects of the invention.
  • a tenth aspect of the invention relates to a solid support, or protein chip, comprising at least one of the NK1 anti-receptor and / or truncated NK1 receptor antibodies, or any combination thereof, for carrying out the any of the methods of the invention.
  • An eleventh aspect of the invention relates to a solid support, or DNA chip, comprising single channel oligonucleotides or microarrays designed from a known sequence or an mRNA of at least one of the genes (NK1 receptor or truncated receptor) .
  • a twelfth aspect of the invention relates to a computer program comprising program instructions to make a computer carry out the method according to any of the methods of the invention.
  • a thirteenth aspect of the invention relates to a computer-readable storage medium comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • a fourteenth aspect of the invention relates to a transmissible signal comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • level or “levels” are used when referring to the amount of a certain substance present and detectable in a given medium. More specifically, we use these expressions to refer to the amount of a protein as the complete and truncated forms of the NK1 receptor or of a nucleic acid sequence such as the mRNA that encodes the complete and truncated forms of said receptor.
  • the inventor describes in the present invention:
  • That the long and short (or truncated) forms of the NK1 receptor are present in the blood plasma of cancer patients. That the presence of the short (or truncated) form of the NK1 receptor in the blood plasma is specific to cancer patients.
  • That the detection of the presence of said short form of the NK1 receptor is useful for the early diagnosis of cancer in early stages, and it can be used as a screening method.
  • That the detection of the presence of said short form of the NK1 receptor, in the blood plasma of cancer patients, is useful for monitoring the evolution of a cancer as it increases as it progresses and decreases when these cancerous tumors return, It can be used as a method of evaluating the evolution of cancerous tumors: their growth or progression, response to the treatment of these cancerous tumors or as a marker of relapse of the cancerous disease.
  • That the detection of the presence of said short form of the NK1 receptor, in the blood plasma of cancer patients, is useful for predicting their response to treatment with NK1 receptor antagonists.
  • That messenger RNA (mRNA) that encodes the long and short (or truncated) forms of the NK1 receptor are present in the blood plasma of cancer patients.
  • That the presence of messenger RNA encoding the short (or truncated) form of the NK1 receptor in the blood plasma is specific to cancer patients.
  • That the detection of the presence of messenger RNA that encodes the short (or truncated) form of the NK1 receptor in the blood plasma is useful for the early diagnosis of cancer in early stages, and can be used as a screening method.
  • the present invention relates to the use of a marker that is selected from: a) the level of the long form of the NK1 receptor, in an isolated biological sample that preferably comprises blood plasma and / or
  • NK1 receptor b) the level of the short (or truncated) form of the NK1 receptor in an isolated biological sample that preferably comprises blood plasma and / or c) the level of the mRNA encoding the long form of the NK1 receptor in an isolated biological sample which preferably comprises blood plasma and / or
  • a) diagnose the presence of a cancer, b) monitor or know the evolution of a cancer so that its progression can be determined,
  • the markers are used simultaneously. More preferably, the biological sample is peripheral blood plasma.
  • one aspect of the invention relates to a method for diagnosing a cancer in a human or individual subject, which comprises using, as an indicator, in an isolated biological sample, preferably, comprising plasma from that subject's blood, the presence of the long (or complete) form of the NK1 receptor, or of the mRNA that encodes it, and / or level the short (or truncated) form of the NK1 receptor, or of the mRNA that encodes it, or a combination of the above.
  • the level of the NK1 receptor in its long form and / or the level of the NK1 receptor in its short form and / or the level of the mRNA encoding the NK1 receptor and / is used as an indicator or that encodes the short (or truncated) form of the NK1 receptor and / or the relationship between any of them.
  • the method of the invention comprises the following steps:
  • an isolated biological sample that preferably comprises peripheral blood plasma of a human subject.
  • step (b) detect the levels of the NK1 receptor in its long form or of the mRNA that encodes it, in the sample obtained in step (a).
  • step (c) detect the levels of the NK1 receptor in its short (or truncated) form or of the mRNA that encodes it, in the sample obtained in step (a). d. Find the ratio between the levels detected in any of steps (b) and (c).
  • the result of the first method of the invention is indicative of the presence of a cancer in the human subject from which the sample, preferably, of peripheral blood plasma was obtained, although this cancer is not detectable by current diagnostic methods. (clinical, radiological, biochemical, pathological or other). More preferably,
  • the value of the relationship between a factor that results from the sum of the levels of the integer and truncated form of the NK1 receptor and another factor that results from the level of the complete form of said receptor is greater than 1 and / or
  • the value of the mRNA encoding the truncated form of the NK1 receptor is greater than 0 and / or
  • the value of the relationship between the level of mRNA encoding the truncated form and the level of mRNA encoding the complete form of said receptor is greater than 1.
  • the levels of the NK1 receptor (in its complete form) or of the mRNA encoding it are increased by more than 0.01% with respect to healthy human subjects in the isolated biological sample obtained in step (a). Even more preferably, the level of the NK1 receptor, or of the mRNA encoding the NK1 receptor, increased by more than 0.1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, and even more preferably, in more than 90%.
  • the levels of the short (or truncated) form of the NK1 receptor or the mRNA encoding it are increased by more than 0.01% compared to healthy human subjects in the isolated biological sample obtained in step (a) .
  • the level of the NK1 receptor, or of the mRNA encoding the NK1 receptor increased by more than 0.1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, and even more preferably, in more than 90%.
  • Another aspect of the invention relates to a method for establishing the degree of progression of a cancer in a human subject, in which the subject suffers from a cancer, which comprises using, as an indicator, in an isolated biological sample that, preferably, it comprises blood plasma of that subject, the presence of the long form of the NK1 receptor, and / or of the mRNA that encodes it, and / or the level of the short (or truncated) form of the NK1 receptor, and / or of the mRNA that the code and / or the relationship between them.
  • the level of the NK1 receptor in its long form and / or the level of the NK1 receptor in its short form and / or the mRNA encoding the NK1 receptor and / or the indicator is used as an indicator MRNA encoding the short (or truncated) form of said receptor and / or the relationship between them to know or monitor the stage of evolution of a cancerous tumor in a human subject.
  • This monitoring includes determining the level of progression of the cancer, its evolutionary stage and its changes over a period of time. This monitoring allows to establish the stage of tumor progression, a prognosis and, consequently, to choose the most appropriate therapeutic options.
  • this method of the invention comprises:
  • step (b) detect the levels of the NK1 receptor in its long form or of the mRNA that encodes it, in the sample obtained in step (a).
  • Another aspect of the invention relates to a method for monitoring the evolution of a cancer in a human subject that is subject to specific treatment for said cancer, which comprises using, as an indicator, in an isolated biological sample that preferably comprises plasma. of the blood of that subject, the presence of the long form of the NK1 receptor, and / or the mRNA that encodes it, and / or the level of the short form (or truncated) of the NK1 receptor, and / or the mRNA that encodes it, and / or the ratio between them.
  • the level of the NK1 receptor in its long form and / or the level of the NK1 receptor in its short form and / or the mRNA encoding the NK1 receptor and / or the indicator is used as an indicator MRNA encoding the short (or truncated) form of said receptor and / or the relationship between them to establish the degree of evolution of a cancerous tumor in a human subject over the period of treatment thereof.
  • This monitoring comprises determining the level of cancer progression and its evolutionary stage from the moment the specific treatment for said cancer is initiated. This monitoring allows to know the degree of response of a tumor to the specific treatment for it and consequently, to choose the most appropriate therapeutic options.
  • the method of the invention comprises:
  • an isolated biological sample that preferably comprises plasma from the peripheral blood of the individual
  • step (b) detect the levels of the NK1 receptor in its long form or of the mRNA that encodes it, in the sample obtained in step (a).
  • the result of this method of the invention is indicative of the progression or regression of a cancer in the human subject from which the sample, preferably, of blood plasma from step (a) and its response was obtained. to the specific treatment.
  • the result will be an indicator of cancer progression when the values obtained in the repetitions of step (e) are sequentially higher.
  • the result will be an indicator of cancer regression when the values obtained in the repetitions of step (e) are sequentially lower.
  • the result will be an indicator of total regression or complete response to treatment, of cancer when the values obtained in the repetitions of step (e) are sequentially lower and the last repetition shows some of the following values:
  • NK1 receptor level less than 10% of the NK1 receptor level detectable in healthy subjects (control), and / or
  • mRNA level that codes for the short (or truncated) form of the NK1 receptor less than 1% of the mRNA that encodes the short (or truncated) form of the N K1 receptor, and / or
  • the result will be an indicator of total cancer regression when the values obtained in the repetitions of steps (e) are sequentially lower and the last repetition shows some of the following values:
  • a) level of the short (or truncated) form of the NK1 receptor is 0 or undetectable.
  • the result will be an indicator of relapse or recurrence of cancerous tumor disease when after obtaining results indicating total tumor regression or complete response to treatment maintained, the values obtained in the repetitions of the steps ( e) are sequentially greater and the last repetition shows some of the following values:
  • NK1 receptor level greater than 10% of the NK1 receptor level detectable in healthy subjects (control), and / or
  • NK1 receptor level of the short (or truncated) form of the NK1 receptor greater than 1% of the level of the NK1 receptor detectable in healthy subjects (control), and / or c) level of the short (or truncated) form of the NK1 receptor greater than 10% of the level of the NK1 receptor, and / or
  • mRNA level encoding the short (or truncated) form of the NK1 receptor greater than 1% of the mRNA encoding the short (or truncated) form of the NK1 receptor, and / or
  • the result will be an indicator of relapse or recurrence of cancerous tumor disease when after obtaining results indicating total tumor regression or complete response to treatment maintained, the values obtained in the repetitions of the steps (e ) are sequentially higher and the last repetition shows some of the following values:
  • a) level of the short (or truncated) form of the NK1 receptor is greater than 0.
  • b) level of the mRNA encoding for the short (or truncated) form of the NK1 receptor is greater than 0.
  • the response is a response to the reduction of tumor burden.
  • the response is an improvement or absence of deterioration of the tumor state.
  • the response is a clinical outcome, such as progression-free survival or overall survival.
  • the response is an improvement in tumor size detectable by radiological techniques, an improvement in the number of tumor cells detectable in blood plasma by immunocytochemistry or flow cytometry, or an improvement in the value of other tumor markers. specific detectable, preferably, in blood plasma.
  • Another aspect of the invention relates to a method, hereafter referred to as the fourth method of the invention, for predicting or forecasting the response to specific treatment with NK1 receptor antagonists, in which the subject suffers from cancer, in an isolated biological sample.
  • NK1 receptor antagonists in which the subject suffers from cancer
  • an isolated biological sample which preferably comprises blood plasma of that subject, which comprises using the presence of the long form of the NK1 receptor as an indicator, and / or of the mRNA encoding it, and / or the level of the short (or truncated) form of the NK1 receptor, and / or the mRNA that encodes it, and / or the proportion between them.
  • the level of the NK1 receptor in its long form and / or the level of the NK1 receptor in its short form and / or the mRNA encoding the NK1 receptor and / or the indicator is used as an indicator MRNA encoding the short (or truncated) form of said receptor and / or the proportion between them to predict or predict a patient's cancer response to treatment with NK1 receptor antagonists.
  • This embodiment allows, prior to treatment, to predict the response of this cancerous tumor to treatment with NK1 receptor antagonists and, consequently, to choose the most appropriate therapeutic options. It would also allow to predict or predict the response once the treatment started, and also continue with it or choose other therapeutically more appropriate options.
  • the method of the invention comprises:
  • an isolated biological sample that preferably comprises peripheral blood plasma of a human subject suffering from cancer.
  • step (b) detect the levels of the NK1 receptor in its long form or of the mRNA that encodes it, in the sample obtained in step (a).
  • the result of the method of the invention is indicative of the cancer response in the human subject from which the sample was obtained, preferably from blood plasma from step (a) to specific treatment with NK1 receptor antagonists.
  • the result will be an indicator of good tumor response to treatment with NK1 receptor antagonists, when in steps (b) and / or (c) and / or (d) some of the following values:
  • NK1 receptor level greater than 10% of the NK1 receptor level detectable in healthy subjects (control), and / or
  • NK1 greater than 1% of the mRNA encoding the short (or truncated) form of the N K1 receptor, and / or
  • the result will be an indicator of total cancer regression when the values obtained in the repetitions of step (e) are sequentially lower and the last repetition shows some of the following values:
  • a) level of the short (or truncated) form of the NK1 receptor equal to 0 or undetectable.
  • mRNA level that codes for the short (or truncated) form of the NK1 receptor is equal to 0 or undetectable.
  • the response is a response to the reduction of tumor burden.
  • the response is an improvement or absence of deterioration of the tumor state.
  • the response is a clinical outcome, such as progression-free survival or overall survival.
  • the response is an improvement in tumor size detectable by radiological techniques, an improvement in the number of detectable tumor cells, preferably in blood plasma by immunocytochemistry or flow cytometry, or an improvement in the value of others. specific tumor markers detectable in blood plasma.
  • the subjects whose response is predicted are human subjects suffering from cancer. The terms "individual”, “human subject”, “subject” and “patient” are therefore used interchangeably in this specification.
  • NK1 receptor also called neurokinin 1 receptor, SPR; NK1 R; NKI R; or TAC1 R
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • It is a receptor of the type of G-protein-coupled receptors, with seven transmembrane bridges, encoded by the TAC1R gene found on chromosome 2 in humans. This gene belongs to a family of tachykinin receptor genes. These tachykinin receptors are characterized by interaction with G proteins and contain seven hydrophobic transmembrane regions. This gene codes for the substance P tachykinin receptor, also known as neurocinin or neurokinin 1. The encoded protein is also involved in the mediation of the phosphatidylinositol metabolism of substance P.
  • TAC1R is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 1 (with number in GeneBank NP_001049.1), and which would comprise various variants from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ I D NO: 1,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 1, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the NK1 protein.
  • SEQ I D NO: 2 is the collection in the sequence SEQ I D NO: 2.
  • the short (or truncated) form of the receptor is collected, but not limited to, in the GeneBank sequences NP_056542.1 (SEQ ID NO: 3) and NM_015727.2 (SEA ID NO: 4), or amino acid and nucleotide sequences, respectively, which have at least an identity of 60%, 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, respectively.
  • reference sample or “reference value” is understood as the sample used to determine the variation in the expression levels of the proteins or nucleic acids of the present invention.
  • the reference value is obtained from the signal provided using a tissue sample obtained from an individual who does not have A tumor.
  • the samples are taken from the blood plasma of several individuals with and without cancer and combined, such that the reference value reflects the average value of said molecules in the population of individuals with and without cancer.
  • Reference value is the level of a protein of the invention (NK1 receptor, or truncated form of the NK1 receptor) or nucleic acids of the present invention (mRNA of the NK1 gene and mRNA of the truncated form of said receptor) in The reference sample.
  • prognosis is understood as the expected evolution of a disease and refers to the assessment of the probability according to which a subject suffers from a disease as well as the assessment of its onset, developmental status, evolution, or its regression, and / or the prognosis of the course of the disease in the future. As those skilled in the art will understand, such assessment, although preferred, may not be correct for 100% of the subjects to be diagnosed. The term, however, requires that a statistically significant part of the subjects can be identified as having the disease or having a predisposition to it.
  • a part is statistically significant, it can be determined by the person skilled in the art using several well-known statistical evaluation tools, for example, determination of confidence intervals, determination of p-values, Student's t-test, Mann-Whitney test , etc.
  • Preferred confidence intervals are at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%.
  • P values are preferably 0.2, 0.0, 0.05.
  • "Prediction of the response" means, in the context of the present invention, the determination of the probability that the patient responds favorably or unfavorably to a particular therapy or treatment, including surgical treatment.
  • the term "prediction”, as used herein, refers to an individual evaluation of any parameter that may be useful in determining the evolution of a patient.
  • the prediction of the clinical response to treatment although it is preferred, does not need to be correct for 100% of the subjects to be diagnosed or evaluated.
  • the term requires that a statistically significant part of the subjects can be identified as having an increased probability of having a positive response.
  • the person skilled in the art can easily determine if a subject is statistically significant using several well-known statistical evaluation tools, for example, determination of confidence intervals, determination of p values, Student's t-test, Mann Whitney test, etc.
  • Preferred confidence intervals are at least 50%>, at least 60%>, at least 70%>, at least 80%>, at least 90%), at least 95%>.
  • P values are preferably 0.2, 0, 1 or 0.05.
  • the prediction of the clinical response can be made using any assessment criteria used in oncology and known to the person skilled in the art.
  • other subclassifications could be established within this principal, thus facilitating the choice and establishment of appropriate therapeutic regimens or treatment.
  • This discrimination is not intended to be correct in 100% of the samples analyzed. However, it requires that a statistically significant amount of the analyzed samples be classified correctly.
  • the amount that is statistically significant can be established by a person skilled in the art by using different statistical tools, for example, but not limited, by determining confidence intervals, determining the significance value P, Student test or discriminant functions. Fisher, non-parametric measurements of Mann Whitney, Spearman correlation, logistic regression, linear regression, area under the ROC curve (AUC).
  • the confidence intervals are at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98% or at least 99%.
  • the value of p is less than 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 or 0.0001.
  • the present invention makes it possible to correctly detect the disease differentially by at least 60%, more preferably at least 70%, much more preferably at least 80%, or even much more preferably at least 90%. of the subjects of a certain group or population analyzed.
  • the term "positive response" refers to a response, by patients suffering from cancer, more effective to treatment with NK1 receptor antagonists, than other patients suffering from cancer but not recovering from said effective way to treatment with NK1 receptor antagonists.
  • the answer may refer to the characteristics of the subject's tumors.
  • the Response may refer to the clinical outcome of the subject.
  • it can be predicted whether an individual patient will show (i) a response (R) to treatment with NK1 receptor antagonists or (ii) will not show response (NR) to treatment with antagonists of the NK1 receiver.
  • R and NR can be made based on the change in the size of the lesion.
  • “Response” can be defined as a decrease in the total tumor burden (defined as the sum of the tumor areas of lesions measured two-dimensionally), taking as reference the values corresponding to the initial value, without the appearance of a new injury.
  • the response may be ⁇ 5% decrease in total tumor burden, such as ⁇ 10% decrease in total tumor burden, ⁇ 15% decrease in total tumor burden, ⁇ 20% decrease in total tumor burden, ⁇ 25% decrease in total tumor burden, ⁇ 30% decrease in total tumor burden, ⁇ 35% decrease in total tumor burden, ⁇ 40% decrease in the total tumor load, ⁇ 45% decrease in the total tumor load or ⁇ 50% decrease in the total tumor load, each defined as the sum of the tumor areas of the lesions measured two-dimensionally.
  • the response is defined as ⁇ 30% decrease in the total tumor burden (defined as the sum of the tumor areas of the lesions measured in two dimensions), taking as reference the values corresponding to the initial values, without the appearance of a new lesion.
  • NR lack of response
  • no response is defined as ⁇ 30% decrease in the tumor area of one or more measurable lesions, or the appearance of at least one new lesion. This normally includes an increase, such as> 20% increase in the area of one or more measurable lesions or the appearance of at least one new lesion.
  • Response refers to the clinical outcome of the subject, the "Response” can be expressed as overall survival or progression-free survival. The survival of cancer patients is adequately expressed generally by means of the Kaplan-Meier curves, which have received their designation from Edward L. Kaplan and Paul Meier who described them first (Kaplan, Meier: Amer. Statist Assn.
  • the presence or not of the truncated form of the NK1 receptor in the biological sample, preferably blood plasma of the sample of step (a), is also determined. , of cancer patients, the result being indicative of a positive response (more effective response to treatment with NK1 receptor antagonists) if the presence of the truncated form of the NK1 receptor, or mRNA, is detected in said blood plasma that encodes it.
  • the levels of gene expression will give a certain gene expression profile.
  • level level of expression
  • Gene expression profile means the gene profile obtained after quantification of mRNA and / or protein produced by the genes of interest or biomarkers, that is, by the genes used as biological markers in the present invention, in a sample biological isolated.
  • the expression profile of the genes is preferably performed by determining the level of mRNA derived from its transcription, after extracting the total RNA present in the isolated biological sample, which can be performed by protocols known in the state of the art.
  • the level of mRNA derived from the transcription of the genes used as biological markers in the present invention can be determined, for example, but not limited to, by amplification by polymerase chain reaction (PCR), back transcription in combination with the polymerase chain reaction (RT-PCR), quantitative RT-PCR, back transcription in combination with the ligase chain reaction (RT-LCR), or any other nucleic acid amplification method; serial analysis of gene expression (SAGE, SuperSAGE); DNA chips made with oligonucleotides deposited by any mechanism; DNA microarrays made with oligonucleotides synthesized in situ by photolithography or by any other mechanism; in situ hybridization using specific probes labeled with any method of marking; by electrophoresis gels; by membrane transfer and hybridization with a specific probe; by nuclear magnetic resonance or any other diagnostic imaging technique using paramagnetic nanoparticles or any other type of detectable nanoparticles functionalized with antibodies or by any other means.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR poly
  • the gene expression profile could also be obtained by detecting and / or quantifying the proteins resulting from the translation of the mRNA derived from the transcription of the genes used as biological markers in the present invention, for example, but not limited to, immunodetection by western blot.
  • Quantitative detection of the expression of the genes used as biological markers in the present invention can be performed more preferably by real-time PCR (RT-PCR or RTqPCR).
  • the real-time detection of the amplified products can be carried out by means of the use of fluorescent molecules that are intercalated in the double-stranded DNA or by hybridization with different types of probes.
  • the detection of protein levels or gene expression level can be done by any of the techniques known to the person skilled in the art.
  • step (a) the detection of the expression levels of the NK1 receptor, or of the mRNA encoding the NK1 receptor in the blood plasma sample obtained in step (a).
  • step (b) the detection of expression levels of the short (or truncated) form of the NK1 receptor in the blood plasma sample obtained in step (a). is done by
  • a genetic profile procedure such as a microarray and / or
  • PCR such as a real-time PCR and / or.
  • Northern transfer and / or
  • the biological sample is blood plasma or RNA extracted from a fluid of a cancer patient. More preferably, the first method of the invention is carried out in vitro using a sample originating from the human subject.
  • the detection of gene expression levels is performed by Q-RT-PCR.
  • the detection of the levels of NK1 proteins and / or the truncated NK1 receptor is performed by immunological techniques.
  • the immunological techniques are based on precipitation reactions, based on agglutination reactions, immunostaining, radioimmunoassay and radioimmunometric techniques, ELISA (Enzyme Linked ImmunoadSorbent Assay), or any combination thereof.
  • immunological techniques comprise immunomarking.
  • the immunomarking is selected from immunolabeling with enzyme conjugated antibodies, immunomarking with fluorochrome conjugated antibodies, or cytometry. Even more preferably, the cytometry is flow cytometry.
  • the human individual or subject suffers from a cancer that is selected from the following: gastric cancer, preferably gastric adenocarcinoma, colon cancer, preferably colon adenocarcinoma, pancreatic cancer, preferably adenocarcinoma of pancreas, renal cancer, preferably clear cell renal carcinoma, breast cancer, preferably breast adenocarcinoma, ovarian cancer, preferably ovarian adenocarcinoma, endometrial carcinoma, uterine cervix carcinoma, lung cancer, preferably non-cell lung carcinoma small and / or small cell lung carcinoma, thyroid cancer, preferably papillary thyroid carcinoma and / or follicular thyroid carcinoma, bladder carcinoma, preferably transitional urine bladder carcinoma, prostate carcinoma, glial lineage cancer central nervous system (gliomas, astrocytomas, ep endimomas), sarcomas, preferably fibrosarcoma, malignant fibrous histiocytoma and Edwing'
  • gastric cancer preferably gastric
  • NK1 receptor antagonists are non-peptide antagonists, and even more preferably, non-peptide antagonists are selected from: Aprepitant (or MK 869 or L-754030), Vestipitant (or GW597599 ), Casopitant (or GW679769), Vofopitant (or GR-205171), Ezlopitant (or CJ -1 1974), Lanepitant (or LY-303870), LY-686017, L-733,060 ((2S, 3S) -3- [ (3,5-bis (Trifluoromethyl) phenyl) methoxy] -2-phenylpiperidine hydrochloride), L-732, 138 (N-Acetyl-L-tryptophan 3,5-bis (trifluoromethyl) benzyl ester), L-703,606 (cis - 2- (Diphenylmethyl) -N - [(2-iodophenyl) methyl]
  • NK1 receptor antagonists are peptide antagonists, and even more preferably, they are selected from antibodies or fragments thereof directed against the NK1 receptor.
  • non-peptide antagonist of NK1 receptors means any substance of a non-peptide nature of sufficient size and conformation suitable to bind to the NK1 receptor and thus inhibit its normal functioning, including preventing SP or other agonists. of these receptors, join the aforementioned receptors.
  • Antibodies are peptide compounds with the ability to bind highly selectively to various organic molecules. Their binding to certain cellular receptors induces a modification in their activity, which can determine a modification in the usual physiological activities of cellular metabolism.
  • antibody against NK1 receptors means any polyclonal or monoclonal antibody or fragments of these antibodies against NK1 receptors.
  • An antibody fragment means a part of an antibody against NK1 receptors that is of sufficient size and conformation suitable for binding to an epitope present on NK1 receptors and thus modifying its normal functioning, including preventing substance P or other agonists of these receptors, join the aforementioned receptors.
  • trastuzumab is an anti-ErbB2 / HER2 for breast cancer
  • cetuximab which is an anti-ErbB1 / EGFR for colon cancer
  • bevacizumab which is a anti-VEGFR (growth factor receptor derived from vascular endothelium) for various types of cancers (Adams et al., 2005).
  • cancer is meant a malignant tumor of unlimited growth potential that expands locally by invasion and systemically by metastasis.
  • the NK1 receptor non-peptide antagonist is administered to individuals with a cancer.
  • the disease is cancer, preferably gastric cancer, preferably gastric adenocarcinoma, colon cancer, preferably colon adenocarcinoma, pancreatic cancer, preferably pancreatic adenocarcinoma, renal cancer, preferably clear cell renal carcinoma, breast cancer, preferably breast adenocarcinoma and / or breast carcinoma, ovarian cancer, preferably ovarian adenocarcinoma and / or ovarian carcinoma, endometrial carcinoma, uterine cervi
  • NK1 receptor antagonists both peptide and non-peptide, can be used alone, in combination with each other or with various anticancer agents that are selected, but not limited to, from any of the following: Chlorambucil, Melphalan, Aldesleukin, 6-mercaptopurine, 5 -fluoruracil, Ara-c, Bexarotene, Bleomycin, Capecitabine, Carboplatin, Cisplatin, Docetaxel, Doxorubicin, Epirubicin, Fludarabine, Irinotecan, Methotrexate, Mitoxantrone, Oxaliplatin, Paclitaxel, Rituximabidine, Vinoplobine, Vinoplobine, Vinoplobine, Vinoplobine, Vinoplobin, Vinoplobin, Vinyltinin, Vinyltinintin, Vinyltinintin, Vinyltinintin, Vinyltinin, Vinyltinin, Vinyltinin, Vinyltinin, Vinyltinin, Vinyltin
  • a seventh aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising an NK1 receptor antagonist in the preparation of a medicament for the treatment of an individual identifiable by the first, second or third method of the invention, as individuals suffering from cancer, or that can be classified at a certain stage of cancer.
  • the NK1 receptor antagonist is a non-peptide antagonist. More preferably, the non-peptide antagonist is selected from the list consisting of: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant, Lanepitant, LY-686017, L-733,060, L-732, 138, L-703,606, WIN 62,577, CP -122721,, TAK-637, and R673, CP-100263, WIN 51708, CP-96345, L- 760735, CP-122721, L-758298, L-741671, L-742694, CP-99994, T-2328, or any of its combinations. Even more preferably, the NK1 non-peptide receptor antagonist is selected from: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant and Lanepitant, or any combination thereof.
  • the antagonist is a peptide antagonist. More preferably, the peptide antagonist is an antibody or a fragment thereof, specific against NK1, NK2 and / or NK3 cell receptors, or combinations thereof. Even more preferably it is an antibody that recognizes at least one sequence of NK1, NK2 or NK3 receptors, selected from: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7, or any of its fragments.
  • the compositions of the present invention can be formulated for administration to an animal, and more preferably to a mammal, including man, in a variety of ways known in the state of the art.
  • compositions can be, without limitation, in sterile aqueous solution or in biological fluids, such as serum.
  • Aqueous solutions may be buffered or unbuffered and have additional active or inactive components. Additional components include salts to modulate ionic strength, preservatives including, but not limited to, antimicrobial agents, antioxidants, chelators, and the like, and nutrients including glucose, dextrose, vitamins and minerals.
  • the compositions can be prepared for administration in solid form.
  • compositions may be combined with various inert vehicles or excipients, including but not limited to; binders such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth, or gelatin; excipients such as starch or lactose; dispersing agents such as alginic acid or corn starch; lubricants such as magnesium stearate, glidants such as colloidal silicon dioxide; sweetening agents such as sucrose or saccharin; or flavoring agents such as peppermint or methyl salicylate.
  • binders such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth, or gelatin
  • excipients such as starch or lactose
  • dispersing agents such as alginic acid or corn starch
  • lubricants such as magnesium stearate, glidants such as colloidal silicon dioxide
  • sweetening agents such as sucrose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint or methyl salicylate.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition further comprises excipients.
  • the pharmaceutical composition may further comprise another active ingredient.
  • active ingredient means any component that potentially provides a pharmacological activity or other different diagnostic effect, cure, mitigation, treatment, or prevention of a disease, or that affects the structure or function of the body of man or other animals.
  • the term includes those components that promote a chemical change in the preparation of the drug and are present therein in a modified form intended to provide the specific activity or effect.
  • kit or device hereafter kit or device of the invention, comprising the elements necessary to analyze:
  • the kit may contain oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the genes, and / or capable of hybridizing with the mRNA sequence encoding the NK1 receptor and the truncated form of the NK1 receptor, for subsequent PCR amplification.
  • the kit or device of the invention comprises at least one antibody that is selected from:
  • the antibody is human, humanized or synthetic. In another more preferred embodiment, the antibody is monoclonal. In another more preferred embodiment, the antibody is labeled with a fluorochrome. More preferably, the fluorochrome is selected from the list comprising Fluorescein (FITC), Tetramethylrodamine and derivatives, Phycoerythrin (PE), PerCP, Cy5, Texas, allophycocyanin, or any combination thereof.
  • FITC Fluorescein
  • PE Tetramethylrodamine and derivatives
  • PE Phycoerythrin
  • PerCP PerCP
  • Cy5 Texas
  • allophycocyanin or any combination thereof.
  • the kit of the present invention comprises the means necessary to compare the amount detected in the different steps with a reference amount.
  • the kit can also include, without any limitation, buffers, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for its start-up and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out any of the methods of the invention.
  • the kit additionally comprises a polyT oligonucleotide primer in addition to ( of the) oligonucleotide (s) of the kit.
  • a polyT oligonucleotide primer in addition to ( of the) oligonucleotide (s) of the kit.
  • These reagents may optionally be included in the kit.
  • a Northern Transfer involves the use of electrophoresis to separate RNA samples by size and subsequent detection with an oligonucleotide (s) (hybridization probe) complementary to (part of) the target sequence of the RNA of interest. It is also possible that the oligonucleotide (s) are immobilized in spots on a (preferably solid) surface.
  • the kit comprises a microarray, or microarray of the invention.
  • An RNA microarray is a matrix on a solid substrate (usually a glass holder or a cell of a thin silicon film) that evaluates large amounts of different RNAs that are detectable by specific probes immobilized on spots on a solid substrate.
  • Each spot contains a specific nucleic acid sequence, usually a DNA sequence, such as probes (or indicators).
  • said custom matrix comprises fifty spots or less, such as thirty spots or less, including twenty spots or less.
  • another aspect of the invention relates to a microarray comprising oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the genes, and / or capable of hybridizing with the mRNA sequence of the NK1 gene the truncated form of the NK1 receptor .
  • microarray hereinafter microarray of the invention, comprising oligonucleotides or single channel microarrays designed from a known sequence or an mRNA encoding the NK1 receptor and the short (or truncated) form. ) of the NK1 receiver.
  • oligonuleotide sequences are constructed on the surface of a chip by sequential elongation of a growing chain with a single nucleotide using photolithography.
  • the oligonucleotides are anchored at the 3 'end by a method of selective activation of nucleotides, protected by a photolabile reagent, by the selective incidence of light through a photomask.
  • the photomask can be physical or virtual.
  • oligonucleotide probes can be between 10 and 100 nucleotides, more preferably, between 20 and 70 nucleotides, and even more preferably, between 24 and 30 nucleotides.
  • oligonucleotides per gene preferably about 40 oligonucleotides per gene are used.
  • Synthesis in situ on a solid support could be done using ink-jet technology, which requires longer probes.
  • the supports could be, but not limited to, filters or membranes of NC or nylon (charged), silicon, or glass slides for microscopes covered with aminosilanes, polylysine, aldehydes or epoxy.
  • the probe is each of the chip samples.
  • the target is the sample to be analyzed: messenger RNA, total RNA, a PCR fragment, etc.
  • Another aspect of the invention relates to a protein microarray, hereafter referred to as a protein microarray of the invention, comprising anti-NK1 antibodies and / or truncated NK1 receptor antibodies.
  • the probes are antibodies fixed to glass slides and the targets are samples of serum or tissue.
  • Another aspect of the invention relates to a solid support, or protein chip, comprising at least one of the anti-and anti-antibodies, or any combination thereof, to carry out any of the methods of the invention.
  • the methods of the invention may include additional steps, such as the separation of proteins by mono and two-dimensional electrophoresis (2D-PAGE), or prior digestion with trypsin of a mixture of proteins (from the sample) and then purified and analyzed.
  • Another aspect of the invention relates to a solid support, or DNA chip, comprising oligonucleotides or single channel microarrays designed from a known sequence or an mRNA of at least one of the genes encoding the NK1 receptor.
  • a solid support, or DNA chip comprising oligonucleotides or single channel microarrays designed from a known sequence or an mRNA of at least one of the genes encoding the NK1 receptor.
  • it comprises oligonucleotides capable of detecting the mRNA of all genes.
  • oligonucleotide sequences are constructed on the surface of the chip by sequential elongation of a growing chain with a single nucleotide using photolithography.
  • oligonucleotides are anchored by the 3 'end by a method of selective activation of nucleotides, protected by a photolabile reagent, by the selective incidence of light through a photomask.
  • the photomask can be physical or virtual.
  • oligonucleotide probes can be between 10 and 100 nucleotides, more preferably, between 20 and 70 nucleotides, and even more preferably, between 24 and 30 nucleotides.
  • oligonucleotides For the quantification of gene expression, preferably about 40 oligonucleotides per gene are used. Synthesis in situ on a solid support (for example, glass) could be done using ink-jet technology, which requires longer probes.
  • the supports could be, but are not limited to, filters or membranes of NC or nylon (charged), silicon, or glass slides for microscopes covered with aminosilanes, polylysine, aldehydes or epoxy.
  • the probe is each of the chip samples.
  • the target is the sample to be analyzed: messenger RNA, total RNA, a PCR fragment, etc.
  • Another aspect of the invention relates to a computer-readable storage medium comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • Another aspect of the invention relates to a transmissible signal comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the kit or device, the microarray, or the microarray of the invention, to carry out any of the methods of the invention.
  • the invention also extends to computer programs adapted so that any processing means can implement the methods of the invention.
  • Such programs may have the form of source code, object code, an intermediate source of code and object code, for example, as in partially compiled form, or in any other form suitable for use in the implementation of the processes according to the invention .
  • Computer programs also cover cloud applications based on that
  • Another aspect of the invention relates to a computer program comprising program instructions for making a computer carry out the method according to any of the methods of the invention.
  • the invention encompasses computer programs arranged on or within a carrier.
  • the carrier can be any entity or device capable of supporting the program.
  • the carrier may be constituted by said cable or other device or means.
  • the carrier could be an integrated circuit in which the program is included, the integrated circuit being adapted to execute, or to be used in the execution of, the corresponding processes.
  • the programs could be incorporated into a storage medium, such as a ROM, a CD ROM or a semiconductor ROM, a USB memory, or a magnetic recording medium, for example, a floppy disk or a disk Lasted.
  • the programs could be supported on a transmissible carrier signal.
  • it could be an electrical or optical signal that could be transported through an electrical or optical cable, by radio or by any other means.
  • Another aspect of the invention relates to a computer-readable storage medium comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • Another aspect of the invention relates to a transmissible signal comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • amino acid sequence refers to a polymeric form of amino acids of any length, which may be coding or non-coding, chemistry or biochemically modified.
  • the present invention means biologically active variant or fragment, those variants or fragments of the indicated peptides that have the same physiological, metabolic or immunological effect, or have the same utility as those described. That is, they are functionally equivalent. Such effects can be determined by conventional methods.
  • identity refers to the proportion of identical nucleotides or amino acids between two nucleotide or amino acid sequences that are compared. Sequence comparison methods are known in the state of the art, and include, but are not limited to, the GAG program, including GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST, BLASTP or BLASTN, and FASTA (Altschul et al., 1999. J. Mol. Biol. 215: 403-410.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides (RNA or RNA) and deoxyribonucleotides (DNA or DNA).
  • amino acid sequence amino acid sequence
  • peptide oligopeptide
  • polypeptide a polypeptide of any length
  • protein a polymeric form of amino acids of any length, which may be coding or non-coding, Chemically or biochemically modified. Unless defined otherwise, all the technical and scientific terms used here have the same meaning as those usually understood by a person skilled in the field of the invention.
  • Example 1 Cancer patients show detectable levels of the NK1 receptor and the truncated form of the NK1 receptor in peripheral blood plasma. The levels of the truncated form of the NK1 receptor are elevated in the blood plasma of cancer patients. To demonstrate that cancer patients have detectable levels of the NK1 receptor and the blood truncated form of said receptor was taken from the blood of healthy patients and plasma from the blood of cancer patients. In all cases, the presence of the NK1 receptor and the truncated form of said receptor was determined by the ELISA method.
  • NK1 receptor To determine the level of the complete form of the NK1 receptor (hereinafter "value of the complete form of the NK1 receptor" or "VFC-NK1 R”) was labeled with an antibody that binds to an epitope of the c-terminal end of said receptor (Reference sc-141 16; Santacruz Biotechnology). This end is exclusive and specific of said complete form of the NK1 receiver.
  • joint value of the complete and truncated form of the ⁇ receptor or" VCFCT-NK1 R an antibody was used which binds to an epitope of the second extracellular bridge of the receptor (which is common to both complete and truncated forms of receptor) and, therefore, marks both the truncated form of the NK1 receptor and the complete (or “full-length” form ") of said receiver (Reference sc-141 15; Santacruz Biotechnology).
  • VCFCT-NK1 R ⁇ Standard deviation
  • Table 1 shows the relationship between VCFCT-NK1 R and VFC-NK1 R ( ⁇ Standard Deviation) in healthy subjects and in patients with different types of cancer. It is shown that healthy human subjects the relationship between the joint value of the complete and truncated forms of the NK1 receptor (VCFCT-NK1 R) and the value of the form The complete NK1 receptor (VFC-NK1 R) is close to 1, demonstrating that in the plasma of the blood plasma of healthy subjects the predominant (exclusive) form is the complete NK1 receptor form. In cancer patients this proportion is greater than 1, which demonstrates that in the plasma of the blood plasma of cancer patients the presence of a significant amount of the truncated form of the NK1 receptor is detectable.
  • Example 2 Cancer patients show a relationship between detectable levels of the NK1 receptor and the truncated form of the NK1 receptor, in peripheral blood plasma, different depending on the tumor stage.
  • the present example demonstrates that cancer patients have a relationship between VCFCT-NK1 R and VFC-NK1 R that is higher in cases where the tumor stage is more advanced.
  • the VCFCT-NK1 R and the VFC-NK1 R were determined in each case by the method explained in example 1.
  • Patients in different evolutionary stages were selected for each type of cancer (stage I being the least advanced and stage III the most advanced).
  • the stadiums were established based on the pathological and clinical criteria set by the current clinical guidelines, defined by the World Health Organization and scientific societies (Sobin LH, Gospodarowicz MK, Wittekind Ch. Eds. TNM Classification of Malignant Tumors, 7th ed Wiley-Blackwell, Oxford 2009; url: http: / www.uicc.org/resources/tnm).
  • Example 3 Cancer patients show a relationship between detectable levels of the NK1 receptor and the truncated form of the NK1 receptor, in peripheral blood plasma, different depending on the response to the specific treatment for this disease.
  • the present example shows that cancer patients have a relationship between the VCFCT-NK1R and the VFC-NK1R that is higher in cases where there is no response to treatment. In this way, the value of the relationship between VCFCT-NK1R and VFC-NK1R is diminished as a result of a better treatment response.
  • the VCFCT-NK1R and the VFC-NK1R were determined in each case by the method explained in example 1.
  • Type of cancer (number of subjects Relationship VCFCT-NK1R / VFC-NK1R ( ⁇ studied). Standard Deviation). Pre-treatment and post-treatment values (without response -NR- and with response -R-).
  • Ovarian carcinoma (8) 1.2 ( ⁇ 0.6) 1.5 ( ⁇ 0.2) 1.8 ( ⁇ 0.2)
  • Endometrial carcinoma (7) 1.4 ( ⁇ 0.5) 1.6 ( ⁇ 0.3) 1.7 ( ⁇ 0.3)
  • Lineage leukemias B (9) 1.3 ( ⁇ 0.2) 1.6 ( ⁇ 0.3) 1.7 ( ⁇ 0.3)
  • Non-Hodgkin lymphomas (8) 1.2 ( ⁇ 0.3) 1.7 ( ⁇ 0.2) 1.8 ( ⁇ 0.3) Leukemia (6) 1.4 ( ⁇ 0.4) 1.8 ( ⁇ 0.2) 1.8 ( ⁇ 0.3)
  • Example 4 Cancer patients show detectable levels of mRNA encoding the NK1 receptor and mRNA encoding the truncated form of the NK1 receptor in peripheral blood plasma. The levels of mRNA encoding the truncated form of the NK1 receptor are elevated in the blood plasma of cancer patients.
  • mRNA value encoding the truncated form of the NK1 receptor or "VARNmFT-NK1 R”
  • a “primer” was used that binds to a sequence that common to both forms, long and truncated, of the mRNA encoding both forms of the receptor, whose characteristics are expressed in table 4 with the reference of "tr-TACR1").
  • NK1 receiver TACR1 Table 5. Proportion between VARNmFT-NK1 R / VARNmFC-NK1 R ( ⁇ Standard deviation) in the plasma of the blood plasma of healthy human subjects and patients with various types of cancer. In brackets the number of human subjects studied is specified.
  • Table 5 shows the relationship between VARNmFT-NK1 R / VARNmFC-NK1 R ( ⁇ Standard Deviation) in healthy subjects and in patients with different types of cancer. It is shown that healthy human subjects the ratio between the joint value of the mRNA of the complete and truncated forms of the NK1 receptor (VARNmFT-NK1 R / VARNmFC-NK1 R) is close to 0, which shows that in the blood plasma of the healthy subjects, the predominant (exclusive) form is that of the mRNA that encodes the complete form of the NK1 receptor. In cancer patients this proportion is greater than 0, even greater than 1 or 2, which demonstrates that in the plasma of the blood plasma of cancer patients the presence of a significant amount of the mRNA truncated form of the NK1 receiver.
  • Example 5 Cancer patients show a relationship between the detectable levels of the mRNA encoding the NK1 receptor and the mRNA encoding the truncated form of the NK1 receptor in peripheral blood plasma, different depending on the tumor stage.
  • the present example demonstrates that cancer patients have a relationship between VARNmFT-NK1 R / VARNmFC-NK1 R which is higher in cases where the tumor stage is more advanced.
  • the VARNmFT-NK1 R / VARNmFC-NK1 R was determined in each case by the method explained in example 4. Patients for different types of cancer were selected for each type of cancer (stage I being the least advanced and the stage III the most advanced).
  • Colon carcinoma (6) 0.6 ( ⁇ 0.1) 1.9 ( ⁇ 0.3) 2.5 ( ⁇ 0.6)
  • Pancreatic carcinoma (6) 0.6 ( ⁇ 0.2) 1.5 ( ⁇ 0.2) 2.4 ( ⁇ 0.5)
  • Renal carcinoma (9) 0.7 ( ⁇ 0.1) 1.5 ( ⁇ 0.3) 1.9 ( ⁇ 0.4)
  • Endometrial carcinoma (7) 0.6 ( ⁇ 0.5) 1.5 ( ⁇ 0.2) 2.8 ( ⁇ 0.4)
  • Carcinoma of the uterine cervix (6) 0.7 ( ⁇ 0.3) 1.2 ( ⁇ 0.3) 2.1 ( ⁇ 0.6)
  • Papillary thyroid carcinoma (6) 0.7 ( ⁇ 0.1) 1.5 ( ⁇ 0.4) 2.5 ( ⁇ 0.5)
  • Follicular thyroid carcinoma (6) 0.6 ( ⁇ 0.2) 1.6 ( ⁇ 0.3) 2.1 ( ⁇ 0.4)
  • Non-Hodgkin lymphomas, of strain T (7) 1.6 ( ⁇ 0.2) 2.3 ( ⁇ 0.4) 3.9 ( ⁇ 0.4)
  • Burkitt lymphoma (6) 1.8 ( ⁇ 0.4) 2.4 ( ⁇ 0.4) 3.6 ( ⁇ 0.5)
  • Hodgkin lymphoma (6) 1.2 ( ⁇ 0.3) 2.4 ( ⁇ 0.5) 2.9 ( ⁇ 0.4)
  • Lineage B leukemias (6) 1.9 ( ⁇ 0.4) 2.4 ( ⁇ 0.4) 3.6 ( ⁇ 0.5)
  • Example 6 Cancer patients show a relationship between detectable levels of the NK1 receptor and the truncated form of the NK1 receptor, in plasma. of peripheral blood, different depending on the response to the specific treatment for this disease.
  • the present example shows that cancer patients have a relationship between VARNmFT-NK1 R / VARNmFC-NK1 R which is higher in cases where there is no response to treatment. In this way, the value of the relationship between VARNmFT-NK1 R / VARNmFC-NK1 R is diminished as a result of a better treatment response.
  • the VARNmFT-NK1 R and the VARNmFC-NK1 R were determined in each case by the method explained in example 4.
  • Type of cancer VARNmFT-NK1 R / VARNmFC Relationship number - subjects studied.
  • NK1 R ( ⁇ Standard Deviation).
  • Pre-treatment and post-treatment values (without response -NR- and with response -R-).
  • Endometrial carcinoma (7) 2.6 ( ⁇ 0.6) 3.7 ( ⁇ 0.4) 0.9 ( ⁇ 0.2)
  • Non-Hodgkin lymphomas (8) 3.7 ( ⁇ 0.5) 4.4 ( ⁇ 0.4) 0.5 ( ⁇ 0.2)
  • Leukemia (6) 3.6 ( ⁇ 0.5) 4.2 ( ⁇ 0.5) 0.7 ( ⁇ 0.3)
  • NK-1 receptor is expressed in human melanoma and is involved in the antitumor action of the NK-1 receptor antagonist Aprepitant on melanoma cell lines. Lab Invest. 2010; 90 (8): 1259-69

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Abstract

Método para diagnosticar y monitorizar la presencia de cáncer en un sujeto humano. Método de obtención de datos útiles para diagnosticar la presencia de un cáncer en un individuoy para determinar el estadío o grado de progresión de ese cáncer. También permite determinar la respuesta al tratamiento y agrupar a los sujetos en respondedores y no respondedores. Kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para llevar a cabo dicho método y sus usos.

Description

MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR Y MONITORIZAR LA PRESENCIA DE CÁNCER EN UN SUJETO HUMANO.
CAMPO DE LA INVENCIÓN.
La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina, la farmacia y la biología molecular, y más concretamente en el campo de la oncología. Específicamente, está relacionada con un método para diagnosticar la presencia de un cáncer, monitorizar la progresión de un cáncer o su respuesta a tratamiento en un sujeto humano, así como al kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para llevar a cabo dicho método y su uso.
ESTADO DE LA TÉCNICA.
Los receptores NK1 (receptores de la Neurokinina 1 o receptores neuropeptídicos de la Sustancia P y de las taquicininas), están ampliamente distribuidos en las células del organismo. Actualmente se conocen numerosos procesos biológicos en cuya regulación están involucrados los receptores NK1. Los receptores NK1 son receptores del tipo de los receptores acoplados a la proteína G.
Se ha publicado que el receptor NK1 se encuentra sobreexpresado en las células tumorales y que el uso de diversos antagonistas de los mismos puede inhibir la proliferación celular (Singh et al., 2000; Bigioni et al., 2005) y más en concreto, de células de carcinoma de pulmón (Orosz et al., 1995; Bunn et al., 1994; Muñoz et al., 2012), tumores cerebrales (Palma et al., 2000), tumores de células enterocromafines (patente EP 773026 -Pfizer-), carcinomas prostéticos (patente WO 2001001922), carcinoma de colon y de estómago (Rosso et al., 2008) o el melanoma (Muñoz et al., 2010).
La patente ES 2246687 reivindica la utilización de los antagonistas no peptídicos de receptores NK1 en la elaboración de una composición farmacéutica para la producción de apoptosis en células tumorales cancerosas de los mamíferos. La solicitud de patente española P201101311 (PCT/ES2012/070865) reivindica el uso de agentes modificadores del microambiente peritumoral, en concreto los antagonistas de los receptores NK1 , para el tratamiento del cáncer. Por otro lado, la solicitud de patente WO2012020162 describe el uso de anticuerpos o fragmentos de los mismos, frente a los receptores NK1 , NK2 y/o NK3, útiles en el tratamiento del cáncer.
El gen TAC1R es el gen que codifica para el receptor N K1 . Se ha descrito que en las células que componen los tejidos el receptor NK1 tiene dos formas: una forma larga que contiene 407 aminoácidos y una forma corta (truncada) que contiene 31 1 aminoácidos en la que dicho receptor carece de su extremo c-terminal citoplásmico (Kage et al., 1993; Guillespie et al. , 201 1 ). Ambas formas son el fruto de una variante de "splicing" del gen TAC1R que codifica el receptor NK1 .
Esta forma truncada del receptor NK1 está presente en las células tumorales cancerosas (Guillespie et al. , 201 1). La patente española P201330174 reivindica un método que incluye la detección de esta forma truncada en el tejido tumoral para ser utilizada para predecir la respuesta de estos tumores al tratamiento con los antagonistas del receptor NK1 .
Por lo tanto y en conclusión, en la actualidad son conocidos en el estado del arte, los siguientes hechos:
1 . Que los receptores NK1 están ampliamente difundidos en el organismo del ser humano.
2. Que la utilización de antagonistas no peptídicos del receptor NK1 puede ser útil en el tratamiento de los tumores cancerosos, mediante la inducción de muerte en las células tumorales por apoptosis (ES 2246687), modificación del microambiente tumoral (PCT/ES2012/070865) o mediante el uso de anticuerpos o fragmentos de los mismos, frente a estos receptores (WO2012020162).
3. Que las células tumorales pueden tener una forma corta o truncada del receptor N K1 .
4. Que esta forma truncada del receptor NK1 está presente en las células tumorales cancerosas y que su detección en el tejido tumoral puede ser utilizada para predecir la respuesta de estos tumores al tratamiento con los antagonistas del receptor NK1 (P201330174).
5. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de la forma corta (o truncada) del receptor NK1 , o del ARNm que la codifica, para:
a) diagnosticar de cáncer a un individuo,
b) monitorizar la progresión del cáncer en un individuo,
c) clasificar a un individuo en un estadio de la enfermedad, y/o
d) predecir la respuesta de dicho individuo al tratamiento del cáncer.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la forma corta (o truncada) del receptor NK1 , y/o el ARNm que la codifica, se detecta en sangre, y aún más preferiblemente en el plasma de la sangre. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el diagnóstico es un diagnóstico precoz.
En esta memoria se entiende por diagnóstico precoz de la enfermedad cancerosa o cáncer, cuando aún no se han puesto de manifiesto otros síntomas o signos de dicha enfermedad, o estos síntomas o signos no son específicos ni suficientes para el diagnóstico de la misma.
Preferiblemente, el diagnóstico puede ser complementario a otras pruebas, como por ejemplo, pero sin limitarse, datos clínicos, exploratorios, radiológicos, bioquímicos (sanguíneos o de otros fluidos corporales) y/o anatomopatológicos. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el tratamiento del cáncer del que se predice la respuesta del individuo, es un tratamiento con antagonistas del receptor N K1.
En otra realización preferida, el diagnóstico puede ser complementario a otras pruebas, como por ejemplo, pero sin limitarse, datos clínicos, exploratorios, radiológicos, bioquímicos (sanguíneos o de otros fluidos corporales) y/o anatomopatológicos.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método in vitro de obtención de datos útiles para diagnosticar de cáncer a un individuo, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende detectar los niveles de expresión de la forma corta (o truncada) del receptor NK1 , o del ARNm que lo codifica, en una muestra biológica aislada de dicho individuo. En una realización preferida de este aspecto el primer método de la invención comprende, además, detectar los niveles de expresión del receptor NK1 o los niveles del ARNm que lo codifica en una muestra biológica del individuo.
En otra realización preferida, la muestra biológica aislada es la sangre, y aún más preferiblemente, la muestra biológica es el plasma de la sangre de dicho individuo.
En otra realización preferida, el primer método de la invención comprende medir la relación entre los niveles de la forma entera y la truncada del receptor NK1 y/o del ARNm que lo/s codifica.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar de cáncer a un individuo, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende:
a) obtener una muestra biológica aislada del individuo,
b) detectar los niveles de expresión de la forma corta (o truncada) del receptor
NK1 , o del ARNm que lo codifica, en la muestra biológica del paso (a), y c) asignar a dicho individuo al grupo de individuos que padece cáncer cuando la forma corta (o truncada) del receptor NK1 o su ARNm presenta una expresión superior, o sobreexpresión, respecto a una muestra de referencia.
En una realización preferida de este aspecto el primer método de la invención comprende, además, detectar los niveles de expresión del receptor NK1 o los niveles del ARNm que lo codifica en una muestra biológica del individuo. En otra realización preferida, la muestra biológica aislada es la sangre, y aún más preferiblemente, la muestra biológica es el plasma de la sangre de dicho individuo.
En otra realización preferida, el primer método de la invención comprende medir la relación entre los niveles de la forma entera y la truncada del receptor NK1 y/o del ARNm que lo/s codifica. En otra realización preferida, la expresión superior, o sobreexpresion, se define como:
- Un valor de la forma truncada del receptor N K1 superior a 0 y/o
- Un valor de la relación entre la suma de los niveles de la forma entera y la truncada del receptor NK1 y otro factor que resulta del nivel de la forma completa de dicho receptor, mayor a 1 y/o
- Un valor del ARNm que codifica la forma truncada del receptor NK1 superior a 0.
- Un valor de la relación entre el nivel de ARNm que codifica la forma truncada y el nivel del ARNm que codifica la forma completa de dicho receptor mayor a 0.
En otra realización aún más preferida, la sobreexpresion se define como un nivel de expresión de la forma truncada del receptor NK1 , o del ARNm que codifica para la forma truncada del receptor NK1 respecto al nivel de expresión de la forma completa del receptor NK1 , o del ARNm que codifica para la forma completa del receptor NK1 , respectivamente, aumentado en más de al menos un:
a) 0,01 %
b) 0, 1 %
c) 1 %
d) 10%
e) 20%
f) 30%
g) 40%
h) 50%
i) 60%
j) 70%, o del
k) 80%
en la muestra biológica aislada del individuo.
En otra realización preferida de la presente invención, el método in vitro para diagnosticar el cáncer a un individuo comprende:
a) obtener una muestra biológica aislada del individuo,
b) detectar simultáneamente los niveles de expresión del receptor NK1 y de su forma corta o truncada, o del ARNm que los codifica, en la muestra biológica del paso (a), y c) asignar a dicho individuo al grupo de individuos que padece cáncer cuando la relación entre los niveles de expresión del receptor NK1 y los niveles de expresión de su forma truncada, o la relación entre el ANRm que los codifica respectivamente, tiene un valor mayor de 1
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección
a. de los niveles de expresión de la forma completa del receptor NK1 b. de los niveles de expresión de la forma truncada del receptor NK1
c. de la presencia del ARNm que codifica la forma completa del receptor NK1. d. de la presencia del ARNm que codifica la forma truncada del receptor NK1. se realiza por
i. un procedimiento de perfil genético, tal como una micromatriz, y/o
¡i. un procedimiento que comprende PCR, tal como una PCR en tiempo real; y/o
Ni. transferencia Northern, y/o
iv. western blot, y/o
iv. un procedimiento inmunohistoquímico y/o
v. un procedimiento de ELISA.
Más preferiblemente la detección de los niveles de expresión de los genes se realiza mediante Q-RT-PCR. En otra realización preferida, la detección de los niveles de proteínas, de la forma completa del receptor NK1 y/o de la forma truncada del receptor NK1 , se realiza mediante técnicas inmmunológicas. Más preferiblemente, las técnicas inmunológicas están basadas en reacciones de precipitación, basadas en reacciones de aglutinación, inmunomarcación, radioinmunoanálisis y técnicas radioinmunométricas, ELISA (Enzime Linked ImmunoadSorbent Assay), o en cualquiera de sus combinaciones. Más preferiblemente, las técnicas inmunológicas comprenden el inmunomarcaje. Aún más preferiblemente, el inmunomarcaje se selecciona de entre inmunomarcaje con anticuerpos conjugados a enzimas, inmunomarcaje con anticuerpos conjugados a fluorocromos, o citometría.
Más preferiblemente, la muestra biológica es plasma de la sangre extraída de un individuo. En otra realización preferida, el cáncer se selecciona de entre los siguientes: cáncer gástrico, preferentemente adenocarcinoma gástrico; cáncer de colon, preferentemente adenocarcinoma de colon; cáncer de páncreas, preferentemente adenocarcinoma de páncreas; cáncer renal, cáncer de mama, cáncer de ovario, preferentemente adenocarcinoma de ovario; cáncer de endometrio; cáncer de cérvix uterino; cáncer de pulmón, preferentemente carcinoma de pulmón de célula no pequeña y/o carcinoma de pulmón de células pequeñas; cáncer de tiroides, preferentemente carcinoma de tiroides papilar y/o carcinoma folicular de tiroides; carcinoma de vejiga, preferentemente carinoma transicional de vejiga de la orina; carcinoma de próstata; cáncer de estirpe glial del sistema nervioso central (glioma); sarcomas, preferentemente fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno y sarcoma de Edwing; melanoma; cánceres embrionarios, preferentemente neuroblastoma; y cánceres hematológicos, preferentemente leucemias de estirpe B o de estirpe T, linfomas no Hodgkin, preferentemente de estirpe B o de estirpe T, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin y mieloma múltiple.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para clasificar a un individuo que padece un cáncer en un estadio tumoral determinado, de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende los pasos los pasos a) - c) según el primer o segundo método de la invención, y además comprende clasificar al individuo en el grupo de individuos que padece cáncer en estadio I, II, III o IV en función de:
a) el nivel de la forma truncada del receptor NK1 y/o
b) el nivel del ARNm que codifica la forma truncada del receptor NK1 y/o c) el valor de la relación entre la suma de los niveles de la forma entera y la truncada del receptor NK1 y otro factor que resulta del nivel de la forma completa de dicho receptor y/o
d) el valor de la relación entre el nivel de ARNm que codifica la forma truncada y el nivel del ARNm que codifica la forma completa de dicho receptor.
La clasificación se realiza en función de los criterios recogidos en (Sobin LH, Gospodarowicz MK, Wittekind Ch. Eds. TNM Classification of Malignant Tumors, 7th ed. Wiley-Blackwell, Oxford 2009; url: http://www.uicc.org/resources/tnm En una realización preferida de este aspecto, el tercer método de la invención además comprende clasificar al individuo en el grupo de individuos que padece cáncer en estadio I cuando:
a) el valor de la relación entre la suma de los niveles de la forma entera y la truncada del receptor NK1 y el nivel de la forma completa de dicho receptor, es mayor a 1 y menor a 1 ,5 y/o
b) el valor de la relación entre el nivel de ARNm que codifica la forma truncada y el nivel del ARNm que codifica la forma completa de dicho receptor es mayor a 0 y menor a 1 ,2.
En otra realización preferida de este aspecto, el tercer método de la invención además comprende clasificar al individuo en el grupo de individuos que padece cáncer en estadio I I cuando:
a) el valor de la relación entre la suma de los niveles de la forma entera y la truncada del receptor NK1 y el nivel de la forma completa de dicho receptor, es mayor a 1 ,5 y menor a 1 ,6 y/o
b) el valor de la relación entre el nivel de ARNm que codifica la forma truncada y el nivel del ARNm que codifica la forma completa de dicho receptor es mayor a 1 ,2 y menor a 1 ,9.
En otra realización preferida de este aspecto, el tercer método de la invención además comprende clasificar al individuo en el grupo de individuos que padece cáncer en estadio II I cuando;
a) el valor de la relación entre la suma de los niveles de la forma entera y la truncada del receptor NK1 y el nivel de la forma entera de dicho receptor, es mayor a 1 ,6 y menor a 1 ,9 y/o
b) el valor de la relación entre el nivel de ARNm que codifica la forma truncada y el nivel del ARNm que codifica la forma entera de dicho receptor es mayor a 1 ,9 y menor a 3,9.
En otra realización preferida de este aspecto, el tercer método de la invención además comprende clasificar al individuo en el grupo de individuos que padece cáncer en estadio IV cuando: a) el valor de la relación entre la suma de los niveles de la forma entera y la truncada del receptor NK1 y el nivel de la forma completa de dicho receptor, es mayor a 1 ,9 y/o
b) el valor de la relación entre el nivel de ARNm que codifica la forma truncada y el nivel del ARNm que codifica la forma completa de dicho receptor es mayor a
3,9.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección
a. de los niveles de expresión de la forma completa del receptor NK1 b. de los niveles de expresión de la forma truncada del receptor NK1
c. de la presencia del ARNm que codifica la forma completa del receptor NK1. d. de la presencia del ARNm que codifica la forma truncada del receptor NK1. se realiza por
i. un procedimiento de perfil genético, tal como una micromatriz, y/o
¡i. un procedimiento que comprende PCR, tal como una PCR en tiempo real; y/o
Ni. transferencia Northern, y/o
iv. western blot, y/o
iv. un procedimiento inmunohistoquímico y/o
v. un procedimiento de ELISA.
Más preferiblemente la detección de los niveles de expresión de los genes se realiza mediante Q-RT-PCR. En otra realización preferida, la detección de los niveles de proteínas, de la forma completa del receptor NK1 y/o de la forma truncada del receptor NK1 , se realiza mediante técnicas inmmunológicas. Más preferiblemente, las técnicas inmunológicas están basadas en reacciones de precipitación, basadas en reacciones de aglutinación, inmunomarcación, radioinmunoanálisis y técnicas radioinmunométricas, ELISA (Enzime Linked ImmunoadSorbent Assay), o en cualquiera de sus combinaciones. Más preferiblemente, las técnicas inmunológicas comprenden el inmunomarcaje. Aún más preferiblemente, el inmunomarcaje se selecciona de entre inmunomarcaje con anticuerpos conjugados a enzimas, inmunomarcaje con anticuerpos conjugados a fluorocromos, o citometría.
Más preferiblemente, la muestra biológica es plasma de la sangre extraída de individuo. En otra realización preferida, el cáncer se selecciona de entre los siguientes: cáncer gástrico, preferentemente adenocarcinoma gástrico; cáncer de colon, preferentemente adenocarcinoma de colon; cáncer de páncreas, preferentemente adenocarcinoma de páncreas; cáncer renal, cáncer de mama, cáncer de ovario, preferentemente adenocarcinoma de ovario; cáncer de endometrio; cáncer de cérvix uterino; cáncer de pulmón, preferentemente carcinoma de pulmón de célula no pequeña y/o carcinoma de pulmón de células pequeñas; cáncer de tiroides, preferentemente carcinoma de tiroides papilar y/o carcinoma folicular de tiroides; carcinoma de vejiga, preferentemente carinoma transicional de vejiga de la orina; carcinoma de próstata; cáncer de estirpe glial del sistema nervioso central (glioma); sarcomas, preferentemente fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno y sarcoma de Edwing; melanoma; cánceres embrionarios, preferentemente neuroblastoma; y cánceres hematológicos, preferentemente leucemias de estirpe B o de estirpe T, linfomas no Hodgkin, preferentemente de estirpe B o de estirpe T, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin y mieloma múltiple.
Un quinto aspecto de la presente invención se refiere al uso de un marcador que se selecciona de entre:
a) el nivel o concentración del receptor NK1 en plasma de la sangre y/o b) el nivel o concentración de la forma corta (o truncada) del receptor NK1 en plasma de la sangre y/o
c) el nivel o concentración del ARNm que codifica para del receptor NK1 en plasma de la sangre y/o
d) el nivel o concentración del ARNm que codifica para la forma corta (o truncada) del receptor NK1 en plasma de la sangre y/o
o cualquiera de sus combinaciones, para predecir o pronosticar la respuesta de un sujeto humano o individuo que padece un cáncer, al tratamiento con un antagonista del receptor NK1. Preferiblemente, los marcadores se emplean simultáneamente.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección
a. de los niveles de expresión de la forma completa del receptor NK1 b. de los niveles de expresión de la forma truncada del receptor NK1
c. de la presencia del ARNm que codifica la forma completa del receptor NK1. d. de la presencia del ARNm que codifica la forma truncada del receptor NK1. se realiza por
i. un procedimiento de perfil genético, tal como una micromatriz, y/o
¡i. un procedimiento que comprende PCR, tal como una PCR en tiempo real; y/o
Ni. transferencia Northern, y/o
iv. western blot, y/o
iv. un procedimiento inmunohistoquímico y/o
v. un procedimiento de ELISA. Más preferiblemente la detección de los niveles de expresión de los genes se realiza mediante Q-RT-PCR. En otra realización preferida, la detección de los niveles de proteínas, de la forma completa del receptor NK1 y/o de la forma truncada del receptor NK1 , se realiza mediante técnicas inmmunológicas. Más preferiblemente, las técnicas inmunológicas están basadas en reacciones de precipitación, basadas en reacciones de aglutinación, inmunomarcación, radioinmunoanálisis y técnicas radioinmunométricas, ELISA (Enzime Linked ImmunoadSorbent Assay), o en cualquiera de sus combinaciones. Más preferiblemente, las técnicas inmunológicas comprenden el inmunomarcaje. Aún más preferiblemente, el inmunomarcaje se selecciona de entre inmunomarcaje con anticuerpos conjugados a enzimas, inmunomarcaje con anticuerpos conjugados a fluorocromos, o citometría.
En otra realización preferida, el cáncer se selecciona de entre los siguientes: cáncer gástrico, preferentemente adenocarcinoma gástrico; cáncer de colon, preferentemente adenocarcinoma de colon; cáncer de páncreas, preferentemente adenocarcinoma de páncreas; cáncer renal, cáncer de mama, cáncer de ovario, preferentemente adenocarcinoma de ovario; cáncer de endometrio; cáncer de cérvix uterino; cáncer de pulmón, preferentemente carcinoma de pulmón de célula no pequeña y/o carcinoma de pulmón de células pequeñas; cáncer de tiroides, preferentemente carcinoma de tiroides papilar y/o carcinoma folicular de tiroides; carcinoma de vejiga, preferentemente carinoma transicional de vejiga de la orina; carcinoma de próstata; cáncer de estirpe glial del sistema nervioso central (glioma); sarcomas, preferentemente fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno y sarcoma de Edwing; melanoma; cánceres embrionarios, preferentemente neuroblastoma; y cánceres hematológicos, preferentemente leucemias de estirpe B o de estirpe T, linfomas no Hodgkin, preferentemente de estirpe B o de estirpe T, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin y mieloma múltiple.
Un sexto aspecto de la invención se refiere un método in vitro para evaluar la evolución de un individuo diagnosticado de cáncer que comprende detectar los niveles del receptor NK1 y/o de su forma corta (o truncada) y/o una combinación de los mismos o del ARNm que los codifica en una muestra biológica de dicho individuo, en dos o más tiempos diferentes. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección
a. de los niveles de expresión de la forma completa del receptor NK1 b. de los niveles de expresión de la forma truncada del receptor NK1
c. de la presencia del ARNm que codifica la forma completa del receptor NK1. d. de la presencia del ARNm que codifica la forma truncada del receptor NK1. se realiza por
i. un procedimiento de perfil genético, tal como una micromatriz, y/o
¡i. un procedimiento que comprende PCR, tal como una PCR en tiempo real; y/o
Ni. transferencia Northern, y/o
iv. western blot, y/o
iv. un procedimiento inmunohistoquímico y/o
v. un procedimiento de ELISA.
Más preferiblemente la detección de los niveles de expresión de los genes se realiza mediante Q-RT-PCR. En otra realización preferida, la detección de los niveles de proteínas, de la forma completa del receptor NK1 y/o de la forma truncada del receptor NK1 , se realiza mediante técnicas inmmunológicas. Más preferiblemente, las técnicas inmunológicas están basadas en reacciones de precipitación, basadas en reacciones de aglutinación, inmunomarcación, radioinmunoanálisis y técnicas radioinmunométricas, ELISA (Enzime Linked ImmunoadSorbent Assay), o en cualquiera de sus combinaciones. Más preferiblemente, las técnicas inmunológicas comprenden el inmunomarcaje. Aún más preferiblemente, el inmunomarcaje se selecciona de entre inmunomarcaje con anticuerpos conjugados a enzimas, inmunomarcaje con anticuerpos conjugados a fluorocromos, o citometría. Más preferiblemente, la muestra biológica es plasma de la sangre extraída de un individuo.
En otra realización preferida, el cáncer se selecciona de entre los siguientes: cáncer gástrico, preferentemente adenocarcinoma gástrico; cáncer de colon, preferentemente adenocarcinoma de colon; cáncer de páncreas, preferentemente adenocarcinoma de páncreas; cáncer renal, cáncer de mama, cáncer de ovario, preferentemente adenocarcinoma de ovario; cáncer de endometrio; cáncer de cérvix uterino; cáncer de pulmón, preferentemente carcinoma de pulmón de célula no pequeña y/o carcinoma de pulmón de células pequeñas; cáncer de tiroides, preferentemente carcinoma de tiroides papilar y/o carcinoma folicular de tiroides; carcinoma de vejiga, preferentemente carinoma transicional de vejiga de la orina; carcinoma de próstata; cáncer de estirpe glial del sistema nervioso central (glioma); sarcomas, preferentemente fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno y sarcoma de Edwing; melanoma; cánceres embrionarios, preferentemente neuroblastoma; y cánceres hematológicos, preferentemente leucemias de estirpe B o de estirpe T, linfomas no Hodgkin, preferentemente de estirpe B o de estirpe T, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin y mieloma múltiple. Un séptimo aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un agonista de NK1 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo identificable por el primer, segundo o tercer método de la invención, como individuos que padecen cáncer, o que pueden ser clasificados en un estadio determinado del cáncer.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el antagonista es un antagonista no peptídico. Más preferiblemente, el antagonista no peptídico se selecciona de la lista que consiste en: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant, Lanepitant, LY-686017, L-733,060, L-732, 138, L-703,606, WIN 62,577, CP- 122721 , , TAK-637, y R673, CP-100263, WIN 51708, CP-96345, L-760735, CP- 122721 , L-758298, L-741671 , L-742694, CP-99994, T-2328, o cualquiera de sus combinaciones. Aún más preferiblemente, el antagonista no peptídico del recpetor NK1 se seleccionan de entre: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant y Lanepitant, o cualquiera de sus combinaciones. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el antagonista es un antagonista peptídico. Más preferiblemente, el antagonista peptídico es un anticuerpo o un fragmento del mismo, específico contra los receptores celulares NK1 , NK2 y/o NK3, o combinaciones de los mismos. Aún más preferiblemente es un anticuerpo o un fragmento del mismo que reconoce al menos una secuencia de los receptores NK1 , NK2 o NK3, seleccionada entre: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7, o un fragmento de las mismas, o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%.
Un octavo aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos, o fragmentos de los mismos, capaces de detectar o unirse a la forma truncada del receptor NK1 , o el ARNm que lo codifica, y preferiblemente también comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar la forma entera del receptor NK1 , o el ARNm que lo codifica y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares debases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 4 (forma corta del receptor NK1) y/o SEQ ID NO: 2 (forma larga del receptor NK1),
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 4 (forma corta del receptor NK1) y/o SEQ ID NO: 2 (forma larga del receptor NK1), - los anticuerpos o fragmentos de los mismos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 1 (forma larga del receptor NK1 ), SEQ ID NO: 3 (forma corta del receptor NK1 ), o un fragmento de las mismas, o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%.
Preferiblemente, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente 32P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica.
En otra realización preferida, el kit o dispositivo de la invención comprende al menos un anticuerpo que se selecciona de entre:
a) un anticuerpo anti-NK1 en su forma completa, preferiblemente que reconozca un epitopo localizado en el extremos c-terminal del receptor.
b) un anticuerpo anti-NK1 en su forma truncada, preferiblemente que reconozca un epitopo en alguno de los puentes transmembrana del receptor.
Más preferiblemente, comprende al menos un anticuerpo anti-NK1 en su forma completa y un anticuerpo anti-NK1 en su forma truncada, y aún más preferiblemente el anticuerpo es monoclonal. En otra realización preferida, el anticuerpo es policlonal. Aún más preferiblemente, el anticuerpo se encuentra marcado con un fluorocromo, y aún mucho más preferiblemente, el fluorocromo se selecciona de la lista que comprende: Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones.
Un noveno aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención para llevar a cabo un método según se describe en cualquiera de los objetos de la invención. Un décimo aspecto de la invención se refiere a un soporte sólido, o chip de proteínas, que comprende al menos uno de los anticuerpos anti-receptor NK1 y/o anti- receptor NK1 truncado, o cualquiera de sus combinaciones, para llevar a cabo el cualquiera de los métodos de la invención.
Un undécimo aspecto de la invención se refiere a un soporte sólido, o chip de DNA, que comprende oligonucleótidos o microarrays de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de al menos uno de los genes (receptor NK1 o receptor truncado).
Un duodécimo aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que un ordenador lleve a la práctica el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención. Un decimotercer aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Un decimocuarto aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la presente memoria, se utilizan las expresiones "nivel" o "niveles" cuando nos referimos a la cantidad de una determinada sustancia presente y detectable en un determinado medio. Más en concreto utilizamos estas expresiones para referirnos a la cantidad de una proteína como las formas completa y truncada del receptor NK1 o de una secuencia de ácido nucleico como el ARNm que codifica las formas completa y truncada de dicho receptor.
El inventor describe en la presente invención:
1. Que las formas larga y corta (o truncada) del receptor NK1 están presentes en el plasma de de la sangre de los pacientes con cáncer. Que la presencia de la forma corta (o truncada) del receptor NK1 en el plasma de la sangre es específica de los pacientes con cáncer.
Que la detección de la presencia de dicha forma corta (o truncada) del receptor NK1 en plasma de la sangre es posible en los pacientes con cáncer.
Que la detección de la presencia de dicha forma corta del receptor NK1 es útil para el diagnóstico precoz del cáncer en estadios tempranos, pudiendo ser utilizada como método de "screening".
Que la detección de la presencia de dicha forma corta del receptor NK1 , en el plasma de la sangre de los pacientes con cáncer, es útil para la monitorización de la evolución de un cáncer pues aumenta al progresar éste y disminuye al regresar estos tumores cancerosos, pudiendo ser utilizada como método de evaluación de la evolución de los tumores cancerosos: crecimiento o progresión de los mismos, respuesta al tratamiento de estos tumores cancerosos o como marcador de recaída de la enfermedad cancerosa.
Que la detección de la presencia de dicha forma corta del receptor NK1 , en el plasma de la sangre de los pacientes con cáncer, es útil para predecir la respuesta de los mismos al tratamiento con antagonistas de los receptores NK1.
Que el ARN mensajero (ARNm) que codifica las formas larga y corta (o truncada) del receptor NK1 están presentes en el plasma de la sangre de los pacientes con cáncer.
Que la presencia el ARN mensajero que codifica la forma corta (o truncada) del receptor NK1 en el plasma de la sangre es específica de los pacientes con cáncer.
Que es posible la detección del ARN mensajero que codifica la forma corta (o truncada) del receptor NK1 en el plasma de la sangre de los pacientes con cáncer.
Que la detección de la presencia del ARN mensajero que codifica la forma corta (o truncada) del receptor NK1 en el plasma de la sangre es útil para el diagnóstico precoz del cáncer en estadios tempranos, pudiendo ser utilizada como método de "screening".
Que la detección de la presencia de dicho ARN mensajero que codifica la forma corta del receptor NK1 en el plasma de la sangre de los pacientes con cáncer es útil para la monitorización de la evolución de los tumores cancerosos, pues aumenta al progresar éstos y disminuye al regresar estos tumores cancerosos, pudiendo ser utilizada como método de evaluación de la evolución de los tumores: crecimiento o progresión de los mismos, respuesta al tratamiento de un cáncero como marcador de recaída de la enfermedad cancerosa.
12. Que la detección de la presencia de dicho ARN mensajero que codifica la forma corta del receptor NK1 , en el plasma de la sangre de los pacientes con cáncer, es útil para predecir la respuesta de los mismos al tratamiento con antagonistas de los receptores NK1 .
Este conocimiento permite establecer: 1) un diagnóstico más temprano de los tumores -incluso antes de que sean clínicamente detectables-, 2) la realización de "screening" en la población general para la detección temprana o precoz de los tumores cancerosos, 3) la monitorización de la evolución de los tumores cancerosos, incluidas su respuesta a tratamientos específicos o las recaídas de la enfermedad cancerosa, 4) una herramienta de importancia pronostica y 5) la elección de pautas de tratamiento o de soporte propios de pacientes oncológicos más adecuadas, eventualmente más efectivas y con menos efectos indeseables, para conseguir un resultado más eficaz y eficiente.
La presente invención se refiere al uso de un marcador que se selecciona de entre: a) el nivel la forma larga del receptor NK1 , en una muestra biológica aislada que, preferiblemente, comprende plasma de la sangre y/o
b) el nivel de la forma corta (o truncada) del receptor NK1 en una muestra biológica aislada que, preferiblemente, comprende plasma de la sangre y/o c) el nivel del ARNm que codifica la forma larga del receptor NK1 en una muestra biológica aislada que, preferiblemente, comprende plasma de la sangre y/o
d) el nivel del ARNm que codifica la forma corta (o truncada) del receptor N K1 y/o , en una muestra biológica aislada que, preferiblemente, comprende plasma de la sangre
o cualquiera de sus combinaciones, en un sujeto humano, para
a) diagnosticar la presencia de un cáncer, b) monitorizar o conocer la evolución de un cáncer de forma que se pueda determinar la progresión de los mismos,
c) monitorizar o conocer la respuesta al tratamiento de un cáncer.
d) predecir o pronosticar la respuesta de un cáncer al tratamiento con antagonistas de los receptores NK1.
Preferiblemente, los marcadores se emplean simultáneamente. Más preferiblemente, la muestra biológica es plasma de sangre periférica.
En la presente invención se demuestra que en el plasma de la plasma de la sangre de los pacientes que padecen un cáncer es detectable la presencia del receptor NK1 en sus formas largas y cortas (o truncadas), así como la presencia del ARN mensajero que codifica ambas formas.
MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR DE CÁNCER A UN INDIVIDUO
Así, un aspecto de la invención se refiere a un método para diagnosticar un cáncer en un sujeto humano o individuo, que comprende usar, como un indicador, en una muestra biológica aislada, preferiblemente, que comprende plasma de la sangre de ese sujeto, la presencia de la forma larga (o completa) del receptor NK1 , o del ARNm que la codifica, y/o el nivel la forma corta (o truncada) del receptor NK1 , o del ARNm que la codifica, o una combinación de los anteriores.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, se usa como indicador el nivel del receptor NK1 en su forma larga y/o el nivel del receptor NK1 en su forma corta y/o el nivel del ARNm que codifica el receptor NK1 y/o que codifica la forma corta (o truncada) del receptor NK1 y/o la relación entre cualquiera de ellos.
En otra realización preferida, el método de la invención comprende los siguientes pasos:
a. obtener una muestra biológica aislada que, preferiblemente, comprende plasma de la sangre periférica de un sujeto humano.
b. detectar los niveles del receptor NK1 en su forma larga o del ARNm que la codifica, en la muestra obtenida en el paso (a).
c. detectar los niveles del receptor NK1 en su forma corta (o truncada) o del ARNm que la codifica, en la muestra obtenida en el paso (a). d. Hallar la proporción entre los niveles detectados en cualquiera de los pasos (b) y (c).
Preferiblemente, el resultado del primer método de la invención es indicativo de la presencia de un cáncer en el sujeto humano del que se ha obtenido la muestra, preferiblemente, de plasma de la sangre periférica, aunque éste cáncer no sea detectable por los actuales métodos diagnósticos (clínicos, radiológicos, bioquímicos, anatomopatológicos u otros). Más preferiblemente,
el valor de la forma truncada del receptor NK1 superior a 0 y/o
el valor de la relación entre un factor que resulta de la suma de los niveles de la forma entera y la truncada del receptor NK1 y otro factor que resulta del nivel de la forma completa de dicho receptor es mayor a 1 y/o
- el valor del ARNm que codifica la forma truncada del receptor NK1 es superior a 0 y/o
el valor de la relación entre el nivel de ARNm que codifica la forma truncada y el nivel del ARNm que codifica la forma completa de dicho receptor es mayor a 1 .
Más preferiblemente, los niveles del receptor NK1 (en su forma completa) o del ARNm que lo codifica están aumentados más de un 0,01 % respecto a los sujetos humanos sanos en la muestra biológica aislada obtenida en el paso (a). Aún más preferiblemente, el nivel del receptor NK1 , o del ARNm que codifica para el receptor NK1 , aumentado en más del 0, 1 %, 1 %, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, y aún mucho más preferiblemente, en más de un 90%.
Más preferiblemente aún, los niveles de la forma corta (o truncada) del receptor NK1 o del ARNm que la codifica están aumentados más de un 0,01 % respecto a los sujetos humanos sanos en la muestra biológica aislada obtenida en el paso (a). Aún más preferiblemente, el nivel del receptor NK1 , o del ARNm que codifica para el receptor NK1 , aumentado en más del 0, 1 %, 1 %, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, y aún mucho más preferiblemente, en más de un 90%. MÉTODO PARA ESTABLECER EL GRADO DE PROGRESIÓN DE UN CANCER Otro aspecto de la invención se refiere a un método para establecer el grado de progresión de un cáncer en un sujeto humano, en el que el sujeto padece un cáncer, que comprende usar, como un indicador, en una muestra biológica aislada que, preferiblemente, comprende plasma de la sangre de ese sujeto, la presencia de la forma larga del receptor NK1 , y/o del ARNm que la codifica, y/o el nivel la forma corta (o truncada) del receptor NK1 , y/o del ARNm que la codifica y/o la relación entre éstos.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, se usa como indicador el nivel del receptor NK1 en su forma larga y/o el nivel del receptor NK1 en su forma corta y/o el ARNm que codifica el receptor NK1 y/o el ARNm que codifica la forma corta (o truncada) de dicho receptor y/o la relación entre éstos para conocer o monitorizar el estadio de evolución de un tumor canceroso en un sujeto humano. Esta monitorización comprende determinar el nivel de progresión del cáncer, su estadio evolutivo y los cambios del mismo a lo largo de un periodo de tiempo. Esta monitorización permite establecer el estadio de progresión del tumor, un pronóstico y consecuentemente, elegir las opciones terapéuticas más adecuadas.
En otra realización preferida, este método de la invención comprende:
a. obtener una muestra biológica aislada que comprende plasma de la sangre periférca de un sujeto humano que padece un cáncer.
b. detectar los niveles del receptor NK1 en su forma larga o del ARNm que la codifica, en la muestra obtenida en el paso (a).
c. detectar los niveles del receptor NK1 en su forma corta (o truncada) o del ARNm que la codifica, en la muestra obtenida en el paso (a).
d. Hallar la relación entre los niveles detectados en los pasos (b) y (c).
e. Repetir los pasos (a), (b), (c) y (d) de forma periódica en el tiempo.
METODO PARA MONITORIZAR LA EVOLUCIÓN DEL CÁNCER
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para monitorizar la evolución de un cáncer en un sujeto humano que está sometido a tratamiento específico para dicho cáncer, que comprende usar, como un indicador, en una muestra biológica aislada que, preferiblemente, comprende plasma de la sangre de ese sujeto, la presencia de la forma larga del receptor NK1 , y/o del ARNm que la codifica, y/o el nivel la forma corta (o truncada) del receptor NK1 , y/o del ARNm que la codifica, y/o la proporción entre éstos.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, se usa como indicador el nivel del receptor NK1 en su forma larga y/o el nivel del receptor NK1 en su forma corta y/o el ARNm que codifica el receptor NK1 y/o el ARNm que codifica la forma corta (o truncada) de dicho receptor y/o la relación entre éstos para establecer el grado de evolución de un tumor canceroso en un sujeto humano a lo largo del periodo que dure el tratamiento del mismo. Esta monitorización comprende determinar el nivel de progresión del cáncer y su estadio evolutivo desde el momento en que se inicia el tratamiento específico para dicho cáncer. Esta monitorización permite conocer el grado de respuesta de un tumor al tratamiento específico para el mismo y consecuentemente, elegir las opciones terapéuticas más adecuadas. En otra realización preferida, el método de la invención comprende:
a. obtener una muestra biológica aislada que, preferiblemente, comprende plasma de la sangre periférca del individuo,
b. detectar los niveles del receptor NK1 en su forma larga o del ARNm que la codifica, en la muestra obtenida en el paso (a).
c. detectar los niveles del receptor NK1 en su forma corta (o truncada) o del
ARNm que la codifica, en la muestra obtenida en el paso (a).
d. Hallar la relación entre los niveles de los pasos (b) y (c).
e. Repetir los pasos (a), (b), (c) y (d) de forma periódica en el tiempo durante la evolución del sujeto humano.
f. Hallar la relación entre los datos obtenidos en cada una de las repeticiones del paso (e).
Preferiblemente, el resultado de este método de la invención es indicativo de la progresión o de la regresión de un cáncer en el sujeto humano del que se ha obtenido la muestra, preferiblemente, de plasma de la sangre del paso (a) y de su respuesta al tratamiento específico. En una realización preferida del tercer método, el resultado, será indicador de progresión del cáncer cuando los valores obtenidos en las repeticiones del paso (e) sean secuencialmente mayores. En otra realización preferida del tercer método, el resultado, será indicador de regresión del cáncer cuando los valores obtenidos en las repeticiones del paso (e) sean secuencialmente menores. En una realización preferida de este método, el resultado, será indicador de regresión total o respuesta completa al tratamiento, del cáncer cuando los valores obtenidos en las repeticiones del paso (e) sean secuencialmente menores y la última repetición muestre algunos de los siguientes valores:
a) nivel del receptor NK1 menor al 10% del nivel del receptor NK1 detectable en sujetos sanos (control), y/o
b) nivel de la forma corta (o truncada) del receptor NK1 menor al 1 % del nivel del receptor NK1 detectable en sujetos sanos (control) , y/o
c) nivel de la forma corta (o truncada) del receptor NK1 menor al 10% del nivel del receptor NK1 , y/o
d) nivel del ARNm que codifica para la forma corta (o truncada) del receptor NK1 menor del 1 % del ARNm que codifica la forma corta (o truncada) del receptor N K1 , y/o
e) cualquiera de sus combinaciones.
En una realización aún más preferida de éste método, el resultado, será indicador de regresión total del cáncer cuando los valores obtenidos en las repeticiones del pasos (e) sean secuencialmente menores y la última repetición muestre algunos de los siguientes valores:
a) nivel de la forma corta (o truncada) del receptor NK1 sea de 0 ó indetectable.
b) nivel del ARNm que codifica para la forma corta (o truncada) del receptor NK1 sea de 0 o indetectable. En una realización también preferida del método, el resultado, será indicador de recaída o reaparición de la enfermedad tumoral cancerosa cuando tras la obtención de resultados indicadores de regresión total del tumor o respuesta completa al tratamiento mantenidos, los valores obtenidos en las repeticiones del pasos (e) sean secuencialmente mayores y la última repetición muestre algunos de los siguientes valores:
a) nivel del receptor NK1 mayor al 10% del nivel del receptor NK1 detectable en sujetos sanos (control), y/o
b) nivel de la forma corta (o truncada) del receptor NK1 mayor al 1 % del nivel del receptor NK1 detectable en sujetos sanos (control) , y/o c) nivel de la forma corta (o truncada) del receptor NK1 mayor al 10% del nivel del receptor NK1 , y/o
d) nivel del ARNm que codifica para la forma corta (o truncada) del receptor NK1 mayor del 1 % del ARNm que codifica la forma corta (o truncada) del receptor NK1 , y/o
e) cualquiera de sus combinaciones.
En una realización aún más preferida, el resultado, será indicador de recaída o reaparición de la enfermedad tumoral cancerosa cuando tras la obtención de resultados indicadores de regresión total del tumor o respuesta completa al tratamiento mantenidos, los valores obtenidos en las repeticiones del pasos (e) sean secuencialmente mayores y la última repetición muestre algunos de los siguientes valores:
a) nivel de la forma corta (o truncada) del receptor NK1 sea mayor de 0. b) nivel del ARNm que codifica para la forma corta (o truncada) del receptor NK1 sea mayor de 0.
En una realización, la respuesta es una respuesta a la reducción de la carga tumoral. En una realización alternativa, la respuesta es una mejora o ausencia de deterioro del estado del tumor. En otra realización, la respuesta es un resultado clínico, tal como la supervivencia exenta de progresión o la supervivencia global. En otra realización, la respuesta es una mejora en el tamaño del tumor detectable por técnicas radiológicas, una mejora en el número de células tumorales detectables en plasma de la sangre por inmunocitoquímica o citometría de flujo, o una mejora en el valor de otros marcadores tumorales específicos detectables, preferiblemente, en plasma de la sangre.
MÉTODO PARA PREDECIR O PRONOSTICAR LA RESPUESTA EN PACIENTES CON CÁNCER AL TRATAMIENTO CON UN ANTAGONISTA DEL RECEPTOR NK1.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método, de ahora en adelante cuarto método de la invención, para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento específico con antagonistas del receptor NK1 , en el que el sujeto padece un cáncer, en una muestra biológica aislada que, preferiblemente, comprende plasma de la sangre de ese sujeto, que comprende usar como un indicador la presencia de la forma larga del receptor NK1 , y/o del ARNm que la codifica, y/o el nivel la forma corta (o truncada) del receptor NK1 , y/o del ARNm que la codifica, y/o la proporción entre éstos.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, se usa como indicador el nivel del receptor NK1 en su forma larga y/o el nivel del receptor NK1 en su forma corta y/o el ARNm que codifica el receptor NK1 y/o el ARNm que codifica la forma corta (o truncada) de dicho receptor y/o la proporción entre éstos para predecir o pronosticar la respuesta del cáncer de un paciente al tratamiento con antagonistas de los receptores NK1. Esta realización permite, de manera previa al tratamiento, predecir la respuesta de este tumor canceroso al tratamiento con antagonistas de los receptores NK1 y consecuentemente, elegir las opciones terapéuticas más adecuadas. También permitiría predecir o pronosticar la respuesta una vez iniciado el tratamiento, e igualmente continuar con el mismo o elegir otras opciones terapéuticamente más adecuadas. En otra realización preferida, el método de la invención comprende:
a. obtener una muestra biológica aislada que, preferiblemente, comprende plasma de la sangre periférica de un sujeto humano que padece un cáncer.
b. detectar los niveles del receptor NK1 en su forma larga o del ARNm que la codifica, en la muestra obtenida en el paso (a).
c. detectar los niveles del receptor NK1 en su forma corta (o truncada) o del
ARNm que la codifica, en la muestra obtenida en el paso (a).
d. Hallar la proporción entra los niveles de los pasos (b) y (c).
Preferiblemente, el resultado del método de la invención es indicativo de la respuesta del cáncer en el sujeto humano del que se ha obtenido la muestra, preferiblemente de plasma de la sangre del paso (a) al tratamiento específico con antagonistas del receptor NK1. En una realización preferida del cuarto método, el resultado, será indicador de buena respuesta del tumor al tratamiento con antagonistas del receptor NK1 , cuando en los pasos (b) y/o (c) y/o (d) se muestre algunos de los siguientes valores:
a) nivel del receptor NK1 mayor al 10% del nivel del receptor NK1 detectable en sujetos sanos (control), y/o
b) nivel de la forma corta (o truncada) del receptor N K1 mayor al 1 % del nivel del receptor NK1 detectable en sujetos sanos (control) , y/o
c) nivel de la forma corta (o truncada) del receptor N K1 mayor al 10% del nivel del receptor NK1 , y/o
d) nivel del ARNm que codifica para la forma corta (o truncada) del receptor
NK1 mayor del 1 % del ARNm que codifica la forma corta (o truncada) del receptor N K1 , y/o
e) cualquiera de sus combinaciones.
En una realización aún más preferida del método, el resultado, será indicador de regresión total del cáncer cuando los valores obtenidos en las repeticiones del paso (e) sean secuencialmente menores y la última repetición muestre algunos de los siguientes valores:
a) nivel de la forma corta (o truncada) del receptor NK1 igual a 0 o indetectable.
b) nivel del ARNm que codifica para la forma corta (o truncada) del receptor NK1 sea igual a 0 o indetectable.
En una realización, la respuesta es una respuesta a la reducción de la carga tumoral. En una realización alternativa, la respuesta es una mejora o ausencia de deterioro del estado del tumor. En otra realización, la respuesta es un resultado clínico, tal como la supervivencia exenta de progresión o la supervivencia global. En otra realización, la respuesta es una mejora en el tamaño del tumor detectable por técnicas radiológicas, una mejora en el número de células tumorales detectables, preferiblemente en plasma de la sangre por inmunocitoquímica o citometría de flujo, o una mejora en el valor de otros marcadores tumorales específicos detectables en plasma de la sangre. Los sujetos cuya respuesta se predice son sujetos humanos que padecen cáncer. Los términos "individuo", "sujeto humano", "sujeto" y "paciente" se usan por tanto de manera indistinta en esta memoria descriptiva. En esta memoria se entiende por receptor NK1 (también denominado receptor de la neurokinina 1 , SPR; NK1 R; NKI R; o TAC1 R) a un receptor acoplado a proteína G (GPCR, del inglés: G protein-coupled receptors). Se trata de un receptor del tipo de los receptores acoplados a la proteína G, con siete puentes transmembrana, codificado por el gen TAC1R que se encuentra en el cromosoma 2 en humanos. Este gen pertenece a una familia de genes de receptores de taquiquinina. Estos receptores de taquiquinina se caracterizan por la interacción con las proteínas G y contienen siete regiones transmembrana hidrófobas. Este gen codifica para el receptor de la sustancia P taquiquinina, también conocida como la neurocinina o neurokinina 1. La proteína codificada también está implicada en la mediación del metabolismo de fosfatidilinositol de la sustancia P.
En el contexto de la presente invención, TAC1R se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 1 (con número en el GeneBank NP_001049.1), y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ I D NO: 1 ,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ I D NO: 1 , y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína NK1. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ I D NO: 2.
SEQ I D NO: 1 MDNVLPVDSDLSPNISTNTSEPNQFVQPAWQIVLWAAAYTVIVVTSWGNVWMWIIL AHKRMRTVTNYFLVNLAFAEASMAAFNTVVNFTYAVHNEWYYGLFYCKFHNFFPIAA VFASIYSMTAVAFDRYMAIIHPLQPRLSATATKVVICVIWVLALLLAFPQGYYSTTETMP SRWCMIEWPEHPNKIYEKVYHICVTVLIYFLPLLVIGYAYTWGITLWASEIPGDSSDR YHEQVSAKRKVVKMMIVWCTFAICWLPFHIFFLLPYINPDLYLKKFIQQVYLAIMWLAM SSTMYNPIIYCCLNDRFRLGFKHAFRCCPFISAGDYEGLEMKSTRYLQTQGSVYKVSR LETTISTWGAHEEEPEDGPKATPSSLDLTSNCSSRSDSKTMTESFSFSSNVLS
SEQ ID NO: 2 agctgagcaacccgaaccgagaggtgcccgcgaaactgcaggcggcggcagcggcagcaaaagagaaggaaa aatctccagctggatacgaagctccagaatcctggccataggctcagaacttttacaggtcgcgctgcaatgggccccca cttcgctcctaagtcctcacgcagcacagggctttgcctttccctgcggaggaaggagaaataggagttgcaggcagca gcaggtgcataaatgcgggggatctcttgcttcctagaactgtgaccggtggaatttctttccctttttcagtttaccgcaaga gagatgctgtctccagacttctgaactcaaacgtctcctgaagcttgaaagtggaggaattcagagccaccgcgggcag gcgggcagtgcatccagaagcgtttatattctgagcgccagttcagctttcaaaaagagtgctgcccagaaaaagccttc caccctcctgtctggctttagaaggaccctgagccccaggcgccagccacaggactctgctgcagaggggggttgtgta cagatagtagggctttaccgcctagcttcgaaatggataacgtcctcccggtggactcagacctctccccaaacatctcca ctaacacctcggaacccaatcagttcgtgcaaccagcctggcaaattgtcctttgggcagctgcctacacggtcattgtggt gacctctgtggtgggcaacgtggtagtgatgtggatcatcttagcccacaaaagaatgaggacagtgacgaactattttct ggtgaacctggccttcgcggaggcctccatggctgcattcaatacagtggtgaacttcacctatgctgtccacaacgaatg gtactacggcctgttctactgcaagttccacaacttctttcccatcgccgctgtcttcgccagtatctactccatgacggctgtg gcctttgataggtacatggccatcatacatcccctccagccccggctgtcagccacagccaccaaagtggtcatctgtgtc atctgggtcctggctctcctgctggccttcccccagggctactactcaaccacagagaccatgcccagcagagtcgtgtgc atgatcgaatggccagagcatccgaacaagatttatgagaaagtgtaccacatctgtgtgactgtgctgatctacttcctcc ccctgctggtgattggctatgcatacaccgtagtgggaatcacactatgggccagtgagatccccggggactcctctgac cgctaccacgagcaagtctctgccaagcgcaaggtggtcaaaatgatgattgtcgtggtgtgcaccttcgccatctgctgg ctgcccttccacatcttcttcctcctgccctacatcaacccagatctctacctgaagaagtttatccagcaggtctacctggcc atcatgtggctggccatgagctccaccatgtacaaccccatcatctactgctgcctcaatgacaggttccgtctgggcttca agcatgccttccggtgctgccccttcatcagcgccggcgactatgaggggctggaaatgaaatccacccggtatctccag acccagggcagtgtgtacaaagtcagccgcctggagaccaccatctccacagtggtgggggcccacgaggaggagc cagaggacggccccaaggccacaccctcgtccctggacctgacctccaactgctcttcacgaagtgactccaagacca tgacagagagcttcagcttctcctccaatgtgctctcctaggccacagggcctttggcaggtgcagcccccactgcctttga cctgcctcccttcatgcatggaaattcccttcatctggaaccatcagaaacaccctcacactgggacttgcaaaaagggtc agtatgggttagggaaaacattccatccttgagtcaaaaaatctcaattcttccctatctttgccaccctcatgctgtgtgactc aaaccaaatcactgaactttgctgagcctgtaaaataaaaggtcggaccagcttttcccaaaagcccattcattccattctg gaagtgactttggctgcatgcgagtgctcatttcaggatgaattctgcagcacagctgcggacccggaagactcattttcct ggagccccgtgttacttcaataaagttatctcagattagcctcctgcagctggaggctcctatcaccccagcctacgcttga cagggtgaacaaaagaaggcaccacataacatctaaatgaaaaatttagccctgtcttctaagcatctgtgaaaagaaa catatgtattcccctttttggcatctcagtatttcagtacatttatacatcatgagattgagaacctcgggcttccacattatgtcc ccggtgactgtcctgagcagccgacgcaagcagaatatgtccactgatacctgctagttctcttacagaccaggaattgg gagacttgcactacatttaatgtgtagttgaccctcttttcctacttgtaaacaaggggactgaactagataatctaagtgttcc ttcgaatcttaacatcccgtggttcaaggattgtatgagttttttgtttgttttacaaaaaaaaacaaaacgaagaataaaaga atagaaaagaataggagcagtgagtcttgtaactaatacccagttcctggagatgtagcaactgctaaggccatctgtaa ctatccatctcagacattctccgatttatcttaaaatcctgagtacattccttctcatggaaggttttggcttttgacagagcaga ggacttcatgccaaggcctgcatccatccagctttagcaggcagaatttcatagctgcagaacactgtcagagaagaca aatgtgggctccctgctttaaccttttgggtattttagggtgggggccctaaccttcattcttagttttacactagcatcgtgctcat atgtgcgacaagcaagaaggctgcactttgcagctgcacttctgggaagagggcatcttgcatcttcccttcagactctctg aatgtctcctccctgctccatggctttgccagcttcctgtctctaaggggtagaatgactcatcaaccctaaaggacagtcag tcttccaagagccatgaactgaatgctttatatcctaatttagatttagagtttccagaaggtgagcatgcagttttgttttgtttttt tttctgtctcccaaatctgtgttttttccagatatggctggaagcagaagcttcatgtaacatccatgaatgtcctcctggtagttt gcataatggatgcacatgtgccgcatccataacattaaggggagaataatgcatggtttacagcctttgccagccctgctg gctctaattctaccagggcatccacaggcctgggggaagaagaaacagtataagccagaaaacctcaagaactacat tctctaaagcagcatggaaagttttaaataaactaagtgaagccagatcattgcagatatataaatggaagacaaaattta gaagcaacaaaagttagtgccctaagcattagtcatacttccaatagagaatcttgctgtgtatggattactcactttggaag aatgtaaagagctaacatgattatgagaagtacctgagaagatggtgtcaagaagttggggacaccccatctatggaag agaaggttagagttgagctcaacgaggattaactgagtgcctcctctggactttgccctgaactgggaacacacagcccc tgcagctcttgaagagcctaccttattggccatcactaactaactcaccagtcctagtgagtctaagctgcccagcagtcttg gaggcatctgagaggacagattctccacagaattctaaaaacccacactcaacatgggcagtcaagccaaagactgg gacctttggagagcctctggaatgagagttctctggggtacttccaaagggagctggcagtcagtccaggggacctaaa ggaatttggttgaacagtatcatctctgtgcatagtaagagggaatgttgggtggtccgggcagtttccaatatggcaaagc atctgcttggacagtgccagcaagccttcctctgacccagtctccaatgtccactaacttataaaaatgtcatcaactccca catgtaagaaacaccatgatttgtactgtgcatgggtcacattcttattctagaaatgcatcaccctgtgtttatccaagtgtgtt tacttggtgtaatgtccagtagtaatagaatatgaaatatcaaggaaccatctttgttacgtgacttccaaaatgtgagatctc attgctgtcactgtgatatttgtattgtgtgaatctcttcctcctcttcctcctcatgctttctcagggaggagccctgatgtatatca tgaactcacagttcctagaccacagtaattgaggggcggtgggggggcctttatcggagaagctagagaacaagagtc cttctcctccttatcccccaacaggacactaagagacaaggactgagtggaatcctggagaaaggggactcaggaact gacctcattggcctgatttgtgaggagaggagtataagtggagaggggccattcctgaggtttccgtgttttccagcctggtc tcctggaaagaatctttatacagaaataaagtatgtgtttcactcaaaaaaaaaaaaaaaaa
La forma corta (o truncada) del receptor se recoge, pero sin limitarse, en las secuencias del GeneBank NP_056542.1 (SEQ I D NO: 3) y NM_015727.2 (SEA I D NO: 4), o secuencias de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente, que presentan, al menos, una identidad de un 60%, un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 3 o SEQ I D NO: 4, respectivamente.
SEQ I D NO: 3 MDNVLPVDSDLSPNISTNTSEPNQFVQPAWQIVLWAAAYTVIWTSVVGNVVVMWIIL AHKRM RTVTNYFLVNLAFAEASMAAFNTVVN FTYAVHN EWYYGLFYCKFHNFFPIAA VFASIYSMTAVAFDRYMAI IH PLQPRLSATATKVVICVIWVLALLLAFPQGYYSTTETMP SRWCMI EWPEHPNKIYEKVYHICVTVLIYFLPLLVIGYAYTWGITLWASEIPGDSSDR YHEQVSAKRKWKMMIWVCTFAICWLPFHI FFLLPYINPDLYLKKFIQQVYLAIMWLAM SSTMYNPI IYCCLNDR
SEQ I D NO: 4 agctgagcaacccgaaccgagaggtgcccgcgaaactgcaggcggcggcagcggcagcaaaagagaaggaaa aatctccagctggatacgaagctccagaatcctggccataggctcagaacttttacaggtcgcgctgcaatgggccccca cttcgctcctaagtcctcacgcagcacagggctttgcctttccctgcggaggaaggagaaataggagttgcaggcagca gcaggtgcataaatgcgggggatctcttgcttcctagaactgtgaccggtggaatttctttccctttttcagtttaccgcaaga gagatgctgtctccagacttctgaactcaaacgtctcctgaagcttgaaagtggaggaattcagagccaccgcgggcag gcgggcagtgcatccagaagcgtttatattctgagcgccagttcagctttcaaaaagagtgctgcccagaaaaagccttc caccctcctgtctggctttagaaggaccctgagccccaggcgccagccacaggactctgctgcagaggggggttgtgta cagatagtagggctttaccgcctagcttcgaaatggataacgtcctcccggtggactcagacctctccccaaacatctcca ctaacacctcggaacccaatcagttcgtgcaaccagcctggcaaattgtcctttgggcagctgcctacacggtcattgtggt gacctctgtggtgggcaacgtggtagtgatgtggatcatcttagcccacaaaagaatgaggacagtgacgaactattttct ggtgaacctggccttcgcggaggcctccatggctgcattcaatacagtggtgaacttcacctatgctgtccacaacgaatg gtactacggcctgttctactgcaagttccacaacttctttcccatcgccgctgtcttcgccagtatctactccatgacggctgtg gcctttgataggtacatggccatcatacatcccctccagccccggctgtcagccacagccaccaaagtggtcatctgtgtc atctgggtcctggctctcctgctggccttcccccagggctactactcaaccacagagaccatgcccagcagagtcgtgtgc atgatcgaatggccagagcatccgaacaagatttatgagaaagtgtaccacatctgtgtgactgtgctgatctacttcctcc ccctgctggtgattggctatgcatacaccgtagtgggaatcacactatgggccagtgagatccccggggactcctctgac cgctaccacgagcaagtctctgccaagcgcaaggtggtcaaaatgatgattgtcgtggtgtgcaccttcgccatctgctgg ctgcccttccacatcttcttcctcctgccctacatcaacccagatctctacctgaagaagtttatccagcaggtctacctggcc atcatgtggctggccatgagctccaccatgtacaaccccatcatctactgctgcctcaatgacaggtgaggatcccaacc ccatgagctctccaggggccacaagaccatctacatacacagtggccaagcggccatcctaaatgagtaaacccagct gtgagacaagagggacaagtggggactgcagctaacttatcatcacacaactcagcctggctgattatcaccatccagg aatgggagcccggagtggactgattttctttttttcttttcca
SEQ I D NO: 5: MDNVLPVDSDLSPNISTNTSEPNQFVQPAWQIVLWAAAYTVIWTSVVGNVVVMWIIL AHKRMRTVTNYFLVNLAFAEASMAAFNTVVNFTYAVHNEWYYGLFYCKFHNFFPIAA VFASIYSMTAVAFDRYMAIIHPLQPRLSATATKVVICVIWVLALLLAFPQGYYSTTETMP SRWCMIEWPEHPNKIYEKVYHICVTVLIYFLPLLVIGYAYTWGITLWASEIPGDSSDR YHEQVSAKRKWKMMIVWCTFAICWLPFHIFFLLPYINPDLYLKKFIQQVYLAIMWLAM SSTMYNPIIYCCLNDRFRLGFKHAFRCCPFISAGDYEGLEMKSTRYLQTQGSVYKVSR LETTISTVVGAHEEEPEDGPKATPSSLDLTSNCSSRSDSKTMTESFSFSSNVLS
SEQ ID NO: 6
MGTCDIVTEANISSGPESNTTGITAFSMPSWQLALWATAYLALVLVAVTGNAIVIWIILA HRRMRTVTNYFIVNLALADLCMAAFNAAFNFVYASHNIWYFGRAFCYFQNLFPITAMF VSIYSMTAIAADRYMAIVHPFQPRLSAPSTKAVIAGIWLVALALASPQCFYSTVTMDQG ATKCVVAWPEDSGGKTLLLYHLVVIALIYFLPLAVMFVAYSVIGLTLWRRAVPGHQAH GANLRHLQAMKKFVKTMVLWLTFAICWLPYHLYFILGSFQEDIYCHKFIQQVYLALFW LAMSSTMYNPIIYCCLNHRFRSGFRLAFRCCPWVTPTKEDKLELTPTTSLSTRVNRCH TKETLFMAGDTAPSEATSGEAGRPQDGSGLWFGYGLLAPTKTHVEI
SEQ ID NO: 7
MATLPAAETWIDGGGGVGADAVNLTASLAAGAATGAVETGWLQLLDQAGNLSSSPS ALGLPVASPAPSQPWANLTNQFVQPSWRIALWSLAYGWVAVAVLGNLIVIWIILAHKR MRTVTNYFLVNLAFSDASMAAFNTLVNFIYALHSEWYFGANYCRFQNFFPITAVFASIY SMTAIAVDRYMAIIDPLKPRLSATATKIVIGSIWILAFLLAFPQCLYSKTKVMPGRTLCFV QWPEGPKQHFTYHIIVIILVYCFPLLIMGITYTIVGITLWGGEIPGDTCDKYHEQLKAKRK WKMMIIVVMTFAICWLPYHIYFILTAIYQQLNRWKYIQQVYLASFWLAMSSTMYNPIIY CCLNKRFRAGFKRAFRWCPFIKVSSYDELELKTTRFHPNRQSSMYTVTRMESMTWF DPNDADTTRSSRKKRATPRDPSFNGCSRRNSKSASATSSFISSPYTSVDEYS
En el contexto de la presente invención, se entiende "muestra de referencia" o "valor de referencia" como la muestra que se usa para determinar la variación de los niveles de expresión de las proteínas o ácidos nucleicos de la presente invención. En una realización de la invención, el valor de referencia se obtiene a partir de la señal proporcionada usando una muestra de tejido obtenida de un individuo que no presenta un tumor. Preferiblemente, las muestras se toman de plasma de la sangre de varios individuos con y sin cáncer y se combinan, de tal manera que el valor de referencia refleja el valor promedio de dichas moléculas en la población de individuos con y sin cáncer. "Valor de referencia" es el nivel de una proteína de la invención (receptor NK1 , o forma truncada del receptor NK1 ) o de los ácidos nucleicos de la presente invención (ARNm del gen NK1 y ARNm de la forma truncada de dicho receptor) en la muestra de referencia.
En la presente invención "pronóstico" se entiende como la evolución esperada de una enfermedad y se refiere a la valoración de la probabilidad según la cual un sujeto padece una enfermedad así como a la valoración de su inicio, estado de desarrollo, evolución, o de su regresión, y/o el pronóstico del curso de la enfermedad en el futuro. Como entenderán los expertos en la materia, tal valoración, aunque se prefiere que sea, normalmente puede no ser correcta para el 100% de los sujetos que se va a diagnosticar. El término, sin embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos se pueda identificar como que padecen la enfermedad o que tienen predisposición a la misma. Si una parte es estadísticamente significativa se puede determinar sin más por el experto en la materia usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de valores p, prueba t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%. Los valores de p son, preferiblemente, 0,2, 0, 1 , 0,05. Por "predicción de la respuesta" se entiende, en el contexto de la presente invención, la determinación de la probabilidad de que el paciente responda de forma favorable o desfavorable a una terapia o a un tratamiento determinado, incluyendo el tratamiento quirúrgico. Especialmente, el término "predicción", como se usa aquí, se refiere a una evaluación individual de cualquier parámetro que pueda ser útil en determinar la evolución de un paciente. Como entenderán los expertos en la materia, la predicción de la respuesta clínica al tratamiento, aunque se prefiere que sea, no necesita ser correcta para el 100% de los sujetos a ser diagnosticados o evaluados. El término, sin embargo, requiere que se pueda identificar una parte estadísticamente significativa de los sujetos como que tienen una probabilidad aumentada de tener una respuesta positiva. El experto en la materia puede determinar fácilmente si un sujeto es estadísticamente significativo usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de los valores de p, prueba t de Student, prueba de Mann Whitney, etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos del 50%>, al menos del 60%>, al menos del 70%>, al menos del 80%>, al menos del 90%), al menos del 95%>. Los valores de p son, preferiblemente, 0,2, 0, 1 ó 0,05. La predicción de la respuesta clínica se puede hacer utilizando cualquier criterio de valoración usado en oncología y conocido por el experto en la materia. A su vez, atendiendo al método de la presente invención, se podrían establecer otras subclasificaciones dentro de esta principal, facilitando, por tanto, la elección y el establecimiento de regímenes terapéuticos o tratamiento adecuados. Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor significación P, test de Student o funciones discriminantes de Fisher, medidas no paramétricas de Mann Whitney, correlación de Spearman, regresión logística, regresión lineal, área bajo la curva de ROC (AUC). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0, 1 , de 0,05, de 0,01 , de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60%, más preferiblemente en al menos el 70%, mucho más preferiblemente en al menos el 80%, o aún mucho más preferiblemente en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada. En el contexto de la presente invención el término "respuesta positiva" hace referencia a una respuesta, por parte de los pacientes que padecen cáncer, más efectiva al tratamiento con antagonistas del receptor NK1 , que otros pacientes que padecen cáncer pero que no reponden de dicha manera efectiva al tratamiento con los antagonistas del receptor NK1. La respuesta puede referirse a las características de los tumores del sujeto. De manera alternativa pero no mutuamente excluyente, la respuesta puede referirse al resultado clínico del sujeto. De esta manera, mediante el primer método de la invención, se puede predecir si un paciente individual mostrará (i) una respuesta (R) al tratamiento con antagonistas del receptor NK1 o (ii) no mostrará respuesta (N R) al tratamiento con antagonistas del receptor NK1.
Siempre que la respuesta se refiera a las características de los tumores del sujeto, la distinción entre R y N R se puede llevar a cabo sobre la base del cambio en el tamaño de la lesión. Por ejemplo, se puede definir "Respuesta" como una disminución en la carga total del tumor (definida como la suma de las áreas del tumor de lesiones medidas bidimensionalmente), tomando como referencia los valores correspondientes al valor inicial, sin la aparición de una nueva lesión. De manera particular, la respuesta puede ser≥ 5 % de disminución en la carga total del tumor, tal como ≥ 10 % de disminución en la carga total del tumor, ≥ 15 % de disminución en la carga total del tumor,≥ 20 % de disminución en la carga total del tumor,≥ 25 % de disminución en la carga total del tumor, ≥ 30% de disminución en la carga total del tumor, ≥ 35 % de disminución en la carga total del tumor, ≥ 40 % de disminución en la carga total del tumor,≥ 45 % de disminución en la carga total del tumor o≥ 50 % de disminución en la carga total del tumor, definida cada una como la suma de las áreas del tumor de las lesiones medidas bidimensionalmente. En una realización preferida de la presente invención, la respuesta se define como≥ 30% de disminución en la carga total del tumor (definida como la suma de las áreas del tumor de las lesiones medidas bidimensionalmente), tomando como referencia los valores correspondientes a los valores iniciales, sin la aparición de una nueva lesión. La falta de respuesta (NR) se define de forma contraria a (R). Preferiblemente, sin respuesta (NR) se define como < 30% de disminución en el área del tumor de una o más lesiones medibles, o la aparición de al menos una nueva lesión. Esto incluye normalmente un aumento, tal como > 20% de aumento en el área de una o más lesiones medibles o la aparición de al menos una nueva lesión. Siempre que "Respuesta" se refiera al resultado clínico del sujeto, se puede expresar la "Respuesta" como la supervivencia global o la supervivencia exenta de progresión. La supervivencia de pacientes de cáncer se expresa de manera adecuada generalmente mediante las curvas de Kaplan-Meier, que han recibido su denominación de Edward L. Kaplan y Paul Meier que fueron los que describieron éstas en primer lugar (Kaplan, Meier: Amer. Statist. Assn. 53:457- 35 481 ). Además, en la presente invención se demuestra que los paciente con tumores cancerosos que liberan una mayor cantidad de forma truncada del receptor NK1 y/o una mayor cantidad del ARNm que codifica dicha forma truncada del receptor al medio fluido en el que se encuentran, como puede ser el plasma de la plasma de la sangre periférica, tienen una mejor (más efectiva) respuesta al tratamiento con antagonistas del receptor NK1.
Por tanto, en otra realización preferida de este aspecto de la invención, en el cuarto método además se determina la presencia o no de la forma truncada del receptor NK1 en la muestra biológica, preferiblemente plasma de la sangre de la muestra del paso (a), de los pacientes con cáncer, siendo el resultado indicativo de una respuesta positiva (respuesta más efectiva al tratamiento con antagonistas de los receptores NK1) si en dicha plasma de la sangre se detecta la presencia de la forma truncada del receptor NK1 , o del ARNm que lo codifica.
Los niveles de expresión de los genes van a dar un determinado perfil de expresión génica. El término "nivel", "nivel de expresión", también denominado "cantidad producto génico" se refiere al material bioquímico, ya sea ARN o proteína, resultado de la expresión de un gen. Algunas veces se usa una medida de la cantidad de producto génico para inferir qué tan activo es un gen. Se entiende por "perfil de expresión génica" el perfil génico obtenido tras la cuantificación del ARNm y/o de proteína producida por los genes de interés o biomarcadores, es decir, por los genes empleados como marcadores biológicos en la presente invención, en una muestra biológica aislada. El perfil de expresión de los genes se realiza, preferiblemente, determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción, previa extracción del ARN total presente en la muestra biológica aislada, lo cual puede realizarse mediante protocolos conocidos en el estado de la técnica. La determinación del nivel de ARNm derivado de la transcripción de los genes empleados como marcadores biológicos en la presente invención, puede realizarse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), RT-PCR cuantitativa, retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; análisis en serie de la expresión génica (SAGE, SuperSAGE); chips de ADN elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; microarrays de ADN elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de mareaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante resonancia magnética nuclear o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio. El perfil de expresión génica también podría obtenerse mediante la detección y/o cuantificación de las proteínas producto de la traducción del ARNm derivado de la transcripción de los genes empleados como marcadores biológicos en la presente invención, mediante por ejemplo, pero sin limitarnos, inmunodetección por western blot. La detección cuantitativa de la expresión de los genes empleados como marcadores biológicos en la presente invención puede realizarse más preferiblemente mediante PCR en tiempo real (RT-PCR ó RTqPCR). La detección en tiempo real de los productos amplificados puede llevarse a cabo mediante la utilización de moléculas fluorescentes que se intercalan en el ADN de cadena doble o mediante hibridación con diferentes tipos de sondas. Así pues, la detección de los niveles de proteínas o del nivel de expresión de los genes puede hacerse por cualquiera de las técnicas conocidas por el experto en la materia. Así, en otra realización preferida de este aspecto de la invención,
a) la detección de los niveles de expresión del receptor NK1 , o del ARNm que codifica para el receptor NK1 en la muestra de plasma de la sangre obtenida en el paso (a).
b) la detección de los niveles de expresión de la forma corta (o truncada) del receptor NK1 en la muestra de plasma de la sangre obtenida en el paso (a). se realiza por
un procedimiento de perfil genético, tal como una micromatriz y/o
un procedimiento que comprende PCR, tal como una PCR en tiempo real y/o . transferencia Northern y/o
. transferencia Western y/o
v. ELISA. En otra realización preferida, la muestra biológica es plasma de la sangre o ARN extraído de un fluido de un paciente con cáncer. Más preferiblemente, el primer método de la invención se lleva a cabo in vitro usando una muestra originaria del sujeto humano.
En otra realización preferida, la detección de los niveles de expresión de los genes se realiza mediante Q-RT-PCR. En otra realización preferida, la detección de los niveles de proteínas NK1 y/o el receptor truncado de NK1 , se realiza mediante técnicas inmmunológicas. En una realización más preferida, las técnicas inmunológicas están basadas en reacciones de precipitación, basadas en reacciones de aglutinación, inmunomarcación, radioinmunoanálisis y técnicas radioinmunométricas, ELISA (Enzime Linked ImmunoadSorbent Assay), o en cualquiera de sus combinaciones. En otra realización más preferida, las técnicas inmunológicas comprenden el inmunomarcaje. En otra realización aún más preferida, el inmunomarcaje se selecciona de entre inmunomarcaje con anticuerpos conjugados a enzimas, inmunomarcaje con anticuerpos conjugados a fluorocromos, o citometría. Aún más preferiblemente, la citometría es citometría de flujo.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el individuo o sujeto humano padece un cáncer que se selecciona de entre los siguientes: cáncer gástrico, preferentemente adenocarcinoma gástrico, cáncer de colon, preferentemente adenocarcinoma de colon, cáncer de páncreas, preferentemente adenocarcinoma de páncreas, cáncer renal, preferentemente carcinoma renal de células claras, cáncer de mama, preferentemente adenocarcinoma de mama, cáncer de ovario, preferentemente adenocarcinoma de ovario, carcinoma de endometrio, carcinoma de cérvix uterino, cáncer de pulmón, preferentemente carcinoma de pulmón de célula no pequeña y/o carcinoma de pulmón de células pequeñas, cáncer de tiroides, preferentemente carcinoma de tiroides papilar y/o carcinoma folicular de tiroides, carcinoma de vejiga, preferentemente carinoma transicional de vejiga de la orina, carcinoma de próstata, cáncer de estirpe glial del sistema nervioso central (gliomas, astrocitomas, ependimomas), sarcomas, preferentemente fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno y sarcoma de Edwing, melanoma, cánceres embrionarios, preferentemente neuroblastoma (también hepatoblastoma, meduloblastoma, retinoblastoma, nefroblastoma) y cánceres hematológicos, preferentemente leucemias de estirpe B o de estirpe T, linfomas no Hodgkin, preferentemente de estirpe B o de estirpe T, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin y mieloma múltiple.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los antagonistas del receptor NK1 son antagonistas no peptídicos, y aún más preferiblemente, los antagonistas no peptídicos se seleccionan de entre: Aprepitant (ó MK 869 ó L- 754030), Vestipitant (ó GW597599), Casopitant (ó GW679769), Vofopitant (ó GR- 205171 ), Ezlopitant (ó CJ -1 1974), Lanepitant (ó LY-303870), LY-686017, L-733,060 ((2S,3S)-3-[(3,5-bis(Trifluoromethyl)phenyl)methoxy]-2-phenylpiperidine hydrochloride), L-732, 138 (N-Acetyl-L-tryptophan 3,5-bis(trifluoromethyl)benzyl ester), L-703,606 (cis- 2-(Diphenylmethyl)-N-[(2-iodophenyl)methyl]-1 -azabicyclo[2.2.2]octan-3-amine oxalate salt), WIN 62,577, CP-122721 , TAK-637, R673, CP-100263, WIN 51708, CP-96345, L-760735, CP-122721 , L-758298, L-741671 , L-742694, CP-99994, T-2328, o cualquiera de sus combinaciones. Son preferidos los compuestos: Aprepitant ó MK 869 ó L-754030 (MSD), Vestipitant ó GW597599 (GSK) y Casopitant ó GW679769 (GSK), Fosaprepitant (MSD), o cualquiera de sus combinaciones. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los antagonistas del receptor NK1 son antagonistas peptídicos, y aún más preferiblemente, se seleccionan de entre anticuerpos o fragmentos de los mismos dirigidos contra el receptor NK1 .
Como se usa aquí "antagonista no peptídico de los receptores NK1 " significa cualquier sustancia de naturaleza no peptídica con un tamaño suficiente y conformación adecuada para unirse al receptor NK1 y así inhibir su funcionamiento normal, incluyendo el hecho de evitar que la SP u otros agonistas de estos receptores, se unan a los mencionados receptores. Los anticuerpos son compuestos peptídicos con capacidad para unirse de forma altamente selectiva a diversas moléculas orgánicas. Su unión a determinados receptores celulares induce una modificación en la actividad de los mismos, lo que puede determinar una modificación en las actividades fisiológicas habituales del metabolismo celular. Como se usa aquí "anticuerpo contra los receptores NK1 " significa cualquier anticuerpo policlonal o monoclonal o fragmentos de estos anticuerpos contra los receptores NK1. Un fragmento de anticuerpo significa una parte de un anticuerpo contra los receptores NK1 que es de un tamaño suficiente y conformación adecuada para unirse a un epítopo presente en los receptores NK1 y así modificar su funcionamiento normal, incluyendo el hecho de evitar que la sustancia P u otros agonistas de estos receptores, se unan a los mencionados receptores.
El uso de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el dominio extracelular de diversos receptores celulares, como tratamiento para el cáncer, está ampliamente difundido en la clínica. Entre estos anticuerpos monoclonales terapéuticos aprobados para su uso en oncología, destacan el trastuzumab que es un anti-ErbB2/HER2 para el cáncer de mama, el cetuximab que es un anti-ErbB1/EGFR para el cáncer de colon y el bevacizumab que es un anti-VEGFR (receptor del factor de crecimiento derivado del endotelio vascular) para diversos tipos de cánceres (Adams et al., 2005).
Por "cáncer" se entiende un tumor maligno de potencial crecimiento ilimitado que se expande localmente por invasión y sistémicamente por metástasis. De acuerdo con la presente invención, el antagonista no peptídico del receptor NK1 se administra a individuos con un cáncer.
En el contexto de la presente invención, como se usa "fármacos dirigidos a modificar el funcionamiento de los receptores NK1 " se refieren a moléculas antagonistas no peptídicos o anticuerpos, o fragmentos de los mismos, que actúan sobre el receptor NK1 y que modifican su funcionamiento, con objeto de la producción de inhibición de la proliferación, producción de muerte y/o apoptosis en las células tumorales, en un mamífero, incluyendo el hombre, bien por acción directa sobre los mecanismos fisiológicos de las células tumorales o bien por la modificación del microambiente tumoral. En el contexto de la presente invención, la enfermedad es el cáncer, preferentemente cáncer gástrico, preferentemente adenocarcinoma gástrico, cáncer de colon, preferentemente adenocarcinoma de colon, cáncer de páncreas, preferentemente adenocarcinoma de páncreas, cáncer renal, preferentemente carcinoma renal de células claras, cáncer de mama, preferentemente adenocarcinoma de mama y/o carcinoma de mama, cáncer de ovario, preferentemente adenocarcinoma de ovario y/o carcinoma de ovario, carcinoma de endometrio, carcinoma de cérvix uterino, cáncer de pulmón, preferentemente adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de célula no pequeña y/o carcinoma de pulmón de células pequeñas, cáncer de tiroides, preferentemente carcinoma de tiroides papilar metastatizante y/o carcinoma folicular de tiroides, cáncer de vejiga, preferentemente carcinoma de vejiga de la orina y/o carcinoma transicional de vejiga de la orina, carcinoma de próstata, Tumor de estirpe glial del sistema nervioso central (glioma), sarcomas, preferentemente fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno y sarcoma de Edwing (aunque también es de utilidad en el sarcoma del estroma endometrial humano, osteosarcoma y/o rabdomiosarcoma), melanoma, cánceres embrionarios, preferentemente neuroblastoma (aunque también es útil en meduloblastoma, retinoblastoma, nefroblastoma y/o hepatoblastoma) y cánceres hematológicos, preferentemente leucemias de estirpe B o de estirpe T, linfomas no Hodgkin, preferentemente de estirpe B o de estirpe T, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin, leucemias, preferentemente de estirpe B o de estirpe T, mieloma múltiple.
Estos antagonistas del receptor NK1 , tanto peptídicos como no peptídicos, pueden usarse solos, combinados entre ellos o con diversos agentes anticancerosos que se seleccionan, pero sin limitarnos, de entre cualquiera de los siguientes: Clorambucil, Melfalán, Aldesleukina, 6-mercaptopurina, 5-fluoruracilo, Ara-c, Bexaroteno, Bleomicina, Capecitabina, Carboplatino, Cisplatino, Docetaxel, Doxorrubicina, Epirrubicina, Fludarabina, Irinotecan, Metotrexato, Mitoxantrona, Oxaliplatino, Paclitaxel, Rituximab, Etopósido, Tenipósido, Vincristina, Vinblastina, Vinorelbina, Imatinib, Erlotinib, Cetuximab, Trastuzumab, erlotinib, dasatanib, nilotinib, decatanib, panitumumab, amrubicin, oregovomab, Lep-etu, nolatrexed, azd2171 , batabulin, ofatumumab, zanolimumab, edotecarin, tetrandrine, rubitecan, tesmilifene, oblimersen, ticilimumab, ipilimumab, gossypol, Bio 1 1 1 , 131 -I-TM-601 , ALT-1 10, BIO 140, CC 8490, cilengitide, gimatecan, I L13-PE38QQR, I NO 1001 , IPdR, KRX-0402, lucanthone, LY 317615, neuradiab, vitespan, Rta 744, Sdx 102, talampanel, atrasentan, Xr 31 1 , everolimus, trabectedin, abraxane, TLK 286, AV-299, DN-101 , pazopanib, GSK690693, RTA 744, ON0910. Na, AZD 6244 (ARRY-142886), AMN-107, TKI-258, GSK461364, AZD 1 152, enzastaurin, vandetanib, ARQ-197, MK-0457, MLN8054, PHA-739358, R-763, AT-9263, o cualquiera de sus combinaciones. USOS MÉDICOS DE LA INVENCIÓN Un séptimo aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un antagonista del receptor NK1 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo identificable por el primer, segundo o tercer método de la invención, como individuos que padecen cáncer, o que pueden ser clasificados en un estadio determinado del cáncer.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el antagonista del receptor NK1 es un antagonista no peptídico. Más preferiblemente, el antagonista no peptídico se selecciona de la lista que consiste en: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant, Lanepitant, LY-686017, L-733,060, L-732, 138, L-703,606, WIN 62,577, CP-122721 , , TAK-637, y R673, CP-100263, WIN 51708, CP-96345, L- 760735, CP-122721 , L-758298, L-741671 , L-742694, CP-99994, T-2328, o cualquiera de sus combinaciones. Aún más preferiblemente, el antagonista no peptídico del recpetor NK1 se seleccionan de entre: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant y Lanepitant, o cualquiera de sus combinaciones.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el antagonista es un antagonista peptídico. Más preferiblemente, el antagonista peptídico es un anticuerpo o un fragmento del mismo, específico contra los receptores celulares NK1 , NK2 y/o NK3, o combinaciones de los mismos. Aún más preferiblemente es un anticuerpo que reconoce al menos una secuencia de los receptores NK1 , NK2 o NK3, seleccionada entre: SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO: 7, o cualquiera de sus fragmentos. Las composiciones de la presente invención pueden formularse para su administración a un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Así, pueden estar, sin limitarse, en disolución acuosa estéril o en fluidos biológicos, tal como suero. Las disoluciones acuosas pueden estar tamponadas o no tamponadas y tienen componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes adicionales incluyen sales para modular la fuerza iónica, conservantes incluyendo, pero sin limitarse a, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, y similares, y nutrientes incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas y minerales. Alternativamente, las composiciones pueden prepararse para su administración en forma sólida. Las composiciones pueden combinarse con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a; aglutinantes tales como celulosa microcristalina, goma tragacanto, o gelatina; excipientes tales como almidón o lactosa; agentes dispersantes tales como ácido algínico o almidón de maíz; lubricantes tales como estearato de magnesio, deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes tales como menta o salicilato de metilo.
Por tanto, en una realización preferida de este aspecto de la invención, la composición farmacéutica puede comprender, además un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización preferida la composición farmacéutica comprende, además, excipientes. En otra realización preferida la composición farmacéutica puede comprender, además, otro principio activo.
Como se emplea aquí, el término "principio activo", "sustancia activa", "sustancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.
El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. KIT O DISPOSITIVO DE LA INVENCIÓN
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en delante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para analizar:
a) el nivel del receptor NK1 y/o
b) el nivel de forma truncada del receptor NK1 y/o
c) la presencia del ARNm que codifica el receptor NK1y/o
d) la presencia del ARNm que codifica la forma truncada del receptor NK1 , en plasma de la sangre de la muestra biológica obtenida en el paso (a). En una realización preferida el kit puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencia del ARNm que codifica el receptor NK1 y la forma truncada del receptor NK1 , para la posterior amplificación por PCR.
Preferiblemente, el kit o dispositivo de la invención comprende al menos un anticuerpo que se selecciona de entre:
a) un anticuerpo anti-NK1 en su forma completa o "full length"
b) un anticuerpo anti-NK1 en su forma truncada
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el anticuerpo es humano, humanizado o sintético. En otra realización más preferida, el anticuerpo es monoclonal. En otra realización más preferida, el anticuerpo se encuentra marcado con un fluorocromo. Más preferiblemente, el fluorocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones.
Más preferiblemente, el kit de la presente invención comprende los medios necesarios para comparar la cantidad detectada en los diferentes pasos on una cantidad de referencia.
El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc. Por otro lado, el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención.
Cuando para la cuantificacion génica y/o proteica mediante el kit de la invención se utiliza la técnica RQ-PCR, una técnica de cuantificacion de la expresión génica sensible y reproducible, se desea que el kit comprenda adicionalmente un cebador del oligonucleótido poliT además del (de los) oligonucleótido(s) del kit. Estos reactivos pueden estar comprendidos opcionalmente en el kit. Una Transferencia Northern implica el uso de electroforesis para separar las muestras de ARN por tamaño y la posterior detección con un(os) oligonucleótido(s) (sonda de hibridación) complementaria con (parte de) la secuencia diana del ARN de interés. Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida). En una de sus realizaciones, el kit comprende una micromatriz, o micromatriz de la invención. Una micromatriz de ARN es una matriz sobre un sustrato sólido (normalmente un porta de vidrio o una celda de una película fina de silicio) que evalúa grandes cantidades de diferentes ARN que son detectables mediante sondas específicas inmovilizadas sobre manchas sobre un sustrato sólido. Cada mancha contiene una secuencia específica de ácido nucleico, normalmente una secuencia de ADN, como sondas (o indicadores). Aunque el número de manchas no está limitado de manera alguna, existe una realización preferida en la que la micromatriz se personaliza para los procedimientos de la invención. En una realización, dicha matriz personalizada comprende cincuenta manchas o menos, tal como treinta manchas o menos, incluyendo veinte manchas o menos. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencia del ARNm del gen NK1 la forma truncada del receptor NK1 .
Otro aspecto de la invención se refiere a un microarray, de ahora en adelante microarray de la invención, que comprende oligonuleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm que codifica el receptor NK1 y la forma corta (o truncada) del receptor NK1 .
Así, por ejemplo, las secuencias de oligonuleótidos son construidas en la superficie de un chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleótidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual.
Así, las sondas oligonucleótidos pueden ser de entre 10 y 100 nucleótidos, más preferiblemente, de entre 20 y 70 nucleótidos, y aún más preferiblemente, de entre 24 y 30 nucleóitidos. Para la cuantificación de la expresión génica, preferiblemente se emplean aproximadamente unos 40 oligonucleótidos por gen.
La síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o Portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehidos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: RNA mensajero, RNA total, un fragmento de PCR, etc.
Otro aspecto de la invención se refiere a un microarray de proteínas, de ahora en adelante microarray de proteínas de la invención, que comprende anticuerpos anti- NK1 y/o anticuerpos anti- receptor truncado de NK1 . Las sondas son anticuerpos fijados a portaobjetos de vidrio y los blancos son muestras de suero o tejido.
Otro aspecto de la invención se refiere a un soporte sólido, o chip de proteínas, que comprende al menos uno de los anticuerpos anti- y anti-, o cualquiera de sus combinaciones, para llevar a cabo el cualquiera de los métodos de la invención.
Los métodos de la invención pueden incluir etapas adicionales, como por ejemplo, la separación de proteínas mediante electroforesis mono y bidimensional (2D-PAGE), o la digestión previa con tripsina de una mezcla de proteínas (de la muestra) para después purificar y analizar los péptidos mediante espectrometría de masas (MS), como el MALDI-TOF, o mediante cromatografía multidimensional, mediante ICAT (Isotope-coded affinity tags), DIGE (Differential gel electrophoresis) o arrays de proteínas.
Otro aspecto de la invención se refiere a un soporte sólido, o chip de DNA, que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de al menos uno de los genes que codifican para el receptor NK1. Preferiblemente, comprende los oligonucleótidos capaces de detectar el ARNm de todos los genes.
Así, por ejemplo, las secuencias de oligonucleótidos son construidas en la superficie del chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleótidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual. Así, las sondas oligonucleótidos pueden ser de entre 10 y 100 nucleótidos, más preferiblemente, de entre 20 y 70 nucleótidos, y aún más preferiblemente, de entre 24 y 30 nucleótidos. Para la cuantificación de la expresión génica, preferiblemente se emplean aproximadamente unos 40 oligonucleótidos por gen. La síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehidos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: ARN mensajero, ARN total, un fragmento de PCR, etc.
Otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo, la micromatriz, o el microarray de la invención, para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención.
La invención se extiende también a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los métodos de la invención. Tales programas pueden tener la forma de código fuente, código objeto, una fuente intermedia de código y código objeto, por ejemplo, como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para uso en la puesta en práctica de los procesos según la invención. Los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho
procedimiento. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que un ordenador lleve a la práctica el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención.
En particular, la invención abarca programas de ordenador dispuestos sobre o dentro de una portadora. La portadora puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de soportar el programa. Cuando el programa va incorporado en una señal que puede ser transportada directamente por un cable u otro dispositivo o medio, la portadora puede estar constituida por dicho cable u otro dispositivo o medio. Como variante, la portadora podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa, estando el circuito integrado adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de, los procesos correspondientes. Por ejemplo, los programas podrían estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabación magnética, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Alternativamente, los programas podrían estar soportados en una señal portadora transmisible. Por ejemplo, podría tratarse de una señal eléctrica u óptica que podría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios.
Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.
En la presente invención se entiende por variante o fragmento biológicamente activo, aquellas variantes o fragmentos de los péptidos indicados que tienen un efecto fisiológico, metabólico o inmunológico igual, o presentan la misma utilidad que los descritos. Esto es, son funcionalmente equivalentes. Dichos efectos se pueden determinar mediante métodos convencionales.
El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas que se comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa GAG, incluyendo GAP (Devereux et al. , Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST, BLASTP o BLASTN , y FASTA (Altschul et al., 1999. J. Mol. Biol. 215: 403-410.
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxiribonucleótidos (ADN ó DNA). Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos aquí usados tienen el mismo significado a los habitualmente entendidos por una persona experta en el campo de la invención. Métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos pueden ser usados en la práctica de la presente invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes, no tienen carácter limitativo y por lo tanto no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Por el contrario, la palabra "consiste" y sus variantes, sí que presentan carácter limitativo, refiriéndose exclusivamente a las características técnicas, aditivo, componentes o pasos que la acompañan. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
A continuación, se muestran ejemplos a modo de ilustración, sin pretender que sean limitativos de la presente invención, dónde se ponen de manifiesto las ventajas de la invención. Ejemplo 1. Los pacientes con cáncer muestran niveles detectables del receptor NK1 y de la forma truncada del receptor NK1 en plasma de la sangre periférica. Los niveles de la forma truncada del receptor NK1 están elevados en el plasma de la sangre de los pacientes con cáncer. Para demostrar que los pacientes con cáncer tienen niveles detectables del receptor NK1 y de la forma truncada de dicho receptor se tomó plasma de la sangre de pacientes sanos y plasma de la sangre de pacientes con cáncer. En todos los casos se determinó mediante el método de ELISA la presencia del receptor NK1 y de la forma truncada de dicho receptor. Para determinar el nivel de la forma completa del receptor NK1 (en adelante "valor de la forma completa del receptor NK1 " o "VFC- NK1 R") se marcó con un anticuerpo que se une a un epítopo del extremo c-terminal de dicho receptor (Referencia sc-141 16; Santacruz Biotecnology). Este extremo es exclusivo y específico de dicha forma completa del receptor NK1 . Para determinar el nivel conjunto de ambos, del receptor NK1 en su forma completa y de la forma truncada del receptor NK1 (en adelante "valor conjunto de la forma completa y truncada del receptor ΝΚΓ o "VCFCT-NK1 R") se utilizó un anticuerpo que se une a un epítopo del segundo puente extracelular del receptor (que es común a ambas formas completa y truncada de receptor) y que, por lo tanto, marca tanto la forma truncada del receptor NK1 como la forma completa (o "full-length") de dicho receptor (Referencia sc-141 15; Santacruz Biotecnology). Para determinar el nivel de la forma truncada del receptor NK1 se halló la proporción entre el valor del nivel conjunto de ambos receptores y el valor del nivel del receptor N K1 en su forma completa (VCFCT-NK1 R / VFC-NK1 R). Tabla 1. Proporción entre VCFCT-NK1 R y VFC-NK1 R (± Desviación estándar) en el plasma de la plasma de la sangre de sujetos humanos sanos y pacientes con diversos tipos de cáncer. Entre paréntesis se especifica el número de sujetos humanos estudiados.
Figure imgf000052_0001
En la tabla 1 se muestra la relación entre VCFCT-NK1 R y VFC-NK1 R (± Desviación Estándar) en sujetos sanos y en pacientes con diferentes tipos de cáncer. Se demuestra que los sujetos humanos sanos la relación entre el valor conjunto de las formas completa y truncada del receptor NK1 (VCFCT-NK1 R) y el valor de la forma completa del receptor NK1 (VFC-NK1 R) es próxima a 1 , lo que demuestra que en el plasma de la plasma de la sangre de los sujetos sanos la forma predominante (exclusiva) es la forma completa del receptor NK1. En los pacientes con cáncer dicha proporción es superior a 1 , lo que demuestra que en el plasma de la plasma de la sangre de los pacientes con cáncer es detectable la presencia de una cantidad significativa de la forma truncada del receptor NK1 .
Ejemplo 2. Los pacientes con cáncer muestran una relación entre los niveles detectables del receptor NK1 y de la forma truncada del receptor NK1 , en plasma de la sangre periférica, diferente en función del estadio tumoral.
En el presente ejemplo se demuestra que los pacientes con cáncer tienen una relación entre el VCFCT-NK1 R y el VFC-NK1 R que es mayor en los casos en que el estadio tumoral es más avanzado. Para ello se determinó en cada caso el VCFCT-NK1 R y el VFC-NK1 R mediante el método explicado en el ejemplo 1 . Se seleccionaron, para cada tipo de cáncer pacientes en diferentes estadios evolutivos (siendo el estadio I el menos avanzado y el estadio III el más avanzado). Los estadios se establecieron en función de los criterios anatomopatológicos y clínicos marcados por las guías clínicas vigentes, definidos por la Organización Mundial de la Salud y sociedades científicas (Sobin LH, Gospodarowicz MK, Wittekind Ch. Eds. TNM Classification of Malignant Tumors, 7th ed. Wiley-Blackwell, Oxford 2009; url: http:/ www.uicc.org/resources/tnm ).
Tabla 2. Proporción entre VCFCT-NK1 R y VFC-NK1 R (± Desviación estándar) en el plasma de la plasma de la sangre de pacientes con cáncer en función del estadio de dicho cáncer. Entre paréntesis se especifica el número de sujetos humanos estudiados.
Figure imgf000054_0001
Ejemplo 3. Los pacientes con cáncer muestran una relación entre los niveles detectables del receptor NK1 y de la forma truncada del receptor NK1 , en plasma de la sangre periférica, diferente en función de la respuesta al tratamiento específico para esta enfermedad. En el presente ejemplo se demuestra que los pacientes con cáncer, tienen una relación entre el VCFCT-NK1R y el VFC-NK1R que es mayor en los casos en que los que no existe respuesta al tratamiento. De esta forma, el valor de la relación entre VCFCT-NK1R y el VFC-NK1R es disminuye en función de que se produzca una mejor respuesta al tratamiento. Para ello se determinó en cada caso el VCFCT-NK1R y el VFC-NK1R mediante el método explicado en el ejemplo 1.
Tabla 3. Proporción entre VCFCT-NK1R y VFC-NK1R (± Desviación estándar) en el plasma de la plasma de la sangre de pacientes con cáncer en función de la respuesta al tratamiento específico. Todos los casos fueron tratados con pautas estandarizadas de quimio y radioterapia. Ninguno de los casos era subsidiario de tratamiento quirúrgico (eran inextirpables quirúrgicamente). Entre paréntesis se especifica el número de sujetos humanos estudiados.
Tipo de cáncer (número de sujetos Relación VCFCT-NK1R / VFC-NK1R (± estudiados). Desviación Estándar). Valores pre- tratamiento y post -tratamiento (sin respuesta -NR- y con respuesta -R-).
p repostposttratamiento tratamiento tratamiento R
NR
Carcinoma gástrico (6) 1,2 (±0,1) 1,5 (±0,2) 1,8 (±0,2)
Carcinoma de colon (6) 1,3 (±0,1) 1,6 (±0,2) 1,9 (±0,3)
Carcinoma de páncreas (3) 1,4 1,7 1,9
Carcinoma de mama (9) 1,3 (±0,3) 1,6 (±0,2) 1,8 (±0,3)
Carcinoma de ovario (8) 1,2 (±0,6) 1,5 (±0,2) 1,8 (±0,2)
Carcinoma de endometrio (7) 1,4 (±0,5) 1,6 (±0,3) 1,7 (±0,3)
Carcinoma de pulmón de célula no 1,4 (±0,4) 1,7 (±0,2) 1,7 (±0,2) pequeña (8)
Carcinoma de pulmón, células 1,3 (±0,2) 1,6 (±0,3) 1,8 (±0,2) pequeñas (9)
Sarcoma -histiocitoma fibroso 1,2 (±0,3) 1,6 (±0,1) 1,9 (±0,4) maligno- (8)
Melanoma (6) 1,3 (±0,3) 1,5 (±0,2) 1,8 (±0,3)
Leucemias de estirpe B (9) 1,3 (±0,2) 1,6 (±0,3) 1,7 (±0,3)
Leucemias de estirpe T (9) 1,3 (±0,3) 1,5 (±0,2) 1,8 (±0,2)
Linfomas no Hodgkin (8) 1,2 (±0,3) 1,7 (±0,2) 1,8 (±0,3) Leucemias (6) 1,4 (±0,4) 1,8 (±0,2) 1,8 (±0,3)
Ejemplo 4. Los pacientes con cáncer muestran niveles detectables del ARNm que codifica para el receptor NK1 y del ARNm que codifica para la forma truncada del receptor NK1 en plasma de la sangre periférica. Los niveles del ARNm que codifica para la forma truncada del receptor NK1 están elevados en el plasma de la sangre de los pacientes con cáncer.
Para demostrar que los pacientes con cáncer tienen niveles detectables del ARNm que codifica para el receptor NK1 y ARNm que codifica para la forma truncada de dicho receptor se tomó plasma de la sangre de pacientes sanos y plasma de la sangre de pacientes con cáncer. En todos los casos se determinó mediante el método de PCR, en dicho plasma, la presencia del ARNm que codifica para el receptor NK1 y del ARNm que codifica para la forma truncada de dicho receptor, utilizando sondas ("primers") con las características que se detallan en la tabla 4. Para determinar el nivel ARNm que codifica para de la forma completa del receptor NK1 (en adelante "valor del ARNm que codifica la forma completa del receptor NK1 " o "VARNmFC- NK1 R") se utilizó el primer que se detalla en la tabla 4 con la referencia de "fl-TACR1". Para determinar el nivel de ARNm que codifica la forma truncada del receptor N K1 (en adelante "valor del ARNm que codifica la forma truncada del receptor NK1 " o "VARNmFT-NK1 R") se utilizó un "primer" que se une a una secuencia que común a ambas formas, larga y truncada, del ARNm que codifica para ambas formas del receptor, cuyas características se expresan en la tabla 4 con la referencia de "tr- TACR1 ").
Tabla 4. Características de las sondas utilizadas para la detección de las formas completa y truncada del receptor NK1.
Transcripto Referencia Número de Tamaño Posición de la Catálogo del
Secuencia Amplicón
Forma A-TACR1 NM_001058 PPH68645A 58 4264-4285 completa del (full length
receptor NK1. TACR1 )
Forma corta o tr-TACR1 NM_015727 PPH68646A 80 1581-1604 truncada del (truca nted
receptor NK1. TACR1 ) Tabla 5. Proporción entre VARNmFT-NK1 R / VARNmFC-NK1 R (± Desviación estándar) en el plasma de la plasma de la sangre de sujetos humanos sanos y pacientes con diversos tipos de cáncer. Entre paréntesis se especifica el número de sujetos humanos estudiados.
Figure imgf000058_0001
En la tabla 5 se muestra la relación entre VARNmFT-NK1 R / VARNmFC-NK1 R (± Desviación Estándar) en sujetos sanos y en pacientes con diferentes tipos de cáncer. Se demuestra que los sujetos humanos sanos la relación entre el valor conjunto del ARNm de las formas completa y truncada del receptor NK1 (VARNmFT-NK1 R / VARNmFC-NK1 R) es próxima a 0, lo que demuestra que en el plasma de la sangre de los sujetos sanos la forma predominante (exclusiva) es la del ARNm que codifica la forma completa del receptor NK1. En los pacientes con cáncer dicha proporción es superior a 0, incluso superior a 1 ó 2, lo que demuestra que en el plasma de la plasma de la sangre de los pacientes con cáncer es detectable la presencia de una cantidad significativa del ARNm forma truncada del receptor NK1. Ejemplo 5. Los pacientes con cáncer muestran una relación entre los niveles detectables del ARNm que codifica para el receptor NK1 y del ARNm que codifica para la forma truncada del receptor NK1 en plasma de la sangre periférica, diferente en función del estadio tumoral. En el presente ejemplo se demuestra que los pacientes con cáncer tienen una relación entre el VARNmFT-NK1 R / VARNmFC-NK1 R que es mayor en los casos en que el estadio tumoral es más avanzado. Para ello se determinó en cada caso el VARNmFT- NK1 R / VARNmFC-NK1 R mediante el método explicado en el ejemplo 4. Se seleccionaron, para cada tipo de cáncer pacientes en diferentes estadios evolutivos (siendo el estadio I el menos avanzado y el estadio I I I el más avanzado). Los estadios se establecieron en función de los criterios anatomopatológicos y clínicos marcados por las guías clínicas vigentes, definidas por la Organización Mundial de la Salud y sociedades científicas (Sobin LH, Gospodarowicz MK, Wittekind Ch. Eds. TNM Classification of Malignant Tumors, 7th ed. Wiley-Blackwell, Oxford 2009; url: http:/ www.uicc.org/resources/tnm ).
Tabla 6. Proporción entre VARNmFT-NK1 R / VARNmFC-NK1 R (± Desviación estándar) en el plasma de la plasma de la sangre de pacientes con cáncer en función del estadio de dicho cáncer. Entre paréntesis se especifica el número de sujetos humanos estudiados. Se demuestra que la presencia de ARNm que codifica la forma truncada del receptor NK1 detectable en el plasma de la sangre de los pacientes con cáncer es superior en los pacientes que presentan tumores cancerosos más avanzados (mayor estadio tumoral). Tipo de cáncer (número de sujetos Relación VARNmFT-NK1R / VARNmFC- estudiados). NK1R (± Desviación Estándar).
Estadio tumoral.
Estadio I Estadio II Estadio III
Carcinoma gástrico (9) 0,4 (±0,1) 1,9 (±0,3) 2,5 (± 0,7)
Carcinoma de colon (6) 0,6 (±0,1) 1,9 (±0,3) 2,5 (± 0,6)
Carcinoma de páncreas (6) 0,6 (± 0,2) 1,5 (±0,2) 2,4 (± 0,5)
Carcinoma renal (9) 0,7 (±0,1) 1,5 (±0,3) 1,9 (±0,4)
Carcinoma de mama (9) 0,5 (± 0,3) 1,3 (±0,4) 1,9 (±0,5)
Carcinoma de ovario (8) 0,6 (± 0,6) 1,4 (±0,3) 1,9 (±0,5)
Carcinoma de endometrio (7) 0,6 (± 0,5) 1,5 (±0,2) 2,8 (± 0,4)
Carcinoma de cérvix uterino (6) 0,7 (± 0,3) 1,2 (±0,3) 2,1 (±0,6)
Carcinoma de pulmón, célula no 0,6 (± 0,4) 1,7 (±0,2) 2,9 (± 0,5) pequeña (8)
Carcinoma de pulmón, células 0,5 (± 0,2) 1,4 (±0,2) 3,2 (± 0,4) pequeñas (9)
Carcinoma de tiroides papilar (6) 0,7 (±0,1) 1,5 (±0,4) 2,5 (± 0,5)
Carcinoma folicular de tiroides (6) 0,6 (± 0,2) 1,6 (±0,3) 2,1 (±0,4)
Carcinoma de vejiga (8) 0,7 (±0,1) 1,7 (±0,4) 2,5 (± 0,2)
Sarcoma -histiocitoma fibroso 0,6 (± 0,3) 1,7 (±0,3) 2,9 (± 0,3) maligno- (8)
Melanoma (6) 0,6 (± 0,3) 1,7 (±0,3) 3,6 (± 0,4)
Leucemias de estirpe B (9) 1,2 (±0,2) 2,2 (± 0,2) 3,9 (± 0,5)
Leucemias de estirpe T (9) 1,3 (±0,3) 2,3 (± 0,5) 3,8 (± 0,4)
Linfomas no Hodgkin, de estirpe B 1,5 (±0,3) 2,4 (± 0,4) 3,8 (± 0,5) (8)
Linfomas no Hodgkin, de estirpe T (7) 1,6 (±0,2) 2,3 (± 0,4) 3,9 (± 0,4)
Linfoma de Burkitt (6) 1,8 (±0,4) 2,4 (± 0,4) 3,6 (± 0,5)
Linfoma de Hodgkin (6) 1,2 (±0,3) 2,4 (± 0,5) 2,9 (± 0,4)
Leucemias de estirpe B (6) 1,9 (±0,4) 2,4 (± 0,4) 3,6 (± 0,5)
Leucemias de estirpe T (3) 1,9 2,5 3,8
Ejemplo 6. Los pacientes con cáncer muestran una relación entre los niveles detectables del receptor NK1 y de la forma truncada del receptor NK1, en plasma de la sangre periférica, diferente en función de la respuesta al tratamiento específico para esta enfermedad.
En el presente ejemplo se demuestra que los pacientes con cáncer, tienen una relación entre el VARNmFT-NK1 R / VARNmFC-NK1 R que es mayor en los casos en que los que no existe respuesta al tratamiento. De esta forma, el valor de la relación entre VARNmFT-NK1 R / VARNmFC-NK1 R es disminuye en función de que se produzca una mejor respuesta al tratamiento. Para ello se determinó en cada caso el VARNmFT-NK1 R y el VARNmFC-NK1 R mediante el método explicado en el ejemplo 4.
Tabla 7. Proporción entre VARNmFT-NK1 R / VARNmFC-NK1 R (± Desviación estándar) en el plasma de la plasma de la sangre de pacientes con cáncer en función de la respuesta al tratamiento específico quimio y/o radioterápico. Todos los casos eran subsidiarios exclusivamente de tratamiento quimio y/o radioterápico sin opciones quirúrgicas (no extirpables quirúrgicamente). Entre paréntesis se especifica el número de sujetos humanos estudiados.
Tipo de cáncer (número de Relación VARNmFT-NK1 R / VARNmFC- sujetos estudiados). NK1 R (± Desviación Estándar). Valores pre- tratamiento y post -tratamiento (sin respuesta -NR- y con respuesta -R-).
pre- postposttratamiento tratamiento tratamiento R
NR
Carcinoma gástrico (6) 2,9 (± 0,2) 3,6 (± 0,3) 0,2 (± 0, 1 )
Carcinoma de colon (6) 1 ,9 (± 0,2) 3,2 (± 0,3) 0,5 (± 0, 1 )
Carcinoma de páncreas (3) 2,5 3,5 0,7
Carcinoma de mama (9) 2,6 (± 0,4) 3,5 (± 0,3) 0,7 (± 0, 1 )
Carcinoma de ovario (8) 1 ,9 (± 0,5) 2,6 (± 0,4) 0,8 (± 0,3)
Carcinoma de endometrio (7) 2,6 (± 0,6) 3,7 (± 0,4) 0,9 (± 0,2)
Carcinoma de pulmón de célula no 1 ,9 (± 0,5) 2,5 (± 0,5) 0,9 (± 0,3) pequeña (8)
Carcinoma de pulmón, células 3,2 (± 0,5) 4,3 (± 0,4) 0,7 (± 0, 1 ) pequeñas (9)
Sarcoma -histiocitoma fibroso 2,5 (± 0,3) 3, 1 (± 0,3) 0,8 (± 0,2) maligno- (8)
Melanoma (6) 1 ,9 (± 0,4) 2,2 (± 0,4) 0,6 (± 0,2)
Leucemias de estirpe B (9) 4, 1 (± 0,4) 5,3 (± 0,3) 0,5 (± 0, 1 ) Leucemias de estirpe T (9) 3,6 (± 0,5) 4,2 (± 0,3) 0,6 (± 0,2)
Linfomas no Hodgkin (8) 3,7 (± 0,5) 4,4 (± 0,4) 0,5 (± 0,2)
Leucemias (6) 3,6 (± 0,5) 4,2 (± 0,5) 0,7 (± 0,3)
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Claims

REIVINDICACIONES
1.- Uso de la forma corta (o truncada) del receptor NK1 , o del ARNm que la codifica, para:
a) diagnosticar de cáncer a un individuo,
b) monitorizar la progresión del cáncer en un individuo,
c) clasificar a un individuo en un estadio de la enfermedad,
d) predecir la respuesta de dicho individuo al tratamiento del cáncer.
2.- El uso según la reivindicación anterior donde el diagnóstico es un diagnóstico precoz.
3. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 , donde el tratamiento del que se predice la respuesta es con un antagonista del receptor NK1.
4. - Un método in vitro de obtención de datos útiles para diagnosticar el cáncer a un individuo, que comprende detectar los niveles de expresión de la forma corta (o truncada) del receptor NK1 , o del ARNm que lo codifica, en una muestra biológica aislada de dicho individuo.
5. - Un método in vitro para diagnosticar el cáncer a un individuo que comprende:
a) obtener una muestra biológica aislada del individuo,
b) detectar los niveles de expresión de la forma corta o truncada del receptor NK1 , o del ARNm que lo codifica, en la muestra biológica del paso (a), y c) asignar a dicho individuo al grupo de individuos que padece cáncer cuando la forma corta o truncada del receptor NK1 o su ARNm presenta una expresión superior respecto a una muestra de referencia.
6. - El método según la reivindicación anterior, donde la expresión superior o sobreexpresión se define como un nivel de expresión de la forma truncada del receptor
NK1 , o del ARNm que codifica para la forma truncada del receptor NK1 respecto al nivel de expresión de la forma completa del receptor NK1 , o del ARNm que codifica para la forma completa del receptor NK1 , respectivamente, aumentado en más de, al menos, un:
a) 0,01 % b) 0, 1 %
c) 1 %
d) 10%
e) 20%
f) 30%
g) 40%
h) 50%
i) 60%
j) 70%, o del
k) 80%
en la muestra biológica aislada del individuo.
7. - Un método in vitro para diagnosticar el cáncer a un individuo que comprende:
a) obtener una muestra biológica aislada del individuo,
b) detectar simultáneamente los niveles de expresión del receptor NK1 y de su forma corta o truncada, o del ARNm que los codifica, en la muestra biológica del paso (a), y
c) asignar a dicho individuo al grupo de individuos que padece cáncer cuando la relación entre los niveles de expresión del receptor NK1 y los niveles de expresión de su forma truncada, o la relación entre el ANRm que los codifica respectivamente, tiene un valor mayor de 1 .
8. - Un método in vitro para clasificar a un individuo en un estadio tumoral determinado que comprende los pasos (a) - (c) según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, y además comprende clasificar al individuo en el grupo de individuos que padece cáncer:
i) en estadio I, cuando el valor de la relación entre la suma de los niveles de expresión de la forma entera y la truncada del receptor N K1 y el nivel de expresión de la forma entera de dicho receptor, es mayor a 1 y menor a 1 ,5 y/o el valor de la relación entre los niveles del ARNm que codifican la forma truncada y entera del receptor es mayor a 0 y menor a 1 ,2;
ii) en estadio II, cuando el valor de la relación entre la suma de los niveles de expresión de la forma entera y la truncada del receptor NK1 y el nivel de expresión de la forma entera de dicho receptor, es mayor a 1 ,5 y menor a 1 ,6 y/o el valor de la relación entre los niveles del ARNm que codifican la forma truncada y entera del receptor es mayor a 1 ,2 y menor a 1 ,9;
iii) en estadio III, cuando el valor de la relación entre la suma de los niveles de la forma entera y la truncada del receptor NK1 y el nivel de la forma completa de dicho receptor, es mayor a 1 ,6 y menor a 1 ,9 y/o el valor de la relación entre los niveles del ARNm que codifican la forma truncada y entera del receptor es mayor a 1 ,9 y menor a 3,9;
iv) en estadio IV, cuando el valor de la relación entre la suma de los niveles de la forma entera y la truncada del receptor NK1 y el nivel de la forma entera de dicho receptor, es mayor a 1 ,9 y/o el valor de los niveles del ARNm que codifican la forma truncada y entera del receptor es mayor a 3,9.
9. - Un método in vitro para evaluar la evolución de un individuo diagnosticado de cáncer que comprende detectar los niveles de expresión del receptor NK1 y/o de su forma corta (o truncada) o del ARNm que los codifica, en una muestra biológica de dicho individuo, en dos o más tiempos diferentes.
10. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-9, donde la muestra biológica es plasma de la sangre periférica extraída de un individuo.
1 1 . - El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-10, donde la muestra biológica es el plasma de la sangre extraída de un individuo.
12. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-1 1 , donde la detección
a. de los niveles de expresión de la forma completa del receptor NK1 b. de los niveles de expresión de la forma truncada del receptor NK1
c. de la presencia del ARNm que codifica la forma completa del receptor NK1 . d. de la presencia del ARNm que codifica la forma completa del receptor NK1 . se realiza por
i. un procedimiento de perfil genético, tal como una micromatriz, y/o
¡i. un procedimiento que comprende PCR, tal como una PCR en tiempo real; y/o
Ni. transferencia Northern, y/o
iv. western-blot y/o
v. un procedimiento inmunohistoquímico y/o vi. un procedimiento de ELISA.
13. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-12, donde la detección de los niveles de expresión se realiza mediante Q-RT-PCR.
14. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-13, donde la detección de los niveles de proteínas, de la forma completa del receptor NK1 y/o de la forma truncada del receptor NK1 , se realiza mediante técnicas inmunológicas.
15.- El método según la reivindicación 14, donde las técnicas inmunológicas están basadas en reacciones de precipitación, basadas en reacciones de aglutinación, inmunomarcación, radioinmunoanálisis y técnicas radioinmunométricas, ELISA, o en cualquiera de sus combinaciones.
16.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 14-15, donde las técnicas inmunológicas comprenden el inmunomarcaje.
17. - El método según la reivindicación 16, donde el inmunomarcaje se selecciona de entre inmunomarcaje con anticuerpos conjugados a enzimas, inmunomarcaje con anticuerpos conjugados a fluorocromos, o citometría.
18. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-17, donde el cáncer se selecciona de entre los siguientes: cáncer gástrico, preferentemente adenocarcinoma gástrico; carcinoma de colon, preferentemente adenocarcinoma de colon; cáncer de páncreas, preferentemente adenocarcinoma de páncreas; cáncer renal, preferentemente carcinoma renal de células claras; cáncer de mama, preferentemente adenocarcinoma de mama; carcinoma de ovario, preferentemente adenocarcinoma de ovario; cáncer de endometrio; cáncer de cérvix uterino; cáncer de pulmón, preferentemente carcinoma de pulmón de célula no pequeña y/o carcinoma de pulmón de células pequeñas; cáncer de tiroides, preferentemente carcinoma de tiroides papilar y/o carcinoma folicular de tiroides; cáncer de vejiga, preferentemente carcinoma transicional de vejiga de la orina; carcinoma de próstata; cáncer de estirpe glial del sistema nervioso central o glioma; sarcomas, preferentemente fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno y sarcoma de Edwing; melanoma; cánceres embrionarios, preferentemente neuroblastoma; y cánceres hematológicos, preferentemente leucemias de estirpe B o de estirpe T, linfomas no Hodgkin, preferentemente de estirpe B o de estirpe T, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin y mieloma múltiple.
19.- Una composición farmacéutica que comprende un antagonista del receptor NK1 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo identificado por un método según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 4-18, como un individuo que padece un cáncer, o que pueden ser clasificado en un estadio determinado del cáncer.
20.- La composición según la reivindicación 19, donde el antagonista del receptor NK1 es un antagonista no peptídico que se selecciona de la lista que consiste en: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant, Lanepitant, LY-686017, L- 733,060, L-732, 138, L-703,606, WIN 62,577, CP-122721 , , TAK-637, y R673, CP- 100263, WIN 51708, CP-96345, L-760735, CP-122721 , L-758298, L-741671 , L- 742694, CP-99994, T-2328, o cualquiera de sus combinaciones.
21 . - La composición según la reivindicación 19, donde el antagonista del receptor NK1 es un anticuerpo o un fragmento del mismo, específico contra los receptores celulares NK1 , NK2 y/o NK3, o combinaciones de los mismos, que reconoce al menos una secuencia de los receptores NK1 , NK2 o NK3, seleccionada de entre: SEQ ID NO: 5, SEQ I D NO: 6 o SEQ I D NO: 7.
22. - Un kit o dispositivo que comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar al menos la forma truncada del receptor NK1 , o el ARNm que lo codifica, y preferiblemente también comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar la forma entera del receptor N K1 , o el ARNm que lo codifica y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares debases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ I D NO: 4 (forma corta del receptor NK1) y/o SEQ I D NO: 2 (forma larga del receptor N K1 ), - las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1 100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ I D NO: 4 (forma corta del receptor NK1) y/o SEQ I D NO: 2 (forma larga del receptor N K1 ), - los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 1 (forma larga del receptor NK1 ), SEQ I D NO: 3 (forma corta del receptor NK1 ),
23. - El kit o dispositivo según la reivindicación 22, donde que comprende al menos un anticuerpo que se selecciona de entre:
a) un anticuerpo anti-NK1 en su forma completa.
b) un anticuerpo anti-NK1 en su forma truncada.
24. - El kit o dispositivo según la reivindicación 23, donde el anticuerpo anti-N K1 en su forma completa reconoce un epitopo localizado en el extremo C-terminal del receptor.
25. - El kit o dispositivo según la reivindicación 23, donde el anticuerpo anti-N K1 en su forma truncada reconoce un epitopo en alguno de los puentes transmembrana del receptor.
26. - El kit o dispositivo según la cualquiera de las reivindicaciones 22-25, donde el anticuerpo es monoclonal.
27. - El kit o dispositivo según la cualquiera de las reivindicaciones 22-26, donde el anticuerpo se encuentra marcado con un fluorocromo.
28. - El kit o dispositivo según la reivindicación 27, donde el fluorocromo se selecciona de la lista que comprende: Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones.
29.- El uso de un kit o dispositivo según la cualquiera de las reivindicaciones 22-28, para llevar a cabo un método según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 18.
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