ES2703943T3

ES2703943T3 - Método para el diagnóstico y pronóstico in vitro de recaída de cáncer de mama triple negativo

Info

Publication number: ES2703943T3
Application number: ES14802443T
Authority: ES
Inventors: Catherine Guette; Mario Campone; Olivier Coqueret; Benjamin Barre
Original assignee: Inst De Cancerologie De Louest; Universite dAngers; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; INSTITUT DE CANCEROLOGIE DE L'OUEST
Current assignee: Inst De Cancerologie De Louest; Universite dAngers; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; INSTITUT DE CANCEROLOGIE DE L'OUEST
Priority date: 2013-11-22
Filing date: 2014-11-24
Publication date: 2019-03-13
Anticipated expiration: 2034-11-24
Also published as: WO2015075240A3; EP2876445A1; US20160291021A1; EP3071972B1; US10859577B2; EP3071972A2; WO2015075240A2

Abstract

Método in vitro para diagnosticar y/o pronosticar la recaída o ausencia de recaída de cáncer de mama triple negativo (TNBC) en un sujeto, que comprende las etapas de: a) determinar a partir de una muestra biológica de un sujeto el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en desmoplaquina, proteína 1 activante de Rho GTPasa, epiplaquina, glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa [NADP], queratina de tipo I del citoesqueleto 19, queratina de tipo I del citoesqueleto 8, proteína 3 relacionada con dihidropirimidinasa y trombospondina-1, en el que uno de dichos dos biomarcadores es desmoplaquina; y b) comparar dicho nivel de expresión con un nivel de expresión de referencia de dichos biomarcadores.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para el diagnóstico y pronóstico in vitro de recaída de cáncer de mama triple negativo.

La presente invención se encuentra en el campo técnico de la gestión del cáncer de mama, y más particularmente se refiere al diagnóstico y/o pronóstico de cáncer de mama triple negativo (TNBC). La invención se basa más particularmente en el hallazgo de que se expresan biomarcadores específicos de manera aberrante en pacientes que padecen una recaída de cáncer de mama triple negativo, y están sumamente relacionados con la agresividad de esta enfermedad, y por tanto con la supervivencia de dicho paciente.

Con más de 1.3 millones de casos de cánceres de mama invasivos diagnosticados anualmente, y más de 450.000 muertes notificadas al año, el cáncer de mama es el tumor maligno más común diagnosticado en mujeres y una de las causas principales de muerte relacionada con cáncer en mujeres.

El cáncer de mama representa una enfermedad heterogénea, ya que abarca una plétora de subtipos tumorales que no sólo presentan características morfológicas distintas sino también comportamientos clínicos. Estos subtipos presentan por tanto diferentes implicaciones en el pronóstico y la respuesta a la terapia. La determinación de estado del receptor hormonal (receptor de estrógenos (ER) y progesterona (PR)) se ha convertido en una práctica convencional en la gestión de cánceres de mama invasivos: la positividad para ER puede predecir la respuesta a la terapia endocrina tal como administración de antiestrógenos o supresión ovárica, mientras que la positividad para el receptor de factor de crecimiento epitelial humano 2 (HER2, c-erbB-2) es útil para seleccionar la terapia dirigida con el anticuerpo monoclonal contra HER2.

A pesar de la disminución de la incidencia y mortalidad vinculadas a esta patología debido al examen y la terapia mejorada, el cáncer de mama sigue siendo no obstante una causa principal de muerte. Por tanto, se ha vuelto crucial diagnosticar de manera más precisa los subtipos de cáncer de mama, y seleccionar tratamientos apropiados, no sólo para los pacientes, sino también por motivos económicos de salud.

Entre los subtipos de cáncer de mama, el cáncer de mama triple negativo (TNBC) es responsable de una proporción relativamente grande de muertes, debido notablemente a su desenlace clínico generalmente agresivo. El cáncer de mama triple negativo se define por una falta de expresión de receptores de estrógenos, progesterona y HER2/neu, lo que representa de aproximadamente el 10 al 15% de todos los cánceres de mama. El término “cáncer de mama triple negativo” se describió por primera vez en 2005 (Brenton et al., 2005), y ha aparecido desde entonces en más de 1000 publicaciones. Aunque se presume frecuentemente que afecta a mujeres jóvenes predominantemente (es decir, por debajo de 50 años de edad), su distribución es realmente similar en todos los grupos de edad (Hudis et al., 2011). Este subtipo de cáncer es habitualmente más frecuente en mujeres afroamericanas, se presenta como cánceres de intervalo, es altamente quimiosensible y muestra una débil asociación entre tamaño tumoral y metástasis de ganglios linfáticos. De la manera más importante, está asociado, tal como se mencionó anteriormente, con un fenotipo agresivo, y presenta generalmente un mal desenlace en comparación con otros subtipos de cáncer de mama. Desafortunadamente, debido a su negatividad para los tres marcadores moleculares ER, PR y HER2/neu, el cáncer de mama triple negativo no es sensible a la terapia endocrina habitual o terapia dirigida al receptor de factor de crecimiento epidérmico humano de tipo 2 (HER2). Además, el cáncer de mama triple negativo presenta un patrón de recidiva muy particular que difiere de cánceres de mama positivos para hormonas, ya que aproximadamente el 30% de los pacientes experimentan recidiva en los primeros 3 a 5 años. El riesgo de recidiva disminuye no obstante tras aproximadamente 5 años desde el diagnóstico inicial.

Debido a la ausencia de directrices de tratamiento específicas para pacientes afectados por este cáncer particular, los cánceres de mama triples negativos están gestionándose actualmente con quimioterapia adyuvante adicional. Sin embargo, tal tratamiento es menos eficaz que para otros subtipos de cáncer de mama y sigue estando asociado con una alta tasa de recidiva local y sistémica. Por tanto, es crítico identificar pacientes con recidiva tan pronto como sea posible, con el fin de adaptar su tratamiento según corresponda.

La mayoría de los estudios descritos en la bibliografía se realizaron para identificar biomarcadores que caracterizan al cáncer de mama triple negativo, sin discriminar pacientes con recidiva de aquellos sin recidiva. Además, estos estudios se centraron principalmente en correlaciones genotípicas-fenotípicas, tales como polimorfismos genéticos o variaciones de la expresión génica, pero no en las entidades funcionales reales, las proteínas, que se expresan de manera diferencial en células de cáncer de mama. Sin embargo, el comportamiento de estas entidades funcionales no puede predecirse a partir de sus genes codificantes. Una vez transcritos, la expresión de proteínas puede, de hecho, estar regulada todavía al nivel de la traducción, y pueden someterse las proteínas correspondientes a modificaciones postraduccionales, variación de las semividas y compartimentalización.

Un único estudio, el documento WO 2009/114862, da a conocer métodos de determinación del riesgo de desarrollar TNBC o una recaída basándose en el nivel de dos o más marcadores, al menos uno de los cuales se selecciona particularmente de entre proteínas de reparación del ADN.

Dado que el diagnóstico y pronóstico de cáncer de mama triple negativo y la terapia dirigida están actualmente mal definidos, existe una necesidad urgente de identificar y caracterizar biomarcadores fiables que permitan identificar de manera precisa los diferentes subconjuntos de pacientes con TNBC, especialmente los que desarrollan una recaída del cáncer local o distante, con el fin de diseñar y adaptar su terapia según corresponda.

Esta necesidad se aborda mediante la presente divulgación, que notifica en la presente memoria los resultados de una investigación realizada sobre una cohorte grande de pacientes con cáncer de mama triple negativo con recidiva y sin recidiva, mediante un enfoque proteómico cuantitativo utilizando marcaje con iTRAQ, fraccionamiento de péptido OFFGEL y análisis de espectrometría de masas (Ernoult et al., 2008 y 2010). En contraposición a los biomarcadores genómicos, los biomarcadores proteómicos son de hecho particularmente ventajosos ya que reflejan mejor el microentorno tumoral y pueden experimentar modificaciones postraduccionales específicas de cáncer. Por lo que conoce el solicitante, este es el primer estudio que investiga biomarcadores proteómicos en un panel exhaustivo de pacientes con cáncer de mama para diagnosticar y pronosticar la recaída de TNBC.

Combinando tanto un análisis multivariante como uno univariante, los inventores han identificado biomarcadores clave de la recaída y ausencia de recaída de cáncer de mama triple negativo. En particular, los inventores han identificado, por un lado, desmoplaquina, proteína 1 activante de Rho GTPasa, epiplaquina, glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa [NADP], queratina de tipo I del citoesqueleto 19, queratina de tipo I del citoesqueleto 8, proteína 3 relacionada con dihidropirimidinasa y/o trombospondina-1 como biomarcadores asociados con recaída de TNBC y un mal desenlace clínico, y, por otro lado, hexocinasa-1, proteína de choque térmico de 10 kDa, región de cadena C de Ig gamma-1, proteína 1 que contiene dominio SAM y dominio HD, y/o triptofanil-ARNt sintetasa como biomarcadores asociados con ausencia de recaída de TNBC y un buen desenlace clínico. Aunque se ha mostrado que la desmoplaquina y otros marcadores tales como isocitrato deshidrogenasa 2 [NADP] se expresan de manera diferencial en cáncer de mama (véanse los documentos WO 03/070979 y WO 2004/063355), su asociación con TNBC y recaída de TNBC se describe en la presente memoria por primera vez.

Todos los biomarcadores dados a conocer en la presente memoria pueden utilizarse, por tanto, para monitorizar la progresión o regresión de la enfermedad, para evaluar la susceptibilidad o la predicción de la respuesta al tratamiento, pero también para evaluar la eficacia de un tratamiento. También pueden utilizarse como dianas terapéuticas para diseñar fármacos nuevos.

Por tanto, basándose en los hallazgos dados a conocer en la presente memoria, se proporcionan por primera vez en la presente memoria métodos de diagnóstico, pronóstico y terapéuticos precisos y fiables para la recaída de cáncer de mama triple negativo, que se basan, al menos en parte, en la determinación del nivel de expresión de los biomarcadores mencionados anteriormente. También se proporcionan en la presente memoria un método de examen para identificar fármacos, un método para determinar un fenotipo que responde o no responde a los fármacos, así como un método para diseñar o adaptar un régimen de tratamiento. También se proporcionan en la presente memoria kits y microalineamientos de proteínas para llevar a cabo dichos métodos.

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas y cualquier otro aspecto o realización expuesto en la presente memoria es sólo para información.

Descripción detallada de la invención

A menos que se establezca otra cosa, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente invención presentarán los significados que entienden comúnmente los expertos habituales en la materia. Además, a menos que el contexto requiera otra cosa, las nomenclaturas utilizadas en la presente memoria, y las técnicas de biología molecular y cultivo celular son las bien conocidas y comúnmente utilizadas en la materia.

No obstante, con respecto a la utilización de diferentes términos a lo largo de toda la memoria descriptiva actual, las siguientes definiciones se aplican más particularmente.

Según los diferentes aspectos y realizaciones de la invención, el término “que comprende” o “que contiene” significa la inclusión del referente y no excluye la presencia de cualquier otro elemento. En contraposición con el término “que comprende,” el término “que consiste de” significa la única inclusión del referente y por tanto excluye la presencia de cualquier otro elemento.

Por “cáncer de mama triple negativo” o “TNBC” quiere decirse en la presente memoria, tal como se indicó anteriormente, cualquier cáncer de mama que no exprese el receptor de estrógenos (ER), el receptor de progesterona (PR) y Her2/neu (HER2). Un cáncer de mama triple negativo puede denominarse por tanto alternativamente cáncer de mama negativo para receptor de estrógenos (ER), negativo para receptor de progesterona (PR) y negativo para Her2/neu (HER2). El cáncer de mama triple negativo (TNBC) abarca varios subtipos histológicos comunes, incluyendo notablemente carcinomas medulares, metaplásicos, secretores, mioepiteliales y adenoides quísticos, así como subtipos histológicos menos comunes tales como carcinoma apocrino, carcinoma lobular pleomórfico y cáncer ductal-lobular. Puede encontrarse información adicional sobre cáncer de mama triple negativo (TNBC) en Rakha et al. (2008).

Por “recaída”, “con recaída”, “recidiva” o “con recidiva”, quiere decirse en la presente memoria, en el contexto de posibles desenlaces clínicos del cáncer y tal como define el National Cancer Institute, que el cáncer ha experimentado recaída (ha regresado), habitualmente después de un periodo de tiempo durante el cual no pudo detectarse el cáncer. Un cáncer con recaída puede referirse a un cáncer que regresa al mismo lugar que el tumor original (primario) o a otro lugar en el cuerpo (también conocido como metástasis).

En cambio, el término “sin recaída”, “sin recidiva”, “ausencia de recaída”, “ausencia de recidiva”, significa que el cáncer no ha experimentado recaída (es decir, no ha regresado), habitualmente después de un periodo de tiempo durante el cual no pudo detectarse el cáncer.

El término “sujeto” o “paciente” se utiliza en la presente memoria para describir cualquier miembro del reino animal, preferiblemente un ser humano, más preferiblemente una mujer.

El término “diagnosticar” o “diagnóstico”, tal como se utiliza en el contexto de la presente invención, incluye el acto o proceso de identificar la existencia (o no existencia) y/o el tipo de enfermedad que puede estar padeciendo un individuo.

El término “pronóstico”, “pronosticar” o “desenlace clínico”, tal como se utiliza en la presente memoria se refiere al probable desenlace o transcurso de una enfermedad; la posibilidad de recuperación o no recuperación. Un pronóstico puede indicar si un paciente con cáncer presentará probablemente una progresión o muerte atribuible al cáncer, y/o una supervivencia a corto plazo o largo plazo. Un desenlace clínico puede evaluarse, por ejemplo, en el contexto del desenlace de un individuo en relación con un desenlace de una población de pacientes que presentan un diagnóstico clínico comparable, utilizando diversos criterios de valoración bien conocidos en la materia, tales como supervivencia global (OS), supervivencia libre de enfermedad (DFS), razones de riesgo (HR) y similares. Tales parámetros los conoce bien el experto, que puede hacer referencia a las definiciones proporcionadas por el National Cancer Institute en los National Institutes of Health (http://www.cancer.gov).

El término “desenlace clínico positivo” o “buen pronóstico” significa un desenlace clínico deseado. En el contexto de la presente invención, un desenlace clínico positivo puede ser una expectativa o baja probabilidad de progresión o muerte atribuible a TNBC. Preferiblemente, un desenlace clínico positivo significa que dicho sujeto corre un riesgo de progresión o muerte atribuible a TNBC inferior al 25%, en el plazo de 5 años desde el diagnóstico inicial de cáncer de mama triple negativo.

En cambio, los términos “desenlace clínico negativo” o “mal pronóstico” se utilizan en la presente memoria de manera intercambiable queriendo decir un desenlace clínico no deseado. En el contexto de la presente invención, un desenlace clínico negativo puede ser una expectativa o alta probabilidad de progresión o muerte atribuible a TNBC. Preferiblemente, un desenlace clínico negativo significa que dicho sujeto corre un riesgo de progresión o muerte atribuible a TNBC superior al 75%, en el plazo de 5 años desde el diagnóstico inicial de cáncer de mama triple negativo.

Una “muestra biológica” tal como se utiliza en la presente memoria puede ser cualquier muestra que puede aislarse de un sujeto, incluyendo, sin limitación, un líquido biológico tal como sangre o un componente fraccional de la misma (suero, plasma, extracto celular), linfa, líquido intersticial tumoral, saliva, moco, esputos, sudor, orina, así como una biopsia de tejido tal como una biopsia tumoral. Además, en el caso de una recaída del cáncer local o distante, una muestra biológica puede incluir además células tumorales circulantes (CTC) que pueden aislarse de un líquido biológico tal como se definió anteriormente, preferiblemente a partir de sangre, mediante técnicas bien conocidas en la materia. Un ejemplo de una técnica que permite el aislamiento de células tumorales circulantes (CTC) es el fraccionamiento de flujo de Dean (DFF), tal como establecieron Hou et al., 2013. Más preferiblemente, la muestra biológica según la invención es una biopsia tumoral, tal como la biopsia de un tumor de mama o de una metástasis del mismo.

El término “biomarcador” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere preferiblemente a un polipéptido o proteína, fragmento del mismo o epítopo que está presente de manera diferencial en un sujeto en comparación con sujeto sanos, incluyendo biomarcadores modificados (por ejemplo glicosilados de manera diferencial) y/o expresados de manera diferencial. Se enumeran ejemplos de biomarcadores en las tablas 1, 2, 6A y 8A, y pueden denominarse en la presente memoria “biomarcadores de la divulgación”. Debe indicarse que el término “biomarcador” incluye biomarcadores solubles, es decir biomarcadores que se escinden, secretan, liberan o desprenden de manera diferencial a partir de una célula tumoral en un sujeto, y por tanto pueden detectarse en un líquido biológico tal como se definió anteriormente. Por ejemplo, en el presente contexto, una forma soluble de la proteína de la membrana plasmática desmoplaquina, tal como se describe adicionalmente a continuación, puede detectarse a partir de una mera muestra de sangre o un componente fraccional de la misma (Lopez-Farré et al., 2012). Pueden liberarse “biomarcadores solubles” a un líquido biológico a través de varios posibles mecanismos, tales como destrucción de tejido local durante la progresión de la enfermedad. Por ejemplo, pueden liberarse biomarcadores solubles a la circulación sanguínea a través de desprendimiento y secreción aberrantes a partir de células tumorales o a través de la destrucción de la arquitectura tisular y angiogénesis a medida que el tumor invade. También pueden escindirse proteínas de la superficie extracelular de células tumorales por proteasas y posteriormente se abren camino a la circulación sanguínea. En vista de lo anterior, un experto en la materia entendería fácilmente que, si el nivel de expresión de un biomarcador soluble de interés va a evaluarse a partir de una muestra biológica, dicha muestra se selecciona preferiblemente a partir de al menos uno de los líquidos biológicos descritos anteriormente, impidiendo de ese modo cualquier acto invasivo en el paciente. Un biomarcador soluble sigue siendo no obstante detectable dentro de su sitio de expresión, es decir dentro de un tumor de mama o una metástasis del mismo.

El término “nivel de expresión”, tal como se aplica a un biomarcador tal como una proteína, se refiere en la presente memoria a la cantidad o nivel de un biomarcador de interés expresado en una célula, tejido, líquido biológico u órgano(s). El término “nivel” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una cantidad (por ejemplo cantidad relativa o concentración) de un biomarcador que puede detectarse o medirse en una muestra. Por ejemplo, el nivel puede ser una concentración tal como |ig/l o una cantidad relativa en comparación con un nivel de expresión de referencia. El acto de “determinar el nivel de expresión” realmente de un biomarcador en una muestra biológica se refiere al acto de detectar activamente si un biomarcador se expresa en dicha muestra o no, y permite notablemente la detección de si la expresión del biomarcador está regulada por incremento, regulada por disminución o sustancialmente sin cambios en comparación con un nivel de expresión de referencia.

Por “nivel de expresión de referencia” o “nivel de expresión de control” de un biomarcador, quiere decirse un nivel de expresión predeterminado de dicho biomarcador, que puede utilizarse como referencia en cualquier método descrito en la presente memoria. Por ejemplo, un nivel de expresión de referencia puede ser el nivel de expresión de un biomarcador en una muestra biológica de un sujeto sano, o la mediana o el promedio de nivel de expresión en una muestra biológica de una población de sujetos sanos.

Se proporcionan definiciones adicionales a lo largo de toda la memoria descriptiva.

La presente invención puede entenderse más fácilmente mediante referencia a la siguiente descripción detallada, que incluye realizaciones preferidas de la invención, y los ejemplos incluidos en la presente memoria.

Los inventores han descubierto sorprendentemente biomarcadores clave asociados con recaída y ausencia de recaída de cáncer de mama triple negativo (TNBC). En particular, los inventores han descubierto que el nivel de expresión de biomarcadores específicos se correlaciona con el estado y progresión de la enfermedad. Estos biomarcadores específicos pueden permitir, por tanto, una detección rápida y fiable de una recaída de TNBC, y proporcionan una buena indicación del desenlace clínico.

Por consiguiente, en un primer aspecto, se describe en la presente memoria un método in vitro para diagnosticar y/o pronosticar una recaída o ausencia de recaída de cáncer de mama triple negativo (TNBC) en un sujeto, que comprende las etapas de:

a) determinar a partir de una muestra biológica de un sujeto el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en desmoplaquina, proteína 1 activante de Rho GTPasa, epiplaquina, glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa [NADP], queratina de tipo I del citoesqueleto 19, queratina de tipo I del citoesqueleto 8, proteína 3 relacionada con dihidropirimidinasa y trombospondina-1; y

b) comparar dicho nivel de expresión con un nivel de expresión de referencia de dichos biomarcadores.

El método anterior puede comprender además opcionalmente la etapa c) de determinar si dicho sujeto padece o no una recaída de cáncer de mama triple negativo (TNBC), y/o determinar o predecir el desenlace clínico en dicho sujeto, basándose en la comparación en la etapa b).

Debe entenderse que dicho sujeto ha padecido previamente un cáncer de mama triple negativo (TNBC) primario, y puede habérsele diagnosticado el mismo y/o haberse tratado para el mismo.

Tal como se ilustra en los resultados experimentales de la presente solicitud, los inventores han descubierto que los biomarcadores mencionados anteriormente están asociados con recaída de TNBC, así como con un mal pronóstico.

En la siguiente tabla 1 se enumeran biomarcadores particularmente preferidos asociados con recaída de TNBC.

Tabla 1. Biomarcadores de recaída de TNBC

Como ejemplo, un nivel de expresión de dichos al menos dos biomarcadores asociados con recaída de TNBC tal como se describió anteriormente, superior a un nivel de expresión de referencia obtenido a partir de una muestra biológica de al menos un sujeto sano, es indicativo de que el sujeto padece una recaída de cáncer de mama triple negativo (TNBC), y/o es indicativo de un desenlace clínico negativo.

Por superior a un nivel de expresión de referencia, quiere decirse preferiblemente que la razón entre el nivel de expresión de dichos biomarcadores y el nivel de expresión de referencia está por encima de 1.

Notablemente, con respecto al desenlace clínico, los inventores han descubierto que una expresión superior de dichos biomarcadores, en comparación con un nivel de expresión de referencia, se correlaciona con una baja tasa de supervivencia libre de enfermedad (DSF), una baja tasa de supervivencia global (OS), un riesgo aumentado de muerte y/o un riesgo aumentado de progresión de la enfermedad, tal como se demuestra en los resultados experimentales.

Según un ejemplo adicional, el método anterior comprende además la etapa de determinar a partir de la muestra biológica de dicho sujeto el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en hexocinasa-1, proteína de choque térmico de 10 kDa, región de cadena C de Ig gamma-1, proteína 1 que contiene dominio SAM y dominio HD y triptofanil-ARNt sintetasa. Un experto en la materia comprenderá fácilmente que también se lleva a cabo una comparación del nivel de expresión de dichos biomarcadores con un nivel de expresión de referencia de dichos biomarcadores.

Tal como se ilustra en los resultados experimentales de la presente solicitud, los inventores han descubierto de hecho que los biomarcadores mencionados anteriormente están asociados con ausencia de recaída de TNBC, así como con un buen pronóstico.

En la siguiente tabla 2 se enumeran biomarcadores particularmente preferidos asociados con ausencia de recaída de TNBC.

Tabla 2. Biomarcadores de ausencia de recaída de TNBC

Como ejemplo, un nivel de expresión de dichos al menos dos biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en:

• hexocinasa-1, proteína de choque térmico de 10 kDa, proteína 1 que contiene dominio SAM y dominio HD y triptofanil-ARNt sintetasa, superior a un nivel de expresión de referencia obtenido a partir de una muestra biológica de al menos un sujeto sano, y

• región de cadena C de Ig gamma-1, inferior a un nivel de expresión de referencia obtenido a partir de una muestra biológica de al menos un sujeto sano,

es indicativo de que el sujeto no padece una recaía de cáncer de mama triple negativo (TNBC), y/o es indicativo de un desenlace clínico positivo.

Por inferior a un nivel de expresión de referencia, quiere decirse preferiblemente que la razón entre el nivel de expresión de dichos biomarcadores y el nivel de expresión de referencia está por debajo de 1.

En particular, con respecto al desenlace clínico, los inventores han descubierto que una expresión superior de hexocinasa-1, proteína de choque térmico de 10 kDa, proteína 1 que contiene dominio SAM y dominio HD, y/o triptofanil-ARNt sintetasa, y/o una expresión inferior de región de cadena C de Ig gamma-1, en comparación con un nivel de expresión de referencia, se correlaciona con una alta tasa de supervivencia libre de enfermedad (DSF), una alta tasa de supervivencia global (OS), un bajo riesgo de muerte y/o un bajo riesgo de progresión de la enfermedad.

El experto en la materia comprenderá fácilmente que pueden combinarse más de dos biomarcadores de recaída o ausencia de recaída de TNBC como un panel de biomarcadores, cada uno de los cuales contribuye al diagnóstico y/o pronóstico final descrito en la presente memoria. Está dentro de la experiencia del experto habitual en la materia seleccionar los biomarcadores que van a combinarse en el presente método, así como en otros métodos descritos en la presente memoria. Lo más preferiblemente, el experto combinará los nueve biomarcadores asociados con recaída de TNBC y/o los cinco biomarcadores asociados con ausencia de recaída de TNBC tal como se describió anteriormente.

Aun cuando los biomarcadores enumerados anteriormente son suficientes para llevar a cabo un diagnóstico y/o un pronóstico, se entenderá que la información obtenida utilizando los métodos descritos en la presente memoria pueden utilizarse en combinación con otra información, tal como, pero sin limitarse a, los niveles de expresión de biomarcadores adicionales que pueden ser biomarcadores convencionales, parámetros químicos clínicos, parámetros histopatológicos, o la edad, el género y/o el peso del sujeto.

Por tanto, como ejemplo, el método anterior comprende además la etapa de determinar a partir de la muestra biológica de dicho sujeto el nivel de expresión de al menos un biomarcador adicional de las tablas 7A y/o 8A tal como se describe más adelante, y cualquier combinación de los mismos. Un experto en la materia entendería fácilmente a partir de los datos proporcionados en la presente memoria que los biomarcadores enumerados en las tablas 7A y/o 8A pueden ayudar en el diagnóstico y/o pronóstico del método descrito en la presente memoria. Además, debe indicarse que los valores numéricos indicados en esas tablas se proporcionan como ejemplo representativo del nivel de expresión de cada biomarcador; esos valores no son por tanto limitativos, y no excluyen valores ligeramente mayores y/o ligeramente menores. Está dentro de la experiencia del experto habitual en la materia seleccionar los biomarcadores de las tablas 7A y/o 8A que van a combinarse en el presente método, así como en otros métodos descritos en la presente memoria.

En el contexto de la presente invención, el nivel de expresión se mide preferiblemente al nivel de proteína. Se conocen bien en la materia métodos para medir los niveles de expresión de proteínas y se revisan de manera notable por Reeves et al. (2000) y Schena (2005). Esos métodos implican generalmente poner en contacto una muestra biológica de interés con uno o más reactivos detectables que son adecuados para medir el nivel de expresión de proteínas, tales como un anticuerpo, y posteriormente determinar el nivel de expresión de proteínas basándose en el nivel de reactivo detectado, preferiblemente tras normalización. Los ejemplos de métodos que implican generalmente la utilización de un anticuerpo incluyen, sin limitación, inmunotransferencia de tipo Western, inmunotransferencia, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), Immunospot ligado a enzimas (ELISPOT), radioinmunoensayo (RIA), inmunohistoquímica e inmunoprecipitación. Pueden utilizarse otros métodos adecuados para medir un nivel de expresión de proteínas, que no implican necesariamente la utilización de un anticuerpo, incluyendo, sin limitación, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), microscopía tal como microscopía de fuerza atómica, citometría de flujo, microcitometría, ensayo de unión de proteínas, ensayo de unión de ligandos, microalineamiento, electroforesis en gel de poliacrilamida tales como SDS-PAGE, resonancia de plasmón superficial (SPR), transferencia de energía por resonancia Forster (FRET), transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET), quimioluminiscencia, polarización fluorescente, fosforescencia, espectrometría de masas tal como espectrometría de masas con cromatografía de líquidos (CL-EM) o cromatografía de líquidos/espectrometría de masas/espectrometría de masas (CL-EM-EM), desorción/ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF), desorción/ionización por láser potenciada por superficie-tiempo de vuelo (SELDI-TOF) y obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI).

Según los diferentes aspectos y ejemplos descritos en la presente memoria, la etapa de determinar el nivel de expresión de un biomarcador de interés comprende además preferiblemente una subetapa de normalizar el nivel de expresión de dicho biomarcador. El método para normalizar el nivel de expresión puede seleccionarse basándose en el método utilizado para medir el nivel de expresión. Por ejemplo, si se realiza una inmunotransferencia de tipo Western, el nivel de expresión de un biomarcador de interés en una muestra biológica puede normalizarse evaluando en paralelo en dicha muestra el nivel de expresión de una proteína que se expresa habitualmente de manera constitutiva en cualquier célula de un organismo vivo, preferiblemente al mismo nivel de expresión ya esté la célula sana o no (por ejemplo, ya sea cancerosa o no). Un ejemplo de una proteína expresada de manera constitutiva es una proteína de mantenimiento, que puede seleccionarse, sin limitación, entre actina, beta-tubulina y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), por nombrar unas cuantas. Alternativamente, si se realiza un ELISA, que implica por ejemplo un método de detección colorimétrico, el nivel de expresión de proteína puede normalizarse mediante el número de células total. Aún, todavía alternativamente, si se realiza un microalineamiento, el nivel de expresión de proteína puede normalizarse, por ejemplo, mediante regresión de Loess. Para una revisión detallada de métodos de normalización del nivel de expresión de proteína en un microalineamiento de anticuerpos, un experto en la materia puede remitirse a Hamelinck et al. (2005).

Todos estos métodos para medir y normalizar el nivel de expresión de proteína los conoce bien el experto, y por tanto no es necesario detallarlos adicionalmente en la presente memoria. Si el experto desea utilizar cualquiera de los métodos anteriores que implican la utilización de un anticuerpo para medir el nivel de expresión de proteínas biomarcadoras, puede utilizarse cualquier anticuerpo comercial apropiado específico para dicho biomarcador. Alternativamente, basándose en el conocimiento de la secuencia de aminoácidos de un biomarcador de interés, resulta fácil para el experto diseñar reactivo(s) adecuado(s) para medir el nivel de expresión en cualquier muestra biológica. Por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra un biomarcador específico puede prepararse mediante cualquier método convencional, por ejemplo inmunizando un animal, tal como un ratón, con una forma inmunogénica de dicho biomarcador que provoca una respuesta de anticuerpos en dicho animal. Se describen bien en la bibliografía métodos para producir anticuerpos monoclonales y policlonales (véanse notablemente Kohler y Milstein, 1975; Kozbor et al., 1983; Roder et al., 1986; y Huse et al., 1986), y por tanto no es necesario detallarlos adicionalmente en la presente memoria.

La comparación de un nivel de expresión determinado o sometido a prueba con un nivel de expresión de referencia puede realizarse simplemente calculando la razón entre el nivel de expresión de un biomarcador de interés en la muestra biológica sometida a prueba y en al menos una muestra de referencia, preferiblemente tras normalización tal como se describió anteriormente. Por consiguiente, una razón por encima de 1 es indicativa de que el biomarcador está sobreexpresado, mientras que una razón por debajo de 1 es indicativa de que el biomarcador está subexpresado (es decir, regulado por disminución).

En otro aspecto, los biomarcadores dados a conocer en la presente memoria pueden utilizarse para determinar si un paciente responderá o no a la terapia contra el cáncer. La asociación de la respuesta de un paciente con el tratamiento con tal(es) biomarcador(es) puede dilucidar de hecho nuevas oportunidades para el tratamiento en pacientes que no responden o indicar un tratamiento con respecto a otras opciones de tratamiento.

Por tanto, se proporciona adicionalmente en la presente memoria un método in vitro para determinar un fenotipo de respuesta o ausencia de respuesta a fármaco en un sujeto que padece una recaída de cáncer de mama triple negativo, que comprende las etapas de:

a) determinar a partir de una muestra biológica de dicho sujeto el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en desmoplaquina, proteína 1 activante de Rho GTPasa, epiplaquina, glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa [NADP], queratina de tipo I del citoesqueleto 19, queratina de tipo I del citoesqueleto 8, proteína 3 relacionada con dihidropirimidinasa y trombospondina-1;

b) comparar el nivel de expresión en la etapa a) con un nivel de expresión de referencia de dichos biomarcadores; y

c) determinar a partir de dicha comparación el fenotipo de respuesta a fármaco o ausencia de respuesta a fármaco.

Según la presente invención, un “fenotipo de respuesta a fármaco” se refiere a un estado de respuesta de un sujeto a la administración de un fármaco. Un “estado de respuesta” significa que dicho sujeto responde al tratamiento, es decir que dicho tratamiento es eficaz en dicho sujeto. Un fenotipo de respuesta se caracteriza por tanto por una mejora en los signos clínicos, es decir en el presente contexto, un fenotipo de respuesta se caracteriza por ejemplo por una regresión o desaparición de células de cáncer de mama triple negativo y metástasis del mismo, si las hay. Una regresión o desaparición de células cancerosas puede evaluarse principalmente determinando un volumen tumoral, tal como mediante obtención de imágenes por tomografía computarizada (CT) u obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI). En cambio, un “fenotipo de ausencia de respuesta a fármaco” se refiere a la ausencia en dicho sujeto de un estado de respuesta, lo que significa que dicho sujeto es resistente al tratamiento.

Como ejemplo, el método tal como se describió anteriormente comprende además la etapa de determinar a partir de dicha muestra el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores asociados con ausencia de recaída de TNBC tal como se describió anteriormente.

El experto entendería que pueden utilizarse más de dos de los biomarcadores mencionados anteriormente como panel de biomarcadores, con el fin de contribuir a la determinación de un fenotipo de respuesta o ausencia de respuesta a fármaco según el método descrito en la presente memoria.

El experto entendería también a partir de los datos proporcionados en la presente memoria que los biomarcadores enumerados en las tablas 7A y/u 8A pueden ayudar adicionalmente en esta determinación.

Por consiguiente, como ejemplo, el método tal como se describió anteriormente comprende además la etapa de determinar a partir de dicha muestra el nivel de expresión de al menos un biomarcador adicional de las tablas 7A y/u 8A, tal como se describe más adelante.

En un aspecto adicional, los biomarcadores dados a conocer en la presente memoria pueden utilizarse para diseñar o adaptar un tratamiento contra una recaída de cáncer de mama triple negativo (TNBC). En particular, tal tratamiento puede diseñarse o adaptarse una vez que se le ha diagnosticado a un sujeto que presenta una recaída de TNBC, según el método descrito en la presente memoria.

Por consiguiente, se proporciona en la presente memoria un método para diseñar o adaptar un régimen de tratamiento para un sujeto que padece una recaída de cáncer de mama triple negativo (TNBC), que comprende las etapas de:

a) determinar a partir de una muestra biológica de dicho sujeto un fenotipo de respuesta o ausencia de respuesta a fármaco, según el método descrito anteriormente; y

b) diseñar o adaptar un régimen de tratamiento para dicho sujeto basándose en dicho fenotipo de respuesta o ausencia de respuesta.

El presente método es particularmente útil para ofrecer una terapia adaptada a cada paciente afectado por una recaída de TNBC.

El término “régimen de tratamiento” se refiere en la presente memoria a un plan de tratamiento que especifica el tipo de tratamiento (es decir, el tipo de fármaco o combinación de fármacos y el modo de administración de dicho(s) fármaco(s)), la dosificación, el programa y/o la duración de un tratamiento proporcionado a un sujeto que lo necesita. La dosificación, programa y/o duración del tratamiento pueden variar, dependiendo de la progresión de la enfermedad y el tipo de tratamiento seleccionado. En este sentido, además de los fármacos que pueden identificarse según el método de examen descrito en la presente memoria, los agentes terapéuticos que pueden utilizarse en el régimen de tratamiento descrito en la presente memoria incluyen, sin limitación, agentes quimioterápicos, inhibidores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) tales como bevacizumab, inhibidores del receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) tales como cetuximab y panitumumab, inhibidores de tirosina cinasa, inhibidores de poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), inhibidores de la glicoproteína transmembrana NMB (GPNMB) tales como glembatumumab vedotin (CDX-011), y cualquier combinación de los mismos.

Los fármacos quimioterápicos convencionales para tratar cáncer de mama incluyen, sin limitación, agentes basados en platino tales como oxaliplatino, cisplatino, carboplatino, espiroplatino, iproplatino y satraplatino; agentes alquilantes tales como ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucilo, busulfano, melfalán, mecloretamina, uramustina, tiotepa y nitrosoureas; antimetabolitos tales como 5-fluorouracilo, azatioprina, 6-mercaptopurina, metotrexato, leucovorina, capecitabina, citarabina, floxuridina, fludarabina, gemcitabina, pemetrexed o raltitrexed; alcaloides vegetales tales como vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, podofilotoxina o taxanos tales como paclitaxel y docetaxel; inhibidores de topoisomerasa tales como irinotecán, topotecán, amsacrina, etopósido (VP16), fosfato de etopósido o tenipósido; antibióticos antitumorales tales como antraciclinas (por ejemplo, doxorubicia, daunorubicia, epirubicia, mitoxantrona), actinomicina, bleomicina, mitomicina o plicamicina; y cualquier combinación de los mismos.

Los ejemplos de inhibidores de tirosina cinasa que pueden utilizarse en el régimen de tratamiento descrito en la presente memoria incluyen, sin limitación, dasatinib, gefitinib, sunitinib, erlotinib, lapatinib, canertinib, semaxinib, vatalanib, sorafenib, mesilato de imatinib, leflunomida, vandetanib, pelitinib, CP-654577, CP-724714, HKI-272, PKI-166, AEE788, BMS-599626, HKI-357, BIBW 2992, ARRY-334543, JNJ-26483327, JNJ-26483327, y cualquier combinación de los mismos.

Los ejemplos de inhibidores de poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) que pueden utilizarse en el régimen de tratamiento descrito en la presente memoria incluyen, sin limitación, olaparid (AZD-2281), iniparib (BSI-201), rucaparib (AG014699, PF-01367338), veliparib (ABT-888), CEP 9722, MK 4827, BMN-673, 3-aminobenzamida, y cualquier combinación de los mismos.

Un régimen de tratamiento particularmente preferido descrito en la presente memoria consiste en la combinación de tres agentes (“terapia triple” o “régimen de tratamiento triple”). Por ejemplo, pueden combinarse tres agentes terapéuticos de distintas categorías, seleccionándose dichos agentes de un agente quimioterápico, un inhibidor de receptor de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), un inhibidor de receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), un inhibidor de tirosina cinasa, un inhibidor de poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) y/o un inhibidor de glicoproteína transmembrana NMB (GPNMB), tal como se definió anteriormente. Otro ejemplo de una terapia triple puede incluir un inhibidor de un biomarcador asociado con recaída de TNBC junto con dos agentes terapéuticos de distintas categorías tal como se describió anteriormente.

En el método anterior, el régimen de tratamiento que se diseña o adapta y opcionalmente se administra al sujeto depende del fenotipo de respuesta o ausencia de respuesta. En particular, un régimen de tratamiento puede seleccionarse por primera vez, continuarse, ajustarse o detenerse basándose en dicho fenotipo. Por ejemplo, un régimen de tratamiento puede ajustarse aumentando la dosis que va a administrarse, o detenerse y cambiarse a un régimen de tratamiento alternativo, si el sujeto no responde. Todavía, alternativamente, un régimen de tratamiento puede seleccionarse por primera vez o continuarse si un sujeto responde. Un experto en la materia diseñaría o ajustaría no obstante fácilmente el tipo de tratamiento con la dosificación, el programa y la duración del tratamiento, dependiendo del fenotipo del sujeto.

Además, basándose en dicho fenotipo, el régimen de tratamiento seleccionado puede ser uno agresivo que se espera que dé como resultado el mejor desenlace clínico (por ejemplo, regresión y/o desaparición de las células de cáncer de mama triple negativo y metástasis del mismo, si las hay) y que puede estar asociado con alguna molestia para el sujeto o efectos secundarios adversos (por ejemplo, daño para el tejido o las células sanas). Un ejemplo de un régimen de tratamiento agresivo incluye un régimen de tratamiento tal como se describió anteriormente combinado con intervención quirúrgica para eliminar células tumorales, tejido u órganos y/o una exposición a radioterapia. Un régimen de tratamiento agresivo puede incluir también una dosificación superior del/de los agente(s) terapéutico(s), una administración más frecuente de dicho(s) agente(s) y/o una duración más prolongada del tratamiento.

Por tanto, una vez que se ha determinado un régimen de tratamiento según las enseñanzas dadas a conocer en la presente memoria, el sujeto puede recibir el tratamiento apropiado.

Por tanto, en otro aspecto, se proporciona en la presente memoria un método para tratar una recaída de cáncer de mama triple negativo en un sujeto que lo necesita, que comprende las etapas de:

b) administrar a dicho sujeto dicho fármaco si el fenotipo es un fenotipo de respuesta.

El término “administrar” tal como se utiliza en la presente memoria significa que el/los fármaco(s) de interés se suministran o dispensan a un sujeto por vía oral, o por vía parenteral tal como mediante inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intratecal o intraperitoneal.

En otro aspecto, los biomarcadores dados a conocer en la presente memoria pueden utilizarse para fines de examen de fármacos. En particular, pueden proporcionarse ensayos de fármacos nuevos, que identifican productos terapéuticos que interfieren eficazmente con la proliferación de células de cáncer de mama triple negativo que expresan de manera aberrante esos biomarcadores. El tratamiento actual de cáncer de mama triple negativo (TNBC) se basa principalmente en quimioterapia y/o fármacos antiangiogénicos, que pueden combinarse, si es necesario, con cirugía. Sin embargo, con quimioterapia sola, el riesgo residual de recaída sigue siendo alto, de entre el 30 y el 40%. Además, tal como se indicó anteriormente, la terapia endocrina y anti-HER2 habitualmente no están indicadas para pacientes con TNBC, ya que son negativos para el receptor de estrógenos (ER), receptor de progesterona (PR) y receptor de factor de crecimiento epidérmico 2 humano (HER2). Se proporciona por tanto en la presente memoria un ensayo de examen nuevo para identificar fármacos candidatos que se dirigen a la recaída de cáncer de mama triple negativo.

En este aspecto, se proporciona más particularmente en la presente memoria un método de examen para identificar un fármaco o combinación de fármacos adecuados para tratar una recaída de cáncer de mama triple negativo, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto células o una línea celular de cáncer de mama aisladas que presentan un fenotipo de recaída de cáncer de mama triple negativo con un fármaco candidato o combinación de fármacos candidatos;

b) determinar, a partir de dichas células o línea celular en contacto con dicho fármaco o combinación de fármacos, el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en desmoplaquina, proteína 1 activante de Rho GTPasa, epiplaquina, glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa [NADP], queratina de tipo I del citoesqueleto 19, queratina de tipo I del citoesqueleto 8, proteína 3 relacionada con dihidropirimidinasa y trombospondina-1; y

c) comparar el nivel de expresión de dichos biomarcadores en la etapa b) con su nivel de expresión en ausencia de dicho fármaco o combinación de fármacos.

Por “fármaco” o “agente” quiere decirse en la presente memoria un compuesto tal como una molécula química o biológica que puede administrarse o someterse a prueba tal como se describe en la presente memoria. Un compuesto químico puede ser de cualquier composición tal como inorgánica u orgánica. Una molécula biológica puede ser una molécula de cualquier origen biológico que puede encontrarse o producirse por, al menos en parte, una célula, tal como, sin limitación, péptidos o proteínas tales como anticuerpos o Affibodies, lípidos, ácidos nucleicos tales como iARN o aptámeros, hidratos de carbono, y cualquier combinación de los mismos.

Por “fármaco adecuado para tratar una recaída de TNBC”, quiere decirse en la presente memoria un fármaco que puede ralentizar o detener el crecimiento de células de cáncer de mama triple negativo y metástasis del mismo, si las hay, o bien destruyendo dichas células, o bien ralentizando o deteniendo su división incontrolada.

Además, se entenderá que por “células o línea celular de cáncer de mama que presentan un fenotipo de recaída de TNBC” según la invención, quiere decirse células o línea celular de cáncer mama que presenta(n) el mismo perfil de expresión del/de los biomarcador(es) asociado(s) con recaída de cáncer de mama triple negativo como el descrito anteriormente, tal como el perfil de expresión descrito en la tabla 7A. Preferiblemente, las células o línea celular utilizadas en el presente método de examen son células o línea celular de cáncer de mama aisladas de un sujeto que padece una recaída de cáncer de mama triple negativo.

El método de examen descrito anteriormente es preferiblemente un método de examen in vitro. Por ejemplo, las células o línea celular utilizadas en el presente método pueden cultivarse en un sistema de cultivo tridimensional (3D), para imitar el microentorno tumoral de un TNBC. Para hacer esto, dichas células pueden incrustarse en una matriz extracelular (ECM) tal como describen Weigelt et al. (2008), Kenny et al. (2007) y Li et al. (2010).

Con el fin de evaluar la eficacia del agente anticancerígeno candidato, dichas células o línea celular, como alternativa o como prueba de validación, pueden injertarse en un animal, tal como un ratón. Este procedimiento, también conocido como xenoinjerto, se ha utilizado satisfactoriamente para evaluar la eficacia de metformina sobre xenoinjertos en ratón de TNBC (Liu et al., 2009). Si se lleva a cabo un xenoinjerto de este tipo, el método de examen descrito anteriormente comprende además preferiblemente la etapa de matar a dicho animal.

Como ejemplo del método anterior, un nivel de expresión de dichos biomarcadores en la etapa b) inferior a su nivel de expresión en ausencia de dicho fármaco o combinación de fármacos es indicativo de que dicho fármaco o combinación de fármacos es adecuado para tratar una recaída de TNBC.

Preferiblemente, un nivel de expresión de los nueve biomarcadores en la etapa b) inferior a su nivel de expresión en ausencia de dicho fármaco o combinación de fármacos es indicativo de que dicho fármaco o combinación de fármacos es adecuado para tratar una recaída de TNBC.

Aún, como ejemplo, el método de examen descrito en la presente memoria comprende además la etapa de determinar, a partir de dichas células o línea celular, el nivel de expresión de al menos un biomarcador adicional de la tabla 7A tal como se describe más adelante. Un experto en la materia entendería fácilmente a partir de los datos proporcionados en la presente memoria que los biomarcadores enumerados en la tabla 7A pueden ayudar en la identificación de un fármaco o combinación de fármacos adecuados para tratar una recaída de TNBC.

En otro aspecto, se proporcionan kits en la presente memoria que pueden emplearse en los métodos descritos en la presente memoria. En este sentido, se describe en la presente memoria un kit para su utilización en cualquier método descrito anteriormente, que comprende o consiste en:

a) un reactivo que puede determinar específicamente el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en desmoplaquina, proteína 1 activante de Rho GTPasa, epiplaquina , glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa [NADP], queratina de tipo I del citoesqueleto 19, queratina de tipo I del citoesqueleto 8, proteína 3 relacionada con dihidropirimidinasa y trombospondina-1; y

b) instrucciones para realizar dicho método.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “instrucciones” se refiere a una publicación, una grabación, un diagrama o cualquier otro medio que pueda utilizarse para comunicar cómo realizar un método descrito en la presente memoria. Dichas instrucciones, por ejemplo, pueden fijarse a un recipiente que contiene dicho kit. Preferiblemente, las instrucciones para utilizar dicho kit incluyen un nivel de expresión de referencia de dichos biomarcadores.

El término “reactivo que puede determinar específicamente el nivel de expresión” designa un reactivo o un conjunto de reactivos que reconoce específicamente dicho(s) biomarcador(es) y permite la cuantificación del nivel de expresión de dicho(s) biomarcador(es). Estos reactivos pueden ser por ejemplo anticuerpos, aptámeros o Affibodies que reconocen específicamente un biomarcador. En el presente contexto, se dice que un reactivo de este tipo es “específico” para su diana (es decir, biomarcador) o “reconoce específicamente” su diana si 1) presenta un nivel umbral de actividad de unión, y/o 2) no reacciona significativamente de manera cruzada con moléculas diana que se sabe que están relacionadas con el biomarcador de interés. La afinidad de unión de un reactivo de este tipo puede determinarla fácilmente un experto en la materia, por ejemplo, mediante análisis de Scatchard. La reactividad cruzada de un reactivo también puede determinarla fácilmente un experto en la materia, y por tanto no es necesario detallarlo adicionalmente en la presente memoria. Los ejemplos de reactivos que pueden determinar específicamente el nivel de expresión de un biomarcador incluyen, sin limitación, anticuerpos.

Como ejemplo particular, el kit puede comprender además:

c) un reactivo que puede determinar específicamente el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores asociados con ausencia de recaída de TNBC tal como se describió anteriormente.

Aún, en un ejemplo adicional, el kit descrito en la presente memoria comprende además un reactivo que puede determinar específicamente el nivel de expresión de al menos un biomarcador adicional de la tabla 7A y/o 8A, tal como se describe adicionalmente más adelante, y cualquier combinación de los mismos.

Con el fin de normalizar el nivel de expresión de proteína, el kit descrito en la presente memoria puede comprender también opcionalmente un reactivo que puede determinar específicamente el nivel de expresión de una proteína de mantenimiento, tal como actina, beta-tubulina o gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).

En aún otro aspecto, los métodos descritos en la presente memoria pueden ponerse en práctica utilizando un microalineamiento, para determinar notablemente el nivel de expresión de biomarcadores de interés descritos en la presente memoria.

El término “microalineamiento” se refiere en la presente memoria a una colección espacialmente definida y diferenciada de moléculas biológicas individuales que se inmovilizan sobre una superficie sólida, y a los que se unen específicamente uno o varios biomarcadores de interés. Estas moléculas biológicas permiten la determinación del nivel de expresión de dicho(s) biomarcador(es), y pueden ser anticuerpos, Affibodies o aptámeros si el microalineamiento es un microalineamiento de proteínas, que es un tipo preferido de microalineamiento descrito en la presente memoria. El experto conoce bien tecnologías de microalineamientos de proteínas, y se describen notablemente en Mitchell (2002), Haab (2005) y Eckel-Passow et al. (2005), y en las patentes US n.os 6.087.102, 6.139.831 y 6.087.103. Para la determinación del nivel de expresión de proteína de uno o varios biomarcadores utilizando tal alineamiento, pueden utilizarse normalmente dos tecnologías: 1) marcaje directo y 2) marcaje indirecto, tal como describen por ejemplo Kingsmore et al. (2006). En el método de “marcaje directo”, la proteína de interés (es decir, el biomarcador descrito en la presente memoria, o diana) obtenida a partir de una muestra, tal como una muestra biológica, se marca con un marcador específico (por ejemplo un marcador fluorescente o de radioisótopo), y posteriormente se hibrida con el microalineamiento uniéndose específicamente a un reactivo que reconoce a dicho biomarcador, estando dicho reactivo conjugado con la superficie del microalineamiento de proteínas. Si va a evaluarse el nivel de expresión de varios biomarcadores, cada biomarcador se marca con un marcador distinto. En el método de “marcaje indirecto”, la muestra que contiene el biomarcador de interés se hibrida con el microalineamiento uniéndose específicamente a un reactivo no marcado que reconoce a dicho biomarcador, estando dicho reactivo conjugado con la superficie del microalineamiento de proteínas, y entonces se añade un reactivo marcado secundario, que reconoce también específicamente a dicho biomarcador. La especificidad y sensibilidad de un método de marcaje indirecto de este tipo puede potenciarse además utilizando un tercer reactivo marcado, que reconoce al reactivo secundario (ensayo de tipo sándwich). De manera similar, si va a evaluarse el nivel de expresión de varios biomarcadores en el método de marcaje indirecto, cada reactivo secundario o terciario se marca con un marcador distinto. Pueden utilizarse también sistemas libre de marcador para determinar el nivel de expresión de un biomarcador en un microalineamiento de proteínas; en un sistema de este tipo, la detección del biomarcador, y por tanto de su nivel de expresión, puede realizarse mediante resonancia de plasmón superficial (SPR), biodetección de microviga, SELDI-TOF-EM o microscopía de fuerza atómica (Chandra et al., 2011).

Por tanto, se describe en la presente memoria un microalineamiento de proteínas para su utilización en cualquier método descrito anteriormente, que comprende o consiste en:

a) un reactivo que puede determinar específicamente el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en desmoplaquina, proteína 1 activante de Rho GTPasa, epiplaquina, glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa [NADP], queratina de tipo I del citoesqueleto 19, queratina de tipo I del citoesqueleto 8, proteína 3 relacionada con dihidropirimidinasa y trombospondina-1.

Por ejemplo, el microalineamiento de proteínas descrito en la presente memoria puede comprender además:

b) un reactivo que puede determinar específicamente el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores asociados con ausencia de recaída de cáncer de mama triple negativo (TNBC) tal como se describió anteriormente.

Aún, en un ejemplo adicional, el microalineamiento descrito en la presente memoria comprende además un reactivo que puede determinar específicamente el nivel de expresión de al menos un biomarcador adicional de la tabla 7A y/o 8a , tal como se describe adicionalmente más adelante, y cualquier combinación de los mismos.

Con el fin de normalizar el nivel de expresión de proteínas, el microalineamiento descrito en la presente memoria puede comprender también opcionalmente un reactivo que puede determinar específicamente el nivel de expresión de una proteína de mantenimiento, tal como actina, beta-tubulina o gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).

La presente invención se entenderá mejor en vista de la siguiente descripción detallada de experimentos, que incluye ejemplos.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Flujo de trabajo esquemático del diseño experimental y análisis de datos.

Figura 2. Clasificación tumoral mediante análisis de mínimos cuadrados parciales ortogonal (OPLS) en el análisis global.

Figura 3. Análisis de inmunotransferencia de la expresión de los biomarcadores WARS y THBS1 en sujetos con recidiva y sin recidiva. Se sometieron a inmunotransferencia seis o siete tumores “con recidiva” y seis u ocho tumores “sin recidiva”. Se utilizó HSC70 como control.

Figura 4. Estimaciones de Kaplan-Meier de la supervivencia libre de enfermedad para la expresión de WARS (A) , HSPE1 (B), SAMHD1 (C), HK1 (D) e IGHG1 (E).

Figura 5. Estimaciones de Kaplan-Meier de la supervivencia global para la expresión de WARS (A), HSPE1 (B) e IGHG1 (C).

Figura 6. Estimaciones de Kaplan-Meier de la supervivencia libre de enfermedad para la expresión de DSP (A), THBS1 (B), G6PD (C), IDH2 (D), KRT19 (E), KRT8 (F), EPPK1 (G), ARHGAP1 (H) y DPYSL3 (I).

Figura 7. Estimaciones de Kaplan-Meier de la supervivencia global para la expresión de DSP (A), THBS1 (B), G6PD (C) e IDH2 (D).

Figura 8. Curvas de Kaplan-Meier para los biomarcadores DSP (A,B), THBS1 (C,D) e IGHG1 (E,F) (supervivencia libre de enfermedad a la izquierda (A,C,E) y supervivencia global a la derecha (B,D,F)).

Figura 9. Validación de DSP en las muestras de suero de una cohorte de cáncer de mama triple negativo. Ejemplos

1. Materiales y métodos

1.1. Colección de muestras

Los inventores seleccionaron casos de tumores de mama triples negativos (TNBC) que se extirparon quirúrgicamente con intención curativa en el banco de tumores del West Cancer Institute. Todos los pacientes proporcionaron su consentimiento informado para la participación y este proyecto lo aprobó el Comité de revisión institucional. Todas las muestras se recogieron inmediatamente después de la cirugía, se congelaron instantáneamente y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta el momento de análisis. También se seleccionaron 4 zonas macroscópicamente normales para el conjunto de control. Se cortaron secciones congeladas (12 |im de grosor) de o bien TNBC o bien zonas normales con un crisostato (Bright Instrument Co Ltd, St Margarets Way, RU). Se tiñeron secciones específicas con azul de toluidina para referencia visual y patólogos experimentados evaluaron cada sección de tejido de todas las muestras para la determinación de la proporción de células. Se eliminaron muestras que contenían menos del 80% de células tumorales. En la tabla 3 a continuación se resumen las características de candidatos tisulares.

Tabla 3. Características clinicopatológicas de pacientes para estudios de proteómica tisular ____________________________________ Total (n=80) Sin recaída (n=45) Recaída (n=35) Edad

Mediana (intervalo) 56 (28-78) 55 (28-78) 58 (37-76)

1 1 0 1

Grado _{2 6 6 0}

3 73 39 34

pT

08-11 6 5 1

12-15 23 16 7

16-19 11 7 4

20-23 15 10 5

24-27 6 4 2

28-31 5 2 3

32-35 6 4 2

36-70 7 3 4 Quimioterapia adyuvante 3 2 1 Radioterapia 77 49 28

1.2. Extracción de proteína a partir de tejidos congelados

Se cortaron secciones congeladas (12 |im de grosor) de TNBC o zona de mama normal con un criostato (Bright Instrument Co Ltd, St Margarets Way, RU). Se tiñeron secciones específicas con azul de toluidina para referencia visual. Se lisaron diez secciones congeladas por tumor en un tampón que consistía en Tris-HCl 0.1 M, pH 8.0, DTT 0.1 M y SDS al 4% a 95°C durante 90 min. Se eliminó el detergente de los lisados y se digirieron las proteínas con tripsina utilizando el protocolo de FASP (Wisniewski et al., 2009) utilizando unidades de ultrafiltración por centrifugación de corte de peso molecular nominal de 30000. A unidades de filtro YM-30 Microcon (n.° de cat. MRCF0R030, Millipore) que contenían concentrados de proteína, se le añadieron 200 |il de urea 8 M en Tris/HCl 0.1 M, pH 8.5 (uA), y se centrifugaron las muestras a 14000 g a 20°C durante 8 min. Se realizó esta etapa tres veces. Entonces se añadieron 6 |il de MMTS 200 mM en urea 8 M a los filtros y se incubaron las muestras durante 20 min. Se lavaron los filtros tres veces con 200 |il de UA 8 M seguido por seis lavados con 100 |il de TEAB 0.5 M. Finalmente, se añadió tripsina (AB sciex) en 100 |il de TEAB 0.5 M a cada filtro. La razón de proteína con respecto a enzima era de 100:1. Se incubaron las muestras durante la noche a 37°C y se recogieron los péptidos liberados mediante centrifugación. Entonces se secaron las muestras completamente utilizando un instrumento Speed-Vac y se resuspendieron en 100 |il de ácido trifluoroacético (TFA) al 0.5% en acetonitrilo al 5%, y se desalaron por medio de columnas de centrifugación PepClean C-18 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Se determinó el contenido en péptido utilizando el kit de ensayo de proteínas Micro BCA (Pierce-Thermo Scientific, Rockford, IL).

1.3. Marcaje de péptidos con reactivos iTRAQ

Se marcó cada disolución de péptido a temperatura ambiente durante 2 h con un vial de reactivo iTRAQ previamente reconstituido con 70 |il de etanol para reactivo iTRAQ 4plex y reconstituido con 50 |il de isopropanol para reactivo iTRAQ 8plex. Se analizó una mezcla que contenía pequeñas alícuotas de cada muestra marcada mediante EM/EM para determinar una razón de mezclado apropiada para corregir la irregularidad en el rendimiento de péptido a partir de procedimientos de tejidos líquidos. Entonces se mezclaron los péptidos marcados en una razón 1:1:1:1 (o 1:1:1:1:1:1:1:1). Entonces se secó completamente la mezcla de péptidos utilizando un instrumento Speed-Vac.

1.4. Fraccionamiento OFFGEL de péptidos

Para la separación de péptidos basada en pl, los inventores utilizaron el fraccionador 3100 OFFGEL (Agilent Technologies, Boblingen, Alemania) con una configuración de 24 pocillos según el protocolo descrito por Ernoult et al. (2008). Brevemente, antes del electroenfoque, se desalaron las muestras en un cartucho Sep-Pak C18 (Waters). Para la configuración de 24 pocillos, se diluyeron muestras de péptido hasta un volumen final de respectivamente 3,6 ml utilizando una disolución de muestra de péptido OFFGEL. Para comenzar, se rehidrató la tira de gel IPG de 24 cm de largo (GE Healthcare, Múnich, Alemania) con un intervalo de pH lineal de 3-10 con la disolución de rehidratación de tira IPG de péptido según el protocolo del fabricante durante 15 min. Entonces, se cargaron 150 |il de muestra en cada pocillo. Se realizó el electroenfoque de los péptidos a 20°C y 50 HA hasta que se alcanzó el nivel de 50 kVh. Tras el enfoque, se extrajeron 24 fracciones de péptido y se lavaron los pocillos con 200 |il de una disolución de agua/metanol/ácido fórmico (49/50/1). Tras 15 min, se agruparon las disoluciones de lavado con su correspondiente fracción de péptido. Se evaporaron todas las fracciones mediante centrifugación a vacío y se mantuvieron a -20°C. Justo antes de la nano-CL, se resuspendieron las fracciones en 20 |il de H²O con TFA al 0.1% (v/v).

1.5. Separación por CL capilar

Se separaron las muestras en un sistema de nano-CL Ultimate 3.000 (Dionex, Sunnyvale, EE.UU.) utilizando una columna C18 (PepMap100, 3 |im, 100A, d.i. de 75 |im x 15 cm, Dionex) a una velocidad de flujo de 300 nl/min. El tampón A era ACN al 2% en agua con TFA al 0.05% y el tampón B era ACN al 80% en agua con TFA al 0.04%. Se desalaron los péptidos durante 3 min utilizando sólo tampón A en la precolumna, seguido por una separación durante 105 min utilizando el siguiente gradiente: del 0 al 20% de B en 10 min, del 20% al 45% de B en 85 min y del 45% al 100% de B en 10 min. Se registraron los cromatogramas a la longitud de onda de 214 nm. Se recogieron fracciones de péptido utilizando un colector de microfracciones Probot (Dionex). Se utilizó CHCA (LaserBioLabs, Sophia-Antipolis, Francia) como matriz de MALDI. Se añadió de manera continua la matriz (concentración de 2 mg/ml en ACN al 70% en agua con TFA al 0.1%) al efluente de la columna por medio de una pieza de mezclado de micro “T” a una velocidad de flujo de 1.2 |il/min. Tras 12 min de ejecución, se envió una señal de inicio al Probot para iniciar el fraccionamiento. Se recogieron fracciones durante 10 s y se dispusieron en puntos sobre una placa de muestra de MALDI (1.664 puntos por placa, Applied Biosystems, Foster City, CA).

1.6. MALDI-EM/EM

Se realizaron análisis de EM y EM/EM de muestras de péptidos en puntos fuera de línea utilizando el analizador de MALDI-TOF/TOF 5800 (ABsciex) y el software 4000 Series Explorer, versión 4.0. Se hizo funcionar el instrumento en un modo de ión positivo y se calibró externamente utilizando un kit convencional de calibración de masas (ABsciex). La potencia del láser se fijó entre 2800 y 3400 para la adquisición de EM y entre 3600 y 4200 para la de EM/EM. Tras el examen de todas las posiciones de muestra de CL-MALDI en modo de reflector positivo para EM utilizando 1500 disparos de láser, se realizó la fragmentación de precursores seleccionados automáticamente a una energía de colisión de 1 kV utilizando aire como gas de colisión (presión de ~ 2 x 10"6 Torr) con una acumulación de 2000 disparos para cada espectro. Se adquirieron los espectros de EM entre m/z 1000 y 4000. Para la calibración interna, se utilizó el ión original de Glu1-fibrinopéptido a m/z 1570.677 diluido en la matriz (30 femtomoles por punto). Se seleccionaron hasta 12 de las señales iónicas más intensas por posición de punto que presentaban una S/N > 12 como precursores para la adquisición de EM/EM. Se realizó la identificación de péptidos y proteínas mediante el software ProteinPilot™ V 4.0 (AB Sciex) utilizando el algoritmo Paragon como motor de búsqueda (Shilov et al., 2007).

Se buscó cada espectro de EM/EM para la especie Homo sapiens frente a la base de datos Uniprot/swissprot (Uni-ProtKB/Sprot 20110208 versión 01, con 525997 entradas de secuencia). Se ejecutaron las búsquedas utilizando la modificación fija de cisteína marcada con metilmetanotiosulfato permitida. Otros parámetros tales como especificidad de escisión tríptica, precisión de masa de ión precursor y presión de masa de ión de fragmento son funciones incorporadas en MALDI 5800 del software ProteinPilot. El umbral de proteína detectada (Protscore no utilizada (confianza)) en el software se fijó a 1.3 para lograr el 95% de confianza, y se agruparon las proteínas identificadas mediante el algoritmo ProGroup (ABsciex) para minimizar la redundancia. Se ejecutó la opción de corrección del sesgo.

Se utilizó también una estrategia de búsqueda en base de datos señuelo para estimar la tasa de descubrimiento falso (FDR), definida como el porcentaje de proteínas señuelo identificadas frente a la identificación de proteínas totales. Se calculó la FDR buscando el espectro frente a la base de datos señuelo de Homo sapiens Uniprot. La baja FDR estimada del 0.9% indicó una alta fiabilidad de las proteínas identificadas.

1.7. Cuantificación de la expresión de proteína relativa.

Los inventores emplearon un paquete de software adaptado, iQuantitator (Schwacke et al., 2009; Grant et al., 2009; y Besson et al., 2011) para inferir la magnitud del cambio en la expresión de proteína. El software infiere cambios dependientes del tratamiento en la expresión utilizando métodos estadísticos bayesianos. Básicamente, se utilizó este enfoque para generar medias, medianas e intervalos plausibles del 95% (superior e inferior) para cada cambio dependiente del tratamiento en la expresión de proteína utilizando datos de nivel de péptidos para cada péptido componente, e integrando los datos a través de los dos experimentos. Para proteínas cuyas razones de iTRAQ estaban reguladas por disminución en tejidos, se consideró el grado de regulación por disminución adicionalmente si el límite superior del intervalo plausible presentaba un valor inferior a 1. A la inversa, para proteínas cuyas razones de iTRAQ estaban reguladas por incremento en tumores, se consideró el grado de regulación por incremento adicionalmente si el límite inferior del intervalo plausible presentaba un valor mayor de 1. La anchura de estos intervalos plausibles depende de los datos disponibles para una proteína dada. Puesto que el número de péptidos observados y el número de espectros utilizados para cuantificar el cambio en la expresión para una proteína dada se toman en consideración, es posible detectar cambios pequeños pero significativos en la regulación por incremento o disminución cuando están disponibles muchos péptidos. Para cada proteína y cada péptido asociados con una proteína dada, se calcularon la media, la mediana e intervalos plausibles del 95% para cada uno de los efectos de tratamiento al nivel de proteína y péptido.

Los criterios de selección de péptidos para la cuantificación relativa se realizaron tal como sigue. Sólo se consideraron péptidos únicos para una proteína dada para la cuantificación relativa, excluyendo los comunes para otras isoformas o proteínas de la misma familia. Se identificaron proteínas basándose en que presentaran al menos un péptido con una puntuación iónica por encima de la confianza del 95%. Se estimó la cobertura de secuencia de proteína (95%) para proteínas específicas mediante el porcentaje de aminoácidos coincidentes a partir de los péptidos identificados que presentaban una confianza mayor o igual al 95% dividido entre el número total de aminoácidos en la secuencia.

1.8. Anotación funcional y análisis de red

Se extrajeron términos de ontología génica (GO) para las proteínas identificadas, y se determinaron categorías funcionales sobrerrepresentadas para proteínas abundantes de manera diferencial mediante la herramienta GOMiner de alto rendimiento (National Cancer Institute, http://discover.nci.nih.gov.gate2.inist.fr/gominer/) (Zeeberg et al., 2005). Todas las proteínas que se sometieron al análisis de iQuantitator sirvieron como liga de antecedentes, y se utilizaron los términos de GO con al menos cinco proteínas para los cálculos estadísticos. Se calculó un valor de p para cada término por medio de la prueba exacta de Fisher unilateral, y se estimó la FDR mediante análisis de permutación utilizando 1000 conjuntos seleccionados aleatoriamente de proteínas muestreadas a partir de la lista de antecedentes. Se agruparon términos de GO estadísticamente significativos (FDR <25%) basándose en la correlación de proteínas asociadas para minimizar la posible redundancia en términos de GO significativos.

1.9. Análisis de inmunotransferencia de tipo Western de proteínas en TNBC

Se montaron tumores congelados en OCT y se cortaron con un criostato (Starlet 2212). Entonces se lisaron secciones de 12 |im en tampón FASP (SDS al 4%, Tris 0.1 M) durante 90 min a 95°C, se sonicaron 3 veces y se centrifugaron 10 min a TA a 13200 rpm. Se evaluó la concentración de proteína utilizando el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo scientific, n.° 23225). Se realizó inmunotransferencia de tipo Western sobre lisados tumorales tal como se describió previamente (Besson et al., 2011). Brevemente, se cargaron 50 |ig de lisados tumorales en gel de poliacrilamida al 12% y luego se transfirieron sobre una membrana de PVDF. Tras bloquear con BSA al 5% en TBS (0.1 M, pH 7.4), se incubaron las inmunotransferencias con los respectivos anticuerpos primarios a 4°C durante la noche (trombospondina-1: Abcam Ab1823 1/500, proteína de choque térmico de 10 kDa: Abcam Ab108600 1/10000, triptofanil-ARNt sintetasa: Abcam Ab 92733 1/10000). Se utilizó la abundancia de proteína de Hsc70 como control para la carga de proteína y se determinó con anticuerpo de ratón anti-Hsc de Santa Cruz sc-7278 1/500 2 h a temperatura ambiente. Se incubaron las membranas con el anticuerpo secundario respectivo, anticuerpo de conejo anti-IgG conjugado con peroxidasa del rábano (anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-HRP sc-2004, 1:4000; Santa Cruz Biotechnology Inc.) o anticuerpo de ratón anti-IgG conjugado con peroxidasa del rábano (anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-HRP, sc-2005, 1:4000; Santa Cruz Biotechnology Inc.), durante 45 min a temperatura ambiente. Tras cada etapa, se lavaron las inmunotransferencias tres veces con Tween al 0.05%, TBS. Se exploró la membrana con los anticuerpos indicados y se reveló con el ECL en un sistema Chemidoc (Bio-Rad).

1.10. ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas)

Se utilizaron kits de ELISA disponibles comercialmente de USCN Life Science Inc. o R&D para someter a ensayo las concentraciones de decorina, asporina y trombospondina-1. Los kits consistían en placas de microtitulación de 96 pocillos recubiertas con anticuerpo específico para cada tipo de molécula, anticuerpos de detección para identificar el anticuerpo-proteína en la placa mediante marcaje con estreptavidina-biotina y sustrato TMB que generó producto coloreado. Se añadió la muestra y se realizó el ensayo según las instrucciones del fabricante. Se cuantificó la absorbancia del producto coloreado revelado al final del ensayo a una longitud de onda de 450 nm en el lector de ELISA (Tecan Magellan Sunrise). Las diluciones de los sueros se indican en la tabla 4 a continuación. 2.

Tabla 4

Proteínas Proveedor Referencia Dilución en suero DECORINA USCN Life Science Inc. E92127Hu 1/5 en PBS ASPORINA USCN Life Science Inc. E92321Hu 1/5 en PBS TROMBOSPONDINA-1 R&D Systems Quantikine DTSP10 1/100 en RD5-33 1X (suministrado por el fabricante)

2. Resultados

2.1. Identificación de proteínas expresadas: cobertura proteómica de 80 tumores de mama triples negativos

Utilizando los softwares Protein Pilot e iQuantitator, los inventores identificaron y cuantificaron un total de 2805 proteínas no redundantes con al menos 2 péptidos, según el flujo de trabajo esquemático del diseño experimental de la figura 1. Teniendo en consideración tanto los números de péptidos como de espectros, este enfoque permitió detectar cambios de expresión pequeños pero significativos, siempre que se detectaran varios péptidos (datos no mostrados). Utilizando este análisis, los inventores pudieron obtener una lista de proteínas cuantificadas a partir de los veinte experimentos de iTRAQ. Examinando estas proteínas con la función “enriquecimiento de función proteica” de Metacore (tabla 5A), los inventores caracterizaron entre todas las proteínas, 690 enzimas, 58 fosfatasas, 122 proteasas, 105 cinasas, 73 ligandos, 82 factores de transcripción y 83 receptores. Este análisis mostró que la mejor puntuación de enriquecimiento y valor de p se asignaron al proceso de GO “proceso metabólico” (tabla 5B) y a los mapas de rutas “remodelación del citoesqueleto” (tabla 5C).

Tabla 5A. Enriquecimiento mediante función proteica

Las columnas presentan los siguientes significados:

Clase de proteína: una función proteica ampliamente definida;

real: número de objetos de red a partir del/de los conjunto(s) de datos activado(s) para una clase de proteína dada;

n: número de objetos de red en el/los conjunto(s) de datos activado(s);

R: número de objetos de red de una clase de proteína dada en la lista de antecedentes o base de datos completa;

N: número total de objetos de red en la lista de antecedentes o base de datos completa;

esperado: valor medio para la distribución hipergeométrica (n*R/N);

razón: razón de conectividad (real/esperada);

puntuación z: puntuación z ((real-esperada)/sqrt(varianza));

valor de p: probabilidad de presentar el valor dado de real o superior (o inferior para puntuación z negativa); en conjunto de datos: fracción de objetos de red con una función seleccionada en el conjunto de datos activados;

en función proteica: fracción de red con una función seleccionada en el conjunto de datos activados entre; objetos de red con esta función en la lista de antecedentes o base de datos completa;

función proteica en base de datos: fracción de objetos de red con una función seleccionada en la lista de antecedentes o base de datos completa.

Tabla 5B. Mapas de rutas

Tabla 5C. Proceso de ontología génica (GO)

Entre estas 2805 proteínas, 219 proteínas cumplieron la definición de los inventores para expresión diferencial en una comparación entre tejidos tumorales y normales: 126 estaban sobreexpresadas y 93 estaban subexpresadas (tabla 6A). Los inventores sometieron las 219 proteínas identificadas que se expresaban de manera diferencial en tumores de mama triples negativos a análisis de Metacore y las clasificaron, inicialmente, según la función molecular y el proceso biológico. Cuando los inventores analizaron las proteínas desreguladas para determinar la función molecular, encontraron que la mejor puntuación de enriquecimiento y valor de p se asignaron a los términos de GO unión a proteína, actividad de receptor de CMH de clase I y actividad GTPasa (p= 2.0 10-13), que incluía 7 miembros de la familia de oncogén RAS (tabla 6B). Cuando los inventores agruparon las proteínas desreguladas basándose en procesos biológicos, encontraron que la mejor puntuación de términos de GO se obtuvo con organización del citoesqueleto (p= 9.2 10-16) (tabla 6C). Finalmente, cuando los inventores analizaron el enriquecimiento de función proteica de estas proteínas desreguladas, encontraron que la primera clase con la mejor puntuación z era “ligandos” con 14 proteínas, indicado posibles candidatos a biomarcador (tabla 6D). Tabla 6A. Proteínas subexpresadas y sobreexpresadas en cáncer de mama triple negativo

Tabla 6B. Función molecular de ontología génica (GO) - cáncer de mama triple negativo

Tabla 6C. Proceso de ontología génica (GO) - cáncer de mama triple negativo

Tabla 6D. Enriquecimiento mediante función proteica - cáncer de mama triple negativo

2.2. Una cobertura proteómica de los diferentes estados

Los inventores utilizaron el software iQuantitator para cuantificar la expresión de proteínas entre los diferentes estados de “recidiva” y “sin recidiva”. Para el grupo de “recidiva”, 295 estaban significativamente expresadas de manera diferencial: ¹⁶⁵estaban sobreexpresadas y ¹³⁰estaban subexpresadas (tabla 7A). e| análisis de Metacore de esta lista de proteínas indicó una remodelación del citoesqueleto con un valor de p = 9.2 10 para la red de procesos “Regulación de la redisposición del citoesqueleto” y una mejor puntuación de enriquecimiento y valor de p para “Unión” (p= 9.4 10'26) en el término de funciones moleculares de GO. Debe indicarse que se encontraron 26 ligandos en esta lista que caracterizaban al grupo de “Recidiva” (tabla 7D).

Tabla 7A. Proteínas subexpresadas y sobreexpresadas en recaída de cáncer de mama triple negativo

Tabla 7B. Función molecular de ontología génica (GO) - recaída de cáncer de mama triple negativo

Tabla 7C. Proceso de ontología génica (GO) - recaída de cáncer de mama triple negativo

Tabla 7D. Enriquecimiento mediante función proteica - recaída de cáncer de mama triple negativo

Para el grupo “sin recidiva”, 189 proteínas estaban significativamente expresadas de manera diferencial: 98 estaban sobreexpresadas y 91 estaban subexpresadas (tabla 8A). Para este grupo, la mejor puntuación para la red de procesos se obtuvo para “Adhesión celular_Adhesión a la matriz celular mediada por integrina” (p= 7.5 10-11) (tabla 8C). La clase de proteínas “ligandos” se encontró que presentaba la mejor puntuación z en el módulo “Enriquecimiento para función proteica” con 15 proteínas (tabla 8D).

Tabla 8A. Proteínas subexpresadas y sobreexpresadas en ausencia de recaída de cáncer de mama triple negativo

Tabla 8B. Función molecular de ontología génica (GO) - ausencia de recaída de cáncer de mama triple negativo

Tabla 8C. Proceso de ontología génica (GO) - ausencia de recaída de cáncer de mama triple negativo

Tabla 8D. Enriquecimiento mediante función proteica - ausencia de recaída de cáncer de mama tiple negativo

2.3. Clasificación basada en el estado de recidiva

Los inventores investigaron si podían detectar diferencias entre grupos con “recidiva” y “sin recidiva” en cuanto a los niveles de proteína en los tumores triples negativos mediante análisis de OPLS. Este análisis se realizó sobre 549 proteínas para las que estaba disponible información cuantitativa en todos los tumores. El modelo de OPLS, inicialmente basado en las 549 proteínas, se optimizó mediante la eliminación gradual de proteínas con valor de VIP pequeño (importancia variable en la proyección). Se realizó esto hasta que el modelo ya no se mejoraba tal como se determinó mediante el valor de p de CV-ANOVA, indicativo de la probabilidad de que el modelo sea el resultado de una posibilidad sola. El modelo de OPLS optimizado incluía 58 proteínas (p= 2.1 10"15) (figura 2). Entre estas proteínas, se asignaron 33 al grupo sin recaída y 26 al grupo con recaída. Se compararon estas proteínas con una base de datos que consistía en rutas de señalización de proteínas conocidas utilizando Metacore. Para el grupo “sin recidiva”, se encontraron 2 rutas significativas (p<0.05): Coagulación sanguínea (p= 4.4 10"6) y Quimiotaxis_Acción inhibidora de lipoxina sobre quimiotaxis de neutrófilos inducida por fMLP (p= 0.0003). El grupo con recidiva se caracterizó por tan sólo una ruta significativa: Remodelación del citoesqueleto_Filamentos de queratina (p= 7.9 10"7) (tabla 9).

Tabla 9

2.4. Firma proteómica de tumores de mama triples negativos del grupo con “recidiva”

Combinando listas de proteínas obtenidas a partir de análisis univariante (con iQuantitator) y multivariante (OPLS), se generaron dos listas de proteínas que caracterizaban a los grupos con “recidiva” (9 proteínas) y “sin recidiva” (5 proteínas) de tumores de mama triples negativos (tablas 10A y B). No es posible asignar una ruta significativa para el grupo “sin recidiva” con una FDR<0.05; por otro lado, se encontró la ruta Remodelación del citoesqueleto_Filamentos de queratina (p= 1.9 10-8) para el grupo con “Recidiva”, según los análisis previos para este grupo. Entre estas proteínas, se sabe que trombospondina-1 es un ligando secretado. Aunque la desmoplaquina es una proteína de la membrana plasmática, se ha descrito previamente como proteína detectable en el suero (López-Farré A.J. et al, 2012).

Tabla 10A. Proteínas que caracterizan la “ausencia de recidiva” para cáncer de mama triple negativo

Tabla 10B. Proteínas que caracterizan la “recidiva” para cáncer de mama triple negativo

2.5. Análisis de rutas de tumores individuales

También se realizó análisis de rutas sobre cada una de las 80 muestras tumorales por separado. Mediante esto, los inventores obtuvieron una huella de las rutas afectadas por cada tumor. Todas las proteínas con un nivel que difiere significativamente del nivel de proteína medio entre todos los tumores del “grupo con recidiva” o tumores del “grupo sin recidiva” se incluyeron en el análisis de tumores individuales; en total 1078 proteínas. Se mapearon las intensidades relativas de estas proteínas específicas de tumor en los mapas de rutas de la base de datos de Metacore. El análisis identificó las rutas que eran las más significativas en cada uno de los 80 conjuntos de datos de tumores individuales, medidas mediante la ruta exacta de Fisher. Los inventores utilizaron las clasificaciones de asociación como variables de entrada en el análisis multivariante para la comparación de muestras, basándose por tanto en el enriquecimiento de rutas. Para detectar alteraciones de rutas conectadas al riesgo de recidiva, los inventores realizaron un análisis de OLPLS sobre los datos de asociación de rutas. Se optimizó el modelo de OPLS tal como se describió en el análisis de grupos. Los inventores realizaron una eliminación gradual de variables (es decir, rutas) con menos influencia sobre el rendimiento de separación del modelo hasta que el modelo ya no se mejoraba. La ruta más significativa para el “grupo sin recidiva” es Glicólisis. Las rutas mejor clasificadas en el grupo con recidiva fueron Remodelación del citoesqueleto_Filamentos de queratina y Uniones Gap.

2.6. Validación de la expresión de proteína desregulada

Para proceder con las primeras etapas en la validación del análisis de EM, los inventores confirmaron la expresión diferencial de dos proteínas desreguladas mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western utilizando muestras de la misma cohorte de tumor de mama triple negativo. Se seleccionaron las proteínas trombospondina-1 y triptofanil-ARNt sintetasa para la validación basándose en su significancia potencial en la tumorigénesis del cáncer de mama. Se encontró que la expresión de trombospondina-1 estaba elevada en tumores de mama primarios del grupo “con recaída” en comparación con los tumores del grupo “sin recaída”. A la inversa, se encontró que triptofanil-ARNt sintetasa estaba elevada en el grupo “sin recidiva” en comparación con el grupo “con recidiva” (figura 3).

2.7. Valor de pronóstico de los marcadores

Se evaluó el valor de pronóstico de los marcadores a través de la estimación de la supervivencia global (OS) utilizando el método de Kaplan-Meier. Se dividieron los pacientes en dos categorías basándose en la mediana de los datos de expresión de iTraq para cada marcador: expresión alta frente a baja.

Para el grupo “sin recidiva”, el tumor de pacientes con altos niveles de expresión de triptofanil-ARNt sintetasa (WARS), proteína de choque térmico de 10 kDa (HSPE1), proteína 1 que contiene dominio SAM y dominio HD (SAMHD1) y hexocinasa-1 (HK1) experimentó una DFS (supervivencia libre de enfermedad) significativamente mejor en comparación con los de baja expresión (p= 0.0017, p=0.0042, p= 0.0073, p= 0.0124 respectivamente), y a la inversa, el tumor de pacientes con bajos niveles de expresión de región de cadena C de Ig gamma-1 (IGHG1) mostró una DFS significativamente mejor en comparación los de alta expresión (p= 0.0339), de acuerdo con los resultados de iTraq (figura 4). Además, tumores con alta expresión de triptofanil-ARNt sintetasa (WARS) (p=0.0026), proteína de choque térmico de 10 kDa (HSPE1) (p=0.0067) y región de cadena C de Ig gamma-1 (IGHGI) (p=0.031) también estaban asociados con tasas de OS (supervivencia global) superiores (figura 5).

Para el grupo “con recidiva”, los tumores de pacientes con altos niveles de expresión de cualquiera de las 9 proteínas experimentaron una DFS significativamente peor en comparación con los de baja expresión (p<0.0001, p=0.0001, p= 0.0005, p<0.0001, p=0.021, p=0.0051, p=0.020, p=0.0457 y p=0.031) para desmoplaquina (DSP), trombospondina-1 (THBS1), glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa (G6PD), isocitrato deshidrogenasa [NADP] (IDH2), queratina de tipo I del citoesqueleto 19 (KRT19), queratina de tipo II del citoesqueleto 8 (KRT8), epiplaquina (EPPK1), proteína 1 activante de Rho GTPasa (ARHGAP1) y proteína 3 relacionada con dihidropirimidinasa (DPYSL3), respectivamente (figura 6). Además, tumores con alta expresión de desmoplaquina (DSP) (p= 0.001), trombospondina-1 (THSB1) (p= 0.0001), glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa (G6PD) (p=0.0014) e isocitrato deshidrogenasa [NADP] (IDh 2) (p=0.0005) estaban también asociados con menores tasas de OS (figura 7). Por consiguiente, las respectivas razones de riesgo para la progresión de la enfermedad o muerte eran también significativamente mayores para pacientes cuyos tumores presentaban alta expresión de estas proteínas. Específicamente, elevados trombospondina-1 (THSB1) (HR= 3.91 - HR: razón de tasa de riesgo), desmoplaquina (DSP) (HR=4.36), glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa (G6PD) (HR=4.18), isocitrato deshidrogenasa [n A d P] (IDH2) (Hr =4.42), queratina de tipo I del citoesqueleto 19 (KRT19) (HR=2.97), queratina de tipo II del citoesqueleto 8 (KRT8) (HR=2.70), epiplaquina (EPPK1) (Hr =2.47), proteína 1 activante de Rho GTPasa (ARHGAP1) (HR=5.06) o proteína 3 relacionada con dihidropirimidinasa (DpYSL3) (HR=2.98) estaban asociados con un riesgo aumentado de progresión de la enfermedad. Se observaron asociaciones similares para un riesgo aumentado de muerte para trombospondina-1 (THSB1) (HR= 4.30), desmoplaquina (DSP) (HR=3.67), glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa (G6PD) (HR=3.90), isocitrato deshidrogenasa [nA d P] (IDH2) (HR=3.32) o queratina de tipo II del citoesqueleto 8 (KRT8) (HR= 2.50). En oposición, las razones de riesgo para el grupo sin recaída fueron significativamente mayores para pacientes cuyos tumores presentaban alta expresión de triptofanil-ARNt sintetasa (WARS), proteína de choque térmico de 10 kDa (HSPE1), proteína 1 que contiene dominio SAM y dominio HD (SAMHD1), hexocinasa-1 (HK1) y una baja expresión de región de cadena C de Ig gamma-1 (IGHG1). Específicamente, elevados triptofanil-ARNt sintetasa (WARS) (HR= 3.12) y proteína de choque térmico de 10 kDa (HSPE1) (3.67) estaban asociados con un riesgo débil de progresión de la enfermedad o muerte.

La figura 8 resume las curvas de Kaplan-Meier para tres proteínas secretadas: desmoplaquina (DSP), THSB1 y región de cadena C de Ig gamma-1 (IGHG1).

2.8. Validación preliminar en muestras de suero derivadas de pacientes

Los inventores cuestionaron entonces si cualquiera de estas proteínas secretadas podía medirse en el suero de pacientes con TNBC, notablemente en pacientes con recidiva de TNBC.

La determinación de la cantidad de desmoplaquina en el suero de la cohorte de TNBC correspondiente a los tumores triples negativos estudiados en este artículo mostró que la desmoplaquina está más concentrada en el grupo “con recidiva” (p=0.01) que en el grupo “sin recidiva”, según los resultados proteómicos dados a conocer en la presente memoria (figura 9).

Puesto que estaban disponibles muy pocas muestras de suero en esta cohorte, los inventores extendieron la determinación de la expresión de desmoplaquina en una cohorte de suero de TNBC más nueva. Basándose en este nueva cohorte, los inventores demostraron una cantidad significativamente sobreexpresada de desmoplaquina en sueros de TNBC en comparación con controles sanos (p=0.0008).

3. Discusión

A pesar de los muchos avances recientes en tratamientos de tumores de mama a través de terapias dirigidas, no existe ningún tratamiento específico para tumores de mama triples negativos y no hay ningún marcador molecular de pronóstico que prediga si un tumor se comportará agresivamente o permanecerá indolente. Está muy claro que la biología del tumor desempeña un papel significativo en el comportamiento del tumor resultante. Desafortunadamente, los tumores primarios de mama triples negativos que se colocan en la misma categoría de pronóstico basándose en parámetros utilizados actualmente pueden comportarse de manera diferente. La hipótesis de los inventores es que la biología subyacente de estos tumores y las diferencias en su detalle determinarán el potencial de agresividad de un tumor particular. Además, estas diferencias biológicas pueden utilizarse para identificar marcadores moleculares nuevos que pueden ser útiles para propósitos de diagnóstico, pronóstico o predictivos, cuyo éxito allanaría el camino para una nueva era de medicina personalizada en cáncer de mama.

En este estudio, los inventores realizaron una obtención del perfil proteómico cuantitativo de 80 tumores de mama triples negativos para identificar, en primer lugar, la expresión de proteína diferencial entre tumores de mama triples negativos y tejidos normales y, en segundo lugar, identificar posibles marcadores de pronóstico de recaída. Según lo que conocen los inventores, este estudio representa el análisis proteómico más grande de tumores de mama triples negativos jamás realizado.

A partir de todos los tumores de mama triples negativos, se identificaron 219 proteínas con expresión diferencial significativa en tumores en comparación con tejidos normales. Entre estas proteínas, se había notificado previamente que 58 proteínas estaban implicadas en tumores de mama.

Otro objetivo de este estudio era identificar la expresión de proteína diferencial entre el grupo de pacientes sin recidiva y el grupo de pacientes con recidiva. Los inventores caracterizaron 5 proteínas asociadas con el grupo sin recidiva grupo (es decir, hexocinasa-1, proteína de choque térmico de 10 kDa, región de cadena C de Ig gamma-1, proteína 1 que contiene dominio SAM y dominio HD y triptofanil-ARNt sintetasa) y 9 proteínas asociadas con el grupo con recidiva (es decir, desmoplaquina, proteína 1 activante de Rho GTPasa, epiplaquina, glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa [NADP], queratina de tipo I del citoesqueleto 19, queratina de tipo I del citoesqueleto 8, proteína 3 relacionada con dihidropirimidinasa y trombospondina-1). Se propone por tanto en la presente memoria que el grupo de proteínas anterior es una firma de proteínas del grupo sin recidiva y grupo con recidiva de tumores de mama triples negativos, respectivamente.

Entre estas proteínas, se mostró que la desmoplaquina podía detectarse fácilmente en el suero de pacientes, y también se expresada de manera diferencial en el grupo “con recidiva” en comparación con el grupo “sin recidiva”. Tal como se mencionó previamente, esta proteína es un componente clave de desmosomas, y pertenece a la ruta Remodelación del citoesqueleto_Filamentos de queratina y Uniones Gap encontrada en el análisis de Metacore, lo que está de acuerdo con el hecho de que esta ruta es la ruta mejor clasificada que caracteriza al grupo “con recidiva” en el enfoque proteómico. Al expandir los ensayos en una cohorte más grande de sueros de pacientes con cáncer de mama, los inventores demostraron que esta proteína está sobreexpresada de manera diferencial en sueros de TNBC en comparación con controles sanos.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Método in vitro para diagnosticar y/o pronosticar la recaída o ausencia de recaída de cáncer de mama triple negativo (TNBC) en un sujeto, que comprende las etapas de:

a) determinar a partir de una muestra biológica de un sujeto el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en desmoplaquina, proteína 1 activante de Rho GTPasa, epiplaquina, glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa [NADP], queratina de tipo I del citoesqueleto 19, queratina de tipo I del citoesqueleto 8, proteína 3 relacionada con dihidropirimidinasa y trombospondina-1, en el que uno de dichos dos biomarcadores es desmoplaquina; y

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho nivel de expresión de dichos al menos dos biomarcadores superior a dicho nivel de expresión de referencia obtenido a partir de una muestra biológica de al menos un sujeto sano, es indicativo de que dicho sujeto padece una recaída de cáncer de mama triple negativo, y/o es indicativo de un desenlace clínico negativo.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además en la etapa a) la etapa de determinar a partir de dicha muestra el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en hexocinasa-1, proteína de choque térmico de 10 kDa, región de cadena C de Ig gamma-1, proteína 1 que contiene dominio SAM y dominio HD, y triptofanil-ARNt sintetasa.

4. Método según la reivindicación 3, en el que dicho nivel de expresión de dichos al menos dos biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en:

• hexocinasa-1, proteína de choque térmico de 10 kDa, proteína 1 que contiene dominio SAM y dominio HD, y triptofanil-ARNt sintetasa, superior a dicho nivel de expresión de referencia obtenido a partir de una muestra biológica de al menos un sujeto sano, y

• región de cadena C de Ig gamma-1, inferior a dicho nivel de expresión de referencia de dichos biomarcadores obtenidos a partir de una muestra biológica de al menos un sujeto sano,

es indicativo de que dicho sujeto no padece una recaída de cáncer de mama triple negativo (TNBC), y/o es indicativo de un desenlace clínico positivo.

5. Método in vitro para determinar un fenotipo de respuesta a fármaco o de ausencia de respuesta a fármaco en un sujeto que padece una recaída de cáncer de mama triple negativo, que comprende las etapas de:

a) determinar a partir de una muestra biológica de dicho sujeto el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores según la reivindicación 1, en el que uno de dichos dos biomarcadores es desmoplaquina;

c) determinar el fenotipo de respuesta a fármaco o ausencia de respuesta a fármaco a partir de dicha comparación.

6. Método según la reivindicación 5, que comprende además en la etapa a) la etapa de determinar a partir de dicha muestra biológica el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores según la reivindicación 3.

7. Método para diseñar o adaptar un régimen de tratamiento para un sujeto que padece una recaída de cáncer de mama triple negativo, que comprende las etapas de:

a) determinar a partir de una muestra biológica de dicho sujeto un fenotipo de respuesta o ausencia de respuesta a fármaco según el método según la reivindicación 5 ó 6; y

8. Método de examen para identificar un fármaco o una combinación de fármacos adecuados para tratar una recaída de cáncer de mama triple negativo, que comprende las etapas de:

b) determinar, a partir de dichas células o línea celular en contacto con dicho fármaco o combinación de fármacos, el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores según la reivindicación 1, en el que uno de dichos dos biomarcadores es desmoplaquina; y

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, linfa, líquido intersticial tumoral, saliva, moco, esputos, sudor, orina, células tumorales circulantes y biopsia tumoral.

10. Método según la reivindicación 9, en el que dicha biopsia tumoral es una biopsia de un tumor de mama o de una metástasis del mismo.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el nivel de expresión se determina mediante un método seleccionado del grupo que consiste en inmunotransferencia de tipo Western, inmunotransferencia, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), Immunospot ligado a enzimas (ELISPOT), radioinmunoensayo (RIA), inmunohistoquímica, inmunoprecipitación, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), microscopía, citometría de flujo, microcitometría, ensayo de unión de proteínas, ensayo de unión de ligandos, microalineamiento, electroforesis en gel de poliacrilamida tal como SDS-PAGE, resonancia de plasmón superficial (SPR), transferencia de energía por resonancia Forster (FRET), transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET), quimioluminiscencia, polarización fluorescente, fosforescencia, espectrometría de masas, obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI), y cualquier combinación de los mismos.

12. Utilización de un kit en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, comprendiendo dicho kit:

a) un reactivo que puede determinar específicamente el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores según la reivindicación 1, en el que uno de dichos dos biomarcadores es desmoplaquina; y

b) instrucciones para realizar dicho método.

13. Utilización de un kit según la reivindicación 12, comprendiendo dicho kit además:

c) un reactivo que puede determinar específicamente el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores según la reivindicación 3.

14. Utilización de un microalineamiento de proteínas en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, comprendiendo dicho microalineamiento de proteínas:

a) un reactivo que puede determinar específicamente el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores según la reivindicación 1, en el que uno de dichos dos biomarcadores es desmoplaquina.

15. Utilización de un microalineamiento de proteínas según la reivindicación 14, comprendiendo además dicho microalineamiento de proteínas:

b) un reactivo que puede determinar específicamente el nivel de expresión de al menos dos biomarcadores según la reivindicación 3.