KR101374667B1 - 혈소판 유래 성장 인자 수용체-알파를 발현하는 비-소 세포폐암 종양들의 동정 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PDGFRα가 발현되어 질병을 유발하는 이전에는 동정되지 않았던 포유류 NSCLC를 설명하고, PDGFRα가 발현되는 NSCLC 종양들의 서브셋에 속하는 포유류 NSCLC 종양을 동정하기 위한 방법과 PDGFRα-저해 치료제에 반응할 수 있는 NSCLC 종양을 동정하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 PDGFRα가 발현되는 포유류 NSCLC 종양의 진행을 저해하는 방법과, 한 화합물이 PDGFRα-발현 포유류 NSCLC 종양의 진행을 저해하는지를 결정하는 방법을 제공한다.

PDGFRα, NSCLC 종양, PDGFRα-저해 치료제

Description

혈소판 유래 성장 인자 수용체-알파를 발현하는 비-소 세포 폐암 종양들의 동정{IDENTIFICATION OF NON-SMALL CELL LUNG CARCINOMA (NSCLC) TUMORS EXPRESSING PDGFR-ALPHA}

본 발명은 일반적으로 암과 항체들, 및 암을 특성화하는 항체들의 용도와 관련이 있다.

많은 암들은 세포과정(cellular processes)의 비정상적인 조절, 또는 세포의 제어되지 않는 성장 및 증식을 이끄는 세포의 신호전달경로(cellular signaling pathways)에 있어서의 혼란(disruptions)으로 특성화된다. 이런 혼란들은 종종 인산화 상태, 따라서 특정한 신호전달 단백질들의 활성, 에서의 변화에 의해 야기된다. 이런 암들 사이에 비-소 세포 폐암(NSCLC)이 있다. NSCLC은 미국에서 암 사망의 주요 원인인데, 즉 모든 폐암의 약 87%가 이에 해당한다. 매년 미국에서 NSCLC의 151,000명의 새로운 케이스가 있는데, 그것은 매년 미국에서만 120,000명 이상의 환자들이 그 질병으로 사망할 것으로 평가된다. "Cancer Facts and Figures. 2003," American Cancer Society 참조. 세 개의 전혀 다른 특수형들을 포함하는 NSCLC는 종종 그것이 전이한(metastasized) 후에만 탐지되며, 따라서 진단 2년 안의 사망률이 75%이다.

대부분의 암들과 같이, NSCLC는 신호 전달 경로들에서의 결함들을 수반한다. 수용체 티로신 키나아제들(Receptor tyrosine kinases)(RTKs)은 이런 신호전달 경로들에서, 세포 외의 분자 신호들을 세포질(cytoplasm) 및/또는 세포핵으로 전달하는, 중추적인 역할을 수행한다. 그런 RTKs사이에는 상피 성장 인자(EGF), 인슐린, 프레이트렛-유도된(platelet-derived) 성장 인자(PDGF), 뉴로트로핀들(neurotrophins)(즉, NGF), 및 섬유모세포 성장 인자(FGF)와 같은 폴리펩타이드 성장 인자들에 대한 수용체들이 있다. 그런 RTKs의 인산화는 그것들의 시토플라즈믹 도메인 키나아제 기능(cytoplasmic domain kinase function)을 활성화시키며, 차례로 하향(downstream) 신호전달 분자들을 활성화시킨다. 그러므로, RTKs는 세포의 신호전달뿐 아니라 그런 RTKs 및 그것들의 기질들의 과-발현 및 활성화로부터의 결과인 종양발생의 주요한 중개자이다. 정상적인 및 비정상적인 신호전달에서의 그것들의 중추적인 역할 때문에, RTKs는 특정 형태의 암의 치료를 위한 잠재적인 약물표적으로서 관심이 증가하고 있는 주제이다. 예를 들면, HER2/neu의 저해물인 Herceptin®는 현재 유방암의 특정 서브셋에 대한 승인된 치료법이다. 둘 다 EGFR의 소-분자 저해제들인 Iressa^TM(ZD1839) 및 Tarceva^TM(OSI-774)은 NSCLC의 치료를 위해 승인되었다.

PDGF 및 그것의 수용체들(PDGFRs)은 정상적인 세포 성장 및 분화의 조절에 있어서 중요한 역할을 하는 RTKs의 패밀리(family)이다. PDGFRs는 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis), 종양형성(neoplasia), 조직 수선(tissue repair), 및 의료염증(inflammation)을 포함하는 다양한 병리학적 과정에 관여한다(예를 들어 Ross et al., Cell 46: 155-169(1986); Ross et al., Adv. Exp Med. Biol. 234: 9-21(1988) 참조). 두 개의 이성구조들(알파(α) 및 베타(β))로 구성된 PDGFRs은, PDGF에 결합하여 활성화되고, SH2 도메인-포함 작동체 분자들(SH2 domain-containing effector molecules)의 보충을 통해 세포의 반응들을 조정하는 별개의 또는 겹쳐지는 신호전달 캐스케이드(cascades)를 개시하는 막 단백질-티로신 키나아제들(membrane protein-tyrosine kinases)이다.

본질적으로 활성인 PDGFR의 발현은 세포의 변형을 이끌고(Gazit et al., Cell 39: 89-97(1984) 참조), 정상적인 세포들에서 PDGFR 활성은 그것의 하향 이펙터들의 계속적인 활성화를 방해하도록 타이트하게 조절되어야 한다고 제안한다. 예를 들면, PDGFRβ는 많은 수의 종양들에 있어서 과-발현된 것으로 알려져 있으며, PDGF 치료는 다양한 실험 시스템에 있어서 변형 및 악성 종양(malignant tumors)을 유발시킨다(Heldin et al., Physiol. Rev. 79(4): 1283-1316(1999) 참조). 그러므로 PDGF 수용체들의 과-발현 또는 본질적인 활성화가 특정 암 세포들의 시작 또는 종양 발생에 작용을 한다고 제안되었다. PDGFR가 만성 골수단구성 백혈병(CML)을 가진 환자들의 서브셋에서 전사 인자 TEL(Ide et al., PNAS 99(22): 14404-14409(2002) 참조)과의 융합에 의해 활성화된다고 보고되었다. PDGFR 활성화는 또한 글리오블라스토마(glioblastoma)와 같은 특정 고체 종양들의 성장과 연루되었 다(예를 들어 Vassbotn et al., J. Cell. Physiol. 158: 381-389(1994) 참조).

따라서, PDGFR 및 그것의 하향 경로의 저해는 약물 개발을 위해 관심이 증가하는 영역이 되었다. 소-분자 의약 글리벡®(STI-571; Imatinib mesylate)과 같은 PDGFR의 특정한 저해제들이 최근에 개발되었고 전립선 및 난소암들을 포함하는 특정 암들의 치료를 위한 임상실험 중에 있다. 그것은 글리벡®이 PDGFR의 활성화와 관련된 만성 골수증식성 질환들을 가진 환자들에서 지속적인 반응들을 유발한다는 것을 보여주었다(Apperley et al., N. Engl. J. Med 347(7): 481-7(2002) 참조). 그러나, PDGFR 발현이 CML 및 교모세포종(glioblastoma)과 같은 몇몇 암들의 진행과는 관련되는 반면에, 많은 다른 형태의 암들에서는 이런 관계가 만들어지지 않았다. 비슷하게, 비록 NSCLC의 진행 아래 있는 특정 신호전달 결함들이 동정되어졌더라도(EGFR 과-발현을 포함하여), 이런 질병을 가져오는 명확한 분자 메카니즘이 완벽하게 이해되지는 않는다.

한 연구는 진단된 인간 폐암 종양들의 거의 100%에서 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파(PDGFRα)의 외형상(apparent)의 발현을 보고했고, PDGFR 저해를 통해서 달성된 것으로 추측된 효과인 글리벡®에 의한 폐암 셀 라인(cell line), A549의 성장저해를 보고했다. (Zhang et al., Mol. Cancer 2(1): 1-10(2003) 참조). 그러나, 그 연구에 채용된 항체가 비-특이적이고, PDGFRα이외에 다양한 단백질들과 교차-반응한다는 것이 (현재의 발명자들에 의해) 후에 밝혀졌기 때문에, 그 보고는 확정된 것이 아니었다; 그러므로 어떤 단백질이 그 Zhang 연구에서 실제로 검출되어졌는지는 불분명하다. 게다가, PDGFRα는 그 연구에 채용된 A549 셀 라인에서 검 출될 수 없으며--글리벡®에 의한 이런 셀 라인의 성장 저해를 재현하는 것에 대한 현재 발명자들의 불가능성과 일치하는--Zhang의 연구에서 보고된 관찰이 잘못되었거나 또는 PDGFRα의 발현 및 저해 이외의 어떤 메카니즘에 의해 달성되었다는 추가적인 입증이 있다.

PDGFR 및 EGFR과 같은 RTKs에 대항하는 표적 치료법의 새로운 세대가 매우 특별하기 때문에, 이런 약들에 의한 표적이 되는 RTK에 의해 유도되고 있는 특정한 종양들을 동정하기 위한 지속적이고 피할 수 없는 요구가 있는데, 이는 그런 종양들이 저해제와 가장 쉽게 반응하기 때문이다. 암의 대부분의 유형이 다른 신호전달 경로들에 의해 유도되고 있는 종양들의 독특한 서브셋들을 가지고 있다는 것이 현재 넓게 받아들여진다. 예를 들면, 유방암의 두 가지의 전혀 다른 서브셋들이 존재하는 것으로 알려져 있으며, Her2/Neu 신호전달에 의해 유도된 하나 및 EGFR 신호전달에 의해 유도된 다른 것이 그것인데, 그러나 오로지 전자만이 Her2-표적 치료제 Herceptin®에 반응한다. RTK가 질병의 유도자로서 이미 동정된(및 표적이 된) 것들을 포함하는, 암의 대부분의 유형들은 사실 현재로서는 알려지지 않은 다른 RTKs 및 경로들에 의해 유도되고 있는 다수의 아류형들(subtypes)을 가질 것이라고 볼 수 있다. 실제로, 몇몇 고도의 특이적인 표적 치료법들(EGFR 및 PDGFR에 대항하는 것들을 포함하는)의 임상실험에서 추가적으로 관찰된 느린(modest) 반응 속도가 치료되고 있는 많은 암들이 사실 적절하게 표적 되지 않은 또 다른(alternative) RTKs 및 경로들에 의해 유도되는 서브그룹들(subgroups)을 포함할 수 있다는 증거이다.

따라서, RTKs를 포함하는 그것의 발현 및/또는 활성화가 사실 암의 특정한 유형(또는 그 암의 서브셋)을 유도하고 있는, 특정한 신호전달 분자들을 동정하기 위한 지속적이고 절박한 요구가 있다. 그런 신호전달 분자들의 동정은 환자들이 그들의 질병에 가장 효과적으로 대항할 수 있는 표적 치료법을 얻는 것을 확실하게 하도록 돕기 위한, 뿐 아니라 이런 암들의 치료를 위한 새로운 표적 약물들을 제공하기 위한 새롭고 개선된 진단학적 및/또는 전조가 되는 에세이(assays)의 발전을 가능케 할 것이다. NSCLC와 같은 어떤 암들은 종종 그 질병이 이미 전이된 후 까지 탐지되지 않아, 신속하고 효과적인 치료가 매우 중요하게 된다. 그러므로, 현재로는-표적이 되지 않은 RTKs 및 신호전달 경로들에 의해 유도되고 있는 암들의 서브그룹들을 동정하는 능력은 대안이 되는 보다 유용한 치료 전략들을 개발하는 데에 있어서, 및 그에 반응할 수 없는 환자들에게 무익한 치료법을 처방하는 것을 피하기 위해서 굉장히 도움이 될 수 있을 것이다.

본 발명의 따르면, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파(PDGFRα)가 발현되고, 질병을 유도하는 포유류 NSCLC 종양들의 이전에 알려지지 않은 서브셋이 이제는 동정되었다. PDGFRα가 발현되고, 질병을 유도하는 포유류 NSCLC 종양들을 동정하는 능력은 Imatinib mesylate(STI-571; 글리벡®)와 같은 PDGFRα의 저해제와 반응할 수 있는 NSCLC 종양들의 동정을 가능케 한다. 그러므로 본 발명은 PDGFRα가 발현되는 NSCLC 종양들의 서브셋에 속하는 포유류 NSCLC 종양을 동정하기 위한, 및 PDGFRα-저해 치료제와 반응할 수 있는 NSCLC 종양을 동정하기 위한 방법들을 제공한다. 본 발명은 또한 한 화합물이 NSCLC 종양 발현 PDGFRα의 진행을 저해하는지를 결정하기 위한, 및 PDGFRα의 활성을 저해함에 의해 PDGFRα가 발현되는 포유류 NSCLC 종양의 진행을 저해하기 위한 방법들을 제공한다.

본 발명에 따르면, PDGFRα가 발현되고 질병을 유도하고 있는 포유류 NSCLC 종양들의 이전에 알려지지 않은 서브셋이 최근에 동정되었다. EGFR 발현/활성화는 많은 NSCLC 종양들에서 발생하는 것으로 알려져 있고(Neal et al., supra.; Sainsbury et al., supra. 참조) 그 수용체가 현재는 NSCLC의 치료를 위한 치료법상의 표적이 된다. 그러나, 비록 PDGFR의 활성화가 예를 들어 전립선(prostrate) 암과 같은 특정 암들의 서브셋을 유도하는 것으로 알려져 있지만, NSCLC 종양들의 서브셋에서 PDGFRα 발현의 관계는 이전에 확정적으로 보고되지는 않았다.

이전의 연구(Zhang et al., supra.)는 진단된 인간 폐암 종양들의 거의 100%에서 PDGFRα의 명백한 발현을 보고했다. 이 연구는 또한 PDGFR에 대항하는 활성을 가진 소 분자 저해제인, 글리벡®(STI-571)이 폐암 셀 라인, A549의 진행을 저해할 수 있다는 것이 보고되었는데, 이는 상기 세포들에서 PDGFRα의 저해를 통해 달성된 것으로 저자들에 의해 추측된 효과였다. 그러나, 현재 나타난 것처럼(실시예 2 참조), 그 연구에 채용된 가능한 항체들은(Santa Cruz Biotechnology로부터 얻어진) PDGFRα에 대하여 특이적이지 않고 사실 다양한 다른 단백질들과 교차-반응한다. 따라서, 그 Zhang 연구에서 어떤 단백질(들)이 실제적으로 검출되었는지와 PDGFRα가 진단된 모든 세포들에서 발현되었는지는 불분명하다. 실제로, 현재 나타난 것처럼(실시예 2 참조), 그 Zhang 연구에 채용된 A549 셀 라인은 사실 검출할만큼의 PDGFRα를 발현하지 않는다. 이런 셀 라인에서 PDGFRα 발현의 부족은 글리벡이 사실 이런 셀 라인의 성장을 저해하지 않는다는 현재의 발견과 일치하며, 이는 Zhang 연구에서 보고된 관찰이 틀렸거나 또는 PDGFRα 저해 이외의 어떤 메카니즘에 의해 달성되었다는 추가적인 입증이 된다.

이런 암에 대한 상당한 치료학적 개발 움직임에도 불구하고, PDGFRα 발현과 NSCLC 종양들의 서브셋 사이의 관계가 지금까지 확정적으로 확립되지 않았기 때문에, 현재의 발견은 놀라운 것이다. PDGFRα가 발현된 NSCLC 종양들의 별개의 서브셋의 동정은 이런 주요한 질병의 관리와 치료를 위한 중요한 함축적 의미들을 가진다. NSCLC는 미국에서 암 사망의 주요한 원인이고, 종종 그것이 전이된 후에 까지도 진단하기가 어려워서, 이런 질병을 효율적으로 치료하거나 회복시키데 어려움이 증가하고 있다. 따라서 진단 2년 이내에 NSCLC의 사망률은 75%이다(Amercian Cancer Society, supra. 참조). 비록 표적 EGFR-저해제들이 현재 NSCLC의 치료를 위하여 승인되고 있지만, 이런 치료제는 PDGFRα(EGFR 보다는 또는 EGFR에 더하여)가 발현되고 그 질병을 유도하는 종양들을 가지는 환자들의 서브그룹의 전체 또는 일부분에 대하여 무익할 것이다.

NSCLC 종양들의 서브셋이 PDGFRα의 발현에 의해 유도되고 있다는 현재의 발견은 PDGFRα가 발현되고 있는 포유류 NSCLC 종양들을 정확하게 동정하기 위한 중요한 새로운 방법들을 가능케 하며, 따라서 이런 종양들은 Imatinib mesylate(STI-571; 글리벡®)와 같은 PDGFRα-저해 치료제들과 반응할 수 있다. 가능한 한 쉽게 그런 종양들을 동정하는 능력은 어떤 치료제 또는 치료제들의 조합이 특정한 NSCLC 종양에 가장 적합한지를 임상적으로 결정하는데 있어서 굉장한 도움이 될 것이며, 따라서 그것은 그런 저해제들이 부분적으로 또는 전체적으로 무익할 수 있는 경우(즉 하나의 표적이 된 것 이외의 수용체들이 종양에 있어서 그 질병을 전체적으로 또는 부분적으로 유도하고 있는 경우)들에 있어서 EGFR-저해제들의 처방을 피하는데 도움이 된다. 그러므로, 본 발명은 부분적으로 PDGFRα가 발현되는 NSCLC 종양들의 서브셋에 속하는 포유류 NSCLC 종양을 동정하기 위한 방법들을 제공한다. 그런 종양의 동정은 글리벡®과 같은 하나 또는 그 이상의 PDGFRα-저해 치료제들을 포함하는 조성물과 반응할 수 있는 종양을 동정하는 것이다.

본 발명은 또한, 그 화합물이 그런 NSCLC 종양에서 PDGFRα의 발현 또는 활성을 저해하는지를 결정함으로써, 한 화합물이 PDGFRα가 발현되는 NSCLC 종양들의 서브셋에 속하는 포유류 NSCLC 종양의 진행을 저해하는지를 결정하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 더 제공된 것은 PDGFRα의 발현 또는 활성을 저해함에 의해 PDGFRα가 발현된 포유류 NSCLC 종양의 진행을 저해하기 위한 방법이다.

본 발명의 추가적인 특징들, 이점들, 및 실시예들은 아래에 더 자세히 설명된다. 여기에 인용된 모든 참조문헌들은 그 결과 참조문헌으로 통합된다.

A. NSCLC 종양들의 PDGFR α-발현 서브셋 .

PDGFRα가 발현되고 그 질병이 유도되고 있는 인간 NSCLC 종양들의 별개의 서브셋은 놀랍게도 4개의 셀 라인들; A549, H441, H1373 및 H1703 셀 라인을 포함하는 알려진 인간 NSCLC 종양 셀 라인들로부터의 추출물들에서 글로벌 인산화 펩타이드 프로파일들(global phosphorylated peptide profiles)의 조사 과정에서 동정되었다. 실시예 1에서 더 설명되는 것처럼, 이런 셀 라인들의 인산화 프로파일들은 복합 혼합물들로부터 개질된 펩타이드들의 분리 및 질량 분석적 특성(mass spectrometric characterization)에 대한 최근의 설명된 기술을 이용하여 밝혀진다(U.S. Patent Publication No. 20030044848, Rush et al., "Immunoaffinity Isolation of Modified Peptides from Complex Mixtures"(the "IAP" technique) 참조). 포스포티로신-특이적 항체(CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly, Mass., 2003/04 Cat. #9411)를 사용하는 IAP 기술의 적용은, 종종 EGFR이 발현되었지만 PDGFRα가 결핍된 다른 셀 라인들과는 대조적으로, PDGFRα가 발현된 H1703 셀을 동정했다(표 1, 실시예 1는 오직 H1703 셀 라인에서만 관찰된 PDGFRα 포스포위치들(phosphosites)을 기록한다). 이런 새로운 발견은 이전에는 동정되지 않았던 PDGFRα이 발현된 NSCLC 종양들의 서브셋의 존재를 지적했고, 이런 종양들의 서브셋은 단지 EGFR 경로만을 임상적으로 표적으로 함에도 불구하고 생존할 수 있을 것이라는 점을 지적했다.

이런 초기의 발견은, 아래 실시에 3에서 더 설명된 것처럼, 이후에 304명의 다른 인간 NSCLC 환자들로부터의 종양 생검 조직 샘플들을 포함하는 조직 마이크로어레이(tissue microarray)의 면역조직화학염색법(IHC) 분석에 의해 확증되었다. 305 종양들 중 17개(또는 진단된 모든 종양들의 6%)가 PDGFRα-발현 서브셋에 속했으며, 그것은 NSCLC 종양들의 이런 서브셋의 출현이 드물다는 점을 지적한다(실시예 3에서 표 2 참조). PDGFRα-발현 NSCLC 종양들의 서브셋 중에 선암(adenocarcinomas) 및 기관지폐포암(bronchioloalveolar carcinomas)이 그 종양들의 76%(17개 중 11개)이며, PDGFRα-발현 NSCLC 종양들은 남성에서 보다 여성에서(65%, 17개 중 11개) 더 자주 발생한다.

여기서 PDGFRα-발현 NSCLC 종양들의 낮은 빈도(진단된 큰 환자 샘플 인구에서)는 작은(33개 샘플) 환자 인구를 사용한 Zhang et al., supra.에서 보고된 거의 100%의 빈도와 완전히 대조됨을 설명했다. 이런 대조는 Zhang에서의 보다 이른 보고가 잘못되었거나, 실제로 PDGFRα-특이성이 없는 다수의 다른 단백질들과 결합하는 항체의 사용으로부터 얻어진 결과였음을 나타낸다(아래 실시예 2 참조). 실제로, 현재 나타난 것처럼(실시예 2 참조), Zhang 연구에 이용된 A549 NSCLC 셀 라인은 PDGFRα을 동정할 수 있을 만큼 발현하지 않고, 이 셀 라인의 성장은 PDGFRα-저해 화합물, 글리벡®(STI-571)에 의해 저해되지 않는다. 도 10 참조.

PDGFR 활성화 및 하향 신호전달의 저해는 이후 H1703 셀 라인에서 증명되었다(도 9 참조). 같은 도면에서, 결과는 이런 세포들에서 지속적인 세포의 신호전달이 Iressa^TM 또는 EGFR 저해에 의해 영향받지 않는다는 것을 나타낸다. 이런 결과들은 글리벡® 치료가 PDGFRα에 의해 유도된 종양들에서 종양 성장을 저해할 수 있음을 제안한다. 이런 가설이 H1703 셀 라인으로부터 유도된 쥐 이종이식들을 사용하여 실험되었다. 실제로, 생체 내에서 PDGFRα 활성의 저해는 도 9 및 10에서 나타난 것처럼 PDGFRα-발현 인간 NSCLC 종양들(H1703)를 품고 있는 쥐 이종이식들을 PDGFRα의 소 분자 표적 저해제, 글리벡®(STI-571)로 처리함에 의해 나타났다.

PDGFRα이 발현되고 그 질병을 유도하고 있는(전체적으로 또는 부분적으로) NSCLC 종양들의 서브셋에 속하는 NSCLC 종양들을 선택적으로 동정하는 능력은 진단학적 목적으로 그런 종양들을 정확히 동정하기 위한 중요한 새로운 방법들, 뿐 아니라 그런 종양이 PDGFRα-저해 치료제 조성물에 쉽게 반응하는지, 또는 NSCLC의 치료를 위한 단일 약제로서 처리될 때 EGFR 저해제에 부분적으로 또는 전체적으로 무-반응할 수 있는지를 결정하는데 있어서 유용한 정보를 얻기 위한 중요한 새로운 방법들을 가능케 한다.

따라서, 일실시예에서, 본 발명은 PDGFRα이 발현된 NSCLC 종양들의 서브셋에 속하는 포유류 NSCLC 종양을 동정하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 적어도 하나의 PDGFRα-특이적 시약을 사용하여 PDGFRα가 NSCLC 종양으로부터의 세포들을 포함하는 생물학적 샘플에서 발현되는지를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 생물학적 샘플에서의 PDGFRα의 발현은 PDGFRα이 발현된 NSCLC 종양들의 서브셋에 속하는 상기 NSCLC 종양을 식별한다.

본 발명의 실시에 유용한 생물학적 샘플들은 아래 섹션 B에서 더 자세하게 설명된다. 바람직한 일실시예에서, 포유류 NSCLC 종양은 인간 종양인 반면, 다른 바람직한 실시예들에서 포유류는 개, 고양이, 또는 말이다. 다른 바람직한 실시예들에서, 그 생물학적 샘플은 종양 생검, 종양 미세 침 흡인물, 또는 흉막 삼출로부터 얻어진 세포들(또는 세포들의 라이세이트)을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시예에서, PDGFRα이 발현되는 NSCLC 종양들의 서브셋에 속하는 NSCLC 종양을 동정하는 것은 적어도 PDGFRα-저해 치료제를 포함하는 조성물에 쉽게 반응하는 NSCLC 종양을 식별하는 것이다. 본 발명의 실시에 유용한 PDGFRα-저해 치료제들은 아래 섹션 F에서 더 자세히 설명된다. 바람직한 일실시예에서, PDGFRα-저해 치료제는 PDGFRα의 소 분자 저해제를 포함한다. 다른 바람직한 실시예들에서, PDGFRα의 소 분자 저해제는 Imatinib mesylate(STI-571; 글리벡®) 또는 그것의 유사체들인 반면, 또 다른 바람직한 실시예에서, PDGFRα의 소 분자 저해제는 BAY 43-93006, XL-999 및 SU11248로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 방법들의 실시에 유용한 PDGFRα-특이적 시약들은 아래 섹션 C에서 더 자세히 설명된다. 바람직한 일실시예에서, PDGFRα-특이적 시약은 PDGFRα-특이적 항체를 포함한다. 바람직한 일실시예에서, 그런 항체는 인산화 부위-특이적 항체일 수 있다. 또 다른 바람직한 실시예에서, PDGFRα-특이적 시약은 PDGFRα 펩타이드 서열(PDGFRα안에 있는 인산화 부위와 일치할 수 있는)에 상응하는 무거운 동위원소 표지된 포스포펩타이드(heavy-isotope labeled phosphopeptide)(AQUA 펩타이드)를 포함한다.

상기 설명된 본 발명의 방법은 또한 상기 생물학적 샘플에서 활성화되거나 발현된 EGFR의 수준을 결정하는 단계를 선택적으로 포함할 수 있다. 주어진 NSCLC 종양에서 PDGFRα 발현/활성화 및 EGFR 발현/활성화 둘 다를 프로파일링 하는 것은 어느 경로, 또는 경로들이 그 질병을 유도하고, 따라서 어느 치료 체제(regime)가 가장 유익할 것인지에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있다.

PDGFRα가 활성화되는 NSCLC 종양들의 서브셋에 속하는 포유류 NSCLC 종양을 동정하는 능력은 환자의 종양이 특정한 치료제(예를 들면, EGFR 저해제 또는 PDGFRα 저해제)에 반응할 수 있는지를 평가하는데 있어서 가치있는 임상학적 정보를 제공할 수 있다. 따라서, 상기 설명된 방법의 바람직한 일실시예에서, PDGFRα가 활성화되는 NSCLC 종양들의 서브셋에 속하는 NSCLC 종양을 동정하는 것은 적어도 하나의 PDGFRα-저해 치료제를 포함하는 조성물에 반응할 수 있는 종양을 식별하는 것이다. 본 발명의 방법들의 실시에 유용한 PDGFRα-저해 치료제들은 아래 섹션 E에서 더 자세히 설명된다.

본 발명의 방법들의 실시에 유용한 항체들 및 AQUA 펩타이드들을 포함하는 PDGFRα-특이적 시약들은 아래 섹션 C에서 더 자세히 설명된다. 바람직한 일실시예에서, PDGFRα-특이적 시약은 항체인데, 바람직한 일실시예에서 그 항체는 단지 인산화될 때만 특이적으로 PDGFRα에 결합하는 인산화 부위-특이적 항체이다. 또 다른 바람직한 실시예에서, PDGFRα-특이적 시약은 PDGFRα 펩타이드 서열에 상응하는 무거운 동위원소 표지된 포스포펩타이드(AQUA 펩타이드)이다.

PDGFRα이 발현되고 그 질병을 유도하는(전체적으로 또는 부분적으로) 포유류 NSCLC 종양들의 새롭게 동정된 별개의 서브셋은--단지 EGFR이 활성화되고 암을 유도하는 종양들의 서브셋과는 대조적으로--또한 NSCLC의 치료를 위한 중요한 함축적 의미를 가진다. PDGFRα가 질병을 유도하고 있는 서브셋에 속하는 NSCLC 종양들의 진행은 PDGFRα의 발현 및/또는 활성을 저해함(종양들의 서브셋에 대항하여 전체적으로 또는 부분적으로 무익할 수 있는, 단지 EGFR만을 표적으로 하는 것과는 대조적으로)에 의해 저해되거나 멈춰질 것이다.

따라서, 본 발명은 또한 부분적으로 PDGFRα이 발현된 NSCLC 종양들의 서브셋에 속하는 포유류 NSCLC 종양의 진행을 저해하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 NSCLC 종양에서 PDGFRα의 활성 및/또는 발현을 저해하는 단계를 포함한다. 바람직한 일실시예에서, PDGFRα의 활성은 그 종양을 적어도 하나의 PDGFRα-저해 치료제를 포함하는 조성물과 함께 접촉시킴에 의해 저해된다. 본 발명의 방법의 실시에 적합한 조성물들과 PDGFRα-저해 화합물들은 아래 섹션 E에 더 자세히 설명된다. 바람직한 일실시예에서, PDGFRα-저해 치료제는 PDGFRα의 소 분자 저해제를 포함하고, 어떤 바람직한 실시예들에서, PDGFRα의 소 분자 저해제는 Imatinib mesylate(STI-571, 글리벡®) 또는 그것의 유사체들이다. 다른 바람직한 실시예들에서, PDGFRα의 소 분자 저해제는 BAY43-9006, XL-999 및 SUl 11248로 구성된 군으로부터 선택된다. NSCLC 종양은 표준 복용 및 처리 조사(administration approaches)에 따라, 치료학적으로 유효한 양의 PDGFRα-저해 치료제에 접촉될 것이다.

본 발명은 또한, 부분적으로, 한 화합물이 PDGFRα이 발현되는 NSCLC 종양들의 서브셋에 속하는 포유류 NSCLC 종양의 진행을 저해하는지를 결정하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 그 화합물이 상기 NSCLC 종양에서 PDGFRα의 발현 및/또는 활성을 저해하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 바람직한 일실시예에서, PDGFRα의 활성의 저해는 상기 NSCLC 종양으로부터의 세포들을 포함하는 생물학적 샘플을 조사함으로써 결정된다. 또 다른 바람직한 실시예에서, PDGFRα의 활성의 저해는 적어도 하나의 PDGFRα 활성화 상태-특이적 시약을 사용하여 결정되며, 바람직한 일실시예에서, 그 활성화 상태-특이적 시약은 인산화-부위 특이적 항체이다. 예를 들면, 그 화합물은 소 분자 또는 항체 저해제와 같은 키나아제 저해제(kinase inhibitor)일 수 있다. PDGFRα-저해 화합물들은 아래 섹션 E에서 더 자세히 논의된다. 환자의 생물학적 샘플들은 저해제로 처리하기 이전 및 이후에 취해질 수 있고, 이후에 아래 섹션 D에 설명된 방법들을 사용하여 PDGFRα 인산화 또는 하향 단백질들의 인산화에 대한 저해제의 생물학적 효과에 대하여 분석될 수 있다. 그런 약효학적 에세이(pharmacodynamic assay)는 그 약제의 최대허용용량(maximal tolerable dose)보다 생물학적으로 활성이 더 좋을 수 있는 복용량을 결정하는데 유용할 것이다. 그런 정보는 또한 의약 행동 메카니즘을 설명함으로써 의약 승인에 대한 서브미션(submissions)에 유용할 수 있다.

정의

본 명세서를 통하여 사용된, 다음 용어들은 나타낸 의미들을 가진다:

"NSCLC 종양으로부터의 세포들"은 NSCLC 종양 또는 종양(neoplasm)으로부터의 전체 세포들 또는 세포들의 추출물들을 의미한다. 생물학적 샘플에서 PDGFRα에 대하여 "발현" 또는 "발현된"은 PDGFRα이 상당한 정도로 발현되지 않은 대조군 샘플에 대비될 만큼 상당히 발현된 것을 의미한다. "PDGFRα-특이적 시약"은 생물학적 샘플에서 특이적으로 PDGFRα와 반응, 결합, PDGFRα을 검출, 및/또는 정량할 수 있는, 화학적 또는 생물학적인 임의의 검출 가능한 시약을 의미하며, 그것은 PDGFRα에 대한 시약의 반응성에 대비될 만큼, PDGFRβ 또는 다른 RTKs 또는 키나아제들과 실질적으로 반응하지 않는다.

"PDGFRα-저해 치료제"는 생체 내에서 PDGFRα의 발현 및/또는 활성을, 직접적으로 또는 간접적으로, 저해하는 화학적 또는 생물학적인 하나 또는 그 이상의 화합물들을 포함하는 임의의 조성물을 의미한다.

B. 생물학적 샘플들

본 발명의 방법들의 실시에 유용한 생물학적 샘플들은 NSCLC 종양이 존재하거나 발달하고 있는 임의의 포유류로부터 얻어질 수 있다. 일실시예에서, 그 포유류는 인간이며, 그 인간은 NSCLC의 치료를 위한 PDGFRα-저해 치료제에 대한 후보자일 수 있다. 그 인간 후보자는 Tarceva^TM 또는 Iressa^TM과 같은 EGFR 저해제로 현재 처리되고 있는, 또는 처리가 고려되고 있는 환자일 것이다. 또 다른 실시예에서, 그 포유류는 말 또는 소와 같은 대형 동물인 반면, 다른 실시예들에서, 그 포유류는 개 또는 고양이와 같은, 그것들의 모두가 NSCLC를 발달시키는 것으로 알려진 소형 동물이다.

포유류 NSCLC 종양으로부터의 세포들(또는 세포들의 추출물들)을 포함하는 임의의 생물학적 샘플은 본 발명의 방법들에 이용하기에 적합하다. 일실시예에서, 그 생물학적 샘플은 종양 생검으로부터 얻어진 세포들을 포함한다. 그 생검은 포유류의 폐에서 발생하는 초기의 NSCLC 종양들로부터 표준 임상 기술에 따라 얻어질 수 있으며, 또는 다른 조직들에 전이된 이차적인 NSCLC 종양들에 의해 얻어질 수 있다. 또 다른 실시예에서, 그 생물학적 샘플은 NSCLC 종양으로부터 취해진 미세 침 흡인물로부터 얻어진 세포들을 포함하며, 그런 흡인물들을 얻기 위한 기술들은 당업계에 잘 알려져 있다(Cristallini et al., Acta Cytol. 36(3): 416-22(1992) 참조).

또 다른 바람직한 실시예에서, 그 생물학적 샘플은 NSCLC 흉막 삼출로부터 얻어진 세포들을 포함한다. 흉막 삼출들(흉강 내에서 폐 바깥쪽을 형성하며 암에 걸린 세포들을 포함하는 액체)은 진행된 NSCLC를 갖는 많은 환자들에서 형성되는 것이 알려져 있고, 그런 삼출의 존재는 나쁜 예후(poor outcome) 및 짧은 생존 시간의 전조가 된다. Mott et al., Chest 119: 317-318(2001) 참조. 그러므로 효과적이고 신속한 치료는 그런 경우들에서 특히 중요하다. 흉막 삼출 샘플들을 얻기 위한 표준 기술들은 당업계에 설명되었고 잘 알려져 있다(Sahn Clin Chest Med. 3(2): 443-52(1982) 참조). 순환하는 NSCLC 세포들은 또한 종양 표지들, 시토케라틴 단백질 표지들(cytokeratin protein markers) 또는 설명된 것과 같은 부정 선택(negative selection)의 다른 방법들을 사용하여 혈청(serum)으로부터 얻어질 수 있다(Ma et al. Anti암 Res. 23(1A): 49-62(2003) 참조).

생물학적 샘플은 PDGFRα이 발현되고 활성화되나 EGFR은 그렇지 않은, NSCLC 종양으로부터의 세포들을 포함할 수 있다. 그 대신에, 그 샘플은 PDGFRα 및 EGFRα 둘 다 발현되고 활성화되는, 또는 EGFRα는 발현되고 활성화되나 PDGFRα는 그렇지 않은 NSCLC 종양으로부터의 세포들을 포함할 수 있다.

상기 생물학적 샘플들의 세포 추출물들은 표준 기술들에 따라, 가공하지 않은 채로 또는 부분적으로(또는 전체적으로) 정제되어 준비될 수 있으며, 본 발명의 방법들이 사용될 수 있다. 그 대신에, 전체 세포들을 포함하는 생물학적 샘플들은, 아래 섹션 D에 더 설명되는 것처럼, 면역조직화학염색법(IHC), 유세포 분석법(FC), 및 면역형광법(IF)과 같은 바람직한 에세이 포맷들에 이용될 수 있다. 그런 전체-세포 에세이들은 그것들이 종양 세포 샘플의 조작을 최소화하고 따라서 생체 내에서 세포들의 신호전달/활성화 상태의 변화 및/또는 인공 신호들(artifact signals)의 도입의 위험들을 감소시키는 점에서 유리하다. 전체 세포 에세이들은 그것들이 종양과 정상 세포들의 혼합물보다는 단지 종양 세포들에서만 발현과 신호전달을 특성화하기 때문에 또한 유리하다.

한 화합물이 PDGFRα이 발현되는 NSCLC 종양의 진행을 저해하는지를 결정하는 설명된 방법의 실시에 있어서, 포유류 이종이식들부터의 세포들을 포함하는 생물학적 샘플들이 또한 유리하게 채용될 수 있다. 바람직한 이종이식들은 PDGFRα를 발현하는 인간 NSCLC 종양들을 품고 있는 쥐들과 같은 작은 포유류들이다. 인간 NSCLC 종양들을 품고 있는 이종이식들이 당업계에 잘 알려져 있고(Kal, Cancer Treat Res. 72: 155-69(1995) 참조) 인간 종양들을 품고 있는 포유류 이종이식들의 생산이 잘 설명되어 있다(Winograd et al., In Vivo. 1(1): 1-13(1987) 참조)

포유류 NSCLC 종양으로부터의 세포들을 포함하는 생물학적 샘플에서 PDGFRα 발현을 평가함에 있어서, 생체 내에서 PDGFRα의 활성화 배경을 나타내는 대조군 샘플(control sample)은 비교 목적들을 위해 바람직하게 채용될 것이다. 이상적으로, 그 대조군 샘플은 PDGFRα이 발현되지 않은 NSCLC 종양들의 서브셋을 대표하는 NSCLC 종양으로부터의 세포들을 포함한다. 그러므로 대조군 샘플 대 테스트 생물학적 샘플에서 발현된 PDGFRα의 수준의 비교는 PDGFRα이 발현되는지를 동정한다. 그 대신에, PDGFRα가 대부분의 NSCLC 종양들(종양들의 현재 설명된 서브셋에 속하지 않는)에서 발현되지 않기 때문에, 비슷하게 PDGFRα를 발현하지 않는 임의의 조직이 대조군으로서 채용될 수 있다.

상기 설명된 방법들은 포유류 NSCLC 종양들 및 똑같은 것에 관련된 치료 결정에 대한 가치 있는 진단학적 효용을 가질 것이다. 예를 들면, 생물학적 샘플들은 NSCLC을 가지는 것으로 이전에 진단되지 않았고, 그런 암에 대한 치료를 아직 겪지 않았던 서브젝트(subject)로부터 얻어질 수 있으며, 그 방법은 PDGFRα이 발현되는 NSCLC 종양들의 서브셋에 속하는 그런 서브젝트에서 NSCLC 종양을 진단학적으로 동정하기 위해 채용된다. 그 대신에, 생물학적 샘플은 NSCLC를 가지는 것으로 진단되었고 그런 암의 치료를 위한 EGFR 저해제 치료(예를 들어 Tarceva^TM, Iressa^TM)와 같은 치료를 받고 있는 서브젝트로부터 얻어질 수 있으며, 본 발명의 상기 방법은 그 서브젝트들의 NSCLC 종양이 그런 치료에 반응할 수 있는 NSCLC의 서브셋에 속하는지 및/또 대체적인 또는 추가적인 PDGFRα-저해 치료가 바람직하거나 요구되는지를 인지하기 위해 채용된다. 본 발명의 그 방법들은 또한 PDGFRα-저해 치료제 또는 치료제들의 조합을 포함하는 조성물로 하는 서브젝트의 치료에 뒤따르는 PDGFRα-발현 NSCLC 종양의 진행 또는 저해를 모니터하기 위해 채용될 수 있다.

그런 진단학적 에세이는 예비 평가 또는 외과적 감시 과정(surgical surveillance procedures) 이후에 또는 이전에 수행될 수 있다. 본 발명의 동정 방법은 PDGFRα에 의해 유도된 종양들을 가지는 NSCLC 환자들을 동정하기 위한 진단방법으로서 유리하게 채용될 수 있으며, 그 환자들은 STI-571(글리벡®) 또는 그것의 유사체들과 같은, PDGFRα 활성 저해를 목표로 한 치료제들에 가장 쉽게 반응할 것이다. 그런 환자들을 선택하는 능력은 또한 장래의 PDGFRα-표적 치료제들의 효능의 임상적 평가에서 뿐 아니라 장래의 NSCLC 환자들에 대한 그런 약들의 처방에 유용할 것이다.

C. PDGFR α-특이적 시약들

설명된 방법들의 실시에 유용한 PDGFRα-활성화 상태-특이적 시약들은 무엇보다도 생물학적 샘플에서 PDGFRα 발현에 상응하는, 및 그것의 동정 및 정량화에 적당한 PDGFRα-특이적 항체들 및 AQUA 펩타이드들을 포함한다. PDGFRα-특이적 시약은 생물학적 샘플에서 발현된 PDGFRα에 특이적으로 결합, 그것의 존재/수준을 동정 및/또는 정량화할 수 있는 생물학적 또는 화학적인 임의의 시약이다. 그 용어는 이에 한정되지는 않지만, 아래 논의된 바람직한 항체 및 AQUA 펩타이드 시약들을 포함하고, 동등한 시약들은 본 발명의 내용 안에 있다.

항체들.

본 발명의 방법들의 실시에 사용을 위해 적합한 항체들은 PDGFRα-특이적 항체 및 PDGFRα 인산화 부위-특이적 항체를 포함한다. PDGFRα-특이적 항체는 독립된 항체이거나 인산화 상태와 관계없으나, 그 단백질의 인산화 된 형태들을 포함하는 PDGFRα 단백질(예를 들어 인간, 서열번호: 1 참조)에 특이적으로 결합하는 항체들이다. PDGFRα 인산화 부위-특이적 항체는 독립된 항체이거나 특정한 티로신, 세린, 또는 트레오닌 잔기가 인산화될 때에만 PDGFRα 단백질과 특이적으로 결합하는 항체들이며, 그것은 실질적으로 단백질의 비인산화 된 형태 또는 그 항체가 특이성을 보이는 것과 다른 부위에 인산화된 단백질과는 결합하지 않는다.

인간 PDGFRα-특이적 및 인산화 부위-특이적 항체들은 또한 다른 포유류 종들, 예를 들면 생쥐 또는 토끼 PDGFRα 에서 및 그 역으로도 고도로 일치하고 동등한 에피토프의 펩타이드 서열들에 결합할 수 있다. 본 발명의 방법들을 실시하는데 유용한 항체들은 (a) 모노클로날 항체들, (b) 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 정제된 폴리클로날 항체들(예를 들어 PDGFRα의 인산화 된 형태), (c) 다른 비-인간 종들(예를 들어 쥐, 큰쥐)에서 동등하고 고도로 일치하는 에피토프들 또는 인산화 부위들에 결합하는 상기 (a)-(c)에 설명된 것과 같은 항체들, 및 (d) 여기에 설명된 예시적인 항체들에 의해 결합된 항원(또는 보다 바람직하게는 에피토프)에 결합하는 상기 (a)-(c)의 조각들을 포함한다.

여기 사용된 "항체" 또는 "항체들"의 용어는 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE를 포함하는 모든 유형의 면역글로불린들을 말한다. 그 항체들은 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고 (예를 들어) 쥐, 큰쥐, 토끼, 말, 또는 인간을 포함하는 기원의 종들의 것일 수 있으며, 또는 키메릭(chimeric) 항체들일 수 있다(예를 들어 M. Walker et al., Molec. Immunol. 26: 403-11(1989); Morrision et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 81: 6851(1984); Neuberger et al., Nature 312: 604(1984) 참조). 그 항체들은 U.S. Pat. No. 4,474,893(Reading) 또는 U.S. Pat. No. 4,816,567(Cabilly et al.)에 설명된 방법들에 따라 생산된 재조합 모노클로날 항체들일 수 있다. 그 항체들은 또한 U.S. Pat. No. 4,676,980(Segel et al.)에 설명된 방법에 따라 만들어진 화학적으로 조립된 특이적 항체들일 수 있다.

PDGFRα-특이적 항체들은 상업적으로 구입할 수 있다(Cell Signaling Technology, 2005 Catalogue, #3164, 및 Santa Cruz Biotechnology, 2005 Catalogue, #338 참조). 본 발명의 방법들의 어떤 바람직한 실시예들은 단백질 활성과 관련이 있는 것으로 알려진 티로신, 예를 들면 인간 PDGFRα 단백질 서열(서열번호: 1)에서 티로신 720 및 754에 인산화될 때에만 특이적으로 PDGFRα에 결합하는 인산화 부위-특이적 항체를 채용한다. 이런 인산화 부위-특이적 항체들의 일부 또는 전부는 상업적으로 구입할 수 있다(Cell Signaling Technology 2005 Catalogue, #2992, 및 Santa Cruz Biotechnology, 2005 Catalogue, # 12911 참조). PDGFRα-특이적 항체들의 생산 및 사용이 설명되었다. 예를 들어 U.S. Pat. No. 6,660,488, Dec. 9, 2003, Matsui et al 참조.

본 발명의 PDGFRα-특이적 항체의 바람직한 에피토픽 부위는 필수적으로 인간 PDGFRα 단백질 서열(서열번호: 1)의 약 11개 내지 17개의 아미노산들로 구성된 펩타이드 조각이다. PDGFRα 인산화 부위-특이적 항체들에 대하여, 그 에피토프는 그것의 각각의 끝에 위치한 약 5개 내지 9개의 아미노산들을 가진, 특정한 인산화 된 잔기(티로신, 세린, 또는 트레오닌)를 포함한다(예를 들면, 위치 754에서 포스포티로신을 포함하는 서열번호: 1의 잔기들 746~762). PDGFRα 안에서 특이적으로 보다 짧거나 보다 긴 펩타이드들/에피토프들과 결합하는 항체들이 본 발명의 내용 안에 있다는 점이 인상적일 것이다. 인간 PDGFRα의 아미노산 서열이 다른 종들로부터의 PDGFRα 서열들과 같이 공개되었다(도 1 참조(서열번호: 1)).

본 발명은 항체들의 사용에 제한되지 않으나, 본 발명의 방법들에 유용한 PDGFRα 항체가 결합하는 같은 에피토프에 필수적으로, 융합-단백질 특이적 방법(fusion-protein specific manner)으로 결합하는 도메인들 또는 핵산 압타머들(aptamers)에 결합하는 단백질과 같은 동등한 분자들을 포함한다. 예를 들어, Neuberger et al., Nature 312: 604(1984) 참조. 그런 동등한 무-항체 시약들은 아래 더 설명된 본 발명의 방법들에서 알맞게 채용될 수 있다.

본 발명의 방법들을 실시하는데 유용한 폴리클로날 항체들은 적당한 동물(예를 들어, 토끼, 염소 등)을 PDGFRα의 의도된 에피토프를 둘러싼 항체와 함께 면역성의 부여, 그 동물로부터 면역혈청(항혈청)의 모집, 및 그 면역혈청으로부터 폴리클로날 항체들의 분리, 및 알려진 과정들에 따라 그 의도된 특이성을 가진 폴리클로날 항체의 정제에 의한 표준 기술들에 따라 생산될 수 있다. 그 항원은 잘 알려진 기술들에 따라 선택되고 조립된, 의도된 에피토픽 서열을 포함하는 합성 펩타이드 항원일 수 있다(예를 들어, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Chapter 5, p. 75-76, Harlow &Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory(1988); Czernik, Methods In Enzymology, 201: 264-283(1991); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 21-49(1962) 참조). 여기에 설명된 것처럼 생산된 폴리클로날 항체들은 아래 더 설명된 것처럼 스크린 되고 분리될 수 있다.

모노클로날 항체들은 또한 본 발명의 방법들에 유리하게 채용될 수 있으며, Kohler 및 Milstein의 잘 알려진 기술에 따라 하이브리도마(hybridoma) 셀 라인들에서 생산될 수 있다. Nature 265:495-97(1975); Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511(1976); 또한, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al. Eds.(1989) 참조. 그렇게 생산된 모노클로날 항체들은 고도로 특이적이고, 본 발명에 의해 제공된 에세이 방법들의 선택성과 특이성을 개선시킨다. 예를 들면, 적절한 항체(예를 들어 PDGFRα안에 인산화 부위를 포함하는 합성 펩타이드)를 포함하는 용액이 쥐에게로 주입될 수 있고, 충분한 시간이 흐른 후에(통상적인 기술들과 일치하는) 그 쥐는 희생되었고 비장(spleen) 세포들이 얻어졌다. 그 비장 세포들은 이후에 폴리에틸렌글리콜의 존재 하에서, 하이브리도마 세포들을 생산하기 위해 그것들을 골수종(myeloma) 세포들과 융합시킴에 의해 전형적으로 불멸화된다. 예를 들면, 토끼 융합 하이브리도마들은 U.S Pat. No. 5,675,063, C. Knight, Issued Oct. 7, 1997에 설명된 것처럼 생산될 수 있다. 그 하이브리도마 세포들은 이후에 HAT(hypoxanthine-aminopterin-thymidine)와 같은 적합한 선택 매질에서 성장시키고, 그 상등액(supernatant)을 아래 설명된 것처럼 의도된 특이성을 가지는 모노클로날 항체들에 대하여 스크린 했다. 그 분비된(secreted) 항체는 침전, 이온 교환 또는 친화 크로마토그래피, 또는 그와 유사한 것들과 같은 통상적인 방법들에 의해 조직배양 상등액으로부터 복구될 수 있다.

모노클로날 팹 조각들은 또한 당업자에게 알려진 재조합 기술들에 의해 Escherichia coli에서 생산될 수 있다. 예를 들어, W. Huse, Science 246:1275-81(1989); Mullinax et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 87: 8095(1990) 참조. 만약 하나의 아이소타입(isotype)의 모노클로날 항체들이 특정한 적용에 대해서 바람직하다면, 특정한 아이소타입들이 초기의 융합물로부터 선택함에 의해, 직접적으로 준비될 수 있으며, 또는 클래스-스위치 배리언트(class-switch variants)를 분리하기 위한 sib 선택 기술을 사용함으로써 다른 아이소타입의 모노클로날 항체를 분비하는(secreting) 모 하이브리도마(parental hybridoma)로부터 이차적으로 준비될 수 있다(Steplewski, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., 82: 8653(1985); Spira et al., J. Immunol. Methods, 74: 307(1984)). 모노클로날 항체의 항원 조합 부위는 PCR 및 E. coli에서 파지-발현된(phage-displayed) 재조합항체들 또는 가용성 항체들로 생산된 단일-사슬 항체들에 의해 클론될 수 있다(예를 들어, ANTIBODY ENGINEERING PROTOCOLS, 1995, Humana Press, Sudhir Paul editor 참조).

본 발명의 방법들에 유용한 항체들은, 폴리클로날이든지 모노클로날이든지, 표준 기술들에 따라 에피토프 및 인산화-상태 특이성에 대하여 스크린될 수 있다. 예를 들어 Czernik et al., Methods in Enzymology, 201: 264-283(1991) 참조. 예를 들면, 그 항체들은 의도된 항원 및 의도된다면 단지 그 항원의 인산화 된 형태에 만의 반응성 둘 다에 대한 특이성을 확실케 하기 위해 ELISA에 의해 펩타이드 라이브러리에 대하여 스크린 될 수 있다. 그 항체들은 또한 오로지 의도된 표적에 만의 반응성을 확인하기 위해 그리고 PDGFR의 다른 이소폼들에 동정될 수 있을 정도로 결합하지 않음을 확실케 하기 위해 표적 단백질을 포함하는 세포 제제들(cell preparations)에 대하여 웨스턴 블롯팅에 의해 시험될 것이다.

본 발명의 방법들에 유용한 PDGFRα-특이적 및 인산화-특이적 항체들은 비-PDGFRα 에피토프들과 함께 어떤 제한된 교차-반응성을 나타낼 수 있다. 이것은 대부분의 항체들이 어느 정도 교차-반응성을 나타내므로 뜻밖의 것은 아니고, 안티-펩타이드 항체들은 종종 면역성 있는 펩타이드에 대해 고도의 상응 또는 동일성을 가지는 에피토프들과 교차-반응할 것이다. 예를 들어, Czemik, supra 참조. 비-PDGFRα 단백질들과의 교차-반응성은 알려진 분자량의 웨스턴 블로팅 옆의 표지들(alongside markers)에 의해 쉽게 특성화된다. 교차-반응한 단백질들의 아미노산 서열들은 항체가 결합하는 PDGFRα 서열에 대해 고도로 상응하거나 동일한 부위들을 동정하기 위해 조사될 수 있다. 바람직하지 않은 교차-반응성은 펩타이드 컬럼들(columns)에 항체 정화를 사용하여 부정 선택에 의해 제거될 수 있다.

본 발명의 방법들을 실시하는데 유용한 PDGFRα-특이적 항체들은 인간 PDGFRα에 대해 이상적으로 특이적이나, 본질적으로 인간 종들에 결합하는 것만으로 제한되지 않는다. 본 발명은 또한 다른 포유류 종들(예를 들어 쥐, 큰쥐, 원숭이)에서 보존되고 고도로 상응하거나 동일한 에피토프들과 결합하는 항체들의 사용을 포함한다. 다른 종들에서 고도로 상응하거나 동일한 서열들은 여기에 설명된 인간 PDGFRα 서열과 함께 BLAST를 사용하는 것과 같은 표준 서열 대비에 의해 쉽게 동정될 수 있다(서열번호: 1).

본 발명의 방법들에서 채용된 항체들은 특정한 에세이 포맷, 예를 들어 FC, IHC, 및/또는 ICC에서의 사용에 의해 더 특성화될 수 있으며, 사용에 대하여 인증될 수 있다. 그런 방법들에서 PDGFRα에 대항하는 항체들의 사용은 아래 섹션 D에서 더 설명되어 있다. 항체들은 또한 아래 섹션 D에서 더 설명되는 것과 같이, 다른 신호 전달(포스포-AKT, 포스포-Erk 1/2) 및/또는 세포 표지(시토케라틴) 항체들과 함께 multi-parametric analyses에 사용을 위해 형광성 염료들(예를 들어 Alexa488, PE) 또는 퀀텀 도트들(quantum dots)과 같은 라벨들에 유리하게 결합될 수 있다.

본 발명의 방법들을 실시함에 있어서, 주어진 NSCLC 종양에서 EGFR의 발현 및/또는 활성은 또한 EGFR-특이적 항체 및/또는 EGFR 인산화 부위-특이적 항체를 사용하여 유리하게 조사될 수 있다. EGFR-특이적 및 인산화-부위 특이적 항체들은 상업적으로 구입할 수 있다(CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly Mass., 2003/04 Catalogue, #'s 2231, 2232, 및 2234-2237; 및 Santa Cruz Biotechnology, 2005 Catalogue, #03 참조). 그런 항체들은 또한 상기 설명된 것과 같은 표준 방법들에 따라 생산될 수 있다. 다른 종들로부터의 EGFR의 서열들처럼, 인간 EGFR의 아미노산 서열이 공개되었다(accession #NP-005219 참조). NSCLC 종양에서 PDGFRα 발현과 함께, EGFR 발현 및/또는 활성화의 동정은 PDGFRα이 단독으로 종양을 유도하고 있는지, 또는 EGFR이 또한 활성화되어 종양을 유도하고 있는지에 대한 정보를 제공할 수 있다. 그런 정보는 표적한(targeting) 수용체들이 NSCLC 종양의 진행을 저해하는데 가장 유용할 것인지를 평가하는데 있어서, 및 적절한 치료제 또는 그것들의 조합을 선택하는데 있어서 하나 또는 둘 다에 임상적으로 유용하다.

하나 이상의 항체가 상기 설명된 방법들의 실시에 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들면, NSCLC 종양으로부터의 세포들을 포함하는 생물학적 샘플에서 그런 다른 신호전달 분자들의 활성을 동정하기 위해, NSCLC 종양에서 활성화되고 있는 것으로, 또는 잠재적으로 활성화되는 것으로 의심되어지는 또 다른 키나아제, 수용체, 또는 키나아제 기질에 특이적인 하나 또는 그 이상의 항체들 및 하나 또는 그 이상의 PDGFRα-특이적 항체들이 동시에 채용될 수 있다

무거운 동위원소 표지된 ( Heavy - Isotope Labeled ) 펩타이드들 ( AQUA 펩타이드 들 ).

설명된 방법의 실시에 유용한 PDGFRα-활성화 상태-특이적 시약들은 또한 생물학적 샘플에서 발현된 PDGFRα(바람직하게는 공개된 부위에서 인산화된)의 절대적 정량화에 적합한 무거운 동위원소 표지된 펩타이드들을 포함할 수 있다. 복합 혼합물에서 단백질들(AQUA)의 절대적 정량화를 위한 AQUA 펩타이드들의 생산 및 사용이 설명되었다. WO/03016861, "Absolute Quantification of Proteins and Modified Forms Thereof by Multistage Mass Spectrometry," Gygi et al. and also Gerber et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100: 6940-5(2003) 참조(이 결과, 그것들의 전체로서, 참조문헌으로써 여기에 통합된 가르침들).

AQUA 방법론(methodology)은 그 펩타이드 표준과 비교하여, 생물학적 샘플에서 같은 서열 및 단백질 변형을 가진 펩타이드의 절대적 양을 결정하기 위해 적어도 하나의 무거운 동위원소 표지된 펩타이드(LC-SRM 크로마토그래피에 의해 동정할 수 있는 유일한 특징을 가지는) 표준의 알려진 양의 소화된 생물학적 샘플로의 주입을 채용한다. 간단히 말해, 그 AQUA 방법론은 두 단계들을 가진다: 펩타이드 내부 표준 선택 및 유효성 및 방법 개발; 및 샘플에서 표적 단백질을 검출하고 정량화하는 유효한 펩타이드 내부 표준들을 사용하여 수행. 그 방법은 세포 라이세이트와 같은 복합적인 생물학적 혼합물 안에서 주어진 펩타이드/단백질을 검출하고 정량화하기 위한 강력한 기술이며, 예를 들어, 의약 처리의 결과로서 단백질 인산화에 있어서의 변화를 정량화하기 위해, 또는 다른 생물학적 상태들에서 단백질의 수준에서의 변화들을 정량화하기 위해 채용될 수 있다.

일반적으로, 적합한 내부 표준을 개발하기 위해, 표적 단백질 서열 안에서 특정한 펩타이드(또는 변형된 펩타이드)는 그것의 아미노산 서열 및 소화하기 위해 사용되는 특정한 프로테아제에 기초하여 선택된다. 그 펩타이드는 이후 하나의 잔기가 안정한 동위원소들(¹³C, ¹⁵N)을 포함하는 같은 잔기를 가진 것으로 대체되도록 고체상 펩타이드 합성에 의해 형성된다. 그 결과물은 단백질 분해에 의해 형성된 그것의 정상 카운터파트(native counterpart)와 화학적으로 동일한 펩타이드이나, 그것은 7-Da 질량 쉬프트(mass shift)를 통해 질량분석기(MS)에 의해 쉽게 구별할 수 있다. 새롭게 합성된 AQUA 내부 표준 펩타이드는 이후 LC-MS/MS에 의해 평가된다. 이런 과정은 역-상 크로마토그래피(reverse-phase chromatography)에 의한 펩타이드 보유, 이온화 효율(ionization efficiency), 및 충돌유발분해(collision-induced dissociation)를 통한 단편화(fragmentation)에 관한 정성적인 정보를 제공한다. 정상 및 내부 표준 펩타이드들의 세트들에 대한 정보를 주는 풍부한 조각 이온들이 선택되고 이후 펩타이드 표준의 유일한 프로파일에 기초한 선택된 반응 모니터링(LC-SRM) 방법을 형성하기 위해 크로마토그래피의 보유의 기능으로서 신속한 연속으로 특이적으로 모니터 된다.

AQUA 전략의 두 번째 단계는 복잡한 혼합물로부터 단백질 또는 변형된 단백질의 양을 측정하기 위한 그것의 수행이다. 전체 세포 라이세이트는 전형적으로 SDS-PAGE 겔 전기영동법에 의해 분류되고, 단백질 이동과 일치하는 그 겔의 지역들은 절개된다. 이런 과정 뒤에는 AQUA 펩타이드들의 존재하에서 인-겔 단백질 분해(in-gel proteolysis) 및 LC-SRM 분석이 뒤따른다(Gerber et al. supra. 참조). AQUA 펩타이드들은 단백질분해 효소에 의한 전체 세포 라이세이트의 소화에 의해 얻어진 복잡한 펩타이드 혼합물에 고정되고 상기 설명된 것과 같은 면역친화 정제를 받는다. 소화(예를 들어 트립신처리)에 의해 형성된 정상 펩타이드(native peptide)의 보유 시간과 단편화 패턴은 이전에 결정된 AQUA 표준 펩타이드의 그것과 일치한다; 그러므로, SRM 실험을 이용한 LC-MS/MS 분석은 내부 표준 및 직접적으로 매우 복잡한 펩타이드 혼합물로부터의 분석물(analyte) 둘 다에서 고도로 특이적이고 민감한 측정 결과를 낳는다.

AQUA 펩타이드의 절대량이 첨가되기 때문에(예를 들어 250 fmol), 그 곡선 아래 영역들의 비율은 원래의 세포 라이세이트에서 단백질 또는 단백질의 인산화 된 형태의 정확한 발현 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 게다가, 그 내부 표준은 겔 단편들(gel pieces)로부터 펩타이드 추출 효율, 샘플 조작(handling)(진공 원심분리를 포함한) 동안의 절대적인 손실, 및 LC-MS 시스템으로의 도입 중의 가변성이 정상과 AQUA 펩타이드 존재도(abundances)의 결정된 비율에 영향을 끼치지 않도록, 정상 펩타이드들이 형성된 것처럼 인-겔 소화(in-gel digestion) 동안 존재한다.

하나의 AQUA 펩타이드 표준은 표적 단백질 안에서 IAP-LC-MS/MS 방법에 의해 동정된 이전에 알려진 인산화 부위 서열에서 발달된다. 그 부위 안에 있는 특정한 잔기의 인산화된 형태를 결합시킨 하나의 AQUA 펩타이드가 발달될 수 있으며, 그 잔기의 비-인산화된 형태를 결합시킨 두 번째 AQUA 펩타이드가 발달될 수 있다. 이런 방법으로, 그 두 개의 표준들은 생물학적 샘플에서 그 부위의 인산화된 및 비-인산화된 둘 다를 검출하고 정량하기 위해 사용될 수 있다.

펩타이드 내부 표준들은 또한 단백질의 초기의 아미노산 서열을 조사함 및 프로테아제 절단에 의해 생산된 펩타이드들의 경계들을 결정함으로써 형성될 수 있다. 그 대신으로, 단백질은 실제적으로 프로테아제로 소화될 수 있으며 생산된 특정한 펩타이드 단편은 그 후 배열이 결정될 수 있다. 적합한 프로테아제들은 여기에 제한되지는 않으나, 세린 프로테아제들(예를 들어 트립신, 헵신), 메탈로 프로테아제들(예를 들어 PUMP1), 키모트립신, 카텝신(cathepsin), 펩신(pepsin), 서몰리신(thermolysin), 카르복시펩티다아제들 등을 포함한다.

표적 단백질 안에 있는 펩타이드 서열은 내부 표준으로서 펩타이드의 사용을 최적화하기 위해서 하나 또는 그 이상의 기준들에 따라 선택된다. 바람직하게, 그 펩타이드의 크기는 펩타이드 서열이 다른 비-표적 단백질들에서 다른 곳으로 반복될 수 있는 기회들을 최소화하기 위해 선택된다. 그러므로, 펩타이드는 바람직하게는 적어도 약 6개의 아미노산들이다. 그 펩타이드의 크기는 또한 이온화 효율을 최대화하기 위해 최적화된다. 그러므로, 약 20개 아미노산들보다 긴 펩타이드들은 바람직하지 않다. 바람직한 범위는 약 7개 내지 15개 아미노산들이다. 펩타이드 서열은 또한 질량 분석 동안에 화학적으로 반응할 수 없는 것으로 선택되므로, 시스테인, 트립토판, 또는 메티오닌을 포함한 서열들은 회피된다.

표적 지역의 변형 지역을 포함하지 않는 펩타이드 서열은 그 펩타이드 내부 표준이 그 단백질의 모든 형태들의 양을 결정하기 위해 사용될 수 있도록 선택될 수 있다. 그 대신으로, 변형된 아미노산을 둘러싼 펩타이드 내부 표준은 그 표적 단백질의 단지 변형된 형태만을 검출하고 정량하기 위해서 바람직할 수 있다. 변형된 및 변형되지 않은 지역들 둘 다에 대한 펩타이드 표준들은 특정한 샘플에서 변형의 정도를 결정하기 위해(즉 단백질의 총량의 어느 부분이 그 변형된 형태에 의해 대표되는지를 결정하기 위해) 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 특정한 부위에서 인산화되는 것으로 알려진 단백질의 인산화된 및 비인산화된 형태 둘 다에 대한 펩타이드 표준들이 샘플에서 인산화된 형태의 양을 정량하기 위해 사용될 수 있다.

그 펩타이드는 하나 또는 그 이상의 표지된 아미노산들을 사용하여 표지되며(즉 그 표지는 그 펩타이드의 실제적 부분이다), 또는 덜 바람직하게 표지들은 표준 방법들에 따라 합성 이후에 부착될 수 있다. 바람직하게, 그 표지는 다음 고려들에 기초하여 선택된 질량-변화(mass-altering) 표지이다: 그 질량은 저 배경(low background)을 가진 스펙트럼의 지역들에 대하여 MS 분석에 의해 생산된 쉬프트 단편들의 질량들에 유일해야 한다; 그 이온 질량 신호(signature) 구성요소는 바람직하게 MS 분석에서 유일한 이온 질량 신호를 나타내는 표지하는 부분의 일부이다; 그 표지의 구성 원자들의 질량들의 합은 바람직하게 모든 가능한 아미노산들의 단편들과 유일하게 다르다. 결과적으로, 그 표지된 아미노산들과 펩타이드들은 그 결과인 질량 스펙트럼에서 이온/질량 패턴에 의해 표지되지 않은 것들과 쉽게 구별된다. 바람직하게, 그 이온 질량 신호 구성요소는 20개의 천연 아미노산들의 임의의 것에 대한 잔여 질량과 매치되지 않는 단백질 단편에 질량을 부여한다.

그 표지는 MS의 단편화 조건들 하에서 튼튼해야(robust)하고 적합하지 않은 단편화를 겪지 않아야 한다. 표지 화학은 조건들, 특히 변성 조건들의 범위 하에서 효율적이어야 하며, 그 표지된 태그(tag)는 선택한 MS 버퍼 시스템에서 가용성으로 남아있는 것이 바람직하다. 그 표지는 단백질의 이온화 효율을 억누르지 않고 화학적으로 반응성이 없는 것이 바람직하다. 그 표지는 각각의 표지된 단편 위치에서 유일한 질량 분석적 패턴을 형성하기 위해 둘 또는 그 이상의 동위원소로 구별되는 종들의 혼합물을 포함할 수 있다. ²H, ¹³C, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O, 또는 ³⁴S와 같은 안정한 동위원소들은 선호되는 표지들이다. 다른 동위원소 표지에 결합하는 펩타이드 내부 표준들의 쌍들이 또한 준비될 수 있다. 무거운 동위원소 표지가 결합될 수 있는 바람직한 아미노산 잔기들은 류신, 프롤린, 발린, 및 페닐알라닌을 포함한다.

펩타이드 내부 표준들은 그들의 질량 대 전하 비(m/z)에 따라, 그리고 바람직하게는, 또한 크로마토그래피의 컬럼(예를 들어 HPLC 컬럼)에서 그것들의 보유 시간에 따라 특성화 된다. 동일한 서열의 비표지된 펩타이드들과 함께 용리(co-elute)하는 내부 표준들은 최적의 내부 표준들로 선택된다. 그 내부 표준은 이후 임의의 적당한 방법들에 의해, 예를 들면, 예를 들어 충돌 가스로서 아르곤 또는 헬륨을 사용하는 충돌유발 분해에 의해 그 펩타이드를 단편화함에 의해 분석된다. 그 단편들은 이후 펩타이드 단편화 신호를 얻기 위해, 예를 들면 단편 이온 스펙트럼을 얻기 위한 다단계 질량 분석(MSⁿ)에 의해 분석된다. 바람직하게, 펩타이드 단편들은 각각의 단편에 관련된 피크들이 잘 분리되는 것을 가능케 하기 위해 m/z 비율들에서 상당한 차이들을 가지며, 하나의 신호는 얻어진 표적 펩타이드에 대하여 유일하다. 만약 적당한 단편 신호가 첫 번째 단계에서 얻어지지 않는다면, MS의 추가적인 단계들이 유일한 신호가 얻어질 때까지 수행된다.

MS/MS 및 MS³ 스펙트럼들에서 단편 이온들은 전형적으로 관심있는 펩타이드에 대하여 고도로 특이적이며, 그것은 LC 방법들과 함께 수천 또는 수만 개의 단백질들을 포함하는 세포 라이세이트와 같은 복잡한 단백질 혼합물에서 표적 펩타이드/단백질을 검출하고 정량하는 고도로 선택적인 수단들을 가능케 한다. 잠재적으로 관심있는 표적 단백질/펩타이드를 포함하는 임의의 생물학적 샘플이 에세이될 수 있다. 가공하지 않은 또는 부분적으로 정제된 세포 추출물들이 바람직하게 채용된다. 일반적으로, 그 샘플은 적어도 0.01 mg 의 단백질, 전형적으로 0.1-10 mg/mL 의 농도를 가지며, 의도된 버퍼 농도와 pH에 조절될 수 있다.

검출/정량되는 표적단백질에 대응하는, 표지된 펩타이드 내부 표준의 알려진 양, 바람직하게 약 10펨토몰(femtomoles)이 이후 세포 라이세이트와 같은 생물학적 샘플에 첨가된다. 그 고정된(spiked) 샘플은 이후 소화가 될 정도인 적당한 시간 주기 동안 하나 또는 그 이상의 프로테아제들로 소화된다. 분리(예를 들어 HPLC,역-상 HPLC, 모세관 전기영동법, 이온 교환 크로마토그래피 등)가 이후 그 샘플에서 다른 펩타이드들로부터 표지된 내부 표준과 그것의 대응 표적 펩타이드를 분리하기 위해 수행된다. 마이크로카필러리 LC(Microcapillary LC)가 바람직한 방법이다.

각각의 분리된 펩타이드는 이후 MS에서 선택된 반응의 모니터링에 의해 조사된다. 이것은 펩타이드 내부 표준의 특성화에 의해 얻어진 선행지식을 사용하는 것과 이후 그 관심있는 펩타이드 및 그 내부표준 둘 다에 대한 MS/MS 또는 MS.sup.n 스펙트럼에서 특정한 이온을 계속적으로 모니터하도록 그 MS에 요구하는 것을 포함한다. 용리(elution) 후에, 펩타이드 표준 및 표적 펩타이드 피크들 둘 다에 대한 곡선 아래의 영역(AUC)이 계산된다. 두 지역들의 비는 세포당 단백질의 카피들의 정확한 수를 제공하기 위해, 그 분석에 사용된 세포들의 수 및 단백질의 분자량에 대하여 표준화될 수 있는 절대적인 정량화를 제공한다. AQUA 방법론의 더 자세한 것들은 Gygi et al., and Gerber et al. supra.에 설명되어 있다.

AQUA 내부 펩타이드 표준들이(무거운 동위원소 표지된 펩타이드들) 상기 설명된 것처럼, 임의의 인산화 부위를 이런 RTK의 활성과 관련된 PDGFRα와 함께 검출하고 정량하기 위해 바람직하게 생산될 수 있다. 예를 들면, AQUA 포스포펩타이드는 다음의 바람직한 PDGFRα 티로신 인산화 부위들: 티로신 572, 티로신 742, 티로신 762, 티로신 768, 티로신 849, or 티로신 1018(인간 PDGFRα 단백질 서열(서열번호: 1)에서; 또한 표 1 참조)의 임의의 것과 대응하도록 준비될 수 있다. 주어진 인산화 부위(예를 들어 인간 PDGFRα에서 티로신 572 부위)에 대한 펩타이드 표준들은 그 부위의 인산화된 및 비-인산화된 형태들 둘 다에 대하여 생산될 수 있으며, 그런 표준들은 생물학적 샘플에서 그런 인산화 부위의 형태들 둘 다를 검출하고 정량하기 위한 AQUA 방법론에 채용될 수 있다.

표 1에서 동정된 그 여섯 개의 인산화 부위 펩타이드 서열들(실시예 1 참조)(서열번호: 3-8)은 그것들이 동정되어지는 그 IAP 방법이(상기 A 부분, 및 실시예 1 참조) 그런 펩타이드들이 실제로 효소적 소화(트립신처리)에 의해 생산되고 실제로 MS/MS에서 적절하게 분류/이온화되는 것을 본질적으로 확증했기 때문에, AQUA 펩타이드들에 대응하는 것의 발달을 위해 특히 잘 맞는다. 예를 들면, 인산화할 수 있는 티로신 742(인간 PDGFRα 서열)를 둘러싸는, 펩타이드 서열 QADTTQyVPMLER(서열번호: 4; 표 1 참조)이 생물학적 샘플에서 인산화된(Y742) PDGFRα를 정량하기 위한 AQUA 펩타이드들의 발달을 위해 바람직하게 선택될 수 있다. 이런 바람직한 펩타이드들의 임의의 것의 무거운 동위원소 표지된 동등물들은(인산화된 및 비인산화된 형태에서 둘 다) 그 펩타이드들이 AQUA 펩타이드들로서 유효하고 정량화 실험들에서 사용할 준비가 되도록 쉽게 합성될 수 있고 그것들의 유일한 MS 및 LC-SRM 신호가 결정될 수 있다.

PDGFRα 인산화 부위 서열(및 그것의 하향 또는 상향의 추가적인 잔기들)을 포함하는 더 큰 AQUA 펩타이드들이 또한 건설될 수 있음은 인상적일 것이다. 비슷하게, 그런 인산화 부위 서열(그러나 여전히 관심있는 인산화할 수 있는 티로신 잔기를 포함하는)의 잔기들의 모두 보다 덜 포함하는 더 작은 AQUA 펩타이드가 그 대신으로 건설될 수 있다. 그런 더 크거나 더 작은 AQUA 펩타이드들은 본 발명의 내용 안에 있으며, 총 PDGFRα를 정량하기 위함이든지 또는 인산화된 PDGFRα를 정량하기 위함이든지 바람직한 AQUA 펩타이드들의 선택과 생산은 상기 설명된 것처럼 수행될 수 있다(Gygi et al., Gerber et al., supra. 참조).

D. 에세이 포맷들

본 발명의 방법들의 실시에 유용한 면역측정법들(Immunoassays)은 동질 면역측정법들(homogenous immunoassays) 또는 이질 면역측정법들(heterogeneous immunoassays)일 수 있다. 동질 측정법에서, 그 면역학상의 반응은 보통 PDGFRα-특이적 시약(예를 들어 PDGFRα-특이적 항체), 표지된 분석물, 및 관심있는 생물학적 샘플을 포함한다. 그 표지로부터 일어난 신호는 표지된 분석물에 항체가 결합하여, 직접적으로 또는 간접적으로 변형된다. 면역학상의 반응 및 그것들의 정도의 동정 둘 다는 균질한 용액에서 수행된다. 채용될 수 있는 면역학상의 표지들은 자유 라디칼들, 방사성-동위원소들, 형광염료들, 효소들, 박테리오파지들, 조효소들 등등을 포함한다. 반도체 나노크리스탈 표지들, 또는 "퀀텀 도트들"은 또한 유리하게 채용될 수 있으며, 그것들의 준비와 사용은 잘 설명되었다. 일반적으로, K. Barovsky, Nanotech. Law &Bus. 1(2): Article 14(2004) 및 거기에 인용된 특허들 참조.

이질 측정법 연구에서, 그 시약들은 보통 생물학적 샘플, PDGFRα-특이적 시약(예를 들어, 항체)이며, 동정할 수 있는 신호를 생산하기 위한 적당한 수단들이다. 상기 섹션 B에서 설명된 것과 같은 생물학적 샘플들이 사용될 수 있다. 그 항체는 일반적으로 비드(bead), 플레이트(plate) 또는 슬라이드(slide)와 같은 지지대에 고정되며, 액체상에서 항원을 포함하고 있는 것으로 의심되는 샘플에 접촉된다. 그 지지대는 이후 그 액체상으로부터 분리되고 지지대 상 또는 액체 상 중 어느 한쪽은 그런 신호를 생산하는 수단들을 채용하여 동정할 수 있는 신호들이 조사된다. 그 신호들은 그 생물학적 샘플에 분석물의 존재와 관련이 있다. 동정할 수 있는 신호를 생산하는 수단들은 방사성 표지들, 형광 표지들, 효소 표지들, 퀀텀 도트들 등의 사용을 포함한다. 예를 들면, 만약 검출되는 항원이 두 번째 결합부위를 포함한다면, 그 부위에 결합하는 항체는 동정할 수 있는 그룹에 결합될 수 있고 그 분리 단계 이전에 액체 상 반응 용액이 첨가될 수 있다. 고체 지지대에 동정할 수 있는 그룹의 존재는 그 시험 샘플에 항원의 존재를 나타낸다. 적당한 면역측정법들의 예들은 방사성면역측정법, 면역형광법들, 효소-결합 면역측정법들, 및 그것들과 유사한 것들이 있다.

여기서 설명된 방법들을 수행하기에 유용할 수 있는 면역측정법 포맷들과 그것들의 변화들은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로 E. Maggio, Enzyme-Immuno Assay, (1980)(CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla.) 참조; 또한, 예를 들어, U.S. Pat. No. 4,727,022(Skold et al., "Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application"); U.S. Pat. No. 4,659,678(Forrest et al., "Immunoassay of Antigens"); U.S. Pat. No. 4,376,110(David et al., "Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies") 참조. 시약-항체 복합체들의 형성을 위해 적합한 조건들은 당업자들에게 잘 알려져 있다. id 참조. PDGFRα-특이적 또는 인산화 부위-특이적 모노클로날 항체들은 표지된 모노클로날 항체 및 결합된 모노클로날 항체 둘 다에 대한 소스(source)로서 제공하는 단일 하이브리도마 셀 라인과 함께 "두-부위" 또는 "샌드위치"에세이에 사용될 수 있다. 그런 에세이들은 U.S. Pat. No. 4,376,110에 설명되어 있다. 동정할 수 있는 시약의 농도는 PDGFRα의 결합이 배경에 비하여 동정할 수 있을 정도로 충분해야 한다.

여기에 설명된 방법들의 실시에 유용한 항체들은 침전과 같은 알려진 기술들에 따라 진단학적 에세이에 적당한 고체 지지대(예를 들어, 비드들, 플레이트들, 슬라이드들 또는 라텍스 또는 폴리스티렌과 같은 물질들로부터 형성된 웰들(wells))와 결합될 수 있다. 항체들 또는 다른 PDGFRα 결합 시약들은 마찬가지로 알려진 기술들에 따라 방사성표지들(예를 들어, ³⁵S, ¹²⁵I, ¹³¹I), 효소 표지들(예를 들어, 호오스래디시 페록시다아제(horseradish peroxidase), 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase), 및 형광 표지들(예를 들어, 플루오레세인)과 같은 동정할 수 있는 그룹들과 결합될 수 있다.

유세포 분석법(FC), 면역조직화학염색법(IHC), 또는 면역형광법(IF)과 같은 세포-기초 에세이들은 임상적으로 알맞고, 생체 내에서 PDGFRα 활성화의 동정을 가능케 하며, 추출물들을 얻기 위해 NSCLC 종양으로부터 얻어진 조작한 세포들로부터의 결과인 활성에 있어서의 인공 변화들(artifact changes)의 위험을 회피하기 때문에, 본 발명의 방법들을 실시하는데 특히 바람직하다. 따라서, 어떤 바람직한 실시예에서, 본 발명의 방법들이 유세포 분석법(FC), 면역조직화학염색법(IHC), 또는 면역형광법(IF) 에세이 포맷에서 수행된다.

유세포 분석법(FC)은 PDGFRα 키나아제 활성을 저해시킴을 표적으로 한 의약과 함께 처리하기 이전, 동안, 및 이후에 포유류 NSCLC 종양에서 PDGFRα의 활성화 상태를 결정하기 위해 채용될 수 있다. 예를 들면, 미세 침 흡인검사로부터의 종양 세포들은 PDGFRα 발현 및/또는 활성화에 대하여, 뿐 아니라, 만약 그렇게 의도되었다면, 폐암 세포 유형들을 동정하는 표지들에 대하여 유세포 분석법에 의해 분석될 수 있다. 유세포 분석법은 표준 방법들에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어 Chow et al., Cytometry(Communications in Clinical Cytometry) 46: 72-78(2001) 참조. 간결하게 그리고 예에 의해, 혈구분석(cytometric analysis)을 위한 다음의 프로토콜이 채용될 수 있다: 37℃에서 10분 동안 2% 파라포름알데히드와 함께 세포를 고정한 이후에 90% 메탄올에서 30분 동안 얼음으로 식혀 침투화 과정(permeabilization)을 수행했다. 세포들은 이후 초기 PDGFRα-특이적 항체로 얼룩지고, 씻겨지고 그리고 형광-표지된 2차적 항체로 표지될 수 있다. 그 세포들은 이후에 사용된 기구의 특이성 프로토콜들에 따라 유세포 분석기(예를 들어 a Beckman Coulter FC500)에서 분석될 것이다. 그런 분석은 종양에서 발현된 PDGFRα 단백질의 수준을 동정할 것이다. PDGFRα-저해 치료제로 종양의 치료 후의 비슷한 분석은 PDGFRα-발현 종양의 표적 저해제 또는 PDGFRα 키나아제에 대한 반응성을 나타낼 것이다.

면역조직화학염색적(IHC) 얼룩짐(staining)은 또한 PDGFRα 활성 저해시킴을 표적으로 한 의약으로 처리하기 이전, 동안, 및 이후에 포유류 NSCLC 종양에서 PDGFRα의 발현 및/또는 활성화 상태를 결정하기 위해 채용될 수 있다. IHC는 잘 알려진 기술들에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체S: A LABORATORY MANUAL, Chapter 10, Harlow &Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory(1988) 참조. 간결하게 그리고 예에 의해, 파라핀-묻혀진 조직(예를 들어 생검으로부터의 종양 조직)은 자일렌에 잇달아 에탄올과 함께 조직 조각들을 디파라피나이징(deparaffinizing)함에 의해 면역조직화학염색적으로 얼룩질 준비가 되어있다; 이후 물 PBS에서 수화시킴; 소듐 시트레이트 버퍼에서 슬라이드를 가열함에 의해 항원을 언매스킹(unmasking)함; 과산화수소에서 조각들을 배양시킴; 블로킹 용액으로 블로킹(blocking)함; 초기 안티-PDGFRα 항체 및 2차적인 항체에서 슬라이드를 배양시킴; 그리고 최종적으로 제조자의 지시에 따라 ABC 아비딘(avidin)/바이오틴(biotin) 방법을 사용하여 동정함.

면역형광법(IF) 에세이들은 또한 PDGFRα 활성 저해시킴을 표적으로 한 의약으로 처리하기 이전, 동안, 및 이후에 포유류 NSCLC 종양에서 PDGFRα의 발현 및/또는 활성화 상태를 결정하기 위해 채용될 수 있다. 면역형광법은 잘 알려진 기술들에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, J. M. polak and S. Van Noorden(1997) INTRODUCTION TO IMMUNOCYTOCHEMISTRY, 2nd Ed.; ROYAL MICROSCOPY SOCIETY MICROSCOPY HANDBOOK 37, BioScientific/Springer-Verlag 참조. 간결하게 그리고 예에 의해, 환자 샘플들은 파라핀에 잇달아 메탄올에서 고정되고, 말 혈청과 같은 블록킹 용액으로 블록되며, PDGFRα에 대항하는 초기 항체에 잇달아 Alexa 488와 같은 형광 염료로 표지된 2차적인 항체와 함께 배양되고 형광현미경 (epifluorescent microscope)으로 분석될 수 있다.

상기 설명된 에세이들에서 채용된 항체들은 멀티-파라메트릭 분석들 (multi-parametric analyses)에서 다른 신호 전달(EGFR, 포스포-AKT, 포스포-Erk 1/2) 및/또는 세포 표지(시토케라틴) 항체들과 함께 사용하기 위하여, 형광 염료들 (예를 들어 Alexa488, PE), 또는 퀀텀 도트들과 같은 다른 표지들에 유리하게 결합될 수 있다.

비슷하게, NSCLC 종양으로부터의 세포들을 포함하는 생물학적 샘플에서 발현된 PDGFRα의 동정/정량화를 위한 AQUA 펩타이드들이 상기 섹션 C에서 자세히 설명된 것처럼, 준비되고 표준 AQUA 에세이들에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법들의 어떤 바람직한 실시예들에서, 그 PDGFRα-특이적 시약은 상기 섹션 C에서 설명된 것처럼, PDGFRα 펩타이드 서열(예를 들어, 인산화 부위)에 상응하는 무거운 동위원소 표지된 포스포펩타이드(AQUA 펩타이드)를 포함한다.

본 발명의 방법들의 실시에 유용한 PDGFRα-특이적 시약들은 또한 생물학적 샘플에서 PDGFRα 발현 전사체(transcripts)에 직접적으로 결합(hybridize), 및 동정할 수 있는 mRNA, 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 탐침들일 수 있다. 간결하게 그리고 예에 의해, 포르말린-픽스드(formalin-fixed), 파라핀-엠베디드 (paraffin-embedded) 환자 샘플들은 플루오레세인-표지된 RNA 탐침 (fluorescein-labeled RNA probe)으로 동정될 수 있고 잇달아 포름아미드(formamide), SSC 및 PBS로 씻겨질 수 있으며 형광 현미경으로 분석될 수 있다.

E. PDGFR α-저해 치료제들.

본 발명에 따라, PDGFRα가 발현되는 포유류 NSCLC 종양들의 별개의 서브셋의 진행이 생체 내에서, 그런 종양들에서 PDGFRα의 활성을 저해시킴에 의해서 저해될 수 있다는 것이 이제 보여졌다. NSCLC 종양들의 이런 새롭게 동정되고 별개인 서브셋에서 PDGFRα 활성은 Imatinib mesylate(STI-571; 글리벡®)와 같은 소-분자 PDGFRα 저해제와 같은 PDGFRα-저해 치료제에 종양을 접촉시킴으로써 저해될 수 있다. 여기 실시예 5에 더 설명된 것처럼, PDGFRα-발현 NSCLC 종양들의 성장 저해는 예시적인 PDGFRα-저해 치료제, 글리벡®을 사용하여 이런 RTK를 저해시킴에 의해서 성취될 수 있다. 따라서, 본 발명은 부분적으로 종양에서 PDGFRα의 발현 및/또는 활성을 저해시킴에 의해 PDGFRα-발현 포유류 NSCLC 종양의 진행을 저해하기 위한 방법을 제공한다.

PDGFR-저해 치료제는 아래 설명된 화합물들의 예시적인 부류들을 포함하는, 생체 내에서 PDGFRα의 발현 및/또는 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 저해하는 생물학적인 또는 화학적인 적어도 하나의 화합물을 포함하는 임의의 조성물일 수 있다. 그런 화합물들은 PDGFRα 자체, 또는 단백질들에 직접적으로 작용하는 치료제들 또는 PDGFRα의 활성을 변화시키는, 또는 PDGFRα.의 발현을 저해함으로써 간접적으로 작용하는 분자들을 포함한다. 그런 조성물들은 또한 단일 PDGFRα-저해 화합물만을 포함하는 조성물들뿐 아니라 다수의 치료제들(다른 RTKs에 대항하는 것들을 포함하는)을 포함하는 조성물들을 포함하며, 그것들은 또한 화학요법 제제(chemotherapeutic agent) 또는 일반적인 전사 저해제와 같은 비-특이적 치료학적 제제를 포함할 수 있다.

소 분자 저해제들.

어떤 바람직한 실시예들에서, 본 발명의 방법들의 실시에 유용한 PDGFRα-저해 치료제는 글리벡®(STI-571)과 같은 표적 소분자 저해제, 및 그것의 유사체들이다. 현재 나타난 것처럼(실시예 5 참조), 인간 NSCLC 이종이식들을 품고 있는 쥐들에 글리벡®의 투여가 PDGFRα-발현 종양들을 가진 다른 쥐들에서 그 질병의 진행을 선택적으로 저해했다. PDGFRα(뿐 아니라 Bcr-Abl 키나아제)의 ATP-결합 부위에 특이적으로 결합하여 차단하고, 그로 인해 이런 효소의 인산화 및 활성화를 방해하는 글리벡®은 상업적으로 구입할 수 있으며 그것의 특성들은 잘 알려져 있다. 글리벡®의 PDGFRα-특이적 저해 특성들은 설명되어 졌다. 예를 들어 Martinelli et al., Haematologica 89(2): 236-7(2004) 참조. 다른 바람직한 PDGFR의 소 분자 저해제들은 BAY 43-93006, XL-999 및 SU11248를 포함한다. 이런 화합물들은 임상적 연구대상이고 그것들의 PDGFRα-특이적 저해 특성들은 설명되어 졌다. Wilhelm et al., Cancer Res. 64(19): 7099-109(2004) 및 Mendel et al., Clin Cancer Res. 9(1): 327-37(2003) 참조.

소 분자 표적 저해제들은 특이적으로 그리고 종종 되돌릴 수 없게 효소의 촉매 부위에 결합, 및/또는 효소가 그것의 활성을 위해 필요한 형태를 택하는 것을 방해하는 효소 안에 있는 ATP-결합 틈(cleft) 또는 다른 결합 부위에 결합함으로써 전형적으로 그것들의 표적 효소의 활성을 저해시키는 분자들의 한 부류이다. 소 분자 저해제들은 PDGFRα 3-차원 구조의 X-선 결정법(X-ray crystallographic) 또는 컴퓨터 모델링(computer modeling)을 사용하여 합리적으로 디자인될 수 있으며, 또는 PDGFRα의 저해를 위한 화합물 라이브러리들(libraries)의 초고속 스크리닝 (high throughput screening)에 의해 발견될 수 있다. 그런 방법들은 당업계에서 잘 알려져 있으며, 설명되었다. PDGFRα 저해의 특이성은, 예를 들면, 키나아제들의 패널(panel)에서 다른 키나아제 활성이 아닌 PDGFRα 활성을 저해하는 그런 화합물의 능력을 조사함으로써, 및/또는 상기 설명된 것처럼, NSCLC 종양 세포들을 포함하는 생물학적 샘플에서 PDGFRα 활성의 저해를 조사함으로써 확인될 수 있다. 그런 스크리닝 방법들이 아래 더 설명된다.

퀴놀린(quinoline)과 퀴녹살린(quinoxaline) 화합물들, 및 1,3-다이아진(1,3-diazine) 화합물들과 같은, PDGFRα-저해 특성들을 가진 다른 소 분자들이 설명되었다. 예를 들어 U.S. Pat. Nos. 6,821,962; 6,696,434; 6,169,088 참조. PDGFRα의 적대자들(길항제들)을 동정하기 위한 방법들이 설명되었다. 예를 들어 U.S. Pat. No. 6,566,075, May 20, 2003, Escobedo et al 참조.

항체 저해제들.

본 발명의 방법들에 유용한 PDGFRα-저해 치료제들은 또한 중요한 촉매 또는 결합 부위들 또는 PDGFRα 활성을 위해 요구된 도메인들(domains)에 특이적으로 결합하는 표적 항체들이 있으며, 그것들은 기질들 또는 2차적 분자들의 PDGFRα로의 접근을 차단함에 의해 및/또는 효소가 그것의 활성을 위해 필요한 형태를 선택하는 것을 방해함에 의해 키나아제를 저해한다. 인간다운(humanized) 표적-특이적 항체들의 생산, 스크리닝, 및 치료적 사용은 잘 설명되었다. Merluzzi et al., Adv Clin Path. 4(2): 77-85(2000) 참조. 인간다운 표적-특이적 저해 항체들의 초고속 제네레이션(high-throughput generation) 및 스크리닝을 위한, Morphosys, Inc.'s Human Combinatorial Antibody Library(HuCAL®)와 같은 상업적인 과학기술들과 시스템들이 이용가능하다.

다양한 안티-수용체 키나아제 표적 항체들의 생산과 표적 수용체의 활성을 저해하기 위한 그것들의 사용은 설명되었다. 예를 들어 U.S. Patent Publication No. 20040202655, "Antibodies to IGF-I Receptor for the Treatment of Cancers," Oct. 14, 2004, Morton et al.; U.S. Patent Publication No. 20040086503, "Human anti-Epidermal Growth Factor Receptor Single-Chain Antibodies," Apr. 15, 2004, Raisch et al.; U.S. Patent Publication No. 20040033543, "Treatment of Renal Carcinoma Using Antibodies Against the EGFr," Feb. 19, 2004, Schwab et. al 참조. 수용체 티로신 키나아제 활성-저해 항체들을 생산하고 사용하기 위한 표준화된 방법들이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, European Patent No. EP1423428, "Antibodies that Block Receptor Tyrosine Kinase Activation, Methods of Screening for and Uses Thereof," Jun. 2, 2004, Borges et al 참조.

파지 발현 연구들(Phage display approaches)은 또한 PDGFRα-특이적 항체 저해제들을 생성하기 위해 채용될 수 있으며, 재조합항체들의 박테리오파지 라이브러리 건설 및 선택을 위한 프로토콜들이 잘 알려진 참조문헌 CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Colligan et al.(Eds.), John Wiley &Sons, Inc.(1992-2000), Chapter 17, Section 17.1.에서 제공된다. 또한 U.S. Pat. No. 6,319,690, Nov. 20, 2001, Little et al.; U.S. Pat. No. 6,300,064, Oct. 9, 2001, Knappik et al.; U.S. Pat. No. 5,840,479, Nov. 24, 1998, Little et al.; U.S. Patent Publication No. 20030219839, Nov. 27, 2003, Bowdish et al 참조.

박테리오파지들의 표면에 드러난 항체 조각들의 라이브러리가 생산될 수 있으며(예를 들어 U.S. Pat. No. 6,300,064, Oct. 9, 2001, Knappik et al. 참조) 수용체 단백질 티로신 키나아제의 가용성 이합체 형태(dimeric form)에 결합하는 것에 대해 스크린 될 수 있다. 스크리닝을 위해 사용된 RTK의 가용성 이합체 형태에 결합하는 항체 조각은 세포에서 표적 RTK의 지속적인 활성화를 차단하기 위한 후보 분자로서 동정된다. European Patent No. EP1423428, Borges et al., supra 참조.

상기 설명된 항체 라이브러리들의 스크리닝에서 동정된 PDGFRα-결합 표적 항체들은 이후 시험관 내에서 키나아제 에세이 및 생체 내에서 셀 라인들 및/또는 종양들 둘 다에서 PDGFRα의 활성을 차단하는 그것들의 능력에 대하여 더 스크린 될 수 있다. PDGFRα 저해는 예를 들면, 키나아제들의 패널(panel)에서 PDGFRα 활성, 다른 키나아제 활성은 아닌, 을 저해하는 그런 항체 치료제의 능력을 조사함으로써, 및/또는 상기 설명된 것처럼 NSCLC 종양 세포들을 포함하는 생물학적 샘플에서 PDGFRα 활성의 저해를 조사함으로써 확인될 수 있다. PDGFRα 저해를 위한 그런 화합물들을 스크리닝하기 위한 방법들이 아래 더 설명된다.

간접적인 저해제들.

설명된 방법들의 실시에 유용한 PDGFRα-저해 화합물들은 또한 PDGFRα 그 자체 외의 단백질들 또는 분자들의 활성을 저해시킴에 의해 PDGFRα 활성을 간접적으로 저해하는 화합물들일 수 있다. 그런 저해 치료제들은 PDGFRα 그 자체를 인산화 또는 탈-인산화(따라서 활성화 또는 비활성화)하는 중요한 조절하는 키나아제들의 활성을 조정하는 표적 저해제들일 수 있다. 다른 수용체 티로신 키나아제들과 함께하는 것처럼, PDGFRα는 어댑터(adaptor) 단백질들 및 하향 키나아제들의 네트워크를 통한 하향 신호전달을 조절한다. 결과적으로, PDGFRα 활성에 의한 세포 성장과 생존의 유발은 이런 서로작용하는 또는 하향 단백질들을 표적으로 함으로써 저해될 수 있다. 이런 방법에 사용될 수 있는 최근에 개발된 의약들은 AKT 저해제들(RX-0201) 및 mTOR 저해제들(CC1-779와 같은 rapamycin 및 그것의 유사체들, Rapamune 및 RAD001)을 포함한다.

PDGFRα 활성은 또한 그것의 활성 형태를 선택하기 위해 PDGFRα가 필요한, PDGF A 또는 B와 같은 활성화 분자의 결합을 저해하는 화합물을 사용하여 간접적으로 저해될 수 있다. 예를 들면, 안티-PDGF 항체들의 생산 및 사용이 설명되었다. U.S. Patent Publication No. 20030219839, "Anti-PDGF Antibodies and Methods for Producing Engineered Antibodies," Bowdish et al 참조. PDGFRα에 결합하는 PDGF의 저해는 PDGFRα 활성을 직접적으로 하향-조절한다(down-regulates).

PDGFRα 활성의 간접적 저해제들은 PDGFRα 3-차원 구조의 X-선 결정법 또는 컴퓨터 모델링을 사용하여 합리적으로 디자인될 수 있으며, 또는 중요한 상향 조절 효소들 및/또는, PDGFRα의 저해를 가져오는, 필수적인 결합 분자들에 대한 화합물 라이브러리들의 초고속 스크리닝에 의해 발견될 수 있다. 그런 연구들은 당업계에 잘 알려져 있고 설명되었다. 그런 치료제들에 의한 PDGFRα 저해는 예를 들면, 키나아제들의 패널(panel)에서 다른 키나아제 활성은 아닌 PDGFRα 활성을 저해하는 화합물의 능력을 조사함으로써, 및/또는 상기 설명된 것처럼 NSCLC 종양 세포들을 포함하는 생물학적 샘플에서 PDGFRα 활성의 저해를 조사함으로써 확인될 수 있다. NSCLC 종양들에서 PDGFRα 활성을 저해하는 화합물들을 동정하기 위한 방법들은 아래 더 설명된다.

안티 -센스 및/또는 전사 저해제들.

PDGFRα-저해 치료제들은 또한 PDGFRα을 인코딩하는 유전자의 전사를 차단함에 의해 PDGFRα 활성을 저해하는 안티-센스 및/또는 전사 저해 화합물들을 포함할 수 있다. 암의 치료를 위한 안티센스 치료제들에 의한, VEGFR, EGFR, 및 IGFR를 포함하는 다양한 수용체 키나아제들, 및 FGFR의 저해는 설명되었다. 예를 들어, U.S. Pat. Nos. 6,734,017; 6,710,174, 6,617,162; 6,340,674; 5,783,683; 5,610,288 참조.

안티센스 올리고뉴클레오티드들이 알려진 기술들에 따라 표적 유전자들에 대항하는 치료적 제제들로서 디자인, 건설, 및 채용될 수 있다. 예를 들어 Cohen, J., Trends in Pharmacol. Sci. 10(11): 435-437(1989); Marcus-Sekura, Anal. Biochem. 172: 289-295(1988); Weintraub, H., Sci. AM. pp. 40-46(1990); Van Der Krol et al., BioTechniques 6(10): 958-976(1988); Skorski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1994) 91: 4504-4508 참조. 생체 내에서 EGFR의 안티센스 RNA 저해제를 사용하여 인간 악성종양(carcinoma) 성장의 저해가 최근에 설명되었다. U.S. Patent Publication No. 20040047847, "Inhibition of Human Squamous Cell Carcinoma Growth In vivo by Epidermal Growth Factor Receptor Antisense RNA Transcribed from a Pol III Promoter," Mar. 11, 2004, He et al 참조. 비슷하게, 포유류 PDGFRα 유전자에 대항하는 적어도 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 PDGFRα-소 분자 저해제는 상기 설명된 방법들에 따라 준비될 수 있다. PDGFRα-저해 안티센스 화합물들을 포함하는 약제학적 조성물들은 아래 더 설명된 것처럼 준비되고 투여될 수 있다.

작은 간섭 RNA ( Small Interfering RNA ).

번역(translation)을 방해하고, 따라서 RNA 간섭의 진행을 통하여 PDGFRα의 활성을 방해하는 작은 간섭 RNA 분자(siRNA) 조성물들은 또한 본 발명의 방법들에서 바람직하게 채용될 수 있다. RNA 간섭 및 표적 단백질을 인코딩하는 mRNA에 상보적인 서열을 포함하는 외인성(exogenous) 작은 이중-가닥 RNA 분자들의 도입에 의해 표적 단백질 발현의 선택적인 침묵(silencing)이 잘 설명되었다. 예를 들어 U.S. Patent Publication No. 20040038921, "Composition and Method for Inhibiting Expression of a Target Gene," Feb. 26, 2004, Kreutzer et al.; U.S. Patent Publication No. 20020086356, "RNA Sequence-Specific Mediators of RNA Interference," Jun. 12, 2003, Tuschl et al.; U.S. Patent Publication 20040229266, "RNA Interference Mediating Small RNA Molecules," Nov. 18, 2004, Tuschl et. al 참조.

이중-가닥 RNA 분자들(dsRNA)은 RNA 간섭(RNAi)으로 알려진 고도로 보존된 조절 메카니즘에서 유전자 발현을 차단하는 것으로 보여졌다. 간결하게, 그 RNAse III Dicer는 dsRNA를 대략 22 뉴클레오티드들의 작은 간섭 RNA들(siRNA)로 진행시키는데, 그것은 RNA-유발 침묵 복합체 RISC에 의해 표적-특이적 mRNA 절단을 유발하는 안내 서열들로서 작용한다(Hammond et al., Nature(2000) 404: 293-296 참조). RNAi는 새로운 siRNA들이 보다 긴 dsRNA의 연속적인 절단을 통해 형성되는 촉매-형 반응을 포함한다. 그러므로, 안티센스와 달리, RNAi는 비-화학량적 방법(non-stoichiometric manner)으로 표적 RNA를 퇴화시킨다. 세포 또는 기관에 투여되었을 때, 외인성 dsRNA는 RNAi를 통해 내인성(endogenous) 메신저 RNA(mRNA)의 서열-특이적 퇴화를 나타내는 것으로 보여졌다.

포유류 세포들에서 그것들의 발현 및 사용을 위한 벡터들과 시스템들을 포함하는 아주 다양한 표적-특이적 siRNA 생산물들은 이제 상업적으로 구입할 수 있다. 예를 들어 Promega, Inc.(www.promega.com); Dharmacon, Inc.(www.dharmacon.com) 참조. RNAi를 위한 dsRNA의 디자인, 건설, 및 사용에 대한 상세한 기술적 매뉴얼들이 이용할 수 있다. 예를 들어 Dharmacon's "RNAi Technical Reference &Application Guide"; Promega's "RNAi: A Guide to Gene Silencing 참조. PDGFRα-저해 siRNA 생산물들은 또한 상업적으로 구입할 수 있으며, 본 발명의 방법에 알맞게 채용될 수 있다. 예를 들어 Dharmacon, Inc., Lafayette, Colo.(Cat Nos. M-003162-03, MU-003162-03, D-003162-07 thru -10(siGENOME.TM. SMARTselection and SMARTpool.RTM. siRNAs) 참조.

실질적으로 표적 mRNA 서열의 일부분과 동일한 적어도 하나의 서열을 포함하는, 바람직하게는 19-25 뉴클레오티드들, 그리고 dsRNA가 한쪽 끝에 1-4 뉴클레오티드들의 적어도 하나의 오버행(overhang)을 최적으로 가지는 길이에 있어 49 뉴클레오티드들 미만의 작은 dsRNA가 포유류들에서 RNAi를 중재(mediating)하는데 가장 효과적이라는 것이 최근에 확립되었다. U.S. Patent Publication No. 20040038921, Kreutzer et al., supra; U.S. Patent Publication No. 20040229266, Tuschl et al., supra 참조. 그런 dsRNA의 건설, 및 생체 내에서 표적 단백질의 발현을 침묵시키기 위한 약제학적 준비들에 있어서의 그것들의 사용이 그런 간행물들에 자세하게 설명되어 진다.

만약 포유류에서 표적되어진 유전자의 서열이 알려진다면, 예를 들어 21-23 nt RNAi가 생산될 수 있으며 인간 또는 다른 영장류(primate) 세포와 같은 포유류 세포에서 RNAi를 중재할 수 있는 그것들의 능력이 시험될 수 있다. RNAi를 중재하는 것으로 보여지는 그런 21-23 nt RNA 분자들은 의도된다면, 생체 내에서 그것들의 효율성을 더 평가하기 위해 적당한 동물 모델에서 시험될 수 있다. 알려진 표적 부위들, 예를 들어 다른 핵산 분자들, 예를 들어 리보자임들 또는 안티센스와 함께한 연구들에 기초하여 효과적인 표적부위들이라고 결정된 표적부위들, 또는 변형들(mutations) 또는 결손들(deletions)을 포함하는 부위들과 같은 질병 또는 조건과 관계되는 것으로 알려진 그런 표적들이 마찬가지로 그런 부위들을 표적으로 하는 siRNA 분자들을 디자인하기 위해 사용될 수 있다.

그 대신으로, 효과적인 dsRNA의 서열들은 예를 들어 컴퓨터 폴딩 알고리즘(computer folding algorithm)을 사용함에 의해, 표적부위들에 대해 관심있는 표적 mRNA를 스크리닝하여 합리적으로 디자인/예측될 수 있다. 그 표적 서열은 custom Perl script 또는 Oligo, MacVector, 또는 GCG Wisconsin Package와 같은 상업적 서열 분석 프로그램들을 사용하여, 특정한 길이, 예를 들어 23 뉴클레오티드 조각들의 모든 조각들 또는 서브서열들의 리스트로 인 실리코(in silico) 분석될 수 있다.

다양한 변수들이 어느 부위들이 표적 RNA 서열 안에서 가장 적합한 표적 부위들인지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이런 변수들은 이에 제한되지는 않지만, 2차 또는 3차 RNA 구조, 표적서열의 뉴클레오티드 염기 조성물, 표적 서열의 다양한 지역들 사이의 상동의 정도, 또는 RNA 전사체 안에서 표적 서열의 상대적인 위치를 포함한다. 이런 결정들에 기초하여, RNA 전사체 안에 있는 표적 부위들의 임의의 수가 예를 들어 시험관 내에서 RNA 절단 에세이들, 세포 배양, 또는 동물 모델들을 사용함으로써, 유효성에 대해 siRNA 분자들을 스크린하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, U.S. Patent Publication No. 20030170891, Sep. 11, 2003, McSwiggen J 참조. RNAi 표적 부위들을 동정하고 선택하기 위한 알고리즘이 또한 최근에 설명되었다. U.S. Patent Publication No. 20040236517, "Selection of Target Sites for Antisense Attack of RNA," Nov. 25, 2004, Drlica et al 참조.

일반적으로 사용된 유전자 전달 기술들은 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 전기천공법(electroporation) 및 미세주입법(microinjection) 및 바이러스성 방법들을 포함한다(Graham et al.(1973) Virol. 52: 456; McCutchan et al.,(1968), J. Natl. Cancer Inst. 41: 351; Chu et al.(1987), Nucl. Acids Res. 15: 1311; Fraley et al.(1980), J. Biol. Chem. 255: 10431; Capecchi(1980), Cell 22: 479). DNA는 또한 양이온성 리포좀들(cationic liposomes)을 사용하여 세포들로 도입될 수 있다(Feigner et al.(1987), Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 7413). 상업적으로 이용가능한 양이온성 지질 제제형들(formulations)은 Tfx 50(Promega) 또는 Lipofectamin 200(Life Technologies)를 포함한다. 그 대신으로, 바이러스성 벡터들이 dsRNA를 세포로 전달하고 RNAi를 중재하기 위해 채용될 수 있다. U.S Patent Publication No. 20040023390, "siRNA-mediated Gene Silencing with Viral Vectors," Feb. 4, 2004, Davidson et al 참조.

포유류 세포들에서 RNAi를 위한 트렌스펙션(transfection) 및 벡터/발현 시스템들은 상업적으로 이용가능하고 잘 설명되었다. 예를 들어 Dharmacon, Inc., DharmaFECT^TM system; Promega, Inc., siSTRIKE^TM U6 Hairpin system 참조; 또한 Gou et al.(2003) FEBS. 548, 113-118; Sui, G. et al. A DNA vactor-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 5515-5520; Yu et al.(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 6047-6052; Paul, C. et al.(2002) Nature Biotechnology 19, 505-508; McManus et al.(2002) RNA 8, 842-850 참조.

준비된 dsRNA 분자들을 사용하는 포유류에서 siRNA 간섭은 이후 dsRNA를 포함하는 약제학적 조제약(preparation)을 그 포유류에 투여함에 의해 성취될 수 있다. 약제학적 조성물은 표적 유전자의 발현을 저해하기에 충분한 투약량으로 투여된다. dsRNA는 전형적으로 하루마다 체중 1킬로그램당 dsRNA 5 mg 미만의 투약량으로 투여될 수 있으며, 그것은 표적 유전자의 발현을 저해하거나 완전히 억압하기에 충분하다. 일반적으로, dsRNA의 적합한 투약량은 하루마다 수취인(recipient)의 체중 1 킬로그램당 0.01 내지 2.5 mg의 범위, 바람직하게는 하루마다 체중 1킬로그램당 0.1 내지 200 마이크로그램의 범위, 보다 바람직하게는 하루마다 체중 1킬로그램당 0.1 내지 100 마이크로그램의 범위, 훨씬 더 바람직하게는 하루마다 체중 1킬로그램당 0.1 내지 50 마이크로그램의 범위, 그리고 가장 바람직하게는 하루마다 체중 1킬로그램당 0.1 내지 25 마이크로그램의 범위일 것이다. dsRNA를 포함하는 약제학적 조성물은 하루에 한번, 또는, 예를 들면, 당업계에 잘 알려진 지속된 방출 체계들을 이용하여 멀티플 서브-도우즈(multiple sub-doses)로 투여된다. 그런 약제학적 조성물들의 준비 및 투여는 아래 더 설명된 것과 같은 표준 기술들에 따라서 수행될 수 있다.

그런 dsRNA는 이후 상기 설명된 것처럼, 그런 dsRNA의 치료학적으로 유효한 양을 포함하는 약제학적 조제약을 준비하고, PDGFRα-활성화된 NSCLC 종양을 가지는 인간 서브젝트에 예를 들면, 종양으로의 직접적인 주입을 통해, 그 조제약을 투여함에 의해 NSCLC 종양에서 PDGFRα 발현 및 활성을 저해하기 위해 사용될 수 있다. siRNA 저해제들을 사용하여 VEGFR 및 EGFR와 같은 다른 수용체 티로신 키나아제들의 비슷한 저해가 최근에 설명되어 졌다. U.S. Patent Publication No. 20040209832, Oct. 21, 2004, McSwiggen et al.; U.S. Patent Publication No. 20030170891, Sep. 11, 2003, McSwiggen; U.S. Patent Publication No. 20040175703, Sep. 9, 2004, Kreutzer et al 참조.

치료제 조성물들; 투여

본 발명의 방법들의 실시에 유용한 PDGFRα-저해 치료제 조성물들은 여기에 한정되지는 않으나, 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 복막강내(intraperitoneal), 피하(subcutaneous), 경피(transdermal), 기도(airway)(에어로졸), 직장(rectal), 질(vaginal) 및 국소적(topical)(입(buccal) 및 혀밑(sublingual)을 포함하는) 투여를 포함하는, 구강 또는 복막 경로들을 포함하는 당업계에 알려진 임의의 방법들에 의해 포유류에 투여될 수 있다.

구강 투여를 위해, PDGFRα-저해 치료제는 일반적으로 정제들(tablets) 또는 캡술들(capsules)의 형태로, 가루 또는 미립자들로, 또는 수용액 또는 현탁액으로 제공될 것이다. 구강 사용을 위한 정제들은 불활성 희석제들, 붕해제들(disintegrating agents), 결합 제제들, 윤활제들, 감미제들, 착향제들(flavoring agents), 착색제들 및 방부제들과 같은 약제학적으로 허용될 수 있는 부형제들과 혼합된 활성 성분들을 포함할 수 있다. 적당한 불활성 희석제들은 소듐 및 칼슘 카보네이트, 소듐 및 칼슘 포스페이트, 및 락토오스를 포함하며, 반면에 옥수수 전분 및 알긴산(alginic acid)은 적합한 붕해제들이다. 결합 제제들은 전분 및 젤라틴을 포함할 수 있으며, 반면에 윤활제는 만약 존재한다면, 일반적으로 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산(stearic acid) 또는 탤크(talc)일 것이다. 의도된다면, 그 정제들은 위장관(gastrointestinal tract)에서의 흡수를 지연시키기 위해서 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 물질들로 코팅될 수 있다.

구강 사용을 위한 캡슐들은 활성 성분이 고체 희석제와 혼합되어 있는 하드 젤라틴 캡슐들, 및 활성 성분이 물 또는 피너트 오일(peanut oil), 액체 파라핀 또는 올리브 오일과 같은 오일과 혼합된 소프트 젤라틴 캡슐들을 포함한다. 근육내, 복막강내, 피하 및 정맥내 사용을 위해, 본 발명의 약제학적 조성물들은 일반적으로, 적절한 pH 및 등장(isotonicity)으로 버퍼된, 스터릴(sterile) 수용액들 또는 현탁액들로 제공될 수 있다. 적합한 수용성 운반체들은 링거액 및 등장 소듐 클로라이드를 포함한다. 그 운반체는 배타적으로 수용성 버퍼로 구성된다("배타적으로"는 PDGFRα-저해 치료제의 업테이크(uptake)에 영향을 미치거나 중재하는 어떠한 보조제(auxiliary agents) 또는 동봉하는 물질(encapsulating substances)도 존재하지 않음을 의미한다). 그런 물질들은 예를 들면, 아래 설명된 것처럼, 리포좀들 또는 캡시드들(capsids)과 같은 교질입자(micellar) 구조들을 포함한다. 수용성 현탁액들은 셀룰로오스 유도체들, 소듐 알지네이트(sodium alginate), 폴리비닐-피롤리돈 및 트래거캔스 고무(gum tragacanth)와 같은 현탁화제(suspending agents), 및 레시틴(lecithin)과 같은 적심제(wetting agent)를 포함할 수 있다. 수용성 현탁액들에 적합한 방부제들은 에틸 및 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트를 포함한다.

PDGFRα-저해 치료제 조성물들은 또한 임플란트들(implants) 및 미세동봉된 전달 시스템들(microencapsulated delivery systems)를 포함하는 조절된 방출 제제형(controlled release formulation)처럼, 몸체로부터의 급속한 제거에 대항하여 치료제(예를 들어 dsRNA 화합물)를 보호하기 위한 동봉된 제제형들(encapsulated formulations)을 포함할 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드들, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스터들, 및 폴리젖산(polylactic acid)와 같은 생물 분해성, 생체 적합성 폴리머들이 사용될 수 있다. 그런 체계들의 준비를 위한 방법들은 당업자에게 자명할 것이다. 그 물질들은 또한 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc로부터 상업적으로 얻어질 수 있다. 리포좀 현탁액들은(모노클로날 항체들을 가지는 바이러스성 항원들에 감염된 세포들을 표적으로 한 리포좀들을 포함하는) 또한 약제학적으로 허용될 수 있는 운반체들로 사용될 수 있다. 이것들은 예를 들면, U.S. Pat. No. 4,522,811; PCT publication WO 91/06309; 및 European patent publication EP-A-43075에 설명된 것과 같은, 당업자에게 알려진 방법들에 따라 준비될 수 있다. 동봉된 제제형은 바이러스성 코트(coat) 단백질을 포함할 수 있다. 그 바이러스성 코트 단백질은 폴리오마(polyoma) 바이러스와 같은 바이러스로부터 유래되거나 또는 그것과 결합될 수 있으며, 또는 그것은 부분적으로 또는 전체적으로 인공물일 수 있다. 예를 들면, 그 코트 단백질은 폴리오마 바이러스의 Virus Protein 1 및/또는 Virus Protein 2, 또는 그것들의 유도체일 수 있다.

PDGFRα-저해 조성물들은 또한 서브젝트에 투여를 위한 리포좀들을 포함하는 전달 운반체, 캐리어들 및 희석제들 및 그것들의 염들을 포함할 수 있으며, 및/또는 약제학적으로 허용될 수 있는 제제형(formulation)들에 존재할 수 있다. 예를 들면, 핵산 분자들의 전달을 위한 방법들은 Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; DELIVERY STRATEGIES FOR ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE THERAPEUTICS, ed. Akbtar, 1995, Maurer et al., 1999, Mol. Membr. Biol., 16, 129-140; Hofland and Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol., 137, 165-192; and Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192에서 설명되어 있다. Beigelman et al., U.S. Pat. No. 6,395,713 and Sullivan et al., PCT WO 94/02595는 핵산 분자들의 전달을 위한 일반적인 방법들을 더 설명한다. 이런 프로토콜들이 사실상 임의의 핵산 분자의 전달을 위해 이용될 수 있다.

PDGFRα-저해 치료제들은 이에 제한되지는 않지만, 리포좀들 안에 동봉, 이온도입법에 의함, 또는 하이드로겔(hydrogels), 사이클로덱스트린(cyclodextrins), 생분해성 나노캡슐(biodegradable nanocapsules), 및 바이오어드헤시브 마이크로스피어(bioadhesive microspheres)와 같은 다른 운반체들에 혼입함에 의함, 또는 단백질 벡터들(proteinaceous vectors)에 의함을 포함하는 당업자에게 알려진 다양한 방법들에 의해 포유류 종양에 투여될 수 있다(O'Hare 및 Normand, International PCT Publication No. WO 00/53722). 그 대신으로, 그 치료제/운반체 조합은 직접적인 주입에 의해 또는 주입 펌프의 사용에 의해 국지적으로 전달된다. 그 조성물의 직접적인 주입은 피하, 근육내, 또는 피부내로 든지, 표준 침 또는 주사기 방법론들을 사용하여, 또는 Conry et al., 1999, Clin. Cancer Res., 5, 2330-2337 및 Barry et al., International PCT Publication No. WO 99/31262에 설명된 것들과 같은 무-침 기술들(needle-free technologies)에 의해 이루어질 수 있다.

PDGFRα-저해 치료제들의 약제학적으로 허용될 수 있는 제제형들은 상기 설명된 화합물들의 염들, 예를 들어, 산 첨가 염들, 예를 들면, 염산, 브롬화수소산, 아세트산, 및 벤젠 술폰산의 염들을 포함한다. 약학적 조성물 또는 제제형은 투여 예를 들어, 예를 들면 인간을 포함하는, 세포 또는 환자로의 조직에 투여에 적합한 형태로 있는 조성물 또는 제제형을 말한다. 적합한 형태들은 부분적으로 사용 또는 도입 경로, 예를 들면, 구강, 경비, 또는 주입에 의존한다. 그런 형태들은 그 조성물 또는 제제형이 표적 세포에 닿는 것을 방해하지 않아야 한다. 예를 들면, 혈류로 주입된 약학적 조성물들은 가용성이어야 한다. 다른 인자들은 당업계에 알려져 있으며, 그 조성물 또는 제제형이 그것의 효과를 발휘하는 것을 방해하는 독성 및 형태들과 같은 고려들을 포함한다.

조직의 흡수(즉 혈류에서 의약들의 조직의 흡수 또는 축적에 잇달아 몸 전체에 걸친 분배)를 이끄는 투여 경로들이 바람직하고 그것은 제한없이: 정맥내, 피하, 복막강내, 흡입, 구강, 폐내 및 근육내를 포함한다. 이런 투여 경로들의 각각은 접근할 수 있는 병 걸린 조직 또는 종양에 PDGFRα-저해 치료제를 접하게 한다. 순환기로의 약물의 도입율은 분자의 무게 또는 크기의 기능임이 보여졌다. 본 즉각적인 발명의 화합물들을 포함하는 리포좀 또는 다른 약물 캐리어의 사용은 그 약물을 잠재적으로 한 지역에, 예를 들면, 망상 내피 시스템(reticular endothelial system)(RES)의 조직과 같은 특정한 조직 형태들에 국한시킬 수 있다. 림프구들 및 대식세포들과 같은, 약물과 세포들의 표면과의 관계를 촉진할 수 있는 리포좀 제제형이 또한 유용하다. 이런 연구는 암 세포들과 같은 비정상 세포들의 대식세포 및 림프구 면역 인식의 특이성을 이용하여 약물의 표적세포로의 증진된 전달을 제공할 수 있다.

"약제학적으로 허용될 수 있는 제제형"는 그것들의 의도된 활성을 위해 가장 적합한 물리적인 위치에서 본 즉각적인 발명의 핵산 분자들의 효과적인 분배를 허용하는 조성물 또는 제제형으로 여겨진다. 본 즉각적인 발명의 핵산분자들과의 제제형을 위해 적합한 제제들의 제한없는 예들은 다음을 포함한다: 약물의 CNS로의 도입을 증진시킬 수 있는 P-글리코단백질 저해제들(Pluronic P85와 같은)(Jolliet-Riant 및 Tillement, 1999, Fundam. Clin. Pharmacol., 13, 16-26); 뇌내주입(intracerebral implantation) 후에 지속적인 방출 전달을 위한 폴리(DL-락타이드-코글리코라이드) 마이크로스피어들과 같은 생물 분해성 폴리머들(Emerich et al, 1999, Cell Transplant, 8, 47-58)(Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.); 및 약물들을 뇌혈관장벽을 가로질러 전달할 수 있고 뉴런의 업테이크 메카니즘들(neuronal uptake mechanisms)을 바꿀 수 있는, 폴리부틸시아노아크릴레이트로 만들어진 것들과 같은 적재된 나노입자들(Prog Neuro-psychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999). 본 발명의 방법에 유용한 PDGFRα-저해 화합물들을 위한 전달 전략들의 다른 제한없는 예들은 Boado et al., 1998, J. Pharm. Sci., 87, 1308-1315; Tyler et al., 1999, FEBS Lett., 421, 280-284; Pardridge et al., 1995, PNAS USA., 92, 5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev., 15, 73-107; Aldrian-Herrada et al., 1998, Nucleic Acids Res., 26, 4910-4916; and Tyler et al., 1999, PNAS USA., 96, 7053-7058에 설명된 물질을 포함한다.

폴리(에틸렌 글리콜) 지질들(PEG-개질된, 또는 장기-순환 리포좀들(long-circulating liposomes) 또는 스텔스 리포좀들(stealth liposomes))을 포함하는 표면-개질된 리포좀들을 포함하는 치료제 조성물들은 또한 본 발명의 방법들에 알맞게 채용될 수 있다. 이런 제제형들은 표적 조직에 약물들의 축적을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 약물 캐리어들의 이런 부류는 단핵 탐식계(mononuclear phagocytic system)(MPS 또는 RES)에 의한 옵소닌작용(opsonization) 및 제거(elimination)에 견디며, 그 때문에 그것은 더 긴 혈액순환 시간을 가능케 하고 동봉된 약물에 대한 조직 노출을 증진시킨다(Lasic et al. Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011). 그런 리포좀들은 아마도 그 신혈관형성된(neovascularized) 표적 조직들에서 삼출(extravasation) 및 포획(capture)에 의해 종양들에 선택적으로 축적됨이 보여졌다(Lasic et al., Science 1995, 267,1275-1276; Oku et al.,1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90). 장기-순환 리포좀들은 특히 MPS의 조직에 축적된 것으로 알려진 통상적인 양이온성 리포좀들에 비하여 DNA 및 RNA의 약물동태학(pharmacokinetics) 및 약효학(pharmacodynamics)을 증진시킨다(Liu et al., J. Biol. Chem. 1995, 42, 24864-24870; Choi et al., International PCT Publication No. WO 96/10391; Ansell et al., International PCT Publication No. WO 96/10390; Holland et al., International PCT Publication No. WO 96/10392). 장기-순환 리포좀들은 또한 간 및 비장과 같은 신진대사적으로 공격적인 MPS 조직들에의 축적을 피하는 그것들의 능력에 기초하여, 양이온성 리포좀들에 비하여 보다 큰 정도로 누클레아제 분해(nuclease degradation)로부터 약물들을 보호하기 쉽다.

치료제 조성물들은 약제학적으로 허용될 수 있는 캐리어 또는 희석제에 있는 의도된 화합물들의 약제학적으로 효과적인 양을 포함한다. 치료적 사용을 위해 허용가능한 캐리어들 또는 희석제들은 약제학적 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들면, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro edit. 1985)에 설명되어 있다. 예를 들면, 방부제들, 안정제들, 염료들 및 착향제들이 제공될 수 있다. 이것들은 소듐 벤조에이트, 소르브산(sorbic acid) 및 p-하이드록시벤조산의 에스터들을 포함한다. 게다가, 산화방지제들 및 현탁화제들(suspending agents)이 사용될 수 있다.

약제학적으로 효과적인 투약량은 발생의 방해, 억제, 또는 질병상태를 치료하기(어느 정도 증상을 완화시키는, 바람직하게는 증상들의 전부를 완화시키기) 위해 요구된 투약량이다. 약제학적으로 효과적인 투약량은 질병의 유형, 사용된 조성물, 투여 경로, 치료되는 포유류의 유형, 고려되는 특정한 포유류의 물리적인 특성들, 동시에 투약한 약물(concurrent medication), 및 의료계의 당업자들이 인식할 수 있는 다른 인자들에 의존한다. 일반적으로, 활성 성분들의 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg 체중/일 사이의 양이 음전하(negatively charged) 폴리머의 잠재력에 의존하여 투여된다.

하루마다 체중 1 킬로그램당 약 0.1 mg 내지 약 140 mg 정도의 투약 수준들이 상기 지시된 조건들의 치료에 유용하다(하루마다 환자당 약 0.5 mg 내지 약 7 g). 단일 투약 형태를 생산하기 위해 캐리어 물질들과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 호스트(host) 및 투여의 특정한 모드(mode)에 따라 다르다. 투약 유닛 형태들은 일반적으로 활성 성분의 약 1 mg 내지 약 500 mg 사이를 포함한다. 임의의 특정한 환자에 대한 특정한 투약량 수준은 채용된 특정한 화합물의 활성, 나이, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이요법, 투약 시간, 투여 경로, 및 배설 속도, 약물 조합 및 치료중인 특정한 질병의 중대성을 포함한 다양한 인자들에 의존한다는 점이 이해된다.

비-인간 동물들에의 투여를 위해, 그 조성물은 또한 동물 사료 또는 음료수에 첨가될 수 있다. 그 동물이 그것의 음식물과 함께 그 조성물의 치료학적으로 적당한 양을 섭취하도록 동물 사료 및 음료수 조성물들을 체계화하는 것이 편리할 수 있다. 또한 사료 또는 음료수에 첨가를 위해 미리 섞어놓은 것으로 조성물을 놓아두는 것이 편리할 수 있다.

본 발명의 실시에 유용한 PDGFRα-저해 치료제는 상기 설명된 것처럼 단일 화합물, 또는 다수의 화합물들, 같은 부류의 저해제(즉 항체 저해제)이든지, 또는 다른 부류들(즉 항체 저해제들 과 소-분자 저해제들)이든지, 의 조합을 포함할 수 있다. 화합물들의 그런 조합은 포유류에서 PDGFRα-발현 NSCLC 종양의 진행을 저해하는데 있어서 전체적인 치료 효과를 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 그 치료제 조성물은 단독의 STI-571(글리벡®)과 같은 소 분자 저해제, 또는 PDGFRα 활성을 표적으로 하는 다른 글리벡® 유사체들 및/또는, Tarceva^TM 또는 Iressa^TM과 같은 EGFR의 소 분자 저해제들과의 조합일 수 있다. 그 치료제 조성물은 또한 하나 또는 그 이상의 비-특이적 화학요법제제에 하나 또는 그 이상의 표적 저해제들을 첨가한 것을 포함할 수 있다. 그런 조합들이 많은 암들에서 상승작용의 종양 살상 효과를 제공한다는 것이 최근에 보여졌다. 생체 내에서 PDGFRα 활성 및 NSCLC 종양 성장을 저해하는 그런 조합들의 효용성은 아래 설명된 것처럼 평가될 수 있다.

PDGFR α-저해 화합물들의 동정.

본 발명은 또한 부분적으로 그 화합물이 NSCLC 종양에서 PDGFRα의 활성을 저해하는지를 결정함으로써, 한 화합물이 PDGFRα이 활성화되는 NSCLC 종양들의 서브셋에 속하는 포유류 NSCLC 종양의 진행을 저해하는지를 결정하기 위한 방법을 제공한다. 바람직한 일실시에서, PDGFRα의 활성의 저해는 NSCLC 종양으로부터의 세포들을 포함하는 생물학적 샘플을 조사함에 의해 결정된다. 또 다른 바람직한 실시예에서, PDGFRα의 활성의 저해는 적어도 하나의 PDGFRα 활성화 상태-특이적 시약을 사용하여 결정되며, 바람직한 일실시예에서, 그 활성화 상태-특이적 시약은 인산화-부위 특이적 항체이다.

시험된 화합물은 아래 설명된 것처럼 치료제 또는 조성물의 임의의 형태일 수 있다. 시험관 내 및 생체 내 둘 다에서 한 화합물의 효력을 평가하기 위한 방법들은 잘 확립되어있고 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, 하나의 조성물이 PDGFRα이 활성화되는 세포 또는 세포 추출물을 사용하여 시험관 내에서 PDGFRα를 저해하는 능력이 시험될 수 있다. 화합물들의 한 패널은 PDGFRα(EGFR 또는 PDGFRβ와 같은 다른 표적들과는 대조적으로)에 대한 그 화합물의 특이성을 시험하기 위해 채용될 수 있다.

시험관 내에서 PDGFRα 활성의 효과적인 저해제인 것으로 발견된 화합물은 이후, 예를 들면, 인간 PDGFRα-발현 NSCLC 종양들을 품고 있는 포유류 이종이식들을 사용하여, 생체 내에서, NSCLC 종양 성장을 저해하는 그것의 능력에 대하여 조사될 것이다. 이런 과정에서, PDGFRα에 의해 유도된 것으로 알려진 셀 라인들은 쥐에서 피하로 배치된다. 그 세포들은 이후 시각적으로 모니터될 수 있는 종양 덩어리로 자란다. 그 쥐는 이후 그 약물로 처리될 것이다. 종양 크기에 대한 약물 치료의 효과가 외부적으로 관찰될 수 있다. 그 쥐는 이후 희생되고 그 종양은 IHC 및 웨스턴 블롯에 의한 분석을 위해 제거되었다. 이런 방법으로, 그 약물의 효과들은 환자와 가장 가깝게 닮은 생물학적 세팅에서 관찰될 수 있다. 그 종양 세포들 또는 둘러싸고 있는 기질(stromal) 세포들에서 신호전달을 변화시키는 그 약물의 능력은 인산화-특이적 항체들과 함께한 분석에 의해 결정될 수 있다. 세포 사망 또는 세포 증식의 저해를 유발하는데 있어 그 약물의 유효성은 또한 절단된 캐스파제 3(caspase 3) 및 절단된 PARP와 같은 아폽토시스 특이적 표지들과 함께한 분석에 의해 관찰될 수 있다.

그런 화합물들의 독성 및 치료적 효력은 세포 배양액들 또는 실험적 동물들에서, 예를 들어, LD50(그 인구의 50%가 치사하는 투약량) 및 ED50(그 인구의 50%에서 치료학적으로 효과가 있는 투약량)을 결정하는, 표준 약제학적 과정들에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료적 효과들 사이의 투약량 비는 치료적 지표(index)이고 그것은 비율 LD50/ED50로서 표현될 수 있다. 높은 치료적 지표를 나타내는 화합물들이 바람직한다.

본 특허 또는 출원서는 적어도 하나의 컬러로 실행된 도면을 포함한다. 컬러 도면을 가진 본 특허 또는 특허 출원 공개의 복사본은 요구하고 필요한 비용을 지불하면 특허청에 의해 제공될 것이다.

도 1은 인간 PDGFRα(서열번호: 1)(SwissProt Accession No. P16234)의 아미노산 서열(1-문자 코드)이다.

도 2는 분류된 알려진/보고된 티로신(tyrosine) 인산화 부위들을 가진 인간 PDGFRα 키나아제의 도식적인 설명이다.

도 3은 인간 PDGFRα(Accession No. NM_006206)를 인코딩한 DNA 서열이다.

도 4는 PDGFRα에 대항하여 만들어진 다양한 항체들을 사용하여 인간 NSCLC 셀 라인들로부터 추출한 것들의 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)로 구성되어 있으며, 그것은 어떤 상업적으로 구입가능한 항체들이 사실 PDGFRα에 대하여 특이적이지 않다는 점을 설명한다.

도 5는 다른 안티-PDGFRα 항체들을 사용하여 세 개의 다른 셀 라인들로부터 추출한 것들의 두 개의 웨스턴 블롯 분석들로 구성되어 있으며, 그것은 어떤 상업적으로 구입가능한 항체들이 A549 세포들에서 PDGFRα을 틀리게 동정한다는 점을 설명한다.

도 6은 PDGFRα, 포스포-PDGFRα에 대항하여 및 하향 키나아제, 포스포-AKT에 대하여 만들어진 항체들을 사용하여 PDGFaa와 함께 유발된 두 개의 NSCLC 셀 라인들로부터 추출된 것들의 하나의 웨스턴 블롯 분석이며, 그것은 H1703 셀 라인이 PDGFaa에 의해 활성화될 수 있는 PDGFRα를 발현하고 반면에 A549 셀 라인은 그 수용체를 발현하지 않으며 PDGFaa에 반응하지 않는다는 점을 설명한다.

도 7은 PDGFRα에 대항하여 만들어진 두 개의 항체들과 함께 동정된 H1703 이종이식 샘플들의 하나의 IHC 분석이다. 그 결과는 상업적인 항체들 중의 하나가, 그 셀 라인들 위의 그 웨스턴 결과들과 일치하는, 이종이식들에서 비-특이적 스테이닝(staining)을 동정한다는 점을 설명한다.

도 8은 NSCLC 셀 라인들에서 세포 성장 및 셀 아폽토시스(cell apoptosis)에 글리벡처리의 효과를 표현한다. 패널 A는 H1703 셀 라인이 글리벡®에 민감하다는 것을 설명하는 글리벡®의 농도 증가와 함께 네 개의 셀 라인들에 대한 성장 곡선들을 표현한다. 패널 B는 글리벡®이 PARP의 절단에 의해 나타난 것처럼 H1703 셀 라인에서 아폽토시스를 유발한다는 점을 설명하는 웨스턴 블롯 결과들을 표현한다. 패널 C는 아폽토시스가 갈라진 캐스파제-3의 존재하에 유세포 분석법을 사용하여 결정된 것처럼 글리벡®의 투여(administration)에 의해 H1703 세포들에서 유발된다는 점을 보여주는 막대 그래프이다.

도 9는 EGF, 글리벡® 및 Iressa®와 함께 처리된 H1703 세포들로부터 추출된 것들의 웨스턴 블롯 분석이다. 그 결과는 그 셀 라인이 AKT 활성화를 이끄는 본질적으로 활성화된 PDGFRα를 가지고 이런 활성화가 Iressa®에 의해서가 아니라 글리벡®에 의해서 저해될 수 있다는 점을 설명한다.

도 10은, 쥐들에서, 글리벡®에 의한 PDGFRα-발현 NSCLC 종양 이종이식들의 저해를 표현한다. 패널 A는 이런 PDGFRα 저해제와 함께 처리된 쥐들에서 종양 부피에 있어서의 감소를 보여주는 그래프이다. 패널 B는 글리벡®으로의 그 이종이식의 노출이 PDGFRα 인산화의 손실 및 총 AKT 수중들에서의 무 변화와 관계가 있다는 것을 설명하는 쥐 이종이식들로부터의 종양 세포 추출물들의 웨스턴 블롯 분석이다.

도 11은 글리벡에의 노출이 그 수용체의 총 수준을 변화시키지 않는 반면에 PDGFRα 및 AKT의 인산화에서의 상당한 감소를 가져오는 점을 설명하는 PDGFRα-지해제 글리벡®(STI-571)와 함께 처리된(panel B) 또는 처리되지 않은(panel A) 쥐 NSCLC 종양 이종이식들(PDGFRα를 발현하는)로부터의 세포들의 면역조직화학염색법(IHC) 분석이다.

다음의 실시예들은 단지 본 발명을 더 설명하기 위해 제공되며, 이에 대해 덧붙여진 청구항들에 제공된 것을 제외하고는, 그것의 내용을 제한하려는 의도는 없다. 본 발명은 당업자에게 명백한 여기 지시된 다양한 방법들의 변형들 및 변화 들을 포함한다.

실시예 1

글로벌 포스포펩타이드 프로파일링에 의한 NSCLC 셀 라인에서 PDGFR α-발현의 동정

네 개의 인간 NSCLC 셀 라인들, A549, H441, H1373, 및 H1703의 글로벌 인산화 프로파일들은 복잡한 혼합물들로부터 개질된 펩타이드들의 분리 및 질량 분석적 특성에 대하여 최근에 설명된 강력한 기술을 사용하여 조사되었다("IAP" 기술, Rush et al., supra 참조). 그 IAP 기술은 그 NSCLC 셀 라인들의 추출물들로부터 포스포티로신-함유 펩타이드들을 분리하고, 이후에 특성화하기 위해 포스포티로신-특이적 항체(CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly, Mass., 2003/04 Cat. #9411)를 사용하여 수행되었다.

트립틱(Tryptic) 포스포티로신-함유 펩타이드들은 다음과 같이, 상기 언급된 셀 라인들의 각각의 추출물들로부터 정제되고 분석되었다. 세포들은 10% 우태아혈청(fetal bovine serum) 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 DMEM 매질 또는 RPMI 1640 매질에서 배양되었다. 세포들은 저속 원심분리에 의해 수확(harvest)되었다. 매질의 완전한 흡인(aspiration) 후에 세포들은 1.25 x 10⁸ 세포들 마다 1 mL 라이시스 버퍼(lysis buffer)에 현탁되었고(2.5 mM 소듐 피로-포스페이트, 1 mM β-글리세롤-포스페이트으로 보충되거나 안 되고, 20 mM HEPES pH 8.0, 9 M 우레아, 1 mM 소듐 바나데이트) 초음파로 분해되었다.

초음파로 분해된 세포 라이세이트들은 20,000 x g에서 원심분리에 의해 맑게 되었고, 단백질들은 4.1 mM의 최종농도에서 DTT로 환원되었으며 8.3 mM에서 아이오도아세트아미드(iodoacetamide)로 알킬화되었다. 트립신으로의 소화를 위해, 단백질 추출물들은 20 mM HEPES pH 8.0에서 2 M 우레아의 최종농도로 희석되었고 가용성 TLCK-트립신(Worthington)이 10-20 ㎍/mL 첨가되었다. 소화는 실온에서 1-2일 동안 수행되었다.

트리플루오로아세트산(TFA)은 단백질 소화물들에 첨가되어 1% 의 최종농도가 되었다, 침전물은 원심분리로 제거되었으며, 소화물들은 0.1% TFA와 평형이 된 Sep-Pak C₁₈ 컬럼들(Waters)에 실려졌다. 0.7-1.0 ml의 컬럼 부피가 2 x 10⁸ 세포들마다 사용되었다. 컬럼들은 0.1% TFA 15 부피(volumes)로, 이후 0.1% TFA에서 5% 아세토니트릴(MeCN) 4 부피로 씻겨졌다. 펩타이드 프렉션 I 은 0.1% TFA에서 8, 12, 및 15% MeCN의 각각 2 부피로 컬럼들을 용리시킴(eluting)에 의해 얻어졌다. 프렉션들 II 및 III 는, 각각, 0.1% TFA에서 18, 22, 25% MeCN으로, 그리고 0.1% TFA에서 30, 35, 40% MeCN으로 컬럼들을 용리시킨 후의 용출액들(eluates)의 조합이었다. 모든 펩타이드 프렉션들은 냉동건조되었다.

2 x 10⁸ 세포들에 상응하는 각각의 프렉션으로부터의 펩타이드들은 IAP 버퍼 1 ml에 용해되었다(20 mM Tris/HCl 또는 50 mM MOPS pH 7.2, 10 mM 소듐 포스페이트, 50 mM NaCl) 그리고 불용성 물질(주로 펩타이드 프렉션들 III에서) 원심분리에 의해 제거되었다. IAP가 각각 펩타이드 프렉션에 독립적으로 수행되었다. 포스포티로신 모노클로날 항체 P-Tyr-100(Cell Signaling Technology, Inc., catalog number 9411)은 각각 단백질 G(Roche)에 4 mg/ml 비드들(beads)로 결합되었다. 고정된 항체(15 ㎕, 60 ㎍)는 IAP 버퍼에서 각각의 펩타이드 프렉션 1 ml에 1:1 슬러리로 첨가되었고, 그 혼합물은 4℃에서 부드럽게 회전시키면서 밤새도록(overnight) 배양되었다. 고정된 항체 비드들은 모두 4℃에서 1 ml IAP 버퍼로 3번 씻겨졌고 1 ml 물로 두 번 씻겨졌다. 펩타이드들은 실온에서 10분 동안 0.1% TFA 75 ㎕ 와 함께 배양함에 의해 비드들로부터 용리되었다.

그 대신으로, 하나의 단일 펩타이드 프렉션은 0.1% TFA 및 모든 용출액들의 조합에서 각각 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 및 40% 아세토니트릴 2 부피와 함께 용리함에 의해 Sep-Pak C18 컬럼들로부터 얻어졌다. 이런 펩타이드 프렉션에 IAP가 다음처럼 수행되었다: 냉동건조 후에, 펩타이드는 1.4 ml IAP 버퍼(MOPS pH 7.2, 10 mM 소듐 포스페이트, 50 mM NaCl)에 용해되었고 불용성 물질은 원심분리에 의해 제거되었다. 고정된 항체(40 ㎕, 160 ㎍)는 IAP 버퍼에서 1:1 슬러리로 첨가되었고, 그 혼합물은 4℃에서 부드럽게 흔들면서 밤새도록(overnight) 배양되었다. 그 고정된 항체 비드들은 모두 4℃에서 1 ml IAP 버퍼로 3번 씻겨졌고 1 ml 물로 두 번 씻겨졌다. 펩타이드들은 실온에서 10분 동안 0.15% TFA 55 ㎕ 와 함께 배양함에 의해 비드들로부터 용리되었고(용출액 1), 이후 0.15% TFA 45 ㎕ 로 그 비드들이 씻겨졌다(용출액 2). 두 개의 용출액들이 조합되었다.

LC - MS / MS 질량 분석기에 의한 분석.

IAP 용출액 40 ㎕ 또는 그 이상이 0.2 ㎕ StageTips 또는 Zip Tips에 의해 정제되었다. 펩타이드들은 40% MeCN 1 ㎕, 0.1% TFA(프렉션 I 및 II ) 또는 60% MeCN 1 ㎕, 0.1% TFA(프렉션 III)와 함께 마이크로컬럼들로부터 0.4% 아세트산/0.005% 헵타플루오로부티르산 7.6 ㎕ 로 용리되었다. 단일 프렉션 분석을 위해, 60% MeCN 1 ㎕, 0.1% TFA가 마이크로컬럼들로부터의 용리를 위해 사용되었다. 이 샘플은 불활성 샘플 주입 밸브(Dionex)를 가지고 있는 파모스 오토샘플러(Famos autosampler)를 이용하여 Magic C18 AQ 역-상 수지(Michrom Bioresources)로 채워진 10 cm x 75 ㎛ PicoFrit 모세관 컬럼(New Objective)에 적재되었다. 그 컬럼은 이후 200 nl/min로 전달된 아세토니트릴의 45-min 선형 그라디언트(linear gradient)와 함께 발달되었고, 탠덤 질량 스펙트럼들(tandem mass spectra)이 LCQ Deca XP Plus 이온포집질량분석기(ion trap mass spectrometer)와 함께 데이터-디펜던트 방법(data-dependent manner)으로 선택되었다.

데이터베이스 분석 및 어싸인먼트들 ( Assignments ).

MS/MS 스펙트럼들은 BioWorks 3.0(ThermoFinnigan)의 부분으로서 공급된 Sequest Browser package(v. 27, rev. 12)에서 TurboSequest를 사용하여 평가되었다. 개별적인 MS/MS 스펙트럼들은 다음과 같은 세팅(settings)을 가지는, Sequest Browser program CreateDta를 사용하여 원본 데이타 파일(raw data file)로부터 추출되었다: bottom MW, 700; top MW, 4,500; 이온들의 최소 수, 20; 최소 TIC, 4 x 10⁵; 및 전구체 전하 상태, 비특성화(unspecified). 스펙트럼들은 용리한 그라디언트의 끝으로 샘플 주입하기 이전에 원본 데이터 파일의 시작부(beginning)로부터 추출되었다. 그 IonQuest 및 VuDta 프로그램들은 Sequest 분석을 위한 MS/MS 스펙트럼들을 더 선택하기 위해 사용되지 않았다. MS/MS 스펙트럼들은 다음의 TurboSequest 파라미터들을 가지고 평가되었다: 펩타이드 질량 톨러런스(tolerance), 2.5; 토막 이온(fragment ion) 톨러런스, 0.0; 모디피케이션당 다른 아미노산들의 최대 수, 4; 질량 유형 패런트(mass type parent), 평균(average); 질량 유형 프래그먼트(fragment), 평균; 내부 절단 부위들의 최대 수, 10; b 및 y 이온들로부터 물 및 암모니아의 중성 손실들(neutral losses)이 상관 분석에서 고려되었다. 단백질분해효소는 엘라스타제(elastase) 소화물들로부터 모아진 스펙트럼들을 제외하고는 특정되었다.

조사들은 NCBI 인간 단백질 데이터베이스에 대항하여 수행되었다(2003년4월29일에 방출되고 37,490 단백질 서열들을 포함하는 것 또는 2004년2월23일에 방출되고 27,175 단백질 서열들을 포함하는 것 중에서 어느 하나). 시스테인 카르복스아미도메틸레이션(Cysteine carboxamidomethylation)은 정적 모디피케이션(static modification)으로 특성화되었고, 인산화는 세린, 트레오닌, 및 티로신 잔기들에 또는 단지 티로신 잔기들에만 가변 모디피케이션(variable modification)으로서 허용되었다. 인산화를 티로신 잔기들에 한정하는 것은 어싸인된(assigned) 인산화 부위들의 수에 거의 영향을 미치지 않는다는 것이 결정되었다.

프로테오믹스 연구(proteomics research)에서, 그 단백질이, 실제로, 샘플에 존재하는지를 나타내기 위해, 하나의 실험적 결과에서 오로지 단일 펩타이드의 관찰에만 기초한 단백질 동정들을 유효하게 하는 것이 바람직하다. 이것은 펩타이드 어싸인먼트들(assignments)을 유효하게하기 위한 통계학적 방법들의 발달을 이끌었는데, 그것들은 아직 세계적으로 받아들여지지는 않으며, 단백질 및 펩타이드 동정 결과들의 간행물(publication)에 대한 가이드라인들인데(Carr et al., Mol. Cell Proteomics 3: 531-533(2004) 참조), 그것들을 이 실시예에서 뒤따랐다. 그러나, 그 면역친화 전략(immunoaffinity strategy)이 비 인산화된 펩타이드들로부터 인산화된 펩타이드들을 분리시키기 때문에, 하나의 단백질로부터의 단지 하나의 포스포펩타이드를 관찰하는 것은 많은 인산화된 단백질들이 단지 하나의 티로신-인산화된 부위를 가지고 있기에 일반적인 결과이다.

이런 이유 때문에, 포스포펩타이드 연구들을 유효하게 하기 위하여 추가적인 기준들을 사용하는 것이 적절하다. 연구들이 만약 이런 추가적인 기준들의 모두가 met한다면 정확하기 쉽다: (i) 같은 서열이 MS/MS 스펙트럼이 전하 상태와 함께 뚜렷하게 변화하기 때문에, 다른 전하 상태들을 가진 상호분리(co-eluting) 이온들에 어싸인(assigned)된다; (ii) 그 부위는 불완전한 단백질분해 또는 트립신 이외의 프로테아제들의 사용으로부터 서열 겹침(부분적 일치)들에 기인하는 하나 이상의 펩타이드 서열 컨텍스트(context)에서 발견된다; (iii) 그 부위는 유사하나 일치하지는 않는 단백질 이성구조들(isoforms)에서 기인하는 하나 이상의 펩타이드 서열 컨텍스트에서 발견된다; (iv) 그 부위는 종들(species) 사이에 유사하나 일치하지 는 않는 단백질들에서 기인하는 하나 이상의 펩타이드 서열 컨텍스트에서 발견된다; 및 (v) 부위들은 이온포집질량분석기가 고도로 재현할 수 있는 MS/MS 스펙트럼들을 생산하기 때문에, 할당된 서열들에 대응하는 합성 포스포펩타이드들의 MS/MS 분석에 의해 유효하게 되었다. 마지막 기준은 특정한 흥미있는 새로운 부위 어싸인먼트들를 확인하기 위해 일상적으로 채용된다.

Sequest에 의해 만들어진 모든 스펙트럼들 및 모든 서열 어싸인먼트들은 관계있는 데이타베이스로 끌어들여졌다. 보수적인(conservative), 2-단계 과정에 잇달은 어싸인된 서열들은 인정되거나 또는 거부되었다. 첫 번째 단계에서, 고득점(high-scoring) 서열 어싸인먼트들의 서브셋은, 10의 최대 RSp 값을 허용하여, +1의 전하 상태에 대하여 적어도 1.5의 XCorr 값들, +2에 대해 2.2, 및 +3에 대해 3.3, 로 필터링 함으로써 선택되었다. 이런 서브셋에서의 어싸인먼트들은 만약 다음 기준들의 모두가 충족되었다면 거절되었다: (i)스펙트럼은 어싸인된 서열이 a, b, 또는 y 이온, b 또는 y 이온으로부터 물 또는 암모니아의 중성-손실로부터 생기는 이온 , 또는 복합적으로 양자화된 이온으로서 지도로 그려질 수 없는 적어도 하나의 주요 피크(그 스펙트럼에서 가장 강한 이온의 적어도 10%의 강도인)를 포함했다; (ii) 그 스펙트럼은 적어도 6개의 중단되지 않은 잔기들과 동등한 b 또는 y 이온들의 시리즈들을 포함하지 않았다; 또는 (iii) 그 서열이 우리가 실시했던 모든 연구(studies) 중에서 적어도 5번 관찰되지 않았다(불완전한 단백질분해 또는 트립신 이외의 프로테아제들의 사용에 기인하는 겹치는 서열들을 제외하고). 두 번째 단계에서, 경계 아래 점수들(below-threshold scores)로 한 어싸인먼트들은 만약 그 저-득점 스펙트럼이 또 다른 연구에서 모여진 고-득점 스펙트럼과 높은 유사도를 보였다면 인정되었다, 그리고 그것은 진정한 참조문헌 도서관-검색 전략을 시뮬레이트한다. 어싸인된 서열들의 최종 리스트를 지지하는 모든 스펙트럼들은(여기에 보여지지 않은) 그것들의 진실성을 확립하기 위해 적어도 세 명의 과학자들에 의해 검토되었다.

상기 IAP 분석은, 조사된 세 개의 다른 NSCLC 셀 라인들에서가 아닌 ,H1703 셀 라인에서 존재하고 있는 것처럼 PDGFRα에서 6개의 포스포-티로신 부위들을 동정했다(아래 표 1 참조). 대조적으로, EGFR에 있는 포스포 티로신 부위들은 모든 네 개의 셀 라인들에서 동정되었다. 이런 결과는 인간 NSCLC의 서브셋에서 PDGFRα 발현 및/또는 인산화 사이의 연결이 이전에는 확립되지 않았기 때문에 놀라웠다.

표 1

키나아제	인산화 부위 서열	인산화된 티로신	서열번호:
PDGFRα	VIESISPDGHEyIYVDPMQLPYDSR	Y572	서열번호:3
PDGFRα	QADTTQyVPMLER	Y742	서열번호:4
PDGFRα	SLyDRPASYK	Y762	서열번호:5
PDGFRα	SLYDRPASyK	Y768	서열번호:6
PDGFRα	DIMHDSNyVSK	Y849	서열번호:7
PDGFRα	LSADSGyIIPLPDIDPVPEEEDLGKR	Y1018	서열번호:8

실시예 2

NSCLC 종양 셀 라인들 및 이종이식들에서 PDGFR α 발현의 웨스턴 블롯 분석 및 IHC

H1703 NSCLC 종양 셀 라인--다른 NSCLC 셀 라인들이 아닌--은 PDGFRα를 발 현한다는 관찰은 PDGFRα 및 다른 수용체 티로신 키나아제들(RTKs) 및 하향 키나아제들에 특이적인 항체들을 사용하여 세포 추출물들의 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다. 수용체 티로신 키나아제들에 대한 항체 특이성은 종종 그 수용체들과 그 수용체들이 겪는 2차적인 변형들(modifications) 사이에 가까운 유사성(homology)을 포함하는 많은 가능한 변수들에 기인하여 얻어지기가 어렵다. 그러므로, 웨스턴 블롯 분석에 의해 PDGFRα 발현을 결정하는 첫 번째 단계는 이런 단백질에 대하여 특이적인 항체를 동정하는 것이었다.

도 4는 PDGFRα에 대해 두 개의 항체들을 가지고 동정된 및 PDGFRβ에 대해 하나의 항체를 가지고 동정된 세 개의 셀 라인들의 분석의 결과들을 나타낸다. U87 셀 라인은 PDGFRβ를 발현하는 것으로 알려지고, 그 H358 셀 라인은 PDGFR를 발현하지 않는다는 것 및 H118 셀 라인은 이성구조 둘 다를 강하게 발현하는 것으로 알려진다. 그 이종이식 샘플들은 그 셀 라인 및 둘러싸는 기질(stromal) 세포들 둘 다를 포함한다. 결과적으로, 이런 샘플들은 이종 구조들 둘 다를 포함하는 것으로 기대된다. 그 결과들은 CST(Cell Signaling Technology, Beverly, Mass.) PDGFRα 및 PDGFRα 항체들(Cat. Nos. 3164 and 3169, respectively)이 적절한 단백질들을 정확하게 동정한다는 것과 그리고 웨스턴 블롯에 추가적인 밴드들(bands)의 결핍에 의해 나타난 것처럼 어떤 다른 단백질들을 동정하지 않는다는 것을 증명한다. 대조적으로, Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, Calif.)(Cat. No. SC-338)부터의 PDGFRα 항체는 다수의 단백질들을 동정한다. 이런 항체로 동정된 단백질들의 어떤 것은 정확한 분자량에서의 밴드들만큼 강하게 동정된다(도 4 참조). Santa Cruz Biotechnology가 PDGFRα에 다수의 항체들을 제공하는 반면, SC-338는 IHC에 대해 바람직한 생산물이고 연구문헌에서 가장 자주 참조된 생산물이다.

이전 보고(Zhang et al.,(2003), supra.)는 A549 셀 라인에서 PDGFRα 발현를 분석하기 위한 시도로 a PDGFRα 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc.로부터)를 채용했다. 이런 웨스턴 블롯은 현재 Santa Cruz Biotechnology로부터의 SC-338 항체뿐 아니라 PDGFRα에 대한 CST 항체 및 PDGFRβ에 대한 CST 항체를 사용하여 반복되었다(결과들은 FIG. 5(a)에 나타낸다). 그 NIH3T3 셀 라인은 포지티브 대조군(positive control)으로서 포함되었고, 따라서 이런 셀 라인은 PDGFR의 이성구조들 둘 다를 발현한다는 것이 알려졌다. 그 결과들은 the Santa Cruz Biotechnology 항체가 A549 세포들에서 다수의 단백질들을 동정하며, 그것들의 어느 것도 PDGFR에 대한 정확한 분자량에 매치하지 않는다는 것을 나타낸다. 그 항체는 그 정확한 분자량을 가지는 NIH3T3 세포들에서 단백질을 동정한다. 그 CST PDGFRα(#3164) 항체는 A549 세포들에서가 아니라 NIH3T3 셀 라인에서 정확한 분자량을 가진 단백질을 동정한다. 마찬가지로, CST PDGFRβ(#3169) 항체는 A549 셀 라인에서가 아니라 NIH3T3 셀 라인에서 PDGFRβ를 동정한다. 이런 결과들은 Santa Cruz 항체가 A549 셀 라인에서 PDGFRα에 특이적이지 않다는 점 및 이런 단백질에 특이적인 항체들을 가진 웨스턴들은 A549 셀 라인이 PDGFRα을 동정할 수 있는 수준으로 발현하지 않는다는 것을 나타낸다는 점을 분명하게 증명한다. 현재 결과들은 Zhang et al.에 의해 도달된, 및 그 연구에서 채용된 항체의 특이성의 부족이 준 결론들에 의심을 가져오고, 그것은 저자들이 PDGFRα 발현 이외의 어떤 것을 동정했다고 볼 수 있 다.

NSCLC 셀 라인들의 초기의 질량 스펙 스크린(initial mass spec screen)은 H1703 셀 라인이 PDGFRα를 발현했다는 점을 나타내었다(실시예 1 참조). 특이적이라고 나타난 CST PDGFR 항체들은 도 5b에서 이런 셀 라인의 웨스턴 블롯 분석에 사용되었다. A549 셀 라인은 또한 그 분석뿐 아니라 두 개의 Santa Cruz Biotechnology PDGFRα 항체들(SC-338 및 SC-431)에 포함되었다. 그 결과들은, H1703 셀 라인은 PDGFRα를 발현하는 반면 A549 셀 라인은 그러하지 않다는 점을 나타내는, 그 질량 스펙 결과를 지지한다. Santa Cruz Biotechnology 항체들과 함께한 결과들은 둘 다의 항체들이 A549 셀 라인에서 다수의 교차-반응 밴드들(cross-reactive bands)을 보여주기는 하나 비슷하다.

PDGFRα 발현의 최종적인 결론으로서, 세포들은 PDGFaa 성장 인자와 함께 자극받았다. 성장 인자의 한 형태의 이런 호모-다이머는 특이적으로 PDGFRα를 활성화 시키고 PDGFRβ를 활성화시키지 않는다. 그러므로, PDGFRα를 발현하는 세포들은 그 수용체의 인산화 및 이런 리간드와 함께한 치료가 잇달아 일어나는 하향 신호전달의 활성화를 보여야 하는 반면, 수용체가 부족한 세포들은 반응을 보이지 않아야 한다. AKT 인산화는 하향 신호전달의 표지로서 사용되었다.

도 6에 있는 결과들은 H1703 셀 라인에서 PDGFaa 처리는 PDGFRα 및 AKT의 인산화를 가져온다는 것을 보여준다. A549 세포들의 PDGFaa 처리는 AKT 활성화를 가져오지 않고 어떤 PDGFRα 또는 포스포-PDGFRα도 검출되지 않는다. 상기 제공된 결론들에 더하여, 이런 결론들은 H1703 셀 라인이 PDGFRα를 발현하는 반면 A549 셀 라인은 그러하지 않다는 것을 분명하게 증명한다.

최종적으로, 웨스턴 블롯 분석에 의해 관찰된 항체 특이성은 IHC에서 항체의 사용을 위한 중요한 암시들을 가질 수 있다. IHC에서 PDGFRα 항체들의 사용(용도)을 시험하기 위해, A549 이종이식들은 포르말린 픽스드(formalin fixed) 및 파라핀 엠베디드(paraffin embedded) 되었고, 항체들로 동정되었다. 도 7은 IHC 결과들을 나타낸다. 웨스턴 블롯 결과들로부터 기대된 것처럼, 그 Santa Cruz PDGFRα 항체, SC-338는 A549 세포들의 비-특이적 스테이닝(staining)을 주는 반면 CST #3164 항체는 둘러싸는 기질(surrounding stromal) 세포들에서 오로지 PDGFRα만을 동정한다. 정상 쥐 기질 세포들의 이런 스테이닝은 이런 세포들이 그 수용체를 발현하는 것으로 알려지기에 적절하다.

실시예 3

인간 NSCLC 종양 샘플들에서 PDGFR α 발현의 면역조직화학적 분석

PDGFRα이 발현되는 인간 NSCLC 종양들의 별개의 서브셋의 존재는 304명의 인간 NSCLC 환자들로부터의 종양 샘플들을 포함하는 다수의 조직 마이크로-어레이들의 IHC 분석에 의해 더 확인되었다. 조직들은 상업적 뿐 아니라 공공의 조직 은행들을 포함하는 다수의 소스들로부터 얻어졌다. 종양들의 분류뿐 아니라 IHC 스테이닝의 스코어링이 훈련된 병리학자에 의해 수행되었다. 그 IHC는 웨스턴 블롯 뿐 아니라 펩타이드 흡수(보여지지 않은 데이타)에 의해 특이적이라고 나타난 CST PDGFRα-특이적 항체(#3164)와 함께 행해졌다. IHC 스크린의 결과들은 아래 표 2에 요약된다.

표 2. PDGFR α는 인간 NSCLC 종양들의 작은 서브셋에서 발현된다.

케이스들	IHC 점수	병리학적 진단	나이		성별
HL001	2+	선암	40		여
HL002	2+	선암	62		여
HL003	1-2+	선암	52		남
HL004	1+	선암	51		여
HL005	1+	선암	60		여
HL006	2+	선암	50		남
HL007	1-2+	선암	56		여
HL008	1-2+	세기관지폐포암종	58		남
HL009	3+	세기관지폐포암종	57		여
HL010	2-3+	세기관지폐포암종	52		여
HL011	1-2+	세기관지폐포암종	54		남
HL012	1+	세기관지폐포암종	52		여
HL013	1+	세기관지폐포암종	48		여
HL014	1+	평편상피암	67		남
HL015	1+	점막표피암(mucoeperdoid carcinoma)	26		여
HL016	1-2+	선양암종	54		여
HL017	3+	육종성암	59		남

표 2에 나타낸 것처럼, 스크린된 304개 NSCLC 종양 조직 샘플들 중에서, 단지 17개(6%)가 포지티브 PDGFRα 스테이닝을 보였다. PDGFRα 발현은 세기과지폐포암종들(Bronchioloalveolar carcinomas)(6 케이스들) 및 선암들(7 케이스들)(13/17, 76%)에서 보다 빈번하게 보여졌고, 육종양암종들(Sarcomatoid carcinomas)(1 케이스)(1/17, 6%)에서 보다 덜 빈번하게 보여졌다. PDGFRα-발현 NSCLC 종양들은 남성(6/17, 35%)보다 여성(11/17, 65%)에서 더 빈번하게 발생한다. 이런 결과들은 Zhang et al.(2003), supra.에 의해 보고된 IHC 결과들과 매우 다르고, 비-특이적 Santa Cruz Biotechnology 항체와 비교하여 CST PDGFRα 항체의 특 이성을 반영한다. Zhang et al.은 29 NSCLC 샘플들 중 27에서 PDGFRα 발현을 보고했다. 그 Zhang 연구에서 보고된 스테이닝의 극히 높은 수준은 IHC 분석에 채용된 항체의 교차-반응성에 기인하기가 가장 쉽다. 현재 출원서 이전에, NSCLC에서 PDGFRα 발현의 어떤 다른 보고들도 Zhang et al. 보고서를 따르는 것으로 만들어지지 않았다는 점은 주목할 만하다.

실시예 4

글리벡 ®은 PDGFR α-발현 포유류 NSCLC 셀 라인들의 성장을 저해한다

PDGFRα가 이런 RTK가 발현되는 NSCLC 종양들의 서브셋에서 세포 성장 및 생존을 유도하고 있다는 것을 확인하기 위해, H1703 세포들의 성장을 저해하는 PDGFRα-저해제, 글리벡®의 능력이 조사되었다. 표준 MTT 세포 증식 에세이(Mosmann, J. Immunol Methods. 65(1-2): 55-63(1983) 참조)는 글리벡 농도들의 범위를 사용하여 H1703, A549, H1373 및 K562 셀 라인들에 수행되었다. 그 H1373 셀 라인은 그것이 erbB2 및 erbB3에 의해 유도된다고 생각되는 것처럼 글리벡®에 둔감하다고 예측되었다(Sithanandam, Carcinogenesis 24(10): 1581-92(2003) 참조). K562 셀 라인은 글리벡®에 의해 저해되는 BCR/ABL 전좌(translocation)에 의해 유도되는 것으로 알려진다. 그 에세이의 결과들은 도 8(a)에 표현된다. 예측된 것처럼, H1373 셀 라인은 글리벡®에 둔감한 반면 K562 셀 라인은 0.1 μM의 농도들에서 민감하다. H1703 셀 라인는 또한 K562 셀 라인과 함께 관찰된 것과 비슷한 농도들에 서 글리벡®에 민감했다. 대조적으로, A549 셀 라인은 10 μM이하의 농도들에서 글리벡®에 의해 영향받지 않았다.

H1703 셀 라인에서 글리벡®의 효과를 확인하기 위해, 글리벡® 농도들의 범위에 노출에 잇달아 웨스턴 블롯 분석이 수행되었다. 도 8(b)는 이런 분석의 결과들을 나타냈다. 보여진 것처럼, 글리벡® 농도들을 증가시킴이 절단된 PARP에 있어서의 증가를 가져온다는 것은 글리벡® 처리가 세포 아폽토시스를 가져오고 있다는 것을 나타낸다. PARP 절단은 세포 아폽토시스가 연루된 것으로 알려진 한 메카니즘이다(Lazebnik et al. Nature 371: 346-347(1994) 참조). 세포 아폽토시스는 또한 1, 2, 또는 3일 동안의 글리벡® 처리에 잇달은 세포들의 유세포 분석법에 의한 캐스파제 3 절단을 분석함에 의해 분석되었다. 도 8(c)에 나타낸 것처럼, 캐스파제 3 절단은 처리의 1일 만큼 일찍 관찰되는데 그 노출 시간이 증가함에 따라 증가한다. PARP 절단과 비슷하게, 캐스파제 3 절단은 세포 아폽토시스의 잘 알려진 표지이다(Fernandes-Alnemri et al., J. Biol. Chem. 269: 30761-30764(1994) 참조). 이런 결과들은 H1703 세포들의 글리벡® 처리가 성장 저해 및 아폽토시스를 가져온다는 것을 증명한다.

실시예 5

글리벡 ®은 PDGFR α-발현 포유류 NSCLC 셀 라인들에서 신호전달을 저해한다

만약 글리벡®이 H1703 세포들에서 세포 증식 및 생존을 유도하는 PDGFRα의 능력을 변화시킨다면, 이때 그것은 수용체의 하향을 일으키는 세포의 신호전달을 방해해야 한다. 이런 가설을 시험하기 위해, 글리벡® 처리 뿐 아니라 Iressa^TM 처리 및 EGF으로 한 자극에 잇달은 세포들에 웨스턴 블롯 분석이 수행되었다. Iressa^TM은 표적 EGFR 저해제이다. EGFR 수용체, ERK 및 AKT의 인산화는 총 PDGFRα 및 ERK1/2이 로딩 대조군들(loading controls)로 포함되는 동안 결정되었다. 도 9(a)는 이런 분석의 결과들을 나타낸다. 처리되지 않은 대조군 세포들에서, AKT 및 ERK은 둘 다 인산화된 반면 EGFR 수용체는 그러하지 않는다. EGF 처리는 기대되어진 것처럼 EGFR의 인산화 뿐 아니라 ERK 및 AKT의 인산화에서의 증가를 유발한다. Iressa^TM 처리는 EGFR 및 ERK의 인산화를 감소시키나 AKT의 인산화는 감소시키지 않는다. 중요하게, 세포들의 글리벡만으로의 처리는 AKT 인산화의 손실을 가져온다. AKT는 세포 생존의 주요한 유도자(driver)로 생각된다(Franke, Cell 88: 435-437(1997) 참조).

그러므로, 이런 결과들은 이런 세포들이 Iressa^TM에 의해 저해될 수 있는 EGFR을 발현하는 반면, AKT의 지속적인 활성화는 단지 PDGFRα를 통해서만 저해된다는 것을 증명한다. 도 9(b)는 H1703 세포들에서 글리벡®의 용량 반응 분석(dose response analysis)을 나타낸다. 그 결과들은 0.01 μM 만큼 낮은 투약량으로의 글리벡® 처리가 PDGFRα 인산화를 저해하는 반면 0.1 μM의 투약량들은 AKT 인산화를 크게 저해하는 것을 나타낸다. 이런 결과들은 글리벡®이 PDGFRα 및 AKT 신호 전달의 저해를 통하여 H1703 세포 성장 및 생존을 저해하고 있다는 가설과 일치한다.

실시예 6

글리벡 ®은 PDGFR α-발현 포유류 NSCLC 종양 이종이식들의 성장을 저해한다

이런 RTK가 발현되는 NSCLC 종양들의 서브셋에서 세포 성장 및 생존을 저해하는 글리벡®의 능력을 더 확인하기 위해, 생체 내에서 인간 종양 이종이식들이 조사되었다. 이런 모델에서, 인간 셀 라인들이 인간 종양들에서 발견된 혈관신생(vascularization) 및 다른 특징들을 포함하는 인간 종양들을 닮은 이종이식 종양들을 형성하는 면역약화 쥐들(immune-compromised mice)에 주입된다. 그 쥐들은 이후 인간 환자들에서와 똑같은 방법으로 약물이 투여된다. 종양 크기는 약물 처리 동안에 시각적으로 모니터 될 수 있고 그 종양들은 제거, 고정 및 표준 IHC 과정들에 의해 분석 또는 웨스턴 블롯에 의해 라이스드(lysed) 및 분석될 수 있다.

도 10(a)는 글리벡 처리가 종양 크기에 있어서의 상당한 감소를 가져오는 것을 증명하는 이종이식 실험들의 결과들을 나타낸다. 5개 대조군 쥐들에서 평균 종양 직경은 대략 190 mm인 반면 3개 처리군 쥐들에서 평균 종양 직경은 단지 대략 20 mm였다. 처리군 쥐들에서의 종양 크기의 이런 극적인 감소는 생체 내에서 글리벡® 처리가 PDGFRα에 의해 유도되는 종양들에 치료적 효과를 가진다는 강한 표시이다.

종양 크기에서 이런 감소 뒤의 메카니즘을 더 분석하기 위해, 웨스턴 블롯들이 하나의 대조군 쥐에 비교하여 4개 처리군 쥐들로부터의 종양 라이세이트에서 수행되었다. 도 10(b)에 있는 결과들은 이런 이종이식들에서 글리벡®이 PDGFRα 인산화를 저해하고 있다는 것을 보여준다(총 AKT는 로딩 대조군으로서 그 웨스턴에 포함되었다). 이런 결과들은 글리벡®이 PDGFRα 저해를 통하여 종양 크기를 감소시키고 있다고 제안한 이전의 결과들과 일치한다. 그 이종이식 종양들은 또한 대조군 종양들이 글리벡® 처리군 종양들과 대비되는 IHC(도 11 참조)에 의해 분석되었다. IHC 분석의 결과들은 글리벡® 처리가 PDGFRα 및 AKT 인산화에서의 감소를 가져온다는 것을 다시 증명한다. 그 IHC 결과들은 포유류 종양들, 예를 들어 인간 환자로부터 나온, 이 PDGFRα 저해제의 생물학적 활성을 결정하기 위해 비슷한 방법으로 IHC에 의해 분석될 수 있다.

<110> Cell Signaling Technology, Inc. <120> Identification of Non-Small Cell Lung Carcinoma(NSCLC) Tumors Expressing PDGFR-Alpha <130> P08CS015/KR <150> US 11/174,051 <151> 2005-07-01 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1089 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Thr Ser His Pro Ala Phe Leu Val Leu Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 Gly Leu Ser Leu Ile Leu Cys Gln Leu Ser Leu Pro Ser Ile Leu Pro 20 25 30 Asn Glu Asn Glu Lys Val Val Gln Leu Asn Ser Ser Phe Ser Leu Arg 35 40 45 Cys Phe Gly Glu Ser Glu Val Ser Trp Gln Tyr Pro Met Ser Glu Glu 50 55 60 Glu Ser Ser Asp Val Glu Ile Arg Asn Glu Glu Asn Asn Ser Gly Leu 65 70 75 80 Phe Val Thr Val Leu Glu Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala His Thr Gly 85 90 95 Leu Tyr Thr Cys Tyr Tyr Asn His Thr Gln Thr Glu Glu Asn Glu Leu 100 105 110 Glu Gly Arg His Ile Tyr Ile Tyr Val Pro Asp Pro Asp Val Ala Phe 115 120 125 Val Pro Leu Gly Met Thr Asp Tyr Leu Val Ile Val Glu Asp Asp Asp 130 135 140 Ser Ala Ile Ile Pro Cys Arg Thr Thr Asp Pro Glu Thr Pro Val Thr 145 150 155 160 Leu His Asn Ser Glu Gly Val Val Pro Ala Ser Tyr Asp Ser Arg Gln 165 170 175 Gly Phe Asn Gly Thr Phe Thr Val Gly Pro Tyr Ile Cys Glu Ala Thr 180 185 190 Val Lys Gly Lys Lys Phe Gln Thr Ile Pro Phe Asn Val Tyr Ala Leu 195 200 205 Lys Ala Thr Ser Glu Leu Asp Leu Glu Met Glu Ala Leu Lys Thr Val 210 215 220 Tyr Lys Ser Gly Glu Thr Ile Val Val Thr Cys Ala Val Phe Asn Asn 225 230 235 240 Glu Val Val Asp Leu Gln Trp Thr Tyr Pro Gly Glu Val Lys Gly Lys 245 250 255 Gly Ile Thr Met Leu Glu Glu Ile Lys Val Pro Ser Ile Lys Leu Val 260 265 270 Tyr Thr Leu Thr Val Pro Glu Ala Thr Val Lys Asp Ser Gly Asp Tyr 275 280 285 Glu Cys Ala Ala Arg Gln Ala Thr Arg Glu Val Lys Glu Met Lys Lys 290 295 300 Val Thr Ile Ser Val His Glu Lys Gly Phe Ile Glu Ile Lys Pro Thr 305 310 315 320 Phe Ser Gln Leu Glu Ala Val Asn Leu His Glu Val Lys His Phe Val 325 330 335 Val Glu Val Arg Ala Tyr Pro Pro Pro Arg Ile Ser Trp Leu Lys Asn 340 345 350 Asn Leu Thr Leu Ile Glu Asn Leu Thr Glu Ile Thr Thr Asp Val Glu 355 360 365 Lys Ile Gln Glu Ile Arg Tyr Arg Ser Lys Leu Lys Leu Ile Arg Ala 370 375 380 Lys Glu Glu Asp Ser Gly His Tyr Thr Ile Val Ala Gln Asn Glu Asp 385 390 395 400 Ala Val Lys Ser Tyr Thr Phe Glu Leu Leu Thr Gln Val Pro Ser Ser 405 410 415 Ile Leu Asp Leu Val Asp Asp His His Gly Ser Thr Gly Gly Gln Thr 420 425 430 Val Arg Cys Thr Ala Glu Gly Thr Pro Leu Pro Asp Ile Glu Trp Met 435 440 445 Ile Cys Lys Asp Ile Lys Lys Cys Asn Asn Glu Thr Ser Trp Thr Ile 450 455 460 Leu Ala Asn Asn Val Ser Asn Ile Ile Thr Glu Ile His Ser Arg Asp 465 470 475 480 Arg Ser Thr Val Glu Gly Arg Val Thr Phe Ala Lys Val Glu Glu Thr 485 490 495 Ile Ala Val Arg Cys Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gly Ala Glu Asn Arg 500 505 510 Glu Leu Lys Leu Val Ala Pro Thr Leu Arg Ser Glu Leu Thr Val Ala 515 520 525 Ala Ala Val Leu Val Leu Leu Val Ile Val Ile Ile Ser Leu Ile Val 530 535 540 Leu Val Val Ile Trp Lys Gln Lys Pro Arg Tyr Glu Ile Arg Trp Arg 545 550 555 560 Val Ile Glu Ser Ile Ser Pro Asp Gly His Glu Tyr Ile Tyr Val Asp 565 570 575 Pro Met Gln Leu Pro Tyr Asp Ser Arg Trp Glu Phe Pro Arg Asp Gly 580 585 590 Leu Val Leu Gly Arg Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Lys Val Val 595 600 605 Glu Gly Thr Ala Tyr Gly Leu Ser Arg Ser Gln Pro Val Met Lys Val 610 615 620 Ala Val Lys Met Leu Lys Pro Thr Ala Arg Ser Ser Glu Lys Gln Ala 625 630 635 640 Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Thr His Leu Gly Pro His Leu Asn 645 650 655 Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Ser Gly Pro Ile Tyr Ile 660 665 670 Ile Thr Glu Tyr Cys Phe Tyr Gly Asp Leu Val Asn Tyr Leu His Lys 675 680 685 Asn Arg Asp Ser Phe Leu Ser His His Pro Glu Lys Pro Lys Lys Glu 690 695 700 Leu Asp Ile Phe Gly Leu Asn Pro Ala Asp Glu Ser Thr Arg Ser Tyr 705 710 715 720 Val Ile Leu Ser Phe Glu Asn Asn Gly Asp Tyr Met Asp Met Lys Gln 725 730 735 Ala Asp Thr Thr Gln Tyr Val Pro Met Leu Glu Arg Lys Glu Val Ser 740 745 750 Lys Tyr Ser Asp Ile Gln Arg Ser Leu Tyr Asp Arg Pro Ala Ser Tyr 755 760 765 Lys Lys Lys Ser Met Leu Asp Ser Glu Val Lys Asn Leu Leu Ser Asp 770 775 780 Asp Asn Ser Glu Gly Leu Thr Leu Leu Asp Leu Leu Ser Phe Thr Tyr 785 790 795 800 Gln Val Ala Arg Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Lys Asn Cys Val His 805 810 815 Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Ala Gln Gly Lys Ile Val 820 825 830 Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Met His Asp Ser Asn 835 840 845 Tyr Val Ser Lys Gly Ser Thr Phe Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro 850 855 860 Glu Ser Ile Phe Asp Asn Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Asp Val Trp Ser 865 870 875 880 Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Thr Pro Tyr 885 890 895 Pro Gly Met Met Val Asp Ser Thr Phe Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Gly 900 905 910 Tyr Arg Met Ala Lys Pro Asp His Ala Thr Ser Glu Val Tyr Glu Ile 915 920 925 Met Val Lys Cys Trp Asn Ser Glu Pro Glu Lys Arg Pro Ser Phe Tyr 930 935 940 His Leu Ser Glu Ile Val Glu Asn Leu Leu Pro Gly Gln Tyr Lys Lys 945 950 955 960 Ser Tyr Glu Lys Ile His Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp His Pro Ala 965 970 975 Val Ala Arg Met Arg Val Asp Ser Asp Asn Ala Tyr Ile Gly Val Thr 980 985 990 Tyr Lys Asn Glu Glu Asp Lys Leu Lys Asp Trp Glu Gly Gly Leu Asp 995 1000 1005 Glu Gln Arg Leu Ser Ala Asp Ser Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Pro Asp 1010 1015 1020 Ile Asp Pro Val Pro Glu Glu Glu Asp Leu Gly Lys Arg Asn Arg His 1025 1030 1035 1040 Ser Ser Gln Thr Ser Glu Glu Ser Ala Ile Glu Thr Gly Ser Ser Ser 1045 1050 1055 Ser Thr Phe Ile Lys Arg Glu Asp Glu Thr Ile Glu Asp Ile Asp Met 1060 1065 1070 Met Asp Asp Ile Gly Ile Asp Ser Ser Asp Leu Val Glu Asp Ser Phe 1075 1080 1085 Leu <210> 2 <211> 4019 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ttctccccgc cccccagttg ttgtcgaagt ctgggggttg ggactggacc ccctgattgc 60 gtaagagcaa aaagcgaagg cgcaatctgg acactgggag attcggagcg cagggagttt 120 agagaaactt ttattttgaa gagaccaagg ttgagggggg gcttatttcc tgacagctat 180 ttacttagag caaatgatta gttttagaag gatggactat aacattgaat caattacaaa 240 acgcggtttt tgagcccatt actgttggag ctacagggag agaaacagga ggagactgca 300 agagatcatt tgggaaggcc gtgggcacgc tctttactcc atgtgtggga cattcattgc 360 ggaataacat cggaggagaa gtttcccaga gctatgggga cttcccatcc ggcgttcctg 420 gtcttaggct gtcttctcac agggctgagc ctaatcctct gccagctttc attaccctct 480 atccttccaa atgaaaatga aaaggttgtg cagctgaatt catccttttc tctgagatgc 540 tttggggaga gtgaagtgag ctggcagtac cccatgtctg aagaagagag ctccgatgtg 600 gaaatcagaa atgaagaaaa caacagcggc ctttttgtga cggtcttgga agtgagcagt 660 gcctcggcgg cccacacagg gttgtacact tgctattaca accacactca gacagaagag 720 aatgagcttg aaggcaggca catttacatc tatgtgccag acccagatgt agcctttgta 780 cctctaggaa tgacggatta tttagtcatc gtggaggatg atgattctgc cattatacct 840 tgtcgcacaa ctgatcccga gactcctgta accttacaca acagtgaggg ggtggtacct 900 gcctcctacg acagcagaca gggctttaat gggaccttca ctgtagggcc ctatatctgt 960 gaggccaccg tcaaaggaaa gaagttccag accatcccat ttaatgttta tgctttaaaa 1020 gcaacatcag agctggatct agaaatggaa gctcttaaaa ccgtgtataa gtcaggggaa 1080 acgattgtgg tcacctgtgc tgtttttaac aatgaggtgg ttgaccttca atggacttac 1140 cctggagaag tgaaaggcaa aggcatcaca atgctggaag aaatcaaagt cccatccatc 1200 aaattggtgt acactttgac ggtccccgag gccacggtga aagacagtgg agattacgaa 1260 tgtgctgccc gccaggctac cagggaggtc aaagaaatga agaaagtcac tatttctgtc 1320 catgagaaag gtttcattga aatcaaaccc accttcagcc agttggaagc tgtcaacctg 1380 catgaagtca aacattttgt tgtagaggtg cgggcctacc cacctcccag gatatcctgg 1440 ctgaaaaaca atctgactct gattgaaaat ctcactgaga tcaccactga tgtggaaaag 1500 attcaggaaa taaggtatcg aagcaaatta aagctgatcc gtgctaagga agaagacagt 1560 ggccattata ctattgtagc tcaaaatgaa gatgctgtga agagctatac ttttgaactg 1620 ttaactcaag ttccttcatc cattctggac ttggtcgatg atcaccatgg ctcaactggg 1680 ggacagacgg tgaggtgcac agctgaaggc acgccgcttc ctgatattga gtggatgata 1740 tgcaaagata ttaagaaatg taataatgaa acttcctgga ctattttggc caacaatgtc 1800 tcaaacatca tcacggagat ccactcccga gacaggagta ccgtggaggg ccgtgtgact 1860 ttcgccaaag tggaggagac catcgccgtg cgatgcctgg ctaagaatct ccttggagct 1920 gagaaccgag agctgaagct ggtggctccc accctgcgtt ctgaactcac ggtggctgct 1980 gcagtcctgg tgctgttggt gattgtgatc atctcactta ttgtcctggt tgtcatttgg 2040 aaacagaaac cgaggtatga aattcgctgg agggtcattg aatcaatcag cccggatgga 2100 catgaatata tttatgtgga cccgatgcag ctgccttatg actcaagatg ggagtttcca 2160 agagatggac tagtgcttgg tcgggtcttg gggtctggag cgtttgggaa ggtggttgaa 2220 ggaacagcct atggattaag ccggtcccaa cctgtcatga aagttgcagt gaagatgcta 2280 aaacccacgg ccagatccag tgaaaaacaa gctctcatgt ctgaactgaa gataatgact 2340 cacctggggc cacatttgaa cattgtaaac ttgctgggag cctgcaccaa gtcaggcccc 2400 atttacatca tcacagagta ttgcttctat ggagatttgg tcaactattt gcataagaat 2460 agggatagct tcctgagcca ccacccagag aagccaaaga aagagctgga tatctttgga 2520 ttgaaccctg ctgatgaaag cacacggagc tatgttattt tatcttttga aaacaatggt 2580 gactacatgg acatgaagca ggctgatact acacagtatg tccccatgct agaaaggaaa 2640 gaggtttcta aatattccga catccagaga tcactctatg atcgtccagc ctcatataag 2700 aagaaatcta tgttagactc agaagtcaaa aacctccttt cagatgataa ctcagaaggc 2760 cttactttat tggatttgtt gagcttcacc tatcaagttg cccgaggaat ggagtttttg 2820 gcttcaaaaa attgtgtcca ccgtgatctg gctgctcgca acgtcctcct ggcacaagga 2880 aaaattgtga agatctgtga ctttggcctg gccagagaca tcatgcatga ttcgaactat 2940 gtgtcgaaag gcagtacctt tctgcccgtg aagtggatgg ctcctgagag catctttgac 3000 aacctctaca ccacactgag tgatgtctgg tcttatggca ttctgctctg ggagatcttt 3060 tcccttggtg gcacccctta ccccggcatg atggtggatt ctactttcta caataagatc 3120 aagagtgggt accggatggc caagcctgac cacgctacca gtgaagtcta cgagatcatg 3180 gtgaaatgct ggaacagtga gccggagaag agaccctcct tttaccacct gagtgagatt 3240 gtggagaatc tgctgcctgg acaatataaa aagagttatg aaaaaattca cctggacttc 3300 ctgaagagtg accatcctgc tgtggcacgc atgcgtgtgg actcagacaa tgcatacatt 3360 ggtgtcacct acaaaaacga ggaagacaag ctgaaggact gggagggtgg tctggatgag 3420 cagagactga gcgctgacag tggctacatc attcctctgc ctgacattga ccctgtccct 3480 gaggaggagg acctgggcaa gaggaacaga cacagctcgc agacctctga agagagtgcc 3540 attgagacgg gttccagcag ttccaccttc atcaagagag aggacgagac cattgaagac 3600 atcgacatga tggacgacat cggcatagac tcttcagacc tggtggaaga cagcttcctg 3660 taactggcgg attcgagggg ttccttccac ttctggggcc acctctggat cccgttcaga 3720 aaaccacttt attgcaatgc ggaggttgag aggaggactt ggttgatgtt taaagagaag 3780 ttcccagcca agggcctcgg ggagcgttct aaatatgaat gaatgggata ttttgaaatg 3840 aactttgtca gtgttgcctc tcgcaatgcc tcagtagcat ctcagtggtg tgtgaagttt 3900 ggagatagat ggataaggga ataataggcc acagaaggtg aactttgtgc ttcaaggaca 3960 ttggtgagag tccaacagac acaatttata ctgcgacaga acttcagcat tgtaattat 4019 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Val Ile Glu Ser Ile Ser Pro Asp Gly His Glu Tyr Ile Tyr Val Asp 1 5 10 15 Pro Met Gln Leu Pro Tyr Asp Ser Arg 20 25 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Ala Asp Thr Thr Gln Tyr Val Pro Met Leu Glu Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ser Leu Tyr Asp Arg Pro Ala Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Leu Tyr Asp Arg Pro Ala Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Ile Met His Asp Ser Asn Tyr Val Ser Lys 1 5 10 <210> 8 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Leu Ser Ala Asp Ser Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Pro Asp Ile Asp Pro 1 5 10 15 Val Pro Glu Glu Glu Asp Leu Gly Lys Arg 20 25

Claims (20)

1. 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파(PDGFRα)가 발현되는 포유류 비-소 세포 폐암(NSCLC) 종양들의 서브셋에 속하는 포유류 비-소 세포 폐암(NSCLC) 종양을 동정하는 시험관내(in vitro) 방법으로서,

   상기 방법은 적어도 하나의 PDGFRα-특이적 시약을 사용하여 PDGFRα가 NSCLC 종양으로부터 유래한 세포들을 포함하는 생물학적 샘플에서 발현되는지를 결정하는 단계를 포함하며,

   여기에서, 상기 생물학적 샘플에서 PDGFRα가 발현되면, 상기 NSCLC 종양이, PDGFRα가 발현된 NSCLC 종양들의 서브셋에 속하는 것으로 동정되는

   시험관내 방법.
2. 제1항에 있어서,

   상기 포유류는 인간인

   시험관내 방법.
3. 제1항에 있어서,

   상기 NSCLC 종양이 PDGFRα가 발현된 NSCLC 종양들의 서브셋에 속하는 것으로 동정되면, 상기 NSCLC 종양이 적어도 하나의 PDGFRα-저해 치료제를 포함하는 조성물에 반응할 수 있는 것으로 동정되는

   시험관내 방법.
4. 제3항에 있어서,

   상기 PDGFRα-저해 치료제는 PDGFRα의 소 분자 저해제를 포함하는

   시험관내 방법.
5. 제4항에 있어서,

   상기 PDGFRα의 소 분자 저해제는 이매티닙 메시레이트(Imatinib mesylate;STI-571)인

   시험관내 방법.
6. 제4항에 있어서,

   상기 PDGFRα의 소 분자 저해제는 이매티닙 메시레이트(Imatinib mesylate;STI-571) 유사체인

   시험관내 방법.
7. 제6항에 있어서,

   상기 이매티닙 메시레이트(Imatinib mesylate;STI-571) 유사체는 BAY 43-93006, XL-999 및 SU11248로 구성된 군으로부터 선택된 것인

   시험관내 방법.
8. 제1항에 있어서,

   상기 생물학적 샘플은 종양 생검, 종양 미세 침 흡인물, 또는 흉막 삼출로부터 얻어진 세포들을 포함하는

   시험관내 방법.
9. 제1항에 있어서,

   상기 PDGFRα-특이적 시약은 PDGFRα-특이적 항체를 포함하는

   시험관내 방법.
10. 제9항에 있어서,

    상기 PDGFRα-특이적 항체는 인산화 부위-특이적 항체인

    시험관내 방법.
11. 제1항에 있어서,

    상기 PDGFRα-특이적 시약은 PDGFRα 펩타이드 서열에 상응하는 무거운 동위원소 표지된 펩타이드(AQUA 펩타이드)를 포함하는

    시험관내 방법.
12. 제11항에 있어서,

    상기 AQUA 펩타이드는 서열번호: 3-8로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 가지는 펩타이드인

    시험관내 방법.
13. 제1항에 있어서,

    상기 방법은 유세포 분석법(FC), 면역조직화학염색법(IHC), 또는 면역형광법(IF) 에세이 포맷에서 수행된

    시험관내 방법.
14. 화합물이 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파(PDGFRα)가 발현되는 비-소 세포 폐암(NSCLC) 종양들의 서브셋에 속하는 포유류 비-소 세포 폐암(NSCLC) 종양의 진행을 저해하는지를 결정하는 시험관내(in vitro) 방법으로서,

    상기 방법은 상기 화합물이 상기 NSCLC 종양에서 PDGFRα의 발현, 활성, 또는 발현 및 활성을 저해하는지를 결정하는 단계를 포함하며,

    여기에서, 상기 화합물이 상기 NSCLC 종양에서 PDGFRα의 발현, 활성, 또는 발현 및 활성을 저해하면, 상기 화합물이 상기 NSCLC 종양의 진행을 저해하는 것으로 결정되는

    시험관내 방법.
15. 제14항에 있어서,

    PDGFRα의 발현, 활성, 또는 발현 및 활성의 저해는 상기 NSCLC 종양으로부터 유래한 세포들을 포함하는 생물학적 샘플을 조사함으로써 결정되는

    시험관내 방법.
16. 제14항에 있어서,

    PDGFRα의 발현, 활성, 또는 발현 및 활성의 저해는 적어도 하나의 PDGFRα-특이적 시약을 사용하여 결정되는

    시험관내 방법.
17. 제16항에 있어서,

    상기 PDGFRα-특이적 시약은 인산화-부위 특이적 항체를 포함하는

    시험관내 방법.
18. 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파(PDGFRα)가 발현되는 비-소 세포 폐암(NSCLC) 종양들의 서브셋에 속하는 포유류 비-소 세포 폐암(NSCLC) 종양의 진행을 저해하는 시험관내(in vitro) 방법으로서,

    상기 방법은 상기 NSCLC 종양에서 PDGFRα의 발현, 활성, 또는 발현 및 활성을 저해하는 단계를 포함하며,

    여기에서, 상기 NSCLC 종양에서 PDGFRα의 발현, 활성, 또는 발현 및 활성을 저해함으로써, 상기 NSCLC 종양의 진행이 저해되는

    시험관내 방법.
19. 제18항에 있어서,

    PDGFRα의 발현, 활성, 또는 발현 및 활성은 이매티닙 메시레이트(Imatinib mesylate;STI-571), 이매티닙 메시레이트(Imatinib mesylate;STI-571)의 유사체, 또는 이매티닙 메시레이트(Imatinib mesylate;STI-571) 및 이매티닙 메시레이트(Imatinib mesylate;STI-571)의 유사체를 포함하는 조성물로 저해되는

    시험관내 방법.
20. 제19항에 있어서,

    상기 유사체는 BAY 43-93006, XL-999 및 SU11248로 구성되는 군으로부터 선택된

    시험관내 방법.

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