WO2015118993A1 - ポリカチオン性トリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーの組成物を含む癒着防止用製剤 - Google Patents

ポリカチオン性トリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーの組成物を含む癒着防止用製剤 Download PDF

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長崎　幸夫
寛之 中川
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国立大学法人筑波大学
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Definitions

  • the present invention relates to an anti-adhesion preparation comprising a composition comprising a polycationic triblock copolymer and a polyanionic polymer as active ingredients.
  • a film or sheet type anti-adhesive agent using a biocompatible substance has been used in the course of surgery.
  • films using gel compositions derived from hyaluronic acid and carboxymethylcellulose and films based on collagen have been proposed (for example, Patent Document 1 and Patent Document 2, respectively). reference).
  • problems such as difficulty in handling during surgery and low ability to cover tissue surfaces.
  • carboxymethylcellulose derivatives that enable the formation of hydrogels with excellent viscoelasticity as medical gels and anti-adhesion materials has been proposed (see, for example, Patent Document 3).
  • the present inventors have succeeded in stabilizing a nitroxide radical by covalently bonding a cyclic nitroxide radical to a specific block copolymer, and have found that reactive oxygen species (ROS) can be effectively eliminated ( WO 2009/133647).
  • ROS reactive oxygen species
  • the present inventors have found that an ion complex formed from a cationic polymer in which such a cyclic nitroxide radical is covalently bonded to a specific triblock copolymer and an anionic polymer requires elimination of active oxygen,
  • the inventors have succeeded in providing a gel that stays in periodontal pockets, cancer lesions, etc. and can suppress inflammation, and has filed a patent application for the thus completed invention (see WO2013 / 111801).
  • an aqueous solution of an ion complex capable of providing such a gel functions as a physical barrier that forms an irreversible gel under physiological conditions or in vivo and prevents adhesion of tissues or organs in vivo. It has been found that it exhibits an excellent anti-adhesion effect. It has also been found that an irreversible gel can be formed rapidly after administration to a living body, particularly when the ion complex is used in a micelle state in an aqueous solution. Without being bound by theory, such an excellent anti-adhesion effect is in addition to the excellent physical barrier property due to the irreversible gel that can be rapidly formed, or the tissue damaged by surgery or the like. It is understood to be due to the inhibitory action of inflammation that occurs between the organ and surrounding tissues or organs.
  • an anti-adhesion preparation comprising a composition comprising a triblock copolymer represented by the following formula I and the following polyanionic polymer as an active ingredient, an in vivo tissue or organ
  • a method for preventing adhesion comprising the use of the composition for producing an anti-adhesion preparation, or administering the composition in an amount effective to prevent adhesion to a living body where administration is required.
  • L 1 represents the same or different linking groups
  • L 2 is independently —C 1-6 alkylene-NH— (C 1-6 alkylene) q —, where q is an integer of 0 or 1, and R is independently R At least 20% of the total number n of 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl-4-yl, 2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-1-oxyl-3-yl, 2, 2,5,5-tetramethylpyrrolin-1-oxyl-3-yl and 2,4,4-trimethyl-1,3-oxazolidine-3-oxyl-2-yl, 2,4,4-trimethyl-1, Represents the residue of a cyclic nitroxide radical compound selected from the group consisting of 3-thiazolidine-3-oxyl-2-yl and 2,4,4-trimethyl-imidazolindin-3-oxyl-2-yl, and when present The remaining R is a hydrogen atom, Is a Gen atom or a hydroxy group, Y is independently selected from the
  • the anionic polymer is one or more selected from the group consisting of polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polysulfonic acid, polyanionic polysaccharide, and anionic protein. Furthermore, the present invention relates to a composition in which 5 to 40% of the carboxyl groups in the polyanionic polymer are modified with a fluorescent dye in the composition. The present invention also relates to some novel copolymers of the triblock copolymers represented by Formula I and their synthetic precursors.
  • ⁇ Adhesion> In general, when normal in vivo tissues or organs damaged by surgery are sutured together, the tissues or organs adhere to each other and spontaneously heal (wound healing). However, tissues that should originally be separated in the healing process may stick together, and this is called “post-operative adhesion”.
  • the adhesion according to the present invention encompasses such post-operative adhesion and is widely used. It means a state in which tissues or organs (organs) or tissue surfaces that should originally be separated from each other are stuck together due to trauma or inflammation.
  • In vivo means intended for mammals, especially humans, and patient means mammals, particularly humans.
  • the triblock copolymer represented by the formula I is represented by the above formula:
  • Each L 1 is preferably independently a single bond, —S— (CH 2 ) c —, —S— (CH 2 ) c CO—, — (CH 2 ) c S—, —CO (CH 2 ) C S-,
  • c is an integer from 1 to 5; Y is preferably H or —SH,
  • R is independently 20%, preferably 50%, more preferably at least 80%, most preferably about 90% or more or 100% of the total number n of R is 2, 2, 6, 6-tetramethylpiperidin-1-oxyl-4-yl, 2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-1-oxyl-3-yl, 2,2,5,5-tetramethylpyrrolin-1-oxyl- 3-yl and 2,4,4-trimethyl-1,3-oxazolidine-3-oxyl-2-yl, 2,4,4-trimethyl-1,3-thiazolidin-3-oxyl-2-yl and 2, This represents a residue of a cyclic nitroxide radical compound selected from the group consisting of 4,4-trimethyl-imidazolindin-3-oxyl-2-yl, and when present, the remaining R is a hydrogen atom, a halogen atom or a hydrogen atom.
  • m is independently preferably an integer of 3 to 100, more preferably 3 to 50
  • n is preferably an integer of 5 to 1000, more preferably 10 to 200. It is represented by In the case where the bonding sites such as —S— (CH 2 ) c — exemplified for the linking group L 1 in formula I are different, the right side connector in the described direction (in this case, (CH 2 ) C 2 is bonded to the oxygen atom (O) in the formula, and L 2 is bonded to R through NH— (C 1-6 alkylene) q— It means to do.
  • C 1-6 alkyl or a group containing them such as C 1-6 alkylthiocarbonylthio
  • the alkyl moiety in C 1-6 alkyloxythiocarbonylthio are not specifically limited
  • branched or straight chain lower alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, tert-butyl, hexyl and the like.
  • C 1-6 alkylene includes, but is not limited to, a corresponding alkyl diyl group such as methylene, 1,2-propanediyl, 1,3-propanediyl, 1,4-butanediyl, and the like. Can be mentioned.
  • the cyclic nitroxide radical of the R group is preferably Next formula
  • R ′ is a methyl group.
  • the group represented by these can be mentioned.
  • the polyanionic polymer used in the present invention is a polyanionic organic polymer compound capable of forming a stable polyion complex with the triblock copolymer represented by Formula I in an aqueous solution.
  • Specific examples include, but are not limited to, one or more selected from the group consisting of polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polysulfonic acid, polyanionic polysaccharide, anionic protein, and the like.
  • anionic protein selected from the group consisting of polyanionic polysaccharides selected from the group consisting of carboxymethyl dextran, carrageenan, xanthan gum, chondroitin sulfate, hyaluronic acid, heparin, albumin, polyaspartic acid, polyglutamic acid. it can.
  • an anionic polysaccharide is preferable.
  • the molecular weight of these polyanionic polymers varies depending on the type of polymer and is not limited.
  • Mn is 1,000 to 1,000,000, preferably 1000 to 100,000, more preferably 1000 to 10,000
  • Mn or Mw is 1,000 to 1,000,000
  • an anionic protein such as polyaspartic acid
  • Mn or Mw is 1,000 to 1,000,000, preferably 1,000 to 100,000.
  • the modified anionic polymer includes the polyanionic polymer, for example, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, carboxymethyldextran, xanthan gum, hyaluronic acid, polyaspartic acid and polyglutamic acid, their carboxyl group and fluorescent dye, for example, it means one modified by covalent bonding between a carboxyl group and a functional group capable of covalent bonding, such as fluoresceins, rhodamines and alexaflora.
  • a functional group capable of covalent bonding such as fluoresceins, rhodamines and alexaflora.
  • the triblock copolymer and the polyanionic polymer or the modified anionic polymer are those in which the composition containing them is dissolved in a general aqueous solution (for example, a solution in which a solute is dissolved or dispersed in pure water or ion-exchanged water). It is desirable to use them in such a ratio that they can exist as transparent polyion complex micelles by associating with each other to form micelles.
  • a conceptual diagram of such an ion complex micelle is shown in FIG.
  • such a micelle solution is used in an in vivo environment or physiologically from a change in the ionic strength, pH, temperature, etc. of an aqueous solution, particularly from a prepared micelle solution in vitro such as room temperature. Due to the change in environmental conditions, it is necessary to include the triblock copolymer and the polyanionic polymer or the modified anionic polymer in a proportion that forms an irreversible gel. Such a change is caused, for example, when the ionic strength changes from an ionic concentration of 0 (zero) or several tens of mM to an ionic concentration of 150 mM, and a change in temperature usually forms the micelle at room temperature.
  • the composition provided by the present invention exhibits in vivo retention, while the cyclic nitroxide radical compound carried by the triblock copolymer can scavenge active oxygen, thereby preventing tissue or organ adhesion accompanied by inflammation. It can be effectively prevented.
  • a composition comprising a triblock copolymer and a modified anionic polymer exhibits the in vivo retention, and the behavior of the composition (polyion complex) in vivo is detected by the modifying group or moiety. Enable. For such detection, IVIS imaging can be applied.
  • Such a ratio is such that the number of moles of amino groups (or imino groups) of the triblock copolymer and the number of moles of anionic groups of the polyanionic polymer or modified anionic polymer is 1: 4 to 4: 1, preferably 1: 1 to 4: 1, and more preferably the former mole number exceeds the latter mole number.
  • the polyion complex formed from the composition can be provided as an aqueous solution of a polyion complex micelle containing a physiologically acceptable diluent or excipient, if necessary.
  • a physiologically acceptable diluent or excipient can be sterile water, acidic aqueous solutions containing mineral acids, physiological saline, solutions containing physiologically acceptable buffers, etc.
  • excipients include, for example, sorbitol, dextrin, It can be glucose, mannitol, amino acids (eg glycine, isoleucine, valine, methionine, glutamic acid, etc.).
  • the effective amount of the preparation prepared in this way can be easily determined by a specialist based on the results of an efficacy test using laboratory animals as described below.
  • the composition of the polyion complex is sterilized by a sterilization method known in the art, electron beam irradiation, etc. Applied or administered locally in need of prevention or suppression.
  • a sterilization method known in the art, electron beam irradiation, etc.
  • Such an application can be infused using a suitable infusion device such as a syringe, and thus is not limited in selecting a specific local target.
  • Selected from the group consisting of and Y is independently selected from the group consisting of H, phenylthiocarbonylthio optionally substituted with C 1-6 alkyl, C 1-6 alkylthiocarbonylthio, C 1-6 alkyloxythiocarbonylthio, or SH.
  • a triblock copolymer i.e.
  • Selected from the group consisting of Y is independently selected from the group consisting of H, phenylthiocarbonylthio optionally substituted with C 1-6 alkyl, C 1-6 alkylthiocarbonylthio, C 1-6 alkyloxythiocarbonylthio, or SH.
  • L 2 , R, m and n are as defined for formula I above, The triblock copolymer represented by the formula is not described in WO2013 / 111801, and as far as the present inventors know, it is a novel compound not described in the prior art literature.
  • Such a triblock copolymer is, for example, the following formula a
  • L 1 ′ and n are as defined for Formula II above and CTA is a chain transfer agent such as phenylthiocarbonylthio optionally substituted with C 1-6 alkyl, C 1-6 alkylthiocarbonyl Selected from the group consisting of thio, C 1-6 alkyloxythiocarbonylthio,
  • a poly (ethylene glycol) or poly (oxyethylene) derivative modified at both ends is represented by an azo compound as a radical source such as 2,2′-azo in an inert solvent such as toluene. Chloromethylstyrene in the presence of bisisobutyronitrile (AIBN) at 20-80 ° C. for 18-24 hours
  • CTA, L 1 ′, m and n are as defined above to obtain a triblock copolymer precursor represented by H 2 N— (C 1-6 alkylene) q —R
  • R is as defined for formula I and in a solvent such as dimethylformamide, optionally in the presence of a dehydrohalogenating agent such as pyridine, at room temperature to 70 ° C. For 3 to 72 hours and, if necessary, treatment under reducing conditions.
  • the present invention also relates to such a triblock copolymer, a precursor thereof, and a production method for producing the composition of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of size exclusion chromatography (SEC) measurement and 1 H NMR spectrum measurement of the PCMS-b-PEG-b-PCMS triblock copolymer obtained in Production Example 1.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of SEC measurement and 1 H NMR spectrum of the PMNT-b-PEG-b-PMNT triblock copolymer obtained in Production Example 1.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of SEC measurement and 1 H NMR spectrum measurement of the Br-PEG-Br polymer obtained in Production Example 2.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of SEC measurement and 1 H NMR spectrum of the CTA-PEG-CTA polymer obtained in Production Example 2.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of SEC measurement and 1 H NMR spectrum of the PCMS-PEG-PCMS triblock copolymer obtained in Production Example 2.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of SEC measurement and 1 H NMR spectrum of the PMNT-PEG-PMNT triblock copolymer obtained in Production Example 2.
  • FIG. 3 is a graph showing the particle size distribution of polyion complex micelles (PMNT-PEG-PMNT + CS) prepared in Production Example 1.
  • the vertical axis represents intensity (%), and the horizontal axis represents particle size.
  • 6 is a graph showing the particle size distribution of polyion complex micelles prepared in Production Example 2.
  • FIG. The vertical axis represents intensity (%), and the horizontal axis represents particle size.
  • FIG. 3 is a graph showing the particle size distribution of polyion complex micelles (PMNT-PEG-PMNT + PAA) prepared in Production Example 1.
  • the vertical axis represents intensity (%), and the horizontal axis represents particle size.
  • 6 is a photograph replacing a drawing showing the gelation state of the polyion complex micelle (PMNT-PEG-PMNT + PAA) prepared in Production Example 1.
  • FIG. 6 is a photograph replacing a drawing showing the gelation state of the polyion complex micelle (PMNT-PEG-PMNT + PAA) prepared in Production Example 1.
  • FIG. 6 is a photograph replacing a drawing showing the gelation state of the polyion complex micelle (PMNT-PEG-PMNT + PAA) prepared in Production Example 1.
  • FIG. 2 is a photograph showing the anti-adhesion effect of the polyion complex micelle (PMNT-PEG-PMNT + CS) prepared in Production Example 1. It is a figure which shows the experimental procedure at the time of performing the test 2.
  • FIG. It is a figure regarding the adhesion score system used in Test 2.
  • FIG. It is a figure showing the quantitative evaluation of the adhesion level by the score system in Test 2.
  • FIG. It is a figure of active oxygen production evaluation of the peritoneum section in Test 2.
  • FIG. 6 is a tissue observation diagram of a peritoneal section in Test 2. It is a figure showing the film thickness measurement result of the peritoneum section in Test 2. It is a figure of MPO activity evaluation in Test 2.
  • 5 is a diagram relating to an experimental procedure when performing test 3.
  • FIG. It is a figure regarding the adhesion score system used in Test 3. It is a figure showing the quantitative evaluation of the adhesion level by the score system in Test 3. It is a figure showing the white blood cell count in the test 3.
  • FIG. It is a figure of active oxygen production evaluation of the peritoneum section in Test 3. It is a figure of MPO activity evaluation of the peritoneum section in Test 3. It is a figure of the amount of lipid peroxidation in Test 3.
  • FIG. 10 is an image photograph replacing a drawing showing a result of imaging of each sample in Test 4.
  • FIG. It is a graph display of the quantitative data which shows the residual amount of each sample in Test 4.
  • Polyethylene glycol having a thiol group at both ends (HS-PEG-SH) (Mn: 10000; 0.107 mmol, 1.07 g) was added to the reaction vessel. Next, after the inside of the reaction vessel was evacuated, the operation of blowing nitrogen gas was repeated three times to make the inside of the reaction vessel a nitrogen atmosphere. A 2,2′-azobisisobutyronitrile / toluene (0.107 mmol / 10 ml) solution and chloromethylstyrene (8.03 mmol, 1.13 ml) were added to the reaction vessel, heated to 60 ° C., and stirred for 24 hours. .
  • HS-PEG-SH Polyethylene glycol having a thiol group at both ends
  • FIG. 2 shows the results of size exclusion chromatography (SEC) measurement and 1 H NMR spectrum of the obtained PCMS-b-PEG-b-PCMS triblock copolymer.
  • reaction solution was added to a dialysis membrane (Spectra / Por molecular weight cut-off size 3,500 Spectrum Medical Industries Inc., Houston TX) and dialyzed against 2 L of methanol. Methanol was changed 8 times every 2 hours, evaporated and benzene lyophilized. The yield was 90.1%. From the result of 1 H NMR measurement, it was confirmed that the chloromethyl group reacted 100% and TEMPO was introduced (see FIG. 3).
  • PCMS-b-PEG-b-PCMS polychloromethylstyrene-b-polyethylene glycol-b-polychloromethylstyrene triblock copolymer
  • PCMS-b-PEG-b-PCMS has the following synthesis scheme: Synthesized according to 4:
  • PCNT-b-PEG-b-PCMS (5 g) synthesized in Production Example 2 (3) and 7.7 g of 4-amino TEMPO were dissolved in DMSO, stirred at 50 ° C., and reacted to react with the target substance, PMNT-b.
  • -PEG-PMNTb-PMNT was obtained.
  • the obtained PMNT-b-PEG-b-PMNT was precipitated in 2-propanol and purified by drying under reduced pressure.
  • FIG. 7 shows the results of size exclusion chromatography (SEC) measurement and 1 H-NMR spectrum of the polymer.
  • Example 1 Production of polyion complex micelle
  • the powder of PMNT-b-PEG-b-PMNT triblock polymer obtained in Production Example 1 (4) was dissolved in 0.1 M HCl aqueous solution, and the amino group of the PMNT chain was dissolved. It was completely protonated and recovered by lyophilization of an aqueous system.
  • PMNT-b-PEG-b-PMNT triblock polymer and chondroitin sulfate (CS; Mw: 60k) were dissolved in Na 2 HPO 4 buffer (0.1M), respectively, to give a concentration of 5 mg / ml cationic PMNT.
  • Example 2 Production of polyion complex micelle 100 mg of PMNT-b-PEG-b-PMNT triblock copolymer obtained in Production Example 2 (4) was dissolved in methanol, and polyacrylic acid (PAA) dissolved in water there. Mw: 5k) 17.2 mg was added. Subsequently, this solution was dialyzed against water to prepare polyion complex micelles. When the average particle size of the obtained polyion complex micelle was measured by dynamic light scattering (DLS) measurement, it was confirmed that the polyion complex micelles were unimodal particles having an average particle size of 31 nm (see FIG. 9).
  • DLS dynamic light scattering
  • Example 3 Preparation of Injectable Gel (1) 5 mg / ml of each polyion complex (PIC) micelle solution prepared in Example 1 was concentrated by centrifugal evaporation, the ionic strength was adjusted to 150 mM, and the temperature was 37 ° C. The gelation experiment in a water bath was examined by the test tube inversion method. A photograph replacing the drawing showing the results of the experiment is shown in FIG. From this figure, it is confirmed that an irreversible gel was formed in an environment having an ionic strength of 150 mM and a temperature of 37 ° C. with a PIC micelle solution of pH 4.0.
  • PIC polyion complex
  • Example 4 Production of polyion complex micelle 1 g of PMNT-b-PEG-b-PMNT triblock polymer powder obtained in Production Example 1 (2) was dissolved in 0.1 M HCl aqueous solution, and the amino group of PMNT chain was completely protonated and recovered by lyophilization of an aqueous system. Next, PMNT-b-PEG-b-PMNT triblock polymer and polyacrylic acid (PAA; Mw: 5k) were each dissolved in a phosphate buffer (0.1 M) to give a cationic PMNT- having a concentration of 5 mg / ml. b-PEG-b-PMNT aqueous solution and anionic PAA aqueous solution were prepared.
  • a PMNT-b-PEG-b-PMNT triblock polymer aqueous solution was dropped into the polyacrylic acid aqueous solution while stirring to prepare a polyion complex micelle having a pH of 6.2.
  • DLS dynamic light scattering
  • Example 5 Preparation of Injectable Gel
  • Each polyion complex micelle solution 5 mg / ml prepared in Example 4 was concentrated by centrifugal evaporation, the ionic strength was adjusted to 150 mM, and the gelation experiment was performed in a water bath at a temperature of 37 ° C. Were examined by the test tube inversion method. It was confirmed that the PIC micelle solution at pH 4.0 or pH 6.2 was irreversibly gelled in an environment having an ionic strength of 150 mM and a temperature of 37 ° C. (see FIG. 13 or FIG. 14 respectively).
  • the prepared RIG (30 mg / ml) was intraperitoneally administered (1 day after talc administration) in the same manner as 300 ⁇ l, and the evaluation was made over time (2 days after talc administration, 5 days later). went.
  • the experimental groups of mice used in this test are healthy (Healthy group (Non treatment)), Talc group (Talc only intraperitoneally administered), and Talc + RIG group (Talc administered and then RIG administered).
  • Test result 1 Comparison of adhesion level by adhesion score system According to the score system shown in Fig. 17 by observing the abdomen and observing the abdominal cavity, the degree of adhesion was classified by score (how much when the intestine was lifted with tweezers) Evaluation of adhesion and adhesion formation with organs).
  • FIG. 18 shows the results of evaluating each group by score. From the figure, severe adhesion was observed in the abdominal cavity in the Talc administration group. Further, in the results after 5 days, there was a significant difference in adhesion score between the Talc administration group and the Talc + RIG administration group, and the adhesion preventing effect by RIG was confirmed.
  • Test result 2 Reactive oxygen removal ability evaluation by RIG
  • ROS active oxygen
  • RIG has an effect of suppressing oxidative stress occurring at the site of inflammation.
  • Test result 3 Measurement of film thickness of peritoneal slice It has been reported that from the site of inflammation caused by the administration of Talc, fibers are deposited and the film thickness increases with infiltration of neutrophils and macrophages.
  • peritoneal slices were collected and immersed in 10% formalin for 1 day and 70% ethanol for 2 days, then the peritoneum was cut into 7 ⁇ m, and tissue sections were observed and film thickness was measured by Masson trichrome (MT) staining. . The results are shown in FIGS.
  • Test result 4 MPO activity evaluation Myoperoxidase (MPO) activity known as an inflammatory biomarker was evaluated.
  • Peritoneal slices were collected from the mice, and homogenized and centrifuged (10000 rpm, 10 minutes, 4 ° C.) in 1 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 6.0, Involved 0.5% hexadecyltrimethylammonium bromide).
  • 50 mM phosphate buffer pH 6.0, Involved 0.5% hexadecyltrimethylammonium bromide.
  • To 10 ⁇ l of the supernatant 190 ⁇ l of 50 mM phosphate buffer (pH 6), 0.5% o-dianisidine hydrochloride 5 ul, 5 ⁇ l of 20 mM H 2 O 2 were added, and the absorbance was measured (abs 460 nm).
  • the total protein amount of each tissue was produced by BCA kit (Thermo Scientific Pierce Research Research Products), and the value
  • Adhesion prevention effect (comparison with commercially available Seprafilm * (Separafilm)) * Kaken Pharmaceutical Co., Ltd .: Film-type bioabsorbable anti-adhesion material consisting of carboxycellulose and sodium hyaluronate
  • mice 5 weeks old IGS mice (25-30 g) were administered 300 ⁇ l of talc dispersion (100 mg / ml) intraperitoneally. After one day, the abdomen was opened, and the sample shown below was applied or placed to close the laparotomy part. After 5 days, the abdomen was opened and organ adhesion was evaluated. See FIG. 23 for the experimental procedure.
  • Group 1 Untreated control group 2: Laparotomy untreated group 3: NH 2 -TEMPO aqueous solution (6.4 mg / ml) after laparotomy 300 ⁇ l It was applied intraperitoneally and the laparotomy was closed.
  • Group 4 nRIG after laparotomy (injectable gel without antioxidant capacity, 30 mg / ml aqueous solution) was applied intraperitoneally and the laparotomy was closed.
  • Group 5 After laparotomy, RIG (30 mg / ml aqueous solution) was applied intraperitoneally and the laparotomy was closed.
  • Group 6 After laparotomy, a commercially available Sepra film (2 x 5 mm x 5 mm) was placed in the abdominal cavity and the laparotomy was closed.
  • Group 7 After laparotomy, 75 ⁇ l of 6.4 mg / ml NH 2 -TEMPO solution was applied to both sides of commercially available Sepra film and dried (5 mm ⁇ 5 2 mm) was placed in the abdominal cavity and the abdominal part was closed.
  • Group 8 After laparotomy, 75 ⁇ l of 30 mg / ml RIG solution was applied to both sides of commercially available sepra film and dried (2 x 5 mm x 5 mm) It was placed in the abdominal cavity and the laparotomy was closed.
  • FIG. 24 After 5 days, laparotomy and organ adhesion were scored as shown in FIG. 24 and summarized in FIG. As shown in this figure, it can be seen that the RIG of the present invention and the Separafilm coated with RIG have an adhesion suppressing effect. Although commercially available Separa film showed some adhesion prevention effect, no significant difference was observed. The movement of the film is seen, and it seems that the variation becomes large.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • the water was changed 8 times every 2 hours and freeze-dried by aqueous freeze-drying to recover PAA-FL.
  • the synthesized PAA-FL was dissolved in a phosphate buffer, purification was confirmed by passing through a PD10 column, and it was confirmed that unreacted aminofluorescein was removed.
  • An anionic PAA-FL aqueous solution was prepared.
  • a redox nanoparticle solution (30 mg / ml) from PEG-b-PMNT polymer (described in WO2009 / 133647 or produced by the described method) and PAA-FL in the same procedure. Produced.
  • the aqueous solution of this comparative example did not show gelation behavior under biological conditions in the above gelation experiment.
  • ⁇ Test 4> Evaluation of retention in the abdominal cavity of the redox injectable gel (RIG-FL) of Production Example 3 (2) (Evaluation of retention in the abdominal cavity using IVIS imaging) Using a low-molecular fluorescent substance (aminofluorescein: AFL), a redox nanoparticle solution carrying FL (FL-RNP), and a redox injectable gel carrying FL (FL-RIG), the intraperitoneal retention is performed according to the following scheme. Sex was evaluated. Nude mice (n 4, 25-30 g) were used, and IVID # 2 purchased from Oriental Yeast Co., Ltd. was given one week before the start of the experiment in order to prevent detection of fluorescence from the feed.
  • AFL aminofluorescein
  • FL-RNP redox nanoparticle solution carrying FL
  • FL-RIG redox injectable gel carrying FL
  • the mouse abdomen was opened under isoflurane inhalation anesthesia, 300 ⁇ l of sample (AFL, FL-RNP (micelle concentration 30 mg / ml), FL-RIG (micelle concentration 30 mg / ml)) was administered, and the abdomen was sutured.
  • AFL FL-RNP (micelle concentration 30 mg / ml), FL-RIG (micelle concentration 30 mg / ml)
  • FL-RIG micelle concentration 30 mg / ml
  • FIG. 32 shows an imaging image of each sample
  • FIG. 33 shows quantitative data indicating the remaining amount of the sample.
  • retention was improved by gelation in the abdominal cavity, and a significant difference was seen compared to the control group (AFL, FL-RNP).
  • the present invention is an industry that manufactures and sells anti-adhesion preparations that can be used in medicine. Available at.

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Abstract

【課題】　効果的な癒着を防止できる組成物の提供 【解決手段】　Ａ－Ｂ－Ａ型トリブロックコポリマーであって、Ａがカチオン荷電性ポリマーブロックを表し、Ｂがポリエチレングリコール（またはポリ（オキシエチレン））鎖を含む水溶性ブロックを表す、コポリマーとポリアニオン性ポリマー含む組成物を有効成分とする癒着防止用製剤。

Description

ポリカチオン性トリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーの組成物を含む癒着防止用製剤
　本発明は、ポリカチオン性トリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーを含む組成物を有効成分として含んでなる癒着防止用製剤に関する。
　生体適合性を有する物質を利用したフィルムもしくはシートタイプの癒着防止剤が手術の過程で使用されてきた。このような用途に向けた材料の一例としてヒアルロン酸とカルボキシメチルセルロースに由来するゲル組成物やコラーゲンをベースとする材料を利用したフィルムが提案されている（例えば、それぞれ、特許文献１、特許文献２参照）。しかし、このようなフィルムについては手術中における扱いが困難、組織表面への被覆能力が低いなどの問題が指摘されてきた。一方で、ゲル状のまま使用するための材料の開発が進められており、粘弾性に優れたハイドロゲルの形成を可能にするというカルボキシメチルセルロースの誘導体を医療用ゲルや癒着防止材として使用することが提案されている（例えば、特許文献３参照）。これらのゲル状の癒着防止材の中には、既に実用化を目指して開発が進められているものもある。しかしながら、より効果的な癒着防止能を有するゲル状の癒着防止材（または剤）に対するニーズは依然として存在する。
特開２００３－１９１９４号公報 特開平３－２９５５６１号公報 ＷＯ２００９／０７８４９２号公表公報
　本発明者等は、環状ニトロキシドラジカルを特定のブロックコポリマーに共有結合せしめることで該ニトロキシドラジカルを安定化することに成功し、また、活性酸素種（ＲＯＳ）を効果的に消去できることを見出した（ＷＯ２００９／１３３６４７参照）。さらに、本発明者等は、かような環状ニトロキシドラジカルを特定のトリブロックコポリマーに共有結合せしめたカチオン性ポリマーとアニオン性ポリマーで形成したイオンコンプレックスが活性酸素の消去を必要とする生体内局所、例えば、歯周ポケット、癌病巣部等に滞留し、炎症を抑制し得るゲルを提供することに成功し、こうして完成した発明について特許出願した（ＷＯ２０１３／１１１８０１参照）。
　今回、かようなゲルを提供し得るイオンコンプレックスの水性溶液が、生理学的条件下または生体内において、不可逆的ゲルを形成するとともに生体内で組織または器官どうしの接着を防ぐ物理的バリアーとして機能し、優れた癒着防止効果を発揮することを見出した。また、特に該イオンコンプレックスを水溶液中のミセル状態で使用すると、生体に投与後迅速に不可逆ゲルを形成し得ることも見出した。理論に拘束されるものではないが、このようなすぐれた癒着防止効果は、前記の迅速に形成し得る不可逆的ゲルによる優れた物理的バリアー性に加えて、手術等により損傷を受けた組織または器官と周辺の組織または器官の間で生じる炎症の抑制作用によるものと理解している。
　したがって、前記課題を解決するための手段として、下記式Ｉで表されるトリブロックコポリマーと下記のポリアニオン性ポリマーを含む組成物を有効成分として含んでなる癒着防止用製剤、生体内組織または器官の癒着防止用製剤を製造するための当該組成物の使用、あるいは投与を必要とする生体局所に当該組成物を前記癒着防止に有効な量を投与することを含んでなる癒着防止方法を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　式中、
　Ｌ1は、同一または異なる連結基を表し、
　Ｌ2は、独立して、－Ｃ1-6アルキレン－ＮＨ－（Ｃ1-6アルキレン）q－であり、ここでｑは０または１の整数であり、そして
　Ｒは、独立して、Ｒの総数ｎの少なくとも２０％が２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリジン－１－オキシル－３－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリン－１－オキシル－３－イル及び２，４，４－トリメチル－１，３－オキサゾリジン－３－オキシル－２－イル、２，４，４－トリメチル－１，３－チアゾリジン－３－オキシル－２－イル及び２，４，４－トリメチル－イミダゾリンジン－３－オキシル－２－イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
　Ｙは、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオまたはＳＨからなる群より選ばれ、
　ｍは、独立して、３～１，０００の整数であり、そして
　ｎは、５～５，０００の整数である。
　一方、該アニオン性ポリマーはポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン酸、ポリアニオン性多糖類、アニオン性タンパク質からなる群より選ばれる１種またはそれ以上である。
　さらに、本発明は、当該組成物においてポリアニオン性ポリマーにおけるカルボキシル基の５～４０％が蛍光性色素により修飾されている組成物に関する。
　また、本発明は、当該式Ｉで表されるトリブロックコポリマーの一部の新規コポリマー及びそれらの合成前駆体に関する。
＜発明の詳細な説明＞
　はじめに、本明細書において使用する技術用語は、別に定義しない限り、当該技術分野において常用されている意味、内容のものとして使用している。
　＜癒着＞
一般的に、手術によって傷ついた正常な生体内の組織または器官同士を縫合すると、その組織または器官はくっついて自然に治癒（創傷治癒）する。しかし、治癒の過程で本来は離れているべき組織同士がくっつくことがあり、これを「術後癒着」と呼ぶが、本発明にいう癒着は、このような術後癒着を包含し、広範に、本来離れているべき組織同士や器官（臓器）若しくは組織面が外傷や炎症のためにくっついてしまう状態を意味する。生体内とは、哺乳動物、特にヒトに関するものを意図しており、患者とは哺乳動物、特にヒトを意図している。
＜トリブロックコポリマー＞
　前記式Ｉで表されるトリブロックコポリマーは、上式中、
　各Ｌ1が、好ましくは、独立して、単結合、－Ｓ－（ＣＨ2）c－、－Ｓ－（ＣＨ2）cＣＯ－、－（ＣＨ2）cＳ－、－ＣＯ（ＣＨ2）cＳ－、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
からなる群より選ばれ、ここでｃは１ないし５の整数であり、
　Ｙが、好ましくは、Ｈであるか、または－ＳＨ、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
からなる群から選ばれ、
　Ｒが、独立して、Ｒの総数ｎの中、一般的には２０％、好ましくは５０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは約９０％以上または１００％が２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリジン－１－オキシル－３－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリン－１－オキシル－３－イル及び２，４，４－トリメチル－１，３－オキサゾリジン－３－オキシル－２－イル、２，４，４－トリメチル－１，３－チアゾリジン－３－オキシル－２－イル及び２，４，４－トリメチル－イミダゾリンジン－３－オキシル－２－イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
　ｍは、独立して、好ましくは、３～１００、より好ましくは３～５０の整数であり、そして
　ｎは、好ましくは、５～１０００、より好ましくは１０～２００の整数である、
で表される。
　なお、式Ｉにおける連結基Ｌ１について例示する、例えば－Ｓ－（ＣＨ２）ｃ－等の結合部位が異なる場合、記載されている方向の右側の結合子（当該事例では、（ＣＨ２）ｃ－で表される結合子）を介して式中の酸素原子（Ｏ）に結合し、Ｌ２についてはＲに対してＮＨ－（Ｃ１－６アルキレン）ｑ－の結合子を介して結合する、ことを意味する。
　本発明に関して、Ｃ1-6アルキルまたはそれらを含む基、例えばＣ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオ中のアルキル部分は、限定されるものではないが具体的には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ヘキシル等の分岐もしくは直鎖の低級アルキル基を挙げることができる。
　Ｃ1-6アルキレンは、限定されるものではないが具体的には、メチレン、１，２－プロパンジイル、１，３－プロパンジイル、１，４－ブタンジイル、等の相当するアルキルのジイル基を挙げることができる。
　Ｒ基の環状ニトロキシドラジカルは、好ましくは、
次式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　上式中、Ｒ’はメチル基である、
で表される基を挙げることができる。
　このようなトリブロックコポリマーは、前記ＷＯ２０１３／１１１８０１に記載されており、記載内容は、ここに引用することにより本明細書の内容となる。また、当該国際公開パンフレットに記載の方法で製造できないものは、後述する方法によって効率よく製造することができる
＜ポリアニオン性ポリマー＞
　本発明で用いる、ポリアニオン性ポリマーは、水性溶液中で前記式Ｉ表されるトリブロックコポリマーと安定なポリイオンコンプレックスを形成できるポリアニンオン性有機高分子化合物である。具体的なものとしては、限定されるものでないが、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン酸、ポリアニオン性多糖類、アニオン性タンパク質等からなる群から選ばれる１種またはそれ以上であり、好ましいものとしては、カルボキシメチルデキストラン、カラギーナン、キサンタンガム、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリンからなる群より選ばれるポリアニオン性多糖類、アルブミン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸からなる群より選ばれるアニオン性タンパク質を挙げることができる。特に、アニオン性多糖類が好ましい。これらのポリアニオン性ポリマーの分子量は、ポリマーの種類によって最適値が異なり、限定されるものでない。しかし、ポリアクリル酸の場合、Ｍｎが、１０００～１００００００、好ましくは、１０００～１０００００、より好ましくは、１０００～１００００であり、ポリアニオン性多糖類、例えばコンドロイチン硫酸の場合、ＭｎまたはＭｗが１０００～１００００００、好ましくは１０００～１０００００であり、アニオン性タンパク質、例えば、ポリアスパラギン酸の場合、ＭｎまたはＭｗが１０００～１００００００、好ましくは１０００～１０００００ある。これらは市販のものを、必要に応じて精製して使用することができる。
　また、修飾されたアニオン性ポリマーは、前記ポリアニオン性ポリマー、例えば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、カルボキシメチルデキストラン、キサンタンガム、ヒアルロン酸、ポリアスパラギン酸及びポリグルタミン酸が、それらのカルボキシル基と蛍光色素、例えば、フルオレセイン類、ローダミン類、アレキサフローラ類等のカルボキシル基と共有結合し得る官能基との間で共有結合することにより修飾されたものを意味する。
＜トリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーまたは修飾されたアニオン性ポリマーの使用の態様＞
　トリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーまたは修飾されたアニオン性ポリマーは、それらを含む組成物が、一般的な水性溶液（例えば、純水もしくはイオン交換水中に溶質を溶解もしくは分散させた溶液）中でそれらの分子が会合してミセルを形成することにより、透明なポリイオンコンプレックスミセルとして存在し得る割合で使用することが望ましい。本発明の理解を容易にする目的で、このようなイオンコンプレックスミセルの概念図を図１に示す。このようなミセル溶液は、さらに本発明の目的に沿うためには、水性溶液のイオン強度、ｐＨ、温度等の変化、特に、室温等のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの調製ミセル溶液から生体内環境下または生理学的条件下への変化により、不可逆的ゲルを形成する割合でトリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーまたは修飾されたアニオン性ポリマーが含められる必要がある。このような変化は、例えば、イオン強度が、イオン濃度０（ゼロ）もしくは数十ｍＭからイオン濃度１５０ｍＭのように変化することにより、また、温度の変化は、通常室温で前記ミセルが形成されるが、３７℃程度以上に上昇することを意味する。したがって、本発明により提供される組成物は、生体内滞留性を示し、一方で、トリブロックコポリマーが担持する環状ニトロキシドラジカル化合物が活性酸素を消去し得るので、炎症を伴う組織または器官の癒着を効果的に防止できる。また、トリブロックコポリマーと修飾されたアニオン性ポリマーを含む組成物は、前記生体内滞留性を示し、かつ、修飾基または部分により当該組成物（ポリイオンコンプレックス）の生体内での挙動を検出することを可能にする。このような検出には、ＩＶＩＳイメージングを適用できる。
　このような割合は、トリブロックコポリマーのアミノ基（もしくはイミノ基）のモル数とポリアニオン性ポリマーまたは修飾されたアニオン性ポリマーのアニオン性基のモル数が１：４～４：１、好ましくは、１：１～４：１であり、より好ましくは前者のモル数が後者のモル数を超えるものである。
　前記組成物から形成されたポリイオンコンプレックスは、必要により、生理学的に許容され得る希釈剤または賦形剤を含むポリイオンコンプレックスミセルの水溶液として提供できる。このような希釈剤は、滅菌水、鉱酸を含む酸性水溶液、生理食塩水、生理学的に許容される緩衝剤を含む溶液等であることができ、賦形剤は、例えば、ソルビトール、デキストリン、ブドウ糖、マンニトール、アミノ酸（例えば、グリシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、グルタミン酸等）等であることができる。このように調製される製剤の有効量は、後述するような実験動物を用いる効能試験等の結果に基づき、専門医師が容易に決定できる。
　本発明では、組成物が前記のポリイオンコンプレックス、特に、そのミセル溶液は、必要により、当該技術分野で公知の滅菌方法、電子線照射等、により滅菌した後、生体内の組織または器官の癒着を防止もしくは抑制する必要のある局所に適用または投与される。かような適用は、注射器等の適当な注入用具を用いて注入可能であるので、標的とする特定の局所を選択する際に制限を受けない。
＜新規なトリブロックコポリマー＞
　式Ｉ中のＬ1が、独立して
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
からなる群より選ばれ、かつ、
Ｙが、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオまたはＳＨからなる群より選ばれる、トリブロックコポリマー、すなわち、下式ＩＩ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
式中、Ｌ1’は、独立して
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
からなる群より選ばれ、
Ｙが、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオまたはＳＨからなる群より選ばれる、かつ、
Ｌ2、Ｒ、ｍ及びｎは、上記式Ｉについて定義したとおりである、
で表されるトリブロックコポリマーは、ＷＯ２０１３／１１１８０１に記載されておらず、また、本発明者等の知る限り、従来技術文献に未載の新規化合物である。
　このようなトリブロックコポリマーは、例えば、次式ａ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
式中、Ｌ1’およびｎは上記式ＩＩについて定義したとおりであり、ＣＴＡは連鎖移動剤、例えば、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオからなる群より選ばれる、
で表される両末端が修飾されたポリ（エチレングリコール）またはポリ（オキシエチレン）誘導体に対し、不活性溶媒、例えばトルエン等中で、ラジカル源としてのアゾ化合物、例えば、２，２’―アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）の存在下、２０～８０℃にて、１８～２４時間、クロロメチルスチレン
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
を重合させることにより、次式ｂ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
式中、ＣＴＡ、Ｌ1’、ｍおよびｎは、上記定義のとおりである
で表されるトリブロックコポリマー前駆体を得、次いで、
　　Ｈ2Ｎ－（Ｃ1-6アルキレン）q－Ｒ
　　式中、Ｒは式Ｉについて定義したとおりである
で表されるアミンと、溶媒、例えばジメチルフォルムアミド中で、必要により、脱ハロゲン化水素剤、例えば、ピリジンの存在下、室温～７０℃にて、３～７２時間反応させ、さらに必要により、還元条件下で処理することにより、提供できる。
　これらの方法は、ＷＯ２０１３／１１１８０１に記載されたトリブロックコポリマーの製造方法に比べて製造コストの点で商業的規模での製造に適し、また、ポリマー自体も分子量や分散度をより効果的に制御できる点で、利点を有している。
　したがって、本発明は、本発明の組成物を製造するためのかようなトリブロックコポリマー、その前駆体、および製造方法にも関する。
本発明にしたがうイオンコンプレックスミセルの概念図である。 製造例１で得られたＰＣＭＳ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＭＳトリブロックコポリマーのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と1Ｈ　ＮＭＲスペクトル測定の結果を表す図である。 製造例１で得られたＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴトリブロックコポリマーのＳＥＣ測定と1Ｈ　ＮＭＲスペクトルの測定結果を表す図である。 製造例２で得られたＢｒ－ＰＥＧ－ＢｒポリマーのＳＥＣ測定と1Ｈ　ＮＭＲスペクトルの測定結果を表す図である。 製造例２で得られたＣＴＡ－ＰＥＧ－ＣＴＡポリマーのＳＥＣ測定と1Ｈ　ＮＭＲスペクトルの測定結果を表す図である。 製造例２で得られたＰＣＭＳ－ＰＥＧ－ＰＣＭＳトリブロックコポリマーのＳＥＣ測定と1Ｈ　ＮＭＲスペクトルの測定結果を表す図である。 製造例２で得られたＰＭＮＴ－ＰＥＧ－ＰＭＮＴトリブロックコポリマーのＳＥＣ測定と1Ｈ　ＮＭＲスペクトルの測定結果を表す図である。 製造例１で調製したポリイオンコンプレックスミセル（ＰＭＮＴ－ＰＥＧ－ＰＭＮＴ＋ＣＳ）の粒径分布を表す図である。縦軸は強度（％）を表し、横軸は粒子サイズを表す。 製造例２で調製したポリイオンコンプレックスミセルの粒径分布を表す図である。縦軸は強度（％）を表し、横軸は粒子サイズを表す。 製造例１（１）のゲル化の状態を示す図面に代わる写真である。 製造例１（２）のゲル化の状態を示す図面に代わる写真である。 製造例１で調製したポリイオンコンプレックスミセル（ＰＭＮＴ－ＰＥＧ－ＰＭＮＴ＋ＰＡＡ）の粒径分布を表す図である。縦軸は強度（％）を表し、横軸は粒子サイズを表す。 製造例１で調製したポリイオンコンプレックスミセル（ＰＭＮＴ－ＰＥＧ－ＰＭＮＴ＋ＰＡＡ）のゲル化の状態を示す図面に代わる写真である。 製造例１で調製したポリイオンコンプレックスミセル（ＰＭＮＴ－ＰＥＧ－ＰＭＮＴ＋ＰＡＡ）のゲル化の状態を示す図面に代わる写真である。 製造例１で調製したポリイオンコンプレックスミセル（ＰＭＮＴ－ＰＥＧ－ＰＭＮＴ＋ＣＳ）の癒着防止効果を示す写真である。 試験２を行う際の実験手順を示す図である。 試験２で使用した癒着スコアシステムに関する図である。 試験２におけるスコアシステムによる癒着レベルの定量評価を表す図である。 試験２における腹膜切片の活性酸素産生評価の図である。 試験２における腹膜切片の組織観察図である。 試験２における腹膜切片の膜厚測定結果を表す図である。 試験２におけるＭＰＯ活性評価の図である。 試験３を行う際の実験手順に関する図である。 試験３で使用した癒着スコアシステムに関する図である。 試験３におけるスコアシステムによる癒着レベルの定量評価を表す図である。 試験３における血中白血球数を表す図である。 試験３における腹膜切片の活性酸素産生評価の図である。 試験３における腹膜切片のＭＰＯ活性評価の図である。 試験３における脂質過酸化量評価の図である。 製造例３(２)及びゲル化の概念図である。 製造例３(２)のイオンコンプレックスのゲル化試験の結果を示す図に代わる写真である。 試験４における各サンプルのイメージングの結果を示す図面に代わる画像写真である。 試験４における各サンプルの残存量を示す定量データのグラフ表示である。
　以下に、具体例を挙げ、さらに本発明をより具体的に説明するが、これらの具体例に本発明を限定することを意図するものではない。
Ａ．ポリクロロメチルスチレン－ｂ－ポリエチレングリコール－ｂ－ポリクロロメチルスチレントリブロックコポリマー及びその環状ニトロキシドラジカルの修飾化合物、並びに該修飾化合物とポリアニオン性ポリマー（イオンコンプレックス）及びその使用について
＜製造例１＞
（１）　ポリクロロメチルスチレン－ｂ－ポリエチレングリコール－ｂ－ポリクロロメチルスチレン（ＰＣＭＳ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＭＳ）トリブロックコポリマーの合成
　ＰＣＭＳ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＭＳは、次の合成スキーム１に従い合成した：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　両末端にチオール基を有しているポリエチレングリコール（ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ）（Ｍｎ：１００００；０．１０７ｍｍｏｌ，１．０７ｇ）を反応容器に加えた。次に、反応容器中を真空にした後、窒素ガスを吹き込む操作を３回繰り返すことにより、反応容器内を窒素雰囲気にした。反応容器に２，２’－アゾビスイソブチロニトリル／トルエン（０．１０７ｍｍｏｌ／１０ｍｌ）溶液とクロロメチルスチレン（８．０３ｍｍｏｌ，１．１３ｍｌ）を加え、６０℃まで加熱し、２４時間攪拌した。反応混合物をポリクロロエチルスチレンホモポリマーに対しての良溶媒であるジエチルエーテルを用いて３回洗浄操作を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行い、白い粉体を得た。収量は、１．２８ｍｇであり、収率は９０．３％であった。得られたＰＣＭＳ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＭＳトリブロック共重合体のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と1Ｈ　ＮＭＲスペクトルの結果を図２に示す。
（２）　２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イル（ＴＥＭＰＯ）を有するトリブロックポリマー（ＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ）の合成
　反応容器に、上記（１）で得られる、ＰＣＭＳ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＭＳ（Ｍｎ：１３２６３；１．１２ｇ，０．０８４ｍｍｏｌ）を加えた。次に、４－アミノ－ＴＥＭＰＯ（１．５４５ｇ，０．４２２ｍｍｏｌ）を２０ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、反応容器に加え、室温で２４時間攪拌を行った。反応終了後、反応溶液を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｃｕｔ－ｏｆｆ　ｓｉｚｅ　３，５００　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ　ＴＸ）中に加え、２Ｌのメタノールに対して透析を行った。メタノールは２時間ごとに８回交換し、エバポレーションを行い、ベンゼン凍結乾燥を行った。収率は、９０．１％であった。　1Ｈ　ＮＭＲ測定の結果より、クロロメチル基が１００％反応し、ＴＥＭＰＯが導入されていることが認められた（図３参照）。
＜製造例２＞
（１）　Ｂｒ－ＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））－Ｂｒの合成
　Ｂｒ－ＰＥＧ－Ｂｒは、次の合成スキーム２に従い合成した：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　両末端にヒドロキシル基を有しているポリ（エチレングリコール）（ＨＯ－ＰＥＧ－ＯＨ）（Ｍｎ：１００００：５０ｇ）を１１０℃で１２時間減圧乾燥し脱水した。次にテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２００ｍｌ加え、そこへブチルリチウム１０ｍｌ（１６ｍｍｏｌ）とジブロモキシレン２５ｇを加えて５０℃、２４時間反応させることにより両末端がブロモ化したＢｒ－ＰＥＧ－Ｂｒを得た。得られたポリマーは２－プロパノールに沈殿し、真空乾燥することで精製し。得られたＢｒ－ＰＥＧ－Ｂｒのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と1Ｈ―ＮＭＲスペクトルの結果を図４に示す。
（２）ＣＴＡ（連鎖移動剤（Ｃｈａｉｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ａｇｅｎｔ））―ＰＥＧ－ＣＴＡ（Ｃｈａｉｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ａｇｅｎｔ）の合成（ジチオフェニルエステル両末端化ＰＥＧの合成）
ＣＴＡ－ＰＥＧ－ＣＴＡは、次の合成スキーム３に従い合成した：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　ＴＨＦ５０ｍｌに二硫化炭素を２．４ｍｌ加えた。次いで、ベンジルマグネシウムブロミド６．７ｍｌ（２０ｍｍｏｌ）を氷冷化で徐々に加えて反応させ、マグネシウムベンゾチオブロマイドを得た。製造例２（１）で合成したＢｒ－ＰＥＧ－Ｂｒ　５０ｇをＴＨＦ２００ｍｌに溶かし作製したマグネシウムベンゾチオブロマイドを全て加え、６０℃、２４時間反応させることで、目的物質であるＣＴＡ（Ｃｈａｉｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ａｇｅｎｔ）―ＰＥＧ－ＣＴＡ（Ｃｈａｉｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ａｇｅｎｔ）を得た。得られたＣＴＡ－ＰＥＧ－ＣＴＡは２－プロパノールで沈殿し、真空乾燥で精製した。得られたポリマーのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と1Ｈ―ＮＭＲスペクトルの結果を図５に示す。
（３）　ポリクロロメチルスチレン－ｂ－ポリエチレングリコール－ｂ－ポリクロロメチルスチレン（ＰＣＭＳ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＭＳ）トリブロックコポリマーの合成
　ＰＣＭＳ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＭＳは、次の合成スキーム４に従い合成した：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
製造例２（２）で合成したＣＴＡ－ＰＥＧ－ＣＴＡ　１０ｇとアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）６０ｍｇを窒素雰囲気下でトルエンを２００ｍｌ加えて、クロロメチルスチレン（ＣＭＳ）を１５ｍｌ加え、６０℃、２４時間攪拌することで、目的物質であるＰＣＭＳ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＭＳを得た。得られたポリマーは２―プロパノールで沈殿し、減圧乾燥にて精製した。得られたＰＣＭＳ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＭＳのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と1Ｈ―ＮＭＲスペクトルの結果を図６に示す。
（４）　２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イル（ＴＥＭＰＯ）を有するトリブロックコポリマー（ＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ）の合成
　ＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴは、次の合成スキーム５に従い合成した：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　製造例２（３）で合成したＰＣＭＳ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＭＳ　５ｇと４－アミノ　ＴＥＭＰＯ　７．７ｇをＤＭＳＯに溶解し、５０℃で撹拌し、反応させることで目的物質であるＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ－ＰＭＮＴｂ－ＰＭＮＴを得た。得られたＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ―ｂ－ＰＭＮＴは２―プロパノールに沈殿し、減圧乾燥にて精製した。ポリマーのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と1Ｈ―ＮＭＲスペクトルの結果を図７に示す。
＜実施例１＞　ポリイオンコンプレックスミセルの作製
　製造例１（４）で得られたＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴトリブロックポリマーの粉末を０．１Ｍ　ＨＣｌ水溶液に溶解し、ＰＭＮＴ鎖のアミノ基を完全にプロトン化させ、水系の凍結乾燥を行い回収した。次に、ＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴトリブロックポリマーとコンドロイチン硫酸（ＣＳ；Ｍｗ：６０ｋ）をそれぞれＮａ2ＨＰＯ4バッファー（０．１Ｍ）に溶解し、濃度を５ｍｇ／ｍｌにしたカチオンＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ水溶液とアニオンＣＳ水溶液を調製した。さらに、ＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ水溶液をコンドロイチン硫酸水溶液に撹拌したなら滴下し、ｐＨが３．０、４．０、５．０、６．０と条件を変えたポリイオンコンプレックスミセルを調製した。ここで、ＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴとＣＳのモル比ｒ＝１：１となるように、ポリイオンコンプレックスミセルを調製した（モル比ｒ＝［ＣＳの活性化されたカルボキシル基のモル数］／［ＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴの活性化されたアミノ基のモル数］）。得られたポリイオンコンプレックスミセルの平均粒径を動的光散乱（ＤＬＳ）測定により行ったところ、平均粒径が４５～６０ｎｍの単峰性の粒子であることが確認された。また、図８に粒径の分布を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
＜実施例２＞　ポリイオンコンプレックスミセルの作製
　製造例２（４）で得られたＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴトリブロックコポリマー１００ｍｇをメタノールに溶解し、そこへ水に溶解したポリアクリル酸（ＰＡＡ；Ｍｗ：５ｋ）１７．２ｍｇを加えた。次いで、この溶液を水に対して透析することによって、ポリイオンコンプレックスミセルを作製した。得られたポリイオンコンプレックスミセルの平均粒径を動的光散乱（ＤＬＳ）測定により行ったところ、平均粒径が３１ｎｍの単峰性の粒子であることが確認された（図９参照）。
＜実施例３＞　インジェクタブルゲルの調製
　（１）実施例１で作製した各ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ミセル溶液５ｍｇ／ｍｌを遠心エバポレーションにより濃縮し、イオン強度を１５０ｍＭに調整し、温度３７℃の水浴中でゲル化実験を試験管反転法により検討した。実験の結果を示す図面に代わる写真を図１０に示す。この図から、ｐＨ４．０のＰＩＣミセル溶液で、イオン強度１５０ｍＭかつ温度３７℃の環境下で不可逆的ゲルが形成したことが確認される。
　（２）また、ポリカチオン（Ｎ+）とポリアニオン（ＣＯＯ-）の比を、１：１、２：１および１：２とし、ｐＨを５．０にしたこと以外（１）に記載の試験管反転法を繰り返した。その結果を示す図面に代わる写真を図１１に示す。ポリカチオンの割合を増加させることにより凝集体が生じていたｐＨ値（ｐＨ　５．０）においても不可逆的ゲル化が起こることが確認された。
＜実施例４＞　ポリイオンコンプレックスミセルの作製
　製造例１（２）で得られたＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴトリブロックポリマーの粉末１ｇを０．１Ｍ　ＨＣｌ水溶液に溶解し、ＰＭＮＴ鎖のアミノ基を完全にプロトン化させ、水系の凍結乾燥を行い回収した。次に、ＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴトリブロックポリマーとポリアクリル酸（ＰＡＡ；Ｍｗ：５ｋ）をそれぞれリン酸バッファー（０．１Ｍ）に溶解し、濃度を５ｍｇ／ｍｌにしたカチオンＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ水溶液とアニオン性ＰＡＡ水溶液を調製した。さらに、ＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴトリブロックポリマー水溶液をポリアクリル酸水溶液に撹拌しながら滴下し、ｐＨ＝６．２のポリイオンコンプレックスミセルを調製した。ここで、ＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴとＰＡＡのモル比ｒ＝１：１となるように、ポリイオンコンプレックスミセルを調製した（モル比ｒ＝［ＰＡＡの活性化されたカルボキシル基のモル数］／［ＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴの活性化されたアミノ基のモル数］）。得られたポリイオンコンプレックスミセルの平均粒径を動的光散乱（ＤＬＳ）測定により決定したところ、平均粒径が４０～５０ｎｍ程度の単峰性の粒子であることが確認された（図１２参照）。
＜実施例５＞　インジェクタブルゲルの調製
　実施例４で作製した各ポリイオンコンプレックスミセル溶液５ｍｇ／ｍｌを遠心エバポレーションにより濃縮し、イオン強度を１５０ｍＭに調整し、温度３７℃の水浴中でゲル化実験を試験管反転法により検討した。ｐＨ４．０またはｐＨ６．２のＰＩＣミセル溶液で、イオン強度１５０ｍＭかつ温度３７℃の環境下で不可逆的ゲル化したことが確認された（それぞれ、図１３または図１４参照）。
＜試験１＞　レドックスインジェクタブルゲルによる癒着防止能評価実験（動物実験）
　実施例３（２）にしたがって作製したＰＩＣミセル（ｐＨ５、Ｎ+：ＣＯＯ-＝２：１）を癒着モデルマウスに対して腹腔内投与して癒着防止効果の評価を行った。
　具体的には、ＩＧＳマウス（ｎ＝３，２５～３０ｇ）の腹腔内に炎症を引き起こし、癒着を生じさせるタルク（Ｔａｌｃ：１００ｍｇ／ｍｌ）を腹腔内注射により３００μｌ投与し、１日後サンプル（ＰＢＳ、ＰＩＣミセル（３０ｍｇ／ｍｌ））を同様に腹腔内に５００μｌ投与した。サンプルの投与から４日後、ＩＧＳマウスの腹部を開腹し癒着の程度を確認した（結果を示す図面に代わる写真を図１５に示す）。ＰＢＳを投与した場合（図１５左）、臓器間（肝臓や小腸）において強固な癒着が見られる一方、ＰＩＣミセルを投与したマウスでは癒着が見られないことが確認できる。このことから生体環境下においてゲル化したＰＩＣミセルが癒着防止効果を示す材料として使用できることが理解できる。
＜試験２＞　レドックスインジェクタブルゲル（ＲＩＧ）による癒着防止能評価実験（動物実験）
　実施例４に従って作製したポリイオンコンプレックスミセル（ｐＨ６．２，Ｎ+：ＣＯＯ-＝１：１）を癒着モデルマウスに対し腹腔内投与し癒着防止効果およびＲＩＧの有する活性酸素除去能による抗炎症効果を評価した。実験手順については図１６を参照されたい。
　ＩＧＳマウス（ｎ＝８，２５～３０ｇ）に癒着剤としてタルク（１００ｍｇ／ｍｌ）を３００μｌ腹腔内に投与し炎症を誘発させることによって癒着モデルマウスを作製した。ＲＩＧによる癒着防止の評価のため、作製したＲＩＧ（３０ｍｇ／ｍｌ）を３００μｌ同様に腹腔内投与（Ｔａｌｃ投与の１日後）し時間経過をおって（Ｔａｌｃ投与の２日後、５日後）に評価を行った。本試験で使用したマウスの実験群としては健常（Ｈｅａｌｔｈｙ群（Ｎｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ））、Ｔａｌｃ群（Ｔａｌｃのみ腹腔内投与）、Ｔａｌｃ＋ＲＩＧ群（Ｔａｌｃ投与後、ＲＩＧを投与）である。
試験結果１：癒着スコアシステムによる癒着レベルの比較
　腹部を開腹、腹腔内を観察し図１７に示すスコアシステムにしたがい、癒着の程度をスコア別に分類した（腸をピンセットで持ち上げた際にどの程度の臓器と接着、癒着を形成しているか評価）。
　それぞれの群をスコア（Ｓｃｏｒｅ）別に評価した結果を図１８に示す。図より、Ｔａｌｃ投与群においては腹腔内で激しい癒着が見られた。また５日後の結果においてＴａｌｃ投与群とＴａｌｃ＋ＲＩＧ投与群において癒着スコアに有意差が見られ、ＲＩＧによる癒着防止効果が確認された。
試験結果２：ＲＩＧによる活性酸素除去能評価
　上記にしたがって作製したＲＩＧの活性酸素（ＲＯＳ）除去能を蛍光測定により評価した。具体的にはマウスの腹膜切片を採取し、ＰＢＳ（１ｍｌ）中で組織をホモジナイズしたのち遠心分離し（１００００ｒｐｍ，１０分，４℃）、上澄み（１００ｕｌ）に１ｍＭのジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）を１００μｌ加え蛍光測定（ｅｘ＝５３０ｎｍ，ｅｍ＝６２０ｎｍ）により活性酸素の産出を定量評価した（図１９参照）。
　図より、Ｔａｌｃ投与群においてＲＯＳの産出が確認され、ＲＩＧを投与した群においてはＲＯＳの産出を低減させた。このことにより炎症部位に発生している酸化ストレスをＲＩＧが抑制させる効果があるものと理解できる。
試験結果３：腹膜切片の膜厚測定
　Ｔａｌｃの投与により炎症が生じた部位からは好中球やマクロファージの浸潤に伴い、繊維が堆積し膜厚が増加することが報告されている。本実験では腹膜切片を採取し１０％ホルマリンに１日、７０％エタノールに２日浸したのち、腹膜を７μｍに切り出しマッソントリクローム（ＭＴ）染色にて組織切片の観察および膜厚測定を行った。結果を図２０及び図２１に示す。
　これらの図より、Ｔａｌｃ投与群においては激しい繊維の堆積が見られ、炎症が生じていることが確認された。一方Ｔａｌｃ＋ＲＩＧの投与群においては膜厚の減少（Ｔａｌｃ投与群との有意差も確認された）がみられＲＩＧの有する抗酸化作用による抗炎症効果が示唆される。
試験結果４：ＭＰＯ活性評価
　炎症性バイオマーカーとして知られるミオペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を評価した。マウスから腹膜切片を採取し、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０，Ｉｎｖｏｌｖｅｄ　０．５％　ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）１ｍｌ中でホモジナイズ、遠心分離（１００００ｒｐｍ，１０分，４℃）した。上澄み１０μｌに対して、５０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６）１９０μｌ，０．５％　ｏ－ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ　５ｕｌ，２０ｍＭ　Ｈ2Ｏ2　５μｌ加えて吸光度測定（ａｂｓ　４６０ｎｍ）を行った。それぞれの組織の全タンパク質量はＢＣＡ　ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）により産出し、等量タンパク質量当たりのＭＰＯ活性の値を評価した。結果を図２２に示す。
　図より、Ｔａｌｃ投与群とＴａｌｃ＋ＲＩＧ投与群にいてＭＰＯ活性の値に有意差が見られ、ＲＩＧによる抗炎症能が確認された。また図１９、図２１と比較して同様の傾向が見られたことから、ＲＩＧの抗酸化能が抗炎症作用に大きく寄与し局所炎症部位での治療効果に大きく貢献したものと考えられる。
＜試験３＞　癒着防止効果（市販セプラフィルム*（Ｓｅｐａｒａｆｉｌｍ）との比較）
　　　*科研製薬株式会社製：カルボキシセルロースとヒアルロン酸ナトリウ
　　　ムからなるフィルム型の生体吸収性癒着防止材
　５週齢ＩＧＳマウス（２５－３０ｇ）に３００μｌのタルク分散液（１００ｍｇ／ｍｌ）を腹腔に投与した。一日後に開腹し、下記に示すサンプルを塗布または留置し開腹部を閉じた。５日後開腹し、臓器癒着を評価した。実験手順については図２３を参照されたい。
＜サンプル＞
群１：　無処理コントロール
群２：　開腹未処置
群３：　開腹後ＮＨ2－ＴＥＭＰＯ水溶液（６．４ｍｇ／ｍｌ）を３００μｌ
　　　　腹腔内に塗布し開腹部を閉じた。
群４：　開腹後ｎＲＩＧ（抗酸化能を有さないインジェクタブルゲル、３０
　　　　ｍｇ／ｍｌ水溶液）を腹腔内に塗布し、開腹部を閉じた。
群５：　開腹後ＲＩＧ（３０ｍｇ／ｍｌ水溶液）を腹腔内に塗布し、開腹部
　　　　を閉じた。
群６：　開腹後市販セプラフィルム（５ｍｍｘ５ｍｍを二枚）腹腔内に留置
　　　　し、開腹部を閉じた。
群７：　開腹後、６．４ｍｇ／ｍｌのＮＨ2－ＴＥＭＰＯ溶液７５μｌを市販
　　　　セプラフィルム両面にそれぞれ塗布、乾燥させたのち（５ｍｍｘ５
　　　　ｍｍを二枚）腹腔内に留置し、開腹部を閉じた。
群８：　開腹後、３０ｍｇ／ｍｌのＲＩＧ溶液７５μｌを市販セプラフィル
　　　　ム両面にそれぞれ塗布、乾燥させたのち（５ｍｍｘ５ｍｍを二枚）
　　　　腹腔内に留置し、開腹部を閉じた。
　５日後に開腹、臓器癒着を図２４に示すようにスコア化し、図２５にまとめた。この図に示すように本発明のＲＩＧおよびＲＩＧをコートしたセパラフィルムは優位に癒着抑制効果を有することが認められる。市販のセパラフィルムはある程度の癒着防止効果が見られるものの、有意差が見られなかった。フィルムの移動が見られ、ばらつきが大きくなることが原因とみられる。
　次に、これらの処置マウスを開腹後、血液を採取し、白血球量を調べた。結果を図２６に示す。ＲＩＧおよびＲＩＧコートセパラフィルムは血中白血球量が有意に抑えられ，全身への炎症拡散が抑制されていることが解かる。
　次に、これらの処置マウスの５日後の腹膜を採取し、活性酸素量、ＭＰＯ活性（好中球の浸潤）およびＭＤＡ量（脂質過酸化量）を定量した。結果を、それぞれ図２７、２８および２９に示す。いずれの場合もＲＩＧおよびＲＩＧコートセパラフィルムにおいて、各測定値が有意に低下しており、優位性が示された。
Ｂ．Ａのイオンコンプレックスにおけるアニオン性ポリマーが標識を担持するように修飾されたもので置き換わったイオンコンプレックスの製造、及びその使用について
＜製造例３＞
（１）フルオレセインを担持したポリアクリル酸（ＰＡＡ-ＦＬ）の合成
　ＰＡＡ-ＦＬの合成は次の合成スキーム５に従い合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 　０．０４ｍｍｏｌのポリアクリル酸(分子量５０００ｇ／ｍｏｌ)を５ｍｌのＨ２Ｏに、０．２ｍｍｏｌの５-アミノフルオレセイン（５-Ａｍｉｎｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を５ｍｌのＤＭＳＯにそれぞれ溶解させた。これら２つの溶液を混合し、０．４ｍｍｏｌの塩酸１-エチル－３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え２４時間撹拌した。その後、０．１ＭのＨＣＬ溶液を加え、ｐＨを７．０に調整し、透析膜（ＭＷＣＯ=３５００）中に入れて、２Ｌの水に対して透析を行い未反応のアミノフルオレセインを除去した。水は２時間ごとに８回交換し、水系凍結乾燥にて凍結乾燥を行い、ＰＡＡ-ＦＬを回収した。合成したＰＡＡ-ＦＬをリン酸バッファーに溶解させた後、ＰＤ１０カラムに通すことで精製の確認を行い、未反応のアミノフルオレセインが除去されたことを確認した。
（２）フルオレセインを担持したレドックスインジェクタブル（ＦＬ-ＲＩＧ）の作製
　ＷＯ２０１３／１１１８０１に記載された方法により合成したＰＭＮＴ-ｂ-ＰＥＧ-ｂ-ＰＭＮＴトリブロックポリマー（前記式（Ｉ）中のＬ１が－Ｓ－ＣＨ２－であり、Ｌ２が－ＣＨ２－ＮＨ－であり、Ｒが４-アミノＴＥＭＰＯに由来する基であり、ＹがＨであり、ｍ及びｎがそれぞれ約２２及び約４５４である）とＰＡＡ-ＦＬをそれぞれリン酸バッファー（０．１Ｍ）に溶解し、濃度を５ｍｇ／ｍｌに調整したカチオンＰＭＮＴ-ｂ-ＰＥＧ-ｂ-ＰＭＮＴ水溶液と濃度を５ｍｇ／ｍｌに調整したアニオン性ＰＡＡ-ＦＬ水溶液を調製した。こうして、それぞれ調製したＰＭＮＴ-ｂ-ＰＥＧ-ｂ-ＰＭＮＴトリブロックポリマー水溶液をポリアクリル酸水溶液に撹拌しながら滴下しｐＨ=６．２のポリイオンコンプレックスミセルを作製した。ここでは、ＰＭＮＴ-ｂ-ＰＥＧ-ｂ-ＰＭＮＴとＰＡＡのモル比ｒ＝１：１となるように、ポリイオンコンプレックスミセルが調製された（モル比ｒ＝［ＰＡＡの活性化されたカルボキシル基のモル数］／［ＰＭＮＴ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴの活性化されたアミノ基のモル数]）。
　＜ゲル化＞
　前述のように作製したポリイオンコンプレックスミセル溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を遠心エバポレーションにより濃縮（３０ｍｇ／ｍｌ）し、イオン強度を１５０ ｍＭに調整し、温度３７℃の水浴中でゲル化実験を試験管反転法により検討した。
　なお、製造例３（２）及びゲル化に関する概念図を図３０に示す。
　上記検討の結果、３７℃の条件下で不可逆的ゲル化が確認された(図３１）。比較のため、同様の手順でＰＥＧ-ｂ-ＰＭＮＴポリマー（ＷＯ２００９／１３３６４７に記載されているか、或は記載された方法により製造される）とＰＡＡ-ＦＬからレドックスナノ粒子溶液（３０ｍｇ／ｍｌ）を作製した。この比較例の水溶液は上記のゲル化実験により生体条件下でゲル化挙動を示さなかった。
＜試験４＞ 製造例３（２）のレドックスインジェクタブルゲル（ＲＩＧ-ＦＬ）の腹腔内滞留性評価 （ＩＶＩＳイメージングを用いたＲＩＧ腹腔内滞留性評価）
　低分子蛍光物質(アミノフルオレセイン:ＡＦＬ）、ＦＬを担持したレドックスナノ粒子溶液（ＦＬ-ＲＮＰ）およびＦＬを担持したレドックスインジェクタブルゲル（ＦＬ-ＲＩＧ）を使用し、以下のスキームにて腹腔内滞留性を評価した。
　Ｎｕｄｅマウス（ｎ＝４、２５～３０ｇ）を使用し、飼料からの蛍光検出を防ぐためオリエンタル酵母株式会社より購入したＩＶＩＤ♯２を実験開始１週間前に与えて実験を行った。イソフルランの吸入麻酔下にてマウスの腹部を開腹し、サンプル（ＡＦＬ，ＦＬ-ＲＮＰ（ミセル濃度３０ｍｇ／ｍｌ），ＦＬ-ＲＩＧ（ミセル濃度３０ｍｇ／ｍｌ））を３００μｌ投与し腹部を縫合した。腹腔内滞留性評価方法としては、サンプルに担持したフルオレセインの蛍光（励起波長：５００ｎｍ, 蛍光波長：５４０ｎｍ）を投与直後から各タイムポイントでイメージングすると共に、投与直後の蛍光強度からの蛍光減少を定量することで腹部に残存しているサンプル量を評価した。イメージングの際にはイソフルランでの麻酔下にてイメージングを行った。各サンプルのイメージング画像を図３２に、サンプルの残存量を示す定量データを図３３に示す。ＲＩＧ投与群において、腹腔内でのゲル化により滞留性が向上し、対照群（ＡＦＬ，ＦＬ-ＲＮＰ）と比較して有意差が見られた。これらの結果は作製したＲＩＧが腹腔内で組織間の接触を抑制し、癒着防止剤としての高い機能を発揮することを示唆する。
　本願明細書に開示する本発明のポリイオンコンプレックスミセルが癒着防止効果を示すことが確認されたことから理解できるように、本発明は、医療に用いることのできる癒着防止用製剤を製造、販売する産業で利用できる。

Claims (19)

  1. 　トリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーを含む組成物を有効成分として含んでなる癒着防止用製剤であって、
    該トリブロックコポリマーが式Ｉ
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　式中、
    　Ｌ1は、同一または異なる連結基を表し、
    　Ｌ2は、独立して、－Ｃ1-6アルキレン－ＮＨ－（Ｃ1-6アルキレン）q－であり、ここでｑは０または１の整数であり、そして
    　Ｒは、独立して、Ｒの総数ｎの少なくとも２０％が２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリジン－１－オキシル－３－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリン－１－オキシル－３－イル及び２，４，４－トリメチル－１，３－オキサゾリジン－３－オキシル－２－イル、２，４，４－トリメチル－１，３－チアゾリジン－３－オキシル－２－イル及び２，４，４－トリメチル－イミダゾリンジン－３－オキシル－２－イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
    　Ｙは、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオからなる群より選ばれ、
    　ｍは、独立して、３～１，０００の整数であり、そして
    　ｎは、２０～５，０００の整数である、
    で表され、かつ、
    該アニオン性ポリマーがポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン酸、ポリアニオン性多糖類、アニオン性タンパク質からなる群より選ばれる１種またはそれ以上である、
    癒着防止用製剤。
  2. 　Ｌ1が、独立して、単結合、－Ｓ－（ＣＨ2）c－、－Ｓ－（ＣＨ2）cＣＯ－、－（ＣＨ2）cＳ－、－ＣＯ（ＣＨ2）cＳ－、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     からなる群より選ばれ、ここでｃは１ないし５の整数である、請求項１に記載の癒着防止用製剤。
  3. 　ＹがＨであるか、または
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     からなる群から選ばれる、請求項１に記載の癒着防止用製剤。
  4. 　Ｒが、次式
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     　式中、Ｒ’はメチル基である、
    表される基から選ばれ、Ｒの総数ｎの少なくとも８０％を前記式で表される基が占める、請求項１に記載の癒着防止用製剤。
  5. 　アニオン性ポリマーが、ポリアニオン性多糖類である、請求項１～４のいずれか１項に記載の癒着防止用製剤。
  6. 　アニオン性ポリマーが、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸からなる群より選ばれる請求項１に記載の癒着防止用製剤。
  7. 　ポリアニオン性多糖類が、カルボキシメチルデキストラン、カラギーナン、キサンタンガム、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリンからなる群より選ばれる１種または２種以上の混合物である、請求項５に記載の癒着防止用製剤。
  8. 　トリブロックコポリマーのアミノ基のモル数とポリアニオン性ポリマーのアニオン性基のモル数が、１またはそれを超える数：１である、請求項１～６のいずれかに記載の癒着防止用製剤。
  9. 　生理学的水性条件下で不可逆的ゲルを形成する、請求項１～７のいずれかに記載の癒着防止用製剤。
  10. 　生体内組織または器官の癒着防止用製剤を製造するためのトリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーを含む組成物の使用であって、
    　該トリブロックコポリマーが式Ｉ
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     　式中、
    　Ｌ1は、同一または異なる連結基を表し、
    　Ｌ2は、独立して、－Ｃ1-6アルキレン－ＮＨ－（Ｃ1-6アルキレン）q－であり、ここでｑは０または１の整数であり、そして
    　Ｒは、独立して、Ｒの総数ｎの少なくとも２０％が２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリジン－１－オキシル－３－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリン－１－オキシル－３－イル及び２，４，４－トリメチル－１，３－オキサゾリジン－３－オキシル－２－イル、２，４，４－トリメチル－１，３－チアゾリジン－３－オキシル－２－イル及び２，４，４－トリメチル－イミダゾリンジン－３－オキシル－２－イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
    　Ｙは、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオからなる群より選ばれ、
    　ｍは、独立して、３～１，０００の整数であり、そして
    　ｎは、２０～５，０００の整数である、
    で表され、かつ、
    該アニオン性ポリマーがポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン酸、ポリアニオン性多糖類、アニオン性タンパク質からなる群より選ばれる１種またはそれ以上である、使用。
  11. 　投与を必要とする生体内局所にトリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーを含む組成物を患者における組織または器官の癒着防止に有効量投与することを含んでなる癒着方法であって、
    　該トリブロックコポリマーが式Ｉ
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     　式中、
    　Ｌ1は、同一または異なる連結基を表し、
    　Ｌ2は、独立して、－Ｃ1-6アルキレン－ＮＨ－（Ｃ1-6アルキレン）q－であり、ここでｑは０または１の整数であり、そして
    　Ｒは、独立して、Ｒの総数ｎの少なくとも２０％が２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリジン－１－オキシル－３－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリン－１－オキシル－３－イル及び２，４，４－トリメチル－１，３－オキサゾリジン－３－オキシル－２－イル、２，４，４－トリメチル－１，３－チアゾリジン－３－オキシル－２－イル及び２，４，４－トリメチル－イミダゾリンジン－３－オキシル－２－イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
    　Ｙは、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオからなる群より選ばれ、
    　ｍは、独立して、３～１，０００の整数であり、そして
    　ｎは、２０～５，０００の整数である、
    で表され、かつ、
    　アニオン性ポリマーがポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン酸、ポリアニオン性多糖類、アニオン性タンパク質からなる群より選ばれる１種またはそれ以上である、方法。
  12. 　トリブロックコポリマーと修飾されたポリアニオン性ポリマーを含む組成物であって、
    　該トリブロックコポリマーが式Ｉ
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     　式中、
    　Ｌ1は、同一または異なる連結基を表し、
    　Ｌ2は、独立して、－Ｃ1-6アルキレン－ＮＨ－（Ｃ1-6アルキレン）q－であり、ここでｑは０または１の整数であり、そして
    　Ｒは、独立して、Ｒの総数ｎの少なくとも２０％が２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリジン－１－オキシル－３－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリン－１－オキシル－３－イル及び２，４，４－トリメチル－１，３－オキサゾリジン－３－オキシル－２－イル、２，４，４－トリメチル－１，３－チアゾリジン－３－オキシル－２－イル及び２，４，４－トリメチル－イミダゾリンジン－３－オキシル－２－イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
    　Ｙは、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオからなる群より選ばれ、
    　ｍは、独立して、３～１，０００の整数であり、そして
    　ｎは、２０～５，０００の整数である、
    で表され、かつ、
    　該修飾されたアニオン性ポリマーがポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、カルボキシメチルデキストラン、キサンタンガム、ヒアルロン酸、ポリグルタミン酸及びポリアスパラギン酸からなる群より選ばれ、該アニオン性ポリマー分子中のカルボキシル基の５～４０％を介して蛍光性色素が共有結合しているものである、
    組成物。
  13. 　Ｌ1が、独立して、単結合、－Ｓ－（ＣＨ2）c－、－Ｓ－（ＣＨ2）cＣＯ－、－（ＣＨ2）cＳ－、－ＣＯ（ＣＨ2）cＳ－、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     からなる群より選ばれ、ここでｃは１ないし５の整数であり、
    　蛍光性色素が、フルオレセイン類、ローダミン類、アレキサフローラ類からなる群より選ばれる、請求項１２に記載の組成物。
  14. 　ＹがＨであるか、または
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     からなる群から選ばれる、請求項１２に記載の組成物。
  15. 　Ｒが、次式
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     　式中、Ｒ’はメチル基である、
    表される基から選ばれ、Ｒの総数ｎの少なくとも８０％を前記式で表される基が占める、請求項１２に記載の組成物。
  16. 　組成物が個体における組織または器官の癒着防止または生体内滞留性を評価するために使用される、請求項１２に記載の組成物。
  17. 　式ＩＩ
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     式中、
    　Ｌ1’は、独立して
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     からなる群より選ばれ、
    　Ｌ2は、独立して、－Ｃ1-6アルキレン－ＮＨ－（Ｃ1-6アルキレン）q－であり、ここでｑは０または１の整数であり、そして
    　Ｒは、独立して、Ｒの総数ｎの少なくとも２０％が２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリジン－１－オキシル－３－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリン－１－オキシル－３－イル及び２，４，４－トリメチル－１，３－オキサゾリジン－３－オキシル－２－イル、２，４，４－トリメチル－１，３－チアゾリジン－３－オキシル－２－イル及び２，４，４－トリメチル－イミダゾリンジン－３－オキシル－２－イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
    　Ｙは、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオからなる群より選ばれ、
    　ｍは、独立して、３～１，０００の整数であり、そして
    　ｎは、２０～５，０００の整数である、
    で表される、
    トリブロックコポリマー。
  18. 　請求項１７に記載のコポリマーの製造方法であって、
    　次式ａ
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     式中、Ｌ1’およびｎは上記式ＩＩについて定義したとおりであり、ＣＴＡは、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオからなる群より選ばれる連鎖移動剤である、
    で表される両末端が修飾されたポリ（エチレングリコール）を、不活性溶媒中で、ラジカル源としてのアゾ化合物の存在下で、クロロメチルスチレンと重合させることにより、次式ｂ
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     式中、ＣＴＡ、Ｌ1’、ｍおよびｎは、上記定義のとおりである、
    で表されるトリブロックコポリマーを得、次いで、
    　　Ｈ2Ｎ－（Ｃ1-6アルキレン）q－Ｒ
    　　式中、Ｒは式ＩＩについて定義したとおりである、
    で表されるアミン化合物と反応させる工程を含んでなる、製造方法。
  19. 　式ｂ
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     式中、
    　　Ｌ1’は、独立して
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     からなる群より選ばれ、
    　ＣＴＡは、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオからなる群より選ばれる連鎖移動剤であり、
    　ｍは、独立して、３～１，０００の整数であり、そして
    　ｎは、２０～５，０００の整数である、
    で表される、
    トリブロックコポリマー。
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