WO2013087964A1 - Uso de agentes modificadores del ambiente peritumoral para el tratamiento del cáncer - Google Patents

Uso de agentes modificadores del ambiente peritumoral para el tratamiento del cáncer Download PDF

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Manuel Vicente Salinas Martín
María Carmen LARA RUIZ
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Definitions

  • the present invention falls within the field of medicine. More specifically in molecular biology applied to medicine, pharmacology and oncology. Specifically, it is related to the use of agents that modify the peritumoral environment, preferably non-peptide antagonists of NK1 receptors, for the manufacture of drugs useful in the treatment of cancer in humans.
  • NK1 receptors neuropeptide receptors of Substance P and tachykinins
  • NK1 receptors neuropeptide receptors of Substance P and tachykinins
  • Its presence has been found in the central and peripheral nervous system of mammals, in the digestive system, in the circulatory system, in hematopoietic and inflammatory and / or immune response cells, as well as in soft tissues and especially, in the vascular endothelium.
  • Many biological processes are currently known in whose regulation the NK1 receptors are involved.
  • Substance P is an undecapeptide of natural origin, which belongs to the tachykinin family, is produced in mammals and its sequence was described by Veber et al, (US 4,680,283).
  • the tachykinin family also includes other peptides such as Neurokinin A, Neurokinin B, Neuropeptide K, Neuropeptide Gamma and Hemokinin I, among others.
  • the involvement of SP and other tachykinins in the etiopathogenesis of various diseases has been widely referred to in the scientific literature.
  • tachykinins has been related to the etiopathogenesis of human nervous system diseases such as Alzheimer's Disease, Multiple Sclerosis, Parkinson's Disease, anxiety and depression (Barker R. et al, 1996; Kramer MS, et al, 1998).
  • the involvement of tachykinins in the etiopathogenesis of various diseases with an inflammatory component such as rheumatoid arthritis, asthma, allergic rhinitis, intestinal inflammatory diseases such as ulcerative colitis and Crohn's disease (Maggi CA, et al. 1993).
  • non-peptide antagonists of NK1 receptors have been developed as drugs for the treatment of various disorders of the central nervous system such as depression, psychosis and anxiety (WO 95/16679, WO 95/18124, WO 95/23798 and WO 01/77100). It has been described that the use of selective NK1 receptor antagonists is useful in the treatment of nausea and vomiting induced by antineoplastic chemotherapeutic agents, as well as in the treatment of certain forms of urinary incontinence (Quartara L. et al, 1998; Doi T et al., 1999).
  • astrocytes of the central nervous system express functional receptors for several neurotransmitters including NK1 receptors.
  • NK1 receptors In brain tumors, malignant glial cells derived from astrocytes trigger under the action of tachykinins and through the mediation of NK1 receptors, the secretion of mediators that increase their proliferation rate. Consequently, selective NK1 antagonists can be very useful as therapeutic agents for the treatment of malignant gliomas.
  • EP 773026 (Pfizer) refers to the use of non-peptide antagonists of the NK1 receptor for the treatment of cancers in mammals.
  • APUDOMAS tumor-associated cytoplasmic autoantibody derived cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic acid, and cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasm
  • NK neurokinin receptor antagonists such as CP-96341-1 (Pfizer), MEN 11467, SR 48968 (Sanofi) and MEN 11420 (Nepadutant) have demonstrated their effectiveness in proliferation blockade cellular (Singh D et al, 2000; and Bigioni M. et al, 2005).
  • non-peptide antagonists of NK1 receptors induce apoptosis (cell death) in tumor cells of various tumors such as stomach carcinoma, colon carcinoma (Rosso M, et al, 2008) or melanoma (Mu ⁇ oz M, et al, 2010). Likewise, it has been described that these receptors are overexpressed in cancer cells.
  • Patent ES 2246687 claims the use of non-peptide antagonists of NK1 and SP receptors in the preparation of a pharmaceutical composition for the production of apoptosis in mammalian tumor cells.
  • patent application WO2012020162 describes the use of antibodies or fragments thereof, against NK1, NK2 and / or NK3 receptors, useful in the treatment of cancer, by producing apoptosis of tumor cells.
  • peptide antagonists of NK1 receptors there are two types of peptide antagonists of NK1 receptors: polypeptides (amino acid sequences -10 or 20) that are the first to be synthesized, but which were abandoned - must be taken into account that agonists as substance P are polypeptides, but in this case synthesized by the body itself) and monoclonal antibodies.
  • polypeptides amino acid sequences -10 or 20
  • agonists as substance P are polypeptides, but in this case synthesized by the body itself
  • monoclonal antibodies monoclonal antibodies.
  • tumor cells and cells surrounding the tumor are of great importance.
  • tumor cells and cells surrounding the tumor are of great importance.
  • stromal cells and inflammatory cells are of great importance.
  • TGF- ⁇ transforming growth factor ⁇
  • SPARC from the English term "secreted protein acidic, cysteine-rich ”
  • TGF- ⁇ transforming growth factor a
  • TGF can inhibit the passage of precursor forms of CD8 + lymphocyte to effector cell forms
  • SPARC plays an important role related to neoangiogenesis Tumor (Carmeliet P et al.
  • MMPs Metalloproteases
  • MMPs are expressed physiologically in some situations such as wound healing, the transition from cartilage to bone and placental development. They are expressed pathologically in the process of invasion and the development of metastasis in tumors (Clin Cancer Res 2000, 6: 2349).
  • the MMPs most frequently involved in the development of tumors are: MMP-2 (Gelatinase A), MMP-3 (Stromelysin 1), MMP-7 (Matrilysin), MMP-9 (Gelatinase B), MMP-11 (Stromelysin 3) , MMP-13 (Collagenase 3) and MMP-14.
  • Batimastat peptide-mimetic whose targets are MMP-1, 2, 3, 7 and 9
  • Marimastat peptide-mimetic whose targets are MMP-1, 2, 3, 7, 9 and 12
  • Prinomastat not peptide-mimetic whose targets are MMP-2, 3, 9, 13 and 14
  • Bay-129566 non-peptide-mimetic whose targets are MMP-2, 3 and 9)
  • Metastat tetracycline whose targets are MMP-2 and 9
  • BMS 275291 non-peptidomimetic whose targets are MMP-2 and 9
  • Neovastat obtained from shark cartilage whose targets are MMP-1, 2, 7, 9, 12 and 13
  • Marimastat has passed clinical trials in Phase I in breast and lung cancer of the non-small cell type
  • Prinomastat has passed clinical trials in Phase I in prostate cancer
  • Bay-129566 has passed clinical trials in Phase I in various solid tumors
  • BMS 275291 has passed Phase I clinical trials in non-small cell lung cancer.
  • Marimastat has demonstrated efficacy in the treatment of advanced pancreatic cancer (Rosemurgy et al., Procc ASCO 1999), in advanced gastric cancer (Fieldng et al, Procc ASCO 2000), in glioblastoma (Puphanich et al, Procc ASCO 2001) and in breast cancer after first line of chemotherapy treatment (Sparano et al, Procc ASCO 2002). Therefore and in conclusion, the following facts are currently known in the state of the art:
  • That NK1 receptors are widely disseminated in the body of the human being.
  • patent ES 2 246 687 claims the use of non-peptide antagonists of NK1 receptors to induce death and apoptosis in tumor cells (and lists a specific number thereof, specifically). Therefore, it does not include the effects that non-peptide antagonists of the NK1 receptor can perform at the level of the substances and cells that make up the tumor microenvironment and that are of crucial importance for the genesis, development and progression of tumors.
  • NK1 receptors have been demonstrated in the blood cells involved in the inflammatory and / or immune response, in the stromal matrix cells and in the vascularization cells that surround the tumor cells. It is known that stromal cells, blood cells involved in the inflammatory and / or immune response and the vascularization cells influence the evolution of malignant tumors.
  • the object of the present invention is the use of peritumoral environment modulating agents, preferably selected from non-peptide NK1 receptor antagonists, for the treatment of cancer, thanks to the ability to show the peritumoral environment by inducing changes in the cells that make up the environment and the substances that secrete them, in order to prevent or hinder the genesis, development or progression of tumors and reduce the size of them.
  • the present invention discloses the use of peritumoral environment modifying agents, preferably non-peptide NK1 antagonists for the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition useful in the therapeutic treatment of cancer by direct administration to a mammal, including man .
  • the NK1 receptor activates cell proliferation, preferably through the MAP kinase pathway, specifically through its "downstream” efferents such as, for example, ERK.
  • ERK can modulate cell proliferation through several efferents, in turn "downstream", of great importance such as Fos / Jun or P90rsk, among others.
  • the NK1 receptor activates cell proliferation, preferably through the pathway of PI3 kinases.
  • the activation of the route of the PI3 Kinases produces an increase in one of its final aforementioned "downstream” as is AKT.
  • AKT exerts a cellular anti-apoptotic effect through several efferents, in turn "downstream", of great importance as Bcl2 or a stimulating effect of cell proliferation through, for example, Cyclin D.
  • NK1 non-peptide antagonists are capable of inhibiting tumor growth and proliferation in those types of tumors in which the signaling pathways of MAP Kinases and PI3 Kinases are integrated in said cells, that is, they are active, and therefore, treatment with said antagonists inhibits the proliferation of tumor cells through the MAP kinase and PI3 kinase pathways, preferably through the inhibition of the expression of different "downstream" effectors of said pathways, as by example ERK and AKT, respectively.
  • the present invention shows that there are specific tumors in which treatment with non-peptide antagonists of NK1 receptors is not able to inhibit their growth, nor is the activation of the signaling pathways of MAP kinases and PI3 kinases . But when these types of tumors are grown in the presence of the cells that make up the peritumoral microenvironment (stromal cells - fibroblasts - immune / inflammatory cells - leukocytes and macrophages - and vascular endothelial cells) there is inhibition of their proliferation, regardless of the signaling routes of MAP Kinases or PI3 Kinasas.
  • NK1 receptors inhibit the survival of tumor cells through mechanisms related to blocking the secretion of molecules. typical of the interaction of tumor cells with other cells of the tumor microenvironment, said mechanisms being different from those known in the state of the art.
  • the cellular route that, starting from the NK1 receptors ends up in the inhibition of cellular apoptosis, may be altered, for example, due to "downstream" mutations of the NK1 receptor signaling pathway.
  • the administration of non-peptide antagonists of the NK1 receptor would not have the predictable effect of inducing apoptosis of tumor cells.
  • the antitumor action should be exercised:
  • determining the integrity of the metabolic pathway mediated by NK1 receptors, in cases of cancer will determine:
  • c) Choose the type of anti-tumor to be administered, in combination, possibly with the peritumoral environment modifying agent, in general or, more specifically, with the non-peptide antagonist of the NK1 receptors.
  • the invention affects the treatment of cancer through the modification of the peritumoral environment to reduce the size of the tumors, prevent their development and eventually induce their disappearance, allows to adjust the effective doses of the antitumor agents both based on chemo- as in radiotherapy, as well as the very nature of the combinations to be made with them.
  • This entails a more effective treatment, with a broader spectrum in the types of tumors to be treated, at possibly more adjusted doses, which implies lower associated side effects and a better quality of life for patients during and after treatment.
  • An object of the present invention is the use of at least one peritumoral environment modifying agent, preferably non-peptide NK1 receptor antagonists, for the preparation of a medicament or pharmaceutical composition useful in the treatment of cancer.
  • the peritumoral microenvironment is formed by all the cells surrounding the tumor, preferably said environment, is formed by the stromal cells, preferably fibroblasts, the stromal matrix, the intra and peritumoral vascular and endothelial cells and the inflammatory and / or immune cells surrounding the tumor, preferably mono and polymorphonuclear leukocytes and macrophages.
  • the modification of the peritumoral microenvironment is carried out by inducing changes in the stromal matrix and in the peritumoral cells, as well as in the inflammatory and / or immune response, which leads to the inhibition of tumor development and / or its progression, being therefore useful in the treatment of cancer.
  • the modifications produced in the peritumoral microenvironment by treatment with at least one modifying agent of said peritumoral environment, non-peptide antagonists of the NK1 receptor being preferred, can be summarized in the immunophenotype modification of the cells that comprise said microenvironment, preferably, fibroblasts, inflammatory cells and vascular endothelial cells, preferably in relation to the synthesis of key molecules in the progression of tumors, such as MMPs, NF-KB, TGF and SPARC.
  • Another modification of said peritumoral microenvironment, by treatment with non-peptide NK1 antagonists refers to the inhibition of neoangiogenesis by inhibiting the proliferation of vascular endothelial cells, a factor determining the progression of tumors.
  • non-peptide antagonists of NK1 receptors results in modifications in the cells that make up the tumor microenvironment, fibroblast line cells (stroma), vascular endothelial cells (vessels) and cells involved in the inflammatory and immune response (which promote the growth and perpetuation of tumors through the interaction between stromal cells and cancer cells) said modifications being beneficial for the treatment of cancer.
  • stroma fibroblast line cells
  • vessels vascular endothelial cells
  • the peritumoral environment modifying agent is any substance of a peptide or non-peptide nature, which has the ability to modify the peritumoral environment, as previously defined.
  • non-peptide antagonists of the NK1 receptors are preferably non-peptide antagonists of the NK1 receptors.
  • non-peptide antagonist of NK1 receptors means any substance of a non-peptide nature of sufficient size and conformation suitable to bind to the NK1 receptor and thus inhibit its normal functioning, including preventing SP or other agonists. of these receptors, join the aforementioned receptors.
  • non-peptide antagonists of commercial NK1 receptors have been tested in the present invention: L-733,060 ((2S, 3S) -3 - [(3,5- bis (Trifluoromethyl) phenyl) methoxy] -2-phenylpiperidine hydrochloride) (Sigma-Aldrich), L- 732, 138 (N-Acetyl-L-tryptophan 3,5-bis (trifluoromethyl) benzyl ester) (Sigma-Aldrich), L- 703,606 (cis-2- (Diphenylmethyl) - N - [(2-iodophenyl) methyl] -l-azabicyclo [2.2.2] octan-3-amine oxalate salt) (Sigma-Aldrich), WIN 62,577 (Sigma-Aldrich), CP-122721 (Pfizer), Aprepitant or MK 869 or L-754030 (MSD),
  • NK1 and SP receptors such as: Vofopitant or GR-205171 (Pfizer), Ezlopitant or CJ - can be used. 1 1974 (Pfizer), CP-122721 (Pfizer), L-758298 (MSD), L-741671, L-742694, CP-99994, Lanepitant or LY-303870, T-2328, LY-686017. Compounds are preferred: Aprepitant or MK 869 or L-754030 (MSD), Vestipitant or GW597599 (GSK) and Casopitant or GW679769 (GSK).
  • cancer is meant a malignant tumor of unlimited growth potential that expands locally by invasion and systemically by metastasis.
  • the NK1 receptor non-peptide antagonist is administered to individuals with a cancer.
  • Another of the objects described in the present invention relates to a method of treatment aimed at modifying the peritumoral microenvironment by administering to a patient suffering from cancer an effective amount of at least one agent modifying the peritumoral environment, preferably a non-antagonist.
  • NK1 receptor peptide preferably a non-antagonist.
  • the treatment method described in the present invention is useful for cancer patients, in an asymptomatic, symptomatic state, in neoadjuvant treatment (treatment before surgery), in adjuvant treatment (complementary treatment after surgery, when there is no detectable macroscopic tumor ) and in treatment of metastatic stage disease.
  • Another object of the present invention is a composition, preferably pharmaceutical, comprising at least one peritumoral environment modifying agent selected from:
  • Said pharmaceutical composition may further comprise pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients.
  • Preferred peritumoral environment modifying agents are non-peptide NK1 receptor antagonists. It should be understood that the pharmaceutical composition or medicament comprising at least one peritumoral environment modifying agent, preferably a non-peptide NK1 receptor antagonist, is presented in a pharmaceutically acceptable form to be administered to an individual directly, preferably by intravenous administration. , oral, parenteral, or by any other means. Intravenous administration refers directly to the application of the antagonist or a pharmaceutical composition that comprises it, directly in the patient's bloodstream.
  • Oral administration may involve swallowing, so that the antagonist, as well as a pharmaceutical composition comprising it, enters the gastrointestinal tract, or oral or sublingual administration can be used whereby the compound enters the bloodstream directly from the mouth.
  • Parenteral administration refers to routes of administration other than enteric, transdermal or inhalation, and is typically by injection or infusion. Parenteral administration includes intravenous, intramuscular and / or subcutaneous injection or infusion.
  • the term "medicament” or “pharmaceutical composition”, as used herein, refers to any substance used for prevention, diagnosis, relief, treatment or cure of diseases in man and animals.
  • the disease is cancer, preferably gastric carcinoma, more preferably gastric adenocarcinoma, colon carcinoma, more preferably colon adenocarcinoma, pancreas carcinoma, more preferably pancreas adenocarcinoma, breast carcinoma, more preferably breast adenocarcinoma and / or breast carcinoma, ovarian carcinoma, more preferably ovarian adenocarcinoma and / or ovarian carcinoma, endometrial carcinoma, choriocarcinoma, uterine cervix carcinoma, lung carcinoma, more preferably lung adenocarcinoma, carcinoma of non-small cell lung and / or small cell lung carcinoma, thyroid carcinoma, more preferably metastatic human papillary thyroid carcinoma and / or follicular thyroid carcinoma, bladder carcinoma, more preferably urine bladder carcinoma and / or transitional urine bladder carcinoma, prostate carcinoma, glial carcinoma of the central nervous system, sarcoma, more preferably fibrosarcoma, malignant fibrous his
  • the term "active substance”, “active substance”, “pharmaceutically active substance”, “active ingredient” or “pharmaceutically active ingredient” means any component that potentially provides a pharmacological activity or other different effect on the diagnosis, cure, mitigation, treatment, or prevention of a disease, or that affects the structure or function of the body of man or other animals.
  • the term includes those components that promote a chemical change in the preparation of the drug and are present therein in a modified form intended to provide the specific activity or effect.
  • the peritumoral environment modifying agent preferably non-peptide antagonists of the NK1 receptors of the invention, can be administered alone or in a composition with pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients.
  • oral administration is the preferred method and is preferably achieved through solid dosage forms, including capsules, tablets, pills, powders and granules, among others, or by liquid dosage forms.
  • the peritumoral environment modifying agent preparations for parenteral administration preferably include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions or emulsions, among others.
  • pharmaceutically acceptable vehicle refers to a vehicle that must be approved by a federal government regulatory agency or a government state or listed in the American Pharmacopoeia or the European Pharmacopoeia, or other pharmacopoeia generally recognized for use in animals, and more specifically in humans.
  • suitable pharmaceutically acceptable excipients will vary depending on the particular dosage form selected.
  • suitable pharmaceutically acceptable excipients may be selected for a particular function that they may have in the composition. For example, certain pharmaceutically acceptable excipients may be selected for their ability to facilitate the production of uniform dosage forms. Certain pharmaceutically acceptable excipients can be selected for their ability to facilitate the production of stable dosage forms.
  • Certain pharmaceutically acceptable excipients may be selected for their ability to facilitate the transport of the compound or compounds of the invention once administered to the patient from an organ or part of the body to another organ or part of the body. Certain pharmaceutically acceptable excipients can be selected for their ability to improve patient acceptance. Suitable pharmaceutically acceptable excipients include the following types of excipients, not excluding others known in the state of the art: diluents, fillers, binders, disintegrants, lubricants, glidants, granulating agents, coating agents, moisturizing agents, solvents, co-agents.
  • the dosage of the active ingredient, in the present case, of the peritumoral environment modifying agent may be selected depending on the desired therapeutic effect, from the route of administration and duration of treatment.
  • the dose of administration and the frequency will depend on the size, age and general health conditions of the individual, taking into account the possibility of side effects. Administration will also depend on the simultaneous treatment with other drugs and the tolerance of each individual to the drug administered. Persons skilled in the art may establish the appropriate dose using standard procedures. It is understood that the dose should be the effective amount of the active ingredient, peritumoral environment modulating agent, preferably non-peptide NK1 antagonist, in the sense that the treatment has at least the same or better effect than the current therapies in these patients.
  • composition may comprise at least one peritumoral environment modifying agent as the only agent useful in the treatment of cancer or combinations thereof with other therapeutic agents depending on the condition, preferably selected from agents capable of inducing apoptosis in tumor cells and / or chemotherapy agents and / or radiotherapy agents.
  • One of the objects of the present invention relates to the use of at least one peritumoral environment modifying agent selected from:
  • an agent capable of inhibiting neoangiogenesis by inhibiting the proliferation of vascular line cells and / or (ii) an agent capable of inhibiting the synthesis by fibroblast lineage cells of markers selected from any of the following: TGF- ⁇ , TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, TGF- ⁇ 3, SPARC, MMP- 3; MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-13 and MMP-14 and / or
  • EGF EGF, MMP-9, VEGF and TNF-a
  • agents that modify the peritumoral environment are capable of reducing the size of tumors, in addition to inhibiting their growth and expansion.
  • the use of the peritumoral environment modifying agent or the agent itself, the invention is characterized in that the cells of the endothelial line are preferably vascular endothelial cells, the cells of the fibroblast line are preferably fibroblasts and the cells of The immune and / or inflammatory line are preferably mononuclear leukocytes, polymorphonuclear leukocytes and macrophages.
  • the use of the peritumoral environment modifying agent or the agent itself, the invention is characterized in that, the peritumoral environment modifying agent is a non-peptide antagonist of NK1 receptors.
  • the non-peptide antagonists of the NK1 receptors are selected from any of the following: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant, Lanepitant, LY-686017, L-733,060, L-732, 138, L -703,606, WIN 62,577, CP-122721,, TAK-637, and R673, CP-100263, WIN 51708, CP-96345, L-760735, CP-122721, L-758298, L-741671, L-742694, CP -99994, T-2328, antagonists selected from among: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant and Lanepitant being especially preferred.
  • the use of the peritumoral environment modifying agent or the agent itself, the invention is characterized in that the medicament or pharmaceutical composition useful in the treatment of cancer comprises at least one other active ingredient that induces apoptosis in the tumor cells.
  • said principle that induces apoptosis in tumor cells is selected from any of the following: Chlorambucil, Melphalan, Aldesleukin, 6-mercaptopurine, 5-fluoruracil, Ara-c, Bexarotene, Bleomycin, Capecitabine, Carboplatin, Cisplatin, Docetaxel, Doxorubicin, Epirubicin, Fludarabine, Irinotecan, Methotrexate, Mitoxantrone, Oxaliplatin, Paclitaxel, Rituximab, Etoposide, Teniposide, Vincristine, Vinblastine, Vinorelbumin, Tratinibumatin, Imatinibxima, Tratin
  • an agent capable of inhibiting the synthesis by cells of the fibroblast line of selected markers from any of the following: TGF- ⁇ , TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2,
  • TGF- ⁇ 3 SPARC, MMP-3; MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-13 and MMP-14 and / or
  • the composition of the invention is characterized in that the cells of the endothelial line are preferably vascular endothelial cells, the cells of the fibroblastic line are preferably fibroblasts and the cells of the immune and / or inflammatory line are preferably leukocytes mononuclear, polymorphonuclear leukocytes and macrophages.
  • the composition of the invention is characterized in that the peritumoral environment modifying agent is a non-peptide antagonist of NK1 receptors.
  • the non-peptide antagonists of the NK1 receptors are selected from any of the following: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant, Lanepitant, LY-686017, L-733,060, L-732, 138, L -703,606, WIN 62,577, CP-122721,, TAK-637, and R673, CP-100263, WIN 51708, CP-96345, L-760735, CP- 122721, L-758298, L-741671, L-742694, CP -99994, T-2328, being especially preferred antagonists selected from: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant and Lanepitant.
  • composition of the invention is characterized in that it is a pharmaceutical composition.
  • the composition of the invention is characterized in that it further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the composition of the invention is characterized in that it also comprises at least one other active ingredient that induces apoptosis in tumor cells, said active principle being selected from any of the following: Chlorambucil, Melphalan, Aldesleukin, 6-mercaptopurine, 5-fluoruracil, Ara-c, Bexarotene, Bleomycin, Capecitabine, Carboplatin, Cisplatin, Docetaxel, Doxorubicin, Epirubicin, Fludarabine, Irinotecan, Methotrexate, Mitoxantrone, Oxaliplatin, Paclitaxel, Rituximabine, Vinotylostoidin, Vintobine, Vintin, Vintin, Vintin Erlotinib, Cetuximab, Trastuzumab.
  • composition of the invention is characterized in that it is administered separately, together or sequentially, with another anticancer agent selected from any of the following: chemotherapy agent or radiotherapy agent.
  • Another object described in the present invention relates to a pharmaceutical form comprising a composition as previously defined throughout the present invention.
  • Another object described in the present invention relates to the use of the composition or pharmaceutical form of the invention in the preparation of a medicament, preferably for the treatment of cancer.
  • Another object referred to in the present invention is a combined preparation comprising:
  • the combined preparation of the invention is characterized in that the peritumoral environment modifying agent is a non-peptide NK1 receptor antagonist.
  • the non-peptide antagonists of the NK1 receptors are selected from any of the following: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant, Lanepitant, LY-686017, L- 733,060, L-732, 138, L-703,606, WIN 62,577, CP-122721,, TAK-637, and R673, CP-100263, WIN 51708, CP-96345, L-760735,, CP-122721, L-758298 , L-741671, L-742694, CP-99994, T- 2328.
  • the combined preparation of the invention is characterized in that the non-peptide antagonists of the NK1 receptors are selected from any of the following: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant and Lanepitant.
  • the combined preparation of the invention is characterized in that the active ingredient that induces apoptosis in tumor cells is selected from any of the following: Chlorambucil, Melphalan, Aldesleukin, 6-Mercaptopurine, 5-Fluoruracil, Ara- c, Bexarotene, Bleomycin, Capecitabine, Carboplatin, Cisplatin, Docetaxel, Doxorubicin, Epirubicin, Fludarabine, Irinotecan Methotrexate, Mitoxantrone Oxaliplatin, Paclitaxel, Rituximab, Vinblastine, Etoposid, Trackingostin, Vinistimestin, Cystinothibotin, Cystinothibotin, Ethylbibetum thereof.
  • the active ingredient that induces apoptosis in tumor cells is selected from any of the following: Chlorambucil, Melphalan, Aldesleukin, 6-Mercaptopurine, 5-Fl
  • the combined preparation of the invention is characterized in that it is administered separately, together or sequentially with another anticancer agent selected from any of the following: chemotherapy agent or radiotherapy agent.
  • Another object described in the present invention relates to the separate, simultaneous or sequential use of the active ingredients of the combined preparation as defined in the present invention, in the preparation of a medicament, preferably for the treatment of cancer.
  • Another object described in the present invention relates to a method of treatment, directed at a patient suffering from cancer, by administering an effective amount or effective of at least the composition, or of the pharmaceutical form or of the combined preparation or of the peritumoral environment modifying agent, described in the present invention.
  • the use of the peritumoral environment modifying agent, the peritumoral environment modifying agent itself, the composition, the pharmaceutical form, the combined preparation and the method of treatment of the invention are characterized in that they are useful in the treatment of different types of cancer, such as gastric carcinoma, preferably gastric adenocarcinoma, colon carcinoma, preferably colon adenocarcinoma, pancreas carcinoma, preferably pancreas adenocarcinoma, breast carcinoma, preferably breast adenocarcinoma and / or carcinoma of the breast, ovarian carcinoma, preferably ovarian adenocarcinoma and / or ovarian carcinoma, endometrial carcinoma, choriocarcinoma, uterine cervix carcinoma, lung carcinoma, preferably lung adenocarcinoma, non-small cell lung carcinoma and / or lung carcinoma small cell, thyroid carcinoma, preferably nt metastatic human papillary thyroid carcinoma and / or follicular thyroid carcinoma, bladder carcinoma
  • gastric carcinoma preferably
  • Example 1 Treatment with non-peptide antagonists of NK1 receptors inhibits the proliferation of human endothelial cell lines.
  • NK1 receptors in the human C-12210 vascular endothelial cell line (constituted by microvascular endothelial cells from juvenile foreskin; PromoCell GmbH, SickingenstraBe 63/65, D-69126 Heidelberg, Germany), using the Western-Blot technique. Briefly, the extraction of total proteins was carried out from the samples obtained from cell cultures. The cells were lysed by methods commonly known in the state of the art and their concentration was quantified by a commercial "Protein Assay" kit from Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, SA Madrid), following the manufacturer's instructions.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • the membranes were washed with phosphate buffered saline (PBS) and in the presence of Tween-20 detergent (PBST) and incubated with a secondary antibody conjugated to horseradish peroxidase for 2 hours at room temperature (1: 10000 dilution). To confirm that the same amount of protein had been loaded, the membranes were incubated with the anti-p-tubulin monoclonal antibody. Antibody detection was performed with a chemiluminescence reaction (ECL Western Blot detection; Amersham Life Science, United Kingdom). The presence of NK1 receptors was also analyzed by immunohistochemical techniques.
  • PBS phosphate buffered saline
  • PBST Tween-20 detergent
  • a sample of each of the cell line cultures used in the present invention was centrifuged (5 minutes at 1,500 rpm) and the pellet obtained was dehydrated by treatment at increasing concentrations of ethanol and, finally, in xylol. Then, said dehydrated samples were included in paraffin creating a block of cells. Said paraffin blocks were cut in a microtome to a thickness of 5 microns, which were placed on slides suitable for performing immunohistochemical techniques. Subsequently, they were deparaffinized by immersion in xylol, to be subsequently hydrated through a series of solutions containing decreasing concentrations of Ethanol, to finally submerge them in water.
  • the next step was the addition of the Envision System-HRP (Dako) reagents for 30 min at room temperature. After this time, the samples were washed again in 0.05 M Tris buffer, and the immunoreactivity was visualized by light microscopy with a chromogenic solution with 3,3'-Diaminobenzidine (DAB +; Dako, USA). To differentiate cell nuclei, they were stained slightly with hematoxylin. As a negative control, samples that were not incubated with the primary anti-NKl antibody were used, being replaced by non-immune serum. All samples were evaluated.
  • Dako 3,3'-Diaminobenzidine
  • C-12210 cells were grown in suitable medium (PromoCell Growth Medium; Promocell GmbH, Germany), according to the manufacturer's instructions, in the presence of increasing concentrations of different non-peptide antagonists of NK1 receptors.
  • a white sample (without cells) and a control sample (containing 10 4 cells / ml) were included in the tumor cell culture plates.
  • 20 ⁇ of MTS was added to each of the wells of the cell culture plates 90 minutes before reading the samples in a multiscanner spectrophotometer (TECAN Spectra classic, Barcelona, Spain ) at 492 nm (test wavelength) and 690 nm (reference wavelength).
  • the different doses of each of the non-peptide NKl antagonists were tested in duplicate and each experiment was performed in sextuplicate.
  • the antagonists used for proliferation assays were: L-733,060 ((2S, 3S) -3- [(3,5-bis (Trifluoromethyl) phenyl) methoxy] -2-phenylpiperidine hydrochloride), L-732, 138 (N - Acetyl-L-tryptophan 3,5-bis (trifluoromethyl) benzyl ester), L-703,606 oxalate salt hydrate (cis- 2- (Diphenylmethyl) -N - [(2-iodophenyl) methyl] -l-azabicyclo [2.2.
  • Table 1 shows the increase in proliferation of C-12210 cells cultured in the presence of increasing concentrations of SP (NK1 receptor agonist). I say agonist has a stimulating effect on the growth of human endothelial cells. The results shown in Table 1 are expressed as a percentage with respect to the ⁇ SD control.
  • SP NK1 receptor agonist
  • Tables 2 to 4 show the ability of NK1 receptor antagonists to inhibit cell proliferation, demonstrated by the use of the C12210 cell line.
  • the data expressed as a percentage with respect to the control ⁇ SD of the non-peptide antagonists of the NK1 receptor: Aprepitant, Vestipitant and Casopitant at the concentrations indicated in the tables for 24, 48 and 72 hours are shown.
  • the Different doses were tested in duplicate and each experiment was performed in sextuplicate. The results show that the inhibition of the growth of said endothelial cells is time and dose dependent. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antagonists.
  • Table 2 Analysis of the proliferation of C-12210 cell cultures in the presence of increasing concentrations of Aprepitant. The table shows the percentage of inhibition ⁇ SD of each treatment with respect to the control.
  • Table 3 Analysis of the proliferation of C-12210 cell cultures in the presence of increasing concentrations of Vestipitant. The table shows the percentage of inhibition ⁇ SD of each treatment with respect to the control.
  • Table 4 Analysis of the proliferation of C-12210 cell cultures in the presence of increasing concentrations of Casopitant. The table shows the percentage of inhibition ⁇ SD of each treatment with respect to the control.
  • Example 2 Modification of the peritumoral microenvironment, specifically of fibroblast line cells, by treatment with non-peptide antagonists of NK1 receptors.
  • the present example shows the effect of treatment with non-peptide antagonists of NK1 receptors in the modification of the peritumoral microenvironment, specifically in human primary fibroblasts (PHF).
  • PHF human primary fibroblasts
  • the cells were washed, resuspended in DMEM with high glucose (Dulbecco 's Modified Eagle' s Medium, Invitrogen) supplemented with 1% antibiotic-antimycotic (Invitrogen) and 1% pyruvate of sodium (Invitrogen), and seeded in culture plates at a concentration of 10,000 cells per square centimeter.
  • the adherent cells were separated using 0.5% sterile trypsin (Invitrogen) and used between lanes 3 and 9.
  • the PHFs were seeded in 24-well plates at a concentration of 25,000 cells per well.
  • NK1 receptor agonists for example SP
  • stromal cell changes preferably fibroblasts, similar to those observed in these same cells in the peritumoral areas and that such changes are reversed by non-peptide antagonists of NK1 receptors
  • TGFa, TGF, SPARC and MMPs different molecular markers associated with tumor progression
  • PHF was cultured in the presence of SP at a concentration ⁇ ⁇ (positive control) (S6883; Sigma-Aldrich) and together with different non-peptide antagonists of NK1 receptors at a concentration of ⁇ ⁇ , specifically the results are shown obtained with the antagonists Aprepitant, Vestipitant and Casopitant. After 48 hours of culture, the cells were collected and paraffin cell blocks were constructed for immunohistochemical analyzes, as previously explained in Example 1.
  • Example 3 Modification of the peritumoral microenvironment, specifically of the cells involved in inflammatory / immune processes, by treatment with non-peptide antagonists of the NK1 receptors.
  • NK1 antagonists are the cells involved in inflammatory and / or immune processes.
  • the next step was to analyze the effect exerted by treatment with non-peptide NK1 antagonists in said cells, specifically in blood mononuclear and polymorphonuclear cells. Briefly, heparinized blood from healthy donors was centrifuged, so that the different components of it are separated. The red blood cells remain at the bottom of the tube. Above them is a small whitish layer that is composed of white blood cells and above, in the upper part of the tube, the blood plasma.
  • the white blood cell layer was distributed in a 24-well culture plate, adding in each of them the same concentration of blood plasma from the same donor, supplemented with 1% of antibiotics-antifungals (Invitrogen).
  • PPF antibiotics-antifungals
  • SP was added to these cultures at a concentration of 1 ⁇ or SP a the same concentration together with the non-peptide antagonists of the NK1 receptors, Aprepitant, Vestipitant and Casopitant, all of them at the concentration of 1 ⁇ .
  • the cells were collected and included in paraffin for expression analyzes by immunohistochemical techniques (as described in Example 1).
  • TGF anti-TGF 2, SAB4502956
  • NF-kB anti-NF-kB, SAB4501992
  • Tables 6 and 7 show the presence of TGF and NF-KB in mononuclear cells (Table 6) and polymorphonuclear cells (Table 7) of samples from cultures treated with SP alone.
  • treatment with SP in combination with non-peptide antagonists of NK1 receptors does not show expression of the molecular markers analyzed (absence of staining) in samples of mononuclear and polymorphonuclear cell cultures.
  • non-peptide antagonists of the NK1 receptors is capable of reversing the expression of said markers, which shows the ability of said antagonists to inhibit the genesis of these mediators and, therefore, prevent the development of a tumor microenvironment that allows survival, enlargement and progression of tumors.
  • the use of non-peptide antagonists of NK1 receptors prevents the survival, development and progression of tumors.
  • Table 6 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in mononuclear cells in the presence of non-peptide antagonists of NK1 receptors. The table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • Table 7. Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in polymorphonuclear cells in the presence of non-peptide antagonists of NK1 receptors. The table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • the macrophages were seeded in culture plates at a concentration of approximately 1000 cells per square centimeter, using the pleural fluid itself as a culture medium (to obtain an experimental model similar to the human), supplemented with 1% of antibiotics-antifungals (Invitrogen) , for exposure to the NK1 receptor agonist (SP) and exposure to NK1 receptor antagonists.
  • SP NK1 receptor agonist
  • NK1 receptor agonists for example SP
  • NK1 receptor agonists for example SP
  • NK1 receptor agonists induce immunophenotypic changes in macrophages, similar to those observed in these same cells in the peritumoral areas and that these changes are reversed by treatment with non-peptide receptor antagonists.
  • NK1 the presence or expression has been analyzed by immunohistochemical techniques (see Example 1) of the EGF markers, MMP-9, VEGF and IL-8, by means of specific antibodies against them, in cultures of PHM in the presence of SP ( ⁇ ) (S6883; Sigma-Aldrich) and in the presence of SP and each of the NK1 receptor antagonists, Aprepitant , Vestipitant and Casopitant, all of them at the concentration of 1 ⁇ .
  • SP ⁇
  • EGF EGF
  • MMP-9 polyclonal antibody rabbit anti-MMP-9: SAB4501896; Sigma-Aldrich
  • VEGF anti-VEGF mouse monoclonal antibody, GF25-100UG, Merck-Millipore
  • TNF- ⁇ anti-TNF- ⁇ mouse monoclonal antibody, number of catalog MAB 1021, obtained from Merck-Millipore
  • All these antibodies were used at a concentration of 1/1000.
  • the specific secondary antibody mapping system was used for primary antibodies obtained from rabbit or mouse, as required in each case, both from Envision (Dako). All experiments were performed in sextuplicate.
  • non-peptide antagonists of NK1 receptors prevents the development and progression of tumors, by inhibiting the secretion by HPM of substances that favor their growth and progression. , and thus inducing the reduction of the size of said tumors and decreasing their invasion capacity.
  • Table 8 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in macrophages grown in the presence of SP alone or together with non-peptide antagonists of NK1 receptors.
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • EGF EGF
  • MMP-9 VEGF
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • IL-8 was also determined by the Western Blot technique, as explained in Example 1, using as primary antibody the anti-leucine-8 antibody, (AB1427, Merck-Millipore). The results showed that HPM cultured in the presence of SP showed expression of said marker, however, when the non-peptide antagonists of NK1 receptors were added, said expression disappeared completely, as was the case with the results shown above.
  • Non-peptide antagonists of the NK1 receptor inhibit the secretion, by fibroblasts, of substances that favor the progression of cancer.
  • stromal cells preferably fibroblasts
  • fibroblasts favors the secretion by fibroblasts of different molecules that in turn stimulate the proliferation and survival of tumor cells.
  • tumor cell lines used in the present invention were subjected to joint cultures with fibroblasts (obtained as explained in Example 2), to joint cultures in the presence of the NK1 receptor agonist ( SP) and to joint cultures in the presence of said agonist and of the various non-peptide antagonists of the NK1 receptor.
  • the different tumor cell lines used specifying in each case the type of tumor to which they correspond, the company that supplies them and the catalog code, are shown in Table 9. Table 9. Tumor cell lines used in the present invention.
  • the markers analyzed in fibroblastic cells were: TGF-a, TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, TGF- ⁇ 3, SPARC, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP -13 and MMP-14.
  • Table 10 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts (PHF) co-cultured with human gastric adenocarcinoma tumor cells (reference 23132/87) (co-culture) in the presence of SP alone or together with non-peptide antagonists of NK1 receptors.
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • TGF-a 0 12.3 ⁇ 1, 1% 32.4 ⁇ 1, 1% 0 0 0 0
  • Table 11 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts (PHF) co-cultured with human colon adenocarcinoma tumor cells (reference SW-403) (co-culture) in the presence of SP alone or together with non-peptide antagonists of NK 1 receptors.
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • Table 12 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts (PHF) co-cultured with human pancreatic adenocarcinoma tumor cells (CAPAN-1 reference) (co-culture) in the presence of SP alone or together with non-peptide antagonists of NK1 receptors.
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • TGF-a 0 12.3 ⁇ 1, 1% 42.4 ⁇ 2, 1% 0 0 0 0
  • TGF- ⁇ 1 0 13.4 ⁇ 1, 1% 37.6 ⁇ 1.4% 0 0 0 0
  • Table 14 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts (PHF) co-cultured with ovarian carcinoma tumor cells (reference EFO-27) (co-culture) in the presence of SP alone. or together with non-peptide antagonists of NK1 receptors.
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • Table 15 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts (PHF) co-cultured with human endometrial carcinoma tumor cells (reference AN3-CA) (co-culture) in the presence of SP alone or together with non-peptide antagonists of NK1 receptors.
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • Table 16 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts (PHF) co-cultured with human choriocarcinoma tumor cells (reference AC-1M32) (co-culture) in the presence of SP alone or together with non-peptide antagonists of the NK1 receptors.
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • Table 17 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts (PHF) co-cultured with human uterine cervix carcinoma tumor cells (KB reference) (co-culture) in the presence of SP alone. or together with non-peptide antagonists of NK1 receptors.
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • Table 18 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts (PHF) co-cultured with lung carcinoma tumor cells (reference A-427) (co-culture) in the presence of SP alone. or together with non-peptide antagonists of NK1 receptors.
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • Table 19 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts (PHF) co-cultured with thyroid carcinoma tumor cells (reference A-427) (co-culture) in the presence of SP alone. or together with non-peptide antagonists of NK1 receptors.
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • Table 19 Similar results to those shown in Table 19 were obtained when PHF was co-cultured with cells of the tumor cell lines of human papillary thyroid carcinoma (B-CPAP) or follicular human thyroid carcinoma (TT2609-C02).
  • Table 20 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts (PHF) co-cultured with urine bladder carcinoma tumor cells (reference 5637) (co-culture) in the presence of SP alone or together with non-peptide antagonists of NK1 receptors.
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • Table 21 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts (PHF) co-cultured with human prostate carcinoma tumor cells (reference 22RV1) (co-culture) in the presence of SP alone or together with non-peptide antagonists of the NK1 receptors.
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • TGF-a 0 12.3 ⁇ 1, 1% 41.4 ⁇ 2, 1% 0 0 0 0
  • Table 23 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts (PHF) co-cultured with human fibrosarcoma tumor cells (reference HT-1080) (co-culture) in the presence of SP alone or together with non-peptide antagonists of the NK1 receptors.
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • Table 24 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts (PHF) co-cultured with human Edwing sarcoma tumor cells (reference MHH-ES-1) (co-culture) in the presence of SP alone or together with non-peptide antagonists of NK1 receptors.
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • Table 25 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts (PHF) co-cultured with human melanoma tumor cells (reference MEL-HOl) (co-culture) in the presence of SP alone or together with non-peptide antagonists of NK1 receptors.
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • Table 27 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts (PHF) co-cultured with tumor cells of lymphoblastic leukemia B (SDl reference) (co-culture) in the presence of SP alone or together with non-peptide antagonists of NK1 receptors.
  • PEF fibroblasts
  • SDl reference lymphoblastic leukemia B
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • TGF-a 0 12.3 ⁇ 1, 1% 41.4 ⁇ 3, 1% 0 0 0 0
  • TGF- ⁇ 1 0 13.4 ⁇ 1, 1% 42.5 ⁇ 4.2% 0 0 0 0
  • Table 28 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts (PHF) co-cultured with human Burkitt lymphoma tumor cells (reference CA-46) (co-culture) in the presence of SP alone or together with non-peptide antagonists of NK1 receptors.
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • Table 29 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts (PHF) co-cultured with human T-lymphoma tumor cells (reference DERL-7) (co-culture) in the presence of SP alone or together with non-peptide antagonists of NK1 receptors.
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of cells expressing each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • TGF-a 0 12.3 ⁇ 1, 1% 62.5 ⁇ 3, 1% 0 0 0 0
  • the results shown in the present example show that the interaction between tumor cells and stromal cells - fibroblasts - induces changes and modifications in the physiology of these cells corresponding to those of said cells in the context. associated with cancer, such as the expression of TGF-a, TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, TGF- ⁇ 3, SPARC, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-13 and MMP-14.
  • the co-culture addiction of the NK1 receptor agonist (SP) induces an increase in the secretion of said substances and this secretion is reversed by treatment with non-peptide antagonists of said receptor.
  • the expression of these substances is a key fact in the progression of tumors and is, in turn, a key fact in the survival and maintenance of tumors.
  • the use of NK1 receptor antagonists has, therefore, beneficial effects in the treatment of cancer.
  • Example 6 The non-peptide antagonists of the NK1 receptor inhibit, by the fibroblasts, the secretion of substances that favor the progression of cancer in vivo.
  • Example 5 The in vitro tests carried out in Example 5 are now carried out in an experimental model in vivo in mice.
  • TGF-a TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, TGF- ⁇ 3, MMP-7, MMP-11, MMP-14.
  • mice Permission for this animal experiment was obtained from the ethics committee of the Juan Ramón Jiménez Hospital in Huelva. Immunocompromised female mice of 5-6 weeks of age, nu / nu Balb / c nude mice, provided by Har ⁇ an Ibérica Barcelona (Spain) were used. They were maintained at 24 ° C and sterile conditions with food and water "ad libitum". Be they were injected with 2 x 10 7 tumor cells (corresponding, in each case to each of the tumor types specified in Table 9) in 200 ⁇ of PBS via subcutaneous route. Tumor size was measured and mice were evaluated for their health status and weight daily. The mice were randomized into two groups when the tumors reached a volume of 75 mm 3 .
  • One of the groups was treated with non-peptide antagonists of the NK1 receptor and the other with 200 ⁇ 1 of placebo.
  • a list of the non-peptide NK1 receptor antagonists used, the route of administration and the dose is shown in Table 30.
  • Ten animals were treated for each group, for 7 days. All mice were sacrificed at the end of the experiment. The tumors were removed, and a sample of subcutaneous stromal tissue was taken away from the tumor. Tumors and stromal samples from non-tumor areas away from the tumor were cut in half, fixed with formalin (4%) and subsequently included in paraffin blocks for further analysis by immunohistochemistry.
  • TGF-a SAB4502953
  • TGF- ⁇ 1 SAB4502954
  • TGF- ⁇ 2 SAB4502956
  • TGF- ⁇ 3 SAB4502957
  • MMP-7 SAB4501894
  • MMP- 11 SAB4501898
  • MMP-14 SAB4501901
  • Table 31 shows the mean ⁇ SD volume of tumors of control mice (untreated) or treated with non-peptide antagonists of the NK-1 receptor. This table also indicates the cell line used for the formation of tumors, specifying in each case the type of tumor to which they correspond, the company that supplies them and the catalog code.
  • Table 31 Type of tumor caused in an in vivo mouse model. Average tumor volume in control mice (untreated) or in mice after treatment with non-peptide NK1 receptor antagonists. Cellphone line. Control Aprepitant Vestipitant Casopitant
  • Tables 32 to 35 show the type of marker used and the average percentage of fibroblasts present in non-tumor, tumor and peritumoral areas ( ⁇ SD) that expressed the marker indicated in each of the types of tumor developed from of the different cell lines used. All this in mice treated with non-peptide NK1 receptor antagonists and in untreated animals (control). As an example, Tables 32 to 35 show the results obtained with four of the tumor lines described in Table 9. Table 32.
  • Table 33 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts isolated from the tumor or peritumoral area of tumors produced in an animal mouse model by injecting cells from the human glioma tumor line (GAMG ), in mice treated or not (control group) with different NK1 receptor antagonists.
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of fibroblasts that express each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • Table 34 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts isolated from the tumor or peritumoral area of tumors produced in an animal mouse model by injecting cells from the human rhabdomyosarcoma tumor line (A -204), in mice treated or not (control group) with different NK1 receptor antagonists.
  • the table shows the percentage ⁇ SD of the number of fibroblasts that express each marker with respect to the total number of cells in each sample.
  • Table 35 Analysis of the expression of different molecular markers associated with tumor development and progression in fibroblasts isolated from the tumor or peritumoral zone of tumors produced in an animal mouse model by injecting human melanoma tumor line (MEL) cells HO), in mice treated or not (control group) with different NK1 receptor antagonists.
  • MEL human melanoma tumor line
  • the fibroblasts of the tumor and peritumoral areas express the tumor markers, while their expression is not appreciated in the non-tumor areas, demonstrating that the "z ' w live interaction "of fibroblasts with tumor cells, induces the expression and secretion of these molecules. It is also seen how treatment with non-peptide antagonists of NK1 receptors inhibits the expression of these molecules. Therefore, in mammals the interaction between fibroblasts and tumor cells induces expression in the fibroblasts of the aforementioned molecules of importance in the microenvironment, in the persistence and in the progression of tumors. This expression is canceled by exposure to non-peptide antagonists of the NK1 receptor.
  • fibroblasts In stromal cell samples, fibroblasts, from areas far from the tumor of all cases treated with the different NK1 receptor antagonists and control groups (not treated) the percentage of fibroblasts with expression of all immunohistochemical markers studied was 0%. Similar results to those shown in Tables 33 to 35 were obtained when other non-peptide NK1 receptor antagonists were used: L- 733,060, L-732, 138, L-703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP- 96345 and L-760735.
  • Example 7 The interaction of primary tumor cells, obtained directly from humans, with human vascular endothelial cells, stimulates the survival of both cell types and treatment with non-peptide antagonists of NK1 receptors inhibits said survival.
  • Table 36 Characteristics of patients from whom samples were obtained for cell culture.
  • Leukemia B Female 21 Chronic Leukemia B
  • Example 2 The same method described in Example 2 was used to obtain the tumor cells from human primary tumors. Once isolated, they were plated in 24-well plates at a concentration of 25,000 cells per well. A total of 6 wells containing the tumor cells were used as survival control. Another 6 wells containing the tumor cells were cultured with the addition of endothelial cells. Another 6 wells containing the tumor cells were cultured in the presence of endothelial cells and the NK1 receptor agonist (SP). Other groups of 6 wells containing the tumor cells were cultured in the presence of endothelial cells, the NK1 receptor agonist (SP) and each of the non-peptide antagonists of the NK1 receptor, Aprepitant, Vestipitant and Casopitant.
  • SP NK1 receptor agonist
  • Tables 37 to 41 detail the percentage of inhibition / survival in reference to control, for the joint cultures of tumor cells-endothelial cells (Table 37), tumor cells-endothelial cells with exposure to the NK1 receptor agonist (SP) (Table 38), tumor cells-endothelial cells with exposure to the NK1 receptor antagonist (SP) and each of the NKl receptor antagonists: Aprepitant, Vestipitant and Casopitant (Tables 39-41). The same results were obtained when other non-peptide NK1 receptor antagonists were used: L-733,060, L-732, 138, L-703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP-96345 and L-760735. Table 37. Percentage of inhibition / survival in reference to the control of joint cultures of tumor cells-endothelial cells.
  • Table 38 Percentage of inhibition / survival in reference to control, for joint cultures of tumor cells-endothelial cells in the presence of SP (1 ⁇ ).
  • Endothelial cells in tumor cells in tumor cells
  • Tumor endothelial tumor type co-culture with co-culture with
  • Colon carcinoma 100 100 243 ⁇ 4 253 ⁇ 4
  • Pancreatic carcinoma 100 100 287 ⁇ 3 252 ⁇ 4
  • Ovarian carcinoma 100 100 282 ⁇ 4 254 ⁇ 4
  • Endometrial carcinoma 100 100 283 ⁇ 5 252 ⁇ 3
  • Endothelial cells in tumor cells in tumor cells
  • Tumor endothelial tumor type co-culture with co-culture with
  • Thyroid carcinoma 100 100 260 ⁇ 5 240 ⁇ 6
  • Thyroid carcinoma 100 100 265 ⁇ 2 230 ⁇ 4
  • Prostate carcinoma 100 100 270 ⁇ 4 269 ⁇ 1
  • Fibrous histiocytoma 100 100 246 ⁇ 4 245 ⁇ 3 malignant
  • Ewing's sarcoma 100 100 234 ⁇ 5 236 ⁇ 4
  • Hodgkin lymphoma 100 100 248 ⁇ 5 265 ⁇ 4
  • Table 39 Percentage of inhibition / survival in reference to control, for joint cultures of tumor cells - endothelial cells in the presence of SP (1 ⁇ ) and non-peptide NK1 receptor antagonist, Aprepitant ( ⁇ ).
  • Pancreatic carcinoma 100 100 52 ⁇ 4 46 ⁇ 6
  • Renal Carcinoma 100 100 56 ⁇ 2 53 ⁇ 3
  • Endometrial carcinoma 100 100 57 ⁇ 4 49 ⁇ 3
  • Thyroid carcinoma 100 100 45 ⁇ 3 46 ⁇ 6
  • Thyroid carcinoma 100 100 56 ⁇ 6 56 ⁇ 4
  • Prostate carcinoma 100 100 54 ⁇ 4 47 ⁇ 5
  • Fbrosarcoma 100 100 45 ⁇ 6 55 ⁇ 6
  • Fibrous histiocytoma 100 100 56 ⁇ 6 44 ⁇ 5 malignant.
  • Ewing's sarcoma 100 100 45 ⁇ 5 45 ⁇ 7
  • Table 40 Percentage of inhibition / survival in reference to control, for joint cultures of tumor cells - endothelial cells in the presence of SP (1 ⁇ ) and non-peptide NK1 receptor antagonist, Vestipitant ( ⁇ ).
  • Pancreatic carcinoma 100 100 55 ⁇ 3 47 ⁇ 5
  • Endometrial carcinoma 100 100 56 ⁇ 5 47 ⁇ 6
  • Thyroid carcinoma 100 100 46 ⁇ 4 47 ⁇ 5
  • Thyroid carcinoma 100 100 52 ⁇ 5 55 ⁇ 6
  • Prostate carcinoma 100 100 51 ⁇ 6 48 ⁇ 6
  • Fibrous histiocytoma 100 100 53 ⁇ 4 46 ⁇ 7 malignant.
  • Lymphoma No Hodgking B 100 100 65 ⁇ 4 43 ⁇ 5 Cells cells
  • Table 41 Percentage of inhibition / survival in reference to control, for joint cultures of tumor cells - endothelial cells in the presence of SP (1 ⁇ ) and non-peptide NK1 receptor antagonist, Casopitant ( ⁇ ⁇ ).
  • Pancreatic carcinoma 100 100 54 ⁇ 5 48 ⁇ 5
  • Renal Carcinoma 100 100 55 ⁇ 2 57 ⁇ 4
  • Endometrial carcinoma 100 100 57 ⁇ 6 44 ⁇ 6
  • Prostate carcinoma 100 100 57 ⁇ 5 49 ⁇ 3
  • Fibrous histiocytoma 100 100 56 ⁇ 5 47 ⁇ 3 malignant.
  • Ewing's sarcoma 100 100 49 ⁇ 5 49 ⁇ 3
  • Hodgkin lymphoma 100 100 45 ⁇ 4 77 ⁇ 4
  • Example 8 The interaction of primary tumor cells, obtained directly from humans, with human stromal cells - fibroblasts - obtained from the same patient, stimulates the survival of both cell types and treatment with non-peptide antagonists of NK1 receptors inhibits said survival.
  • a total of 6 wells containing the tumor cells were used as survival control of the same other 6 wells containing the tumor cells were cultured with the addition of stromal cells - fibroblasts - another 6 Wells containing the tumor cells were cultured in the presence of stromal cells - fibroblasts - and the NK1 receptor agonist (SP), another groups of 6 wells containing the tumor cells were cultured in the presence of human stromal cells - fibroblasts - the receptor agonist.
  • SP NKl
  • each of the NKl receptor non-peptide antagonists analyzed: Aprepitant, Vestipitant and Casopitant.
  • Tables 42 to 46 detail the percentage of inhibition / survival in reference to control, for joint cultures of tumor cells-fibroblastic stromal cells (Table 42), tumor cells-fibroblastic stromal cells with exposure to the NK1 receptor agonist (SP ) (Table 43), tumor cells-fibroblastic stromal cells with exposure to the NK1 receptor antagonist (SP) and each of the NKl receptor antagonists: Aprepitant, Vestipitant and Casopitant (Tables 44-46).
  • Table 42 Percentage of inhibition / survival in reference to the control of joint cultures of tumor cells-fibroblast stromal cells.
  • control (control) (control) cells fibroblast tumor cells
  • Pancreatic carcinoma 100 100 117 ⁇ 3 132 ⁇ 2
  • Renal Carcinoma 100 100 132 ⁇ 3 143 ⁇ 4
  • Ovarian carcinoma 100 100 122 ⁇ 3 152 ⁇ 4
  • Endometrial carcinoma 100 100 126 ⁇ 2 143 ⁇ 5
  • Thyroid carcinoma 100 100 125 ⁇ 4 143 ⁇ 4
  • Prostate carcinoma 100 100 126 ⁇ 5 141 ⁇ 5
  • Table 44 Percentage of inhibition / survival in reference to control, for joint cultures of tumor cells-endothelial cells in the presence of SP (1 ⁇ ) and non-peptide antagonist of the NK1 receptor, Aprepitant ( ⁇ ).
  • Pancreatic carcinoma 100 100 85 ⁇ 3 36 ⁇ 5
  • Endometrial carcinoma 100 100 87 ⁇ 3 44 ⁇ 6
  • Thyroid carcinoma 100 100 87 ⁇ 3 45 ⁇ 3
  • Prostate carcinoma 100 100 85 ⁇ 6 49 ⁇ 4
  • Table 45 Percentage of inhibition / survival in reference to control, for the joint cultures of tumor cells - endothelial cells in the presence of SP (1 ⁇ ) and the non-peptide antagonist of the NK1 receptor, Vestipitant ( ⁇ ).
  • Renal Carcinoma 100 100 88 ⁇ 6 53 ⁇ 5
  • Ovarian carcinoma 100 100 84 ⁇ 5 55 ⁇ 5
  • Endometrial carcinoma 100 100 86 ⁇ 6 46 ⁇ 4
  • Prostate carcinoma 100 100 81 ⁇ 5 49 ⁇ 5
  • Table 46 Percentage of inhibition / survival in reference to control, for joint cultures of tumor cells - endothelial cells in the presence of SP (1 ⁇ 1) and non-peptide NK1 receptor antagonist, Casopitant ( ⁇ ).
  • Pancreatic carcinoma 100 100 85 ⁇ 3 49 ⁇ 4
  • Endometrial carcinoma 100 100 94 ⁇ 5 48 ⁇ 7
  • Thyroid carcinoma 100 100 75 ⁇ 4 41 ⁇ 3
  • Thyroid carcinoma 100 100 75 ⁇ 5 56 ⁇ 4
  • Prostate carcinoma 100 100 57 ⁇ 7 47 ⁇ 2
  • Hodgkin lymphoma 100 100 60 ⁇ 3 75 ⁇ 3
  • Example 9 The interaction of the primary tumor cells, obtained directly from humans, with the immune / inflammatory system cells (mono and polymorphonuclear leukocytes) obtained from that same patient, stimulates the survival of both cell types and treatment with non-peptide antagonists. of NK1 receptors inhibits such survival.
  • Example 7 The same method described in Example 7 was used to obtain tumor cells from human primary tumors.
  • the leukocytes were obtained from the centrifugation of the blood of the same patient. They were grown in fresh plasma of the same patient, in order to build a physiological model similar to the human.
  • a total of six wells were used to culture the inflammatory cells (mono and polymorphonuclear leukocytes) as a control, a total of 6 wells containing the tumor cells were used as survival control of said cells Tumor, another 6 wells containing the tumor cells were cultured with the addition of immune / inflammatory system cells (mono and polymorphonuclear leukocytes), another 6 wells containing the tumor cells were cultured in the presence of immune / inflammatory system cells (mono and white leukocytes polymorphonuclear) and the NK1 (SP) receptor agonist, other groups of 6 wells containing tumor cells were cultured in the presence of immune / inflammatory system cells (mono and polymorphonuclear leukocytes), the NK1 (SP) receptor agonist and each One of the non-peptide NK1 receptor antagonists analyzed: Aprepitant, Vestipitant and Casopitant As in Example 7, it was found that both immune / inflammatory system
  • Tables 47 to 51 detail the percentage of inhibition / survival in reference to control, for joint cultures of tumor cells - immune system cells - mono or polymorphonuclear leukocytes - (Table 47), tumor cells - immune system cells - mono or polymorphonuclear leukocyte - with exposure to the NK1 receptor agonist (SP) (Table 48), tumor cells - immune system cells - mono or polymorphonuclear leukocyte -, with exposure to the NK1 (SP) receptor antagonist and each of the antagonists of the NK1 receptor: Aprepitant, Vestipitant and Casopitant (Tables 49-51).
  • SP NK1 receptor agonist
  • Table 47 Percentage of inhibition / survival in reference to the control of joint cultures of tumor cells-cells of the immune / inflammatory system (leukocytes).
  • Pancreatic carcinoma 100 100 116 ⁇ 4 192 ⁇ 3
  • Ovarian carcinoma 100 100 123 ⁇ 4 192 ⁇ 5
  • Endometrial carcinoma 100 100 124 ⁇ 4 193 ⁇ 6
  • Thyroid carcinoma 100 100 125 ⁇ 5 192 ⁇ 7
  • Prostate carcinoma 100 100 124 ⁇ 6 191 ⁇ 6
  • Breast carcinoma 100 100 123 ⁇ 3 194 ⁇ 4 Table 48. Percentage of inhibition / survival in reference to control, for joint cultures of tumor cells - cells of the immune / inflammatory system (leukocytes) in the presence of SP (1 ⁇ ).
  • Table 49 Percentage of inhibition / survival in reference to control, for joint cultures of tumor cells - cells of the immune / inflammatory system (leukocytes) in the presence of SP (1 ⁇ ) and the non-peptide NK1 receptor antagonist, Aprepitant ( ⁇ ).
  • Renal Carcinoma 100 100 91 ⁇ 5 41 ⁇ 7
  • Ovarian carcinoma 100 100 90 ⁇ 4 40 ⁇ 7
  • Endometrial carcinoma 100 100 93 ⁇ 3 42 ⁇ 5
  • Leukocytes Leukocyte Cells in Tumor Cells
  • Thyroid carcinoma 100 100 85 ⁇ 3 46 ⁇ 7
  • Prostate carcinoma 100 100 80 ⁇ 5 41 ⁇ 6
  • Ewing's sarcoma 100 100 75 ⁇ 5 40 ⁇ 6
  • Table 50 Percentage of inhibition / survival in reference to control, for joint cultures of tumor cells of the immune / inflammatory system in the presence of SP (1 ⁇ ) and non-peptide antagonist of the NK1 receptor, Vestipitant ( ⁇ ).
  • Pancreatic carcinoma 100 100 91 ⁇ 5 51 ⁇ 7
  • Renal Carcinoma 100 100 89 ⁇ 6 51 ⁇ 6
  • Endometrial carcinoma 100 100 91 ⁇ 7 52 ⁇ 8
  • Thyroid carcinoma 100 100 94 ⁇ 8 60 ⁇ 7
  • Prostate carcinoma 100 100 91 ⁇ 6 58 ⁇ 6
  • Example 10 The interaction of the primary tumor cells, obtained directly from humans, with the cells of the immune / inflammatory system (macrophages), obtained from that same patient, stimulates the survival of both cell types and treatment with non-peptide antagonists of the NK1 receptors inhibits such survival.
  • Example 7 To obtain the tumor cells from human primary tumors, the same method described in Example 7 was used. Similar to what was done in the aforementioned example, a total of six wells were used to culture the inflammatory cells (macrophages) as control. , a total of 6 wells containing the tumor cells were used as survival control of said tumor cells, another 6 wells containing the tumor cells were cultured with the addition of immune / inflammatory system cells (macrophages), another 6 wells containing the tumor cells were grown in the presence of immune / inflammatory system cells (macrophages) and the NK1 (SP) receptor agonist, other groups of 6 Wells containing the tumor cells were cultured in the presence of immune / inflammatory system cells (mono and polymorphonuclear leukocytes), the NK1 receptor agonist (SP) and each of the NK1 receptor non-peptide antagonists analyzed: Aprepitant, Vestipitant and Casopitant .
  • immune / inflammatory system cells macro and polymorphonuclear leuk
  • Tables 52 to 56 detail the percentage of inhibition / survival in reference to the control, for joint cultures of tumor cells - immune system cells - inflammatory (macrophages) - (Table 52), tumor cells - immune system cells - inflammatory (macrophages) - with exposure to the NK1 receptor agonist (SP) (Table 53), tumor cells - immune system cells - inflammatory (macrophages) -, with exposure to the NK1 (SP) receptor antagonist and each of the antagonists of the NK1 receptor: Aprepitant, Vestipitant and Casopitant (Tables 54-56).
  • Ovarian carcinoma 100 100 125 ⁇ 5 190 ⁇ 8
  • Endometrial carcinoma 100 100 128 ⁇ 7 197 ⁇ 7
  • Table 53 Percentage of inhibition / survival in reference to control, for joint cultures of tumor cells - cells of the immune / inflammatory system in the presence of SP (1 ⁇ ).
  • Table 54 Percentage of inhibition / survival in reference to control, for joint cultures of tumor cells - cells of the immune / inflammatory system in the presence of SP (1 ⁇ ) and non-peptide receptor antagonist NK1, Aprepitant ( ⁇ ).
  • Renal Carcinoma 100 100 90 ⁇ 6 40 ⁇ 6
  • Endometrial carcinoma 100 100 96 ⁇ 6 48 ⁇ 7
  • Prostate carcinoma 100 100 89 ⁇ 5 51 ⁇ 7
  • Table 55 Percentage of inhibition / survival in reference to control, for joint cultures of tumor cells - cells of the immune / inflammatory system in the presence of SP (1 ⁇ ) and non-peptide receptor antagonist NK1, Vestipitant ( ⁇ ).
  • Endometrial carcinoma 100 100 90 ⁇ 6 58 ⁇ 7
  • Lung carcinoma 100 100 90 ⁇ 7 56 ⁇ 7
  • Example 11 The interaction of human tumor cells with human stromal cells - fibroblasts - stimulates the secretion of substances important for the survival and progression of tumors and treatment with non-peptide antagonists of NK1 receptors inhibits said secretion. .
  • Example 7 In order to obtain tumor cells from human primary tumors, the same protocol used in Example 7 was carried out. A control group containing exclusively fibroblasts in culture was used as a control of the expression of substances in them, other groups containing tumor cells were cultured with the addition of stromal cells - fibroblasts - other groups containing tumor cells were cultured in the presence of stromal cells - fibroblasts - and the NK1 (SP) receptor agonist and other groups containing tumor cells were cultured in the presence of human stromal cells - fibroblasts - the NK1 receptor agonist (SP) and each of the non-peptide antagonists of the NK1 receptor: Aprepitant, Vestipitant and Casopitant.
  • SP NK1 receptor agonist
  • TGF- ⁇ (SAB4502953), TGF- ⁇ 1 (SAB4502954) , TGF- ⁇ 2 (SAB4502956), TGF- ⁇ 3 (SAB4502957), SPARC (HPA002989), MMP-3 (HPA007875); MMP-7 (SAB4501894), MMP-9 (SAB4501896), MMP-11 (SAB4501898), MMP-13 (SAB4501900) and MMP-14 (SAB4501901), by specific antibodies against them.
  • tumor cells tumor cells

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Abstract

El objeto de la presente invención va dirigido al uso de agentes modificadores del ambiente peritumoral, específicamente los antagonistas no peptídicos del receptor NK1,para el tratamiento del cáncer. El ambiente peritumoral lo conforman las células estromales, la matriz estromal, la vascularización intra y peritumoral y las células responsables de la respuesta inflamatoria y/o inmunitaria circundante al tumor. La modificación de dicho ambiente peritumoral tiene como finalidad lareduccióndel tamaño del tumor, impedir sudesarrollo y, eventualmente inducir su desaparición.La presente invención describe además composiciones farmacéuticas que comprendan dichos agentes modificadores del ambiente peritumoral, sólos o en combinación con al menos otro princpio activo, para el tratamiento del cáncer.

Description

USO DE AGENTES MODIFICADORES DEL AMBIENTE PERITUMORAL PARA EL
TRATAMIENTO DEL CÁNCER
SECTOR DE LA TÉCNICA.
La presente invención se encuadra en el sector de la medicina. Más en concreto en la biología molecular aplicada a la medicina, la farmacología y la oncología. Específicamente, está relacionada con el uso de agentes modificadores del ambiente peritumoral, preferentemente antagonistas no peptídicos de los receptores NK1, para la fabricación de medicamentos de utilidad en el tratamiento del cáncer, en los seres humanos.
ESTADO DE LA TÉCNICA.
Los receptores NK1 (receptores neuropeptídicos de la Sustancia P y de las taquicininas), están ampliamente distribuidos en las células del organismo. Se ha constatado su presencia en el sistema nervioso central y periférico de los mamíferos, en el aparato digestivo, en el sistema circulatorio, en las células de estirpe hematopoyética y de respuesta inflamatoria y/o inmunitaria, así como en los tejidos blandos y especialmente, en el endotelio vascular. Actualmente se conocen numerosos procesos biológicos en cuya regulación están involucrados los receptores NK1.
La Sustancia P (SP) es un undecapéptido de origen natural, que pertenece a la familia de las taquicininas, es producido en los mamíferos y su secuencia fue descrita por Veber et al, (US 4,680,283). La familia de las taquicinincas también incluye otros péptidos como Neurokinina A, Neurokinina B, Neuropéptido K, Neuropéptido Gamma y Hemokinina I, entre otros. La implicación de la SP y de otras taquicininas en la etiopatogenia de diversas enfermedades ha sido ampliamente referida en la bibliografía científica. En este sentido, la acción de las taquicininas se ha relacionado con la etiopatogenia de enfermedades del sistema nervioso humano como la Enfermedad de Alzheimer, la Esclerosis Múltiple, la Enfermedad de Parkinson, la ansiedad y la depresión (Barker R. et al, 1996; Kramer MS, et al, 1998). También se ha constatado la implicación de las taquicininas en la etiopatogenia de diversas enfermedades con componente inflamatorio como la artritis reumatoide, el asma, la rinitis alérgica, las enfermedades inflamatorias intestinales como la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn (Maggi CA, et al, 1993). En este sentido, se han desarrollado antagonistas no peptídicos de los receptores NKl como medicamentos para el tratamiento de diversos desórdenes del sistema nervioso central como la depresión, la psicosis y la ansiedad (WO 95/16679, WO 95/18124, WO 95/23798 y WO 01/77100). Se ha descrito que el uso de antagonistas selectivos del receptor NKl es útil en el tratamiento de las náuseas y el vómito inducido por quimioterápicos antineoplásicos, así como en el tratamiento de ciertas formas de incontinencia urinaria (Quartara L. et al, 1998; Doi T. et al, 1999).
En un trabajo publicado en 2003 (Giardina G. et al, 2003), se hace una revisión de las patentes más recientes sobre antagonistas de receptores NKl . Se describen las moléculas de los más importantes fabricantes mundiales con indicación de sus posibles aplicaciones entre las que cabe destacar: antidepresivo, antinflamatorio, ansiolítico, antiemético, tratamiento de la colitis ulcerosa y otros. En el artículo publicado por Antal Orosz et al., (Orosz A, et al., 1995), se describe el uso de diversos antagonistas de la SP para inhibir la proliferación de carcinoma de células pulmonares (por ejemplo en células designadas NCI-H69). También, en el artículo publicado por Bunn PA Jr (Bunn PA Jr. et al, 1994), se describen antagonistas de la SP capaces de inhibir el crecimiento in vi tro de varias líneas celulares pulmonares cancerosas (por ejemplo las células designadas NCI-H510, NCI-H345 y SHP-77).
En el artículo publicado por Palma C y cois. (Palma C. et al, 2000), se describe que los astrocitos del sistema nervioso central expresan receptores funcionales para varios neurotransmisores incluidos los receptores NKl . En los tumores cerebrales, las células gliales malignas derivadas de astrocitos desencadenan bajo la acción de las taquicininas y por mediación de los receptores NKl, la secreción de mediadores que aumentan su velocidad de proliferación. Consecuentemente, los antagonistas selectivos del NKl pueden ser muy útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento de gliomas malignos. En la patente EP 773026 (Pfizer) se hace referencia a la utilización de antagonistas no peptídicos del receptor NKl para el tratamiento de cánceres en mamíferos. Particularmente en el tratamiento de pequeños carcinomas pulmonares, APUDOMAS (tumores de células enterocromafines que se localizan de modo predominante en la mucosa del tubo digestivo. Sus siglas significan "Amine Precursos Uptake and Decarboxylation", utilización y decarboxilación de los precursores de aminas). Por otro lado, en la patente WO 2001001922 se describe el uso de antagonistas de receptores NK1 para el tratamiento de adenocarcinomas y muy específicamente los carcinomas prostáticos.
Diversos estudios con antagonistas específicos de los receptores de la neurokinina NK como el CP-96341-1 (Pfizer), MEN 11467, SR 48968 (Sanofi) y MEN 11420 (Nepadutant) han demostrado la eficacia de los mismos en el bloqueo de la proliferación celular (Singh D et al, 2000; y Bigioni M. et al, 2005).
Se ha descrito que los antagonistas no peptídicos de receptores NK1 inducen apoptosis (muerte celular) en las células tumorales de diversos tumores como el carcinoma de estómago, el carcinoma de colon (Rosso M, et al, 2008) o el melanoma (Muñoz M, et al, 2010). Así mismo, se ha descrito que estos receptores están sobre-expresados en las células cancerosas.
La patente ES 2246687 reivindica la utilización de los antagonistas no peptídicos de receptores NK1 y de la SP en la elaboración de una composición farmacéutica para la producción de apoptosis en células tumorales de mamíferos. Por otro lado, la solicitud de patente WO2012020162 describe el uso de anticuerpos o fragmentos de los mismos, frente a los receptores NK1, NK2 y/o NK3, útiles en el tratamiento del cáncer, mediante la producción de apoptosis de las células tumorales. En este sentido, cabe destacar que existen dos tipos de antagonistas peptídicos de los receptores NK1 : los polipéptidos (secuencias de aminoácidos -10 ó 20) que son los primeros que se sintetizaron, pero que se abandonaron -hay que tener en cuanta que los agonistas como la sustancia P son polipéptidos, pero en este caso sintetizados por el propio organismo) y los anticuerpos monoclonales. Las ventajas que presentan los antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 frente a los peptídicos son principalmente que los no peptídicos tienen potencialmente menos efectos indeseables (los peptídicos o los monoclonales pueden generar respuesta inmune del organismo contra ellos mismos) y además, los antagonistas no peptídicos se pueden administrar vía oral y son más fáciles de sintetizar.
En la génesis y desarrollo del cáncer no sólo intervienen mecanismos moleculares propios de las células tumorales, sino que tienen gran importancia las células que rodean el tumor, específicamente las células del estroma y las células inflamatorias, así como las interacciones que tienen lugar entre las células tumorales y las células circundantes al tumor (células estromales y células inflamatorias) (McAllister SS. Et al. 2010; Ikushima H. et al. 2010). Además, algunas sustancias, por ejemplo el factor nuclear NF-KB (factor nuclear kappa B), el TGF-β (factor de crecimiento transformante β), el SPARC (del término en inglés "secreted protein acidic, cysteine-rich") o el TGF-α (factor de crecimiento transformante a) se ha demostrado que están presentes en el microambiente tumoral y que son de gran importancia en la génesis y la progresión de los tumores (Coussens L et al. 2002). TGF puede inhibir el paso de las formas precursoras de linfocito CD8+ a formas de células efectoras (Berzofsky JA, et al, J Clin Invest. 2004; 113: 1515-1525). SPARC desempeña un papel importante relacionado con la neoangiogénesis tumoral (Carmeliet P et al. 2000). En este sentido, la neoangiogénesis, la inmunidad y la inflamación son factores claves para la progresión de los tumores (Hanahan D et al. 2000). Es conocida la importancia de algunas moléculas producidas por los fibroblastos en la progresión del cáncer e, incluso, se ha propuesto el uso de algunas de ellas como dianas terapéuticas en el tratamiento del cáncer mediante el uso de anticuerpos monoclonales específicos contra las mismas (Welt S, et al, J Clin Oncol 1994). En concreto, y relacionadas con el microambiente peritumoral, las Metaloproteasas (MMPs) son enzimas que contienen un metal (zinc) y degradan proteínas de la matriz extracelular (colágeno IV, lamininas, elastinas, fibronectinas, proteoglicanos, etc). Se expresan de forma fisiológica en algunas situaciones como la cicatrización de heridas, la transición de cartílago a hueso y el desarrollo placentario. Se expresan de forma patológica en el proceso de la invasión y el desarrollo de metástasis en tumores (Clin Cáncer Res 2000, 6 :2349) . Las MMPs más frecuentemente implicadas en el desarrollo de tumores son: MMP-2 (Gelatinasa A), MMP-3 (Stromelysin 1), MMP-7 (Matrilysin), MMP-9 (Gelatinasa B), MMP-11 (Stromelysin 3), MMP- 13 (Collagenase 3) y MMP-14. Existen diversos fármacos conocidos como inhibidores de las metaloproteasas que se están estudiando en el tratamiento del cáncer: Batimastat (péptidomimético cuyas dianas son las MMP-1, 2, 3, 7 y 9), Marimastat (péptidomimético cuyas dianas son las MMP-1, 2, 3, 7, 9 y 12), Prinomastat (no péptidomimético cuyas dianas son las MMP-2, 3, 9, 13 y 14), Bay-129566 (no péptidomimético cuyas dianas son las MMP-2, 3 y 9), Metastat (tetraciclina cuyas dianas son las MMP-2 y 9), BMS 275291 (no péptidomimético cuyas dianas son las MMP-2 y 9) y Neovastat (obtenido de cartílago de tiburón cuyas dianas son las MMP-1, 2, 7, 9, 12 y 13). En concreto Marimastat ha superado ensayos clínicos en Fase I en cáncer de mama y de pulmón del tipo no microcítico, Prinomastat ha superado ensayos clínicos en Fase I en cáncer de próstata, Bay-129566 ha superado ensayos clínicos en Fase I en diversos tumores sólidos y BMS 275291 ha superado ensayos clínicos en Fase I en cáncer pulmón del tipo no microcítico. Además, el uso de Marimastat ha demostrado eficacia en el tratamiento del cáncer en estadio avanzado de páncreas (Rosemurgy et al., Procc ASCO 1999), en el cáncer gástrico avanzado (Fieldng et al, Procc ASCO 2000), en el glioblastoma (Puphanich et al, Procc ASCO 2001) y en el cáncer de mama tras primera línea de tratamiento de quimioterapia (Sparano et al, Procc ASCO 2002). Por lo tanto y en conclusión, en la actualidad son conocidos en el estado del arte, los siguientes hechos:
1. Que los receptores NKl están ampliamente difundidos en el organismo del ser humano.
2. Que las taquicininas y en concreto la SP actúan sobre los receptores NKl .
3. Que es posible la utilización de antagonistas no peptídicos de los receptores NKl para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de diversos desórdenes del sistema nervioso central como la depresión, la psicosis y la ansiedad lo que ha sido objeto de reivindicación en diversas solicitudes de patentes (WO 95/16679, WO 95/18124, WO 95/23798 y WO 01/77100).
4. Que la utilización de antagonistas no peptídicos del receptor NKl ha demostrado efectos sobre las células tumorales, que se traducen en su muerte celular por apoptosis
(ES 2246687).
5. Que, como ha quedado dicho, la patente ES 2 246 687 reivindica el uso de antagonistas no peptídicos de receptores NKl para inducir muerte y apoptosis en las células tumorales (y enumera un determinado número de los mismos, de forma concreta). Por lo tanto, no incluye los efectos que los antagonistas no peptídicos del receptor NKl pueda realizar a nivel de las sustancias y células que componen el microambiente tumoral y que son de crucial importancia para la génesis, el desarrollo y la progresión de los tumores.
6. Se ha demostrado la presencia de receptores NKl en las células hemáticas involucradas en la respuesta inflamatoria y/o inmunitaria, en las células de la matriz estromal y en las células propias de la vascularización que rodean a las células tumorales. Se sabe que las células estromales, las células hemáticas involucradas en la respuesta inflamatoria y/o inmunitaria y las células propias de la vascularización influyen en la evolución de los tumores malignos.
No obstante, las anterioridades conocidas, que incluyen la utilización de los antagonistas no peptídicos de receptores NKl para la producción de muerte y/o apoptosis en las células tumorales, el objeto de la presente invención así como la ventaja técnica que aporta, es la utilización de agentes moduladores del ambiente peritumoral, preferentemente seleccionados entre antagonistas no peptídicos de receptores NKl, para el tratamiento del cáncer, gracias a la capacidad que muestran para modificar el ambiente peritumoral mediante la inducción de cambios en las células que componen dicho ambiente y en las sustancias que secretan las mismas, con el objeto de impedir o dificultar la génesis, el desarrollo o la progresión de los tumores y reducir el tamaño de los mismos. Por lo tanto, la presente invención divulga el uso de agentes modificadores del ambiente peritumoral, preferentemente antagonistas no peptídicos de NK1 para la fabricación de un medicamento o composición farmacéutica de utilidad en el tratamiento terapéutico del cáncer por administración directa a un mamífero, incluyendo el hombre. Es conocido, en el estado de la técnica, que el receptor NK1 activa la proliferación celular, de manera preferente a través de la ruta de las MAP Kinasas, específicamente a través de sus eferentes "aguas abajo" como por ejemplo, ERK. ERK puede modular la proliferación celular a través de varios eferentes, a su vez "aguas abajo", de gran importancia como Fos/Jun o P90rsk, entre otros. Por otro lado, también es conocido en el estado de la técnica, que el receptor NK1 activa la proliferación celular, de manera preferente a través de la ruta de las PI3 Kinasas. La activación de la ruta de las PI3 Kinasas produce un aumento de uno de sus aferentes finales "aguas abajo" como es AKT. AKT ejerce un efecto anti-apoptótico celular a través de varios eferentes, a su vez "aguas abajo", de gran importancia como Bcl2 o un efecto estimulante de la proliferación celular a través, por ejemplo de las Ciclinas D. En la presente invención se demuestra que los antagonistas no peptídicos de NK1 son capaces de inhibir el crecimiento y proliferación tumoral en aquellos tipos de tumores en los que las vías de señalización de las MAP Kinasas y PI3 Kinasas se encuentran integras en dichas células, es decir, están activas, y por lo tanto el tratamiento con dichos antagonistas inhibe la proliferación de las células tumorales a través de las rutas de las MAP Kinasas y PI3 Kinasas, preferentemente a través de la inhibición de la expresión de diferentes efectores "aguas abajo" de dichas rutas, como por ejemplo ERK y AKT, respectivamente. En cambio, la presente invención pone de manifiesto que existen tumores específicos en los que el tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 no es capaz de inhibir su crecimiento, ni tampoco la activación de las vías de señalización de las MAP Kinasas y PI3 Kinasas. Pero cuando éste tipo de tumores se cultivan en presencia de las células que conforman el microambiente peritumoral (células estromales - fibroblastos- células inmunes/inflamatorias -leucocitos y macrófagos- y células del endotelio vascular) sí se produce inhibición de su proliferación, independientemente de las rutas de señalización de las MAP Kinasas o PI3 Kinasas. Este hecho pone de manifiesto que los antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 inhiben la supervivencia de las células tumorales mediante mecanismos relacionados con el bloqueo de la secreción de moléculas propias de la interacción de las células tumorales con otras células propias del microambiente tumoral, siendo dichos mecanismos diferentes a los conocidos en el estado de la técnica.
La ruta celular que, partiendo de los receptores NKl acaba en la inhibición de la apoptosis celular puede estar alterada, debido por ejemplo, a mutaciones "aguas abajo" de la vía de señalización del propio receptor NKl . En estos casos, la administración de antagonistas no peptídicos del receptor NKl no tendría el efecto predecible de inducción de la apoptosis de las células tumorales. En estos casos, la acción antitumoral debería ejercerse:
(i) Mediante inducción de apoptosis por otra vía diferente a NKl y/o
(ii) Incidiendo sobre el ambiente peritumoral para reducir el tamaño del tumor y/o impedir su desarrollo y/o hacerlo desaparecer.
En cualquier caso, determinar la integridad de la ruta metabólica mediada por los receptores NKl, en los casos de cáncer va a determinar:
a) Ajustar la dosis efectiva de los antagonistas de NKl, en particular y/o,
b) Ajustar la dosis efectiva de los agentes modificadores del ambiente peritumoral en general y/o,
c) Elegir el tipo de anti-tumoral a administrar, en combinación, eventualmente con el agente modificador del ambiente peritumoral, en general o, más específicamente, con el antagonista no peptídico de los receptores NKl .
El hecho de que la invención incida en el tratamiento del cáncer a través de la modificación del ambiente peritumoral para reducir el tamaño de los tumores, impedir su desarrollo y eventualmente, inducir su desaparición, permite ajustar las dosis efectivas de los agentes anti- tumorales tanto basados en quimio- como en radioterapia, así como la propia naturaleza de las combinaciones a efectuar con las mismas. Ello conlleva un tratamiento más eficaz, con un más amplio espectro en los tios de tumores a tratar, a dosis eventualmente más ajustadas, lo que implica menores efectos secundarios asociados y una mayor calidad de vida para los pacientes durante y post-tratamiento. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN.
Breve descripción de la invención Un objeto de la presente invención es la utilización de al menos un agente modificador del ambiente peritumoral, preferentemente antagonistas no peptídicos del receptor NKl, para la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica útil en el tratamiento del cáncer.
El microambiente peritumoral está formado por todas las células que rodean el tumor, preferentemente dicho ambiente, esta formado por las células estromales, preferentemente fibroblastos, la matriz estromal, las células vasculares y endoteliales intra y peritumorales y las células inflamatorias y/o inmunes circundantes al tumor, preferentemente leucocitos mono y polimorfonucleares y macrófagos. La modificación del microambiente peritumoral se lleva a cabo mediante la inducción de cambios en la matriz estromal y en las células peritumorales, así como en la respuesta inflamatoria y/o inmunitaria, que conduce a la inhibición del desarrollo del tumor y/o su progresión, siendo por tanto útiles en el tratamiento del cáncer. Las modificaciones producidas en el microambiente peritumoral mediante el tratamiento con al menos un agente modificador de dicho ambiente peritumoral, siendo preferidos los antagonistas no peptídicos del receptor NKl, pueden resumirse en la modificación del inmunofenotipo de las células que conforman dicho microambiente, preferentemente, fibroblastos, células inflamatorias y células endoteliales vasculares, preferentemente en lo relacionado con la síntesis de moléculas clave en la progresión de los tumores, como por ejemplo, MMPs, NF-KB, TGF y SPARC. Otra de las modificaciones de dicho microambiente peritumoral, mediante el tratamiento con antagonistas no peptídicos de NKl, se refiere a la inhibición de la neoangiogénesis mediante la inhibición de la proliferación de las células endoteliales vasculares, factor determinante de la progresión de los tumores. Por lo tanto, el uso de antagonistas no peptídicos de los receptores NKl da lugar a modificaciones en las células que componen el microambiente tumoral, células de estirpe fibroblástica (estroma), células endoteliales vasculares (vasos) y células implicadas en la respuesta inflamatoria e inmune (que propician el crecimiento y la perpetuación de los tumores mediante la interacción entre las células del estroma y las del cáncer) siendo dichas modificaciones beneficiosas para el tratamiento del cáncer. Estos cambios en el microambiente tumoral están encaminados a reducir el tamaño tumoral o a su eliminación completa, así como a impedir el desarrollo y la progresión de los mismos. Por lo tanto, a efectos de la presente invención el agente modificador del ambiente peritumoral es cualquier sustancia de naturaleza peptídico o no peptídica, que presenta la capacidad de modificar el ambiente peritumoral, según se ha definido previamente. Los agentes modificadores del ambiente peritumoral son preferentemente antagonistas no peptídicos de los receptores NK1. Como se usa aquí " antagonista no peptídico de los receptores NK1 " significa cualquier sustancia de naturaleza no peptídica con un tamaño suficiente y conformación adecuada para unirse al receptor NK1 y así inhibir su funcionamiento normal, incluyendo el hecho de evitar que la SP u otros agonistas de estos receptores, se unan a los mencionados receptores. Preferentemente, en la presente invención se han ensayado los siguientes antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 comerciales: L-733,060 ((2S,3S)-3-[(3,5- bis(Trifluoromethyl)phenyl)methoxy]-2-phenylpiperidine hydrochloride) (Sigma-Aldrich), L- 732, 138 (N-Acetyl-L-tryptophan 3,5-bis(trifluoromethyl)benzyl ester) (Sigma-Aldrich), L- 703,606 (cis-2-(Diphenylmethyl)-N-[(2-iodophenyl)methyl]-l-azabicyclo[2.2.2]octan-3-amine oxalate salt) (Sigma-Aldrich), WIN 62,577 (Sigma-Aldrich), CP-122721 (Pfizer), Aprepitant ó MK 869 ó L-754030 (MSD), TAK-637 (Takeda/Abbot), Vestipitant ó GW597599 (GSK), Casopitant ó GW679769 (GSK) y R673 (Roche). CP-100263, WIN 51708, CP-96345, L- 760735. De manera similar, se pueden utilizar otros compuestos antagonistas no peptídicos de receptores NK1 y de la SP tales como: Vofopitant ó GR-205171 (Pfizer), Ezlopitant ó CJ - 1 1974 (Pfizer), CP-122721 (Pfizer), L-758298 (MSD), L-741671, L-742694, CP-99994, Lanepitant ó LY-303870, T-2328, LY-686017. Son preferidos los compuestos: Aprepitant ó MK 869 ó L-754030 (MSD), Vestipitant ó GW597599 (GSK) y Casopitant ó GW679769 (GSK).
Por "cáncer" se entiende un tumor maligno de potencial crecimiento ilimitado que se expande localmente por invasión y sistémicamente por metástasis. De acuerdo con la presente invención, el antagonista no peptídico del receptor NK1 se administra a individuos con un cáncer.
Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere a un método de tratamiento dirigido a la modificación del microambiente peritumoral mediante la administración a un paciente que padezca cáncer de una cantidad efectiva de al menos un agente modificador del ambiente peritumoral, preferentemente un antagonista no peptídico de los receptores NK1. El método de tratamiento descrito en la presente invención es útil para pacientes afectos de cáncer, en estado asintomático, sintomático, en tratamiento neoadyuvante (tratamiento antes de cirugía), en tratamiento adyuvante (tratamiento complementario después de la cirugía, cuando no hay tumor macroscópico detectable) y en tratamiento de la enfermedad en estadio metastásico. Constituye otro objeto de la presente invención una composición, preferentemente farmacéutica, que comprenda al menos un agente modificador del ambiente peritumoral seleccionado entre :
(i) un agente capaz de inhibir la neoangiogénesis mediada por las células de la estirpe vascular y/o
(ii) un agente capaz de inhibir la síntesis, por parte de células de la estirpe fibroblástica, de marcadores seleccionados entre cualquiera de los siguientes: TGF-α , TGF-β 1, TGF-β 2, TGF-β 3, SPARC, MMP-3; MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-13 y MMP-14 y/o
(iii) un agente capaz de inhibir la síntesis, por parte de células de la estirpe inmunitaria y/o inflamatoria, de marcadores seleccionados entre cualquiera de los siguientes: TGF-β, NF- kB, EGF, MMP-9, VEGF y TNF-α, o combinaciones de los mismos, y que sea útil en el tratamiento del cáncer.
Dicha composición farmacéutica puede comprender además vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Los agentes modificadores del ambiente peritumoral preferidos son los antagonistas no peptídicos del receptor NKl . Debe entenderse que la composición farmacéutica o medicamento que comprenda al menos un agente modificador del ambiente peritumoral, preferentemente un antagonista no peptídico de los receptores NKl, se presenta en una forma aceptable farmacéuticamente para ser administrada a un individuo de forma directa, preferentemente mediante administración intravenosa, oral, parenteral, o por cualquier otra vía. La administración intravenosa se refiere directamente a la aplicación del antagonista o de una composición farmacéutica que lo comprenda, directamente en el torrente sanguíneo del paciente. La administración oral puede implicar la deglución, de modo que el antagonista, así como una composición farmacéutica que lo comprenda, entra en el tracto gastrointestinal, o puede utilizarse la administración bucal o sublingual mediante las cuales el compuesto entra en el torrente sanguíneo directamente desde la boca. La administración parenteral se refiere a vías de administración distintas de la entérica, transdérmica o por inhalación, y típicamente es por inyección o infusión. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intramuscular y/o subcutánea. El término "medicamento" o "composición farmacéutica", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención, la enfermedad es el cáncer, preferentemente carcinoma gástrico, más preferentemente adenocarcinoma gástrico, carcinoma de colon, más preferentemente adenocarcinoma de colon, carcinoma de páncreas, más preferentemente adenocarcinoma de páncreas, carcinoma de mama, más preferentemente adenocarcinoma de mama y/o carcinoma de mama, carcinoma de ovario, más preferentemente adenocarcinoma de ovario y/o carcinoma de ovario, carcinoma de endometrio, coriocarcinoma, carcinoma de cérvix uterino, carcinoma de pulmón, más preferentemente adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de célula no pequeña y/o carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de tiroides, más preferentemente carcinoma de tiroides papilar humano metastatizantes y/o carcinoma folicular de tiroides, carcinoma de vejiga, más preferentemente carcinoma de vejiga de la orina y/o carcinoma transicional de vejiga de la orina, carcinoma de próstata, carcinoma glial del sistema nervioso central, sarcoma, más preferentemente fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, sarcoma de Edwing, sarcoma del estroma endometrial humano, osteosarcoma y/o rabdomiosarcoma, melanoma, carcinomas embrionarios, más preferentemente neuroblastoma, neuroblastoma de médula ósea y/o retinoblastoma y carcinomas hematológicos, más preferentemente leucemia de células T/NK, leucemia linfoblástica B, leucemia linfoblástica T, linfoma B, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin, linfoma T y/o mieloma múltiple.
Como se emplea aquí, el término "principio activo", "substancia activa", "substancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto. Además, el agente modificador del ambiente peritumoral, preferentemente los antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 de la invención, pueden ser administrados solos o en una composición con vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Una persona experta en la materia adaptará la composición dependiendo de la forma particular de administración. En el caso de administrar un anticuerpo purificado, la administración oral es el método preferido y se consigue preferiblemente a través de formas de dosificación sólidas, que incluyen cápsulas, tabletas, pastillas, polvos y gránulos, entre otros, o por formas de dosificación líquida. Las preparaciones del agente modificador del ambiente peritumoral para la administración parenteral preferentemente incluyen soluciones acuosas o no acuosas estériles, suspensiones o emulsiones, entre otras. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo que debe estar aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o un gobierno estatal o enumerado en la Farmacopea Estadounidense o la Farmacopea Europea, u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales, y más concretamente en humanos. De la misma manera, los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados variarán dependiendo de la forma de dosificación particular seleccionada. Además, los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados pueden seleccionarse para una función particular que pueden tener en la composición. Por ejemplo, ciertos excipientes farmacéuticamente aceptables pueden seleccionarse por su capacidad para facilitar la producción de formas de dosificación uniformes. Ciertos excipientes farmacéuticamente aceptables pueden seleccionarse por su capacidad para facilitar la producción de formas de dosificación estables. Ciertos excipientes farmacéuticamente aceptables pueden seleccionarse por su capacidad para facilitar el transporte del compuesto o compuestos de la invención una vez administrados al paciente desde un órgano o parte del cuerpo a otro órgano o parte del cuerpo. Ciertos excipientes farmacéuticamente aceptables pueden seleccionarse por su capacidad para mejorar la aceptación por parte del paciente. Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen los siguientes tipos de excipientes, sin excluir otros conocidos en el estado de la técnica: diluyentes, cargas, aglutinantes, disgregantes, lubricantes, deslizantes, agentes de granulación, agentes de recubrimiento, agentes hidratantes, disolventes, co- disolventes, agentes de suspensión, emulsionantes, edulcorantes, aromatizantes, agentes para enmascarar el sabor, agentes colorantes, agentes contra la formación de tortas, humectantes, agentes quelantes, plastificantes, agentes para aumentar la viscosidad, antioxidantes, conservantes, estabilizantes, tensioactivos y agentes tamponantes. El especialista en la técnica apreciará que ciertos excipientes farmacéuticamente aceptables pueden realizar más de una función y pueden realizar funciones alternativas dependiendo de la cantidad de excipiente que esté presente en la formulación y qué otros ingredientes estén presentes en la formulación. Los especialistas tienen el conocimiento y habilidad en la técnica que les permite seleccionar excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados en las cantidades apropiadas para uso en la invención. Además, hay varios recursos disponibles para el especialista en la técnica que describen excipientes farmacéuticamente aceptables y pueden ser útiles en la selección de excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados. Los ejemplos incluyen Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company), The Handbook of Pharmaceutical Additives (Gower Publishing Limited), y The Handbook of Pharmaceutical Excipients (the American Pharmaceutical Association and the Pharmaceutical Press).
La dosificación del ingrediente activo, en el presente caso, del agente modificador del ambiente peritumoral, podrá ser seleccionada dependiendo del efecto terapéutico deseado, de la vía de administración y de la duración del tratamiento. La dosis de administración y la frecuencia dependerán del tamaño, edad y condiciones de salud generales del individuo, teniendo en cuenta la posibilidad de efectos secundarios. La administración también dependerá del tratamiento simultáneo con otros fármacos y la tolerancia de cada individuo al fármaco administrado. Las personas expertas en la materia podrán establecer la dosis apropiada usando procedimientos estándares. Se entiende que la dosis deberá ser la cantidad efectiva del principio activo, agente modulador del ambiente peritumoral, preferentemente antagonista no peptídico de NK1, en el sentido de que el tratamiento tenga como mínimo el mismo o mejor efecto que las terapias actuales en estos pacientes.
La composición puede comprender al menos un agente modificador del ambiente peritumoral como único agente de utilidad en el tratamiento del cáncer o combinaciones de los mismos con otros agentes terapéuticos dependiendo de la condición, seleccionados preferentemente entre agentes capaces de inducir apoptosis en las células tumorales y/o agentes de quimioterapia y/o agentes de radioterapia.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos aquí usados tienen el mismo significado a los habitualmente entendidos por una persona experta en el campo de la invención. Métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos pueden ser usados en la práctica de la presente invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes, no tienen carácter limitativo y por lo tanto no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Por el contrario, la palabra "consiste" y sus variantes, sí que presentan carácter limitativo, refiriéndose exclusivamente a las características técnicas, aditivo, componentes o pasos que la acompañan. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.
Descripción detallada de la invención. Uno de los objetos de la presente invención se refiere al uso de al menos un agente modificador del ambiente peritumoral seleccionado entre:
(i) un agente capaz de inhibir la neoangiogénesis, mediante la inhibición de la proliferación de las células de la estirpe vascular y/o (ii) un agente capaz de inhibir la síntesis por parte de células de la estirpe fibroblástica de marcadores seleccionados entre cualquiera de los siguientes: TGF-α , TGF-β 1, TGF-β 2, TGF-β 3, SPARC, MMP-3; MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-13 y MMP-14 y/o
(iii) un agente capaz de inhibir la síntesis por parte de células de la estirpe inmunitaria y/o inflamatoria de marcadores seleccionados entre cualquiera de los siguientes: TGF-β, NF-kB,
EGF, MMP-9, VEGF y TNF-a,
o combinaciones de los mismos, para la fabricación de un medicamento o composición farmacéutica útil en el tratamiento del cáncer, o indistintamente a al menos un agente modificador del ambiente peritumoral, según se ha definido previamente, para su uso en el tratamiento del cáncer. Como se pone de manifiesto en la presente invención los agentes modificadores del ambiente peritumoral son capaces de reducir el tamaño de los tumores, además de inhibir su crecimiento y expansión.
En una realización preferida, el uso del agente modificador del ambiente peritumoral o el propio agente la invención, se caracteriza por que las células de la estirpe endotelial son preferentemente, células endoteliales vasculares, las células de la estirpe fibroblástica son preferentemente fibroblastos y las células de la estirpe inmunitaria y/o inflamatoria son preferentemente leucocitos mononucleares, leucocitos polimorfonucleares y macrófagos. En otra realización preferida, el uso del agente modificador del ambiente peritumoral o el propio agente la invención, se caracteriza por que, el agente modificador del ambiente peritumoral es un antagonista no peptídico de los receptores NK1. En otra realización más preferida, los antagonistas no peptídico de los receptores NK1 se seleccionan de entre cualquiera de los siguientes: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant, Lanepitant, LY-686017, L-733,060, L-732, 138, L-703,606, WIN 62,577, CP-122721, , TAK-637, y R673, CP-100263, WIN 51708, CP-96345, L-760735, CP-122721, L-758298, L-741671, L-742694, CP-99994, T- 2328, siendo especialmente preferidos los antagonistas seleccionados de entre: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant y Lanepitant. En otra realización preferida, el uso del agente modificador del ambiente peritumoral o el propio agente la invención, se caracteriza por que el medicamento o composición farmacéutica útil en el tratamiento del cáncer comprende al menos otro principio activo que induce apoptosis en las células tumorales. En una realización preferida, dicho principio que induce apoptosis en las células tumorales se selecciona de entre cualquiera de los siguientes: Clorambucil, Melfalán, Aldesleukina, 6-mercaptopurina, 5-fluoruracilo, Ara-c, Bexaroteno, Bleomicina, Capecitabina, Carboplatino, Cisplatino, Docetaxel, Doxorrubicina, Epirrubicina, Fludarabina, Irinotecan, Metotrexato, Mitoxantrona, Oxaliplatino, Paclitaxel, Rituximab, Etopósido, Tenipósido, Vincristina, Vinblastina, Vinorelbina, Imatinib, Erlotinib, Cetuximab y Trastuzumab. En otra realización preferida, el uso del agente modificador del ambiente peritumoral o el propio agente la invención, se caracteriza por que se administra conjuntamente con otro agente anticancerígeno seleccionado entre cualquiera de los siguientes: agente de quimioterapia o agente de radioterapia. Otro de los objetos descritos en la presente invención hace referencia a una composición que comprende al menos un agente modificador del ambiente peritumoral seleccionado de entre:
(i) un agente capaz de inhibir la neoangiogénesis, mediante la inhibición de la proliferación de las células de la estirpe vascular y/o
(ii) un agente capaz de inhibir la síntesis por parte de células de la estirpe fibroblástica de marcadores seleccionados entre cualquiera de los siguientes: TGF-α , TGF-β 1, TGF-β 2,
TGF-β 3, SPARC, MMP-3; MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-13 y MMP-14 y/o
(iii) un agente capaz de inhibir la síntesis por parte de células de la estirpe inmunitaria y/o inflamatoria de marcadores seleccionados entre cualquiera de los siguientes: TGF-β, NF-kB, EGF, MMP-9, VEGF y TNF-a,
o combinaciones de los mismos.
En una realización preferida, la composición de la invención se caracteriza por que las células de la estirpe endotelial son preferentemente, células endoteliales vasculares, las células de la estirpe fibroblástica son preferentemente fibroblastos y las células de la estirpe inmunitaria y/o inflamatoria son preferentemente leucocitos mononucleares, leucocitos polimorfonucleares y macrófagos.
En otra realización preferida, la composición de la invención se caracteriza por que el agente modificador del ambiente peritumoral es un antagonista no peptídico de los receptores NKl . En otra realización más preferida, los antagonistas no peptídico de los receptores NKl se seleccionan de entre cualquiera de los siguientes: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant, Lanepitant, LY-686017, L-733,060, L-732, 138, L-703,606, WIN 62,577, CP-122721, , TAK-637, y R673, CP-100263, WIN 51708, CP-96345, L-760735, CP- 122721, L-758298, L-741671, L-742694, CP-99994, T-2328, siendo especialmente preferidos los antagonistas seleccionados de entre: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant y Lanepitant.
En otra realización preferida, la composición de la invención se caracteriza por que es una composición farmacéutica.
En otra realización preferida, la composición de la invención se caracteriza por que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización preferida, la composición de la invención se caracteriza por que además comprende al menos otro principio activo que induce apoptosis en las células tumorales, seleccionándose dicho principio activo de entre cualquiera de los siguientes: Clorambucil, Melfalán, Aldesleukina, 6-mercaptopurina, 5-fluoruracilo, Ara-c, Bexaroteno, Bleomicina, Capecitabina, Carboplatino, Cisplatino, Docetaxel, Doxorrubicina, Epirrubicina, Fludarabina, Irinotecan, Metotrexato, Mitoxantrona, Oxaliplatino, Paclitaxel, Rituximab, Etopósido, Tenipósido, Vincristina, Vinblastina,Vinorelbina, Imatinib, Erlotinib, Cetuximab, Trastuzumab.
En otra realización preferida, la composición de la invención se caracteriza por que se administra por separado, conjuntamente o de forma secuencial, con otro agente anticancerígeno seleccionado entre cualquiera de los siguientes : agente de quimioterapia o agente de radioterapia.
Otro objeto descrito en la presente invención se refiere a una forma farmacéutica que comprende una composición según se ha definido previamente a lo largo de la presente invención.
Otro objeto descrito en la presente invención se refiere al uso de la composición o de la forma farmacéutica de la invención en la elaboración de un medicamento, preferentemente para el tratamiento de cáncer.
Otro objeto al que hace referencia la presente invención es una preparación combinada que comprende:
(a) al menos un agente modificador del ambiente peritumoral según se ha definido a lo largo de la presente invención
(b) al menos un principio activo que induce apoptosis en las células tumorales. En una realización preferida, la preparación combinada de la invención se caracteriza por que el agente modificador del ambiente peritumoral es un antagonista no peptídico de los receptores NKl . En otra realización preferida, la preparación combinada de la invención se caracteriza por que los antagonistas no peptídico de los receptores NKl se seleccionan de entre cualquiera de los siguientes: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant, Lanepitant, LY-686017, L-733,060, L-732, 138, L-703,606, WIN 62,577, CP-122721, , TAK-637, y R673, CP-100263, WIN 51708, CP-96345, L-760735, , CP-122721, L-758298, L-741671, L-742694, CP-99994, T- 2328.
En otra realización preferida, la preparación combinada de la invención se caracteriza por que los antagonistas no peptídico de los receptores NKl se seleccionan de entre cualquiera de los siguientes: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant y Lanepitant.
En otra realización preferida, la preparación combinada de la invención se caracteriza por que el principio activo que induce apoptosis en las células tumorales se selecciona de entre cualquiera de los siguientes: Clorambucil, Melfalán, Aldesleukina, 6-Mercaptopurina, 5-Fluoruracilo, Ara- c, Bexaroteno, Bleomicina, Capecitabina, Carboplatino, Cisplatino, Docetaxel, Doxorrubicina, Epirrubicina, Fludarabina, Irinotecan Metotrexato, Mitoxantrona Oxaliplatino, Paclitaxel, Rituximab, Vinblastina, Etopósido, Tenipósido, Vincristina, Vinorelbina, Imatinib, Erlotinib, Cetuximab y Trastuzumab, o combinaciones de los mismos.
En otra realización preferida, la preparación combinada de la invención se caracterizada por que se administra por separado, conjuntamente o secuencial con otro agente anticancerígeno seleccionado entre cualquiera de los siguientes: agente de quimioterapia o agente de radioterapia.
Otro objeto descrito en la presente invención se refiere al uso por separado, simultáneo o secuencial de los principios activos de la preparación combinada según se define en la presente invención, en la elaboración de un medicamento, preferentemente para el tratamiento del cáncer.
Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere a un método de tratamiento, dirigido a un paciente que padece cáncer, mediante la administración de una cantidad efectiva o eficaz de al menos la composición, o de la forma farmacéutica o de la preparación combinada o del agente modificador del ambiente peritumoral, descritos en la presente invención.
Debe enfatizarse que el término "preparación combinada" o también denominada "yuxtaposición", en esta memoria, significa que los componentes de la preparación combinada no necesitan encontrarse presentes como unión, por ejemplo en una composición, para poder encontrarse disponibles para su aplicación separada o secuencial. De esta manera, la expresión "yuxtapuesta" implica que no resulta necesariamente una combinación verdadera, a la vista de la separación física de los componentes.
En otra realización preferida de la invención, el uso del agente modificador del ambiente peritumoral, el propio agente modificador del ambiente peritumoral, la composición, la forma farmacéutica, la preparación combinada y el método de tratamiento de la invención se caracterizan por que son útiles en el tratamiento de diferentes tipos de cáncer, como por ejemplo, carcinoma gástrico, preferentemente adenocarcinoma gástrico, carcinoma de colon, preferentemente adenocarcinoma de colon, carcinoma de páncreas, preferentemente adenocarcinoma de páncreas, carcinoma de mama, preferentemente adenocarcinoma de mama y/o carcinoma de mama, carcinoma de ovario, preferentemente adenocarcinoma de ovario y/o carcinoma de ovario, carcinoma de endometrio, coriocarcinoma, carcinoma de cérvix uterino, carcinoma de pulmón, preferentemente adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de célula no pequeña y/o carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de tiroides, preferentemente carcinoma de tiroides papilar humano metastatizantes y/o carcinoma folicular de tiroides, carcinoma de vejiga, preferentemente carcinoma de vejiga de la orina y/o carcinoma transicional de vejiga de la orina, carcinoma de próstata, carcinoma glial del sistema nervioso central, sarcoma, preferentemente fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, sarcoma de Edwing, sarcoma del estroma endometrial humano, osteosarcoma y/o rabdomiosarcoma, melanoma, carcinomas embrionarios, preferentemente neuroblastoma, neuroblastoma de médula ósea y/o retinoblastoma y carcinomas hematológicos, preferentemente leucemia de células T/NK, leucemia linfoblástica B, leucemia linfoblástica T, linfoma B, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin, linfoma T y/o mieloma múltiple.
A continuación, se muestran ejemplos a modo de ilustración, sin pretender que sean limitativos de la presente invención, dónde se ponen de manifiesto las ventajas de la invención. Ejemplo 1. El tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 inhibe la proliferación de líneas celulares de endotelio humano.
Para poner de manifiesto la modificación del microambiente peritumoral mediante el tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores MK1, en primer lugar, se procedió al análisis de la presencia de dichos receptores NK1 en la línea celular humana de endotelio vascular C- 12210 (constituida por células endoteliales microvasculares procedentes de prepucio juvenil; PromoCell GmbH, SickingenstraBe 63/65, D-69126 Heidelberg, Germany), mediante la técnica de Western-Blot. Brevemente, la extracción de las proteínas totales se realizó a partir de las muestras obtenidas de los cultivos celulares. Las células se lisaron mediante métodos comúnmente conocidos en el estado de la técnica y se cuantificó su concentración mediante un kit comercial "Protein Assay" de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, S.A. Madrid), siguiendo para ello las instrucciones del fabricante. De cada muestra, se separaron 50 mg de proteína por electroforesis en geles al 10% SDS-poliacrilamida y se transfirieron electroforéticamente a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Dichas membranas fueron incubadas durante toda la noche en una solución de bloqueo (5% de leche descremada en tampón fosfato -PBS- con un 0, 1% de Tween-PBST), seguido de una incubación durante la noche con los anticuerpos primarios diluidos 1/4000 en tampón PBST. Como anticuerpo primario se utilizó el anticuerpo anti-NKl (S8305, Sigma-Aldrich) que reconoce el dominio correspondiente a la región carboxilo terminal del receptor NK1 entre los aminoácidos 393-407. A continuación, las membranas fueron lavadas con tampón fosfato salino (PBS) y en presencia del detergente Tween-20 (PBST) y se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano durante 2 horas a temperatura ambiente (dilución 1 : 10000). Para confirmar que se había cargado la misma cantidad de proteína, las membranas se incubaron con el anticuerpo monoclonal anti-p-tubulina. La detección de anticuerpos se realizó con una reacción de quimioluminiscencia (ECL Western Blot detección; Amersham Life Science, Reino Unido). La presencia de receptores NK1 también fue analizada mediante técnicas inmunohistoquímicas. Brevemente, una muestra de cada uno de los cultivos de las líneas celulares utilizadas en la presente invención, se centrifugaron (5 minutos a 1.500 rpm) y el pellet obtenido se deshidrató mediante un tratamiento a concentraciones crecientes de etanol y, finalmente, en xilol. A continuación, dichas muestras deshidratadas se incluyeron en parafina creándose un bloque de células. Dichos bloques de parafina se cortaron en un microtomo a un grosor de 5 mieras, que se colocaron sobre portaobjetos adecuados para la realización de técnicas de inmunohistoquímica. Posteriormente se desparafinaron mediante su inmersión en xilol, para posteriormente ser hidratados a través de una serie de soluciones que contienen concentraciones decrecientes de etanol, para finalmente, sumergirlos en agua. Después, dichas muestras se sometieron a un tratamiento en olla a presión en tampón citrato lOx a pH 6.0, para obtener una mayor exposición de los antígenos. Posteriormente, las muestras se dejaron enfriar a temperatura ambiente durante 10 minutos. La actividad peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno al 3% durante 30 min a temperatura ambiente. Después de lavar las muestras con 0,05 M de tampón Tris, se incubaron con suero de cerdo no-inmune al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para comprobar la expresión de receptores NK1, las muestras celulares se incubaron en presencia de los anticuerpos anti-NKl (S8305, Sigma-Aldrich) diluido 1 : 1000, durante toda la noche a 4o C. Transcurrido dicho tiempo se lavaron en tampón Tris 0,05 M a temperatura ambiente. El siguiente paso fue la adición de los reactivos Envision System-HRP (Dako) durante 30 min a temperatura ambiente. Trascurrido dicho tiempo, se lavaron nuevamente las muestras en tampón Tris 0,05 M, y la inmunorreactividad fue visualizada mediante microscopía de luz con una solución cromogénica con 3,3'-Diaminobencidina (DAB+; Dako, USA). Para diferenciar los núcleos celulares, éstos se tiñeron ligeramente con hematoxilina. Como control negativo, se utilizaron muestras a las que no se les incubó con el anticuerpo primario anti-NKl, siendo reemplazado por suero no inmune. Todas las muestras fueron evaluadas.
Los resultados obtenidos mediante ambas técnicas pusieron de manifiesto la existencia de receptores NK1 en la línea celular C-12210.
A continuación, para analizar el efecto sobre la proliferación de los cultivos celulares de la línea celular C-12210 se procedió al tratamiento de dichos cultivos con concentraciones crecientes de diferentes antagonistas no peptídicos de NK1. La proliferación celular se evaluó mediante el compuesto tetrazolium 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil) 2-(4-sulfofenil)-2H- tetrazolium (MTS) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Kit "CellTiter 96 Aqueous One-Solution Cell Proliferation Assay" Promega, USA). El número de células se cuantificó usando un contador Coulter. Las células C-12210 se cultivaron en medio adecuado (PromoCell Growth Médium; Promocell GmbH, Germany), según las instrucciones del fabricante, en presencia de concentraciones crecientes de diferentes antagonistas no peptídicos de los receptores NK1. En las placas de cultivos celulares tumorales se incluyó una muestra blanco (sin células) y una muestra control (que contenía 104 cel/ml). Para obtener la tinción en los ensayos de proliferación, se añadieron 20 μΐ de MTS a cada uno de los pocilios de las placas de cultivo celular 90 minutos antes de realizar la lectura de las muestras en un espectrofotómetro multiescaner (TECAN Spectra classic, Barcelona, España) a 492 nm (longitud de onda del ensayo) y 690 nm (longitud de onda de referencia). Las diferentes dosis de cada uno de los antagonistas no peptídicos de NKl se ensayaron por duplicado y cada experimento se realizó por sextuplicado.
Los antagonistas utilizados para los ensayos de proliferación fueron: L-733,060 ((2S,3S)-3- [(3,5-bis(Trifluoromethyl)phenyl)methoxy]-2-phenylpiperidine hydrochloride), L-732, 138 (N- Acetyl-L-tryptophan 3,5-bis(trifluoromethyl)benzyl ester), L-703,606 oxalate salt hydrate (cis- 2-(Diphenylmethyl)-N-[(2-iodophenyl)methyl]-l-azabicyclo[2.2.2]octan-3-amine oxalate salt), Aprepitant (ó MK 869 ó L-754,030), Vestipitant (o GW597599), Casopitant (o GW679769), CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP-96345 y L-760735. Como se ha mencionado a lo largo de lapresente invención, otros antagonistas no peptídicos de los receptores NKl , no descritos aquí, pueden también utilizarse.
Se expuso la línea comercial con referencia C- 12210, de células endoteliales microvasculares, a concentraciones crecientes de antagonistas no peptídicos del receptor NKl y se observó una inhibición de la proliferación de las mismas, que resultó ser tiempo y dosis dependiente.
En la Tabla 1, se muestran el aumento de la proliferación de las células C- 12210 cultivadas en presencia de concentraciones crecientes de la SP (agonista del receptor NKl). Digo agonista tiene un efecto estimulante en el crecimiento de las células endoteliales humanas. Los resultados mostrados en la Tabla 1 están expresados en forma de porcentaje respecto al control±SD.
Tabla 1. Análisis de la proliferación de cultivos celulares de C- 12210 en presencia de concentraciones crecientes de SP.
Figure imgf000022_0001
En las Tablas 2 a 4 se muestra la capacidad de los antagonistas de los receptores NKl para inhibir la proliferación celular, demostrado mediante el uso de la línea celular C12210. En dichas tablas 2 a 4 se muestran los datos expresados en forma de porcentaje respecto al control±SD, de los antagonistas no peptídicos del receptor NKl : Aprepitant, Vestipitant y Casopitant a las concentraciones indicadas en las tablas durante 24, 48 y 72 horas. Las diferentes dosis se ensayaron por duplicado y cada experimento se realizó por sextuplicado. Los resultados ponen de manifiesto que la inhibición del crecimiento de dichas células endoteliales es tiempo y dosis dependiente. Como control de la proliferación las células se cultivaron en ausencia de los antagonistas mencionados.
Tabla 2. Análisis de la proliferación de cultivos celulares de C- 12210 en presencia de concentraciones crecientes de Aprepitant. La tabla muestra el porcentaje de inhibición±SD de cada tratamiento respecto al control.
Figure imgf000023_0001
Tabla 3. Análisis de la proliferación de cultivos celulares de C-12210 en presencia de concentraciones crecientes de Vestipitant. La tabla muestra el porcentaje de inhibición±SD de cada tratamiento respecto al control.
Figure imgf000023_0002
Tabla 4. Análisis de la proliferación de cultivos celulares de C-12210 en presencia de concentraciones crecientes de Casopitant. La tabla muestra el porcentaje de inhibición±SD de cada tratamiento respecto al control.
Concentración Tiempo de exposición (horas)
Casopitant 0 24 48 72
Control (0 nM) 100 100 100 100
10 nM 9,3 ± 1, 1 14 ± 2, 1 23,3 ± 3,2 31,4 ± 3, 1
100 nM 12,3 ± 2, 1 18,5 ± 2,4 27,4 ± 4,5 36,4 ± 4,3
500 nM 19,5 ± 2,3 24,6 ± 3,6 36,6 ± 4,9 45,5 ± 5
ΙμΜ 22,4 ± 2,5 32,6 ± 4,8 42,3 ± 5,2 51,6 ± 5,6
50μΜ 28,3 ± 3,5 37,5 ± 5,6 47,5 ± 6,8 58,6 ± 6,2
ΙΟΟμΜ 36,3 ± 3,7 43,6 ± 5,7 52,4 ± 7,2 79,7 ± 8,7 Similares resultado a los mostrados en las Tablas 2 a 4 se obtuvieron cuando se utilizaron otros antagonistas no peptídicos del receptor NK1 : L-733,060, L-732, 138, L-703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP-96345 y L-760735. Por lo tanto, los resultados mostrados en el presente ejemplo ponen de manifiesto que los antagonistas no peptídicos del receptor NK1 inhiben la proliferación de las células endoteliales. La proliferación de las mismas es un elemento clave en el desarrollo de la neovascularización necesaria para que los tumores puedan recibir un aporte de sangre (y por lo tanto de oxígeno, nutrientes entre otros elementos necesarios) suficiente que le permita mantener su crecimiento y progresión.
Ejemplo 2. Modificación del microambiente peritumoral, específicamente de las células de estirpe fibroblástica, mediante el tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1.
En el presente ejemplo se muestra el efecto del tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 en la modificación del microambiente peritumoral, específicamente en fibroblastos primarios humanos (PHF). Dichos PHF fueron obtenidos y purificados a partir de muestras obtenidas de la dermis de la piel de voluntarios sanos, como se describe en De Bari et al (De Bari et al. 2001). Brevemente, pequeños trozos de la dermis de la piel fueron digeridos en una solución de hialuronidasa (Sigma-Aldrich, USA) a una concentración de 1 mg/ml durante 15 minutos a 37°C y posteriormente tratados con 6 mg/ml de colagenasa tipo IV (Invitrogen) durante 2 horas a 37°C. A continuación, se lavaron las células, se resuspendieron en medio de cultivo DMEM con alta concentración de glucosa (Dulbecco's Modified Eagle's Médium, Invitrogen) suplementado con 1% de antibióticos-antimicóticos (Invitrogen) y con un 1% de piruvato de sodio (Invitrogen), y se sembraron en placas de cultivo a una concentración de 10.000 células por centímetro cuadrado. Cuando las células alcanzaron la confluencia, las células adherentes fueron separadas utilizando tripsina estéril al 0,5% (Invitrogen) y se utilizó entre los pases 3 y 9. Para los ensayos mostrados a continuación, los PHF se sembraron en placas de 24 pocilios a una concentración de 25.000 células por pocilio.
Para comprobar que los agonistas de los receptores NK1, por ejemplo la SP, inducen cambios en las células del estroma, preferentemente fibroblastos, similares a los observados en estas mismas células en las zonas peritumorales y que dichos cambios son revertidos por los antagonistas no peptídicos de los receptores NK1, se ha analizado la presencia de diferentes marcadores moleculares (TGFa, TGF , SPARC y MMPs), asociados con la progresión tumoral, en las células que forman el microambiente tumoral, específicamente en cultivos celulares de fibroblastos primarios humanos (PFH), en presencia del agonista SP de los receptores NKl, así como en presencia de dicho agonista junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl . Para ello, se cultivaron PHF en presencia de la SP a una concentración Ι μΜ (control positivo) (S6883; Sigma-Aldrich) y junto a diferentes antagonistas no peptídicos de los receptores NKl a una concentración de Ι μΜ, específicamente se muestran los resultados obtenidos con los antagonistas Aprepitant, Vestipitant y Casopitant. Transcurridas 48 horas de cultivo, las células fueron recolectadas y se construyeron bloques celulares de parafina para los análisis inmunohistoquímicos, según se ha explicado previamente en el Ejemplo 1.
En los ensayos inmunohistoquímicos se estudió la expresión de los marcadores : TGFa, (SAB4502953), TGF i (SAB4502954), TGF 2 (SAB4502956), TGF 3 (SAB4502957), SPARC (HPA002989), MMP-3 (HPA007875); MMP-7 (SAB4501894), MMP-9 (SAB4501896), MMP-1 1 (SAB4501898), MMP-13 (SAB4501900) y MMP-14 (SAB4501901), mediante anticuerpos específicos frente a los mismos. Todos los anticuerpos utilizados fueron anticuerpos policlonales de conejo obtenidos de Sigma-Aldrich y se utilizaron a una concentración 1/1000. Todos los experimentos se realizaron por sextuplicado.
Para valorar la inmunotinción en cada uno de los seis cortes se realizó un contaje de las células en 20 campos de gran aumento (400x) mediante un microscopio de la marca Olympus (modelo CX31). En cada uno de los campos se contó el número de células total y el número de células que presentaban inmunotinción, hallándose posteriormente el porcentaje de células que presentaban dicha inmunotinción. Los resultados obtenidos y mostrados en la Tabla 5, ponen de manifiesto en primer lugar, la presencia de todos los marcadores estudiados en las muestras procedentes de los cultivos celulares de PHF tratados únicamente con la SP, lo que indica que el agonista de los receptores NKl induce, en los fibroblastos primarios humanos, cambios inmunofenotípicos similares a los que se producen en las zonas peritumorales. Por el contrario, no se observó inmunotinción, signo de ausencia de expresión, en los cultivos celulares tratados de manera conjunta con la SP y con cada uno de los antagonistas no peptídicos de los receptores NKl (Tabla 5). Esto demuestra que el uso de los antagonistas no peptídicos de los receptores NKl es capaz de revertir la expresión de marcadores asociados con el desarrollo y progresión tumoral. En este sentido, el uso de los antagonistas no peptídicos de los receptores NKl impiden la supervivencia, el desarrollo y la progresión de dichos tumores. Tabla 5. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en PHF cultivados en presencia de antagonistas no peptídicos de NK1. La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Figure imgf000026_0001
Similares resultado a los mostrados en la Tabla 5 se obtuvieron cuando se utilizaron otros antagonistas no peptídicos del receptor NK1 : L-733,060, L-732, 138, L-703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP-96345 y L-760735. Ejemplo 3. Modificación del microambiente peritumoral, específicamente de las células implicadas en procesos inflamatorios/inmunes, mediante el tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1.
Otras de las células que conforman el microambiente peritumoral son las células implicadas en procesos inflamatorios y/o inmunes. En este sentido el siguiente paso fue analizar el efecto ejercido por el tratamiento con antagonistas no peptídicos NK1 en dichas células, específicamente en células mononucleares y polimorfonucleares de la sangre. Brevemente, la sangre heparinizada de donantes sanos se centrifugó, de forma que se separan los distintos componentes de la misma. Los glóbulos rojos quedan en el fondo del tubo. Por encima de ellos queda una pequeña capa blanquecina que está compuesta por los glóbulos blancos y por encima, en la parte superior del tubo, el plasma sanguíneo. La capa de glóbulos blancos se distribuyó en una placa de cultivo de 24 pocilios añadiéndole en cada uno de ellos la misma concentración de plasma sanguíneo del mismo donante, suplementado con un 1% de antibióticos-antimicóticos (Invitrogen). En cada pocilio se añadieron además, aproximadamente 1000 células (PHF) procedentes de la dermis cutánea, obtenidas según se ha descrito previamente en el Ejemplo 2. A continuación, a dichos cultivos se les añadió la SP a una concentración de 1 μΜ o SP a la misma concentración junto con los antagonistas no peptídicos de los receptores NK1, Aprepitant, Vestipitant y Casopitant, todos ellos a la concentración de 1 μΜ. Tras una incubación de 48 horas, las células fueron recolectadas y se incluyeron en parafina para los análisis de expresión mediante técnicas inmunohistoquímicas (según se describe en el Ejemplo 1).
Se analizó la expresión de los marcadores moleculares TGF (anti-TGF 2, SAB4502956) y NF-kB (anti-NF-kB, SAB4501992) mediante anticuerpos específicos frente a los mismos. Todos los anticuerpos utilizados fueron anticuerpos policlonales de conejo obtenidos de Sigma Aldrich y se utilizaron a una concentración 1/1000. Todos los experimentos se realizaron por sextuplicado.
Los resultados mostrados en las Tablas 6 y 7 ponen de manifiesto la presencia de TGF y NF- kB en las células mononucleares (Tabla 6) y polimorfonucleares (Tabla 7) de las muestras procedentes de los cultivos tratados únicamente con la SP. Por el contrario, el tratamiento con la SP en combinación con los antagonistas no peptídicos de los receptores NK1, no muestra expresión de los marcadores moleculares analizados (ausencia de tinción) en las muestras de cultivos de células mononucleares y polimorfonucleares. Estos resultados demuestran que el tratamiento con un agonista de los receptores NK1, la SP, induce la expresión de los marcadores moleculares TGF y NF-kB, que son mediadores de la progresión y desarrollo del tumor. Por el contrario, el uso de antagonistas no peptídicos de los receptores NK1, es capaz de revertir la expresión de dichos marcadores, lo que muestra la capacidad de dichos antagonistas para inhibir la génesis de estos mediadores y, por lo tanto, impedir el desarrollo de un microambiente tumoral que permita la supervivencia, el aumento de tamaño y la progresión de los tumores. En este sentido, el uso de los antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 impiden la supervivencia, el desarrollo y la progresión de los tumores.
Tabla 6. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en células mononucleares en presencia de antagonistas no peptídicos de los receptores NK1. La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Figure imgf000027_0001
Tabla 7. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en células polimorfonucleares en presencia de antagonistas no peptídicos de los receptores NK1. La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Figure imgf000028_0001
Similares resultado a los mostrados en las Tablas 6 y 7 se obtuvieron cuando se utilizaron otros antagonistas no peptídicos del receptor NK1 : L-733,060, L-732, 138, L-703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP-96345 y L-760735. Ejemplo 4. Modificación del microambiente peritumoral, específicamente modificación de las células de estirpe macrofágica, mediante el tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1.
Otras de las células que conforman el microambiente peritumoral son las células de la estirpe macrofágica que tienen una gran importancia en el desarrollo del microambiente peritumoral, al interaccionar con las células tumorales, estimulando su crecimiento y dispersión mediante la secreción al medio de diferentes marcadores que favorecen la expansión y crecimiento de los tumores. En este sentido el siguiente paso fue analizar el efecto ejercido por el tratamiento con antagonistas no peptídicos NK1 en macrófagos primarios humanos (PHM) obtenidos y purificados a partir de muestras obtenidas de derrame pleural crónico de hombres con rango de edad comprendida entre 45 y 55 años. Brevemente, el líquido procedente de derrame pleural crónico (rico en macrófagos) fue centrifugado. Los macrófagos fueron sembrados en placas de cultivo a una concentración de aproximadamente 1000 células por centímetro cuadrado, utilizando como medio de cultivo el propio líquido pleural (para obtener un modelo experimental similar al humano), suplementado con 1% de antibióticos-antimicóticos (Invitrogen), para la exposición al agonista de los receptores NK1 (SP) y la exposición a los antagonistas de los receptores NK1.
Para comprobar que los agonistas de los receptores NK1, por ejemplo la SP, inducen cambios inmunofenotípicos en los macrófagos, similares a los observados en estas mismas células en las zonas peritumorales y que dichos cambios son revertidos mediante el tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1, se ha analizado la presencia o expresión, mediante técnicas inmunohistoquímicas (ver Ejemplo 1) de los marcadores EGF, MMP-9, VEGF e IL-8, mediante anticuerpos específicos frente a los mismos, en cultivos de PHM en presencia de la SP (ΙμΜ) (S6883; Sigma-Aldrich) y en presencia de SP y cada uno de los antagonistas de los receptores NK1, Aprepitant, Vestipitant y Casopitant, todos ellos a la concentración de 1 μΜ. Transcurridas 48 horas de cultivo, las células fueron recolectadas y se construyeron bloques celulares de parafina para los análisis inmunohistoquímicos (ver Ejemplo 1). Para analizar la expresión de los marcadores EGF, MMP-9, VEGF e IL-8 se utilizaron los siguientes anticuerpos: EGF (Anticuerpo monoclonal de conejo, anti-EGF; 07-1432. Merck- Millipore), MMP-9 (anticuerpo policlonal de conejo anti-MMP-9: SAB4501896; Sigma- Aldrich), VEGF (anticuerpo monoclonal de ratón anti-VEGF, GF25-100UG, Merck-Millipore) y el TNF-α (anticuerpo monoclonal de ratón anti-TNF-α, número de catálogo MAB 1021 , obtenido de Merck-Millipore). Todos estos anticuerpos se utilizaron a una concentración 1/1000. Se empleó el sistema de mareaje con anticuerpo secundario específico para anticuerpos primarios obtenidos de conejo o ratón, según fue preciso en cada caso, ambos del Envision (Dako). Todos los experimentos se realizaron por sextuplicado.
En la Tabla 8 se muestran los resultados obtenidos, poniendo de manifiesto que los PHM expresan todos los marcadores analizados en presencia de la SP (agonista de los receptores NK1), lo que evidencia que dicho agonista es capaz de inducir en los PHM cambios inmunofenotípicos similares a los que se encuentran en las zonas peritumorales, propios de los denominados "Macrófagos Asociados al Cáncer" (Hagemann T et al 2009; Condeelis J et al. 2006). Por el contrario, no se observó inmunotinción, signo de ausencia de expresión, para los cultivos celulares tratados de manera conjunta con la SP y con cada uno de los antagonistas no peptídicos de los receptores NK1. En este sentido, el uso de los antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 impiden el desarrollo y la progresión de los tumores, por medio de la inhibición de la secreción por parte de los HPM de sustancias que favorecen el crecimiento y la progresión de los mismos, e induciendo, por lo tanto, la reducción del tamaño de dichos tumores y la disminuyendo su capacidad de invasión.
Tabla 8. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en macrófagos cultivados en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1. La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Marcador SP SP + Aprepitant SP + Vestipitant SP + Casopitant
EGF 27,4±1, 1% 0% 0% 0%
MMP-9 24,3±1,4% 0% 0% 0%
VEGF 29,6±2, 1% 0% 0% 0% En caso de TNF-α, se obtuvieron resultados similares, respesto a su expresión a los obtenidos mediante el resto de marcadores analizados: EGF, MMP-9 y VEGF. Es decir, el tratamiento con los antagonistas no peptídicos de los receptores de NKl inhibieron la expresión del marcador TNF-OL También se determinó la presencia de IL-8 mediante la técnica de Western Blot, según se ha explicado en el Ejemplo 1, utilizando como anticuerpo primario el anticuerpo anti-leucina- 8, (AB1427, Merck-Millipore). Los resultados pusieron de manifiesto que los HPM cultivados en presencia de la SP mostraban expresión de dicho marcador, en cambio, cuando se añadían los antagonistas no peptídicos de los receptores NKl, dicha expresión desaparecía completamente, al igual que sucedía con los resultados mostrados anteriormente. Similares resultados a los mostrados en la Tabla 8 se obtuvieron cuando se utilizaron otros antagonistas no peptídicos del receptor NKl : L-733,060, L-732, 138, L-703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP- 96345 y L-760735.
Ejemplo 5. Los antagonistas no peptídicos del receptor NKl inhiben la secreción, por parte de los fibroblastos, de sustancias que favorecen la progresión del cáncer.
La interacción entre las células tumorales y las células del estroma, preferentemente los fibroblastos, favorece la secreción por parte de los fibroblastos de diferentes moléculas que a su vez estimulan la proliferación y la supervivencia de las células tumorales.
Para comprobar que la interacción de las células tumorales con las células estromales - fibroblastos- induce cambios similares a los observados en estas mismas células en las zonas peritumorales, que estos cambios se ven potenciados por la exposición a un agonista del receptor NKl y que se inhiben en presencia de antagonistas no peptídicos de dicho receptor, se sometieron diversos tipos de células tumorales procedentes de líneas tumorales comerciales a cultivos conjuntos con fibroblastos (obtenidos según se explica en el Ejemplo 2), a cultivos conjuntos en presencia del agonista de los receptores NKl (SP) y a cultivos conjunto en presencia de dicho agonista y de los diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl . Las diferentes líneas celulares tumorales empleadas, especificando en cada caso el tipo de tumor al que corresponden, la empresa que las suministra y el código de catálogo, se muestran en la Tabla 9. Tabla 9. Líneas celulares tumorales utilizadas en la presente invención
Línea celular Empresa
Carcinoma gástrico humano
Adenocarcinoma gástrico humano 23132/87 DSMZ
Carcinoma de colon humano
Adenocarcinoma de colon humano SW-403 DSMZ
Carcinoma de páncreas humano
Adenocarcinoma de páncreas humano CAPAN- 1 DSMZ
Adenocarcinoma de páncreas humano PA-TU 8902 DSMZ
Carcinoma de mama humano
Adenocarcinoma de mama humano MCF-7 DSMZ
Carcinoma de mama humano MT-3 DSMZ
Carcinoma de mama humano MDA-MB-468 DSMZ
Carcinoma de ovario
Adenocarcinoma de ovario humano EFO-27 DSMZ
Carcinoma de ovario humano COLO-704 DSMZ
Carcinoma de endometrio humano
Carcinoma de endometrio humano AN3-CA DSMZ
Coriocarcinoma humano
Coriocarcinoma humano AC-1M32 DSMZ
Carcinoma de cérvix uterino humano
Carcinoma de cérvix uterino humano KB DSMZ
Carcinoma de pulmón humano
Adenocarcinoma de pulmón humano DV-90 DSMZ
Carcinoma de pulmón de célula no pequeña humano HCC-44 DSMZ
Carcinoma de pulmón de célula no pequeña humano COR-L23 ECACC
Carcinoma de pulmón de células pequeñas humano H-209 DSMZ
Carcinoma de pulmón de células pequeñas humano H-1963 DSMZ
Carcinoma de pulmón humano A-427 DSMZ
Carcinoma de tiroides humano
Carcinoma de tiroides humano 8505C DSMZ
Carcinoma de tiroides papilar humano metastatizante B-CPAP DSMZ
Carcinoma folicular de tiroides humano TT2609-C02 DSMZ
Carcinoma de vejiga de la orina humano
Carcinoma de vejiga de la orina humano 5637 DSMZ
Carcinoma transicional de vejiga de la orina humano RT-4 DSMZ
Carcinoma de próstata humano Línea celular Empresa
Carcinoma de próstata humano 22RV1 DSMZ
Tumores gliales del Sistema Nervioso Central
Glioma humano GAMG DSMZ
Sarcomas Humanos
Fibrosarcoma humano HT-1080 DSMZ
Histiocitoma fibroso maligno humano U-2197 DSMZ
Sarcoma de Edwing humano MHH-ES-1 DSMZ
Sarcoma del estroma endometrial humano ESS-1 DSMZ
Osteosarcoma humano CAL-72 DSMZ
Rabdomiosarcoma humano A-204 DSMZ
Melanoma humano
Melanoma humano MEL HO DSMZ
Melanoma humano, metástasis en ganglio linfático COLO 858 ICLC
Tumores embrionarios
Neuroblastoma humano KELLY DSMZ
Neuroblastoma humano, médula ósea SKN-BE 2 ICLC
Retinoblastoma humano WERI-Rb-1 DSMZ
Cáncer hematológico
Leucemia humana de células T/NK YT DSMZ
Leucemia linfoblástica B SD 1 DSMZ
Leucemia linfoblástica T humana BE- 13 DSMZ
Linfoma B humano BC-1 DSMZ
Linfoma de Burkitt humano CA-46 DSMZ
Linfoma de Hodgkin humano KM-H2 DSMZ
Linfoma T humano DERL-7 DSMZ
Mieloma múltiple humano COLO-677 DSMZ
Previamente a la realización de los experimentos, se comprobó, mediante Western Blot, que todas las líneas celulares tumorales comerciales expresaban el receptor NK1. Los cultivos se realizaron en plasma sanguíneo fresco de donante sano, obtenido mediante extracción de sangre y centrifugación ligera de la misma, suplementado con un 1% de antibióticos-antimicóticos (Invitrogen), con objeto de obtener un modelo experimental similar al fisiológico humano. Todos los cultivos se mantuvieron 48 horas, transcurridas las cuales, las células de los mismos se incluyeron en bloques de parafina para los posteriores análisis de la expresión de diferentes marcadores mediante técnicas inmunohistoquímicas (ver Ejemplo 1). Los anticuerpos primarios utilizados para la realización de los ensayos inmunohistoquímicos y la concentración de los mismos se detalla en el Ejemplo 2. Todos los experimentos se realizaron por sextuplicado. Los marcadores analizados en las células fibroblásticas (estroma) fueron: TGF-a, TGF-β 1, TGF-β 2, TGF-β 3, SPARC, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-13 y MMP-14.
A modo de ejemplo, en las Tablas 10 a 29, se muestran los resultados del análisis de la expresión de los marcadores mencionados previamente en PHF cocultivados junto con diferentes líneas celulares tumorales (Tabla 9). En dichas tablas se aprecia como el co-cultivo de las células estromales (fibroblastos PHF) con diferentes células tumorales (y por tanto la interacción de las mismas) aumenta el porcentaje de fibroblastos con expresión de los marcadores analizados respecto a la expresión observada de los mismos en cultivos de estas células solas. Esta expresión, a su vez, se ve incrementada con la exposición al agonista del receptor NK1 (SP) (ΙμΜ) y se inhibe con la exposición a los antagonistas del receptor NK1, Aprepitant, Vestipitant y Casopitant, a la concentración de Ι μΜ para cada uno de ellos. En dichas tablas se muestra el porcentaje medio de células±SD que presentaban inmunotinción (o que segregan) para cada marcador en presencia de la SP sola o en combinación con diferentes antagonistas no peptídicos de los receptores NK1. Similares resultados a los mostrados en las Tablas 10 a 29 se obtuvieron cuando se utilizaron otros antagonistas no peptídicos del receptor NK1 : L-733,060, L-732, 138, L-703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP-96345 y L- 760735.
Tabla 10. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de Adenocarcinoma gástrico humano (referencia 23132/87) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1. La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Cocultivo Cocultivo Cocultivo
Cocultivo
Marcador PHF Co-cultivo +SP +SP +SP
+SP
+Aprepitant +Vestipitant +Casopitant
TGF-a 0 12,3±1, 1% 32,4±1, 1% 0 0 0
TGF-β 1 0 13,4±1, 1% 33,5±1, 1% 0 0 0
TGF-β 2 0 20,5±1,2% 40,5±1, 1% 0 0 0
TGF-β 3 0 13, 1±1,6% 41±1,56% 0 0 0
SPARC 0 17±1,8% 47±1,2% 0 0 0
MMP-3 0 23,4±1,2% 43,4±1,7% 0 0 0
MMP-7 0 46,2±2,3% 56, 1±2,8% 0 0 0 Cocultivo Cocultivo Cocultivo
Cocultivo
Marcador PHF Co-cultivo +SP +SP +SP
+SP
+Aprepitant +Vestipitant +Casopitant
MMP-9 0 33,3±1,5% 52,3±1,4% 0 0 0
MMP-11 0 7,6±2,4% 27,4±2,8% 0 0 0
MMP-13 0 16±2,4% 45±3,5% 0 0 0
MMP-14 0 29,3±2,2% 49,2±4,5% 0 0 0
Tabla 11. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de Adenocarcinoma de colon humano (referencia SW-403) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NK 1. La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Figure imgf000034_0001
Tabla 12. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de Adenocarcinoma de páncreas humano (referencia CAPAN- 1) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1. La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Cocultivo Cocultivo
Cocultivo Cocultivo +SP
Marcador PHF Co-cultivo +SP +SP
+SP +Vestipitant
+Aprepitant +Casopitant
TGF-a 0 12,3±1, 1% 42,4±2, 1% 0 0 0
TGF-β 1 0 13,4±1, 1% 37,6±1,4% 0 0 0
TGF-β 2 0 20,5±1,2% 42,4±6, 1% 0 0 0
TGF-β 3 0 13, 1±1,6% 43±2,6% 0 0 0
SPARC 0 17±1,8% 49±1,4% 0 0 0
MMP-3 0 23,4±1,2% 4454±1,6% 0 0 0
MMP-7 0 46,2±2,3% 58,2±2,4% 0 0 0 Cocultivo Cocultivo
Cocultivo Cocultivo +SP
Marcador PHF Co-cultivo +SP +SP
+SP +Vestipitant
+Aprepitant +Casopitant
MMP-9 0 33,3±1,5% 56,4±1,5% 0 0 0
MMP-11 0 7,6±2,4% 25,3±1,5% 0 0 0
MMP-13 0 16±2,4% 55±3,6% 0 0 0
MMP-14 0 29,3±2,2% 47,2±4,7% 0 0 0
Similares resultados a los mostrados en la Tabla 12 se obtuvieron cuando se cocultivaron PHF con células de la línea celular tumoral de adenocarcinoma de páncreas humano (PA-TU-8902). Tabla 13. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de carcinoma de mama humano (referencia MCF-7) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl . La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Figure imgf000035_0001
Similares resultados a los mostrados en la Tabla 13 se obtuvieron cuando se co-cultivaron PHF con células de las líneas celulares tumoral de carcinoma de cáncer de mama humano MT-3 o MDA-MB-468.
Tabla 14. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de carcinoma de ovario (referencia EFO-27) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl . La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra. Cocultivo Cocultivo Cocultivo
Cocultivo
Marcador PHF Co-cultivo +SP +SP +SP
+SP
+Aprepitant +Vestipitant +Casopitant
TGF-α 0 12,3±1, 1% 37,2±2, 1% 0 0 0
TGF-β 1 0 13,4±1, 1% 35,5±2, 1% 0 0 0
TGF-β 2 0 20,5±1,2% 45,4±1,2% 0 0 0
TGF-β 3 0 13, 1±1,6% 42±1,6% 0 0 0
SPARC 0 17±1,8% 46±2,2% 0 0 0
MMP-3 0 23,4±1,2% 44,4±1,5% 0 0 0
MMP-7 0 46,2±2,3% 55, 1±2,6% 0 0 0
MMP-9 0 33,3±1,5% 56,6±1,7% 0 0 0
MMP-11 0 7,6±2,4% 22,4±2,6% 0 0 0
MMP-13 0 16±2,4% 55±2,5% 0 0 0
MMP-14 0 29,3±2,2% 46,2±2,5% 0 0 0
Similares resultados a los mostrados en la Tabla 14 se obtuvieron cuando se co-cultivaron PHF con células de la línea celular tumoral de carcinoma de ovario humano COLO-704.
Tabla 15. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de carcinoma de endometrio humano (referencia AN3-CA) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl . La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Figure imgf000036_0001
Tabla 16. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de coriocarcinoma humano (referencia AC-1M32) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl . La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra. Cocultivo Cocultivo
Cocultivo Cocultivo +SP
Marcador PHF Co-cultivo +SP+ +SP
+SP +Vestipitant
Aprepitant +Casopitant
TGF-α 0 12,3±1, 1% 41,4±1, 1% 0 0 0
TGF-β 1 0 13,4±1, 1% 36,5±2, 1% 0 0 0
TGF-β 2 0 20,5±1,2% 53,5±3, 1% 0 0 0
TGF-β 3 0 13, 1±1,6% 46±3% 0 0 0
SPARC 0 17±1,8% 46±3, 1% 0 0 0
MMP-3 0 23,4±1,2% 45,4±2,7% 0 0 0
MMP-7 0 46,2±2,3% 57, 1±3,8% 0 0 0
MMP-9 0 33,3±1,5% 56,3±2,4% 0 0 0
MMP-11 0 7,6±2,4% 28,4±2,8% 0 0 0
MMP-13 0 16±2,4% 47±3,7% 0 0 0
MMP-14 0 29,3±2,2% 51,2±4,5% 0 0 0
Tabla 17. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de carcinoma de cérvix uterino humano (referencia KB) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl . La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Figure imgf000037_0001
Tabla 18. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de carcinoma de pulmón (referencia A-427) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl . La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra. Cocultivo Cocultivo
Cocultivo Cocultivo +SP
Marcador PHF Co-cultivo +SP+ +SP
+SP +Vestipitant
Aprepitant +Casopitant
TGF-α 0 12,3±1, 1% 42,3±2, 1% 0 0 0
TGF-β 1 0 13,4±1, 1% 33,4±2, 1% 0 0 0
TGF-β 2 0 20,5±1,2% 40,9±2, 1% 0 0 0
TGF-β 3 0 13, 1±1,6% 51,4±1,6% 0 0 0
SPARC 0 17±1,8% 47±1,2% 0 0 0
MMP-3 0 23,4±1,2% 45,5±1,6% 0 0 0
MMP-7 0 46,2±2,3% 54,3±2,2% 0 0 0
MMP-9 0 33,3±1,5% 55,5±2,4% 0 0 0
MMP-11 0 7,6±2,4% 25,5±1,8% 0 0 0
MMP-13 0 16±2,4% 44,3±2,5% 0 0 0
MMP-14 0 29,3±2,2% 45, 1±3,5% 0 0 0
Similares resultados a los mostrados en la Tabla 18 se obtuvieron cuando se co-cultivaron PHF con células de las líneas celulares tumoral de adenocarcinoma de pulmón humano (DV-90), carcinoma de pulmón de célula no pequeña humano (HCC44 y COR-L23), y carcinoma de pulmón de células pequeñas humano (H-209 y H-1963).
Tabla 19. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de carcinoma de tiroides (referencia A-427) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl . La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Figure imgf000038_0001
Similares resultados a los mostrados en la Tabla 19 se obtuvieron cuando se co-cultivaron PHF con células de las líneas celulares tumoral de carcinoma de tiroides papilar humano mestastatizante (B-CPAP) o carcinoma folicular de tiroides humano (TT2609-C02). Tabla 20. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de carcinoma de vejiga de la orina (referencia 5637) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl . La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Figure imgf000039_0001
Similares resultados a los mostrados en la Tabla 20 se obtuvieron cuando se co-cultivaron PHF con células de la línea celular tumoral de carcinoma transicional de vejiga de la orina humano (RT-4).
Tabla 21. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de carcinoma de próstata humano (referencia 22RV1) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl . La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Cocultivo Cocultivo Cocultivo
Cocultivo
Marcador PHF Co-cultivo +SP +SP +SP
+SP
+Aprepitant +Vestipitant +Casopitant
TGF-a 0 12,3±1, 1% 41,4±2, 1% 0 0 0
TGF-β 1 0 13,4±1, 1% 34,5±3, 1% 0 0 0
TGF-β 2 0 20,5±1,2% 42,5±2, 1% 0 0 0
TGF-β 3 0 13, 1±1,6% 4, 11±3,6% 0 0 0
SPARC 0 17±1,8% 48, 1±3,2% 0 0 0
MMP-3 0 23,4±1,2% 43,3±2,7% 0 0 0
MMP-7 0 46,2±2,3% 54,3±4,8% 0 0 0
MMP-9 0 33,3±1,5% 51,4±2,4% 0 0 0
MMP-11 0 7,6±2,4% 28,5±3,8% 0 0 0
MMP-13 0 16±2,4% 46±2,5% 0 0 0
MMP-14 0 29,3±2,2% 49±3,5% 0 0 0 Tabla 22. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de glioma humano (referencia GAMG) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl . La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Figure imgf000040_0001
Tabla 23. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de fibrosarcoma humano (referencia HT-1080) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl . La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Figure imgf000040_0002
Tabla 24. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de sarcoma de Edwing humano (referencia MHH-ES-1) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl . La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Figure imgf000041_0001
Similares resultados a los mostrados en las Tablas 23 y 24 se obtuvieron cuando se co- cultivaron PHF con células de las líneas celulares tumoral de histiocitoma fibroso maligno humano (U-2197), o de sarcoma del estroma endometrial humano (ESS-1) u osteosarcoma humano (CAL-72) o rabdomiosarcoma humano (A-204).
Tabla 25. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de melanoma humano (referencia MEL-HOl) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1. La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Cocultivo Cocultivo Cocultivo
Cocultivo
Marcador PHF Co-cultivo +SP +SP +SP
+SP
+Aprepitant +Vestipitant +Casopitant
TGF-a 0 12,3±1, 1% 42,4±3,2% 0 0 0
TGF-β 1 0 13,4±1, 1% 42,5±2, 1% 0 0 0
TGF-β 2 0 20,5±1,2% 44,5±1,9% 0 0 0
TGF-β 3 0 13, 1±1,6% 43,5±2,6% 0 0 0
SPARC 0 17±1,8% 44,5±1,4% 0 0 0
MMP-3 0 23,4±1,2% 4455±4,7% 0 0 0
MMP-7 0 46,2±2,3% 55,5±3,8% 0 0 0
MMP-9 0 33,3±1,5% 53,3±2,4% 0 0 0
MMP-11 0 7,6±2,4% 24,4±3,8% 0 0 0
MMP-13 0 16±2,4% 46, 1±3,5% 0 0 0
MMP-14 0 29,3±2,2% 46,2±3,5% 0 0 0 Similares resultados a los mostrados en la Tabla 25 se obtuvieron cuando se co-cultivaron PHF con células de la línea celular tumoral de melanoma humano, metástasis en ganglio linfático (COLO 858). Tabla 26. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de neuroblastoma humano (referencia KELLY) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl . La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Figure imgf000042_0001
Similares resultados a los mostrados en la Tabla 26 se obtuvieron cuando se co-cultivaron PHF con células de las líneas celulares tumorales de neuroblastoma humano de médula ósea (SKN- BE 2) o retinoblastoma humano (WERI-rb-1).
Tabla 27. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de leucemia linfoblástica B (referencia SDl) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl . La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Cocultivo Cocultivo Cocultivo
Cocultivo
Marcador PHF Co-cultivo +SP +SP +SP
+SP
+Aprepitant +Vestipitant +Casopitant
TGF-a 0 12,3±1, 1% 41,4±3, 1% 0 0 0
TGF-β 1 0 13,4±1, 1% 42,5±4,2% 0 0 0
TGF-β 2 0 20,5±1,2% 50,5±1, 1% 0 0 0
TGF-β 3 0 13, 1±1,6% 51,4±5,5% 0 0 0
SPARC 0 17±1,8% 56±6,2% 0 0 0
MMP-3 0 23,4±1,2% 53,4±5,7% 0 0 0
MMP-7 0 46,2±2,3% 59, 1±4,8% 0 0 0 Cocultivo Cocultivo Cocultivo
Cocultivo
Marcador PHF Co-cultivo +SP +SP +SP
+SP
+Aprepitant +Vestipitant +Casopitant
MMP-9 0 33,3±1,5% 59,3±3,4% 0 0 0
MMP-11 0 7,6±2,4% 4754±4,8% 0 0 0
MMP-13 0 16±2,4% 49,5±6,5% 0 0 0
MMP-14 0 29,3±2,2% 53,9±5,5% 0 0 0
Tabla 28. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de linfoma de Burkitt humano (referencia CA-46) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl . La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Figure imgf000043_0001
Tabla 29. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos (PHF) co-cultivados con células tumorales de linfoma T humano (referencia DERL-7) (co-cultivo) en presencia de la SP sola o junto con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl . La tabla muestra el porcentaje±SD del número de células que expresaban cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Cocultivo Cocultivo Cocultivo
Cocultivo
Marcador PHF Co-cultivo +SP +SP +SP
+SP
+Aprepitant +Vestipitant +Casopitant
TGF-a 0 12,3±1, 1% 62,5±3, 1% 0 0 0
TGF-β 1 0 13,4±1, 1% 64,5±4,3% 0 0 0
TGF-β 2 0 20,5±1,2% 70,6±4, 1% 0 0 0
TGF-β 3 0 13, 1±1,6% 61±5,6% 0 0 0
SPARC 0 17±1,8% 67±4,2% 0 0 0
MMP-3 0 23,4±1,2% 63,4±3,7% 0 0 0
MMP-7 0 46,2±2,3% 66, 1±4,8% 0 0 0
MMP-9 0 33,3±1,5% 62,3±3,4% 0 0 0
MMP-11 0 7,6±2,4% 67,8±4,8% 0 0 0
MMP-13 0 16±2,4% 61±5,3% 0 0 0
MMP-14 0 29,3±2,2% 58,4±3,5% 0 0 0 Similares resultados a los mostrados en las Tablas 27 a 29 se obtuvieron cuando se co- cultivaron PHF con células de las líneas celulares tumorales de diferentes tipos de cáncer hematológicos, por ejemplo, leucemia humana de células T/NK (YT), o leucemia linfoblástica T humana (BE-13) o linfoma B humano (BC-1) o linfoma de Hodgkin humano (KM-H2) o mieloma múltiple humano (COLO-677).
Por lo tanto, los resultados mostrados en el presente ejemplo ponen de manifiesto que la interacción entre las células tumorales y las células estromales -fibroblastos- induce cambios y modificaciones en la fisiología propia de las estas células que corresponden a los de dichas células en el contexto asociado al cáncer, como son la expresión de TGF-a, TGF-β 1, TGF-β 2, TGF-β 3, SPARC, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-13 y MMP-14. La adicción al co-cultivo del agonista del receptor NK1 (SP) induce un aumento de la secreción de dichas sustancias y esta secreción es revertida mediante el tratamiento con antagonistas no peptídicos de dicho receptor. La expresión de estas sustancias es un hecho clave en la progresión de los tumores y es, a su vez, un hecho clave en la supervivencia y mantenimiento de los tumores. El uso de antagonistas del receptor NK1 tiene, por lo tanto, efectos beneficiosos en el tratamiento del cáncer.
Ejemplo 6. Los antagonistas no peptídicos del receptor NK1 inhiben, por parte de los fibrobastos, la secreción de sustancias que favorecen la progresión del cáncer in vivo.
Los ensayos in vi tro llevados a cabo en el Ejemplo 5 se llevan a cabo ahora en un modelo experimental in vivo en ratones. Para comprobar que la interacción de las células tumorales con las células estromales -fibroblastos- inducen cambios en estas células estromales similares a los observados en las zonas peritumorales, se implantaron células tumorales en ratones y posteriormente fueron tratados con antagonistas no peptídicos del receptor NK1. Posteriormente se analizó, mediante técnicas de inmunohistoquímica, la expresión en los fibroblastos del área tumoral y peritumoral, de los marcadores moleculares asociados con la progresión y mantenimiento de los tumores: TGF-a, TGF-β 1, TGF-β 2, TGF-β 3, MMP-7, MMP-11, MMP- 14.
El permiso para este experimento con animales, fue obtenido del comité de ética del Hospital Juan Ramón Jiménez de Huelva. Se utilizaron ratones hembra inmunocomprometidos de 5-6 semanas de edad, nu/nu Balb/c nude mice, proporcionados por Harían Ibérica Barcelona (Spain). Fueron mantenidos a 24 °C y condiciones estériles con comida y agua "ad libitum". Se les inyectaron 2 x 107 células tumorales (corresponidnetes, en cada caso a cada uno de los tipos de tumor especificados en la Tabla 9) en 200 μΐ de PBS via subcutánea. El tamaño tumoral fue medido y los ratones fueron evaluados para su estado de salud y peso diariamente. Los ratones fueron randomizados en dos grupos cuando los tumores alcanzaron un volumen de 75 mm3. Uno de los grupos fue tratado con antagonistas no peptídicos del receptor NKl y el otro con 200μ1 de placebo. En la Tabla 30 se muestra un listado de los antagonistas no peptídicos del receptor NKl utilizados, la vía de administración y la dosis. Fueron tratados 10 animales por cada grupo, durante 7 días. Todos los ratones fueron sacrificados al final del experimento. Los tumores fueron extirpados, tomándose además una muestra de tejido estromal subcutáneo alejado del tumor. Los tumores y las muestras de estroma de áreas no tumorales alejadas del tumor fueron cortados por la mitad, fijados con formol (al 4%) y posteriormente fueron incluidos en bloques de parafina para su posterior análisis mediante inmunohistoquímica.
Los anticuerpos primarios utilizados para el análisis inmunohistoquímico fueron: TGF-a (SAB4502953), TGF-β 1 (SAB4502954), TGF-β 2 (SAB4502956), TGF-β 3 (SAB4502957), MMP-7 (SAB4501894), MMP-11 (SAB4501898), MMP-14 (SAB4501901).
Tabla 30. Antagonistas no peptídicos del receptor NKl utilizados en el modelo animal.
Figure imgf000045_0001
En la Tabla 31 se muestran el volumen medio±SD de los tumores de los ratones control (no tratados) o tratados con los antagonistas no peptídicos del receptor NK-1. En dicha tabla también se indica la línea celular utilizada para la formación de los tumores, especificando en cada caso el tipo de tumor al que corresponden, la empresa que las suministra y el código de catálogo.
Tabla 31. Tipo de tumor provocado en un modelo in vivo de ratón. Volumen medio del tumor en los ratones control (no tratados) o en los ratones después del tratamiento con antagonistas no peptídicos del receptor NKl . Línea celular. Control Aprepitant Vestipitant Casopitant
Adenocarcinoma gástrico humano
230±9 77±6 63±8 83±4 23132/87
Adenocarcinoma de colon humano
240±12 79±4 78±2 78±7 SW-403
Adenocarcinoma de páncreas
210±8 86±8 85±8 73±8 humano CAPAN- 1
Adenocarcinoma de páncreas
230±10 102±7 91±6 75±6 humano PA-TU 8902
Adenocarcinoma de mama humano
240±1 1 95±6 78±7 86±8 MCF-7
Carcinoma de mama humano MT-3 221±9 109±2 78±8 87±12
Carcinoma de mama humano
241±8 99±7 84±7 77±9 MDA-MB-468
Adenocarcinoma de ovario humano
210±9 98±7 63±7 88±6 EFO-27
Carcinoma de ovario humano
240±18 101±7 78±8 97±6 COLO-704
Carcinoma de endometrio humano
235±12 90±4 89±1 82±3 AN3-CA
Coriocarcinoma humano AC-1M32 243±18 1 12±4 88±8 84±1
Carcinoma de cérvix uterino
25 lil i 103±9 89±1 1 12±1 humano KB
Adenocarcinoma de pulmón
236±10 97±3 136±10 99±5 humano DV-90
Carcinoma de pulmón de célula no
254±1 1 105±7 100±4 101±8 pequeña humano HCC-44
Carcinoma de pulmón de célula no
261±12 102±5 1 1 1±3 1 19±5 pequeña humano COR-L23
Carcinoma de pulmón de células
243±9 104±6 1 13±5 1 14±7 pequeñas humano H-209
Carcinoma de pulmón de células
210±6 98±5 101±6 97±3 pequeñas humano H-1963
Carcinoma de pulmón humano A-
230±10 104±4 98±10 102±8 427
Carcinoma de tiroides humano
259±9 105±3 98±9 99±9 8505C
Carcinoma de tiroides papilar
252±12 102±4 102±2 106±4 humano metastatizante B-CPAP
Carcinoma folicular de tiroides
321±23 105±7 100±4 1 12±5 humano TT2609-C02
Carcinoma de vejiga de la orina
235±12 102±4 1 12±3 100±2 humano 5637
Carcinoma transicional de vejiga de
253±1 1 102±6 120±3 101±3 la orina humano RT-4
Carcinoma de próstata humano
325±12 103±5 98±2 98±4 22RV1
Glioma humano GAMG 199±12 108±8 101±4 102±4
Fibrosarcoma humano HT-1080 312±9 100±4 1 12±4 89±4 Línea celular. Control Aprepitant Vestipitant Casopitant
Histiocitoma fibroso maligno
214±8 102±6 95±8 107±2 humano U-2197
Sarcoma de Edwing humano MHH-
245±12 103±5 1 15±3 97±9 ES-1
Sarcoma del estroma endometrial
212±10 107±4 99±3 101±5 humano ESS-1
Osteosarcoma humano CAL-72 245±9 U2±4 104±9 106±7
Rabdomiosarcoma humano A-204 267±9 102±8 97±9 98±5
Melanoma humano MEL HO 312±23 104±5 102±4 102±9
Melanoma humano, metástasis en
21 1±10 109±4 1 10±4 99±5 ganglio linfático COLO 858
Neuroblastoma humano KELLY 234±19 105±6 121±4 1 12±5
Neuroblastoma humano, médula
288±7 97±9 101±7 103±4 ósea SKN-BE 2
Retinoblastoma humano WERI-Rb-
274±8 99±4 1 12±8 101±5 1
Leucemia humana de células T/NK
305±1 1 106±6 101±3 102±7 YT
Leucemia linfoblástica B (células
linfoblastoides B humanas 233±8 103±8 1 12±8 109±8 periféricas) SD 1
Leucemia linfoblástica T humana
223±14 102±6 1 1 1±4 101±4 BE- 13
Linfoma B humano BC-1 209±9 108±5 101±9 83±1 1
Linfoma de Burkitt humano CA-46 294±19 109±7 100±19 94±9
Linfoma de Hodgkin humano KM-
310±8 101±5 99±8 86±7 H2
Linfoma T humano DERL-7 250±9 105±6 90±9 97±6
Mieloma múltiple humano COLO-
224±21 102±6 101±4 104±6 677
En las células fibroblásticas obtenidas del modelo animal, se analizó la expresión, mediante inmunohistoquímica, de los mencionados marcadores: TGF-a, TGF-β 1, TGF-β 2, TGF-β 3, MMP-7, MMP-1 1, MMP-14MP-14. En las Tablas 32 a 35, se muestra el tipo de marcador utilizado y el porcentaje medio de fibroblastos presente en áreas áreas no tumorales, tumorales y peritumorales (±SD) que expresaban el marcador indicado en cada uno de los tipos de tumor desarrollado a partir de las diferentes a líneas celulares utilizadas. Todo ello en ratones tratados con antagonistas no peptídicos del receptor NK1 y en animales no tratados (control). A modo de ejemplo, las Tablas 32 a 35 muestran los resultados obtenidos con cuatro de las líneas tumorales descritas en la Tabla 9. Tabla 32. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos aislados de la zona tumoral o peritumoral de tumores producidos en un modelo animal de ratón mediante la inyección de células de la línea tumoral de carcinoma de pulmón de célula no pequeña humano (HCC-44), en ratones tratados o no (grupo control) con diferentes antagonistas del receptor NK1. La tabla mue stra el porcentaje±SD del número de fibroblastos que expresan cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Figure imgf000048_0001
Tabla 33. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos aislados de la zona tumoral o peritumoral de tumores producidos en un modelo animal de ratón mediante la inyección de células de la línea tumoral de glioma humano (GAMG), en ratones tratados o no (grupo control) con diferentes antagonistas del receptor NK1. La tabla muestra el porcentaje±SD del número de fibroblastos que expresan cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Figure imgf000048_0002
Tabla 34. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos aislados de la zona tumoral o peritumoral de tumores producidos en un modelo animal de ratón mediante la inyección de células de la línea tumoral de rabdomiosarcoma humano (A-204), en ratones tratados o no (grupo control) con diferentes antagonistas del receptor NK1. La tabla muestra el porcentaje±SD del número de fibroblastos que expresan cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Figure imgf000049_0001
Tabla 35. Análisis de la expresión de diferentes marcadores moleculares asociados con el desarrollo y progresión tumoral en fibroblastos aislados de la zona tumoral o peritumoral de tumores producidos en un modelo animal de ratón mediante la inyección de células de la línea tumoral de melanoma humano (MEL HO), en ratones tratados o no (grupo control) con diferentes antagonistas del receptor NK1. La tabla muestra el porcentaje±SD del número de fibroblastos que expresan cada marcador respecto al total de células de cada muestra.
Figure imgf000049_0002
Como se puede apreciar en las Tablas 32 a 35, los fibroblastos de las zonas tumorales y peritumorales expresan los marcadores tumorales, mientras que no se aprecia expresión de los mismos en las áreas no tumorales, lo que demuestra que la interacción "z'w vivo" de los fibroblastos con las células tumorales, induce la expresión y la secreción de estas moléculas. También se aprecia como el tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 inhibe la expresión de estas moléculas. Por lo tanto, en mamíferos la interacción entre los fibroblastos y las células tumorales induce la expresión en los fibroblastos de las mencionadas moléculas de importancia en el microambiente, en la persistencia y en la progresión de los tumores. Esta expresión se anula con la exposición a los antagonistas no peptídicos del receptor NK1.
En las muestras de células estromales, fibroblastos, de zonas alejadas del tumor de todos los casos tratados con los diferentes antagonistas del receptor NK1 y de los grupos control (no tratados) el porcentaje de fibroblastos con expresión de todos los marcadores inmunohistoquímicos estudiados fue del 0%. Similares resultados a los mostrados en las Tablas 33 a 35 se obtuvieron cuando se utilizaron otros antagonistas no peptídicos del receptor NK1 : L- 733,060, L-732, 138, L-703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP-96345 y L-760735.
Ejemplo 7. La interacción de las células tumorales primarias, obtenidas directamente de humanos, con células endoteliales vasculares humanas, estimula la supervivencia de ambos tipos celulares y el tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 inhibe dicha supervivencia.
Para comprobar que la interacción de las células de tumores primarios extraídas directamente de humanos con las células endoteliales vasculares humanas, estimula la supervivencia de ambos tipos celulares, se realizaron cultivos conjuntos de células endoteliales microvasculares procedentes de prepucio juvenil (PromoCell GmbH, SickingenstraBe 63/65, D-69126 Heidelberg, Germany; referencia C-12210) con células tumorales obtenidas directamente de tumores primarios humanos. Los distintos tumores y las características de los pacientes se muestran en la Tabla 36.
Tabla 36. Características de los pacientes de los que se obtuvieron muestras para el cultivo celular.
Tipo de tumor Sexo Edad Tipo histológico
Carcinoma de estómago. Hombre 56 Adenocarcinoma
Carcinoma de Colon. Hombre 61 Adenocarcinoma
Carcinoma de Páncreas. Mujer 52 Adenocarcinoma
Carcinoma Renal. Hombre 62 Carcinoma de células claras
Carcinoma de mama. Mujer 48 Adenocarcinoma ductal.
Carcinoma de Ovario. Mujer 59 Adenocarcinoma
Carcinoma de endometrio. Mujer 63 Adenocarcinoma
Carcinoma de cérvix. Mujer 36 Carcinoma de células escamosas
Carcinoma de pulmón Hombre 57 Carcinoma de células Pequeñas
Carcinoma de pulmón Hombre 65 Carcinoma de células No Pequeñas
Carcinoma de tiroides. Mujer 42 Carcinoma folicular
Carcinoma de tiroides. Mujer 37 Carcinoma papilar
Carcinoma de próstata. Hombre 71 Adenocarcinoma (Gleasson 3+4)
Glioma Hombre 57 Oligoastrocitoma
Fbrosarcoma Hombre 61 Fiborarcoma Grado histológico 2
Histiocitoma fibroso maligno Hombre 72 Histiocitoma fibroso maligno (Grado 3).
Sarcoma de Ewing. Hombre 31 Sarcoma de Ewing
Melanoma Mujer 61 Melanoma nodular.
Neuroblastoma Hombre 12 Neuroblastoma
Leucemia B Mujer 21 Leucemia crónica B
Leucemia T Hombre 32 Leucemia crónica T Tipo de tumor Sexo Edad Tipo histológico
Linfoma No Hodgking B Hombre 52 Linfoma T angioinmunoblástico
Linfoma No Hodgkin T Hombre 34 Linfoma B difuso de célula Grande
Linfoma de Hodgkin Hombre 41 Linfoma de Hodgkin
Mieloma Hombre 63 Mieloma múltiple
Para obtener las células tumorales a partir de tumores primarios humanos se empleó el mismo método descrito en el Ejemplo 2. Una vez aisladas se sembraron en placas de 24 pocilios a una concentración de 25.000 células por pocilio. Un total de 6 pocilios conteniendo las células tumorales se utilizaron como control de supervivencia. Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales se cultivaron con adición de células endoteliales. Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales se cultivaron en presencia de células endoteliales y el agonista del receptor NKl (SP). Otros grupos de 6 pocilios conteniendo las células tumorales se cultivaron en presencia de células endoteliales, el agonista del receptor NKl (SP) y cada uno de los antagonistas no peptídicos del receptor NKl, Aprepitant, Vestipitant y Casopitant.
En primer lugar, se comprobó que tanto las células tumorales como las endoteliales expresaban receptor NKl mediante la técnica de Western Blot descrita en el Ejemplo 1. Posteriormente se incluyeron en parafina para su análisis mediante técnicas inmunohistoquímicas. Para poder identificar los distintos tipos celulares y hacer el recuento de los mismos se llevó a cabo un mareaje con anticuerpos primarios específicos para células endoteliales humanas (Anti-CD31), células de carcinoma (Anti-Citoqueratinas de Amplio Espectro), Glioma (Anti-Proteína Glial Fibrilar Acida), Fibrosarcoma e Histiocitoma Fibroso Maligno (Anti-Actina de Músculo Liso), Sarcoma de Ewing (Anti-CD99), Melanoma (Anti-HMB45), Leucemias y linfomas (Anti- Antígeno Común Leucitario) y Mieloma (anti-CD 138). Todos los anticuerpos son distribuidos por Dako y se utilizaron a la misma concentración a la que son suministrados (se suministran prediluidos -"ready to use" -).
En las Tablas 37 a 41 se detalla el porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales-células endoteliales (Tabla 37), células tumorales-células endoteliales con exposición al agonista del receptor NKl (SP) (Tabla 38), células tumorales-células endoteliales con exposición al antagonista del receptor NKl (SP) y cada uno de los antagonistas del receptor NKl : Aprepitant, Vestipitant y Casopitant (Tablas 39- 41). Se obtuvieron los mismos resultados cuando se utilizaron otros antagonistas no peptídicos de receptores NKl : L-733,060, L-732, 138, L-703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP-96345 y L-760735. Tabla 37. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control de los cultivos conjuntos de células tumorales-células endoteliales.
Figure imgf000052_0001
Tabla 38. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales-células endoteliales en presencia de la SP (1 μΜ).
Células Células
Células Células endoteliales en tumorales en
Tipo de tumor endoteliales tumorales co-cultivo con co-cultivo con
(control) (control) células células tumorales+SP endoteliales+SP
Carcinoma de estómago. 100 100 251±3 260±4
Carcinoma de Colon. 100 100 243±4 253±4
Carcinoma de Páncreas. 100 100 287±3 252±4
Carcinoma Renal. 100 100 282±4 260±4
Carcinoma de mama. 100 100 281±4 253±5
Carcinoma de Ovario. 100 100 282±4 254±4
Carcinoma de endometrio. 100 100 283±5 252±3
Carcinoma de cérvix. 100 100 292±4 260±4
Carcinoma de pulmón 100 100 294±2 264±3 Células Células
Células Células endoteliales en tumorales en
Tipo de tumor endoteliales tumorales co-cultivo con co-cultivo con
(control) (control) células células tumorales+SP endoteliales+SP
Carcinoma de pulmón 100 100 274±5 245±6
Carcinoma de tiroides. 100 100 260±5 240±6
Carcinoma de tiroides. 100 100 265±2 230±4
Carcinoma de próstata. 100 100 270±4 269±1
Glioma 100 100 238±6 247±5
Fbrosarcoma 100 100 249±5 257±3
Histiocitoma fibroso 100 100 246±4 245±3 maligno
Sarcoma de Ewing. 100 100 234±5 236±4
Melanoma 100 100 267±4 245±2
Neuroblastoma 100 100 258±3 256±5
Leucemia B 100 100 278±4 265±6
Leucemia T 100 100 276±4 256±6
Linfoma No Hodgking B 100 100 254±7 267±5
Linfoma No Hodgkin T 100 100 256±4 276±4
Linfoma de Hodgkin 100 100 248±5 265±4
Mieloma 100 100 267±2 232±3
Tabla 39. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales -células endoteliales en presencia de la SP (1 μΜ) y del antagonista no peptídico del receptor NKl, Aprepitant (ΙμΜ).
Células Células
Células endoteliales en tumorales en co-
Células
tumorales co-cultivo con cultivo con
Tipo de tumor endoteliales
células células (control)
(control) tumorales+SP+ endoteliales+SP+
Aprepitant Aprepitant
Carcinoma de estómago. 100 100 65±2 54±5
Carcinoma de Colon. 100 100 57±3 61±3
Carcinoma de Páncreas. 100 100 52±4 46±6
Carcinoma Renal. 100 100 56±2 53±3
Carcinoma de mama. 100 100 56±6 56±3
Carcinoma de Ovario. 100 100 49±5 54±4
Carcinoma de endometrio. 100 100 57±4 49±3
Carcinoma de cérvix. 100 100 45±3 46±3
Carcinoma de pulmón 100 100 46±7 63±3
Carcinoma de pulmón 100 100 43±4 65±4
Carcinoma de tiroides. 100 100 45±3 46±6
Carcinoma de tiroides. 100 100 56±6 56±4
Carcinoma de próstata. 100 100 54±4 47±5
Glioma 100 100 56±5 49±4
Fbrosarcoma 100 100 45±6 55±6
Histiocitoma fibroso 100 100 56±6 44±5 maligno. Células Células
Células endoteliales en tumorales en co-
Células
tumorales co-cultivo con cultivo con
Tipo de tumor endoteliales
células células (control)
(control) tumorales+SP+ endoteliales+SP+
Aprepitant Aprepitant
Sarcoma de Ewing. 100 100 45±5 45±7
Melanoma 100 100 56±6 46±5
Neuroblastoma 100 100 49±4 55±6
Leucemia B 100 100 46±5 54±6
Leucemia T 100 100 56±6 56±5
Linfoma No Hodgking B 100 100 67±5 49±6
Linfoma No Hodgkin T 100 100 49±4 83±8
Linfoma de Hodgkin 100 100 48±4 74±6
Mieloma 100 100 54±8 64±3
Tabla 40. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales -células endoteliales en presencia de la SP ( 1 μΜ) y del antagonista no peptídico del receptor NKl, Vestipitant (ΙμΜ).
Células Células
Células endoteliales en tumorales en co-
Células
tumorales co-cultivo con cultivo con
Tipo de tumor endoteliales
células células (control)
(control) tumorales+SP+ endoteliales+SP+
Vestipitant Vestipitant
Carcinoma de estómago. 100 100 62±3 56±4
Carcinoma de Colon. 100 100 54±3 65±6
Carcinoma de Páncreas. 100 100 55±3 47±5
Carcinoma Renal. 100 100 54±3 54±4
Carcinoma de mama. 100 100 55±4 55±5
Carcinoma de Ovario. 100 100 44±4 57±6
Carcinoma de endometrio. 100 100 56±5 47±6
Carcinoma de cérvix. 100 100 47±4 47±4
Carcinoma de pulmón 100 100 45±6 67±5
Carcinoma de pulmón 100 100 45±3 64±6
Carcinoma de tiroides. 100 100 46±4 47±5
Carcinoma de tiroides. 100 100 52±5 55±6
Carcinoma de próstata. 100 100 51±6 48±6
Glioma 100 100 54±3 47±5
Fbrosarcoma 100 100 46±7 56±7
Histiocitoma fibroso 100 100 53±4 46±7 maligno.
Sarcoma de Ewing. 100 100 46±4 47±6
Melanoma 100 100 55±5 44±4
Neuroblastoma 100 100 46±3 56±4
Leucemia B 100 100 47±4 53±5
Leucemia T 100 100 57±4 56±4
Linfoma No Hodgking B 100 100 65±4 43±5 Células Células
Células endoteliales en tumorales en co-
Células
tumorales co-cultivo con cultivo con
Tipo de tumor endoteliales
células células (control)
(control) tumorales+SP+ endoteliales+SP+
Vestipitant Vestipitant
Linfoma No Hodgkin T 100 100 48±6 81±5
Linfoma de Hodgkin 100 100 47±5 76±5
Mieloma 100 100 56±7 66±3
Tabla 41. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales -células endoteliales en presencia de la SP (1 μΜ) y del antagonista no peptídico del receptor NKl, Casopitant (Ι μΜ).
Células Células
Células endoteliales en tumorales en co-
Células
tumorales co-cultivo con cultivo con
Tipo de tumor endoteliales
células células (control)
(control) tumorales+SP+ endoteliales+SP+
Casopitant Casopitant
Carcinoma de estómago. 100 100 61±2 55±4
Carcinoma de Colon. 100 100 53±4 66±6
Carcinoma de Páncreas. 100 100 54±5 48±5
Carcinoma Renal. 100 100 55±2 57±4
Carcinoma de mama. 100 100 54±5 56±5
Carcinoma de Ovario. 100 100 46±4 58±6
Carcinoma de endometrio. 100 100 57±6 44±6
Carcinoma de cérvix. 100 100 51±5 46±4
Carcinoma de pulmón 100 100 47±5 68±4
Carcinoma de pulmón 100 100 5 \±2 67±5
Carcinoma de tiroides. 100 100 47±3 46±4
Carcinoma de tiroides. 100 100 56±4 58±5
Carcinoma de próstata. 100 100 57±5 49±3
Glioma 100 100 56±4 51±3
Fbrosarcoma 100 100 47±8 53±4
Histiocitoma fibroso 100 100 56±5 47±3 maligno.
Sarcoma de Ewing. 100 100 49±5 49±3
Melanoma 100 100 56±4 48±2
Neuroblastoma 100 100 47±2 57±3
Leucemia B 100 100 46±3 54±5
Leucemia T 100 100 56±7 54±6
Linfoma No Hodgking B 100 100 64±5 49±7
Linfoma No Hodgkin T 100 100 47±8 86±4
Linfoma de Hodgkin 100 100 45±4 77±4
Mieloma 100 100 55±5 67±3 En las Tablas 38 a 41, se aprecia que la interacción entre las células tumorales primarias humanas obtenidas directamente de tumores humanos y las células endoteliales vasculares humanas, estimula la supervivencia de las mismas y que el agonista del receptor NKl (SP) potencia dicho fenómeno y, por el contrario, los antagonistas de los receptores NKl lo anulan. Dado que la angiogénesis es fundamental para el desarrollo y mantenimiento de los tumores, el uso de los antagonistas no peptídicos de NKl es capaz de inhibir dicha angiogénis evitando así la extensión y crecimiento del tumor.
Ejemplo 8. La interacción de las células tumorales primarias, obtenidas directamente de humanos, con las células estromales -fibroblastos- humanas, obtenidas del mismo paciente, estimula la supervivencia de ambos tipos celulares y el tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl inhibe dicha supervivencia.
Para comprobar que la interacción de las células de tumores primarios humanos con las células estromales -fibroblastos- humanas, estimula la supervivencia de ambos tipos celulares, se realizaron cultivos conjuntos de células estromales -fibroblastos- humanas con células tumorales obtenidas directamente de tumores primarios humanos. Los distintos tumores y las características de los pacientes se muestran en la Tabla 36. Para obtener las células tumorales a partir de tumores primarios humanos se empleó el mismo método descrito en el Ejemplo 7. De manera similar, se obtuvieron células estromales - fibroblastos- que se pusieron en cultivo, a partir de muestras obtenidas de la piel del mismo paciente en el área de la incisión quirúrgica que les fue realizada en la propia intervención realizada para extirparles el tumor. De manera similar a lo realizado en el Ejemplo 7, un total de 6 pocilios conteniendo las células tumorales se utilizaron como control de supervivencia de las mismas otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales se cultivaron con adición de las células estromales -fibroblastos-, otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales se cultivaron en presencia de células estromales -fibroblastos- y el agonista del receptor NKl (SP), otro grupos de 6 pocilios conteniendo las células tumorales se cultivaron en presencia de células estromales -fibroblastos- humanas, el agonista del receptor NKl (SP) y cada uno de los antagonistas no peptídicos del receptor NKl analizados: Aprepitant, Vestipitant y Casopitant.
Al igual que en el Ejemplo 7, se comprobó que tanto los fibroblastos como las células tumorales expresaban el receptor NKl mediante la técnica de Western Blot y haciendo uso de los anticuerpos descritos en el Ejemplo 7. En las Tablas 42 a 46 se detalla el porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales-células estromales fibroblásticas (Tabla 42), células tumorales-células estromales fibroblásticas con exposición al agonista del receptor NKl (SP) (Tabla 43), células tumorales-células estromales fibroblásticas con exposición al antagonista del receptor NKl (SP) y cada uno de los antagonistas del receptor NKl : Aprepitant, Vestipitant y Casopitant (Tablas 44-46). Se obtuvieron los mismos resultados cuando se utilizaron otros antagonistas no peptídicos de receptores NKl : L-733,060, L-732, 138, L- 703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP-96345 y L-760735. Los resultados mostrados en dichas tablas ponen de manifiesto como la interacción de las células tumorales primarias humanas y las células estromales -fibroblastos- humanas, estimula la supervivencia de las mismas y que el agonista del receptor NKl (SP) potencia dicho fenómeno, pero que los antagonistas no peptídicos del receptor NKl inhiben dicha proliferación.
Tabla 42. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control de los cultivos conjuntos de células tumorales-células estromales fibroblásticas.
Células Células
Células Células fibroblásticas tumorales en co-
Tipo de tumor fibroblásticas tumorales en co-cultivo con cultivo con
(control) (control) células células tumorales fibroblásticas
Carcinoma de estómago. 100 100 115±4 145±4
Carcinoma de Colon. 100 100 114±3 144±5
Carcinoma de Páncreas. 100 100 117±3 132±2
Carcinoma Renal. 100 100 132±3 143±4
Carcinoma de mama. 100 100 121±4 144±3
Carcinoma de Ovario. 100 100 122±3 152±4
Carcinoma de endometrio. 100 100 126±2 143±5
Carcinoma de cérvix. 100 100 124±5 145±4
Carcinoma de pulmón 100 100 124±4 146±5
Carcinoma de pulmón 100 100 126±5 142±5
Carcinoma de tiroides. 100 100 125±4 143±4
Carcinoma de tiroides. 100 100 127±4 142±6
Carcinoma de próstata. 100 100 126±5 141±5
Glioma 100 100 124±4 151±4
Sarcoma de Ewing. 100 100 125±6 152±5
Melanoma 100 100 134±5 153±4
Neuroblastoma 100 100 134±3 155±6
Leucemia B 100 100 124±6 154±7
Leucemia T 100 100 123±4 145±5
Linfoma No Hodgking B 100 100 135±6 156±7
Linfoma No Hodgkin T 100 100 126±3 147±4
Linfoma de Hodgkin 100 100 123±5 151±3
Mieloma 100 100 124±5 152±5 Tabla 43. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales-células estromales fibroblásticas en presencia de la SP (1 μΜ).
Figure imgf000058_0001
Tabla 44. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales-células endoteliales en presencia de la SP (1 μΜ) y del antagonista no peptídico del receptor NK1, Aprepitant (ΙμΜ).
Células Células
Células endoteliales en tumorales en co-
Células
tumorales co-cultivo con cultivo con
Tipo de tumor endoteliales
células células (control)
(control) tumorales+SP+ endoteliales+SP+
Aprepitant Aprepitant
Carcinoma de estómago. 100 100 85±1 44±3
Carcinoma de Colon. 100 100 87±2 41±2
Carcinoma de Páncreas. 100 100 85±3 36±5
Carcinoma Renal. 100 100 86±4 43±2
Carcinoma de mama. 100 100 86±5 49±2
Carcinoma de Ovario. 100 100 89±4 45±6
Carcinoma de endometrio. 100 100 87±3 44±6
Carcinoma de cérvix. 100 100 85±5 47±2 Células Células
Células endoteliales en tumorales en co-
Células
tumorales co-cultivo con cultivo con
Tipo de tumor endoteliales
células células (control)
(control) tumorales+SP+ endoteliales+SP+
Aprepitant Aprepitant
Carcinoma de pulmón 100 100 86±8 45±5
Carcinoma de pulmón 100 100 83±6 44±4
Carcinoma de tiroides. 100 100 87±3 45±3
Carcinoma de tiroides. 100 100 84±5 51±5
Carcinoma de próstata. 100 100 85±6 49±4
Glioma 100 100 86±6 49±4
Sarcoma de Ewing. 100 100 87±6 44±5
Melanoma 100 100 86±5 45±7
Neuroblastoma 100 100 88±6 57±3
Leucemia B 100 100 87±4 58±4
Leucemia T 100 100 86±6 57±6
Linfoma No Hodgking B 100 100 88±4 51±7
Linfoma No Hodgkin T 100 100 89±5 71±6
Linfoma de Hodgkin 100 100 86±5 79±5
Mieloma 100 100 88±6 84±6
Tabla 45. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales -células endoteliales en presencia de la SP (1 μΜ) y del antagonista no peptídico del receptor NKl, Vestipitant (ΙμΜ).
Células Células
Células endoteliales en tumorales en co-
Células
tumorales co-cultivo con cultivo con
Tipo de tumor endoteliales
células células (control)
(control) tumorales+SP+ endoteliales+SP+
Vestipitant Vestipitant
Carcinoma de estómago. 100 100 85±2 54±3
Carcinoma de Colon. 100 100 87±3 62±2
Carcinoma de Páncreas. 100 100 88±5 44±6
Carcinoma Renal. 100 100 88±6 53±5
Carcinoma de mama. 100 100 89±3 54±6
Carcinoma de Ovario. 100 100 84±5 55±5
Carcinoma de endometrio. 100 100 86±6 46±4
Carcinoma de cérvix. 100 100 87±5 46±7
Carcinoma de pulmón 100 100 85±7 69±4
Carcinoma de pulmón 100 100 85±6 68±5
Carcinoma de tiroides. 100 100 86±5 49±4
Carcinoma de tiroides. 100 100 82±6 51±5
Carcinoma de próstata. 100 100 81±5 49±5
Glioma 100 100 84±6 46±4
Sarcoma de Ewing. 100 100 86±5 45±5
Melanoma 100 100 85±5 46±6
Neuroblastoma 100 100 86±3 55±6
Leucemia B 100 100 87±4 54±4
Leucemia T 100 100 87±5 55±6 Células Células
Células endoteliales en tumorales en co-
Células
tumorales co-cultivo con cultivo con
Tipo de tumor endoteliales
células células (control)
(control) tumorales+SP+ endoteliales+SP+
Vestipitant Vestipitant
Linfoma No Hodgking B 100 100 86±6 42±3
Linfoma No Hodgkin T 100 100 91±5 46±4
Linfoma de Hodgkin 100 100 92±4 76±4
Mieloma 100 100 91±6 65±3
Tabla 46. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales -células endoteliales en presencia de la SP (1 μΜ) y del antagonista no peptídico del receptor NKl, Casopitant (ΙμΜ).
Células Células
Células endoteliales en tumorales en co-
Células
tumorales co-cultivo con cultivo con
Tipo de tumor endoteliales
células células (control)
(control) tumorales+SP+ endoteliales+SP+
Casopitant Casopitant
Carcinoma de estómago. 100 100 91±3 51±3
Carcinoma de Colon. 100 100 83±4 62±3
Carcinoma de Páncreas. 100 100 85±3 49±4
Carcinoma Renal. 100 100 86±4 56±5
Carcinoma de mama. 100 100 84±5 57±7
Carcinoma de Ovario. 100 100 91±4 56±8
Carcinoma de endometrio. 100 100 94±5 48±7
Carcinoma de cérvix. 100 100 83±4 47±5
Carcinoma de pulmón 100 100 78±4 67±5
Carcinoma de pulmón 100 100 76±3 66±4
Carcinoma de tiroides. 100 100 75±4 41±3
Carcinoma de tiroides. 100 100 75±5 56±4
Carcinoma de próstata. 100 100 57±7 47±2
Glioma 100 100 51±6 50±2
Sarcoma de Ewing. 100 100 52±4 47±2
Melanoma 100 100 52±3 46±3
Neuroblastoma 100 100 53±1 56±2
Leucemia B 100 100 52±2 53±4
Leucemia T 100 100 51±5 52±5
Linfoma No Hodgking B 100 100 54±4 48±6
Linfoma No Hodgkin T 100 100 61±7 44±3
Linfoma de Hodgkin 100 100 60±3 75±3
Mieloma 100 100 57±4 65±4 Ejemplo 9. La interacción de las células tumorales primarias, obtenidas directamente de humanos, con las células del sistema inmune/inflamatorias (leucocitos mono y polimorfonucleares) obtenidas de ese mismo paciente, estimulan la supervivencia de ambos tipos celulares y el tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 inhibe dicha supervivencia.
Para comprobar que la interacción de las células de tumores primarios humanos con las células del sistema inmune/inflamatorias (leucocitos mononucleares y leucocitos polimorfonucleares) humanas, estimula la supervivencia de ambos tipos celulares, se realizaron cultivos conjuntos de células del sistema inmune/inflamatorias (leucocitos mono y polimorfonucleares) con células tumorales obtenidas directamente de tumores primarios humanos de los mimos pacientes. Los distintos tumores y las características de los pacientes se muestran en la Tabla 36.
Para obtener las células tumorales a partir de tumores primarios humanos se empleó el mismo método descrito en el Ejemplo 7. Los leucocitos se obtuvieron de la centrifugación de la sangre del mismo paciente. Se cultivaron en plasma fresco del mismo paciente, con objeto de construir un modelo fisiológico similar al humano. De manera similar a lo realizado en el citado ejemplo, un total de seis pocilios se emplearon para cultivas las células inflamatorias (leucocitos mono y polimorfonucleares) como control, un total de 6 pocilios conteniendo las células tumorales se utilizaron como control de supervivencia de dichas células tumorales, otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales se cultivaron con adición de células del sistema inmune/inflamatorias (leucocitos mono y polimorfonucleares), otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales se cultivaron en presencia de las células del sistema inmune/inflamatorias (leucocitos mono y polimorfonucleares) y el agonista del receptor NK1 (SP), otros grupos de 6 pocilios conteniendo las células tumorales se cultivaron en presencia de las células del sistema inmune/inflamatorias (leucocitos mono y polimorfonucleares), el agonista del receptor NK1 (SP) y cada uno de los antagonistas no peptídicos del receptor NK1 analizados: Aprepitant, Vestipitant y Casopitant. Al igual que en el Ejemplo 7, se comprobó que tanto las células del sistema inmune/inflamatorias (leucocitos mono y polimorfonucleares), como las células tumorales expresaban el receptor NK1 mediante la técnica de Western Blot y haciendo uso de los anticuerpos descritos en el Ejemplo 7. En las Tablas 47 a 51 se detalla el porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales- células del sistema inmune - leucocitarias mono o polimorfonucleares-(Tabla 47), células tumorales- células del sistema inmune -leucocitarias mono o polimorfonucleares- con exposición al agonista del receptor NK1 (SP) (Tabla 48), células tumorales- células del sistema inmune -leucocitarias mono o polimorfonucleares-, con exposición al antagonista del receptor NK1 (SP) y cada uno de los antagonistas del receptor NK1 : Aprepitant, Vestipitant y Casopitant (Tablas 49-51). Se obtuvieron los mismos resultados cuando se utilizaron otros antagonistas no peptídicos de receptores NK1 : L-733,060, L-732, 138, L-703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP- 96345 y L-760735. Los resultados mostrados en dichas tablas ponen de manifiesto como la interacción de las células tumorales primarias humanas y las células del sistema inmune - leucocitarias mono o polimorfonucleares-, estimula la supervivencia de las mismas y que el agonista del receptor NK1 (SP) potencia dicho fenómeno, pero que los antagonistas no peptídicos del receptor NK1 inhiben dicha proliferación.
Tabla 47. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control de los cultivos conjuntos de células tumorales-células del sistema inmune/inflamatorio (leucocitos).
Leucocitos en Células
Células
Leucocitos co-cultivo con tumorales en co-
Tipo de tumor tumorales
(control) células cultivo con
(control)
tumorales leucocitos
Carcinoma de estómago. 100 100 125±4 185±5
Carcinoma de Colon. 100 100 124±2 184±6
Carcinoma de Páncreas. 100 100 116±4 192±3
Carcinoma Renal. 100 100 122±2 193±5
Carcinoma de mama. 100 100 123±3 194±4
Carcinoma de Ovario. 100 100 123±4 192±5
Carcinoma de endometrio. 100 100 124±4 193±6
Carcinoma de cérvix. 100 100 125±4 195±7
Carcinoma de pulmón 100 100 125±3 196±6
Carcinoma de pulmón 100 100 124±5 192±7
Carcinoma de tiroides. 100 100 126±3 193±5
Carcinoma de tiroides. 100 100 125±5 192±7
Carcinoma de próstata. 100 100 124±6 191±6
Glioma 100 100 125±5 188±6
Sarcoma de Ewing. 100 100 126±7 189±4
Melanoma 100 100 135±6 189±6
Neuroblastoma 100 100 136±7 189±5
Mieloma 100 100 125±6 189±6
Carcinoma de mama. 100 100 123±3 194±4 Tabla 48. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales- células del sistema inmune/inflamatorio (leucocitos) en presencia de la SP (1 μΜ).
Figure imgf000063_0001
Tabla 49. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales- células del sistema inmune/inflamatorio (leucocitos) en presencia de la SP (1 μΜ) y del antagonista no peptídico del receptor NKl, Aprepitant (ΙμΜ).
Leucocitos en Células
Células co-cultivo con tumorales en co-
Leucocitos
Tipo de tumor tumorales células cultivo con
(control)
(control) tumorales+SP+ Leucocitos +SP+
Aprepitant Aprepitant
Carcinoma de estómago. 100 100 89±6 34±5
Carcinoma de Colon. 100 100 89±6 31±6
Carcinoma de Páncreas. 100 100 89±6 35±6
Carcinoma Renal. 100 100 91±5 41±7
Carcinoma de mama. 100 100 92±5 47±2
Carcinoma de Ovario. 100 100 90±4 40±7
Carcinoma de endometrio. 100 100 93±3 42±5
Carcinoma de cérvix. 100 100 94±4 43±6
Leucocitos Células Leucocitos en Células tumorales
Tipo de tumor
(control) tumorales co-cultivo con en co-cultivo con (control) células Leucocitos +SP+ tumorales+SP+ Aprepitant Aprepitant
Carcinoma de pulmón 100 100 95±6 45±7
Carcinoma de pulmón 100 100 86±6 42±6
Carcinoma de tiroides. 100 100 85±3 46±7
Carcinoma de tiroides. 100 100 87±5 52±6
Carcinoma de próstata. 100 100 80±5 41±6
Glioma 100 100 78±6 45±5
Sarcoma de Ewing. 100 100 75±5 40±6
Melanoma 100 100 80±4 43±5
Neuroblastoma 100 100 81±5 51±5
Mieloma 100 100 87±5 64±7
Tabla 50. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales del sistema inmune/inflamatorio en presencia de la SP (1 μΜ) y del antagonista no peptídico del receptor NK1, Vestipitant (ΙμΜ).
Figure imgf000064_0001
Tabla 51. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales -células del sistema inmune/inflamatorio en presencia de la SP (1 μΜ) y del antagonista no peptídico del receptor NK1, Casopitant (ΙμΜ). Leucocitos en Células
Células co-cultivo con tumorales en co-
Leucocitos
Tipo de tumor tumorales células cultivo con
(control)
(control) tumorales+SP+ Leucocitos +SP+
Casopitant Casopitant
Carcinoma de estómago. 100 100 92±5 50±5
Carcinoma de Colon. 100 100 91±6 60±6
Carcinoma de Páncreas. 100 100 91±5 51±7
Carcinoma Renal. 100 100 89±6 51±6
Carcinoma de mama. 100 100 89±7 52±8
Carcinoma de Ovario. 100 100 90±8 54±7
Carcinoma de endometrio. 100 100 91±7 52±8
Carcinoma de cérvix. 100 100 89±8 53±6
Carcinoma de pulmón 100 100 90±6 52±6
Carcinoma de pulmón 100 100 92±7 51±7
Carcinoma de tiroides. 100 100 93±6 61±6
Carcinoma de tiroides. 100 100 94±8 60±7
Carcinoma de próstata. 100 100 91±6 58±6
Glioma 100 100 92±7 57±5
Sarcoma de Ewin 100 100 93±5 49±5
Melanoma 100 100 91±7 49±4
Neuroblastoma 100 100 92±7 51±6
Mieloma 100 100 92±7 60±5
Ejemplo 10. La interacción de las células tumorales primarias, obtenidas directamente de humanos, con las células del sistema inmune/inflamatorias (macrófagos), obtenidas de ese mismo paciente, estimulan la supervivencia de ambos tipos celulares y el tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 inhibe dicha supervivencia.
Para comprobar que la interacción de las células de tumores primarios humanos con las células del sistema inmune/inflamatorias (macrófagos) humanas, estimula la supervivencia de ambos tipos celulares, se realizaron cultivos conjuntos en plasma sanguíneo fresco, de células del sistema inmune/inflamatorias (macrófagos) con células tumorales obtenidas de tumores primarios obtenidos del mismo paciente. Todo ello obtenido del mismo paciente, para construir un modelo experimental similar al fisiológico humano. Los distintos tumores y las características de los pacientes se muestran en la Tabla 36. Las muestras para el aislamiento de los macrófagos se tomaron de líquido pleural o de líquido peritoneal.
Para obtener las células tumorales a partir de tumores primarios humanos se empleó el mismo método descrito en el Ejemplo 7. De manera similar a lo realizado en el citado ejemplo, un total de seis pocilios se emplearon para cultivas las células inflamatorias (macrófagos) como control, un total de 6 pocilios conteniendo las células tumorales se utilizaron como control de supervivencia de dichas células tumorales, otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales se cultivaron con adición de células del sistema inmune/inflamatorias (macrófagos), otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales se cultivaron en presencia de las células del sistema inmune/inflamatorias(macrófagos) y el agonista del receptor NK1 (SP), otros grupos de 6 pocilios conteniendo las células tumorales se cultivaron en presencia de las células del sistema inmune/inflamatorias (leucocitos mono y polimorfonucleares), el agonista del receptor NK1 (SP) y cada uno de los antagonistas no peptídicos del receptor NK1 analizados: Aprepitant, Vestipitant y Casopitant.
Al igual que en el Ejemplo 7, se comprobó que tanto las células del sistema inmune/inflamatorias (macrófagos), como las células tumorales expresaban el receptor NK1 mediante la técnica de Western Blot y haciendo uso de los anticuerpos específicos para células del sistema inmune/inflamatorias (macrófagos) (Anti-CD68), células de carcinoma (Anti- Citoqueratinas de amplio espectro), Melanoma (Anti-HMB45). Todos los anticuerpos son distribuidos por Dako y se utilizaron a la concentración a la que son suministrados (se suministran pre-diluidos -"ready to use"-).
En las Tablas 52 a 56 se detalla el porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales- células del sistema inmune - inflamatorias (macrófagos) -(Tabla 52), células tumorales- células del sistema inmune - inflamatorias (macrófagos)- con exposición al agonista del receptor NK1 (SP) (Tabla 53), células tumorales- células del sistema inmune - inflamatorias (macrófagos)-, con exposición al antagonista del receptor NK1 (SP) y cada uno de los antagonistas del receptor NK1 : Aprepitant, Vestipitant y Casopitant (Tablas 54-56). Se obtuvieron los mismos resultados cuando se utilizaron otros antagonistas no peptídicos de receptores NK1 : L-733,060, L-732, 138, L- 703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP-96345 y L-760735. Los resultados mostrados en dichas tablas ponen de manifiesto como la interacción de las células tumorales primarias humanas y las células del sistema inmune - inflamatorias (macrófagos), estimula la supervivencia de las mismas y que el agonista del receptor NK1 (SP) potencia dicho fenómeno, pero que los antagonistas no peptídicos del receptor NK1 inhiben dicha proliferación.
Tabla 52. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control de los cultivos conjuntos de células tumorales-células del sistema inmune/inflamatorio (macrófagos). Macrófagos en Células
Células
Macrófagos co-cultivo con tumorales en co-
Tipo de tumor tumorales
(control) células cultivo con
(control)
tumorales Macrófagos
Carcinoma de estómago. 100 100 128±6 189±8
Carcinoma de Colon. 100 100 127±7 188±7
Carcinoma de mama 100 100 129±5 191±8
Carcinoma de Ovario. 100 100 125±5 190±8
Carcinoma de endometrio 100 100 128±7 197±7
Carcinoma de pulmón 100 100 124±6 194±8
Carcinoma de pulmón 100 100 128±7 192±8
Melanoma 100 100 137±5 184±9
Tabla 53. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales- células del sistema inmune/inflamatorio en presencia de la SP (1 μΜ).
Figure imgf000067_0001
Tabla 54. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales- células del sistema inmune/inflamatorio en presencia de la SP (1 μΜ) y del antagonista no peptídico del receptor NK1, Aprepitant (ΙμΜ).
Macrófagos en Células
Células co-cultivo con tumorales en co-
Macrófagos
Tipo de tumor tumorales células cultivo con
(control)
(control) tumorales+SP+ Macrófagos+SP+
Aprepitant Aprepitant
Carcinoma de estómago. 100 100 91±5 39±6
Carcinoma de Colon. 100 100 89±5 37±7
Carcinoma de Páncreas. 100 100 88±7 38±7
Carcinoma Renal. 100 100 90±6 40±6
Carcinoma de mama. 100 100 90±6 40±5
Carcinoma de Ovario. 100 100 94±5 42±6
Carcinoma de endometrio. 100 100 96±6 48±7
Carcinoma de cérvix. 100 100 95±5 45±6
Carcinoma de pulmón 100 100 96±5 47±6 Macrófagos en Células
Células co-cultivo con tumorales en co-
Macrófagos
Tipo de tumor tumorales células cultivo con
(control)
(control) tumorales+SP+ Macrófagos+SP+
Aprepitant Aprepitant
Carcinoma de pulmón 100 100 89±7 48±7
Carcinoma de tiroides. 100 100 89±5 47±6
Carcinoma de tiroides. 100 100 91±6 50±7
Carcinoma de próstata. 100 100 89±5 51±7
Glioma 100 100 88±5 52±6
Sarcoma de Ewing. 100 100 81±6 51±7
Melanoma 100 100 86±6 52±6
Neuroblastoma 100 100 87±7 56±6
Mieloma 100 100 86±6 54±7
Tabla 55. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales- células del sistema inmune/inflamatorio en presencia de la SP (1 μΜ) y del antagonista no peptídico del receptor NK1, Vestipitant (ΙμΜ).
Figure imgf000068_0001
Tabla 56. Porcentaje de inhibición/supervivencia en referencia al control, para los cultivos conjuntos de células tumorales- células del sistema inmune/inflamatorio en presencia de la SP
(1 μΜ) y del antagonista no peptídico del receptor NK1, Casopitant (ΙμΜ).
Macrófagos en
Células tumorales
Células co-cultivo con
Macrófagos en co-cultivo con
Tipo de tumor tumorales células
(control) Macrófagos+SP+
(control) tumorales+SP+
Casopitant Casopitant
Carcinoma de estómago. 100 100 95±6 55±7
Carcinoma de Colon. 100 100 94±5 58±5
Carcinoma de mama. 100 100 91±6 59±6
Carcinoma de Ovario. 100 100 92±5 57±6
Carcinoma de endometrio. 100 100 90±6 58±7
Carcinoma de pulmón 100 100 90±7 56±7
Carcinoma de pulmón 100 100 89±6 58±8
Melanoma 100 100 88±8 51±6 Ejemplo 11. La interacción de las células tumorales en humanos con las células estromales -fibroblastos- humanas, estimula la secreción de sustancias de importancia para la supervivencia y la progresión de los tumores y el tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 inhibe dicha secreción.
Para comprobar que la interacción de las células de tumores primarios humanos con las células estromales -fibroblastos- humanas, estimula la secreción de sustancias de importancia para la supervivencia y la progresión de los tumores, se realizaron cultivos conjuntos de células estromales -fibroblastos- humanas con células tumorales obtenidas directamente de tumores primarios humanos. Los distintos tumores y las características de los pacientes se muestran en la Tabla 36.
Para obtener las células tumorales a partir de tumores primarios humanos se llevó a cabo el mismo protocolo empleado en el Ejemplo 7. Un grupo control que contenía exclusivamente fibroblastos en cultivo fue utilizado como control de la expresión de sustancias en los mismos, otros grupo que contenía las células tumorales se cultivaron con adición de las células estromales -fibroblastos-, otros grupo que contenía las células tumorales se cultivaron en presencia de células estromales -fibroblastos- y el agonista del receptor NK1 (SP) y otros grupos que contenían las células tumorales se cultivaron en presencia de células estromales - fibroblastos- humanas, el agonista del receptor NK1 (SP) y cada uno de los antagonistas no peptídicos del receptor NK1 : Aprepitant, Vestipitant y Casopitant.
Previamente, se comprobó que las células tumorales y las células estromales -fibroblastos- humanas, expresaban receptor NK1 mediante la técnica de Western Blot. Posteriormente se elaboraron bloques de parafina para la posterior realización d ensayos inmunohistoquímicos. En esta ocasión y para poder identificar, mediante las técnicas de inmunohistoquímica, la secreción de sustancias de importancia para la supervivencia y la progresión de los tumores, se utilizaron los siguientes anticuerpos: TGF-α (SAB4502953), TGF-β 1 (SAB4502954), TGF-β 2 (SAB4502956), TGF-β 3 (SAB4502957), SPARC (HPA002989), MMP-3 (HPA007875); MMP-7 (SAB4501894), MMP-9 (SAB4501896), MMP-11 (SAB4501898), MMP-13 (SAB4501900) y MMP-14 (SAB4501901), mediante anticuerpos específicos frente a los mismos. Para la realización de estos estudios inmunohistoquímicos todos los anticuerpos utilizados fueron anticuerpos policlonales de conejo obtenidos de Sigma-Aldrich y se utilizaron a una concentración 1/1000. Todos los experimentos se realizaron por sextuplicado. En las tablas 57 a 61 se detalla el porcentaje de células con expresión para cada uno de los marcadores (sustancias con importancia para el microambiente tumoral), para los cultivos conjuntos de células tumorales-células estromales -fibroblásticas-, células tumorales-células estromales -fibroblásticas- con exposición al agonista del receptor NKl (SP), células tumorales y estromales -fibroblásticas- con exposición al agonista del receptor NKl (SP) y cada uno de los antagonistas del receptor NKl : Aprepitant, Vestipitant y Casopitant. En dichas tablas 57 a 61 se muestran 5 ejemplos de cocultivos de las células estromales -fibroblásticas junto con diferentes células tumorales extraídas de tumores del tipo: cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, glioma y mieloma. Se obtuvieron los mismos resultados cuando se utilizaron otros antagonistas no peptídicos de receptores NKl : L-733,060, L-732, 138, L-703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP-96345 y L-760735.
Los resultados mostrados en dichas tablas ponen de manifiesto como la interacción de las células tumorales primarias humanas y las células estromales -fibroblastos- humanas, estimula la expresión de las sustancias con importancia en el microambiente tumoral, para la supervivencia y progresión de los tumores y que el agonista del receptor NKl (SP) potencia este fenómeno, mientras que el tratamiento con los antagonistas no peptídicos de los receptores NKl inhiben dicha expresión. Tabla 57. Porcentaje de células fibroblásticas que expresan los marcadores analizados en cocultivo con células aisladas de carcinoma de colon y en presencia de la SP (1 μΜ) y de diferentes antagonistas no peptídicos del receptor NKl a la concentración de ΙμΜ.
Cocultivo Cocultivo Cocultivo
Cocultivo de
Cocultivo de células de células de células células
de células tumorales tumorales tumorales tumorales
Marcador Fibroblastos tumorales primarias + primarias + primarias + primarias +
primarias + fibroblastos fibroblastos fibroblastos fibroblastos
fibroblastos + SP + + SP + + SP +
+ SP
Aprepitant Vestipitant Casopitant
TGFa 0 14,2±3,2% 45,5±4,2% 0 0 0
TGF 1 0 15,4±4,3% 35,3±2,3% 0 0 0
TGF 2 0 23,6±5,3% 44,5±3,6% 0 0 0
TGF 3 0 15,7±3,4% 45±3,9% 0 0 0
SPARC 0 16,6±4,5% 47±2,7% 0 0 0
MMP-3 0 27,5±4,5% 47,4±2,4% 0 0 0
MMP-7 0 48,6±3,4% 55, 1±3,6% 0 0 0
MMP-9 0 35,5±5,6% 54,7±4,5% 0 0 0
MMP-11 0 7,6±5,5% 28,4±4,4% 0 0 0
MMP-13 0 18±3,6% 43,4±4,6% 0 0 0
MMP-14 0 26,3±4,4% 48,6±5,6% 0 0 0 Tabla 58. Porcentaje de células fibroblásticas que expresan los marcadores analizados en cocultivo con células aisladas de carcinoma de páncreas y en presencia de la SP (1 μΜ) y de diferentes antagonistas no peptídicos del receptor NK1 a la concentración de ΙμΜ.
Figure imgf000071_0001
Tabla 59. Porcentaje de células fibroblásticas que expresan los marcadores analizados en cocultivo con células aisladas de cáncer de pulmón y en presencia de la SP (1 μΜ) y de diferentes antagonistas no peptídicos del receptor NK1 a la concentración de ΙμΜ.
Figure imgf000071_0002
Tabla 60. Porcentaje de células fibroblásticas que expresan los marcadores analizados en cocultivo con células aisladas de glioma y en presencia de la SP ( 1 μΜ) y de diferentes antagonistas no peptídicos del receptor NK1 a la concentración de ΙμΜ. Cocultivo Cocultivo Cocultivo
Cocultivo
Cocultivo de células de células de células de células
de células tumorales tumorales tumorales tumorales
Marcador Fibroblastos tumorales primarias + primarias + primarias + primarias +
primarias + fibroblastos fibroblastos fibroblastos fibroblastos
fibroblastos + SP + + SP + + SP +
+ SP
Aprepitant Vestipitant Casopitant
TGFa 0 15,5±2,3% 38,4±2,3% 0 0 0
TGF 1 0 16,5±3,3% 35,4±2,6% 0 0 0
TGF 2 0 23,4±2,4% 42,4±4,2% 0 0 0
TGF 3 0 19,3±3, 1% 52, 1±3,7% 0 0 0
SPARC 0 18,2±2,7% 56,2±4,2% 0 0 0
MMP-3 0 25,3±3,5% 48,4±5, 1% 0 0 0
MMP-7 0 47,3±4,6% 59,4±5,7% 0 0 0
MMP-9 0 3454±4,4% 55,5±4,5% 0 0 0
MMP-11 0 7, 1±1,7% 28,9±4,7% 0 0 0
MMP-13 0 19,2±2,5% 48,0±5,6% 0 0 0
MMP-14 0 21,2±3,5% 46,3±3,6% 0 0 0
Tabla 61. Porcentaje de células fibroblásticas que expresan los marcadores analizados en cocultivo con células aisladas de mieloma múltiple y en presencia de la SP (1 μΜ) y de diferentes antagonistas no peptídicos del receptor NKl a la concentración de ΙμΜ.
Figure imgf000072_0001
Ejemplo 12. La interacción de las células tumorales en humanos obtenidas directamente de la muestra tumoral de un paciente con células del sistema inmune/inflamatorias (leucocitos mono y polimorfonucleares) obtenidas de ese mismo paciente, estimula la secreción de sustancias de importancia para la supervivencia y la progresión de los tumores y el tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl inhibe dicha secreción. Para comprobar que la interacción de las células de tumores primarios humanos con las células del sistema inmune/inflamatorias (leucocitos mono y polimorfonucleares) humanas, estimula la secreción de sustancias de importancia para la supervivencia y la progresión de los tumores, se realizaron cultivos conjuntos de células del sistema inmune/inflamatorias (leucocitos mono y polimorfonucleares) con células tumorales obtenidas directamente de tumores primarios humanos de los mismos pacientes. Los distintos tumores y las características de los pacientes se expresan en la Tabla 36.
Para obtener las células tumorales a partir de tumores primarios humanos se empleó el mismo método descrito en los Ejemplos 7 y 9. De la misma manera se cultivaron células del sistema inmune/inflamatorias (leucocitos mono y polimorfonucleares) y se utilizaron como control, por otro lado se cultivaron las células tumorales aisladas de los pacientes en presencia de células del sistema inmune/inflamatorias (leucocitos mono y polimorfonucleares), por otro lado se cultivaron las células tumorales en presencia de las células del sistema inmune/inflamatorias (leucocitos mono y polimorfonucleares) y el agonista del receptor NK1 (SP) y por último, se cultivaron las células tumorales en presencia de las células del sistema inmune/inflamatorias (leucocitos mono y polimorfonucleares), el agonista del receptor NK1 (SP) y de cada uno de los antagonistas no peptídicos del receptor Aprepitant, Vestipitant y Casopitant. Como paso previo, se comprobó que todas las células expresaban el receptor NK1, mediante la técnica de Western Blot. Posteriormente se elaboraron bloques de parafina con el contenido de cada uno de los grupos mencionados previamente para los estudios de expresión mediante inmunohistoquímica. En esta ocasión y para poder identificar la secreción de sustancias con importancia para la supervivencia y progresión de los tumores, analizaron los marcadores: TGF- β 2 (SAB4502956) y NF-kB (SAB4501992) mediante anticuerpos específicos frente a los mismos. Todos los anticuerpos utilizados fueron anticuerpos policlonales de conejo obtenidos de Sigma Aldrich y se utilizaron a una concentración 1/1000. Las técnicas inmunohistoquímicas se realizaron y se evaluaron según se describe en los ejemplos previos. En las tablas 62 a 66 se detalla el porcentaje de células con expresión para cada uno de los marcadores (sustancias con importancia para el microambiente tumoral), para los cultivos conjuntos de células tumorales-células leucocitarias-, células tumorales-leucocitarias con exposición al agonista del receptor NK1 (SP), células tumorales y leucocitarias con exposición al agonista del receptor NK1 (SP) y cada uno de los antagonistas del receptor NK1 : Aprepitant, Vestipitant y Casopitant. En dichas tablas 62 a 66 se muestran 5 ejemplos de cocultivos de las células leucocitarias junto con diferentes células tumorales extraídas de tumores del tipo: cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, glioma y melanoma.
Se obtuvieron los mismos resultados cuando se utilizaron otros antagonistas no peptídicos de receptores NKl : L-733,060, L-732, 138, L-703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP- 96345 y L-760735.
Los resultados mostrados en dichas tablas ponen de manifiesto como la interacción de las células tumorales primarias humanas y de las células del sistema inmune -leucocitos mono y polimofonucleares- humanas, estimula la expresión de las sustancias con importancia en el microambiente tumoral, para la supervivencia y progresión de los tumores y que el agonista del receptor NKl (SP) potencia este fenómeno, mientras que el tratamiento con los antagonistas no peptídicos de los receptores NKl inhiben dicha expresión.
Tabla 62. Porcentaje de células leucocitarias (poli y morfonucleares) que expresan los marcadores analizados en cocultivo con células aisladas de carcinoma de colon y en presencia de la SP (1 μΜ) y de diferentes antagonistas no peptídicos del receptor NKl a la concentración de ΙμΜ.
Figure imgf000074_0001
Tabla 63. Porcentaje de células leucocitarias (poli y morfonucleares) que expresan los marcadores analizados en cocultivo con células aisladas de carcinoma de páncreas y en presencia de la SP (1 μΜ) y de diferentes antagonistas no peptídicos del receptor NKl a la concentración de ΙμΜ. Cocultivo Cocultivo Cocultivo
Cocultivo
Cocultivo de células de células de células de células
de células tumorales tumorales tumorales tumorales
Marcador Leucocitos tumorales primarias + primarias + primarias + primarias +
primarias + leucocitos + leucocitos+ leucocitos+ leucocitos+
leucocitos SP + SP + SP+
SP
Aprepitant Vestipitant Casopitant
Células leucocitarias mononucleares
TGF-β 0 16,5±3, 1% 39,5±4,5% 0 0 0
NF-kB 0 20,4±3,2% 375±3,6% 0 0 0
Células leucocitarias polinucleares
TGF-β 0 15,5±3,5% 36,5±3, 1% 0 0 0
NF-kB 0 24,6±4,6% 35,4±4,2% 0 0 0
Tabla 64. Porcentaje de células leucocitarias (poli y morfonucleares) que expresan los marcadores analizados en cocultivo con células aisladas de carcinoma de pulmón y en presencia de la SP (1 μΜ) y de diferentes antagonistas no peptídicos del receptor NKl a la concentración de ΙμΜ.
Figure imgf000075_0001
Tabla 65. Porcentaje de células leucocitarias (poli y morfonucleares) que expresan los marcadores analizados en cocultivo con células aisladas de glioma y en presencia de la SP (1 μΜ) y de diferentes antagonistas no peptídicos del receptor NKl a la concentración de ΙμΜ.
Cocultivo Cocultivo Cocultivo
Cocultivo
Cocultivo de células de células de células de células
de células tumorales tumorales tumorales tumorales
Marcador Leucocitos tumorales primarias + primarias + primarias + primarias +
primarias + leucocitos + leucocitos+ leucocitos+ leucocitos+
leucocitos SP + SP + SP+
SP
Aprepitant Vestipitant Casopitant
Células leucocitarias mononucleares
TGF-β 0 21,5±3, 1% 41,7±3,4% 0 0 0
NF-kB 0 26,5±4,3% 41,6±4, 1% 0 0 0
Células leucocitarias polinucleares
TGF-β 0 29,3±3,6% 39,7±3,3% 0 0 0
NF-kB 0 19,5±3,8% 39,4±4,2% 0 0 0 Tabla 66. Porcentaje de células leucocitarias (poli y morfonucleares) que expresan los marcadores analizados en cocultivo con células aisladas de melanoma y en presencia de la SP (1 μΜ) y de diferentes antagonistas no peptídicos del receptor NK1 a la concentración de ΙμΜ.
Figure imgf000076_0001
Ejemplo 13. La interacción de las células tumorales en humanos con las células del sistema inmune/inflamatorias (macrófagos), estimula la expresión de sustancias de gran importancia en la supervivencia de ambos tipos celulares y el tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 inhibe dicha secreción. Para comprobar que la interacción de las células de tumores primarios obtenidas directamente de humanos con las células del sistema inmune/inflamatorias (macrófagos) humanas, obtenidas del mismo paciente estimula la secreción de sustancias, por parte de estos macrófagos, de reconocida importancia en la supervivencia de ambos tipos celulares y en la progresión de las células tumorales, se realizaron cultivos conjuntos en plasma sanguíneo fresco, de células del sistema inmune/inflamatorias (macrófagos) con células tumorales obtenidas de tumores primarios. Todo ello obtenido del mismo paciente, para construir un modelo experimental similar al fisiológico humano. Los distintos tumores de los que se obtuvieron células para cultivo y las características de los mismos y de los pacientes donantes se expresan en la Tabla 36.
Para obtener las células tumorales a partir de tumores primarios humanos se empleó el mismo método descrito en los ejemplos 7 y 10. Los macrófagos se obtuvieron a partir de lavado o derrame pleural o peritoneal del mismo paciente del que se obtuvieron las células tumorales primarias, en cada caso.
De manera similar a lo realizado en el citado ejemplo 7, un total de 6 pocilios conteniendo exclusivamente macrófagos se utilizaron como control, otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales se cultivaron con adición de células del sistema inmune/inflamatorias (macrófagos), otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales se cultivaron en presencia de las células del sistema inmune/inflamatorias (macrófagos) y el agonista del receptor NK1 (SP), otro grupos de 6 pocilios conteniendo las células tumorales se cultivaron en presencia de las células del sistema inmune/inflamatorias (macrófagos), el agonista del receptor NK1 (SP) y cada uno de los antagonistas no peptídicos del receptor NK1 Aprepitant, Vestipitant y Casopitant.
Previamente, se comprobó que las células tumorales y las células del sistema inmune/inflamatorias (macrófagos) humanas, expresaban receptor NK1 mediante la técnica de Western Blot. Posteriormente se elaboró un bloque de parafina con el contenido de cada uno de los pocilios, según se detalla en el Ejemplo 1.
Para poder identificar los distintos tipos celulares para poder hacer el recuento de los mismos se realizaron inmunohistoquímicas con anticuerpos primarios específicos para detectar las sustancias de importancia en la supervivencia y progresión de los tumores: EGF (Anticuerpo monoclonal de conejo, anti-EGF; 07-1432, Merck-M lipore), la MMP-9 (anticuerpo policlonal de conejo anti-MMP-9, SAB4501896, Sigma-Aldrich), el VEGF (anticuerpo monoclonal de ratón anti-VEGF, GF25-100UG, Merck-Miilipore) y el TNF-α (anticuerpo monoclonal de ratón anti-TNF-α, MAB102L Merck-Milüpore). En las tablas 67 a 71 se detalla el porcentaje de células con expresión para cada uno de los marcadores (sustancias con importancia para el microambiente tumoral), para los cultivos conjuntos de células tumorales-macrófagos, células tumorales- macrófagos con exposición al agonista del receptor NK1 (SP), células tumorales y macrófagos con exposición al agonista del receptor NK1 (SP) y cada uno de los antagonistas del receptor NK1 : Aprepitant, Vestipitant y Casopitant. En dichas tablas 67 a 71 se muestran 5 ejemplos de cocultivos de las células leucocitarias junto con diferentes células tumorales extraídas de tumores del tipo: cáncer de colon, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de ovario y cáncer de mama. Se obtuvieron los mismos resultados cuando se utilizaron otros antagonistas no peptídicos de receptores NK1 : L- 733,060, L-732, 138, L-703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP-96345 y L-760735.
Los resultados mostrados en dichas tablas ponen de manifiesto como la interacción de las células tumorales primarias humanas y de las células del sistema inmune/inflamatorio- macrófagos- humanas, estimula la expresión de las sustancias con importancia en el microambiente tumoral, para la supervivencia y progresión de los tumores y que el agonista del receptor NKl (SP) potencia este fenómeno, mientras que el tratamiento con los antagonistas no peptídicos de los receptores NKl inhiben dicha expresión.
Tabla 67. Porcentaje de macrófagos que expresan los marcadores analizados en cocultivo con células aisladas de carcinoma de colon y en presencia de la SP ( 1 μΜ) y de diferentes antagonistas no peptídicos del receptor NKl a la concentración de ΙμΜ.
Figure imgf000078_0001
Tabla 68. Porcentaje de macrófagos que expresan los marcadores analizados en cocultivo con células aisladas de carcinoma de mama y en presencia de la SP (1 μΜ) y de diferentes antagonistas no peptídicos del receptor NKl a la concentración de ΙμΜ.
Figure imgf000078_0002
Tabla 69. Porcentaje de macrófagos que expresan los marcadores analizados en cocultivo con células aisladas de carcinoma de ovario y en presencia de la SP (1 μΜ) y de diferentes antagonistas no peptídicos del receptor NKl a la concentración de ΙμΜ.
Cocultivo Cocultivo Cocultivo
Cocultivo
Cocultivo de células de células de células de células
de células tumorales tumorales tumorales tumorales
Marcador Macrófagos tumorales primarias + primarias + primarias + primarias +
primarias + macrófagos macrófagos macrófagos macrófagos
macrófagos + SP + + SP + + SP+
+ SP
Aprepitant Vestipitant Casopitant
EGF 0 12, 1±2% 41,5±4,2% 0 0 0
MMP-9 0 19,4±2,5% 39,5±3,2% 0 0 0
VEGF 0 18,4±3,5% 37,4±4% 0 0 0 Tabla 70. Porcentaje de macrófagos que expresan los marcadores analizados en cocultivo con células aisladas de carcinoma de pulmón y en presencia de la SP (1 μΜ) y de diferentes antagonistas no peptídicos del receptor NKl a la concentración de ΙμΜ.
Figure imgf000079_0001
Tabla 71. Porcentaje de macrófagos que expresan los marcadores analizados en cocultivo con células aisladas de melanoma y en presencia de la SP (1 μΜ) y de diferentes antagonistas no peptídicos del receptor NKl a la concentración de ΙμΜ.
Figure imgf000079_0002
Ejemplo 14. El tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl inhibe la proliferación de las células tumorales exclusivamente cuando dicho receptor actúa a través de la vía de las MAP-Kinasas. El tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl inhibe, en ambos casos, la proliferación de dichas células cuando se cultivan de forma conjunta con las células del estroma - fibroblastos-. Como se ha demostrado en el Ejemplo 8, la interacción de las células de tumores primarios humanos con las células estromales -fibroblastos- humanas, estimula la proliferación de ambos tipos celulares, demostrando la importancia que las sustancias que se segregan por parte de éstas (que constituyen el microambiente tumoral) tienen para la supervivencia y la progresión de dichas células tumorales.
Para obtener las células tumorales a partir de tumores primarios humanos se empleó el mismo método descrito en el Ejemplo 7. Los distintos tumores y las características de los pacientes se muestran en la Tabla 36. De cada uno de los tumores mostrados en dicha Tabla 36 se obtuvieron cuatro que mostraban expresión de la ruta MAP Kinasas después del tratamiento con los diferentes antagonistas no peptídicos de NKl y otros cuatro que no expresaban dicha ruta después del tratamiento con los diferentes antagonistas no peptídicos de NKl . De manera similar, se obtuvieron células estromales -fibroblastos- para ponerlos en cultivo, a partir de muestras obtenidas de la piel del mismo paciente en el área de la incisión quirúrgica que les fue realizada en la propia intervención practicada para extirparles el tumor. De manera similar a lo realizado en el ejemplo 7, un total de 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con integridad de la vía de las MAP Kinasas (con ausencia de ERK tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK l ) se utilizaron como control de supervivencia de las células tumorales de dichos tumores. Otros 6 pocilios se utilizaron como control de supervivencia de las células tumorales procedentes de tumores con alteración de la vía de las MAP Kinasas (presencia de ERK tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl). Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con integridad de la vía de las MAP Kinasas (con ausencia de ERK tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl . Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con alteración de la vía de las MAP Kinasas (con presencia de ERK tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl . Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con integridad de la vía de las MAP Kinasas (con ausencia de ERK tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia células estromales -fibroblastos- y de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl . Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con alteración de la vía de las MAP Kinasas (con presencia de ERK tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia células estromales -fibroblastos- y de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl .
Previamente, se comprobó que las células tumorales y las células del estroma-fibroblastos-, expresaban receptor NKl mediante la técnica de Western Blot. Posteriormente se elaboró un bloque de parafina con el contenido de cada uno de los pocilios, según se detalla en el Ejemplo 1. Para comprobar la existencia de proteínas pertenecientes a la ruta de las MAP Kinasas en los diferentes cultivos celulares se realizó una técnica de Western Blot, utilizando como anticuerpo primario: Phospho-p44/42 MAPK (Erkl/2) (Thr202/Tyr204) (D 13.14.4E) XP® Rabbit mAb (4370, Cell Signalling). En esta ocasión y para poder identificar los distintos tipos celulares para poder hacer el recuento de los mismos se realizó una técnica inmunohistoquímica con mareaje con anticuerpos primarios específicos para células estromales -fibroblastos- humanas (Anti- Actina de músculo liso), células de carcinoma (Anti-Citoqueratinas de amplio espectro), Glioma (Anti-Proteína Glial Fibrilar Acida), Sarcoma de Ewing (Anti-CD99), Melanoma (Anti- HMB45), Leucemias y linfomas (Anti-Antígeno común leucocitario) y Mieloma (anti-CD138). Todos los anticuerpos son distribuidos por Dako y se utilizaron a la concentración a la que son suministrados (se suministran prediluidos -"ready to use"-).
En las tablas 72 y 73 se aprecia como el Aprepitant sólo inhibe el crecimiento de las células en las que el receptor NKl actúa a través de la vía de las MAP Kinasas, mientras que en las células en las que no produce inhibición de su crecimiento, no se observa modificación de esta ruta. Sin embargo, cuando las células tumorales se co-cultivan con células del estroma -fibroblastos-, dicho antagonista produce inhibición de la proliferación de las células tumorales, independientemente de que provengan de tumores en los que existe o no integridad de la ruta de las MAP Kinasas "aguas abajo" de dicho receptor. Es decir, que independientemente de que el receptor actúe o no a través de dicha vía de señalización en las células tumorales.
Se obtuvieron los mismos resultados cuando se utilizaron otros antagonistas no peptídicos de receptores NKl : Vestipitant, Casopitant, L-733,060, L-732, 138, L-703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP-96345 y L-760735.
Tabla 72. Porcentaje de inhibición/proliferación de células tumorales primarias procedentes de tumores humanos en los que se modifica ERK (no se detecta su presencia tras el tratamiento con antagonistas del receptor NKl - dicho receptor actúa a través de la ruta de las MAP Kinasas en las células tumorales) en cultivo con el antagonista de dicho receptor Aprepitant (ΙμΜ) y en cultivo conjunto con células estromales -fibroblastos- humanas y Aprepitant (ΙμΜ).
Células Células
Células Células tumorales en tumorales en
Tipo de tumor tumorales tumorales + co-cultivo con co-cultivo con
(control). Aprepitant. fibroblastos fibroblastos +
(control) Aprepitant.
Carcinoma de estómago. 100 50±2 100 21±3
Carcinoma de Colon. 100 62±4 100 19±4
Carcinoma de Páncreas. 100 68±5 100 22±3
Carcinoma Renal. 100 76±3 100 23±3
Carcinoma de mama. 100 78±2 100 19±4
Carcinoma de Ovario. 100 61±2 100 20±5
Carcinoma de endometrio. 100 68±3 100 19±8 Células Células
Células Células tumorales en tumorales en
Tipo de tumor tumorales tumorales + co-cultivo con co-cultivo con
(control). Aprepitant. fibroblastos fibroblastos +
(control) Aprepitant.
Carcinoma de cérvix. 100 70±3 100 19±8
Carcinoma de pulmón de 100 61±3 100 23±5
Células pequeñas
Carcinoma de pulmón de 100 69±4 100 19±7
Células No Pequeñas
Carcinoma de tiroides. 100 70±2 100 19±1
Carcinoma de próstata. 100 68±3 100 19±7
Glioma 100 69±4 100 31±4
Sarcoma de Ewing. 100 69±5 100 19±6
Melanoma 100 68±6 100 19±7
Neuroblastoma 100 69±6 100 21±5
Leucemia B 100 70±1 100 18±4
Leucemia T 100 60±1 100 23±4
Linfoma No Hodgking B 100 61±2 100 19±6
Linfoma No Hodgkin T 100 61±2 100 2±5
Linfoma de Hodgkin 100 60±3 100 18±4
Mieloma 100 71±4 100 19±4
Tabla 73. Porcentaje de inhibición/estimulación de la proliferación de células tumorales primarias procedentes de tumores humanos en los que no se modifica ERK (se detecta su presencia tras el tratamiento con antagonistas del receptor NK1 - dicho receptor no actúa a través de la ruta de las MAP Kinasas en las células tumorales) en cultivo con el antagonista de dicho receptor Aprepitant (ΙμΜ) y en cultivo conjunto con células estromales -fibroblastos- humanas y Aprepitant (ΙμΜ).
Células Células
Células Células tumorales en tumorales en
Tipo de tumor tumorales tumorales + co-cultivo con co-cultivo con
(control). Aprepitant. fibroblastos fibroblastos +
(control) Aprepitant.
Carcinoma de estómago. 100 100±2 100 21±3
Carcinoma de Colon. 100 100±4 100 19±4
Carcinoma de Páncreas. 100 101±5 100 22±3
Carcinoma Renal. 100 99±3 100 23±3
Carcinoma de mama. 100 100±2 100 19±4
Carcinoma de Ovario. 100 101±2 100 20±5
Carcinoma de endometrio. 100 98±3 100 19±8
Carcinoma de cérvix. 100 100±3 100 19±8
Carcinoma de pulmón de 100 101±3 100 23±5
Células pequeñas
Carcinoma de pulmón de 100 99±4 100 19±7
Células No Pequeñas
Carcinoma de tiroides. 100 100±2 100 19±1
Carcinoma de próstata. 100 98±3 100 19±7
Glioma 100 99±4 100 31±4 Células Células
Células Células tumorales en tumorales en
Tipo de tumor tumorales tumorales + co-cultivo con co-cultivo con
(control). Aprepitant. fibroblastos fibroblastos +
(control) Aprepitant.
Sarcoma de Ewing. 100 99±5 100 19±6
Melanoma 100 98±6 100 19±7
Neuroblastoma 100 99±6 100 21±5
Leucemia B 100 100±1 100 18±4
Leucemia T 100 100±1 100 23±4
Linfoma No Hodgking B 100 101=1=2 100 19±6
Linfoma No Hodgkin T 100 101=1=2 100 2±5
Linfoma de Hodgkin 100 100±3 100 18±4
Mieloma 100 101±4 100 19±4
Los resultados ponen de manifiesto que en los casos en los que se produjo una inhibición de la proliferación, existía integridad de la vía de las MAP Kinasas, pero mostraban una ausencia de expresión de ERK. Esto significa que los antagonistas de los receptores NKl inhiben la proliferación en este grupo de células tumorales, a través de la ruta de las MAP Kinasas. Sin embargo en los casos en los que no se produjo disminución de la proliferación, tras tratamiento con antagonistas del receptor NKl, se constató la presencia de expresión de ERK, lo que significa que el tratamiento con antagonistas del receptor NKl no inhibe dicha vía de las MAP Kinasas. Por lo tanto, la inhibición de la proliferación de las células tumorales por los mencionados antagonistas se produce mediante inhibición, "aguas abajo" de la ruta de las MAP Kinasas. Sin embargo, cuando se cultivan ambos tipos de células tumorales (con integridad de las MAP Kinasas -y por lo tanto con ausencia de ERK tras tratamiento con antagonistas del receptor NKl - y con alteración de la ruta de las MAP Kinasas - y por lo tanto con presencia de ERK tras tratamiento con antagonistas de los receptores NKl) junto con fibroblastos obtenidos del mismo paciente, sí se observa inhibición de la proliferación de las células tumorales, independientemente del estado de la vía de las MAP Kinasas. Esto demuestra que los antagonistas no peptídicos de los receptores NKl inhiben la proliferación de las células tumorales por mecanismos distintos a los conocidos en el estado de la técnica y relacionados con el bloqueo de la secreción de sustancias propias de la interacción de dichas células con otras células propias del microambiente tumoral, en concreto con las células del estroma - fibroblastos-.
Ejemplo 15. El tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl inhibe la proliferación de las células tumorales exclusivamente cuando dicho receptor actúa a través de la vía de las PI3 Kinasas. El tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl inhibe, en ambos casos, la proliferación de dichas células cuando se cultivan de forma conjunta con las células del estroma -fibroblastos-.
Para obtener las células tumorales a partir de tumores primarios humanos se empleó el mismo método descrito en el Ejemplo 7. Los distintos tumores y las características de los pacientes se muestran en la Tabla 36. De cada uno de los tumores mostrados en dicha Tabla 36 se obtuvieron cuatro que mostraban expresión de la ruta PI3 Kinasas después del tratamiento con los diferentes antagonistas no peptídicos de NKl y otros cuatro que no expresaban dicha ruta después del tratamiento con los diferentes antagonistas no peptídicos de NKl . De manera similar, se obtuvieron células estromales -fibroblastos- para ponerlos en cultivo, a partir de muestras obtenidas de la piel del mismo paciente en el área de la incisión quirúrgica que les fue realizada en la propia intervención practicada para extirparles el tumor. De manera similar a lo realizado en el ejemplo 7, un total de 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con integridad de la vía de las PI3 Kinasas (con ausencia de AKT tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK l) se utilizaron como control de supervivencia de las células tumorales de dichos tumores. Otros 6 pocilios se utilizaron como control de supervivencia de las células tumorales procedentes de tumores con alteración de la vía de las PI3 Kinasas (presencia AKT tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl). Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con integridad de la vía de las PI3 Kinasas (con ausencia de AKT tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl . Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con alteración de la vía de las PI3 Kinasas (con presencia de AKT tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl . Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con integridad de la vía de las PI3 Kinasas (con ausencia de AKT tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia células estromales -fibroblastos- y de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl . Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con alteración de la vía de las PI3 Kinasas (con presencia de AKT tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia células estromales -fibroblastos- y de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl .
Previamente, se comprobó que las células tumorales y las células del estroma-fibroblastos-, expresaban receptor NKl mediante la técnica de Western Blot. Posteriormente se elaboró un bloque de parafina con el contenido de cada uno de los pocilios, según se detalla en el Ejemplo 1. AKT en los diferentes cultivos celulares se realizó una técnica de Western Blot (según lo descrito en el ejemplo 1 -apartado Western Blot-), pero utilizando como anticuerpo primario con referencia: Akt (pan) (11E7) Rabbit mAb (4685, Cell Signalling). En esta ocasión y para poder identificar los distintos tipos celulares para poder hacer el recuento de los mismos se realizó una técnica inmunohistoquímica con mareaje con anticuerpos primarios específicos para células estromales -fibroblastos- humanas (Anti-Actina de músculo liso), células de carcinoma (Anti-Citoqueratinas de amplio espectro), Glioma (Anti-Proteína Glial Fibrilar Acida), Sarcoma de Ewing (Anti-CD99), Melanoma (Anti-HMB45), Leucemias y linfomas (Anti-Antígeno común leucocitario) y Mieloma (anti-CD138). Todos los anticuerpos son distribuidos por Dako y se utilizaron a la concentración a la que son suministrados (se suministran prediluidos -"ready to use"-).
En las tablas 74 y 75 se aprecia como el antagonista no peptídico del receptor NK1 Aprepitant sólo inhibe el crecimiento de las células en las que dicho receptor actúa a través de la vía de las PI3 Kinasas, mientras que en las células en las que no produce inhibición no se observa modificación de esta ruta. Sin embargo, cuando las células tumorales se co-cultivan con células del estroma -fibroblastos-, dicho antagonista produce inhibición de la proliferación de las células tumorales, independientemente de que provengan de tumores en los que existe o no integridad de la ruta de las PI3 Kinasas "aguas abajo" de dicho receptor, Es decir, que independientemente de que el receptor actúe o no a través de dicha vía de señalización en las células tumorales. Se obtuvieron los mismos resultados cuando se utilizaron otros antagonistas no peptídicos de receptores NK1 : Vestipitant, Casopitant, L-733,060, L-732, 138, L-703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP-96345 y L-760735.
Tabla 74. Porcentaje de inhibición/estimulación de la proliferación de células tumorales primarias procedentes de tumores humanos en los que los que se modifica AKT (no se detecta su presencia tras el tratamiento con antagonistas del receptor NK1 - dicho receptor actúa a través de la ruta de las PI3 Kinasas en las células tumorales) en cultivo con el antagonista de dicho receptor Aprepitant (ΙμΜ) y en cultivo conjunto con células estromales -fibroblastos- humanas y Aprepitant (ΙμΜ) Células Células
Células Células tumorales en tumorales en co-
Tipo de tumor tumorales tumorales + co-cultivo con cultivo con
(control) Aprepitant fibroblastos fibroblastos +
(control) Aprepitant
Carcinoma de estómago. 100 51±3 100 22±3
Carcinoma de Colon. 100 61±3 100 21±4
Carcinoma de Páncreas. 100 65±4 100 21±3
Carcinoma Renal. 100 76±4 100 20±3
Carcinoma de mama. 100 77±3 100 21±4
Carcinoma de Ovario. 100 65±4 100 21±5
Carcinoma de endometrio. 100 66±5 100 21±8
Carcinoma de cérvix. 100 75±3 100 20±8
Carcinoma de pulmón de 100 61±4 100 22±5
Células pequeñas
Carcinoma de pulmón de 100 66±5 100 21±7
Células No Pequeñas
Carcinoma de tiroides. 100 69±6 100 20±1
Carcinoma de próstata. 100 69±6 100 22±7
Glioma 100 68±5 100 26±4
Sarcoma de Ewing. 100 67±4 100 25±6
Melanoma 100 67±5 100 20±7
Neuroblastoma 100 67±5 100 26±5
Leucemia B 100 69±4 100 24±4
Leucemia T 100 68±3 100 25±4
Linfoma No Hodgking B 100 62±4 100 23±6
Linfoma No Hodgkin T 100 63±3 100 22±5
Linfoma de Hodgkin 100 62±4 100 21±4
Mieloma 100 68±5 100 20±4
Tabla 75. Porcentaje de inhibición/estimulación de la proliferación de células tumorales primarias procedentes de tumores humanos en los que los que no se modifica AKT (se detecta su presencia tras el tratamiento con antagonistas del receptor NK1 - dicho receptor no actúa a través de la ruta de las PI3 Kinasas en las células tumorales) en cultivo con el antagonista de dicho receptor Aprepitant (ΙμΜ) y en cultivo conjunto con células estromales -fibroblastos- humanas y Aprepitant (ΙμΜ).
Células Células
Células Células tumorales en tumorales en co-
Tipo de tumor tumorales tumorales + co-cultivo con cultivo con
(control) Aprepitant fibroblastos fibroblastos +
(control) Aprepitant
Carcinoma de Colon. 100 100±4 100 21±5
Carcinoma de Páncreas. 100 101±3 100 20±4
Carcinoma Renal. 100 101±4 100 25±5
Carcinoma de mama. 100 99±5 100 22±5
Carcinoma de Ovario. 100 102±5 100 23±4
Carcinoma de endometrio. 100 99±2 100 18±7 Células Células
Células Células tumorales en tumorales en co-
Tipo de tumor tumorales tumorales + co-cultivo con cultivo con
(control) Aprepitant fibroblastos fibroblastos +
(control) Aprepitant
Carcinoma de cérvix. 100 101=1=2 100 17±7
Carcinoma de pulmón de 100 102±2 100 21±6
Células pequeñas
Carcinoma de pulmón de 100 100±2 100 18±6
Células No Pequeñas
Carcinoma de tiroides. 100 101±3 100 18±4
Carcinoma de próstata. 100 99±4 100 21±3
Glioma 100 100±3 100 25±3
Sarcoma de Ewing. 100 98±4 100 24±4
Melanoma 100 99±3 100 26±4
Neuroblastoma 100 100±5 100 25±4
Leucemia B 100 101=1=2 100 22±5
Leucemia T 100 101=1=2 100 25±5
Linfoma No Hodgking B 100 102±3 100 22±5
Linfoma No Hodgkin T 100 102±3 100 21±6
Linfoma de Hodgkin 100 99±2 100 28±5
Mieloma 100 100±1 100 29±5
Los resultados ponen de manifiesto que en los casos en los que se produjo una inhibición de la proliferación, existía integridad de la vía de las PI3 Kinasas, mediante la determinación de AKT. En estos casos en los que se apreció disminución de la proliferación, se apreciaba también ausencia de expresión de AKT. Esto significa que los antagonistas de los receptores NKl inhiben la proliferación en este grupo de células tumorales, a través de la ruta de las PI3 Kinasas. Sin embargo en los casos en los que no se produjo disminución de la proliferación, tras tratamiento con antagonistas del receptor NKl, se constató la presencia de AKT, lo que significa que el tratamiento con antagonistas del receptor NKl no inhibe dicha vía de las PI3 Kinasas. Por lo tanto que la inhibición de la proliferación de las células tumorales por los mencionados antagonistas se produce por inhibición, "aguas abajo" de la ruta de las PI3 Kinasas. Sin embargo, cuando se cultivan ambos tipos de células tumorales (con integridad de las PI3 Kinasas -y por lo tanto con ausencia de AKT tras tratamiento con antagonistas del receptor NKl- y con alteración de la ruta de las PI3 Kinasas - y por lo tanto con presencia de AKT tras tratamiento con antagonistas de los receptores NKl) junto con fibroblastos obtenidos del mismo paciente, sí se observa inhibición de la proliferación de las células tumorales, independientemente del estado de la vía de las PI3 Kinasas. Esto demuestra que los antagonistas no peptídicos de los receptores NKl inhiben la supervivencia de las células tumorales por mecanismos distintos a los conocidos en el estado de la técnica y relacionados con el bloqueo de la secreción de sustancias propias de la interacción de dichas células con otras células propias del microambiente tumoral, en concreto con las células del estroma -fibroblastos-.
Ejemplo 16. El tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 inhibe la proliferación de las células tumorales exclusivamente cuando dicho receptor actúa a través de la vía de las MAP Kinasas. El tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 inhibe, en ambos casos, la proliferación de dichas células cuando se cultivan de forma conjunta con las células de la inflamación/inmunidad (leucocitos mononucleares y polimorfonucleares).
Para obtener las células tumorales a partir de tumores primarios humanos se empleó el mismo método descrito en el Ejemplo 7. Los distintos tumores y las características de los pacientes se muestran en la Tabla 36. De cada uno de los tumores mostrados en dicha Tabla 36 se obtuvieron cuatro que mostraban expresión de la ruta MAP Kinasas después del tratamiento con los diferentes antagonistas no peptídicos de NK1 y otros cuatro que no expresaban dicha ruta después del tratamiento con los diferentes antagonistas no peptídicos de NK1. De manera similar, se obtuvieron células inflamatorias/inmunes (leucocitos poli y morfonucleares) para ponerlos en cultivo, a partir de muestras obtenidas de la piel del mismo paciente en el área de la incisión quirúrgica que les fue realizada en la propia intervención practicada para extirparles el tumor. De manera similar a lo realizado en el ejemplo 7, un total de 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con integridad de la vía de las MAP Kinasas (con ausencia de ERK tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1) se utilizaron como control de supervivencia de las células tumorales de dichos tumores. Otros 6 pocilios se utilizaron como control de supervivencia de las células tumorales procedentes de tumores con alteración de la vía de las MAP Kinasas (presencia de ERK tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1). Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con integridad de la vía de las MAP Kinasas (con ausencia de ERK tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1) se cultivaron en presencia de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NK1. Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con alteración de la vía de las MAP Kinasas (con presencia de ERK tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1) se cultivaron en presencia de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NK1. Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con integridad de la vía de las MAP Kinasas (con ausencia de ERK tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1) se cultivaron en presencia células estromales -fibroblastos- y de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl . Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con alteración de la vía de las MAP Kinasas (con presencia de ERK tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia células inflamatorias/inmunes (leucocitos poli y morfonucleares) y de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl .
Previamente, se comprobó que las células tumorales y las células inflamatorias/inmunes (leucocitos poli y morfonucleares), expresaban el receptor NKl mediante la técnica de Western Blot. Posteriormente se elaboró un bloque de parafina con el contenido de cada uno de los pocilios, según se detalla en el Ej emplo 1 . Para comprobar la existencia de proteínas pertenecientes a la ruta de las MAP Kinasas en los diferentes cultivos celulares se realizó una técnica de Western Blot, utilizando como anticuerpo primario: Phospho-p44/42 MAPK (Erkl/2) (Thr202/Tyr204) (D 13.14.4E) XP® Rabbit mAb (4370, Cell Signalling). En esta ocasión y para poder identificar los distintos tipos celulares para poder hacer el recuento de los mismos se realizó una técnica inmunohistoquímica con mareaje con anticuerpos primarios específicos para células inflamatorias/inmunes (leucocitos poli y morfonucleares) humanas (Anti-Actina de músculo liso), células de carcinoma (Anti-Citoqueratinas de amplio espectro), Glioma (Anti- Proteína Glial Fibrilar Acida), Sarcoma de Ewing (Anti-CD99), Melanoma (Anti-HMB45), Leucemias y linfomas (Anti-Antígeno común leucocitario) y Mieloma (anti-CD 138). Todos los anticuerpos son distribuidos por Dako y se utilizaron a la concentración a la que son suministrados (se suministran prediluidos -"ready to use"-).
En las Tablas 76 y 77 se aprecia como el antagonista no peptídico del receptor NKl, Aprepitant, sólo inhibe el crecimiento de las células en las que dicho receptor actúa a través de la vía de las MAP Kinasas, mientras que en las células en las que no produce inhibición no se observa modificación de esta ruta. Sin embargo, cuando las células tumorales se co-cultivan con células de la inflamación/inmunidad (leucocitos mononucleares y polimorfonucleares), dicho antagonista produce inhibición de la proliferación de las células tumorales, independientemente de que provengan de tumores en los que existe o no integridad de la ruta de las MAP Kinasas "aguas abajo" de dicho receptor, Es decir, que independientemente de que el receptor actúe o no a través de dicha vía de señalización en las células tumorales. Se obtuvieron los mismos resultados cuando se utilizaron otros antagonistas no peptídicos de receptores NKl : Vestipitant, Casopitant, L-733,060, L-732, 138, L-703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP- 96345 y L-760735. Tabla 76. Porcentaje de inhibición de la proliferación de células tumorales primarias humanas procedentes de tumores en los que se modifica ERK (no se detecta su presencia tras el tratamiento con antagonistas del receptor NK1 - dicho receptor actúa a través de la ruta de las MAP Kinasas en las células tumorales) en cultivo con el antagonista de dicho receptor Aprepitant (ΙμΜ) y en cultivo conjunto con células inflamatorias/inmunes (leucocitos mono y polimorfonucleares) humanas y Aprepitant (ΙμΜ).
Figure imgf000090_0001
Tabla 77. Porcentaje de inhibición/estimulación de la proliferación de células tumorales primarias humanos procedentes de tumores en los que no se modifica ERK (se detecta su presencia tras el tratamiento con antagonistas del receptor NK1 - dicho receptor no actúa a través de la ruta de las MAP Kinasas en las células tumorales) en cultivo con el antagonista de dicho receptor Aprepitant (ΙμΜ) y en cultivo conjunto con células inflamatorias/inmunes
(leucocitos mono y polimorfonucleares) humanas y Aprepitant (ΙμΜ).
Células Células
Células Células tumorales en tumorales en
Tipo de tumor tumorales tumorales + co-cultivo con co-cultivo con
(control) Aprepitant leucocitos leucocitos +
(control) Aprepitant
Carcinoma de estómago. 100 101±3 100 24±4
Carcinoma de Colon. 100 99±3 100 25±5
Carcinoma de mama. 100 99±3 100 22±5
Carcinoma de Ovario. 100 98±4 100 23±4
Carcinoma de endometrio. 100 99±4 100 21±6
Carcinoma de pulmón de 100 100±4 100 22±6
Células pequeñas
Carcinoma de pulmón de 100 98±5 100 20±6
Células No Pequeñas
Glioma 100 98±5 100 28±5
Melanoma 100 99±5 100 26±4 Los resultados ponen de manifiesto que en los casos en los que se produjo una inhibición de la proliferación, existía integridad de la vía de las MAP Kinasas, mediante la determinación de ERK. En estos casos en los que se apreció disminución de la proliferación, se apreciaba también ausencia de expresión de ERK. Esto significa que los antagonistas de los receptores NKl inhiben la proliferación en este grupo de células tumorales, a través de la ruta de las MAP Kinasas. Sin embargo en los casos en los que no se produjo disminución de la proliferación, tras tratamiento con antagonistas del receptor NKl, se constató la presencia de ERK, lo que significa que el tratamiento con antagonistas del receptor NKl no inhibe dicha vía de las MAP Kinasas y por lo tanto que la inhibición de la proliferación de las células tumorales por los mencionados antagonistas se produce por inhibición, "aguas abajo" de las ruta de las MAP Kinasas. Sin embargo, cuando se cultivan ambos tipos de células tumorales (con integridad de las MAP Kinasas -y por lo tanto con ausencia de ERK tras tratamiento con antagonistas del receptor NKl - y con alteración de la ruta de las MAP Kinasas - y por lo tanto con presencia de ERK tras tratamiento con antagonistas de los receptores NKl) junto con leucocitos mononucleares y polimorfonucleares obtenidos del mismo paciente, sí se observa inhibición de la proliferación de las células tumorales, independientemente del estado de la vía de las MAP Kinasas. Esto demuestra que los antagonistas no peptídicos de los receptores NKl inhiben la supervivencia de las células tumorales por mecanismos distintos a los conocidos en el estado de la técnica y relacionados con el bloqueo de la secreción de sustancias propias de la interacción de dichas células con otras células propias del microambiente tumoral, en concreto con las células de la inflamación/inmunidad (leucocitos mononucleares y polimorfonucleares).
Ejemplo 17. El tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl inhibe la proliferación de las células tumorales exclusivamente cuando dicho receptor actúa a través de la vía de las PI3 Kinasas. El tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl inhibe, en ambos casos, la proliferación de dichas células cuando se cultivan de forma conjunta con las células de la inflamación/inmunidad (leucocitos mononucleares y polimorfonucleares). Para obtener las células tumorales a partir de tumores primarios humanos se empleó el mismo método descrito en el Ejemplo 7. Los distintos tumores y las características de los pacientes se muestran en la Tabla 36. De cada uno de los tumores mostrados en dicha Tabla 36 se obtuvieron cuatro que mostraban expresión de la ruta PI3 Kinasas después del tratamiento con los diferentes antagonistas no peptídicos de NKl y otros cuatro que no expresaban dicha ruta después del tratamiento con los diferentes antagonistas no peptídicos de NKl . De manera similar, se obtuvieron células de la inflamación/inmunidad (leucocitos mononucleares y polimorfonucleares) para ponerlos en cultivo, a partir de muestras obtenidas de la piel del mismo paciente en el área de la incisión quirúrgica que les fue realizada en la propia intervención practicada para extirparles el tumor. De manera similar a lo realizado en el ejemplo 7, un total de 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con integridad de la vía de las PI3 Kinasas (con ausencia de AKT tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se utilizaron como control de supervivencia de las células tumorales de dichos tumores. Otros 6 pocilios se utilizaron como control de supervivencia de las células tumorales procedentes de tumores con alteración de la vía de las PI3 Kinasas (presencia AKT tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl). Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con integridad de la vía de las PI3 Kinasas (con ausencia de AKT tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl . Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con alteración de la vía de las PI3 Kinasas (con presencia de AKT tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl . Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con integridad de la vía de las PI3 Kinasas (con ausencia de AKT tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia células estromales -fibroblastos- y de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl . Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con alteración de la vía de las PI3 Kinasas (con presencia de AKT tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia células de la inflamación/inmunidad (leucocitos mononucleares y polimorfonucleares) y de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl .
Previamente, se comprobó que las células tumorales y las células de la inflamación/inmunidad (leucocitos mononucleares y polimorfonucleares) expresaban el receptor NKl mediante la técnica de Western Blot. Posteriormente se elaboró un bloque de parafina con el contenido de cada uno de los pocilios, según se detalla en el Ejemplo 1. AKT en los diferentes cultivos celulares se realizó una técnica de Western Blot (según lo descrito en el ejemplo 1 -apartado Western Blot-), pero utilizando como anticuerpo primario con referencia: Akt (pan) (11E7) Rabbit mAb (4685, Cell Signalling). En esta ocasión y para poder identificar los distintos tipos celulares para poder hacer el recuento de los mismos se realizó una técnica inmunohistoquímica con mareaje con anticuerpos primarios específicos para células de la inflamación/inmunidad (leucocitos mononucleares y polimorfonucleares) humanas (Anti-Actina de músculo liso), células de carcinoma (Anti-Citoqueratinas de amplio espectro), Glioma (Anti-Proteína Glial Fibrilar Acida), Sarcoma de Ewing (Anti-CD99), Melanoma (Anti-HMB45), Leucemias y linfomas (Anti-Antígeno común leucocitario) y Mieloma (anti-CD138). Todos los anticuerpos son distribuidos por Dako y se utilizaron a la concentración a la que son suministrados (se suministran prediluidos -"ready to use"-).
En las tablas 78 y 79 se aprecia como el antagonista no peptídico del receptor NK1 Aprepitant sólo inhibe el crecimiento de las células en las que dicho receptor actúa a través de la vía de las PI3 Kinasas, mientras que en las células en las que no produce inhibición no se observa modificación de esta ruta. Sin embargo, cuando las células tumorales se co-cultivan con células de la inflamación/inmunidad (leucocitos mononucleares y polimorfonucleares), dicho antagonista produce inhibición de la proliferación de las células tumorales, independientemente de que provengan de tumores en los que existe o no integridad de la ruta de las PI3 Kinasas "aguas abajo" de dicho receptor, Es decir, que independientemente de que el receptor actúe o no a través de dicha vía de señalización en las células tumorales.
Se obtuvieron los mismos resultados cuando se utilizaron otros antagonistas no peptídicos de receptores NK1 : Vestipitant, Casopitant, L-733,060, L-732, 138, L-703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP-96345 y L-760735.
Tabla 78. Porcentaje de inhibición/estimulación de la proliferación de células tumorales primarias procedentes de tumores humanos en los que se modifica AKT (no se detecta su presencia tras el tratamiento con antagonistas del receptor NK1 - dicho receptor actúa a través de la ruta de las PI3 Kinasas en las células tumorales) en cultivo con el antagonista de dicho receptor Aprepitant (ΙμΜ) y en cultivo conjunto con células de la inflamación/inmunidad (leucocitos mononucleares y polimorfonucleares) humanas y Aprepitant (ΙμΜ).
Células Células
Células Células tumorales en tumorales en
Tipo de tumor tumorales tumorales + co-cultivo con co-cultivo con
(control) Aprepitant leucocitos leucocitos +
(control) Aprepitant
Carcinoma de estómago. 100 56±5 100 27±5
Carcinoma de Colon. 100 61±6 100 25±6
Carcinoma de mama. 100 75±7 100 25±7
Carcinoma de Ovario. 100 64±6 100 29±4
Carcinoma de endometrio. 100 63±7 100 29±6
Carcinoma de pulmón de 100 66±6 100 31±7
Células pequeñas Células Células
Células Células tumorales en tumorales en
Tipo de tumor tumorales tumorales + co-cultivo con co-cultivo con
(control) Aprepitant leucocitos leucocitos +
(control) Aprepitant
Carcinoma de pulmón de 100 66±7 100 33±7
Células No Pequeñas
Glioma 100 67±6 100 34±7
Melanoma 100 66±7 100 37±6
Tabla 79. Porcentaje de inhibición/estimulación de la proliferación de células tumorales primarias humanos procedentes de tumores en los que no se modifica AKT (se detecta su presencia tras el tratamiento con antagonistas del receptor NKl - dicho receptor no actúa a través de la ruta de las MAP Kinasas en las células tumorales) en cultivo con el antagonista de dicho receptor Aprepitant (ΙμΜ) y en cultivo conjunto con células inflamatorias/inmunes (leucocitos mono y polimorfonucleares) humanas y Aprepitant (ΙμΜ).
Figure imgf000094_0001
Los resultados demuestran que en los casos en los que se produjo una inhibición de la proliferación, existía integridad de la vía de las PI3 Kinasas, mediante la determinación de AKT. En estos casos en los que se apreció disminución de la proliferación, se apreciaba también ausencia de expresión de AKT. Esto significa que los antagonistas de los receptores NKl inhiben la proliferación en este grupo de células tumorales, a través de la ruta de las PI3 Kinasas. Sin embargo en los casos en los que no se produjo disminución de la proliferación, tras tratamiento con antagonistas del receptor NKl, se constató la presencia de AKT, lo que significa que el tratamiento con antagonistas del receptor NKl no inhibe dicha vía de las PI3 Kinasas y por lo tanto que la inhibición de la proliferación de las células tumorales por los mencionados antagonistas se produce por inhibición, "aguas abajo" de las ruta de las PI3 Kinasas. Sin embargo, cuando se cultivan ambos tipos de células tumorales (con integridad de las PI3 Kinasas -y por lo tanto con ausencia de AKT tras tratamiento con antagonistas del receptor NK1- y con alteración de la ruta de las PI3 Kinasas - y por lo tanto con presencia de AKT tras tratamiento con antagonistas de los receptores NK 1 ) junto con leucocitos mononucleares y polimorfonucleares obtenidos del mismo paciente, sí se observa inhibición de la proliferación de las células tumorales, independientemente del estado de la vía de las PI3 Kinasas. Esto demuestra que los antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 inhiben la supervivencia de las células tumorales por mecanismos distintos a los conocidos en el estado de la técnica y relacionados con el bloqueo de la secreción de sustancias propias de la interacción de dichas células con otras células propias del microambiente tumoral, en concreto con las células de la inflamación/inmunidad (leucocitos mononucleares y polimorfonucleares).
Ejemplo 18. El tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 inhibe la proliferación de las células tumorales exclusivamente cuando dicho receptor actúa a través de la vía de las MAP Kinasas, pero no cuando no actúa a través de dicha vía. El tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 inhibe, en ambos casos, la proliferación de dichas células cuando se cultivan de forma conjunta con las células de la inflamación/inmunidad (macrófagos).
Para obtener las células tumorales a partir de tumores primarios humanos se empleó el mismo método descrito en el Ejemplo 7. Los distintos tumores y las características de los pacientes se muestran en la Tabla 36. De cada uno de los tumores mostrados en dicha Tabla 36 se obtuvieron cuatro que mostraban expresión de la ruta MAP Kinasas después del tratamiento con los diferentes antagonistas no peptídicos de NK1 y otros cuatro que no expresaban dicha ruta después del tratamiento con los diferentes antagonistas no peptídicos de NK1. De manera similar, se obtuvieron células de la inflamación/inmunidad (macrófagos) para ponerlos en cultivo, a partir de muestras obtenidas de la piel del mismo paciente en el área de la incisión quirúrgica que les fue realizada en la propia intervención practicada para extirparles el tumor. De manera similar a lo realizado en el ejemplo 7, un total de 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con integridad de la vía de las MAP Kinasas (con ausencia de ERK tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NK1) se utilizaron como control de supervivencia de las células tumorales de dichos tumores. Otros 6 pocilios se utilizaron como control de supervivencia de las células tumorales procedentes de tumores con alteración de la vía de las MAP Kinasas (presencia de ERK tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl). Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con integridad de la vía de las MAP Kinasas (con ausencia de ERK tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl . Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con alteración de la vía de las MAP Kinasas (con presencia de ERK tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl . Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con integridad de la vía de las MAP Kinasas (con ausencia de ERK tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia células estromales -fibroblastos- y de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl . Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con alteración de la vía de las MAP Kinasas (con presencia de ERK tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia células de la inflamación/inmunidad (macrófagos) y de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl .
Previamente, se comprobó que las células tumorales y las células inflamatorias/inmunes (macrófagos), expresaban el receptor NKl mediante la técnica de Western Blot. Posteriormente se elaboró un bloque de parafina con el contenido de cada uno de los pocilios, según se detalla en el Ejemplo 1. Para comprobar la existencia de proteínas pertenecientes a la ruta de las MAP Kinasas en los diferentes cultivos celulares se realizó una técnica de Western Blot, utilizando como anticuerpo primario: Phospho-p44/42 MAPK (Erkl/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP® Rabbit mAb (4370, Cell Signalling). En esta ocasión y para poder identificar los distintos tipos celulares para poder hacer el recuento de los mismos se realizó una técnica inmunohistoquímica con mareaje con anticuerpos primarios específicos para células inflamatorias/inmunes (macrófagos) humanas (Anti-Actina de músculo liso), células de carcinoma (Anti- Citoqueratinas de amplio espectro), Glioma (Anti-Proteína Glial Fibrilar Acida), Sarcoma de Ewing (Anti-CD99), Melanoma (Anti-HMB45), Leucemias y linfomas (Anti-Antígeno común leucocitario) y Mieloma (anti-CD138). Todos los anticuerpos son distribuidos por Dako y se utilizaron a la concentración a la que son suministrados (se suministran prediluidos -"ready to use"-).
En las Tablas 80 y 81 se aprecia como el antagonista no peptídico del receptor NKl Aprepitant sólo inhibe el crecimiento de las células en las que dicho receptor actúa a través de la vía de las MAP Kinasas, mientras que en las células en las que no produce inhibición no se observa modificación de esta ruta. Sin embargo, cuando las células tumorales se co-cultivan con células de la inflamación/inmunidad (macrófagos), dicho antagonista produce inhibición de la proliferación de las células tumorales, independientemente de que provengan de tumores en los que existe o no integridad de la ruta de las MAP Kinasas "aguas abajo" de dicho receptor, Es decir, que independientemente de que el receptor actúe o no a través de dicha vía de señalización en las células tumorales.
Se obtuvieron los mismos resultados cuando se utilizaron otros antagonistas no peptídicos de receptores NK1 : Vestipitant, Casopitant, L-733,060, L-732, 138, L-703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP-96345 y L-760735.
Tabla 80. Porcentaje de inhibición/proliferación de células tumorales primarias humanas procedentes de tumores en los que se modifica ERK (no se detecta su presencia tras el tratamiento con antagonistas del receptor NK1 - dicho receptor actúa a través de la ruta de las MAP Kinasas en las células tumorales) en cultivo con el antagonista de dicho receptor Aprepitant (ΙμΜ) y en cultivo conjunto con 1 células inflamatorias/inmunes (Macrófagos) humanas y Aprepitant (ΙμΜ).
Figure imgf000097_0001
Tabla 81. Porcentaje de inhibición/estimulación de la proliferación de células tumorales primarias humanos procedentes de tumores en los que no se modifica ERK (se detecta su presencia tras el tratamiento con antagonistas del receptor NK1 - dicho receptor no actúa a través de la ruta de las MAP Kinasas en las células tumorales) en cultivo con el antagonista de dicho receptor Aprepitant (ΙμΜ) y en cultivo conjunto con células inflamatorias/inmunes (Macrófagos) humanas y Aprepitant (ΙμΜ). Células Células
Células Células tumorales en tumorales en co-
Tipo de tumor tumorales tumorales + co-cultivo con cultivo con
(control) Aprepitant macrófagos macrófagos +
(control) Aprepitant
Carcinoma de estómago. 100 100±5 100 27±5
Carcinoma de Colon. 100 100±7 100 28±6
Carcinoma de mama. 100 101±6 100 29±6
Carcinoma de Ovario. 100 99±3 100 29±7
Carcinoma de endometrio. 100 98±7 100 29±4
Carcinoma de pulmón de 100 101±6 100 28±5
Células pequeñas
Carcinoma de pulmón de 100 102±6 100 29±5
Células No Pequeñas
Glioma 100 99±7 100 27±7
Melanoma 100 98±6 100 32±5
Los resultados ponen de manifiesto que en los casos en los que se produjo una inhibición de la proliferación, existía integridad de la vía de las MAP Kinasas, mediante la determinación de ERK. En estos casos en los que se apreció disminución de la proliferación, se apreciaba también ausencia de expresión de ERK. Esto significa que los antagonistas de los receptores NKl inhiben la proliferación en este grupo de células tumorales, a través de la ruta de las MAP Kinasas. Sin embargo en los casos en los que no se produjo disminución de la proliferación, tras tratamiento con antagonistas del receptor NKl, se constató la presencia de ERK, lo que significa que el tratamiento con antagonistas del receptor NKl no inhibe dicha vía de las MAP Kinasas y por lo tanto que la inhibición de la proliferación de las células tumorales por los mencionados antagonistas se produce por inhibición, "aguas abajo" de las ruta de las MAP Kinasas. Sin embargo, cuando se cultivan ambos tipos de células tumorales (con integridad de las MAP Kinasas -y por lo tanto con ausencia de ERK tras tratamiento con antagonistas del receptor NKl - y con alteración de la ruta de las MAP Kinasas - y por lo tanto con presencia de ERK tras tratamiento con antagonistas de los receptores NK l ) junto con leucocitos mononucleares y polimorfonucleares obtenidos del mismo paciente, sí se observa inhibición de la proliferación de las células tumorales, independientemente del estado de la vía de las MAP Kinasas. Esto demuestra que los antagonistas no peptídicos de los receptores NKl inhiben la supervivencia de las células tumorales por mecanismos distintos a los conocidos en el estado de la técnica y relacionados con el bloqueo de la secreción de sustancias propias de la interacción de dichas células con otras células propias del microambiente tumoral, en concreto con las células de la inflamación/inmunidad (macrófagos). Ejemplo 19. El tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl inhibe la proliferación de las células tumorales exclusivamente cuando dicho receptor actúa a través de la vía de las PI3 Kinasas. El tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl inhibe, en ambos casos, la proliferación de dichas células cuando se cultivan de forma conjunta con las células de la inflamación/inmunidad (macrófagos).
Para obtener las células tumorales a partir de tumores primarios humanos se empleó el mismo método descrito en el Ejemplo 7. Los distintos tumores y las características de los pacientes se muestran en la Tabla 36. De cada uno de los tumores mostrados en dicha Tabla 36 se obtuvieron cuatro que mostraban expresión de la ruta PI3 Kinasas después del tratamiento con los diferentes antagonistas no peptídicos de NKl y otros cuatro que no expresaban dicha ruta después del tratamiento con los diferentes antagonistas no peptídicos de NKl . De manera similar, se obtuvieron células de la inflamación/inmunidad (leucocitos mononucleares y polimorfonucleares) para ponerlos en cultivo, a partir de muestras obtenidas de la piel del mismo paciente en el área de la incisión quirúrgica que les fue realizada en la propia intervención practicada para extirparles el tumor. De manera similar a lo realizado en el ejemplo 7, un total de 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con integridad de la vía de las PI3 Kinasas (con ausencia de AKT tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se utilizaron como control de supervivencia de las células tumorales de dichos tumores. Otros 6 pocilios se utilizaron como control de supervivencia de las células tumorales procedentes de tumores con alteración de la vía de las PI3 Kinasas (presencia AKT tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl). Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con integridad de la vía de las PI3 Kinasas (con ausencia de AKT tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl . Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con alteración de la vía de las PI3 Kinasas (con presencia de AKT tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl . Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con integridad de la vía de las PI3 Kinasas (con ausencia de AKT tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia células estromales -fibroblastos- y de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NKl . Otros 6 pocilios conteniendo las células tumorales procedentes de tumores con alteración de la vía de las PI3 Kinasas (con presencia de AKT tras tratamiento con antagonistas no peptídicos de los receptores NKl) se cultivaron en presencia células estromales -fibroblastos- y de diversos antagonistas no peptídicos del receptor NK1.
Previamente, se comprobó que las células tumorales y las células de la inflamación/inmunidad (leucocitos mononucleares y polimorfonucleares) expresaban el receptor NK 1 mediante la técnica de Western Blot. Posteriormente se elaboró un bloque de parafina con el contenido de cada uno de los pocilios, según se detalla en el Ejemplo 1. AKT en los diferentes cultivos celulares se realizó una técnica de Western Blot (según lo descrito en el ejemplo 1 -apartado Western Blot-), pero utilizando como anticuerpo primario con referencia: Akt (pan) (11E7) Rabbit mAb (4685, Cell Signalling). En esta ocasión y para poder identificar los distintos tipos celulares para poder hacer el recuento de los mismos se realizó una técnica inmunohistoquímica con mareaje con anticuerpos primarios específicos para células de la inflamación/inmunidad (leucocitos mononucleares y polimorfonucleares) humanas (Anti-Actina de músculo liso), células de carcinoma (Anti-Citoqueratinas de amplio espectro), Glioma (Anti-Proteína Glial Fibrilar Acida), Sarcoma de Ewing (Anti-CD99), Melanoma (Anti-HMB45), Leucemias y linfomas (Anti-Antígeno común leucocitario) y Mieloma (anti-CD138). Todos los anticuerpos son distribuidos por Dako y se utilizaron a la concentración a la que son suministrados (se suministran prediluidos -"ready to use"-). En las tablas 82 y 83 se aprecia como el antagonista no peptídico del receptor NK1 Aprepitant sólo inhibe el crecimiento de las células en las que dicho receptor actúa a través de la vía de las PI3 Kinasas, mientras que en las células en las que no produce inhibición no se observa modificación de esta ruta. Sin embargo, cuando las células tumorales se co-cultivan con células de la inflamación/inmunidad (macrófagos), dicho antagonista produce inhibición de la proliferación de las células tumorales, independientemente de que provengan de tumores en los que existe o no integridad de la ruta de las PI3 Kinasas "aguas abajo" de dicho receptor, Es decir, que independientemente de que el receptor actúe o no a través de dicha vía de señalización en las células tumorales. Se obtuvieron los mismos resultados cuando se utilizaron otros antagonistas no peptídicos de receptores NK1 : Vestipitant, Casopitant, L-733,060, L- 732, 138, L-703,606, CP-100263, WIN 62,577, WIN 51708, CP-96345 y L-760735.
Tabla 82. Porcentaje de inhibición de la proliferación de células tumorales primarias humanos procedentes de tumores en los que se modifica AKT (no se detecta su presencia tras el tratamiento con antagonistas del receptor NK1 - dicho receptor actúa a través de la ruta de las PI3 Kinasas en las células tumorales) en cultivo con el antagonista de dicho receptor Aprepitant (ΙμΜ) y en cultivo conjunto con 1 células inflamatorias/inmunes (Macrófagos) humanas y Aprepitant (ΙμΜ).
Figure imgf000101_0001
Tabla 83. Porcentaje de inhibición/estimulación de la proliferación de células tumorales primarias humanos procedentes de tumores en los que no se modifica AKT (se detecta su presencia tras el tratamiento con antagonistas del receptor NK1 - dicho receptor no actúa a través de la ruta de las PI3 Kinasas en las células tumorales) en cultivo con el antagonista de dicho receptor Aprepitant (ΙμΜ) y en cultivo conjunto con células inflamatorias/inmunes (Macrófagos) humanas y Aprepitant ( 1 μΜ) .
Figure imgf000101_0002
Los resultados ponen de manifiesto que en los casos en los que se produjo una inhibición de la proliferación, existía integridad de la vía de las PI3 Kinasas, mediante la determinación de AKT. En estos casos en los que se apreció disminución de la proliferación, se apreciaba también ausencia de expresión de AKT. Esto significa que los antagonistas de los receptores NKl inhiben la proliferación en este grupo de células tumorales, a través de la ruta de las PI3 Kinasas. Sin embargo en los casos en los que no se produjo disminución de la proliferación, tras tratamiento con antagonistas del receptor NKl, se constató la presencia de AKT, lo que significa que el tratamiento con antagonistas del receptor NKl no inhibe dicha vía de las PI3 Kinasas y por lo tanto que la inhibición de la proliferación de las células tumorales por los mencionados antagonistas se produce por inhibición, "aguas abajo" de las ruta de las PI3 Kinasas. Sin embargo, cuando se cultivan ambos tipos de células tumorales (con integridad de las PI3 Kinasas -y por lo tanto con ausencia de AKT tras tratamiento con antagonistas del receptor NKl- y con alteración de la ruta de las PI3 Kinasas - y por lo tanto con presencia de AKT tras tratamiento con antagonistas de los receptores NKl) junto con leucocitos mononucleares y polimorfonucleares obtenidos del mismo paciente, sí se observa inhibición de la proliferación de las células tumorales, independientemente del estado de la vía de las PI3 Kinasas. Esto demuestra que los antagonistas no peptídicos de los receptores NKl inhiben la supervivencia de las células tumorales por mecanismos distintos a los conocidos en el estado de la técnica y relacionados con el bloqueo de la secreción de sustancias propias de la interacción de dichas células con otras células propias del microambiente tumoral, en concreto con las células de la inflamación/inmunidad (macrófagos). Ejemplo 20. Los antagonistas no peptídicos del receptor NKl a dosis bajas no inhiben la proliferación de las células tumorales, sin embargo si la inhiben cuando se cultivan en presencia de fibroblastos humanos y de células del sistema inmune e inflamatorias.
Como se ha explicado en los ejemplos precedentes, la interacción entre las células tumorales y las células propias del estroma -fibroblastos- y las células del sistema inmune/inflamatorias (leucocitos mononucleares, leucocitos polimorfonucleares y macrófagos) modifica el microambiente, estimulando la secreción por parte de estas células de sustancias que favorecen la progresión del cáncer. Según se conoce en el estado de la técnica, los antagonistas de los receptores NKl pueden inhibir la proliferación de las células tumorales a dosis altas, sin embargo este efecto no se produce cuando se utilizan a dosis bajas. En el presente ejemplo se demuestra que cuando se cultivan estas células de manera conjunta con células del estroma - fibroblastos- y las células del sistema inmune/inflamatorias (leucocitos mononucleares, leucocitos polimorfonucleares y macrófagos), dichos antagonistas si pueden inhibir la proliferación de dichas células tumorales. En la Tabla 36 se exponen las células tumorales empleadas, especificando en cada caso el tipo de tumor al que corresponden. Dichas células tumorales y los fibroblastos (primarios humanos) se obtuvieron según los métodos empleados y descritos en la presente invención. Previamente a la realización de los experimentos, se comprobó que todas estas líneas celulares presentaban receptor NK1 mediante la técnica de Western Blot.
En la Tabla 84 se aprecia como el antagonista no peptídico del receptor NK1 Aprepitant no inhibe el crecimiento de las células tumorales a dosis bajas (5 nanomolar), mientras que cuando las células tumorales se co-cultivan con células del estroma -fibroblastos- y células del sistema inmune/inflamatorias (leucocitos mononucleares, leucocitos polimorfonucleares y macrófagos), dicho antagonista produce inhibición de la proliferación de las células tumorales, independientemente de que se utilice a dosis bajas (que no produce inhibición cuando estas células tumorales se cultivan solas en presencia de Aprepitant).
Tabla 84. Porcentaje de inhibición/proliferación de células tumorales primarias humanas en cultivo con el antagonista de dicho receptor Aprepitant (5nM) y en cultivo conjunto con células estromales -fibroblastos-, células de la inflamación/inmunidad (leucocitos mononucleares, leucocitos polimorfonucleares y macrófagos) humanas y Aprepitant (5nM).
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Por lo tanto, la interacción entre las células tumorales y las células propias del estroma - fibroblastos- y las células del sistema inmune/inflamatorias (leucocitos mononucleares, leucocitos polimorfonucleares y macrófagos) modifican el microambiente de los tumores, favoreciendo la progresión del cáncer. Los antagonistas de los receptores NKl pueden inhibir la proliferación de las células tumorales mediante la modulación de la secreción de sustancias de importancia para la supervivencia y progresión del cáncer producidas por las células del estroma, incluso a dosis que "per se" no producen inhibición directa de la proliferación de dichas células tumorales.
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Claims

REIVINDICACIONES
1.- Uso de al menos un agente modificador del ambiente peritumoral seleccionado entre:
(i) un agente capaz de inhibir la neoangiogénesis mediada por las células de la estirpe vascular y/o
(ii) un agente capaz de inhibir la síntesis, por parte de células de la estirpe fibroblástica, de marcadores seleccionados entre cualquiera de los siguientes: TGF-α , TGF-β 1, TGF-β 2, TGF-β 3, SPARC, MMP-3; MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-13 y MMP-14 y/o
(iii) un agente capaz de inhibir la síntesis, por parte de células de la estirpe inmunitaria y/o inflamatoria, de marcadores seleccionados entre cualquiera de los siguientes: TGF-β, NF- kB, EGF, MMP-9, VEGF y TNF-a,
o combinaciones de los mismos, para la fabricación de un medicamento útil en el tratamiento del cáncer.
2 - Uso según la reivindicación 1 en el que el agente modificador del ambiente peritumoral es un antagonista no peptídico de los receptores NK1.
3. - Uso según la reivindicación 2 caracterizado por que los antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 se seleccionan de entre cualquiera de los siguientes: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant, Lanepitant, LY-686017, L-733,060, L-732, 138, L-703,606, WIN 62,577, CP-122721, , TAK-637, y R673, CP-100263, WIN 51708, CP-96345, L-760735, CP-122721, L-758298, L-741671, L-742694, CP-99994, T-2328.
4. - Uso según la reivindicación 3 caracterizado por que los antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 se seleccionan de entre cualquiera de los siguientes: Aprepitant, Vestipitant,
Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant y Lanepitant.
5. - Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado por que el medicamento útil en el tratamiento del cáncer comprende al menos otro principio activo que induce apoptosis en las células tumorales.
6. - Uso según la reivindicación 5 caracterizado por que el principio activo que induce apoptosis en las células tumorales se selecciona de entre cualquiera de los siguientes: Clorambucil, Melfalán, Aldesleukina, 6-Mercaptopurina, 5-Fluoruracilo, Ara-c, Bexaroteno, Bleomicina, Capecitabina, Carboplatino, Cisplatino, Docetaxel, Doxorrubicina, Epirrubicina, Fludarabina, Irinotecan Metotrexato, Mitoxantrona Oxaliplatino, Paclitaxel, Rituximab , Vinblastina, Etopósido, Tenipósido, Vincristina, Vinorelbina, Imatinib, Erlotinib, Cetuximab y Trastuzumab, o combinaciones de los mismos.
7.- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado por que el medicamento útil en el tratamiento del cáncer se administra por separado, conjuntamente o secuencialmente, con al menos otro agente anticancerígeno seleccionado entre cualquiera de los siguientes: un agente de quimioterapia o un agente de radioterapia.
8.- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado por que las células de la estirpe vascular son células endoteliales vasculares, las células de la estirpe fibroblástica son fibroblastos y las células de la estirpe inmunitaria y/o inflamatoria se seleccionan de entre: leucocitos mononucleares, leucocitos polimorfonucleares y/o macrófagos.
9.- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado por que el cáncer se selecciona de entre cualquiera de los siguientes: carcinoma gástrico, carcinoma de colon, carcinoma de páncreas, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma de endometrio, coriocarcinoma, carcinoma de cérvix uterino, carcinoma de pulmón, carcinoma de tiroides, carcinoma de vejiga, carcinoma de próstata, carcinoma glial del sistema nervioso central, sarcoma, melanoma, carcinomas embrionarios y carcinomas hematológicos.
10. - Composición que comprenda al menos un agente modificador del ambiente peritumoral seleccionado entre:
(i) un agente capaz de inhibir la neoangiogénesis mediada por las células de la estirpe vascular y/o
(ii) un agente capaz de inhibir la síntesis, por parte de células de la estirpe fibroblástica, de marcadores seleccionados entre cualquiera de los siguientes: TGF-a, TGF-β 1, TGF-β 2, TGF-β 3, SPARC, MMP-3; MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-13 y MMP-14 y/o
(iii) un agente capaz de inhibir la síntesis, por parte de células de la estirpe inmunitaria y/o inflamatoria, de marcadores seleccionados entre cualquiera de los siguientes: TGF-β, NF- kB, EGF, MMP-9, VEGF y TNF-α, o combinaciones de los mismos.
1 1. - Composición según la reivindicación 10 caracterizada por que el agente modificador del ambiente peritumoral es un antagonista no peptídico de los receptores NK1.
12- Composición según la reivindicación 1 1 caracterizada por que los antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 se seleccionan de entre cualquiera de los siguientes: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant, Lanepitant, LY-686017, L-733,060, L-732, 138, L-703,606, WIN 62,577, CP-122721, , TAK-637, y R673, CP-100263, WIN 51708, CP-96345, L-760735, , CP-122721, L-758298, L-741671, L-742694, CP-99994, T-2328.
13. - Composición según la reivindicación 1 1 caracterizada por que los antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 se seleccionan de entre cualquiera de los siguientes: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant y Lanepitant.
14. - Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-13 caracterizada por que es una composición farmacéutica.
15. - Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-14 caracterizada por que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
16. - Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-15 caracterizada por que además comprende al menos otro principio activo que induce apoptosis en las células tumorales.
17.- Composición según la reivindicación 16 caracterizada por que el principio activo que induce apoptosis en las células tumorales se selecciona de entre cualquiera de los siguientes: Clorambucil, Melfalán, Aldesleukina, 6-Mercaptopurina, 5-Fluoruracilo, Ara-c, Bexaroteno, Bleomicina, Capecitabina, Carboplatino, Cisplatino, Docetaxel, Doxorrubicina, Epirrubicina, Fludarabina, Irinotecan Metotrexato, Mitoxantrona Oxaliplatino, Paclitaxel, Rituximab, Vinblastina, Etopósido, Tenipósido, Vincristina, Vinorelbina, Imatinib, Erlotinib, Cetuximab y Trastuzumab, o combinaciones de los mismos.
18. - Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-17 caracterizada por que se administra por separado, conjuntamente o secuencialmente, con al menos otro agente anticancerígeno seleccionado entre cualquiera de los siguientes: un agente de quimioterapia o un agente de radioterapia.
19. - Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-18 caracterizada por que el cáncer se selecciona de entre cualquiera de los siguientes: carcinoma gástrico, carcinoma de colon, carcinoma de páncreas, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma de endometrio, coriocarcinoma, carcinoma de cérvix uterino, carcinoma de pulmón, carcinoma de tiroides, carcinoma de vejiga, carcinoma de próstata, carcinoma glial del sistema nervioso central, sarcoma, melanoma, carcinomas embrionarios y carcinomas hematológicos.
20- Forma farmacéutica que comprende una compo sición según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19.
21. - Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-19 o de la forma farmacéutica según la reivindicación 20 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
22. - Preparación combinada que comprende:
(a) al menos un agente modificador del ambiente peritumoral seleccionado entre:
(i) un agente capaz de inhibir la neoangiogénesis mediada por las células de la estirpe vascular y/o
(ii) un agente capaz de inhibir la síntesis, por parte de células de la estirpe fibroblástica, de marcadores seleccionados entre cualquiera de los siguientes: TGF-α , TGF-β 1, TGF-β 2, TGF-β 3, SPARC, MMP-3; MMP-7, MMP-9, MMP-1 1, MMP-13 y MMP-14 y/o
(iii) un agente capaz de inhibir la síntesis, por parte de células de la estirpe inmunitaria y/o inflamatoria, de marcadores seleccionados entre cualquiera de los siguientes: TGF-β, NF-kB, EGF, MMP-9, VEGF y TNF-a, o combinaciones de los mismos,según cualquiera de las reivindicaciones 1-4
(b) al menos un segundo principio activo que induce apoptosis en las células tumorales.
23. - Preparación combinada según la reivindicación 22 caracterizada por que el agente modificador del ambiente peritumoral es un antagonista no peptídico de los receptores NK1.
24. - Preparación combinada según la reivindicación 23 caracterizada por que los antagonistas no peptídicos de los receptores NK 1 se seleccionan de entre cualquiera de los siguientes:
Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant, Lanepitant, LY-686017, L-733,060, L-732, 138, L-703,606, WIN 62,577, CP-122721, , TAK-637, y R673, CP-100263, WIN 51708, CP-96345, L-760735, , CP-122721, L-758298, L-741671, L-742694, CP-99994, T-2328.
25.- Preparación combinada según la reivindicación 24 caracterizada por que los antagonistas no peptídico de los receptores NK1 se seleccionan de entre cualquiera de los siguientes: Aprepitant, Vestipitant, Casopitant, Vofopitant, Ezlopitant y Lanepitant.
26.- Preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 caracterizada por que el principio activo que induce apoptosis en las células tumorales se selecciona de entre cualquiera de los siguientes: Clorambucil, Melfalán, Aldesleukina, 6-Mercaptopurina, 5- Fluoruracilo, Ara-c, Bexaroteno, Bleomicina, Capecitabina, Carboplatino, Cisplatino, Docetaxel, Doxorrubicina, Epirrubicina, Fludarabina, Irinotecan Metotrexato, Mitoxantrona Oxaliplatino, Paclitaxel, Rituximab, Vinblastina, Etopósido, Tenipósido, Vincristina, Vinorelbina, Imatinib, Erlotinib, Cetuximab y Trastuzumab, o combinaciones de los mismos.
27. - Preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 caracterizada por que se administra por separado, conjuntamente o secuencialmente con al menos otro agente anticancerígeno seleccionado entre cualquiera de los siguientes: un agente de quimioterapia o un agente de radioterapia.
28. - Uso por separado, simultáneo o secuencial de los principios activos de la preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
PCT/ES2012/070865 2011-12-13 2012-12-13 Uso de agentes modificadores del ambiente peritumoral para el tratamiento del cáncer WO2013087964A1 (es)

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