WO2015105083A1 - アンチセンスオリゴヌクレオチド及び糖誘導体を含む二本鎖オリゴヌクレオチド - Google Patents

アンチセンスオリゴヌクレオチド及び糖誘導体を含む二本鎖オリゴヌクレオチド Download PDF

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釘宮　啓
昌浩 阪上
関口　光明
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塩野義製薬株式会社
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Definitions

  • two antisense strands are antisense oligonucleotides having an activity of suppressing the expression of a target protein, and a sugar derivative having an interaction with an asialoglycoprotein receptor is bound to the sense strand via a linker. Relates to strand oligonucleotides.
  • An antisense oligonucleotide is an oligonucleotide complementary to ncRNA (non-coding RNA) such as mRNA, mRNA precursor or ribosomal RNA, transfer RNA, miRNA, etc. of a target gene, and consists of about 8 to 30 bases. Strand DNA, RNA and / or structural analogs thereof. The function of mRNA, mRNA precursor or ncRNA is suppressed by forming a double strand with the mRNA, mRNA precursor or ncRNA targeted by the antisense oligonucleotide.
  • ncRNA non-coding RNA
  • nucleic acid drugs such as antisense oligonucleotides and siRNA are difficult to put to practical use because they are easily degraded by nucleases in living bodies and have low efficiency of incorporation into target cells.
  • chemical modification of the active ingredient nucleic acid itself and drug delivery system (DDS) for delivering the nucleic acid into the target cell have been studied for many years.
  • Examples of chemical modification of the antisense oligonucleotide itself include S-oligo (phosphorothioate) in which the phosphate moiety is modified, and 2 ′, 4′-BNA (bridged nucleic acid) / LNA (in which the sugar moiety is modified). locked nucleic acid) (see Patent Documents 1 to 5).
  • Non-Patent Document 1 suggests that liposomes modified with a galactose derivative, which is a sugar derivative that interacts with the asialoglycoprotein receptor, are useful for the incorporation of drugs into liver cells.
  • Patent Documents 6 to 8 suggest that liposomes modified with a GalNac (N-acetylgalactosamine) derivative, which is a sugar derivative that interacts with the asialoglycoprotein receptor, are useful for siRNA uptake into liver cells.
  • Patent Document 9 describes an siRNA in which a GalNac derivative is bound via a linker, and describes that when the siRNA is administered subcutaneously, the expression of a target gene in the liver is suppressed.
  • Patent Document 10 discloses that, in a mouse, by binding tocophenol to a double-stranded oligonucleotide containing an RNA oligonucleotide complementary to an antisense oligonucleotide, compared to a single-stranded antisense oligonucleotide, It is described that it was efficiently delivered and accumulated in the liver, and the expression of the target gene in the liver was suppressed.
  • An object of the present invention is to provide a novel complex capable of efficiently transporting a DNA antisense oligonucleotide to the liver.
  • antisense oligonucleotides When using antisense oligonucleotides as pharmaceuticals, single-stranded antisense oligonucleotides, which are active ingredients, are poorly absorbed into the target cells due to poor stability in the stomach and poor absorption from the intestine. In general, research and development have been conducted on injections that easily reach the target tissue. However, depending on the disease, a dosage form other than an injection may be preferable, for example, because injection is difficult due to the thickness of the patient's subcutaneous fat. Based on the method described in Patent Document 10, the present inventors conducted research using a tocopherol-modified double-stranded oligonucleotide.
  • the target gene expression inhibitory activity in the liver was improved by intravenous injection, but the target gene expression inhibitory activity was improved by subcutaneous administration. Improvement could not be confirmed.
  • the present inventors have found that the double-stranded oligonucleotide of the present invention has excellent target gene expression inhibitory activity in the liver for both intravenous injection and subcutaneous administration.
  • the double-stranded oligonucleotide of the present invention is very useful because it can efficiently deliver and accumulate an antisense oligonucleotide, which is an active ingredient of a nucleic acid drug, to the liver to exert its effect.
  • the present inventors measured aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) during intravenous injection and subcutaneous administration using the double-stranded oligonucleotide of the present invention, and liver toxicity was observed. Confirm that there is no. Therefore, the double-stranded oligonucleotide of the present invention has low toxicity and is sufficiently safe for use as a medicine.
  • AST aspartate aminotransferase
  • ALT alanine aminotransferase
  • the double-stranded oligonucleotide of the present invention utilizes, for example, a GalNac derivative.
  • Patent Document 9 describes a siRNA in which a GalNac derivative is bound via a linker, and describes that the expression of a target gene in the liver is suppressed when the siRNA is administered intravenously or subcutaneously. Yes.
  • DDS that has been shown to be usable in siRNA for the following reasons is not always applicable to antisense oligonucleotides as they are.
  • Methods for suppressing protein expression targeting mRNA include an antisense method using an antisense oligonucleotide or an RNA interference (RNAi) approach using siRNA.
  • the antisense method is, for example, cleaving mRNA strands by RNaseH that recognizes RNA / DNA heteroduplexes generated by hybridizing to target mRNA using single-stranded DNA (antisense oligonucleotide) around 20 mer. This is a technique for suppressing protein production.
  • RNA interference is incorporated into RISC (RNA-induced silencing complex) in cells by using, for example, 20 to 30-mer double-stranded RNA (siRNA; short interfering RNA), and then homologous to the incorporated siRNA. This is a technique for suppressing protein expression by cleaving a typical mRNA chain.
  • RNA interference In order for both the antisense method and RNA interference to exert sufficient effects in vivo, it is important to improve the degradation resistance against in vivo nuclease and the delivery efficiency to the target organ.
  • approaches using chemically modified nucleic acids and biological ligand molecules eg, GalNac derivatives
  • usable chemical modifications depend on differences in molecular structure and mRNA chain cleavage mechanism. The type of nucleic acid, the optimal ligand molecule, and the binding site are considered to be different.
  • the antisense strand is a DNA antisense oligonucleotide having 8 to 25 bases, which may contain a nucleoside derivative,
  • a double-stranded oligonucleotide to which a sugar derivative having an interaction with an asialoglycoprotein receptor is bound via a linker.
  • the sugar derivative is (Where P1A , P1B , P2A , P2B , P3A , P3B , P4A , P4B , P4C , T1A , T1B , T2A , T2B , T3A , T3B , T4A , T4B And T 4C are each independently absent or CO, NH, O, S, OC ( ⁇ O), NHC ( ⁇ O), CH 2 , CH 2 NH or CH 2 O; Q 1A , Q 1B , Q 2A , Q 2B , Q 3A , Q 3B , Q 4A , Q 4B and Q 4C are each independently absent or substituted or unsubstituted alkylene; R 1A , R 1B , R 2A , R 2B , R 3A , R 3B , R 4A , R 4B and R 4C are each independently absent or NH, O, S, CH 2 , C ( ⁇ O
  • the crosslinked structure is 4 ′-(CH 2 ) m—O-2 ′ (m is an integer of 1 to 4) or 4′-C ( ⁇ O) —NR 6 -2 ′ (R 6 is The double-stranded oligonucleotide according to (5), which is a hydrogen atom or alkyl).
  • the linker is (Where L 1 binds to the 3 ′ end and / or the 5 ′ end of the sense strand, and L 5 binds to the sugar derivative.
  • L 1 is C ( ⁇ O) NH, NHC ( ⁇ O), NHC ( ⁇ O) NH, Where R 7 is alkyl or alkyloxy.
  • Each L 2 independently represents a substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 20 carbon atoms or an aromatic ring which may be interposed via an aromatic ring;
  • Each L 3 is independently absent, C ( ⁇ O) NR 8 (R 8 is hydrogen or substituted or unsubstituted alkyl), NR 9 C ( ⁇ O) (R 9 is hydrogen or substituted or An unsubstituted alkyl or R 9 may form a substituted or unsubstituted nitrogen-containing ring together with the carbon in the alkylene of L 2 );
  • Each L 4 independently is a substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 20 carbon atoms or an aromatic ring which may not exist or may be interposed via an aromatic ring;
  • L 5 is C ( ⁇ O) NH, NHC ( ⁇ O), NH or O
  • L 1 is C ( ⁇ O) NH, NHC ( ⁇ O), NHC ( ⁇ O) NH, Where R 7 is alkyl or alkyloxy.
  • Each L 2 independently represents a substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 20 carbon atoms or an aromatic ring which may be interposed via an aromatic ring;
  • Each L 3 is independently absent, C ( ⁇ O) NR 8 (R 8 is hydrogen or substituted or unsubstituted alkyl) or NR 9 C ( ⁇ O) (R 9 is hydrogen or substituted or An unsubstituted alkyl, or R 9 together with the carbon in the alkylene of L 2 may form a substituted or unsubstituted nitrogen-containing ring),
  • Each L 4 independently is a substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 20 carbon atoms or an aromatic ring which may not exist or may be interposed via an aromatic ring;
  • L 5 is C ( ⁇ O) NH, NHC ( ⁇ O), NH or
  • the double-stranded oligonucleotide of the present invention exhibits high activity by stably delivering and accumulating an antisense oligonucleotide, which is an active ingredient, to the liver regardless of the route of intravenous administration or subcutaneous administration. Since the double-stranded oligonucleotide was not toxic, it is useful as a nucleic acid pharmaceutical.
  • Knockdown evaluation of ⁇ -tocopherol modified oligonucleotide (Comparative Example). The remaining amount of mRNA was expressed as a relative value when the physiological saline-administered group was taken as 100. The dose of SEQ-7 (10, 3.3 or 1.1 mg / kg) was expressed in terms of the amount of antisense strand. Knockdown evaluation of the double-stranded oligonucleotide (SEQ-8) of the present invention. The remaining amount of mRNA was expressed as a relative value when the physiological saline-administered group was taken as 100. The dose of SEQ-8 (20, 6.6 or 2.2 mg / kg) was expressed in terms of the amount of antisense strand.
  • the dose of SEQ-21 or 22 (4 or 2 mg / kg) was expressed in terms of the amount of antisense strand.
  • Knockdown evaluation of the double-stranded oligonucleotide (SEQ-20, 23-25) of the present invention The remaining amount of mRNA was expressed as a relative value when the physiological saline-administered group was taken as 100.
  • the doses of SEQ-20 and 23-25 (4 or 2 mg / kg) were expressed in terms of the amount of antisense strand.
  • the remaining amount of mRNA was expressed as a relative value when the physiological saline-administered group was taken as 100.
  • the dose of SEQ-30 to 32 (0.2 mg / kg) was expressed in terms of the amount of antisense strand.
  • Nucleoside means a compound in which a nucleobase and a sugar form an N-glycoside bond.
  • An oligonucleotide means a nucleotide in which a plurality of identical or different nucleosides are bound.
  • the bond between sugars in the oligonucleotide may be a bond that a natural nucleic acid has, a phosphodiester (D-oligo), an artificially modified bond, or a bond that does not have a phosphorus atom. Also good. Any bond known in the art can be used. Examples of the bonds that have been artificially modified include phosphorothioate (S-oligo), methylphosphonate (M-oligo), and boranophosphonate. Examples of the bond having no phosphorus atom include alkyl, non-aromatic carbocycle, haloalkyl, halogen-substituted non-aromatic carbocycle, and the like.
  • siloxane siloxane, sulfide, sulfoxide, sulfone, acetyl, acetyl formate, acetyl thioformate, acetyl methylene formate, acetyl thioformate, alkenyl, sulfamate, methyleneimino, methylenehydrazino, sulfonate, sulfonamide, amide and the like.
  • all may be the same bond or may contain different bonds.
  • DNA nucleoside or “RNA nucleoside” means a natural DNA nucleoside or a natural RNA nucleoside and means a part of a nucleotide which is one unit constituting an oligonucleotide.
  • Natural DNA nucleoside means: (Wherein, B X1 is adenine, guanine, cytosine or thymine.)
  • Natural RNA nucleoside means: (In the formula, B X2 is adenine, guanine, cytosine or uracil.)
  • DNA oligonucleotide is an oligonucleotide in which a plurality of DNA nucleosides are bound
  • RNA oligonucleotide is an oligonucleotide in which a plurality of RNA nucleosides are bound.
  • nucleoside derivative means a nucleoside in which the nucleobase and / or sugar site of the DNA nucleoside or the RNA nucleoside is artificially modified. Any modification of nucleosides known in the art can be used.
  • nucleobase modifications include 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine, 5-propynylcytosine and the like.
  • Examples of the modification of the sugar moiety include substitution at the 2 ′ position of the sugar. Specifically, 2′-F, 2′-OCH 3 (2′-OMe), 2′-OCH 2 CH 2 OCH 3 (2′-MOE) and the like. Moreover, for example, a cross-linked structure between the 4′-position and the 2′-position of the following sugars can be mentioned.
  • R 6 is preferably a hydrogen atom, alkyl, alkenyl, alkynyl, aromatic carbocyclic group, non-aromatic carbocyclic group, aromatic heterocyclic group, non-aromatic heterocyclic group, aromatic carbocycle It is alkyl, non-aromatic carbocyclic alkyl, aromatic heterocyclic alkyl or non-aromatic heterocyclic alkyl, and may have one or more arbitrary substituents selected from ⁇ group.
  • the ⁇ group is a hydroxyl group, alkyl, alkyloxy, mercapto, alkylthio, amino, alkylamino or halogen.
  • R 10 and R 11 are preferably a hydrogen atom.
  • the crosslinked structure is preferably 4 ′-(CR 10 R 11 ) m—O-2 ′ or 4 ′-(CR 10 R 11 ) m 1 —C ( ⁇ O) —NR 6 -2 ′ (AmNA, Bridged nucleic acid) here
  • R 6 is a hydrogen atom, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl or substituted or unsubstituted alkynyl
  • Each R 10 is independently a hydrogen atom, halogen, cyano, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, or substituted or unsubstituted alkynyl
  • Each of R 11 is independently a hydrogen atom, halogen, cyano, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, or substituted or unsubstituted alkynyl
  • m is an integer of
  • the cross-linked structure is particularly preferably 4 ′-(CH 2 ) m—O-2 ′ (m is an integer of 1 to 4) or 4′-C ( ⁇ O) —NR 6 -2 ′ (R 6 Is a hydrogen atom or alkyl).
  • 4 ′-(CH 2 ) m—O-2 ′ (m is an integer of 1 to 4)
  • 4′—CH 2 —O-2 ′ (LNA, Locked Nucleic Acid) is particularly preferable.
  • Specific examples and preparation methods thereof are described in International Publication No. 98/39352, International Publication No. 2003/066875, International Publication No. 2005/021570, and the like.
  • 4′-C ( ⁇ O) —NR 6 ⁇ 2 ′ (R 6 is a hydrogen atom or alkyl)
  • 4′—C ( ⁇ O) —NCH 3 ⁇ 2 ′ is particularly preferable. Specific examples and preparation methods thereof are described in International Publication No. 2011/052436.
  • Nucleotide modification and modification methods known in the art are also disclosed in, for example, the following patent documents.
  • the “double-stranded oligonucleotide” of the present invention is a DNA antisense oligonucleotide of 8 to 25 bases in which the antisense strand may contain a nucleoside derivative,
  • the antisense strand of the “double-stranded oligonucleotide” of the present invention is a DNA antisense oligonucleotide of 8 to 25 bases which may contain a nucleoside derivative.
  • the “DNA antisense oligonucleotide” is an oligonucleotide complementary to the target gene mRNA, mRNA precursor or ncRNA, and is composed of single-stranded DNA. The function of mRNA, mRNA precursor or ncRNA is suppressed by forming a double strand with the mRNA, mRNA precursor or ncRNA targeted by the antisense oligonucleotide.
  • the “DNA antisense oligonucleotide” includes not only those that are completely complementary to the target mRNA, mRNA precursor, or ncRNA, but also those that can hybridize with the mRNA, mRNA precursor, or ncRNA under stringent conditions.
  • ncRNA non-coding RNA
  • target gene includes a gene whose expression is increased in various diseases.
  • the length of “DNA antisense oligonucleotide” is 8 to 25 bases.
  • 8 to 19 bases 10 to 19 bases, 13 to 19 bases, 13 bases, 14 bases, 15 bases, 16 bases, 17 bases, 18 bases or 19 bases.
  • the sense strand of the “double-stranded oligonucleotide” of the present invention contains a sequence capable of hybridizing to the antisense strand under stringent conditions, and may contain a DNA nucleoside and / or a nucleoside derivative of 8 to 35 bases.
  • Sense strand RNA oligonucleotides include those in which one or several mismatches exist at the site of hybridization, as long as they can hybridize to the antisense strand DNA antisense oligonucleotide under stringent conditions.
  • the hybridizing site has at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more homology with the complementary sequence of the DNA antisense oligonucleotide of the antisense strand.
  • Antisense oligonucleotides are mentioned.
  • the homology is indicated in the score by using a search program BLAST using an algorithm developed by Altschul et al. (The Journal of Molecular Biology, 215, 403-410 (1990)), for example. .
  • the length of the sense strand of the double-stranded oligonucleotide of the present invention is 8 to 35 bases. For example, 8 to 30, 8 to 19 bases, 10 to 19 bases, 13 to 19 bases, 13 bases, 14 bases, 15 bases, 16 bases, 17 bases, 18 bases or 19 bases.
  • the length of the sense strand may be the same length as the antisense strand, or may be shorter by one or several bases than the length of the antisense strand as long as it hybridizes with the antisense strand. Further, the length of the sense strand may be longer than the length of the antisense strand by adding one or several bases to one side or both sides of the site that hybridizes with the antisense strand.
  • the base in the sense strand may hybridize at a portion that does not hybridize with the antisense strand, so that it may have a hairpin structure.
  • “One or several bases” means 1 to 10, 1 to 5, 1 to 3, or 1 or 2 bases.
  • “Stringent conditions” means that a certain base sequence forms a hybrid with a specific sequence (so-called specific hybrid), and a base sequence that does not have an equivalent function forms a hybrid with a specific sequence (so-called non-specific hybrid) It means a condition that does not.
  • Those skilled in the art can easily select such conditions by changing the temperature during the hybridization reaction and washing, the salt concentration of the hybridization reaction solution and the washing solution, and the like. Specifically, it is 42 ° C. in 6 ⁇ SSC (0.9 M NaCl, 0.09 M trisodium citrate) or 6 ⁇ SSPE (3 M NaCl, 0, 2 M NaH 2 PO 4 , 20 mM EDTA ⁇ 2Na, pH 7.4).
  • Examples of the stringent conditions of the present invention include, but are not limited to, the conditions in which the cells are hybridized with and washed with 0.5 ⁇ SSC at 42 ° C.
  • a hybridization method a well-known and commonly used method in this field, for example, a Southern blot hybridization method or the like can be used. Specifically, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Current Protocol in Amplification in Coal (1994) (Ten-Proc. It can be carried out according to the method described in Second Edition (1995) (Oxford University Press) and the like.
  • One or several mismatches means 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2 mismatches.
  • the antisense strand DNA antisense oligonucleotide and the sense strand RNA oligonucleotide in the “double-stranded oligonucleotide” of the present invention preferably contain one or more nucleoside derivatives.
  • the sense strand may further contain a DNA nucleoside. That is, in the DNA antisense oligonucleotide of the antisense strand, at least one nucleoside is a DNA nucleoside, but the other nucleoside may be a DNA nucleoside or a nucleoside derivative.
  • At least one nucleoside is an RNA nucleoside, but the other nucleoside may be an RNA nucleoside, a DNA nucleoside, or a nucleoside derivative.
  • Examples of the pattern of the nucleoside derivative and the DNA nucleoside or RNA nucleoside include gapmer or mixmer.
  • a gapmer includes a central region (“gap”) and regions on both sides of the central region, wings (“5 ′ wing” on the 5 ′ side or “3 ′ wing” on the 3 ′ side), and each wing has at least It means an oligonucleotide containing one nucleoside derivative.
  • “5 ′ wing” and / or “3 ′ wing” contains one or more nucleoside derivatives, preferably 1 to 5, more preferably 2 to 3.
  • the type, number, and position of the modification in one wing may be the same as or different from the type, number, and position of the modification in the other wing.
  • a mixmer means an oligonucleotide containing a nucleoside derivative at random.
  • the DNA antisense oligonucleotide of the antisense strand is particularly preferably a gapmer.
  • any nucleoside derivative known in the art can be used as the nucleoside derivative in the “double-stranded oligonucleotide” of the present invention.
  • it is a nucleoside having a substituent at the 2′-position of the sugar and / or a nucleoside having a cross-linking structure between the 4′-position and the 2′-position of the sugar.
  • the substituent at the 2′-position of the sugar is preferably F, OCH 3 or OCH 2 CH 2 OCH 3 .
  • the cross-linked structure between the 4′-position and the 2′-position of the sugar is preferably 4 ′-(CH 2 ) m—O-2 ′ (m is an integer of 1 to 4), 4′-C ( ⁇ O) —NR 6 -2 ′ (R 6 is a hydrogen atom or alkyl).
  • a DNA antisense oligonucleotide having an antisense strand is preferably phosphorothioate (S-oligo).
  • the DNA antisense oligonucleotide of the antisense strand and the RNA oligonucleotide of the sense strand in the “double-stranded oligonucleotide” of the present invention can be synthesized by a conventional method in the art, for example, a commercially available nucleic acid automatic synthesizer (For example, Applied Biosystems, Dainippon Seiki Co., Ltd., etc.) can be easily synthesized.
  • Examples of the synthesis method include a solid phase synthesis method using phosphoramidite and a solid phase synthesis method using hydrogen phosphonate. For example, it is disclosed in Examples 3) 1) to 7), Tetrahedron Letters 22, 1859-1862 (1981), International Publication No. 2011/052436, and the like.
  • the synthesized antisense strand and sense strand are hybridized by a known method to form a double-stranded oligonucleotide. For example, it is disclosed in Example 3 of Example 3 below, Example 1 of International Publication No. 2013/0889283, and the like.
  • a sugar derivative having an interaction with an asialoglycoprotein receptor is bonded to the 3 ′ end and / or the 5 ′ end of the sense strand via a linker.
  • “Asialoglycoprotein receptor” is present on the surface of liver cells and has the function of recognizing galactose residues of asialoglycoprotein and taking them into the cells for degradation. That is, “a sugar derivative having an interaction with an asialoglycoprotein receptor” means a compound having a structure similar to that of a galactose residue and binding to the asialoglycoprotein receptor and taken into a cell. Examples thereof include GalNac (N-acetylgalactosamine) derivatives, galactose derivatives, and lactose derivatives.
  • GalNac N-acetylgalactosamine
  • a GalNac derivative is a compound containing the following groups. (Where R X1 , R X2 and R X3 are each independently a hydrogen atom or substituted or unsubstituted alkyl; R X4 ′ is substituted or unsubstituted alkyl. )
  • a galactose derivative is a compound containing the following groups. (In the formula, R X1 , R X2 and R X3 are each independently a hydrogen atom or substituted or unsubstituted alkyl.)
  • a lactose derivative is a compound containing the following groups.
  • R X1 is a hydrogen atom or substituted or unsubstituted alkyl
  • R X2 and R X3 are each independently a hydrogen atom or substituted or unsubstituted alkyl
  • Each R X4 is independently OH or NHCOR X4 ′ (R X4 ′ is a substituted or unsubstituted alkyl).
  • Preferred examples of the “sugar derivative having an interaction with the asialoglycoprotein receptor” include the following. (Where P 0A, P 1A, P 1B , P 2A, P 2B, P 3A, P 3B, P 4A, P 4B, P 4C, T 0A, T 1A, T 1B, T 2A, T 2B, T 3A, T 3B , T 4A , T 4B and T 4C are each independently absent or in CO, NH, O, S, OC ( ⁇ O), NHC ( ⁇ O), CH 2 , CH 2 NH or CH 2 O Yes, Q 0A , Q 1A , Q 1B , Q 2A , Q 2B , Q 3A , Q 3B , Q 4A , Q 4B and Q 4C are each independently absent or substituted or unsubstituted alkylene; R 0A , R 1A , R 1B , R 2A , R 2B , R 3A , R 3B
  • Amino acid side chain is a part of the structure of an amino acid, for example, CH 3 , CH 2 SH, CH 2 COOH, CH 2 CH 2 COOH, CH 2 C 6 H 5 , CH 2 C 3 H 3 N 2 , CH (CH 3 ) CH 2 CH 3 , (CH 2 ) 4 NH 2 , CH 2 CH (CH 3 ) 2 , CH 2 CH 2 SCH 3 , CH 2 CONH 2 , CH 2 CH 2 CONH 2 , (CH 2 ) 3 NHC (NH) NH 2 , CH 2 OH, CH (OH) CH 3 , CH 2 SeH, CH (CH 3 ) 2 , CH 2 C 8 H 6 N, CH 2 C 6 H 4 OH, etc. It is done.
  • Any linker can be used as a linker through the sense strand and the sugar derivative as long as it is a linker used in this field.
  • L 1 binds to the 3 ′ end and / or the 5 ′ end of the sense strand, and L 5 binds to the sugar derivative.
  • L 1 is C ( ⁇ O) NH, NHC ( ⁇ O), NHC ( ⁇ O) NH, Where R 7 is alkyl or alkyloxy.
  • Each L 2 independently represents a substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 20 carbon atoms or an aromatic ring which may be interposed via an aromatic ring;
  • Each L 3 is independently absent, C ( ⁇ O) NR 8 (R 8 is hydrogen or substituted or unsubstituted alkyl), NR 9 C ( ⁇ O) (R 9 is hydrogen or substituted or An unsubstituted alkyl or R 9 may form a substituted or unsubstituted nitrogen-containing ring together with the carbon in the alkylene of L 2 ); (Note that when L 3 is represented by the above formula, L 2 is bonded to the left side in the formula) And Each L 4 independently is a substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 20 carbon atoms or an aromatic ring which may not exist or may be interposed via an aromatic ring;
  • L 5 is C ( ⁇ O) NH, NHC ( ⁇ O), NH or O, n is 1 or 2.
  • L 1 binds to the 3 ′ end and / or the 5 ′ end of the sense strand, and L 5 binds to the sugar derivative.
  • L 1 is C ( ⁇ O) NH, NHC ( ⁇ O), NHC ( ⁇ O) NH, Where R 7 is alkyl or alkyloxy.
  • Each L 2 independently represents a substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 20 carbon atoms or an aromatic ring which may be interposed via an aromatic ring;
  • Each L 3 is independently absent, C ( ⁇ O) NR 8 (R 8 is hydrogen or substituted or unsubstituted alkyl) or NR 9 C ( ⁇ O) (R 9 is hydrogen or substituted or An unsubstituted alkyl, or R 9 together with the carbon in the alkylene of L 2 may form a substituted or unsubstituted nitrogen-containing ring),
  • Each L 4 independently is a substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 20 carbon atoms or an aromatic ring which may not exist or may be interposed via an aromatic ring;
  • L 5 is C ( ⁇ O) NH, NHC ( ⁇ O), NH or O, n is 1 or 2.
  • L 2 or L 4 is “substituted or unsubstituted alkylene optionally via an aromatic ring” or “aromatic ring”, the aromatic ring is preferably a benzene ring, a biphenyl ring or the like. It is done.
  • R 9 together with carbon in the alkylene of L 2 may form a substituted or unsubstituted nitrogen-containing ring” means the following. (In the formula, a is an integer of 0 to 18, and b is an integer of 1 to 5. The alkylene and the nitrogen-containing ring may have a substituent.) Specific examples include the following.
  • L 1 is bound to the 3 ′ position of the sugar at the end of the oligonucleotide.
  • L 1 is bound to the 4 ′ position of the end of the oligonucleotide via a substituted or unsubstituted methylene.
  • linker examples include the following.
  • L 1 is preferably It is.
  • L 2 is preferably 1 to 20 substituted or unsubstituted alkylene, benzene ring or biphenyl ring.
  • L 3 is preferably absent, C ( ⁇ O) NH or NR 9 C ( ⁇ O) (R 9 is hydrogen, R 9 is substituted with carbon in the alkylene of L 2 or NR 9 C ( ⁇ O) (R 9 together with the carbon in the alkylene of L 2 forms a substituted or unsubstituted nitrogen-containing ring, which may form an unsubstituted nitrogen-containing ring) ), (Note that when L 3 is represented by the above formula, L 2 is bonded to the left side in the formula) It is.
  • L 4 is preferably absent, substituted or unsubstituted 1 to 20 alkylene, benzene ring or biphenyl ring.
  • L 5 is preferably C ( ⁇ O) NH.
  • n 1 and n 2 are each independently an integer of 1 to 20, and n 3 is an integer of 1 to 6)
  • the “sugar derivative interacting with the asialoglycoprotein receptor” and the linker were synthesized as a compound containing a sugar derivative and a part of the linker as described in Example 1 below, and the compound was synthesized as described in the following Example. It is solid-phased on the resin and introduced into the RNA oligonucleotide of the sense strand as described in 9) and 10) of Example 3 below. Thereafter, as described in Example 3 below 11), the antisense strand DNA antisense oligonucleotide is hybridized to obtain the “double-stranded oligonucleotide” of the present invention.
  • Specific examples of the “compound containing a sugar derivative and a part of the linker” include the compounds described in Example 1 below.
  • the 3 ′ end or 5 ′ end to which the sugar derivative of the “double-stranded oligonucleotide” of the present invention is not bound, or the linker may be further modified.
  • modifying groups known in the art to enable tracking of the oligonucleotide, to improve the pharmacokinetics or pharmacodynamics of the oligonucleotide, or to improve the stability or binding affinity of the oligonucleotide.
  • examples thereof include a hydroxyl protecting group, a reporter molecule, cholesterol, phospholipid, a dye, and a fluorescent molecule.
  • the 3 ′ end or 5 ′ end to which the sugar derivative of the “double-stranded oligonucleotide” of the present invention is not bound may contain a phosphate ester moiety.
  • Phosphate ester moiety means a terminal phosphate group, including phosphate esters as well as modified phosphate esters.
  • the phosphate ester moiety may be located at either end, but is preferably a 5′-terminal nucleoside. Specifically, it is a group represented by the formula: —OP ( ⁇ O) (OH) OH or a modifying group thereof.
  • O and OH is replaced by H, O, OR ′, S, N (R ′) (where R ′ is H, an amino protecting group or substituted or unsubstituted alkyl) or alkyl May be.
  • R ′ is H, an amino protecting group or substituted or unsubstituted alkyl
  • alkyl May be.
  • the 5 ′ or 3 ′ end may each independently contain 1 to 3 phosphate ester moieties that are substituted or unsubstituted.
  • Halogen includes fluorine atom, chlorine atom, bromine atom and iodine atom. In particular, a fluorine atom and a chlorine atom are preferable.
  • Alkyl includes straight or branched hydrocarbon groups having 1 to 15 carbon atoms, preferably 1 to 10 carbon atoms, more preferably 1 to 6 carbon atoms, and still more preferably 1 to 4 carbon atoms. To do. For example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, n-hexyl, isohexyl, n-heptyl, isoheptyl, n-octyl , Isooctyl, n-nonyl, n-decyl and the like.
  • alkyl examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl and n-pentyl. Further preferred examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl and tert-butyl.
  • Alkenyl has 2 to 15 carbon atoms, preferably 2 to 10 carbon atoms, more preferably 2 to 6 carbon atoms, and further preferably 2 to 4 carbon atoms, having one or more double bonds at any position. These linear or branched hydrocarbon groups are included.
  • alkenyl include vinyl, allyl, propenyl, isopropenyl, butenyl, isobutenyl, prenyl, butadienyl, pentenyl, isopentenyl, pentadienyl, hexenyl, isohexenyl, hexadienyl, heptenyl, octenyl, nonenyl, decenyl, undecenyl, dodecenyl, tridecenyl, decenyl, tridecenyl, decenyl Etc.
  • alkenyl include vinyl, allyl, propenyl, isopropenyl and butenyl.
  • Alkynyl has 2 to 10 carbon atoms, preferably 2 to 8 carbon atoms, more preferably 2 to 6 carbon atoms, more preferably 2 to 4 carbon atoms, having one or more triple bonds at any position. Includes straight chain or branched hydrocarbon groups. Examples include ethynyl, propynyl, butynyl, pentynyl, hexynyl, heptynyl, octynyl, nonynyl, decynyl and the like. These may further have a double bond at an arbitrary position. Preferred embodiments of “alkynyl” include ethynyl, propynyl, butynyl and pentynyl.
  • Alkylene is a straight or branched divalent hydrocarbon having 1 to 15 carbon atoms, preferably 1 to 10 carbon atoms, more preferably 1 to 6 carbon atoms, and still more preferably 1 to 4 carbon atoms. Includes groups. Examples include methylene, ethylene, trimethylene, propylene, tetramethylene, pentamethylene, hexamethylene and the like.
  • “Aromatic carbocyclic group” means a monocyclic or bicyclic or more cyclic aromatic hydrocarbon group. For example, phenyl, naphthyl, anthryl, phenanthryl and the like can be mentioned. A preferred embodiment of the “aromatic carbocyclic group” includes phenyl.
  • non-aromatic carbocyclic group means a cyclic saturated hydrocarbon group or a cyclic non-aromatic unsaturated hydrocarbon group having one or more rings.
  • the non-aromatic carbocyclic group having two or more rings includes a monocyclic ring or a non-aromatic carbocyclic group having two or more rings condensed with the ring in the above “aromatic carbocyclic group”.
  • the “non-aromatic carbocyclic group” includes a group which forms a bridge or a spiro ring as described below.
  • the monocyclic non-aromatic carbocyclic group preferably has 3 to 16 carbon atoms, more preferably 3 to 12 carbon atoms, and still more preferably 4 to 8 carbon atoms.
  • Examples include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, cyclononyl, cyclodecyl, cyclopropenyl, cyclobutenyl, cyclopentenyl, cyclohexenyl, cycloheptenyl, cyclohexadienyl, and the like.
  • Examples of the two or more non-aromatic carbocyclic groups include indanyl, indenyl, acenaphthyl, tetrahydronaphthyl, fluorenyl and the like.
  • “Aromatic heterocyclic group” means a monocyclic or bicyclic or more aromatic cyclic group having one or more heteroatoms arbitrarily selected from O, S and N in the ring. To do.
  • the aromatic heterocyclic group having two or more rings includes those obtained by condensing a ring in the above “aromatic carbocyclic group” to a monocyclic or two or more aromatic heterocyclic group.
  • the monocyclic aromatic heterocyclic group is preferably 5 to 8 members, more preferably 5 or 6 members.
  • Examples include pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, pyridyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, triazolyl, triazinyl, tetrazolyl, furyl, thienyl, isoxazolyl, oxazolyl, oxadiazolyl, isothiazolyl, thiazolyl, thiadiazolyl and the like.
  • bicyclic aromatic heterocyclic group examples include indolyl, isoindolyl, indazolyl, indolizinyl, quinolinyl, isoquinolinyl, cinnolinyl, phthalazinyl, quinazolinyl, naphthyridinyl, quinoxalinyl, purinyl, pteridinyl, benzimidazolyl, benzisoxazolyl, benzisoxazolyl, Oxazolyl, benzoxiadiazolyl, benzisothiazolyl, benzothiazolyl, benzothiadiazolyl, benzofuryl, isobenzofuryl, benzothienyl, benzotriazolyl, imidazopyridyl, triazolopyridyl, imidazothiazolyl, pyrazinopyr Dazinyl, oxazolopyridyl, thiazolopyridyl and the like can be mentioned
  • aromatic heterocyclic group having 3 or more rings examples include carbazolyl, acridinyl, xanthenyl, phenothiazinyl, phenoxathinyl, phenoxazinyl, dibenzofuryl and the like.
  • non-aromatic heterocyclic group is a monocyclic or bicyclic or more cyclic non-aromatic cyclic group having one or more of the same or different heteroatoms arbitrarily selected from O, S and N in the ring Means group.
  • the non-aromatic heterocyclic group having two or more rings includes the above-mentioned “aromatic carbocyclic group”, “non-aromatic carbocyclic group”, and monocyclic or two or more non-aromatic heterocyclic groups, and Also included are those in which each ring in the “aromatic heterocyclic group” is condensed.
  • non-aromatic heterocyclic group also includes a group that forms a bridge or a spiro ring as described below.
  • the monocyclic non-aromatic heterocyclic group is preferably 3 to 8 members, more preferably 5 or 6 members.
  • Heterocycle means a ring derived from the above “aromatic heterocyclic group” and “non-aromatic heterocyclic group”.
  • Aromatic ring means a ring derived from the above “aromatic carbocyclic group” and “aromatic heterocyclic group”.
  • Alkyloxy means a group in which the above “alkyl” is bonded to an oxygen atom. Examples thereof include methoxy, ethoxy, n-propyloxy, isopropyloxy, n-butyloxy, tert-butyloxy, isobutyloxy, sec-butyloxy, pentyloxy, isopentyloxy, hexyloxy and the like. Preferable embodiments of “alkyloxy” include methoxy, ethoxy, n-propyloxy, isopropyloxy, tert-butyloxy.
  • Alkenyloxy means a group in which the above “alkenyl” is bonded to an oxygen atom. Examples thereof include vinyloxy, allyloxy, 1-propenyloxy, 2-butenyloxy, 2-pentenyloxy, 2-hexenyloxy, 2-heptenyloxy, 2-octenyloxy and the like.
  • Alkynyloxy means a group in which the above “alkynyl” is bonded to an oxygen atom. Examples include ethynyloxy, 1-propynyloxy, 2-propynyloxy, 2-butynyloxy, 2-pentynyloxy, 2-hexynyloxy, 2-heptynyloxy, 2-octynyloxy and the like.
  • Haloalkyl means a group in which one or more of the “halogen” is bonded to the “alkyl”. For example, monofluoromethyl, monofluoroethyl, monofluoropropyl, 2,2,3,3,3-pentafluoropropyl, monochloromethyl, trifluoromethyl, trichloromethyl, 2,2,2-trifluoroethyl, 2, Examples include 2,2-trichloroethyl, 1,2-dibromoethyl, 1,1,1-trifluoropropan-2-yl and the like. Preferable embodiments of “haloalkyl” include trifluoromethyl and trichloromethyl.
  • Haloalkyloxy means a group in which the above “haloalkyl” is bonded to an oxygen atom. Examples thereof include monofluoromethoxy, monofluoroethoxy, trifluoromethoxy, trichloromethoxy, trifluoroethoxy, trichloroethoxy and the like. Preferable embodiments of “haloalkyloxy” include trifluoromethoxy and trichloromethoxy.
  • Alkyloxyalkyl means a group in which the above “alkyloxy” is bonded to the above “alkyl”. For example, methoxymethyl, methoxyethyl, ethoxymethyl and the like can be mentioned.
  • Alkyloxyalkyloxy means a group in which the “alkyloxy” is bonded to the “alkyloxy”. Examples thereof include methoxymethoxy, methoxyethoxy, ethoxymethoxy, ethoxyethoxy and the like.
  • Alkylthio means a group in which the above “alkyl” is bonded to a sulfur atom.
  • Alkylcarbonyl means a group in which the above “alkyl” is bonded to a carbonyl group. Examples thereof include methylcarbonyl, ethylcarbonyl, propylcarbonyl, isopropylcarbonyl, tert-butylcarbonyl, isobutylcarbonyl, sec-butylcarbonyl, pentylcarbonyl, isopentylcarbonyl, hexylcarbonyl and the like. Preferable embodiments of “alkylcarbonyl” include methylcarbonyl, ethylcarbonyl, and n-propylcarbonyl.
  • Alkenylcarbonyl means a group in which the above “alkenyl” is bonded to a carbonyl group.
  • alkenyl ethylenylcarbonyl, propenylcarbonyl and the like can be mentioned.
  • Alkynylcarbonyl means a group in which the above “alkynyl” is bonded to a carbonyl group. For example, ethynylcarbonyl, propynylcarbonyl and the like can be mentioned.
  • Alkylamino includes monoalkylamino and dialkylamino.
  • “Monoalkylamino” means a group in which the above “alkyl” is replaced with one hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the amino group.
  • methylamino, ethylamino, isopropylamino and the like can be mentioned.
  • methylamino and ethylamino are used.
  • “Dialkylamino” means a group in which the above “alkyl” is replaced with two hydrogen atoms bonded to the nitrogen atom of the amino group. The two alkyls may be the same or different.
  • Examples include dimethylamino, diethylamino, N, N-diisopropylamino, N-methyl-N-ethylamino, N-isopropyl-N-ethylamino and the like. Preferable examples include dimethylamino and diethylamino.
  • Alkylsulfonyl means a group in which the above “alkyl” is bonded to a sulfonyl group.
  • methylsulfonyl, ethylsulfonyl, propylsulfonyl, isopropylsulfonyl, tert-butylsulfonyl, isobutylsulfonyl, sec-butylsulfonyl and the like can be mentioned.
  • Preferable embodiments of “alkylsulfonyl” include methylsulfonyl and ethylsulfonyl.
  • Alkenylsulfonyl means a group in which the above “alkenyl” is bonded to a sulfonyl group.
  • alkenyl ethylenylsulfonyl, propenylsulfonyl and the like can be mentioned.
  • Alkynylsulfonyl means a group in which the above “alkynyl” is bonded to a sulfonyl group. For example, ethynylsulfonyl, propynylsulfonyl and the like can be mentioned.
  • “Monoalkylcarbonylamino” means a group in which the above “alkylcarbonyl” is replaced with one hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the amino group.
  • methylcarbonylamino, ethylcarbonylamino, propylcarbonylamino, isopropylcarbonylamino, tert-butylcarbonylamino, isobutylcarbonylamino, sec-butylcarbonylamino and the like can be mentioned.
  • Preferable embodiments of “monoalkylcarbonylamino” include methylcarbonylamino and ethylcarbonylamino.
  • Dialkylcarbonylamino means a group in which the above “alkylcarbonyl” is replaced with two hydrogen atoms bonded to the nitrogen atom of the amino group. Two alkylcarbonyl groups may be the same or different. For example, dimethylcarbonylamino, diethylcarbonylamino, N, N-diisopropylcarbonylamino and the like can be mentioned. Preferred embodiments of “dialkylcarbonylamino” include dimethylcarbonylamino and diethylcarbonylamino.
  • “Monoalkylsulfonylamino” means a group in which the above “alkylsulfonyl” is replaced with one hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the amino group.
  • methylsulfonylamino, ethylsulfonylamino, propylsulfonylamino, isopropylsulfonylamino, tert-butylsulfonylamino, isobutylsulfonylamino, sec-butylsulfonylamino and the like can be mentioned.
  • Preferable embodiments of “monoalkylsulfonylamino” include methylsulfonylamino and ethylsulfonylamino.
  • Dialkylsulfonylamino means a group in which the above “alkylsulfonyl” is replaced with two hydrogen atoms bonded to the nitrogen atom of the amino group. Two alkylsulfonyl groups may be the same or different. For example, dimethylsulfonylamino, diethylsulfonylamino, N, N-diisopropylsulfonylamino and the like can be mentioned. Preferred embodiments of “dialkylcarbonylamino” include dimethylsulfonylamino and diethylsulfonylamino.
  • Alkylimino means a group in which the above “alkyl” is replaced with a hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the imino group.
  • methylimino, ethylimino, n-propylimino, isopropylimino and the like can be mentioned.
  • Alkenylimino means a group in which the above “alkenyl” is replaced with a hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the imino group. Examples thereof include ethylenylimino and propenylimino.
  • Alkynylimino means a group in which the above “alkynyl” is replaced with a hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the imino group.
  • alkynylimino ethynylimino, propynylimino and the like can be mentioned.
  • Alkylcarbonylimino means a group in which the above “alkylcarbonyl” is replaced with a hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the imino group.
  • methylcarbonylimino, ethylcarbonylimino, n-propylcarbonylimino, isopropylcarbonylimino and the like can be mentioned.
  • Alkenylcarbonylimino means a group in which the above “alkenylcarbonyl” is replaced with a hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the imino group.
  • alkenylcarbonylimino ethylenylcarbonylimino, propenylcarbonylimino and the like can be mentioned.
  • Alkynylcarbonylimino means a group in which the above “alkynylcarbonyl” is replaced with a hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the imino group.
  • alkynylcarbonylimino ethynylcarbonylimino, propynylcarbonylimino and the like can be mentioned.
  • Alkyloxyimino means a group in which the above “alkyloxy” is replaced with a hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the imino group. Examples thereof include methyloxyimino, ethyloxyimino, n-propyloxyimino, isopropyloxyimino and the like.
  • Alkenyloxyimino means a group in which the above “alkenyloxy” is replaced with a hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the imino group.
  • alkenyloxyimino ethylenyloxyimino, propenyloxyimino and the like can be mentioned.
  • Alkynyloxyimino means a group in which the above “alkynyloxy” is replaced with a hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the imino group.
  • alkynyloxyimino ethynyloxyimino, propynyloxyimino and the like can be mentioned.
  • Alkylcarbonyloxy means a group in which the above “alkylcarbonyl” is bonded to an oxygen atom. Examples thereof include methylcarbonyloxy, ethylcarbonyloxy, propylcarbonyloxy, isopropylcarbonyloxy, tert-butylcarbonyloxy, isobutylcarbonyloxy, sec-butylcarbonyloxy and the like. Preferable embodiments of “alkylcarbonyloxy” include methylcarbonyloxy and ethylcarbonyloxy.
  • Alkenylcarbonyloxy means a group in which the above “alkenylcarbonyl” is bonded to an oxygen atom.
  • alkenylcarbonyl ethylenylcarbonyloxy, propenylcarbonyloxy and the like can be mentioned.
  • Alkynylcarbonyloxy means a group in which the above “alkynylcarbonyl” is bonded to an oxygen atom.
  • alkynylcarbonyloxy ethynylcarbonyloxy, propynylcarbonyloxy and the like can be mentioned.
  • Alkyloxycarbonyl means a group in which the above “alkyloxy” is bonded to a carbonyl group. For example, methyloxycarbonyl, ethyloxycarbonyl, propyloxycarbonyl, isopropyloxycarbonyl, tert-butyloxycarbonyl, isobutyloxycarbonyl, sec-butyloxycarbonyl, pentyloxycarbonyl, isopentyloxycarbonyl, hexyloxycarbonyl, etc. It is done.
  • Preferable embodiments of “alkyloxycarbonyl” include methyloxycarbonyl, ethyloxycarbonyl, propyloxycarbonyl.
  • Alkenyloxycarbonyl means a group in which the above “alkenyloxy” is bonded to a carbonyl group. For example, ethylenyloxycarbonyl, propenyloxycarbonyl and the like can be mentioned.
  • Alkynyloxycarbonyl means a group in which the above “alkynyloxy” is bonded to a carbonyl group. For example, ethynyloxycarbonyl, propynyloxycarbonyl and the like can be mentioned.
  • Alkylsulfanyl means a group in which the above “alkyl” is replaced with a hydrogen atom bonded to a sulfur atom of a sulfanyl group.
  • methylsulfanyl, ethylsulfanyl, n-propylsulfanyl, isopropylsulfanyl and the like can be mentioned.
  • Alkenylsulfanyl means a group in which the above “alkenyl” is replaced with a hydrogen atom bonded to a sulfur atom of a sulfanyl group.
  • alkenyl ethylenylsulfanyl, propenylsulfanyl and the like can be mentioned.
  • Alkynylsulfanyl means a group in which the above “alkynyl” is replaced with a hydrogen atom bonded to a sulfur atom of a sulfanyl group.
  • alkynylsulfanyl ethynylsulfanyl, propynylsulfanyl and the like can be mentioned.
  • Alkylsulfinyl means a group in which the above “alkyl” is bonded to a sulfinyl group. Examples thereof include methylsulfinyl, ethylsulfinyl, n-propylsulfinyl, isopropylsulfinyl and the like.
  • Alkenylsulfinyl means a group in which the above “alkenyl” is bonded to a sulfinyl group.
  • alkenyl ethylenylsulfinyl, propenylsulfinyl and the like can be mentioned.
  • Alkynylsulfinyl means a group in which the above “alkynyl” is bonded to a sulfinyl group. For example, ethynylsulfinyl, propynylsulfinyl and the like can be mentioned.
  • “Monoalkylcarbamoyl” means a group in which the above “alkyl” is replaced with one hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the carbamoyl group. Examples thereof include methylcarbamoyl and ethylcarbamoyl.
  • Dialkylcarbamoyl means a group in which the above “alkyl” is replaced with two hydrogen atoms bonded to the nitrogen atom of the carbamoyl group.
  • Two alkyl groups may be the same or different. Examples thereof include dimethylcarbamoyl, diethylcarbamoyl and the like.
  • “Monoalkylsulfamoyl” means a group in which the above “alkyl” is replaced with one hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the sulfamoyl group. For example, methylsulfamoyl, dimethylsulfamoyl, etc. are mentioned.
  • Dialkylsulfamoyl means a group in which the above “alkyl” is replaced with two hydrogen atoms bonded to the nitrogen atom of the sulfamoyl group.
  • Two alkyl groups may be the same or different. Examples thereof include dimethylsulfamoyl and diethylsulfamoyl.
  • Trialkylsilyl means a group in which the above three “alkyls” are bonded to a silicon atom.
  • the three alkyls may be the same or different.
  • trimethylsilyl, triethylsilyl, tert-butyldimethylsilyl and the like can be mentioned.
  • “Aromatic carbocyclic alkyl” means an alkyl substituted with one or more of the above “aromatic carbocyclic groups”. For example, benzyl, phenethyl, phenylpropyl, benzhydryl, trityl, naphthylmethyl, groups shown below Etc.
  • aromatic carbocyclic alkyl Preferable embodiments of “aromatic carbocyclic alkyl” include benzyl, phenethyl and benzhydryl.
  • Non-aromatic carbocyclic alkyl means alkyl substituted with one or more of the above “non-aromatic carbocyclic groups”.
  • the “non-aromatic carbocyclic alkyl” also includes “non-aromatic carbocyclic alkyl” in which the alkyl moiety is substituted with the above “aromatic carbocyclic group”. For example, cyclopropylmethyl, cyclobutylmethyl, cyclopentylmethyl, cyclohexylmethyl, groups shown below Etc.
  • “Aromatic heterocyclic alkyl” means alkyl substituted with one or more of the above “aromatic heterocyclic groups”. “Aromatic heterocyclic alkyl” also includes “aromatic heterocyclic alkyl” in which the alkyl moiety is substituted with the above “aromatic carbocyclic group” and / or “non-aromatic carbocyclic group”. .
  • pyridylmethyl furanylmethyl, imidazolylmethyl, indolylmethyl, benzothiophenylmethyl, oxazolylmethyl, isoxazolylmethyl, thiazolylmethyl, isothiazolylmethyl, pyrazolylmethyl, isopyrazolylmethyl, pyrrolidinylmethyl, benz Oxazolylmethyl, group shown below Etc.
  • Non-aromatic heterocyclic alkyl means an alkyl substituted with one or more of the above “non-aromatic heterocyclic groups”.
  • the alkyl portion is substituted with the above “aromatic carbocyclic group”, “non-aromatic carbocyclic group” and / or “aromatic heterocyclic group”.
  • non-aromatic heterocyclic alkyl For example, tetrahydropyranylmethyl, morpholinylethyl, piperidinylmethyl, piperazinylmethyl, groups shown below Etc.
  • “Aromatic carbocyclic alkyloxy” means alkyloxy substituted with one or more of the above “aromatic carbocyclic groups”. For example, benzyloxy, phenethyloxy, phenylpropyloxy, benzhydryloxy, trityloxy, naphthylmethyloxy, groups shown below Etc.
  • Non-aromatic carbocyclic alkyloxy means alkyloxy substituted with one or more of the above “non-aromatic carbocyclic groups”.
  • the “non-aromatic carbocyclic alkyloxy” also includes “non-aromatic carbocyclic alkyloxy” in which the alkyl moiety is substituted with the above “aromatic carbocyclic group”. For example, cyclopropylmethyloxy, cyclobutylmethyloxy, cyclopentylmethyloxy, cyclohexylmethyloxy, groups shown below Etc.
  • “Aromatic heterocyclic alkyloxy” means alkyloxy substituted with one or more of the above “aromatic heterocyclic groups”. “Aromatic heterocyclic alkyloxy” also includes “aromatic heterocyclic alkyloxy” in which the alkyl moiety is substituted with the above “aromatic carbocyclic group” and / or “non-aromatic carbocyclic group”. Include.
  • Non-aromatic heterocyclic alkyloxy means alkyloxy substituted with one or more of the above “non-aromatic heterocyclic groups”.
  • the alkyl moiety is substituted with the above “aromatic carbocyclic group”, “non-aromatic carbocyclic group” and / or “aromatic heterocyclic group”. It also includes “non-aromatic heterocyclic alkyloxy”. For example, tetrahydropyranylmethyloxy, morpholinylethyloxy, piperidinylmethyloxy, piperazinylmethyloxy, groups shown below Etc.
  • “Aromatic carbocyclic alkyloxycarbonyl” means alkyloxycarbonyl substituted with one or more of the above “aromatic carbocyclic groups”. For example, benzyloxycarbonyl, phenethyloxycarbonyl, phenylpropyloxycarbonyl, benzhydryloxycarbonyl, trityloxycarbonyl, naphthylmethyloxycarbonyl, groups shown below Etc.
  • Non-aromatic carbocyclic alkyloxycarbonyl means alkyloxycarbonyl substituted with one or more of the above “non-aromatic carbocyclic groups”.
  • the “non-aromatic carbocyclic alkyloxycarbonyl” also includes “non-aromatic carbocyclic alkyloxycarbonyl” in which the alkyl moiety is substituted with the above “aromatic carbocyclic group”. For example, cyclopropylmethyloxycarbonyl, cyclobutylmethyloxycarbonyl, cyclopentylmethyloxycarbonyl, cyclohexylmethyloxycarbonyl, groups shown below Etc.
  • “Aromatic heterocyclic alkyloxycarbonyl” means alkyloxycarbonyl substituted with one or more of the above “aromatic heterocyclic groups”.
  • the “aromatic heterocyclic alkyloxycarbonyl” is an “aromatic heterocyclic alkyloxycarbonyl” in which the alkyl moiety is substituted with the above “aromatic carbocyclic group” and / or “non-aromatic carbocyclic group”. Is also included.
  • pyridylmethyloxycarbonyl furanylmethyloxycarbonyl, imidazolylmethyloxycarbonyl, indolylmethyloxycarbonyl, benzothiophenylmethyloxycarbonyl, oxazolylmethyloxycarbonyl, isoxazolylmethyloxycarbonyl, thiazolylmethyl Oxycarbonyl, isothiazolylmethyloxycarbonyl, pyrazolylmethyloxycarbonyl, isopyrazolylmethyloxycarbonyl, pyrrolidinylmethyloxycarbonyl, benzoxazolylmethyloxycarbonyl, groups shown below Etc.
  • Non-aromatic heterocyclic alkyloxycarbonyl means alkyloxycarbonyl substituted with one or more of the above “non-aromatic heterocyclic groups”.
  • the alkyl moiety is substituted with the above “aromatic carbocyclic group”, “non-aromatic carbocyclic group” and / or “aromatic heterocyclic group”.
  • non-aromatic heterocyclic alkyloxycarbonyl For example, tetrahydropyranylmethyloxy, morpholinylethyloxy, piperidinylmethyloxy, piperazinylmethyloxy, groups shown below Etc.
  • “Aromatic carbocyclic alkyloxyalkyl” means alkyloxyalkyl substituted with one or more of the above “aromatic carbocyclic groups”. For example, benzyloxymethyl, phenethyloxymethyl, phenylpropyloxymethyl, benzhydryloxymethyl, trityloxymethyl, naphthylmethyloxymethyl, groups shown below Etc.
  • Non-aromatic carbocyclic alkyloxyalkyl means alkyloxyalkyl substituted with one or more of the above “non-aromatic carbocyclic groups”.
  • non-aromatic carbocyclic alkyloxyalkyl means “non-aromatic carbocyclic alkyloxyalkyl” in which the alkyl moiety to which the non-aromatic carbocycle is bonded is substituted with the above “aromatic carbocyclic group”. Is also included. For example, cyclopropylmethyloxymethyl, cyclobutylmethyloxymethyl, cyclopentylmethyloxymethyl, cyclohexylmethyloxymethyl, groups shown below Etc.
  • “Aromatic heterocyclic alkyloxyalkyl” means alkyloxyalkyl substituted with one or more of the above “aromatic heterocyclic groups”.
  • the “aromatic heterocycle alkyloxyalkyl” is obtained by substituting the alkyl moiety to which the aromatic heterocycle is bonded with the above “aromatic carbocyclic group” and / or “non-aromatic carbocyclic group”. Also included are “aromatic heterocyclic alkyloxyalkyl”.
  • pyridylmethyloxymethyl furanylmethyloxymethyl, imidazolylmethyloxymethyl, indolylmethyloxymethyl, benzothiophenylmethyloxymethyl, oxazolylmethyloxymethyl, isoxazolylmethyloxymethyl, thiazolylmethyl Oxymethyl, isothiazolylmethyloxymethyl, pyrazolylmethyloxymethyl, isopyrazolylmethyloxymethyl, pyrrolidinylmethyloxymethyl, benzoxazolylmethyloxymethyl, groups shown below Etc.
  • Non-aromatic heterocyclic alkyloxyalkyl means alkyloxyalkyl substituted with one or more of the above “non-aromatic heterocyclic groups”.
  • non-aromatic heterocyclic alkyloxy means that the alkyl moiety to which the non-aromatic heterocyclic ring is bonded is the above “aromatic carbocyclic group”, “non-aromatic carbocyclic group” and / or “aromatic”.
  • non-aromatic heterocyclic alkyloxyalkyl substituted with “aromatic heterocyclic group”. For example, tetrahydropyranylmethyloxymethyl, morpholinylethyloxymethyl, piperidinylmethyloxymethyl, piperazinylmethyloxymethyl, groups shown below Etc.
  • “Aromatic carbocyclic alkylamino” means a group in which the above “aromatic carbocyclic alkyl” is replaced with one or two hydrogen atoms bonded to the nitrogen atom of the amino group. Examples include benzylamino, phenethylamino, phenylpropylamino, benzhydrylamino, tritylamino, naphthylmethylamino, dibenzylamino and the like.
  • Non-aromatic carbocyclic alkylamino means a group in which the above “non-aromatic carbocyclic alkyl” is replaced with one or two hydrogen atoms bonded to the nitrogen atom of the amino group.
  • cyclopropylmethylamino, cyclobutylmethylamino, cyclopentylmethylamino, cyclohexylmethylamino and the like can be mentioned.
  • “Aromatic heterocyclic alkylamino” means a group in which the above “aromatic heterocyclic alkyl” is replaced with one or two hydrogen atoms bonded to the nitrogen atom of the amino group.
  • aromatic heterocyclic alkyl For example, pyridylmethylamino, furanylmethylamino, imidazolylmethylamino, indolylmethylamino, benzothiophenylmethylamino, oxazolylmethylamino, isoxazolylmethylamino, thiazolylmethylamino, isothiazolylmethylamino , Pyrazolylmethylamino, isopyrazolylmethylamino, pyrrolidinylmethylamino, benzoxazolylmethylamino and the like.
  • Non-aromatic heterocyclic alkylamino means a group in which the above-mentioned “non-aromatic heterocyclic alkyl” is replaced with one or two hydrogen atoms bonded to the nitrogen atom of the amino group.
  • non-aromatic heterocyclic alkyl For example, tetrahydropyranylmethylamino, morpholinylethylamino, piperidinylmethylamino, piperazinylmethylamino and the like can be mentioned.
  • aromatic carbocyclic oxy means a group in which an “aromatic carbocycle” is bonded to an oxygen atom.
  • aromatic carbocyclic carbonyl means a group in which an “aromatic carbocycle” is bonded to a carbonyl group.
  • “Aromatic carbocyclic oxycarbonyl” means a group in which the above “aromatic carbocyclic oxy” is bonded to a carbonyl group.
  • “Aromatic carbocyclic sulfanyl” means a group in which an “aromatic carbocyclic ring” is replaced with a hydrogen atom bonded to a sulfur atom of a sulfanyl group. Examples thereof include phenylsulfanyl and naphthylsulfanyl.
  • “Aromatic carbocyclic sulfonyl” means a group in which “aromatic carbocycle” is bonded to a sulfonyl group.
  • aromatic carbocycle for example, phenylsulfonyl, naphthylsulfonyl and the like can be mentioned.
  • Non-aromatic carbocyclic oxy “non-aromatic carbocyclic carbonyl”, “non-aromatic carbocyclic oxycarbonyl”, “non-aromatic carbocyclic sulfanyl”, and “non-aromatic carbocyclic sulfonyl”
  • the “aromatic carbocyclic” moiety is the same as the above “non-aromatic carbocyclic group”.
  • Non-aromatic carbocyclic oxy means a group in which “non-aromatic carbocycle” is bonded to an oxygen atom. For example, cyclopropyloxy, cyclohexyloxy, cyclohexenyloxy and the like can be mentioned.
  • Non-aromatic carbocycle carbonyl means a group in which “non-aromatic carbocycle” is bonded to a carbonyl group.
  • cyclopropylcarbonyl, cyclohexylcarbonyl, cyclohexenylcarbonyl and the like can be mentioned.
  • the “non-aromatic carbocyclic oxycarbonyl” means a group in which the above “non-aromatic carbocyclic oxy” is bonded to a carbonyl group.
  • cyclopropyloxycarbonyl, cyclohexyloxycarbonyl, cyclohexenyloxycarbonyl and the like can be mentioned.
  • Non-aromatic carbocyclic sulfanyl means a group in which a “non-aromatic carbocyclic ring” is replaced with a hydrogen atom bonded to a sulfur atom of a sulfanyl group. Examples include cyclopropylsulfanyl, cyclohexylsulfanyl, cyclohexenylsulfanyl and the like.
  • Non-aromatic carbocycle sulfonyl means a group in which “non-aromatic carbocycle” is bonded to a sulfonyl group. For example, cyclopropylsulfonyl, cyclohexylsulfonyl, cyclohexenylsulfonyl and the like can be mentioned.
  • aromatic heterocycle portion of “aromatic heterocycle oxy”, “aromatic heterocycle carbonyl”, “aromatic heterocycle oxycarbonyl”, “aromatic heterocycle sulfanyl”, and “aromatic heterocycle sulfonyl”
  • Aromatic heterocycle oxy means a group in which “aromatic heterocycle” is bonded to an oxygen atom.
  • pyridyloxy, oxazolyloxy and the like can be mentioned.
  • Aromatic heterocycle carbonyl means a group in which “aromatic heterocycle” is bonded to a carbonyl group.
  • “Aromatic heterocyclic oxycarbonyl” means a group in which the above “aromatic heterocyclic oxy” is bonded to a carbonyl group.
  • “Aromatic heterocycle sulfanyl” means a group in which an “aromatic heterocycle” is replaced with a hydrogen atom bonded to a sulfur atom of a sulfanyl group.
  • pyridylsulfanyl, oxazolylsulfanyl and the like can be mentioned.
  • “Aromatic heterocycle sulfonyl” means a group in which “aromatic heterocycle” is bonded to a sulfonyl group.
  • aromatic heterocycle for example, pyridylsulfonyl, oxazolylsulfonyl and the like can be mentioned.
  • Non-aromatic heterocyclic oxy means a group in which “non-aromatic heterocyclic” is bonded to an oxygen atom.
  • Non-aromatic heterocyclic oxy means a group in which “non-aromatic heterocyclic” is bonded to an oxygen atom.
  • piperidinyloxy, tetrahydrofuryloxy and the like can be mentioned.
  • Non-aromatic heterocyclic carbonyl means a group in which “non-aromatic heterocyclic” is bonded to a carbonyl group.
  • piperidinylcarbonyl, tetrahydrofurylcarbonyl and the like can be mentioned.
  • the “non-aromatic heterocyclic oxycarbonyl” means a group in which the “non-aromatic heterocyclic oxy” is bonded to a carbonyl group.
  • piperidinyloxycarbonyl, tetrahydrofuryloxycarbonyl and the like can be mentioned.
  • Non-aromatic heterocyclic sulfanyl means a group in which a “non-aromatic heterocyclic ring” is replaced with a hydrogen atom bonded to a sulfur atom of a sulfanyl group.
  • piperidinylsulfanyl, tetrahydrofurylsulfanyl and the like can be mentioned.
  • Non-aromatic heterocyclic sulfonyl means a group in which “non-aromatic heterocyclic” is bonded to a sulfonyl group.
  • piperidinylsulfonyl, tetrahydrofurylsulfonyl and the like can be mentioned.
  • the carbon atom at any position may be bonded to one or more groups selected from the following substituents.
  • substituents halogen, hydroxy, carboxy, amino, imino, hydroxyamino, hydroxyimino, formyl, formyloxy, carbamoyl, sulfamoyl, sulfanyl, sulfino, sulfo, thioformyl, thiocarboxy, dithiocarboxy, thiocarbamoyl, cyano, nitro, nitroso , Azide, hydrazino, ureido, amidino, guanidino, trialkylsilyl, alkyloxy, alkenyloxy, alkynyloxy, haloalkyloxy, alkylcarbonyl, alkenylcarbonyl, alkynylcarbonyl, monoalkylamino, dialkylamino, alkylsulfonyl, alkeny
  • An atom at any position on the ring may be bonded to one or more groups selected from the following substituents.
  • substituents halogen, hydroxy, carboxy, amino, imino, hydroxyamino, hydroxyimino, formyl, formyloxy, carbamoyl, sulfamoyl, sulfanyl, sulfino, sulfo, thioformyl, thiocarboxy, dithiocarboxy, thiocarbamoyl, cyano, nitro, nitroso , Azide, hydrazino, ureido, amidino, guanidino, trialkylsilyl, alkyl, alkenyl, alkynyl, haloalkyl, alkyloxy, alkenyloxy, alkynyloxy, haloalkyloxy, alkyloxyalkyl, alkylcarbonyl, alkylcarbonyl, alkyl,
  • substituted or unsubstituted non-aromatic carbocyclic group and “substituted or unsubstituted non-aromatic heterocyclic group” may be substituted with “oxo”. In this case, it means a group in which two hydrogen atoms on a carbon atom are substituted as follows.
  • the present invention also encompasses a pharmaceutical composition containing the “double-stranded oligonucleotide” of the present invention.
  • a pharmaceutical composition containing the “double-stranded oligonucleotide” of the present invention As the administration method and preparation of the pharmaceutical composition of the present invention, any administration method and preparation known in the art can be used. Antisense oligonucleotide administration methods and preparations are also disclosed in, for example, the following documents. International Publication No. 2004/016749, International Publication No. 2005/083124, International Publication No. 2007/143315, International Publication No. 2009/071680, International Publication No. 2013/0889283, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered by various methods depending on whether local or systemic treatment is desired or on the region to be treated.
  • the administration method may be, for example, topical (including eye drops, intravaginal, rectal, intranasal, transdermal), oral, or parenteral.
  • Parenteral administration includes intravenous injection or infusion, subcutaneous, intraperitoneal or intramuscular injection, pulmonary administration by inhalation or inhalation, intradural administration, intraventricular administration, and the like. Intravenous injection or subcutaneous administration is preferred.
  • compositions for oral administration include powders, granules, suspensions or solutions dissolved in water or non-aqueous media, capsules, powders, tablets and the like.
  • compositions for parenteral, subdural space, or intraventricular administration include sterile aqueous solutions containing buffers, diluents and other suitable additives.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises various pharmaceutical additives such as excipients, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, diluents and the like suitable for the dosage form in the effective amount of the antisense oligonucleotide of the present invention.
  • the agent can be obtained by mixing as necessary. In the case of an injection, it may be sterilized with an appropriate carrier to form a preparation.
  • Excipients include lactose, sucrose, glucose, starch, calcium carbonate or crystalline cellulose.
  • binder include methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, gelatin, and polyvinyl pyrrolidone.
  • disintegrant include carboxymethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, starch, sodium alginate, agar powder, or sodium lauryl sulfate.
  • lubricant include talc, magnesium stearate or macrogol. As a suppository base, cocoa butter, macrogol, methylcellulose, or the like can be used.
  • solubilizers when preparing as liquid or emulsion or suspension injections, commonly used solubilizers, suspending agents, emulsifiers, stabilizers, preservatives, isotonic agents, etc. are added as appropriate. You may do it. In the case of oral administration, flavoring agents, fragrances and the like may be added.
  • the optimal dosing schedule can be calculated from measurements of drug accumulation in the body. Persons of ordinary skill in the art can determine optimum dosages, dosing methodologies and repetition rates. The optimal dose will vary depending on the relative potency of the individual antisense oligonucleotides, but can generally be calculated based on the IC50 or EC50 in in vitro and in vivo animal experiments.
  • an antisense oligonucleotide derived from the antisense oligonucleotide sequence and chemical structure
  • an effective dose derived experimentally
  • IC50 for example, mg / kg
  • the NMR analysis obtained in the examples was performed at 300 MHz and measured using DMSO-d6 or CDCl 3 .
  • Step 1 Synthesis of Compound 102 Sodium hydride (60% w / w, 5.26 g, 1.5 eq.) was added to a solution of Compound 101 (15.0 g, 88.0 mmol) in N, N′-dimethylformamide (100 mL) at room temperature. ) And stirred for 30 minutes, then benzyl bromide (10.42 g, 88.0 mmol) was added and stirred at room temperature for 5.5 hours. Methanol (5 ml) was added to the reaction mixture, saturated brine was added, the mixture was extracted with ethyl acetate, washed with saturated brine, and dried over magnesium sulfate.
  • Step 2 Synthesis of Compound 103
  • pyridinium dichromate (19.3 g, 51.3 mmol)
  • ethyl acetate 200 mL
  • saturated brine was added to the filtrate, extracted with ethyl acetate, washed with saturated brine, and then dried over magnesium sulfate.
  • Step 3 Synthesis of Compound 104 and Compound 105
  • Compound 104 was synthesized by the method described in Example 3 of International Publication No. 2012/037254, and then Compound 105 was synthesized.
  • Step 4 Synthesis of Compound 106 To a solution of Compound 103 (218 mg, 17.1 mmol) in N, N′-dimethylformamide (3 mL) at room temperature, N, N′-diisopropylethylamine (405 ⁇ l, 2.32 mmol), HBTU (324 mg, 0 .855 mmol) was added and stirred at room temperature for 10 minutes, and then a solution of compound 105 (218 mg, 17.1 mmol) in N, N′-dimethylformamide (3 mL), N, N′-diisopropylethylamine (75 ⁇ l, 0.428 mmol) And stirred at room temperature for 12 hours.
  • reaction solution was diluted with chloroform, washed successively with 10% aqueous sodium hydrogen carbonate solution and saturated brine, then dried over magnesium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure.
  • Step 5 Synthesis of Compound 107
  • Pd—C 10%, 50 mg
  • the catalyst was filtered off from the reaction solution, and the filtrate was concentrated to obtain Compound 107 (79 mg, yield 92%) as a colorless powder.
  • ESI-MS (m / z): 1992.10 (M-1).
  • Step 6 Synthesis of Compound 1 To a methylene chloride solution (7 mL) of Compound 107 (722 mg, 0.362 mmol) at 0 ° C., N, N′-diisopropylethylamine (253 ⁇ l, 1.45 mmol), 3- (chloro (diisopropylamino) Phosphinoxy) propanenitrile (0.162 ml, 0.725 mmol) was added and stirred at room temperature for 2 hours. The reaction mixture was diluted with methylene chloride, washed successively with 10% aqueous sodium hydrogen carbonate solution and saturated brine, and dried over magnesium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure.
  • Step 1 Synthesis of Compound 109
  • the compound 109 was synthesized in two steps from Compound 108 according to the method described in Bioorganic Medicinal Chemistry Letters, 11, 383-386 (2001).
  • Step 2 Synthesis of Compound 110 Compound 109 (11.84 g, 19.2 mmol) in N, N′-dimethylformamide solution (50 mL) at room temperature with imidazole (1.57 g, 23.1 mmol, 1.2 eq.), Third Butyldimethylsilyl chloride (1.59 g, 21.2 mmol, 1.1 eq.) was sequentially added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours.
  • reaction mixture was diluted with ethyl acetate, washed successively with 10% aqueous sodium hydrogen carbonate solution and saturated brine, and dried over magnesium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure to give compound 110 (14.35 g, crude product).
  • Step 3 Synthesis of Compound 111 Piperidine was added to a solution of Compound 110 (14.35 g, crude) in N, N′-dimethylformamide (50 mL) and stirred at room temperature for 5.5 hours, and then the reaction solution was concentrated under reduced pressure. Gave a crude product of compound 111 (14.46 g).
  • Step 4 Synthesis of Compound 112 N, N′-diisopropylethylamine (4) was added to a solution of 12-methoxy-12-oxododecanoic acid (1.81 g, 7.40 mmol) in N, N′-dimethylformamide (10 ml) at room temperature.
  • Step 5 Synthesis of Compound 113
  • a compound 112 (2.70 g, 3.68 mmol) in methanol (20 ml) -tetrahydrofuran (8 ml) was added 2 mol / L aqueous sodium hydroxide solution (3.68 ml, 2 eq.) At room temperature. For 2 hours. The reaction solution was neutralized by adding 2 mol / L hydrochloric acid at ⁇ 78 ° C., diluted with ethyl acetate, washed successively with saturated brine, then dried over magnesium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure. Compound 113 (2.23 g, yield 88%) was obtained.
  • Step 6 Synthesis of Compound 114 To a solution of Compound 113 (671 mg, 17.1 mmol) in N, N′-dimethylformamide (5 mL) at room temperature, N, N′-diisopropylethylamine (0.549 ml, 3.14 mmol), HBTU (358 mg) 0.94 mmol), and the mixture was stirred at room temperature for 10 minutes, and then a solution of compound 105 (1.20 g, 0.629 mmol) in N, N′-dimethylformamide (5 mL), N, N′-diisopropylethylamine (0. 132 ml, 0.755 mmol) was added and stirred at room temperature for 12 hours.
  • Step 7 Synthesis of Compound 115
  • ESI-MS (m / z): 1214 (M / 2 + Na).
  • Step 1 Synthesis of Compound 117
  • a pyridine solution (40 ml) of Compound 116 (10.0 g, 30.9 mmol) was added 4,4′-dimethoxytrityl chloride (11.0 g, 32.5 mmol, 1.05 eq.) At room temperature. And stirred at room temperature for 2 hours. The reaction mixture was diluted with ethyl acetate, washed successively with 10% aqueous sodium hydrogen carbonate solution and saturated brine, and dried over magnesium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure to give compound 117 (22.95 g, crude product).
  • Step 2 Synthesis of Compound 118 Piperidine (3.65 ml, 36.9 mmol) was added to a solution of Compound 117 (22.85 g, crude) in N, N′-dimethylformamide (70 ml), and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. The liquid was concentrated under reduced pressure to obtain a crude product of Compound 118 (22.75 g).
  • Step 3 Synthesis of Compound 119
  • Compound 119 was obtained as a colorless foam (yield 69% from Compound 117).
  • 1 H-NMR was observed as a 6: 4 rotamer mixture.
  • Step 4 Synthesis of Compound 120 By the same method as in Step 2, compound 120 was obtained as a crude product.
  • Step 5 Synthesis of Compound 121 By the same method as in Step 4 of Compound 4, Compound 121 was obtained as a colorless foam (46% yield from Compound 119).
  • ESI-MS m / z: 854 (M + Na), 830 (MH).
  • Step 6 Synthesis of Compound 122
  • Compound 122 was obtained as a colorless foam (yield 90%).
  • ESI-MS (m / z): 816 (M-H).
  • Step 7 Synthesis of Compound 123
  • Compound 123 was obtained as a colorless foam (yield 61%).
  • ESI-MS (m / z): 1319 (M / 2 + Na).
  • Step 8 Synthesis of Compound 124
  • ESI-MS (m / z): 1262 (M / 2 + Na).
  • Step 9 Synthesis of Compound 5
  • Compound 124 (545 mg, 0.220 mmol) in dichloromethane solution (4 ml) at room temperature with triethylamine (0.061 ml, 0.440 mmol, 2.0 eq.), Succinic anhydride (33 mg, 0.330 mmol, 1.5 eq.) And dimethylaminopyridine (5 mg) were added and stirred at room temperature for 2 hours, and then the reaction solution was concentrated under reduced pressure.
  • Step 2 Synthesis of Compound 134
  • Compound 134 was obtained as a colorless foamy substance in the same manner as in Step 6 of Compound 4 (yield 57%).
  • Step 3 Synthesis of Compound 135
  • Compound 135 was obtained as a colorless powder by the same step as in Step 7 of Compound 4 (yield 60%).
  • ESI-MS m / z: 1157 (M + Na).
  • Step 4 Synthesis of Compound 7 Compound 7 is obtained in the same manner as in Step 8 of Compound 4.
  • Step 1 Synthesis of Compound 136
  • Compound 136 was obtained as a colorless foam by the same method as in Step 1 of Compound 7 (yield 85%).
  • 1 H-NMR was observed as a 63:37 rotamer mixture.
  • Step 2 Synthesis of Compound 137
  • Compound 137 was obtained as a colorless foamy substance in the same manner as in Step 4 of Compound 4 (yield 50%).
  • 1 H-NMR was observed as a 70:30 rotamer mixture.
  • ESI-MS (m / z): 1263 (M / 2 + Na).
  • Step 3 Synthesis of Compound 138
  • Compound 138 was obtained as a colorless foamy substance in the same manner as in Step 5 of Compound 5 (yield 80%).
  • Step 4 Synthesis of Compound 8
  • Compound 8 was obtained as a colorless foamy substance in the same manner as in Step 9 of Compound 5 (yield 82%).
  • ESI-MS (m / z): 1255 (M / 2 + Na).
  • Step 1 Synthesis of Compound 140
  • Compound 140 was obtained as a colorless foamy substance in the same manner as in Step 7 of Compound 7 (yield 57%).
  • ESI-MS (m / z): 663 (MH).
  • Step 2 Synthesis of Compound 141
  • Compound 141 was obtained as a colorless foamy substance in the same manner as in Step 6 of Compound 4 (yield 57%).
  • Step 3 Synthesis of Compound 142
  • Compound 142 was obtained as a colorless foam by the same method as in Step 5 of Compound 5 (yield 68%).
  • Step 4 Synthesis of Compound 9
  • Compound 9 was obtained as a colorless foam by the same method as in Step 5 of Compound 5 (yield 83%).
  • Step 1 Synthesis of Compound 144 To a 1,2-dimethoxyethane solution (100 mL) of Compound 143 (10.0 g, 37.7 mmol) at room temperature (4-tert-butoxycarbonyl) phenyl) boronic acid (9.21 g, 41.41). 5 mmol), 2 mol / L aqueous potassium carbonate solution (56.6 ml, 113 mmol) and PdCl 2 (dppf) (3.07 g, 3.77 mmol) were added, and the mixture was stirred at 80 ° C. for 1 hour.
  • Step 3 Synthesis of Compound 146
  • Compound 146 was obtained as a colorless solid in the same manner as in Step 4 of Compound 4 (yield 74%).
  • Step 4 Synthesis of Compound 147
  • After treating in the same manner as in Step 5 of Compound 4, purify by silica gel column chromatography (chloroform: methanol: triethylamine 97.5: 2.5: 1 ⁇ 90: 10: 1).
  • Gave compound 147 as a colorless solid (47% yield).
  • 1 H-NMR was observed as a 60:40 rotamer mixture.
  • Step 5 Synthesis of Compound 148
  • Compound 148 was obtained as a colorless foamy substance in the same manner as in Step 6 of Compound 4 (yield 52%).
  • 1 H-NMR was observed as a 59:41 rotamer mixture.
  • Step 6 Synthesis of Compound 149
  • Compound 149 was obtained as a colorless foamy substance in the same manner as in Step 5 of Compound 5 (yield%).
  • Step 7 Synthesis of Compound 14 By the same method as in Step 5 of Compound 5, Compound 14 was obtained as a colorless foam (yield 82%).
  • Step 1 Synthesis of Compound 151 Sodium hydride (116 mg, 2 mg) was added to a tetrahydrofuran solution (100 mL) in which Compound 150 (18.1 g, 76.0 mmol) and methyl acrylate (5.0 g, 5.23 mmol) were dissolved. .90 mmol) was added, followed by stirring at the same temperature for 2 hours. The reaction mixture was diluted with ethyl acetate, washed with saturated aqueous ammonium chloride solution and saturated brine, and dried over magnesium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure.
  • Step 2 Synthesis of Compound 152 To a methanol (10 mL) solution in which Compound 151 (1.02 g, 3.13 mmol) was dissolved, 10% palladium carbon (200 mg) was added, and the mixture was stirred at room temperature under a normal pressure hydrogen stream for 12 hours. The catalyst was filtered off from the reaction solution, and the filtrate was concentrated. The obtained residue was dissolved in a mixed solution of acetonitrile (5 ml) -water (5 ml), and then 2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl (98 mg, 0.625 mmol), iodobenzene diaceter at room temperature. (2.22 g, 6.88 mmol) was added and stirred at the same temperature for 1 hour.
  • Step 3 Synthesis of Compound 153
  • Compound 153 was obtained as a colorless oil by the same method as in Step 4 of Compound 4 (yield 70%).
  • 1 H-NMR was observed as a 60:40 rotamer mixture.
  • ESI-MS (m / z): 859 (M + Na).
  • Step 5 Synthesis of Compound 155
  • Compound 155 was obtained as a colorless foam (yield 46%).
  • 1 H-NMR was observed as a 60:40 rotamer mixture.
  • Step 6 Synthesis of Compound 156
  • Compound 156 was obtained as a colorless foamy substance in the same manner as in Step 5 of Compound 5 (yield 66%).
  • Step 7 Synthesis of Compound 18 By the same method as in Step 5 of Compound 5, Compound 18 was obtained as a colorless foam (yield 75%).
  • Step 1 Synthesis of Compound 157 Synthesized according to the method described in International Publication No. 2011/148922.
  • Step 2 Synthesis of Compound 158
  • Compound 158 was synthesized from Compound 157 in two steps by a method similar to the method described in Bioorganic Medicinal Chemistry Letters, 11, 383-386 (2001).
  • Step 7 Synthesis of Compound 163
  • Compound 163 was obtained as a colorless foamy substance in the same manner as in Step 4 of Compound 4 (yield 83%).
  • ESI-MS (m / z) 1220 (M / 2 + Na).
  • Step 8 Synthesis of Compound 19 Compound 19 was obtained as a colorless foam by the same method as in Step 8 of Compound 4 (yield 71%).
  • Step 1 Synthesis of Compound 165
  • Oxalyl chloride (171 ⁇ L, 1.95 mmol) was added to a dichloromethane solution (3.6 mL) of Compound 164 (US 2012/0157509) (90 mg, 0.489 mmol) at room temperature. After stirring for 21 hours, the solvent was distilled off. The obtained residue was dissolved in dichloromethane (1.8 mL), and a solution of compound 105 (877 mg, 0.489 mmol) and pyridine (158 ⁇ L, 1.96 mmol) in dichloromethane (5.4 mL) was added under ice cooling for 7 hours. Stir. A 10% aqueous citric acid solution was added to the reaction solution, and the mixture was extracted with chloroform.
  • Step 1 Synthesis of Compound 167 Diethylamine (84 uL, 0.80 mmol) was added to a solution of Compound 166 (161 mg, 0.27 mmol) in N, N-dimethylformamide (1 mL) prepared according to the method described in EP 624377. ) And stirred at room temperature for 3 hours. Diethylamine and N, N-dimethylformamide were distilled off by concentrating the reaction solution under reduced pressure to make the reaction solution weight 1 g.
  • N, N-diisopropylethylamine 55 uL, 0.32 mmol
  • HBTU 44 mg, 0.12 mmol
  • DMF solution 2 mL
  • HBTU HBTU
  • 0.5 g corresponding to 0.13 mmol
  • water was added to the reaction solution, and the aqueous layer was washed with chloroform.
  • the residue obtained by concentration of the aqueous layer under reduced pressure was dissolved in N, N-dimethylformamide (2 mL).
  • Diisopropylethylamine (50 ⁇ L) was added to a DMF solution (2 mL) of compound 3 (290 mg, 100 ⁇ mol), and then stirred under ice cooling. A DMF solution (0.2 mL) of isobutyl chloroformate (13 ⁇ L, 100 ⁇ mol) was added and stirred for 3 minutes. Diisopropylethylamine (350 ⁇ L) was added to a DMF suspension of PrimerSupport 200 (underivatized support) (GE Healthcare) (1 g), and then the above-mentioned compound 3 reaction solution was added and stirred at room temperature for 24 hours.
  • PrimerSupport 200 underivatized support
  • oligonucleotides SEQ-1 to SEQ-36 shown in Tables 2 to 4 were synthesized by the following method. 1) Amidite synthesis DNA amidites, RNA amidites, and 2'OMe-RNA amidites having standard protecting groups were purchased from Proligo Reagents. Specifically, the following was used.
  • N6-benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'deoxyadenosine-3'-ON N'-diisopropyl-2-cyanoethyl phosphoramidite5'-O-dimethoxytritylthymidine-3'-O -N, N'-diisopropyl-2-cyanoethyl phosphoramidite, N2-tertbutylphenoxyacetyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'deoxyguanosine-3'-ON, N'-diisopropyl-2-cyanoethyl Phosphoramidite N4-benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'deoxycytidine-3'-ON, N'-diisopropyl-2-cyanoethyl phosphoramidite N6-benzoyl-5'-O-dimethoxy Trityl adenosine-2 'tertbut
  • AmNA amidite was synthesized based on the method described in International Publication No. 2011/052436 and the method described below.
  • Step 1 Synthesis of Compound 909 DMF (3.9 L) suspension of Compound 901 (1300 g, 2.53 mol according to the method described in Organic Letters, 7, 1569-1572 (2005)) under nitrogen atmosphere A solution of TBS chloride (1717 g, 11.39 mol) in DMF (2.6 L) was added dropwise at an internal temperature of 5 to 15 ° C. Subsequently, sodium iodide (1138 g, 7.59 mol) was added at an internal temperature of 10 to 20 ° C., and N-methylimidazole (999 mL, 12.7 mol) was added dropwise at the same temperature. The mixture was stirred at an internal temperature of 20 to 30 ° C. for 6 hours and allowed to stand overnight.
  • the reaction mixture was poured into a mixture of ethyl acetate (3.9 L) and ice water (10.4 L), and ethyl acetate (2.6 L) and water (2.6 L) were further added.
  • the organic layer was washed sequentially with 1 mol / L hydrochloric acid (6.5 L), 10% aqueous sodium carbonate solution (6.5 L), and 10% brine (6.5 L).
  • the solvent was distilled off under reduced pressure, and methanol (2.6 L) was added to the obtained residue (2.68 kg).
  • the solvent was distilled off again under reduced pressure to obtain a crude product of compound 909 (2.62 kg).
  • Step 2 Synthesis of Compound 910
  • methanol 6.5 L
  • 35% hydrochloric acid 633 mL, 7.59 mol
  • the reaction mixture was poured into a mixture of diisopropyl ether (6.5 L) and ice water (3.9 L), and diisopropyl ether (6.5 L) and water (2.6 L) were further added.
  • the aqueous layer was washed with diisopropyl ether (3.25 L), a solution of sodium carbonate (1073 g, 10.1 mol) in water (6.5 L) was added, and the mixture was extracted with ethyl acetate (19.5 L and 6.5 L). The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. The solvent was distilled off under reduced pressure, and tetrahydrofuran (2.6 L) was added to the obtained residue. The solvent was distilled off again under reduced pressure to obtain a crude product of compound 910 (1.08 kg).
  • Step 3 Synthesis of Compound 911 Under nitrogen atmosphere, a crude product (17.7 g) of Compound 910 obtained in Step 2 and a solution of pyridine (10.1 mL, 125 mmol) in tetrahydrofuran (80 mL) were added at an internal temperature of 0 to 10 ° C. Trifluoroacetic anhydride (17.8 mL, 125 mmol) was added dropwise and stirred for 1 hour. The reaction mixture was poured into a 20% aqueous sodium carbonate solution (112 mL) under ice cooling, and tetrahydrofuran (24 mL) and water (48 mL) were added.
  • Step 4 Synthesis of Compound 912 Under a nitrogen atmosphere, a solution of Compound 911 (450 g, 935 mmol) in dimethyl sulfoxide (1.35 L) was added to EDC (538 g, 2800 mmol), dimethyl sulfoxide (675 mL), pyridinium paratoluenesulfonate (235 g, 935 mmol). ) And dimethyl sulfoxide (225 mL) were sequentially added, and the mixture was stirred at an internal temperature of 20 to 30 ° C. for 2.5 hours.
  • Step 5 Synthesis of Compound 913
  • a solution of the crude product of Compound 912 obtained in Step 4 (540 g) in acetonitrile (1.8 L) 37% formalin aqueous solution (900 mL) and N-methylmorpholine (900 mL) were sequentially added.
  • the mixture was stirred at an internal temperature of 70-80 ° C. for 4 hours.
  • ethyl acetate (2.25 L) was added, followed by 4 mol / L hydrochloric acid (2.25 L) at an internal temperature of 10-20 ° C.
  • the organic layer was washed twice with water (2.25 L) to obtain an ethyl acetate solution containing compound 913.
  • Step 6 Synthesis of Compound 914 Into an ethyl acetate solution containing Compound 913 obtained in Step 5, sodium dihydrogen phosphate dihydrate (292 g, 1870 mmol) in water (1.35 L), squalene (898 mL, 1870 mmol) Acetonitrile (1.35 L) was sequentially added. A solution of sodium chlorite (423 g, 4670 mmol) in water (2.25 L) was added dropwise at an internal temperature of 20-30 ° C. and stirred for 3 hours.
  • aqueous layers were combined and washed with ethyl acetate (900 mL), and then ethyl acetate (5.4 L) and a 2 mol / L aqueous hydrochloric acid solution (2.25 L) were added to the aqueous layer.
  • the organic layer was washed with 10% brine (2.25 L) and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • the mixture was filtered, and the drying agent was washed with ethyl acetate (1.35 L).
  • potassium acetate (82.5 g, 841 mmol) and ethanol (338 mL) were added. The mixture was stirred at an internal temperature of 20-30 ° C. for 1 hour.
  • Step 1 Synthesis of Compound 915
  • a 1 mol / L tetrabutylammonium fluoride-tetrahydrofuran solution (0.888 mL, 0.888 mmol) was added to a suspension of compound 914 (455 mg, 0.807 mmol) in pyridine (4 mL).
  • the mixture was added dropwise, stirred at an internal temperature of 60 to 70 ° C. for 9 hours, and then allowed to stand overnight at room temperature. The next day, the mixture was further stirred at an internal temperature of 60 to 70 ° C. for 9 hours, and then allowed to stand overnight at room temperature.
  • EDC hydrochloride 310 mg, 1.62 mmol
  • EDC hydrochloride (310 mg, 1.62 mmol) was added, and the mixture was allowed to stand overnight at room temperature. After adding 4,4′-dimethoxytrityl chloride (547 mg, 1.61 mmol) and stirring at room temperature for 5 hours, further 4,4′-dimethoxytrityl chloride (547 mg, 1.61 mmol) was added and stirred for 2 hours. 5% Aqueous sodium hydrogen carbonate solution (10 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted with ethyl acetate (10 mL), and washed 3 times with water (5 mL). Each water wash was extracted with ethyl acetate (5 mL).
  • Step 2 Synthesis of Compound 916 (T Amidite)
  • Compound 916 was synthesized according to a method according to the method described in International Publication No. 2011/052436.
  • Step 1 Synthesis of Compound 917 Under a nitrogen atmosphere, N, O-bis (trimethylsilyl) was added to a suspension of compound 914 (170 g, 271 mmol) and 6-N-benzoyladenine (64.9 g, 271 mmol) in cyclopentyl methyl ether (1700 mL). ) Acetamide (466 mL, 1900 mmol) and TMSOTf (98 mL, 543 mmol) were added and stirred at 70-73 ° C. for 4 hours.
  • Tetrahydrofuran (2920 mL), 2 mol / L hydrochloric acid (1700 mL) and water (1020 mL) were added to the reaction solution under ice cooling, and then the organic layer and aqueous layer were partitioned.
  • the organic layer was 0.1 mol / L hydrochloric acid (1700 mL).
  • Chloroform (340 mL) was added to the residue obtained by distilling off the solvent under reduced pressure, and the resulting slurry obtained by stirring for 20 minutes was filtered.
  • the solid collected by filtration was washed with chloroform (510 mL) and then air-dried to obtain Compound 917 (165 g, yield 80.9%).
  • Step 2 Synthesis of Compound 918 Under a nitrogen atmosphere, a solution of Compound 917 (4.75 g, 7.44 mmol) in tetrahydrofuran (25 mL) was added 1 mol / L tetrabutylammonium fluoride-tetrahydrofuran solution (14.9 mL, 14.9 mmol). The solution was added dropwise and stirred at an internal temperature of 60 to 65 ° C. for 3.5 hours. EDC hydrochloride (1.71 g, 8.92 mmol) was added, and the mixture was stirred at an internal temperature of 60 to 65 ° C. for 1 hour.
  • Step 3 Synthesis of Compound 919 Under a nitrogen atmosphere, a solution of the crude product of compound 918 obtained in Step 2 (9.12 g) in dichloromethane (25 mL) was added DABCO (2.09 g, 18.6 mmol) and 4,4′- Dimethoxytrityl chloride (5.04 g, 14.9 mmol) was added and stirred at room temperature for 2 hours. 4,4′-Dimethoxytrityl chloride (1.26 g, 3.72 mmol) was added, and the mixture was further stirred for 2 hours.
  • a 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution (50 mL) and dichloromethane (50 mL) were added to the reaction solution, and the organic layer was washed with water (50 ml), and the aqueous wash was extracted with dichloromethane (50 mL).
  • the organic layers were combined, methanol (50 mL) was added, the solvent was distilled off until the weight reached 60 g, methanol (50 mL) was added again, and the solvent was distilled off until the weight reached 67 g. Methanol (25 mL) was added again, and the resulting slurry was stirred for 30 minutes at room temperature and filtered.
  • Step 4 Synthesis of Compound 920 (A Amidite)
  • a suspension of compound 919 500 mg, 0.702 mmol
  • N, N′-diisopropylethylamine 0.368 mL, 2.11 mmol
  • 2-cyanoethyl-N, N-diisopropylchlorophosphoramidite (0.235 mL, 1.05 mmol) was added dropwise and stirred at room temperature for 2 hours.
  • 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution 5 mL was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted with ethyl acetate (5 mL).
  • Step 1 Synthesis of Compound 921 N, O-bis (trimethylsilyl) was added to a suspension of compound 914 (15.0 g, 26.6 mmol) and guanine (4.02 g, 26.6 mmol) in cyclopentyl methyl ether (135 mL) under a nitrogen atmosphere.
  • Acetamide (65.1 mL, 266 mmol) and cyclopentyl methyl ether (7.5 mL) were added, and the mixture was stirred at an internal temperature of 60 to 70 ° C. for 10 minutes, then TMSOTf (11.83 g, 53.20 mmol) and cyclopentyl methyl ether (7 0.5 mL) was added and stirred for 2 hours.
  • Ethyl acetate (150 mL) was added to the reaction solution at an internal temperature of 20-30 ° C., and 2 mol / L hydrochloric acid (75 mL), tetrahydrofuran (150 mL) and water (75 mL) were further added at an internal temperature of 15-30 ° C., and the organic layer was washed with water. Washed twice with (150 mL). The washings were combined and extracted with ethyl acetate (150 mL) and washed with water (75 mL). The organic layers were combined and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Step 2 Synthesis of Compound 922 To a solution of Compound 921 (14.0 g, 23.9 mmol) and N-methylimidazole (7.60 mL, 95.4 mmol) in N, N′-dimethylacetamide (70 mL) under a nitrogen atmosphere A 1 mol / L tetrabutylammonium fluoride-tetrahydrofuran solution (28.6 mL, 28.6 mmol) and N, N′-dimethylacetamide (14 mL) were added, and the mixture was stirred at an internal temperature of 70 to 80 ° C. for 8 hours.
  • Step 3 Synthesis of Compound 923 Trimethylsilyl chloride (9.33 g, 85) was added to a suspension of compound 922 (7.50 g, 17.2 mmol) in pyridine (37.5 mL, 464 mmol) in a nitrogen atmosphere at an internal temperature of 10 to 20 ° C. .9 mmol) was added dropwise, followed by stirring at room temperature for 30 minutes. Next, phenoxyacetyl chloride (3.52 g, 20.6 mmol) was added dropwise at an internal temperature of 0 to 5 ° C., and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour.
  • the reaction mixture was diluted with ethyl acetate (150 mL), and a mixed solution of 10% brine (37.5 mL) and concentrated hydrochloric acid (30.0 mL) was added dropwise at an internal temperature of 0 to 10 ° C.
  • the organic layer was washed twice with 1 mol / L hydrochloric acid (75 mL) and water (75 mL), and then ethyl acetate (37.5 mL) and 2 mol / L hydrochloric acid methanol solution (38.7 mL, 77.4 mmol) were sequentially added. Stir at room temperature for 1 hour.
  • Step 4 Synthesis of Compound 924 (G Amidite) To a solution of Compound 923 (500 mg, 1.10 mmol) in dimethylacetamide (3.5 mL) under a nitrogen atmosphere was added 4,4′-dimethoxytrityl chloride (1.11 g, 3 .29 mmol) and DABCO (369 mg, 3.21 mmol) were added and stirred at room temperature for 2.5 hours. DABCO (369 mg, 3.21 mmol) and 2-cyanoethyldiisopropylchlorophosphoramidite (0.587 mL, 2.63 mmol) were added to the reaction solution at 10 ° C. or lower, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour.
  • Step 1 Synthesis of Compound 925 108.1 g of Compound 915 (Purity: 92.53%, Content: 100 g, 0.167 mol), DMF 300 ml, Imidazole 47.8 g (4.2 eq.), TBS Chloride 51.6 g (2. 05 eq.) And stirred at around 25 ° C. for 23 hours. Separation was performed by adding 600 ml of ethyl acetate and 600 ml of water, and the aqueous layer was re-extracted with 300 ml of ethyl acetate. The organic layers were mixed, washed with 600 ml of 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution and 600 ml of 5% brine, and the solvent was recovered.
  • Step 2 Synthesis of Compound 926
  • Compound 925 132.6 g (corresponding to 0.167 mol), acetonitrile 800 ml, triethylamine 50.7 g (3 eq.), 4-dimethylaminopyridine 2.0 g (0.1 eq.), 2 ′, 4 ′ , 6′-triisopropylsulfonyl chloride 65.8 g (1.3 eq.) was added and stirred at around 25 ° C. for 22 hours.
  • 800 ml of 25% aqueous ammonia was added and stirred at around 25 ° C. for 2 hours.
  • Acetonitrile was roughly recovered, and 400 ml of ethyl acetate and 400 ml of water were added for liquid separation, and the aqueous layer was re-extracted with 300 ml of ethyl acetate.
  • the organic layers were mixed, washed with 400 ml of 5% saline twice, and the solvent was recovered.
  • the solidified amorphous was loosened to obtain the desired compound 926 (192.8 g, crude yield 161.9% from compound 915).
  • Step 3 Synthesis of Compound 927 192.8 g (corresponding to 0.167 mol) of Compound 926, 500 ml of DMF, and 75.6 g (2 eq.) Of benzoic anhydride were added and stirred at around 25 ° C. for 22 hours. Separation was performed by adding 1000 ml of ethyl acetate and 1000 ml of 5% sodium hydrogen carbonate, and the aqueous layer was re-extracted with 500 ml of ethyl acetate. The organic layers were mixed, washed with 500 ml of 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution and 500 ml of 5% brine, and the solvent was recovered to obtain a crude product of compound 927.
  • Step 4 Compound 928 124.1 g (0.152 mol) of compound 927, tetrahydrofuran 869 ml, 1 mol / L tetrabutylammonium fluoride / tetrahydrofuran 182 ml (1.2 eq.) Were added, and the mixture was stirred for 2 hours. The solvent was recovered, and liquid separation was performed by adding 620 ml of ethyl acetate and 620 ml of 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution. The solvent was recovered by washing with 620 ml of 5% saline.
  • Oligonucleotide (SEQ-26) was purchased from Gene Design Co., Ltd. (Osaka, Japan).
  • oligonucleotides were confirmed to have the desired sequence synthesized when the molecular weights measured by UPLC / MS coincided with the theoretical molecular weights.
  • Xevo G2 Tof System (made by Waters) Column: Aquity OST C18 (2.1 ⁇ 50 mm) (manufactured by Waters) Mobile phase A solution: 200 mM 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol / 8 mM triethylamine B solution: methanol B concentration gradient: 10-30% (10 min) Temperature: 50 ° C Flow rate: 0.2 mL / min
  • the dose per mouse is 1.1 mg / kg in terms of antisense oligo amount, 3 It was administered intravenously or subcutaneously to 3 mg / kg or 10 mg / kg.
  • a solution of SEQ-1 was administered so that the dose per mouse was 10 mg / kg.
  • liver tissue was collected under somnopentyl anesthesia. RNA extraction from the liver was performed according to the manufacturer's recommended protocol using RNeasy 96 Universal Tissue Kit (Qiagen).
  • RNA 1000 ng was subjected to reverse transcription according to a standard protocol using SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR (manufactured by Life Science) to obtain cDNA. Quantitative PCR was performed using SYBR Premix Ex Taq II (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the primer sequence used to measure the expression level of mouse ACSL1 is Fw primer: AGGTGCTTCAGCCCACATC (SEQ ID NO: 3) Rv primer: AAAGTCCAACAGCCATCGCTTC (SEQ ID NO: 4)
  • the primer sequence used to measure the expression level of mouse GAPDH is: Fw primer: TGTGTCCGTCGTGGATCTGA (SEQ ID NO: 5) Rv primer: TTGCTGTTTGAAGTCGCAGAG (SEQ ID NO: 6) was used.
  • the knockdown efficiency was expressed as a ratio of the reduced amount of Acsl1 mRNA normalized by Gapdh to the physiological saline administration group.
  • GAPDH was used as an endogenous control, and the same primers as those used in the in vitro experiment were used.
  • Example 4 Evaluation of in vivo activity of double-stranded oligonucleotide of the present invention (4-1) Knockdown activity of double-stranded oligonucleotide of the present invention by intravenous administration or subcutaneous administration
  • single-stranded antisense oligo ACSL1 in the mouse liver of the double-stranded oligonucleotide (SEQ-8) of the present invention comprising a nucleotide (SEQ-1) and a sugar derivative (GalNAc derivative) having an interaction with the asialoglycoprotein receptor at the 5 ′ end of the sense strand
  • the knockdown activity was evaluated by changing the mRNA expression level.
  • Diet-induced obesity (DIO) mice were prepared by giving C57BL / 6J (male 7-week-old, Claire Japan) a high fat fat diet (60% kcal fat: manufactured by TestDiet) for 4 weeks.
  • C57BL / 6J male 7-week-old, Claire Japan
  • a high fat fat diet (60% kcal fat: manufactured by TestDiet) for 4 weeks.
  • SEQ-8 solution dissolved in physiological saline (Otsuka raw food injection, Otsuka Pharmaceutical Factory) to DIO mice, the dose per mouse individual is 2.2 mg / kg in terms of antisense chain amount, 6 It was intravenously administered or subcutaneously administered so as to be 6 mg / kg and 20 mg / kg.
  • As a positive control a solution of SEQ-1 was administered so that the dose per mouse was 20 mg / kg.
  • the double-stranded oligonucleotide (SEQ-8) of the present invention improved the knockdown activity in a dose-dependent manner in both intravenous administration and subcutaneous administration, and single-stranded antisense oligonucleotide (SEQ-1). As a result, it was confirmed that the knockdown activity was improved about 9 times.
  • Diet-induced obesity (DIO) mice were prepared by giving C57BL / 6J (male 7-week-old, Claire Japan) a high fat fat diet (60% kcal fat: manufactured by TestDiet) for 4 weeks. About 0.2 mL of any solution of SEQ-8 to 11 dissolved in physiological saline (Otsuka raw food injection, Otsuka Pharmaceutical Factory) to DIO mice, the dose per mouse individual is 2.2 mg in terms of antisense strand. / Kg, 6.6 mg / kg and 20 mg / kg were administered subcutaneously. As a positive control, a solution of SEQ-1 was administered so that the dose per mouse was 20 mg / kg. Seven days after administration, liver tissue was collected under somnopentyl anesthesia and evaluated for activity.
  • physiological saline Otsuka raw food injection, Otsuka Pharmaceutical Factory
  • the double-stranded oligonucleotide of the present invention has no difference in knockdown activity due to the difference in the binding position and phosphate bond of the sugar derivative that interacts with the asialoglycoprotein receptor in subcutaneous administration. It was confirmed that the knockdown activity was improved about 9 times compared with the antisense oligonucleotide (SEQ-1).
  • Diet-induced obesity (DIO) mice were prepared by giving C57BL / 6J (male 7-week-old, Claire Japan) a high fat fat diet (60% kcal fat: manufactured by TestDiet) for 4 weeks. About 0.2 mL of a solution of SEQ-21 or 22 dissolved in physiological saline (Otsuka raw food injection, Otsuka Pharmaceutical Factory) to DIO mice, the dose per mouse individual is 2 mg / kg and 4 mg in terms of antisense chain amount. / Kg was administered intravenously or subcutaneously. As a positive control, a solution of SEQ-12 was administered so that the dose per mouse was 20 mg / kg.
  • physiological saline Otsuka raw food injection, Otsuka Pharmaceutical Factory
  • the double-stranded oligonucleotide (SEQ-21 or 22) of the present invention has a knockdown activity that is dose-dependently improved and binds to a sugar derivative that interacts with the asialoglycoprotein receptor. There was no difference in the knockdown activity due to the difference between the two groups, and the same activity was shown at a dose of 1/10 compared with the single-stranded antisense oligonucleotide (SEQ-12).
  • any double-stranded oligonucleotide improved the knockdown activity in a dose-dependent manner.
  • an antisense oligonucleotide (SEQ-26), a double-stranded oligonucleotide (SEQ-30) that does not contain a sugar derivative that interacts with the asialoglycoprotein receptor, and an asialog sugar at the 3 ′ end of the antisense strand
  • SEQ-32 a double-stranded oligonucleotide containing a sugar-inducible c-conductor (GalNAc derivative) that interacts with a protein receptor was used.
  • RNA extraction from the liver was performed according to the manufacturer's recommended protocol using RNeasy Mini Kit (Qiagen).
  • the primer sequence used to measure the expression level of mouse ApoB is: Fw primer: TCATGTGGCTGATGACTACTTC (SEQ ID NO: 7) Rv primer: CGTCCACAGTATATTTCCCAGCGTA (SEQ ID NO: 8) was used.
  • the primer sequence used to measure the expression level of mouse Gapdh is: Fw primer: TGTGTCCGTCGTGGATCTGA (SEQ ID NO: 5) Rv primer: TTGCTGTTTGAAGTCGCAGAG (SEQ ID NO: 6) was used.
  • SEQ-30 which is a double-stranded oligonucleotide that does not contain a sugar derivative that interacts with the asialoglycoprotein receptor (GalNAc derivative)
  • GalNAc derivative includes a sugar derivative that interacts with the asialoglycoprotein receptor (GalNAc derivative)
  • no improvement in knockdown activity was observed with SEQ-29 having a single-stranded structure or SEQ-32 binding to the antisense strand of a double-stranded oligonucleotide. From the above results, it was revealed that the double-stranded oligonucleotide of the present invention has an optimal design for efficiently knocking down a target gene in the liver.
  • the double-stranded oligonucleotide of the present invention has excellent target gene expression-suppressing activity in the liver, whether administered intravenously or subcutaneously. Therefore, the double-stranded oligonucleotide of the present invention is very useful as a complex because it efficiently transports an active ingredient DNA antisense oligonucleotide to the liver.

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Abstract

　本発明は、ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを肝臓へ効率よく輸送可能な新規の複合体である、 アンチセンス鎖が、ヌクレオシド誘導体を含んでいてもよい８～２５塩基のＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、 センス鎖が、ストリンジェントな条件で該アンチセンス鎖にハイブリダイズ可能な配列を含み、ＤＮＡヌクレオシド及び／又はヌクレオシド誘導体を含んでいてもよい８～３５塩基のＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、 センス鎖の３'末端及び／又は５'末端に、 リンカーを介して アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体 が結合している二本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。

Description

アンチセンスオリゴヌクレオチド及び糖誘導体を含む二本鎖オリゴヌクレオチド
　本発明は、アンチセンス鎖が、標的タンパク質の発現抑制活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、センス鎖にリンカーを介してアシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体が結合している二本鎖オリゴヌクレオチドに関する。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体又はリボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等のｎｃＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ）に対して相補的なオリゴヌクレオチドであり、約８～３０塩基からなる１本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はそれらの構造類似体である。該アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的とするｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、又はｎｃＲＮＡと二本鎖を形成することによりｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体又はｎｃＲＮＡの働きを抑制する。
　しかし、アンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ等の核酸医薬は、生体内のヌクレアーゼにより分解されやすく、標的細胞への取り込み効率が低いため、実用化が難しい。２つの大きな問題点を克服するために、有効成分である核酸自体の化学修飾と、核酸を標的細胞内へ送達させるドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の研究が長年行われている。
　アンチセンスオリゴヌクレオチド自体の化学修飾の例としては、リン酸部分が修飾されているＳ－オリゴ（ホスホロチオエート）、糖部分が修飾されている２’，４’－ＢＮＡ（ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）／ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）（特許文献１～５参照）等がある。
　ＤＤＳの例としては、カチオン性リポソームや高分子ミセル等のキャリアを利用する方法等が知られている。また、非特許文献１は、アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体であるガラクトース誘導体で修飾したリポソームが、医薬の肝臓細胞への取り込みに有用であることが示唆されている。特許文献６～８には、アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体であるＧａｌＮａｃ（Ｎ－アセチルガラクトサミン）誘導体で修飾したリポソームが、ｓｉＲＮＡの肝臓細胞への取り込みに有用であることが示唆されている。特許文献９には、ＧａｌＮａｃ誘導体がリンカーを介して結合しているｓｉＲＮＡが記載されており、該ｓｉＲＮＡを皮下投与すると、肝臓での標的遺伝子の発現が抑制されたことが記載されている。
　また、特許文献１０には、アンチセンスオリゴヌクレオチドと相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチドにトコフェノールを結合させることにより、マウスにおいて、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、効率よく肝臓に送達、集積され、肝臓での標的遺伝子の発現が抑制されたことが記載されている。
国際公開第９８／３９３５２号 国際公開第２００５／０２１５７０号 国際公開第２００３／０６８７９５号 国際公開第２０１１／０５２４３６号 国際公開第２０１１／１５６２０２号 国際公開第２００９／０７３８０９号 国際公開第２００９／０８２６０６号 国際公開第２００９／０８２６０７号 国際公開第２０１２／０３７２５４号 国際公開第２０１３／０８９２８３号 国際公開第２０１４／１１８２６７号
Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ　１９９９，　４２，　６０９－６１８ Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２０１４，　Ｖｏｌ．　４２，　Ｎｏ．１３，　８７９６－８８０７
　本発明の目的は、ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを肝臓へ効率よく輸送可能な新規の複合体を提供することにある。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドを医薬として利用する際、有効成分である一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、胃内における安定性の問題や腸からの吸収に乏しいため、標的細胞への取り込み効率が低いことから、一般的に、標的組織に到達しやすい注射剤での研究及び開発が行われている。しかし、例えば患者の皮下脂肪の厚さが原因で注射が困難といった理由で、疾患によっては注射剤以外の剤形が好ましい場合がある。
　本発明者らは、特許文献１０に記載の方法に基づきトコフェロール修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを用いて研究を行った。１本鎖のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した場合と比較し、静脈注射投与では肝臓における標的遺伝子の発現抑制活性が向上していることが確認されたが、皮下投与では標的遺伝子の発現抑制活性の向上が確認できなかった。
　その後、本発明者らは、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドが、静脈注射投与、皮下投与共に、肝臓における標的遺伝子の発現抑制活性が優れていることを見出した。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは核酸医薬の活性成分であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを効率的に肝臓へ送達、集積し、効果を発揮させることができ、非常に有用である。
　さらに、本発明者らは、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドを用いた静脈注射投与、皮下投与時におけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）を測定し、肝臓毒性が認められないことを確認している。そのため、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは毒性が低く、医薬として使用するために十分安全である。
　本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、例えば、ＧａｌＮａｃ誘導体を利用している。特許文献９にはＧａｌＮａｃ誘導体がリンカーを介して結合しているｓｉＲＮＡが記載されており、該ｓｉＲＮＡを静脈注射投与又は皮下投与すると、肝臓での標的遺伝子の発現が抑制されたことが記載されている。しかし、以下の理由により、ｓｉＲＮＡで利用可能であることが示されているＤＤＳが、そのままアンチセンスオリゴヌクレオチドに応用可能であるとは限らない。
　ｍＲＮＡを標的としたタンパク質の発現抑制法には、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたアンチセンス法又はｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のアプローチがある。アンチセンス法とは、例えば、２０ｍｅｒ前後の一本鎖ＤＮＡ（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を用いて標的ｍＲＮＡにハイブリダイズさせることで生成したＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖を認識するＲＮａｓｅＨによってｍＲＮＡ鎖を切断することで、タンパク質の生成を抑制する手法である。一方、ＲＮＡ干渉は、例えば、２０～３０ｍｅｒの二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；　ｓｈｏｒｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）を用いることで、細胞内でＲＩＳＣ（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｃｏｍｐｌｅｘ）に取り込まれ、その後取り込まれたｓｉＲＮＡに相同的なｍＲＮＡ鎖が切断されることで、タンパク質発現を抑制する手法である。
　アンチセンス法およびＲＮＡ干渉ともに、生体内で十分な効果を発揮させるためには、生体内ヌクレアーゼに対する分解耐性と標的臓器へのデリバリー効率を高めることが重要である。このような課題に対して、化学修飾核酸や生体リガンド分子（例えば、ＧａｌＮａｃ誘導体）を用いるアプローチが報告されているが、分子構造の違いやｍＲＮＡ鎖の切断メカニズムの違いによって、使用可能な化学修飾核酸の種類や最適なリガンド分子及びその結合箇所は異なってくると考えられる。
　すなわち、本発明は、以下に関する。
（１）アンチセンス鎖が、ヌクレオシド誘導体を含んでいてもよい８～２５塩基のＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
センス鎖が、ストリンジェントな条件で該アンチセンス鎖にハイブリダイズ可能な配列を含み、ＤＮＡヌクレオシド及び／又はヌクレオシド誘導体を含んでいてもよい８～３５塩基のＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、
センス鎖の３’末端及び／又は５’末端に、
リンカーを介して
アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体
が結合している二本鎖オリゴヌクレオチド。
（２）糖誘導体が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（式中、
Ｐ１Ａ、Ｐ１Ｂ、Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ４Ｃ、Ｔ１Ａ、Ｔ１Ｂ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ及びＴ４Ｃはそれぞれ独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（＝Ｏ）、ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ又はＣＨ２Ｏであり、
Ｑ１Ａ、Ｑ１Ｂ、Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ及びＱ４Ｃはそれぞれ独立して、存在しないか又は置換若しくは非置換のアルキレンであり、
Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ及びＲ４Ｃはそれぞれ独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒ５）Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ（Ｒ５）ＮＨ、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、複素環、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
であり、
Ｒ５は水素原子又はアミノ酸側鎖であり、
ｑ１Ａ、ｑ１Ｂ、ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ及びｑ４Ｃはそれぞれ独立して、０～２０の整数であり、
ＬＧ１Ａ、ＬＧ１Ｂ、ＬＧ２Ａ、ＬＧ２Ｂ、ＬＧ３Ａ、ＬＧ３Ｂ、ＬＧ４Ａ、ＬＧ４Ｂ及びＬＧ４Ｃはそれぞれ独立して、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
（式中、
ＲＸ１、ＲＸ２及びＲＸ３はそれぞれ独立して、水素原子又は置換若しくは非置換のアルキルであり、
ＲＸ４はＯＨ又はＮＨＣＯＲＸ４’（ＲＸ４’は置換又は非置換のアルキル）である）
である、（１）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（３）糖誘導体が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
である、（２）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（４）糖誘導体が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
である、（３）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（５）ヌクレオシド誘導体が、糖の２’位に置換基を有するヌクレオシド及び／又は糖の４’位と２’位との間に架橋構造を有するクレオシドである、（１）～（４）いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（６）該置換基が、Ｆ、ＯＣＨ３又はＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である、（５）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（７）該架橋構造が、４’－（ＣＨ２）ｍ－Ｏ－２’（ｍは１～４の整数）又は４’－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲ６－２’（Ｒ６は、水素原子又はアルキルである）である、（５）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（８）リンカーが、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
（式中、
Ｌ１はセンス鎖の３’末端及び/又は５’末端に結合し、Ｌ５は糖誘導体に結合する。
Ｌ１はＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（式中、Ｒ７はアルキル又はアルキルオキシである）であり、
Ｌ２はそれぞれ独立して、芳香族環を介していてもよい置換若しくは非置換の炭素数が１～２０のアルキレン又は芳香族環であり、
Ｌ３はそれぞれ独立して、存在しないか、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ８（Ｒ８は水素又は置換若しくは非置換のアルキルである）、ＮＲ９Ｃ（＝Ｏ）（Ｒ９は水素又は置換若しくは非置換のアルキルであるか、Ｒ９はＬ２のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成してもよい）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
であり、
Ｌ４はそれぞれ独立して、存在しないか、芳香族環を介していてもよい置換若しくは非置換の炭素数が１～２０のアルキレン又は芳香族環であり、
Ｌ５はＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＮＨ又はＯであり、
ｎは１又は２である）
である、（１）～（７）いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（９）リンカーが、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
（式中、
Ｌ１はセンス鎖の３’末端及び/又は５’末端に結合し、Ｌ５は糖誘導体に結合する。
Ｌ１はＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
（式中、Ｒ７はアルキル又はアルキルオキシである）であり、
Ｌ２はそれぞれ独立して、芳香族環を介していてもよい置換若しくは非置換の炭素数が１～２０のアルキレン又は芳香族環であり、
Ｌ３はそれぞれ独立して、存在しないか、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ８（Ｒ８は水素又は置換若しくは非置換のアルキルである）又はＮＲ９Ｃ（＝Ｏ）（Ｒ９は水素又は置換若しくは非置換のアルキルであるか、Ｒ９はＬ２のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成してもよい）であり、
Ｌ４はそれぞれ独立して、存在しないか、芳香族環を介していてもよい置換若しくは非置換の炭素数が１～２０のアルキレン又は芳香族環であり、
Ｌ５はＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＮＨ又はＯであり、
ｎは１又は２である）
である、（１）～（７）いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（１０）（１）～（９）いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物。
　本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、活性成分であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、静脈注射投与又は皮下投与いずれの投与経路であっても、安定して肝臓へ送達、集積させ、高い活性を示す。該二本鎖オリゴヌクレオチドは毒性も見られなかったことから、核酸医薬品として有用である。
α-トコフェロール修飾オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－７）のノックダウン評価（比較例）。ｍＲＮＡの残存量は生理食塩水投与群を１００とした場合の相対値として標記した。ＳＥＱ－７の投与量（１０、３．３又は１．１ｍｇ／ｋｇ）はアンチセンス鎖量に換算して標記した。 本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－８）のノックダウン評価。ｍＲＮＡの残存量は生理食塩水投与群を１００とした場合の相対値として標記した。ＳＥＱ－８の投与量（２０、６．６又は２．２ｍｇ／ｋｇ）はアンチセンス鎖量に換算して標記した。 本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドにおけるアシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体の修飾位置の検討。ｍＲＮＡの残存量は生理食塩水投与群を１００とした場合の相対値として標記した。ＳＥＱ－８～１１の投与量（２０、６．６又は２．２ｍｇ／ｋｇ）はアンチセンス鎖量に換算して標記した。 本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－２１又は２２）のノックダウン評価。ｍＲＮＡの残存量は生理食塩水投与群を１００とした場合の相対値として標記した。ＳＥＱ－２１又は２２の投与量（４又は２ｍｇ／ｋｇ）はアンチセンス鎖量に換算して標記した。 本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－２０、２３～２５）のノックダウン評価。ｍＲＮＡの残存量は生理食塩水投与群を１００とした場合の相対値として標記した。ＳＥＱ－２０、２３～２５の投与量（４又は２ｍｇ／ｋｇ）はアンチセンス鎖量に換算して標記した。 本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－３１）及び他の構造のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－２６、２９、３０又は３２）のノックダウンの比較。ｍＲＮＡの残存量は生理食塩水投与群を１００とした場合の相対値として標記した。ＳＥＱ－３０～３２の投与量（０．２ｍｇ／ｋｇ）はアンチセンス鎖量に換算して標記した。
　本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。
　本発明においては、当該分野で公知の遺伝子操作方法の使用が可能である。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（２００１）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　（２００３）に記載された方法等が挙げられる。
　ヌクレオシドとは、核酸塩基と糖とがＮ－グリコシド結合をした化合物を意味する。オリゴヌクレオチドとは、同一又は異なるヌクレオシドが複数個結合したヌクレオチドを意味する。
　オリゴヌクレオチドにおける糖と糖の間の結合は、天然の核酸が有する結合、ホスホジエステル（Ｄ－オリゴ）でもよいし、人工的に修飾がなされた結合又はリン原子を有していない結合であってもよい。当該分野で公知の結合であれば、いずれも利用可能である。人工的に修飾がなされた結合としては、ホスホロチオエート（Ｓ－オリゴ）、メチルホスホネート（Ｍ－オリゴ）、ボラノホスホネート等が挙げられる。リン原子を有していない結合としては、アルキル、非芳香族炭素環、ハロアルキル、ハロゲンで置換された非芳香族炭素環等が挙げられる。例えば、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、アセチル、ギ酸アセチル、チオギ酸アセチル、メチレンギ酸アセチル、チオギ酸アセチル、アルケニル、スルファマート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホナート、スルホンアミド、アミド等である。オリゴヌクレオチド中、全て同じ結合でもよいし、異なる結合を含んでいてもよい。
　本明細書において、「ＤＮＡヌクレオシド」又は「ＲＮＡヌクレオシド」とは、天然のＤＮＡヌクレオシド又は天然のＲＮＡヌクレオシドであり、オリゴヌクレオチドを構成する１単位であるヌクレオチドの一部を意味する。「天然のＤＮＡヌクレオシド」とは、以下を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
(式中、ＢＸ１は、アデニン、グアニン、シトシン又はチミンである。)
「天然のＲＮＡヌクレオシド」とは、以下を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
（式中、ＢＸ２は、アデニン、グアニン、シトシン又はウラシルである。）
　「ＤＮＡオリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡヌクレオシドが複数個結合したオリゴヌクレオチドであり、「ＲＮＡオリゴヌクレオチド」とは、ＲＮＡヌクレオシドが複数個結合したオリゴヌクレオチドである。
　本明細書において、「ヌクレオシド誘導体」とは、上記ＤＮＡヌクレオシド又は上記ＲＮＡヌクレオシドの核酸塩基及び／又は糖部位に人工的な修飾がなされたヌクレオシドを意味する。当該分野で公知のヌクレオシドの修飾であれば、いずれも利用可能である。
　核酸塩基の修飾としては、例えば、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－プロピニルシトシン等が挙げられる。
　糖部位の修飾としては、例えば、糖の２’位の置換が挙げられる。具体的には、２’-Ｆ、２’-ＯＣＨ３（２’-ＯＭｅ）、２’-ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’-ＭＯＥ）等である。
　また、例えば、以下の糖の４’位と２’位との間の架橋構造が挙げられる。
　４’－（ＣＲ１０Ｒ１１）ｍ－Ｏ－２’、４’－（ＣＲ１０Ｒ１１）ｍ－Ｓ－２’、４’－（ＣＲ１０Ｒ１１）ｍ－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－２’、４’－（ＣＲ１０Ｒ１１）ｍ－ＮＲ６－Ｏ－（ＣＲ１０Ｒ１１）ｍ１－２’、４’－（ＣＲ１０Ｒ１１）ｍ１-Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲ６－２’又は４’－（ＣＲ１０Ｒ１１）ｍ２-Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲ６－Ｘ１－２’、４’－（ＣＲ１０Ｒ１１）ｍ１－ＳＯ２－ＮＲ６－２’、又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
であり、
ここで、
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ又はＣＨ２であり、
Ｒ６は、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基、置換若しくは非置換の非芳香族炭素環式基、置換若しくは非置換の芳香族複素環式基、置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基、置換若しくは非置換の芳香族炭素環アルキル、置換若しくは非置換の非芳香族炭素環アルキル、置換若しくは非置換の芳香族複素環アルキル又は置換若しくは非置換の非芳香族複素環アルキルであり、
Ｒ１０は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ｒ１１は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ｙ１はＣＲ１２又はＮであり、
Ｙ２はＣＲ１３又はＮであり、
Ｙ３はＣＲ１４又はＮであり、
Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、置換若しくは非置換のアミノ、置換若しくは非置換のアルコキシ、置換若しくは非置換のアルキルカルボニルアミノ、置換若しくは非置換のアルケニルカルボニルアミノ、置換若しくは非置換のアルキニルカルボニルアミノ、置換若しくは非置換のアルキルカルバモイル、置換若しくは非置換のアルケニルカルバモイル又は置換若しくは非置換のアルキニルカルバモイルであり、
ｍは、１～４の整数であり、
ｍ１は、０～３の整数であり、
ｍ２は、０又は１である。
　Ｒ６は、好ましくは、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環アルキル、非芳香族炭素環アルキル、芳香族複素環アルキル又は非芳香族複素環アルキルであり、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
　α群は、水酸基、アルキル、アルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ又はハロゲンである。
　Ｒ１０及びＲ１１は、好ましくは、水素原子である。
　該架橋構造として、好ましくは、４’－（ＣＲ１０Ｒ１１）ｍ－Ｏ－２’又は４’－（ＣＲ１０Ｒ１１）ｍ１-Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲ６－２’（ＡｍＮＡ、Ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）であり、
ここで、
Ｒ６は、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ｒ１０は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ｒ１１は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
ｍは、１～４の整数であり、
ｍ１は、０～２の整数である。
　該架橋構造として、特に好ましくは、４’－（ＣＨ２）ｍ－Ｏ－２’（ｍは１～４の整数）又は、４’－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲ６－２’（Ｒ６は、水素原子又はアルキルである）である。
　４’－（ＣＨ２）ｍ－Ｏ－２’（ｍは１～４の整数）の中で、特に好ましくは４’－ＣＨ２－Ｏ－２’（ＬＮＡ、Ｌｏｃｋｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）である。具体例及びその調製方法は、国際公開第９８／３９３５２号、国際公開第２００３／０６８７９５号、国際公開第２００５／０２１５７０号等に記載されている。
　４’－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲ６－２’（Ｒ６は、水素原子又はアルキルである）の中で、特に好ましくは４’－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＣＨ３－２’である。具体例及びその調製方法は、国際公開第２０１１／０５２４３６号に記載されている。
　当該分野で公知のヌクレオチドの修飾及び修飾方法については、例えば、以下の特許文献にも開示されている。
国際公開第９８／３９３５２号、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開２０００／０５６７４８、国際公開第２００５／０２１５７０号、国際公開第２００３／０６８７９５号、国際公開第２０１１／０５２４３６号、国際公開第２００４／０１６７４９号、国際公開第２００５／０８３１２４号、国際公開２００７／１４３３１５号、国際公開第２００９／０７１６８０号、国際公開２０１４／１１２４６３号、国際公開２０１４／１２６２２９号等。
　以下に本発明について詳細に説明する。
　本発明の「二本鎖オリゴヌクレオチド」は
アンチセンス鎖が、ヌクレオシド誘導体を含んでいてもよい８～２５塩基のＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
センス鎖が、ストリンジェントな条件で該アンチセンス鎖にハイブリダイズ可能な配列を含み、ＤＮＡヌクレオシド及び／又はヌクレオシド誘導体を含んでいてもよい８～３５塩基のＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、
センス鎖の３’末端及び／又は５’末端に、
リンカーを介して
アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体
が結合している二本鎖オリゴヌクレオチド
である。
　本発明の「二本鎖オリゴヌクレオチド」のアンチセンス鎖は、ヌクレオシド誘導体を含んでいてもよい８～２５塩基のＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
　「ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、標的遺伝子のｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体又はｎｃＲＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチドであり、１本鎖のＤＮＡから構成される。当該アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的とするｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体又はｎｃＲＮＡと二本鎖を形成することによりｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体又はｎｃＲＮＡの働きを抑制する。該「ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド」には、標的となるｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体又はｎｃＲＮＡと完全に相補的であるもののみならず、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体又はｎｃＲＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズできる限り、１又は数個のミスマッチが存在するものも含まれる。
　ｎｃＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ）とは、タンパク質へ翻訳されずに機能するＲＮＡの総称である。例えば、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等が挙げられる。
　「標的遺伝子」としては、特に制限なく、各種疾患において発現が亢進している遺伝子が挙げられる。
　「ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド」の長さは、８～２５塩基である。例えば、８～１９塩基、１０～１９塩基、１３～１９塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基又は１９塩基である。
　本発明の「二本鎖オリゴヌクレオチド」のセンス鎖は、ストリンジェントな条件で該アンチセンス鎖にハイブリダイズ可能な配列を含み、ＤＮＡヌクレオシド及び／又はヌクレオシド誘導体を含んでいてもよい８～３５塩基のＲＮＡオリゴヌクレオチドである。
　センス鎖のＲＮＡオリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖のＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできる限り、ハイブリダイズする部位において、１又は数個のミスマッチが存在するものも含まれる。
　例えば、ハイブリダイズする部位が、アンチセンス鎖のＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドの相補配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。ここで、相同性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３－４１０（１９９０）．）の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、スコアで類似度が示される。
　本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の長さは、８～３５塩基である。例えば、８～３０、８～１９塩基、１０～１９塩基、１３～１９塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基又は１９塩基である。センス鎖の長さは、アンチセンス鎖と同じ長さであってもよいし、アンチセンス鎖とハイブリダイズする限りにおいて、アンチセンス鎖の長さより１又は数個の塩基の分短くてもよい。また、アンチセンス鎖とハイブリダイズする部位の片側又は両側に１又は数個の塩基が付加することにより、センス鎖の長さはアンチセンス鎖の長さより長くてもよい。センス鎖の長さがアンチセンス鎖の長さより長い場合、アンチセンス鎖とハイブリダイズしない部分においてセンス鎖中の塩基同士がハイブリダイズすることにより、ヘアピン構造を有していてもよい。
　「１又は数個の塩基」とは、１～１０個、１～５個、１～３個又は１若しくは２個の塩基を意味している。
　「ストリンジェントな条件」とは、ある塩基配列が特定配列とハイブリット（いわゆる特異的ハイブリット）を形成し、同等の機能を有しない塩基配列は該特定配列とハイブリット（いわゆる非特異的ハイブリット）を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション反応及び洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液及び洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ　ＮａＣｌ，０．０９Ｍ　クエン酸三ナトリウム）又は６×ＳＳＰＥ（３Ｍ　ＮａＣｌ，０，２Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。ハイブリダイゼーション方法としては、当該分野において周知慣用な手法、例えば、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることができる。具体的には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
　「１又は数個のミスマッチ」とは、１～５個、好ましくは１～３個、さらに好ましくは１又は２個のミスマッチを意味している。
　本発明の「二本鎖オリゴヌクレオチド」中のアンチセンス鎖のＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド及びセンス鎖のＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド誘導体を１以上含んでいることが好ましい。センス鎖はさらにＤＮＡヌクレオシドを含んでいてもよい。つまり、アンチセンス鎖のＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであるが、その他のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであってもヌクレオシド誘導体であってもよい。センス鎖のＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオシドはＲＮＡヌクレオシドであるが、その他のヌクレオシドはＲＮＡヌクレオシド、ＤＮＡヌクレオシド、ヌクレオシド誘導体のいずれであってもよい。
　ヌクレオシド誘導体とＤＮＡヌクレオシド又はＲＮＡヌクレオシドのパターンとしては、例えば、ギャップマー又はミクスマーが挙げられる。
　ギャップマーとは、中心領域（“ギャップ”）と該中心領域の両側の領域、ウイング（５’側の“５’ウイング”又は３’側の“３’ウイング”）を含み、各ウイングに少なくとも１つのヌクレオシド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを意味する。例えば、“５’ウイング”及び ／又は“３’ウイング”に、ヌクレオシド誘導体を１以上、好ましくは、１～５、さらに好ましくは、２～３含有する。一方のウイング内の修飾の種類、数、位置は他方のウイングにおける修飾の種類、数、位置と同じであっても異なっていてもよい。
　ミクスマーとは、ランダムにヌクレオシド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
　アンチセンス鎖のＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特に好ましくは、ギャップマーである。
　本発明の「二本鎖オリゴヌクレオチド」中のヌクレオシド誘導体としては、上記に記載の通り、当該分野で公知のヌクレオシドの修飾であれば、いずれも利用可能である。
　好ましくは、糖の２’位に置換基を有するヌクレオシド及び／又は糖の４’位と２’位との間に架橋構造を有するヌクレオシドである。
　糖の２’位に置換基として好ましくは、Ｆ、ＯＣＨ３又はＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である。
　糖の４’位と２’位との間の架橋構造として好ましくは、４’－（ＣＨ２）ｍ－Ｏ－２’（ｍは１～４の整数）、４’－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲ６－２’（Ｒ６は、水素原子又はアルキルである）である。
　本発明の「二本鎖オリゴヌクレオチド」中のアンチセンス鎖のＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドとして好ましくは、ホスホロチオエート（Ｓ－オリゴ）である。
　本発明の「二本鎖オリゴヌクレオチド」中のアンチセンス鎖のＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド及びセンス鎖のＲＮＡオリゴヌクレオチドは、当該分野の常法によって合成することができ、例えば、市販の核酸自動合成装置（例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、（株）大日本精機製等）によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法等がある。例えば、下記実施例３の１）～７）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２，　１８５９－１８６２　（１９８１）、国際公開第２０１１／０５２４３６号等に開示されている。
　合成されたアンチセンス鎖及びセンス鎖は公知の方法でハイブリダイズさせることにより二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する。例えば、下記実施例３の１１）、国際公開第２０１３／０８９２８３の実施例１等に開示されている。
　本発明の「二本鎖オリゴヌクレオチド」は、センス鎖の３’末端及び/又は５’末端に、リンカーを介してアシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体が結合している。
　「アシアロ糖タンパク質受容体」とは肝臓細胞表面に存在し、アシアロ糖タンパク質のガラクトース残基を認識して細胞内に取り込み分解する働きを持つ。つまり、「アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体」とは、ガラクトース残基に類似の構造を持ち、アシアロ糖タンパク質受容体と結合して細胞内に取り込まれる化合物を意味する。例えば、ＧａｌＮａｃ（Ｎ－アセチルガラクトサミン）誘導体、ガラクトース誘導体、ラクトース誘導体が挙げられる。
　ＧａｌＮａｃ誘導体とは、以下の基を含有する化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
（式中、
ＲＸ１、ＲＸ２及びＲＸ３は、それぞれ独立して、水素原子又は置換若しくは非置換のアルキルであり、
ＲＸ４’は置換又は非置換のアルキルである。）
　ガラクトース誘導体とは、以下の基を含有する化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
（式中、ＲＸ１、ＲＸ２及びＲＸ３は、それぞれ独立して、水素原子又は置換若しくは非置換のアルキルである。）
　ラクトース誘導体は、以下の基を含有する化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
（式中、
ＲＸ１は、水素原子又は置換若しくは非置換のアルキルであり、
ＲＸ２及びＲＸ３は、それぞれ独立して、水素原子又は置換若しくは非置換のアルキルであり、
ＲＸ４は、それぞれ独立して、ＯＨ又はＮＨＣＯＲＸ４’（ＲＸ４’は置換又は非置換のアルキル）である。）
　「アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体」として好ましくは、以下が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
（式中、
Ｐ０Ａ、Ｐ１Ａ、Ｐ１Ｂ、Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ４Ｃ、Ｔ０Ａ、Ｔ１Ａ、Ｔ１Ｂ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ及びＴ４Ｃはそれぞれ独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（＝Ｏ）、ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ又はＣＨ２Ｏであり、
Ｑ０Ａ、Ｑ１Ａ、Ｑ１Ｂ、Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ及びＱ４Ｃはそれぞれ独立して、存在しないか又は置換若しくは非置換のアルキレンであり、
Ｒ０Ａ、Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ及びＲ４Ｃはそれぞれ独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒ５）Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ（Ｒ５）ＮＨ、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、複素環、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
（なお、Ｒ０Ａ～Ｒ４Ｃが上記式で表される場合、式中、左側にＱ０Ａ～Ｑ４Ｃが結合する）
であり、
Ｒ５は水素原子又はアミノ酸側鎖であり、
ｑ０Ａ、ｑ１Ａ、ｑ１Ｂ、ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ及びｑ４Ｃはそれぞれ独立して、０～２０の整数であり、
ＬＧ０Ａ、ＬＧ１Ａ、ＬＧ１Ｂ、ＬＧ２Ａ、ＬＧ２Ｂ、ＬＧ３Ａ、ＬＧ３Ｂ、ＬＧ４Ａ、ＬＧ４Ｂ及びＬＧ４Ｃはそれぞれ独立して、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
（式中、
ＲＸ１、ＲＸ２及びＲＸ３はそれぞれ独立して、水素原子又は置換若しくは非置換のアルキルであり、
ＲＸ４はＯＨ又はＮＨＣＯＲＸ４’（ＲＸ４’は置換又は非置換のアルキル）である）
　「アミノ酸側鎖」とは、アミノ酸の構造の一部であり、例えば、ＣＨ３、ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、ＣＨ２Ｃ３Ｈ３Ｎ２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、（ＣＨ２）４ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、（ＣＨ２）３ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＳｅＨ、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２Ｃ８Ｈ６Ｎ、ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ等が挙げられる。
　好ましくは上記（Ｉ）～（ＩＶ）のいずれか、さらに好ましくは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
である。
　特に好ましくは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
である。
　センス鎖と糖誘導体を介するリンカーとしては、当該分野で用いられるリンカーであれば、いずれでも利用可能である。
　例えば、以下が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
（式中、
Ｌ１はセンス鎖の３’末端及び/又は５’末端に結合し、Ｌ５は糖誘導体に結合する。
Ｌ１はＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
（式中、Ｒ７はアルキル又はアルキルオキシである）であり、
Ｌ２はそれぞれ独立して、芳香族環を介していてもよい置換若しくは非置換の炭素数が１～２０のアルキレン又は芳香族環であり、
Ｌ３はそれぞれ独立して、存在しないか、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ８（Ｒ８は水素又は置換若しくは非置換のアルキルである）、ＮＲ９Ｃ（＝Ｏ）（Ｒ９は水素又は置換若しくは非置換のアルキルであるか、Ｒ９はＬ２のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成してもよい）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
（なお、Ｌ３が上記式で表される場合、式中、左側にＬ２が結合する）
であり、
Ｌ４はそれぞれ独立して、存在しないか、芳香族環を介していてもよい置換若しくは非置換の炭素数が１～２０のアルキレン又は芳香族環であり、
Ｌ５はＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＮＨ又はＯであり、
ｎは１又は２である）。
　または、以下が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
（式中、
Ｌ１はセンス鎖の３’末端及び/又は５’末端に結合し、Ｌ５は糖誘導体に結合する。
Ｌ１はＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
（式中、Ｒ７はアルキル又はアルキルオキシである）であり、
Ｌ２はそれぞれ独立して、芳香族環を介していてもよい置換若しくは非置換の炭素数が１～２０のアルキレン又は芳香族環であり、
Ｌ３はそれぞれ独立して、存在しないか、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ８（Ｒ８は水素又は置換若しくは非置換のアルキルである）又はＮＲ９Ｃ（＝Ｏ）（Ｒ９は水素又は置換若しくは非置換のアルキルであるか、Ｒ９はＬ２のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成してもよい）であり、
Ｌ４はそれぞれ独立して、存在しないか、芳香族環を介していてもよい置換若しくは非置換の炭素数が１～２０のアルキレン又は芳香族環であり、
Ｌ５はＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＮＨ又はＯであり、
ｎは１又は２である）。
　Ｌ２又はＬ４が、「芳香族環を介していてもよい置換若しくは非置換のアルキレン」又は「芳香族環」である場合、芳香族環として、好ましくは、ベンゼン環、ビフェニル環等が挙げられる。
　「Ｒ９はＬ２のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成してもよい」とは、以下を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
（式中、ａは０～１８の整数であり、ｂは１～５の整数である。アルキレンや含窒素環は置換基を有していてもよい。）
　具体的には、以下が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　センス鎖の３’末端にリンカーを介して糖誘導体が結合する場合、オリゴヌクレオチドの末端の糖の３’位にＬ１が結合する。
　センス鎖の５’末端に糖誘導体が結合する場合、オリゴヌクレオチドの末端の４’位に置換又は非置換のメチレンを介してＬ１が結合する。
　リンカーとして具体的には、以下が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　Ｌ１として好ましくは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
である。
　Ｌ２として好ましくは、１～２０の置換又は非置換のアルキレン、ベンゼン環又はビフェニル環である。
　Ｌ３として好ましくは、存在しないか、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ又はＮＲ９Ｃ（＝Ｏ）（Ｒ９は水素であるか、Ｒ９はＬ２のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成してもよい）、ＮＲ９Ｃ（＝Ｏ）（Ｒ９はＬ２のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成している）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
（なお、Ｌ３が上記式で表される場合、式中、左側にＬ２が結合する）
である。
　Ｌ４として好ましくは、存在しないか、置換又は非置換の１～２０のアルキレン、ベンゼン環又はビフェニル環である。
　Ｌ５として好ましくは、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
として、具体的には、以下が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
（式中、ＸはＯ又はＳであり、ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立して１～２０の整数であり、ｎ３は１～６の整数である。）
　「アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体」とリンカーは、下記実施例１に記載の通り糖誘導体とリンカーの一部を含む化合物として合成し、下記実施例に記載の通り該化合物を樹脂に固相化し、下記実施例３の９）及び１０）に記載の通りセンス鎖のＲＮＡオリゴヌクレオチドに導入する。その後、下記実施例３の１１）に記載の通りアンチセンス鎖のＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、本発明の「二本鎖オリゴヌクレオチド」が得られる。「糖誘導体とリンカーの一部を含む化合物」の具体例としては、下記実施例１に記載の化合物等が挙げられる。
　「アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体」及びリンカーの具体例と調整方法は、例えば、上記非特許文献１、特許文献６～９、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２、１７－２２５（１９９１）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１４、１８－２９（２００３）等にも開示されている。
　本発明の「二本鎖オリゴヌクレオチド」の糖誘導体が結合していない３’末端又は５’末端、あるいはリンカーはさらに修飾されていてもよい。オリゴヌクレオチドの追跡を可能にするため、オリゴヌクレオチドの薬物動態又は薬力学を改善するため、あるいはオリゴヌクレオチドの安定性又は結合親和性を向上させるために、当該分野で公知の修飾基を利用することができる。例えば、水酸基の保護基、レポーター分子、コレステロール、リン脂質、色素、蛍光分子等が挙げられる。
　また、本発明の「二本鎖オリゴヌクレオチド」の糖誘導体が結合していない３’末端又は５’末端はリン酸エステル部分を含んでいてもよい。「リン酸エステル部分」とは、リン酸エステル並びに修飾リン酸エステルが含まれる、末端リン酸基を意味する。リン酸エステル部分は、いずれの末端に位置してもよいが、５’－末端ヌクレオシドであることが好ましい。具体的には、式：－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）ＯＨで示される基又はその修飾基である。つまり、Ｏ及びＯＨの１以上が、Ｈ、Ｏ、ＯＲ’、Ｓ、Ｎ（Ｒ’）（ここでＲ’は、Ｈ、アミノ保護基又は置換若しくは非置換のアルキルである）又はアルキルで置換されていてもよい。５’又は３’末端は、それぞれ独立して置換又は非置換の１～３のリン酸エステル部分を含んでいてもよい。
　以下に本明細書中で使用する上記以外の用語を説明する。なお、本明細書中、下記用語は単独で使用されている場合も、又は他の用語と一緒になって使用されている場合も、特に記載の無い限り、同一の意義を有する。
　「ハロゲン」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、及びヨウ素原子を包含する。特にフッ素原子、及び塩素原子が好ましい。
　「アルキル」とは、炭素数１～１５、好ましくは炭素数１～１０、より好ましくは炭素数１～６、さらに好ましくは炭素数１～４の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、ｎ－へプチル、イソヘプチル、ｎ－オクチル、イソオクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル等が挙げられる。
　「アルキル」の好ましい態様として、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチルが挙げられる。さらに好ましい態様として、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ－ブチルが挙げられる。
　「アルケニル」とは、任意の位置に１以上の二重結合を有する、炭素数２～１５、好ましくは炭素数２～１０、より好ましくは炭素数２～６、さらに好ましくは炭素数２～４の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。例えば、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、プレニル、ブタジエニル、ペンテニル、イソペンテニル、ペンタジエニル、ヘキセニル、イソヘキセニル、ヘキサジエニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル等が挙げられる。
　「アルケニル」の好ましい態様として、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニルが挙げられる。
　「アルキニル」とは、任意の位置に１以上の三重結合を有する、炭素数２～１０、好ましくは炭素数２～８、さらに好ましくは炭素数２～６、さらに好ましくは炭素数２～４の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニル等を包含する。これらはさらに任意の位置に二重結合を有していてもよい。
　「アルキニル」の好ましい態様として、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニルが挙げられる。
　「アルキレン」とは、炭素数１～１５、好ましくは炭素数１～１０、より好ましくは炭素数１～６、さらに好ましくは炭素数１～４の直鎖又は分枝状の２価の炭化水素基を包含する。例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、プロピレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン等が挙げられる。
　「芳香族炭素環式基」とは、単環又は２環以上の、環状芳香族炭化水素基を意味する。例えば、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル等が挙げられる。
　「芳香族炭素環式基」の好ましい態様として、フェニルが挙げられる。
　「非芳香族炭素環式基」とは、単環又は２環以上の、環状飽和炭化水素基又は環状非芳香族不飽和炭化水素基を意味する。２環以上の非芳香族炭素環式基は、単環又は２環以上の非芳香族炭素環式基に、上記「芳香族炭素環式基」における環が縮合したものも包含する。
　さらに、「非芳香族炭素環式基」は、以下のように架橋している基、又はスピロ環を形成する基も包含する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　単環の非芳香族炭素環式基としては、炭素数３～１６が好ましく、より好ましくは炭素数３～１２、さらに好ましくは炭素数４～８である。例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロヘキサジエニル等が挙げられる。
　２環以上の非芳香族炭素環式基としては、例えば、インダニル、インデニル、アセナフチル、テトラヒドロナフチル、フルオレニル等が挙げられる。
　「芳香族複素環式基」とは、Ｏ、Ｓ及びＮから任意に選択される同一又は異なるヘテロ原子を環内に１以上有する、単環又は２環以上の、芳香族環式基を意味する。
　２環以上の芳香族複素環式基は、単環又は２環以上の芳香族複素環式基に、上記「芳香族炭素環式基」における環が縮合したものも包含する。
　単環の芳香族複素環式基としては、５～８員が好ましく、より好ましくは５員又は６員である。例えば、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアゾリル、トリアジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル等が挙げられる。
　２環の芳香族複素環式基としては、例えば、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、インドリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、プリニル、プテリジニル、ベンズイミダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンズオキサジアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾピリジル、トリアゾロピリジル、イミダゾチアゾリル、ピラジノピリダジニル、オキサゾロピリジル、チアゾロピリジル等が挙げられる。
　３環以上の芳香族複素環式基としては、例えば、カルバゾリル、アクリジニル、キサンテニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、ジベンゾフリル等が挙げられる。
　「非芳香族複素環式基」とは、Ｏ、Ｓ及びＮから任意に選択される同一又は異なるヘテロ原子を環内に１以上有する、単環又は２環以上の、環状非芳香族環式基を意味する。
　２環以上の非芳香族複素環式基は、単環又は２環以上の非芳香族複素環式基に、上記「芳香族炭素環式基」、「非芳香族炭素環式基」、及び／又は「芳香族複素環式基」におけるそれぞれの環が縮合したものも包含する。
　さらに、「非芳香族複素環式基」は、以下のように架橋している基、又はスピロ環を形成する基も包含する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
　単環の非芳香族複素環式基としては、３～８員が好ましく、より好ましくは５員又は６員である。例えば、ジオキサニル、チイラニル、オキシラニル、オキセタニル、オキサチオラニル、アゼチジニル、チアニル、チアゾリジニル、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、モルホリノ、チオモルホリニル、チオモルホリノ、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロチアゾリル、テトラヒドロチアゾリル、テトラヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジニル、ヘキサヒドロアゼピニル、テトラヒドロジアゼピニル、テトラヒドロピリダジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、ジオキソラニル、ジオキサジニル、アジリジニル、ジオキソリニル、オキセパニル、チオラニル、チイニル、チアジニル等が挙げられる。
　２環以上の非芳香族複素環式基としては、例えば、インドリニル、イソインドリニル、クロマニル、イソクロマニル等が挙げられる。
　「複素環」とは、上記「芳香族複素環式基」及び「非芳香族複素環式基」から誘導される環を意味する。
　「芳香族環」とは、上記「芳香族炭素環式基」及び「芳香族複素環式基」から誘導される環を意味する。
　「アルキルオキシ」とは、上記「アルキル」が酸素原子に結合した基を意味する。例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ｎ－ブチルオキシ、ｔｅｒｔ－ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ｓｅｃ－ブチルオキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、へキシルオキシ等が挙げられる。
　「アルキルオキシ」の好ましい態様として、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ｔｅｒｔ－ブチルオキシが挙げられる。
　「アルケニルオキシ」とは、上記「アルケニル」が酸素原子に結合した基を意味する。
例えば、ビニルオキシ、アリルオキシ、１－プロペニルオキシ、２－ブテニルオキシ、２－ペンテニルオキシ、２－ヘキセニルオキシ、２－ヘプテニルオキシ、２－オクテニルオキシ等が挙げられる。
　「アルキニルオキシ」とは、上記「アルキニル」が酸素原子に結合した基を意味する。
例えば、エチニルオキシ、１－プロピニルオキシ、２－プロピニルオキシ、２－ブチニルオキシ、２－ペンチニルオキシ、２－ヘキシニルオキシ、２－ヘプチニルオキシ、２－オクチニルオキシ等が挙げられる。
　「ハロアルキル」とは、１以上の上記「ハロゲン」が上記「アルキル」に結合した基を意味する。例えば、モノフルオロメチル、モノフルオロエチル、モノフルオロプロピル、２，２，３，３，３－ペンタフルオロプロピル、モノクロロメチル、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、２，２，２－トリフルオロエチル、２，２，２－トリクロロエチル、１，２－ジブロモエチル、１，１，１－トリフルオロプロパン－２－イル等が挙げられる。
　「ハロアルキル」の好ましい態様として、トリフルオロメチル、トリクロロメチルが挙げられる。
　「ハロアルキルオキシ」とは、上記「ハロアルキル」が酸素原子に結合した基を意味する。例えば、モノフルオロメトキシ、モノフルオロエトキシ、トリフルオロメトキシ、トリクロロメトキシ、トリフルオロエトキシ、トリクロロエトキシ等が挙げられる。
　「ハロアルキルオキシ」の好ましい態様として、トリフルオロメトキシ、トリクロロメトキシが挙げられる。
　「アルキルオキシアルキル」とは、上記「アルキルオキシ」が上記「アルキル」に結合した基を意味する。例えば、メトキシメチル、メトキシエチル、エトキシメチル等が挙げられる。
　「アルキルオキシアルキルオキシ」とは、上記「アルキルオキシ」が上記「アルキルオキシ」に結合した基を意味する。例えば、メトキシメトキシ、メトキシエトキシ、エトキシメトキシ、エトキシエトキシ等が挙げられる。
　「アルキルチオ」とは、上記「アルキル」が硫黄原子に結合した基を意味する。
　「アルキルカルボニル」とは、上記「アルキル」がカルボニル基に結合した基を意味する。例えば、メチルカルボニル、エチルカルボニル、プロピルカルボニル、イソプロピルカルボニル、ｔｅｒｔ－ブチルカルボニル、イソブチルカルボニル、ｓｅｃ－ブチルカルボニル、ペンチルカルボニル、イソペンチルカルボニル、へキシルカルボニル等が挙げられる。
　「アルキルカルボニル」の好ましい態様として、メチルカルボニル、エチルカルボニル、ｎ－プロピルカルボニルが挙げられる。
　「アルケニルカルボニル」とは、上記「アルケニル」がカルボニル基に結合した基を意味する。例えば、エチレニルカルボニル、プロペニルカルボニル等が挙げられる。
　「アルキニルカルボニル」とは、上記「アルキニル」がカルボニル基に結合した基を意味する。例えば、エチニルカルボニル、プロピニルカルボニル等が挙げられる。
　「アルキルアミノ」には、モノアルキルアミノとジアルキルアミノが含まれる。
　「モノアルキルアミノ」とは、上記「アルキル」がアミノ基の窒素原子と結合している水素原子１個と置き換わった基を意味する。例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、イソプロピルアミノ等が挙げられる。好ましくは、メチルアミノ、エチルアミノが挙げられる。
　「ジアルキルアミノ」とは、上記「アルキル」がアミノ基の窒素原子と結合している水素原子２個と置き換わった基を意味する。２個のアルキルは、同一でも異なっていてもよい。例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルアミノ、Ｎ－イソプロピル－Ｎ－エチルアミノ等が挙げられる。好ましくは、ジメチルアミノ、ジエチルアミノが挙げられる。
　「アルキルスルホニル」とは、上記「アルキル」がスルホニル基に結合した基を意味する。例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、プロピルスルホニル、イソプロピルスルホニル、ｔｅｒｔ－ブチルスルホニル、イソブチルスルホニル、ｓｅｃ－ブチルスルホニル等が挙げられる。
　「アルキルスルホニル」の好ましい態様として、メチルスルホニル、エチルスルホニルが挙げられる。
　「アルケニルスルホニル」とは、上記「アルケニル」がスルホニル基に結合した基を意味する。例えば、エチレニルスルホニル、プロペニルスルホニル等が挙げられる。
　「アルキニルスルホニル」とは、上記「アルキニル」がスルホニル基に結合した基を意味する。例えば、エチニルスルホニル、プロピニルスルホニル等が挙げられる。
　「モノアルキルカルボニルアミノ」とは、上記「アルキルカルボニル」がアミノ基の窒素原子と結合している水素原子１個と置き換わった基を意味する。例えば、メチルカルボニルアミノ、エチルカルボニルアミノ、プロピルカルボニルアミノ、イソプロピルカルボニルアミノ、ｔｅｒｔ－ブチルカルボニルアミノ、イソブチルカルボニルアミノ、ｓｅｃ－ブチルカルボニルアミノ等が挙げられる。
　「モノアルキルカルボニルアミノ」の好ましい態様としては、メチルカルボニルアミノ、エチルカルボニルアミノが挙げられる。
　「ジアルキルカルボニルアミノ」とは、上記「アルキルカルボニル」がアミノ基の窒素原子と結合している水素原子２個と置き換わった基を意味する。２個のアルキルカルボニル基は、同一でも異なっていてもよい。例えば、ジメチルカルボニルアミノ、ジエチルカルボニルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルカルボニルアミノ等が挙げられる。
　「ジアルキルカルボニルアミノ」の好ましい態様として、ジメチルカルボニルアミノ、ジエチルカルボニルアミノが挙げられる。
　「モノアルキルスルホニルアミノ」とは、上記「アルキルスルホニル」がアミノ基の窒素原子と結合している水素原子１個と置き換わった基を意味する。例えば、メチルスルホニルアミノ、エチルスルホニルアミノ、プロピルスルホニルアミノ、イソプロピルスルホニルアミノ、ｔｅｒｔ－ブチルスルホニルアミノ、イソブチルスルホニルアミノ、ｓｅｃ－ブチルスルホニルアミノ等が挙げられる。
　「モノアルキルスルホニルアミノ」の好ましい態様としては、メチルスルホニルアミノ、エチルスルホニルアミノが挙げられる。
　「ジアルキルスルホニルアミノ」とは、上記「アルキルスルホニル」がアミノ基の窒素原子と結合している水素原子２個と置き換わった基を意味する。２個のアルキルスルホニル基は、同一でも異なっていてもよい。例えば、ジメチルスルホニルアミノ、ジエチルスルホニルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルスルホニルアミノ等が挙げられる。
　「ジアルキルカルボニルアミノ」の好ましい態様として、ジメチルスルホニルアミノ、ジエチルスルホニルアミノが挙げられる。
　「アルキルイミノ」とは、上記「アルキル」がイミノ基の窒素原子と結合している水素原子と置き換わった基を意味する。例えば、メチルイミノ、エチルイミノ、ｎ－プロピルイミノ、イソプロピルイミノ等が挙げられる。
　「アルケニルイミノ」とは、上記「アルケニル」がイミノ基の窒素原子と結合している水素原子と置き換わった基を意味する。例えば、エチレニルイミノ、プロペニルイミノ等が挙げられる。
　「アルキニルイミノ」とは、上記「アルキニル」がイミノ基の窒素原子と結合している水素原子と置き換わった基を意味する。例えば、エチニルイミノ、プロピニルイミノ等が挙げられる。
　「アルキルカルボニルイミノ」とは、上記「アルキルカルボニル」がイミノ基の窒素原子と結合している水素原子と置き換わった基を意味する。例えば、メチルカルボニルイミノ、エチルカルボニルイミノ、ｎ－プロピルカルボニルイミノ、イソプロピルカルボニルイミノ等が挙げられる。
　「アルケニルカルボニルイミノ」とは、上記「アルケニルカルボニル」がイミノ基の窒素原子と結合している水素原子と置き換わった基を意味する。例えば、エチレニルカルボニルイミノ、プロペニルカルボニルイミノ等が挙げられる。
　「アルキニルカルボニルイミノ」とは、上記「アルキニルカルボニル」がイミノ基の窒素原子と結合している水素原子と置き換わった基を意味する。例えば、エチニルカルボニルイミノ、プロピニルカルボニルイミノ等が挙げられる。
　「アルキルオキシイミノ」とは、上記「アルキルオキシ」がイミノ基の窒素原子と結合している水素原子と置き換わった基を意味する。例えば、メチルオキシイミノ、エチルオキシイミノ、ｎ－プロピルオキシイミノ、イソプロピルオキシイミノ等が挙げられる。
　「アルケニルオキシイミノ」とは、上記「アルケニルオキシ」がイミノ基の窒素原子と結合している水素原子と置き換わった基を意味する。例えば、エチレニルオキシイミノ、プロペニルオキシイミノ等が挙げられる。
　「アルキニルオキシイミノ」とは、上記「アルキニルオキシ」がイミノ基の窒素原子と結合している水素原子と置き換わった基を意味する。例えば、エチニルオキシイミノ、プロピニルオキシイミノ等が挙げられる。
　「アルキルカルボニルオキシ」とは、上記「アルキルカルボニル」が酸素原子に結合した基を意味する。例えば、メチルカルボニルオキシ、エチルカルボニルオキシ、プロピルカルボニルオキシ、イソプロピルカルボニルオキシ、ｔｅｒｔ－ブチルカルボニルオキシ、イソブチルカルボニルオキシ、ｓｅｃ－ブチルカルボニルオキシ等が挙げられる。
　「アルキルカルボニルオキシ」の好ましい態様としては、メチルカルボニルオキシ、エチルカルボニルオキシが挙げられる。
　「アルケニルカルボニルオキシ」とは、上記「アルケニルカルボニル」が酸素原子に結合した基を意味する。例えば、エチレニルカルボニルオキシ、プロペニルカルボニルオキシ等が挙げられる。
　「アルキニルカルボニルオキシ」とは、上記「アルキニルカルボニル」が酸素原子に結合した基を意味する。例えば、エチニルカルボニルオキシ、プロピニルカルボニルオキシ等が挙げられる。
　「アルキルオキシカルボニル」とは、上記「アルキルオキシ」がカルボニル基に結合した基を意味する。例えば、メチルオキシカルボニル、エチルオキシカルボニル、プロピルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル、イソブチルオキシカルボニル、ｓｅｃ－ブチルオキシカルボニル、ペンチルオキシカルボニル、イソペンチルオキシカルボニル、へキシルオキシカルボニル等が挙げられる。
　「アルキルオキシカルボニル」の好ましい態様としては、メチルオキシカルボニル、エチルオキシカルボニル、プロピルオキシカルボニルが挙げられる。
　「アルケニルオキシカルボニル」とは、上記「アルケニルオキシ」がカルボニル基に結合した基を意味する。例えば、エチレニルオキシカルボニル、プロペニルオキシカルボニル等が挙げられる。
　「アルキニルオキシカルボニル」とは、上記「アルキニルオキシ」がカルボニル基に結合した基を意味する。例えば、エチニルオキシカルボニル、プロピニルオキシカルボニル等が挙げられる。
　「アルキルスルファニル」とは、上記「アルキル」がスルファニル基の硫黄原子と結合している水素原子と置き換わった基を意味する。例えば、メチルスルファニル、エチルスルファニル、ｎ－プロピルスルファニル、イソプロピルスルファニル等が挙げられる。
　「アルケニルスルファニル」とは、上記「アルケニル」がスルファニル基の硫黄原子と結合している水素原子と置き換わった基を意味する。例えば、エチレニルスルファニル、プロペニルスルファニル等が挙げられる。
　「アルキニルスルファニル」とは、上記「アルキニル」がスルファニル基の硫黄原子と結合している水素原子と置き換わった基を意味する。例えば、エチニルスルファニル、プロピニルスルファニル等が挙げられる。
　「アルキルスルフィニル」とは、上記「アルキル」がスルフィニル基に結合した基を意味する。例えば、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、ｎ－プロピルスルフィニル、イソプロピルスルフィニル等が挙げられる。
　「アルケニルスルフィニル」とは、上記「アルケニル」がスルフィニル基に結合した基を意味する。例えば、エチレニルスルフィニル、プロペニルスルフィニル等が挙げられる。
　「アルキニルスルフィニル」とは、上記「アルキニル」がスルフィニル基に結合した基を意味する。例えば、エチニルスルフィニル、プロピニルスルフィニル等が挙げられる。
　「モノアルキルカルバモイル」とは、上記「アルキル」がカルバモイル基の窒素原子と結合している水素原子１個と置き換わった基を意味する。例えば、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル等が挙げられる。
　「ジアルキルカルバモイル」とは、上記「アルキル」がカルバモイル基の窒素原子と結合している水素原子２個と置き換わった基を意味する。２個のアルキル基は、同一でも異なっていてもよい。例えば、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル等が挙げられる。
　「モノアルキルスルファモイル」とは、上記「アルキル」がスルファモイル基の窒素原子と結合している水素原子１個と置き換わった基を意味する。例えば、メチルスルファモイル、ジメチルスルファモイル等が挙げられる。
　「ジアルキルスルファモイル」とは、上記「アルキル」がスルファモイル基の窒素原子と結合している水素原子２個と置き換わった基を意味する。２個のアルキル基は、同一でも異なっていてもよい。例えば、ジメチルスルファモイル、ジエチルスルファモイル等が挙げられる。
　「トリアルキルシリル」とは、上記「アルキル」３個がケイ素原子に結合している基を意味する。３個のアルキルは同一でも異なっていてもよい。例えば、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル等が挙げられる。
　「芳香族炭素環アルキル」、「非芳香族炭素環アルキル」、「芳香族複素環アルキル」、及び「非芳香族複素環アルキル」、
「芳香族炭素環アルキルオキシ」、「非芳香族炭素環アルキルオキシ」、「芳香族複素環アルキルオキシ」、及び「非芳香族複素環アルキルオキシ」、
「芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル」、「非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル」、「芳香族複素環アルキルオキシカルボニル」、及び「非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル」、
「芳香族炭素環アルキルオキシアルキル」、「非芳香族炭素環アルキルオキシアルキル」、「芳香族複素環アルキルオキシアルキル」、及び「非芳香族複素環アルキルオキシアルキル」、ならびに
「芳香族炭素環アルキルアミノ」、「非芳香族炭素環アルキルアミノ」、「芳香族複素環アルキルアミノ」、及び「非芳香族複素環アルキルアミノ」のアルキル部分も、上記「アルキル」と同様である。
　「芳香族炭素環アルキル」とは、１以上の上記「芳香族炭素環式基」で置換されているアルキルを意味する。例えば、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、ベンズヒドリル、トリチル、ナフチルメチル、以下に示される基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
等が挙げられる。
　「芳香族炭素環アルキル」の好ましい態様としては、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルが挙げられる。
　「非芳香族炭素環アルキル」とは、１以上の上記「非芳香族炭素環式基」で置換されているアルキルを意味する。また、「非芳香族炭素環アルキル」は、アルキル部分が上記「芳香族炭素環式基」で置換されている「非芳香族炭素環アルキル」も包含する。例えば、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロへキシルメチル、以下に示される基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
等が挙げられる。
　「芳香族複素環アルキル」とは、１以上の上記「芳香族複素環式基」で置換されているアルキルを意味する。また、「芳香族複素環アルキル」は、アルキル部分が上記「芳香族炭素環式基」及び／又は「非芳香族炭素環式基」で置換されている「芳香族複素環アルキル」も包含する。例えば、ピリジルメチル、フラニルメチル、イミダゾリルメチル、インドリルメチル、ベンゾチオフェニルメチル、オキサゾリルメチル、イソキサゾリルメチル、チアゾリルメチル、イソチアゾリルメチル、ピラゾリルメチル、イソピラゾリルメチル、ピロリジニルメチル、ベンズオキサゾリルメチル、以下に示される基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
等が挙げられる。
　「非芳香族複素環アルキル」とは、１以上の上記「非芳香族複素環式基」で置換されているアルキルを意味する。また、「非芳香族複素環アルキル」は、アルキル部分が上記「芳香族炭素環式基」、「非芳香族炭素環式基」及び／又は「芳香族複素環式基」で置換されている「非芳香族複素環アルキル」も包含する。例えば、テトラヒドロピラニルメチル、モルホリニルエチル、ピペリジニルメチル、ピペラジニルメチル、以下に示される基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
等が挙げられる。
　「芳香族炭素環アルキルオキシ」とは、１以上の上記「芳香族炭素環式基」で置換されているアルキルオキシを意味する。例えば、ベンジルオキシ、フェネチルオキシ、フェニルプロピルオキシ、ベンズヒドリルオキシ、トリチルオキシ、ナフチルメチルオキシ、以下に示される基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
等が挙げられる。
　「非芳香族炭素環アルキルオキシ」とは、１以上の上記「非芳香族炭素環式基」で置換されているアルキルオキシを意味する。また、「非芳香族炭素環アルキルオキシ」は、アルキル部分が上記「芳香族炭素環式基」で置換されている「非芳香族炭素環アルキルオキシ」も包含する。例えば、シクロプロピルメチルオキシ、シクロブチルメチルオキシ、シクロペンチルメチルオキシ、シクロへキシルメチルオキシ、以下に示される基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
等が挙げられる。
　「芳香族複素環アルキルオキシ」とは、１以上の上記「芳香族複素環式基」で置換されているアルキルオキシを意味する。また、「芳香族複素環アルキルオキシ」は、アルキル部分が上記「芳香族炭素環式基」及び／又は「非芳香族炭素環式基」で置換されている「芳香族複素環アルキルオキシ」も包含する。例えば、ピリジルメチルオキシ、フラニルメチルオキシ、イミダゾリルメチルオキシ、インドリルメチルオキシ、ベンゾチオフェニルメチルオキシ、オキサゾリルメチルオキシ、イソキサゾリルメチルオキシ、チアゾリルメチルオキシ、イソチアゾリルメチルオキシ、ピラゾリルメチルオキシ、イソピラゾリルメチルオキシ、ピロリジニルメチルオキシ、ベンズオキサゾリルメチルオキシ、以下に示される基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
等が挙げられる。
　「非芳香族複素環アルキルオキシ」とは、１以上の上記「非芳香族複素環式基」で置換されているアルキルオキシを意味する。また、「非芳香族複素環アルキルオキシ」は、アルキル部分が上記「芳香族炭素環式基」、「非芳香族炭素環式基」及び／又は「芳香族複素環式基」で置換されている「非芳香族複素環アルキルオキシ」も包含する。例えば、テトラヒドロピラニルメチルオキシ、モルホリニルエチルオキシ、ピペリジニルメチルオキシ、ピペラジニルメチルオキシ、以下に示される基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
等が挙げられる。
　「芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル」とは、１以上の上記「芳香族炭素環式基」で置換されているアルキルオキシカルボニルを意味する。例えば、ベンジルオキシカルボニル、フェネチルオキシカルボニル、フェニルプロピルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、トリチルオキシカルボニル、ナフチルメチルオキシカルボニル、以下に示される基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
等が挙げられる。
　「非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル」とは、１以上の上記「非芳香族炭素環式基」で置換されているアルキルオキシカルボニルを意味する。また、「非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル」は、アルキル部分が上記「芳香族炭素環式基」で置換されている「非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル」も包含する。例えば、シクロプロピルメチルオキシカルボニル、シクロブチルメチルオキシカルボニル、シクロペンチルメチルオキシカルボニル、シクロへキシルメチルオキシカルボニル、以下に示される基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
等が挙げられる。
　「芳香族複素環アルキルオキシカルボニル」とは、１以上の上記「芳香族複素環式基」で置換されているアルキルオキシカルボニルを意味する。また、「芳香族複素環アルキルオキシカルボニル」は、アルキル部分が上記「芳香族炭素環式基」及び／又は「非芳香族炭素環式基」で置換されている「芳香族複素環アルキルオキシカルボニル」も包含する。例えば、ピリジルメチルオキシカルボニル、フラニルメチルオキシカルボニル、イミダゾリルメチルオキシカルボニル、インドリルメチルオキシカルボニル、ベンゾチオフェニルメチルオキシカルボニル、オキサゾリルメチルオキシカルボニル、イソキサゾリルメチルオキシカルボニル、チアゾリルメチルオキシカルボニル、イソチアゾリルメチルオキシカルボニル、ピラゾリルメチルオキシカルボニル、イソピラゾリルメチルオキシカルボニル、ピロリジニルメチルオキシカルボニル、ベンズオキサゾリルメチルオキシカルボニル、以下に示される基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
等が挙げられる。
　「非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル」とは、１以上の上記「非芳香族複素環式基」で置換されているアルキルオキシカルボニルを意味する。また、「非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル」は、アルキル部分が上記「芳香族炭素環式基」、「非芳香族炭素環式基」及び／又は「芳香族複素環式基」で置換されている「非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル」も包含する。例えば、テトラヒドロピラニルメチルオキシ、モルホリニルエチルオキシ、ピペリジニルメチルオキシ、ピペラジニルメチルオキシ、以下に示される基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
等が挙げられる。
　「芳香族炭素環アルキルオキシアルキル」とは、１以上の上記「芳香族炭素環式基」で置換されているアルキルオキシアルキルを意味する。例えば、ベンジルオキシメチル、フェネチルオキシメチル、フェニルプロピルオキシメチル、ベンズヒドリルオキシメチル、トリチルオキシメチル、ナフチルメチルオキシメチル、以下に示される基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
等が挙げられる。
　「非芳香族炭素環アルキルオキシアルキル」とは、１以上の上記「非芳香族炭素環式基」で置換されているアルキルオキシアルキルを意味する。また、「非芳香族炭素環アルキルオキシアルキル」は、非芳香族炭素環が結合しているアルキル部分が上記「芳香族炭素環式基」で置換されている「非芳香族炭素環アルキルオキシアルキル」も包含する。例えば、シクロプロピルメチルオキシメチル、シクロブチルメチルオキシメチル、シクロペンチルメチルオキシメチル、シクロへキシルメチルオキシメチル、以下に示される基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
等が挙げられる。
　「芳香族複素環アルキルオキシアルキル」とは、１以上の上記「芳香族複素環式基」で置換されているアルキルオキシアルキルを意味する。また、「芳香族複素環アルキルオキシアルキル」は、芳香族複素環が結合しているアルキル部分が上記「芳香族炭素環式基」及び／又は「非芳香族炭素環式基」で置換されている「芳香族複素環アルキルオキシアルキル」も包含する。例えば、ピリジルメチルオキシメチル、フラニルメチルオキシメチル、イミダゾリルメチルオキシメチル、インドリルメチルオキシメチル、ベンゾチオフェニルメチルオキシメチル、オキサゾリルメチルオキシメチル、イソキサゾリルメチルオキシメチル、チアゾリルメチルオキシメチル、イソチアゾリルメチルオキシメチル、ピラゾリルメチルオキシメチル、イソピラゾリルメチルオキシメチル、ピロリジニルメチルオキシメチル、ベンズオキサゾリルメチルオキシメチル、以下に示される基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
等が挙げられる。
　「非芳香族複素環アルキルオキシアルキル」とは、１以上の上記「非芳香族複素環式基」で置換されているアルキルオキシアルキルを意味する。また、「非芳香族複素環アルキルオキシ」は、非芳香族複素環が結合しているアルキル部分が上記「芳香族炭素環式基」、「非芳香族炭素環式基」及び／又は「芳香族複素環式基」で置換されている「非芳香族複素環アルキルオキシアルキル」も包含する。例えば、テトラヒドロピラニルメチルオキシメチル、モルホリニルエチルオキシメチル、ピペリジニルメチルオキシメチル、ピペラジニルメチルオキシメチル、以下に示される基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
等が挙げられる。
　「芳香族炭素環アルキルアミノ」とは、上記「芳香族炭素環アルキル」がアミノ基の窒素原子と結合している水素原子１個又は２個と置き換わった基を意味する。例えば、ベンジルアミノ、フェネチルアミノ、フェニルプロピルアミノ、ベンズヒドリルアミノ、トリチルアミノ、ナフチルメチルアミノ、ジベンジルアミノ等が挙げられる。
　「非芳香族炭素環アルキルアミノ」とは、上記「非芳香族炭素環アルキル」がアミノ基の窒素原子と結合している水素原子１個又は２個と置き換わった基を意味する。例えば、シクロプロピルメチルアミノ、シクロブチルメチルアミノ、シクロペンチルメチルアミノ、シクロへキシルメチルアミノ等が挙げられる。
　「芳香族複素環アルキルアミノ」とは、上記「芳香族複素環アルキル」がアミノ基の窒素原子と結合している水素原子１個又は２個と置き換わった基を意味する。例えば、ピリジルメチルアミノ、フラニルメチルアミノ、イミダゾリルメチルアミノ、インドリルメチルアミノ、ベンゾチオフェニルメチルアミノ、オキサゾリルメチルアミノ、イソキサゾリルメチルアミノ、チアゾリルメチルアミノ、イソチアゾリルメチルアミノ、ピラゾリルメチルアミノ、イソピラゾリルメチルアミノ、ピロリジニルメチルアミノ、ベンズオキサゾリルメチルアミノ等が挙げられる。
　「非芳香族複素環アルキルアミノ」とは、上記「非芳香族複素環アルキル」がアミノ基の窒素原子と結合している水素原子１個又は２個と置き換わった基を意味する。例えば、テトラヒドロピラニルメチルアミノ、モルホリニルエチルアミノ、ピペリジニルメチルアミノ、ピペラジニルメチルアミノ等が挙げられる。
　「芳香族炭素環オキシ」、「芳香族炭素環カルボニル」、「芳香族炭素環オキシカルボニル」、「芳香族炭素環スルファニル」、及び「芳香族炭素環スルホニル」の「芳香族炭素環」部分も、上記「芳香族炭素環式基」と同様である。
　「芳香族炭素環オキシ」とは、「芳香族炭素環」が酸素原子に結合した基を意味する。例えば、フェニルオキシ、ナフチルオキシ等が挙げられる。
　「芳香族炭素環カルボニル」とは、「芳香族炭素環」がカルボニル基に結合した基を意味する。例えば、フェニルカルボニル、ナフチルカルボニル等が挙げられる。
　「芳香族炭素環オキシカルボニル」とは、上記「芳香族炭素環オキシ」がカルボニル基に結合した基を意味する。例えば、フェニルオキシカルボニル、ナフチルオキシカルボニル等が挙げられる。
　「芳香族炭素環スルファニル」とは、「芳香族炭素環」がスルファニル基の硫黄原子と結合している水素原子と置き換わった基を意味する。例えば、フェニルスルファニル、ナフチルスルファニル等が挙げられる。
　「芳香族炭素環スルホニル」とは、「芳香族炭素環」がスルホニル基に結合した基を意味する。例えば、フェニルスルホニル、ナフチルスルホニル等が挙げられる。
　「非芳香族炭素環オキシ」、「非芳香族炭素環カルボニル」、「非芳香族炭素環オキシカルボニル」、「非芳香族炭素環スルファニル」、及び「非芳香族炭素環スルホニル」の「非芳香族炭素環」部分も、上記「非芳香族炭素環式基」と同様である。
　「非芳香族炭素環オキシ」とは、「非芳香族炭素環」が酸素原子に結合した基を意味する。例えば、シクロプロピルオキシ、シクロヘキシルオキシ、シクロへキセニルオキシ等が挙げられる。
　「非芳香族炭素環カルボニル」とは、「非芳香族炭素環」がカルボニル基に結合した基を意味する。例えば、シクロプロピルカルボニル、シクロヘキシルカルボニル、シクロへキセニルカルボニル等が挙げられる。
　「非芳香族炭素環オキシカルボニル」とは、上記「非芳香族炭素環オキシ」がカルボニル基に結合した基を意味する。例えば、シクロプロピルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、シクロへキセニルオキシカルボニル等が挙げられる。
　「非芳香族炭素環スルファニル」とは、「非芳香族炭素環」がスルファニル基の硫黄原子と結合している水素原子と置き換わった基を意味する。例えば、シクロプロピルスルファニル、シクロヘキシルスルファニル、シクロヘキセニルスルファニル等が挙げられる。
　「非芳香族炭素環スルホニル」とは、「非芳香族炭素環」がスルホニル基に結合した基を意味する。例えば、シクロプロピルスルホニル、シクロヘキシルスルホニル、シクロヘキセニルスルホニル等が挙げられる。
　「芳香族複素環オキシ」、「芳香族複素環カルボニル」、「芳香族複素環オキシカルボニル」、「芳香族複素環スルファニル」、及び「芳香族複素環スルホニル」の「芳香族複素環」部分も、上記「芳香族複素環式基」と同様である。
　「芳香族複素環オキシ」とは、「芳香族複素環」が酸素原子に結合した基を意味する。例えば、ピリジルオキシ、オキサゾリルオキシ等が挙げられる。
　「芳香族複素環カルボニル」とは、「芳香族複素環」がカルボニル基に結合した基を意味する。例えば、ピリジルカルボニル、オキサゾリルカルボニル等が挙げられる。
　「芳香族複素環オキシカルボニル」とは、上記「芳香族複素環オキシ」がカルボニル基に結合した基を意味する。例えば、ピリジルオキシカルボニル、オキサゾリルオキシカルボニル等が挙げられる。
　「芳香族複素環スルファニル」とは、「芳香族複素環」がスルファニル基の硫黄原子と結合している水素原子と置き換わった基を意味する。例えば、ピリジルスルファニル、オキサゾリルスルファニル等が挙げられる。
　「芳香族複素環スルホニル」とは、「芳香族複素環」がスルホニル基に結合した基を意味する。例えば、ピリジルスルホニル、オキサゾリルスルホニル等が挙げられる。
　「非芳香族複素環オキシ」、「非芳香族複素環カルボニル」、「非芳香族複素環オキシカルボニル」、「非芳香族複素環スルファニル」、及び「非芳香族複素環スルホニル」の「非芳香族複素環」部分も、上記「非芳香族複素環式基」と同様である。
　「非芳香族複素環オキシ」とは、「非芳香族複素環」が酸素原子に結合した基を意味する。例えば、ピペリジニルオキシ、テトラヒドロフリルオキシ等が挙げられる。
　「非芳香族複素環カルボニル」とは、「非芳香族複素環」がカルボニル基に結合した基を意味する。例えば、ピペリジニルカルボニル、テトラヒドロフリルカルボニル等が挙げられる。
　「非芳香族複素環オキシカルボニル」とは、上記「非芳香族複素環オキシ」がカルボニル基に結合した基を意味する。例えば、ピペリジニルオキシカルボニル、テトラヒドロフリルオキシカルボニル等が挙げられる。
　「非芳香族複素環スルファニル」とは、「非芳香族複素環」がスルファニル基の硫黄原子と結合している水素原子と置き換わった基を意味する。例えば、ピペリジニルスルファニル、テトラヒドロフリルスルファニル等が挙げられる。
　「非芳香族複素環スルホニル」とは、「非芳香族複素環」がスルホニル基に結合した基を意味する。例えば、ピペリジニルスルホニル、テトラヒドロフリルスルホニル等が挙げられる。
　「置換若しくは非置換のアルキル」、「置換若しくは非置換のアルケニル」、「置換若しくは非置換のアルキニル」、「置換若しくは非置換のアルキレン」、「置換又は非置換のメチレン」、「置換若しくは非置換のアルキルオキシ」、「置換若しくは非置換のアルケニルオキシ」、「置換若しくは非置換のアルキニルオキシ」、「置換若しくは非置換のアルキルカルボニル」、「置換若しくは非置換のアルケニルカルボニル」、「置換若しくは非置換のアルキニルカルボニル」、「置換若しくは非置換のモノアルキルアミノ」、「置換若しくは非置換のジアルキルアミノ」、「置換若しくは非置換のアルキルスルホニル」、「置換若しくは非置換のアルケニルスルホニル」、「置換若しくは非置換のアルキニルスルホニル」、「置換若しくは非置換のモノアルキルカルボニルアミノ」、「置換若しくは非置換のジアルキルカルボニルアミノ」、「置換若しくは非置換のモノアルキルスルホニルアミノ」、「置換若しくは非置換のジアルキルスルホニルアミノ」、「置換若しくは非置換のアルキルイミノ」、「置換若しくは非置換のアルケニルイミノ」、「置換若しくは非置換のアルキニルイミノ」、「置換若しくは非置換のアルキルカルボニルイミノ」、「置換若しくは非置換のアルケニルカルボニルイミノ」、「置換若しくは非置換のアルキニルカルボニルイミノ」、「置換若しくは非置換のアルキルオキシイミノ」、「置換若しくは非置換のアルケニルオキシイミノ」、「置換若しくは非置換のアルキニルオキシイミノ」、「置換若しくは非置換のアルキルカルボニルオキシ」、「置換若しくは非置換のアルケニルカルボニルオキシ」、「置換若しくは非置換のアルキニルカルボニルオキシ」、「置換若しくは非置換のアルキルオキシカルボニル」、「置換若しくは非置換のアルケニルオキシカルボニル」、「置換若しくは非置換のアルキニルオキシカルボニル」、「置換若しくは非置換のアルキルスルファニル」、「置換若しくは非置換のアルケニルスルファニル」、「置換若しくは非置換のアルキニルスルファニル」、「置換若しくは非置換のアルキルスルフィニル」、「置換若しくは非置換のアルケニルスルフィニル」、「置換若しくは非置換のアルキニルスルフィニル」、「置換若しくは非置換のモノアルキルカルバモイル」、「置換若しくは非置換のジアルキルカルバモイル」、「置換若しくは非置換のモノアルキルスルファモイル」、及び「置換若しくは非置換のジアルキルスルファモイル」の置換基としては、次の置換基が挙げられる。任意の位置の炭素原子が次の置換基から選択される１以上の基と結合していてもよい。
　置換基：ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシイミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、モノアルキルカルボニルアミノ、ジアルキルカルボニルアミノ、モノアルキルスルホニルアミノ、ジアルキルスルホニルアミノ、アルキルイミノ、アルケニルイミノ、アルキニルイミノ、アルキルカルボニルイミノ、アルケニルカルボニルイミノ、アルキニルカルボニルイミノ、アルキルオキシイミノ、アルケニルオキシイミノ、アルキニルオキシイミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アルキルスルファニル、アルケニルスルファニル、アルキニルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環オキシ、非芳香族炭素環オキシ、芳香族複素環オキシ、非芳香族複素環オキシ、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル、非芳香族複素環カルボニル、芳香族炭素環オキシカルボニル、非芳香族炭素環オキシカルボニル、芳香族複素環オキシカルボニル、非芳香族複素環オキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルオキシ、非芳香族炭素環アルキルオキシ、芳香族複素環アルキルオキシ、非芳香族複素環アルキルオキシ、芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルアミノ、非芳香族炭素環アルキルアミノ、芳香族複素環アルキルアミノ、非芳香族複素環アルキルアミノ、芳香族炭素環スルファニル、非芳香族炭素環スルファニル、芳香族複素環スルファニル、非芳香族複素環スルファニル、非芳香族炭素環スルホニル、芳香族炭素環スルホニル、芳香族複素環スルホニル、及び非芳香族複素環スルホニル。
　「置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基」、「置換若しくは非置換の非芳香族炭素環式基」、「置換若しくは非置換の芳香族複素環式基」、及び「置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基」、
「置換若しくは非置換の芳香族炭素環オキシ」、「置換若しくは非置換の非芳香族炭素環オキシ」、「置換若しくは非置換の芳香族複素環オキシ」、及び「置換若しくは非置換の非芳香族複素環オキシ」、
「置換若しくは非置換の芳香族炭素環カルボニル」、「置換若しくは非置換の非芳香族炭素環カルボニル」、「置換若しくは非置換の芳香族複素環カルボニル」、及び「置換若しくは非置換の非芳香族複素環カルボニル」、
「置換若しくは非置換の芳香族炭素環オキシカルボニル」、「置換若しくは非置換の非芳香族炭素環オキシカルボニル」、「置換若しくは非置換の芳香族複素環オキシカルボニル」、及び「置換若しくは非置換の非芳香族複素環オキシカルボニル」、
「置換若しくは非置換の芳香族炭素環スルファニル」、「置換若しくは非置換の非芳香族炭素環スルファニル」、「置換若しくは非置換の芳香族複素環スルファニル」、及び「置換若しくは非置換の非芳香族複素環スルファニル」、ならびに
「置換若しくは非置換の芳香族炭素環スルホニル」、「置換若しくは非置換の非芳香族炭素環スルホニル」、「置換若しくは非置換の芳香族複素環スルホニル」、及び「置換若しくは非置換の非芳香族複素環スルホニル」の「芳香族炭素環」、「非芳香族炭素環」、「芳香族複素環」及び
「非芳香族複素環」の環上の置換基及び「置換若しくは非置換の含窒素環」の環上の置換基としては、次の置換基が挙げられる。環上の任意の位置の原子が次の置換基から選択される１以上の基と結合していてもよい。
　置換基：ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシイミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルキルオキシ、アルキルオキシアルキル、アルキルオキシアルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、モノアルキルカルボニルアミノ、ジアルキルカルボニルアミノ、モノアルキルスルホニルアミノ、ジアルキルスルホニルアミノ、アルキルイミノ、アルケニルイミノ、アルキニルイミノ、アルキルカルボニルイミノ、アルケニルカルボニルイミノ、アルキニルカルボニルイミノ、アルキルオキシイミノ、アルケニルオキシイミノ、アルキニルオキシイミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アルキルスルファニル、アルケニルスルファニル、アルキニルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環オキシ、非芳香族炭素環オキシ、芳香族複素環オキシ、非芳香族複素環オキシ、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル、非芳香族複素環カルボニル、芳香族炭素環オキシカルボニル、非芳香族炭素環オキシカルボニル、芳香族複素環オキシカルボニル、非芳香族複素環オキシカルボニル、芳香族炭素環アルキル、非芳香族炭素環アルキル、芳香族複素環アルキル、非芳香族複素環アルキル、芳香族炭素環アルキルオキシ、非芳香族炭素環アルキルオキシ、芳香族複素環アルキルオキシ、非芳香族複素環アルキルオキシ、芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルオキシアルキル、非芳香族炭素環アルキルオキシアルキル、芳香族複素環アルキルオキシアルキル、非芳香族複素環アルキルオキシアルキル、芳香族炭素環アルキルアミノ、非芳香族炭素環アルキルアミノ、芳香族複素環アルキルアミノ、非芳香族複素環アルキルアミノ、芳香族炭素環スルファニル、非芳香族炭素環スルファニル、芳香族複素環スルファニル、非芳香族複素環スルファニル、非芳香族炭素環スルホニル、芳香族炭素環スルホニル、芳香族複素環スルホニル、及び非芳香族複素環スルホニル。
　また、「置換若しくは非置換の非芳香族炭素環式基」及び「置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基」は「オキソ」で置換されていてもよい。この場合、以下のように炭素原子上の２個の水素原子が置換されている基を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
　上記、「置換若しくは非置換の非芳香族炭素環オキシ」、「置換若しくは非置換の非芳香族複素環オキシ」、「置換若しくは非置換の非芳香族炭素環カルボニル」、「置換若しくは非置換の非芳香族複素環カルボニル」、「置換若しくは非置換の非芳香族炭素環オキシカルボニル」、「置換若しくは非置換の非芳香族複素環オキシカルボニル」、「置換若しくは非置換の非芳香族炭素環スルファニル」、「置換若しくは非置換の非芳香族複素環スルファニル」、「置換若しくは非置換の非芳香族炭素環スルホニル」、及び「置換若しくは非置換の非芳香族複素環スルホニル」の非芳香族炭素環、及び非芳香族複素環部分も上記と同様に「オキソ」で置換されていてもよい。
　本発明は、本発明の「二本鎖オリゴヌクレオチド」を含有する医薬組成物も包含する。本発明の医薬組成物の投与方法及び製剤は、当該分野で公知の投与方法及び製剤であれば、いずれも利用可能である。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与方法及び製剤は、例えば、以下の文献にも開示されている。
国際公開第２００４／０１６７４９号、国際公開第２００５／０８３１２４号、国際公開２００７／１４３３１５号、国際公開第２００９／０７１６８０号、国際公開第２０１３／０８９２８３号等。
　本発明の医薬組成物は、局所的あるいは全身的な治療のいずれが望まれるのか、又は治療すべき領域に応じて、様々な方法により投与することができる。投与方法としては、例えば、局所的（点眼、膣内、直腸内、鼻腔内、経皮を含む）、経口的、又は、非経口的であってもよい。非経口的投与としては、静脈内注射若しくは点滴、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注入、吸引若しくは吸入による肺投与、硬膜下腔内投与、脳室内投与等が挙げられる。好ましくは、静脈内注射又は皮下投与である。
　本発明の医薬組成物を局所投与する場合、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、散剤等の製剤を用いることができる。
　経口投与用組成物としては、散剤、顆粒剤、水若しくは非水性媒体に溶解させた懸濁液又は溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等が挙げられる。
　非経口、硬膜下腔、又は、脳室内投与用組成物としては、バッファー、希釈剤及びその他の適当な添加剤を含む無菌水溶液等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量にその剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤等の各種医薬用添加剤を必要に応じて混合して得ることができる。注射剤の場合には適当な担体と共に滅菌処理を行なって製剤とすればよい。
　賦形剤としては乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム又は結晶セルロース等が挙げられる。結合剤としてはメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末又はラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられる。滑沢剤としてはタルク、ステアリン酸マグネシウム又はマクロゴール等が挙げられる。坐剤の基剤としてはカカオ脂、マクロゴール又はメチルセルロース等を用いることができる。また、液剤又は乳濁性、懸濁性の注射剤として調製する場合には通常使用されている溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、等張剤等を適宜添加しても良い。経口投与の場合には嬌味剤、芳香剤等を加えても良い。
　投与は、治療される病態の重度と反応度に依存し、治療コースは、数日から数ヶ月、あるいは、治癒が実現されるまで、又は、病状の減退が達成されるまで持続する。最適投与スケジュールは、生体における薬剤蓄積の測定から計算が可能である。当該分野の当業者であれば、最適用量、投与法、及び、繰り返し頻度を定めることができる。最適用量は、個々のアンチセンスオリゴヌクレオチドの相対的効力に応じて変動するが、一般に、インビトロ及びインビボの動物実験におけるＩＣ５０又はＥＣ５０に基づいて計算することが可能である。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの分子量（アンチセンスオリゴヌクレオチド配列及び化学構造から導かれる）と、例えば、ＩＣ５０のような効果的用量（実験的に導かれる）が与えられたならば、ｍｇ／ｋｇで表される用量が通例にしたがって計算される。
　なお、本明細書中で用いる略語は以下の意味を表す。
Ａｃ：アセチル
Ｂｎ：ベンジル
Ｂｚ：ベンゾイル
ＤＡＢＣＯ：１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン
ＤＭＴｒ：ジメトキシトリチル
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド
ＥＤＣ：１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
Ｆｍｏｃ：９－フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＨＢＴＵ：Ｏ－ベンゾトリアゾール－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－ウロニウム－ヘキサフルオロ－ホスフェート
Ｍｅ：メチル
Ｐｈ：フェニル
ＴＢＳ：ｔｅｒｔ-ブチルジメチルシリル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＭＳＯＴｆ：トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル
　以下に本発明の実施例及び参考例、ならびに試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
　実施例で得られたＮＭＲ分析は３００ＭＨｚで行い、ＤＭＳＯ－ｄ６あるいはＣＤＣｌ３を用いて測定した。
　ＵＰＬＣ分析は以下の条件を用いた。
移動相：［Ａ］は０．１％ギ酸含有水溶液［Ｂ］は０．１％ギ酸含有アセトニトリル溶液
グラジエント：３．５分間で５％－１００％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行った後、０．５分間、１００％溶媒［Ｂ］を維持した。
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ　Ｃ１８（１．７μｍ、ｉ．ｄ．２．１ｘ５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）
流速：０．８　ｍＬ／分
ＰＤＡ検出波長：２５４ｎｍ（検出範囲２１０－５００ｎｍ）
実施例１　アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体を含有する化合物の合成
１）化合物１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
工程１　化合物１０２の合成
　化合物１０１（１５．０ｇ、８８．０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド溶液（１００ｍＬ）に室温で水素化ナトリウム（６０％　ｗ／ｗ、５．２６ｇ、１．５ｅｑ．）を加え、３０分間撹拌した後、ベンジルブロミド（１０．４２ｇ、８８．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で５．５時間撹拌した。反応液にメタノール（５ｍｌ）を加えた後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルにて抽出、飽和食塩水にて洗浄、次いで硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：３３０ｇ、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝９０：１０→７５：２５）により精製し、化合物１０２（１１．０ｇ、収率４２％）を油状物質として得た。
ESI-MS(m/z) : 293.10 (M+1). 
工程２　化合物１０３の合成
　化合物１０２（５．００ｇ、１７．１ｍｏｌ）のＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド溶液（４０ｍＬ）に室温で二クロム酸ピリジニウム（１９．３ｇ、５１．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で５．５時間撹拌した後、酢酸エチル（２００ｍＬ）を加え、反応混合物をセライトろ過した。ろ液に飽和食塩水を加えた後、酢酸エチルで抽出、飽和食塩水にて洗浄、次いで硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：１２０ｇ、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝９０：１０→５０：５０）により精製し、化合物１０３（３．３２ｇ、収率６３％）を得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：7.36 -7.32 (m, 4H), 7.28 (dd, J = 8.4, 4.0 Hz, 1H), 7.20 (m, 1H), 4.51 (s, 2H, -OCH2Ph), 3.46 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.34 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.68-1.56 (m, 4H), 1.40-1.23 (m, 14H). 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
工程３　化合物１０４及び化合物１０５の合成
　国際公開第２０１２／０３７２５４号の実施例３に記載の方法にて、化合物１０４を合成し、続いて化合物１０５を合成した。
工程４　化合物１０６の合成
　化合物１０３（２１８ｍｇ、１７．１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド溶液（３ｍＬ）に室温でＮ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（４０５μｌ、２．３２ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３２４ｍｇ、０．８５５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間撹拌した後、化合物１０５（２１８ｍｇ、１７．１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド溶液（３ｍＬ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（７５μｌ、０．４２８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。反応液をクロロホルムで希釈し、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：２４ｇ、クロロホルム：メタノール＝９０：１０→８０：２０）により精製し、化合物１０６（４３０ｍｇ、収率５８％）を得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：7.38-7.31 (m, 4H), 7.23 (m, 1H), 7.00-6.90 (m, 3H, -NH), 6.69-6.60 (m, 2H, -NH), 6.46 (br.s, 1H, -NH), 5.35 (d, J = 2.9 Hz, 3H, H-4 of GalNAc), 5.24-5.14 (m, 3H, H-3 of GalNAc), 4.61 (d, J = 8.4 Hz, 3H, H-1 of GalNAc), 4.50 (s, 2H, -CH2Ph), 4.22-4.00 (m, 9H), 3.99-3.88 (m, 6H), 3.79-3.60 (m, 12H), 3.56-3.43 (m, 3H), 3.47 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.39-3.20 (m, 12H), 2.47-2.40 (m, 6H), 2.32-2.16 (m, 6H), 2.15 (s, 9H), 2.05 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.85-1.50 (18H, m), 1.32-1.23 (12H, m).
工程５　化合物１０７の合成
　化合物１０６（９０ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（３ｍＬ）に室温でＰｄ－Ｃ（１０％、５０ｍｇ）を加え、水素気流下、室温で１２時間撹拌した。反応液より触媒をろ別した後、ろ液を濃縮することにより化合物１０７（７９ｍｇ、収率９２％）を無色粉末として得た。
ESI-MS(m/z) : 1992.10 (M-1).
工程６　化合物１の合成
　化合物１０７（７２２ｍｇ、０．３６２ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（７ｍＬ）に０℃で、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（２５３μｌ、１．４５ｍｍｏｌ）、３－（クロロ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノキシ）プロパンニトリル（０．１６２ｍｌ、０．７２５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液を塩化メチレンで希釈し、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：２４ｇ、クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝９５：５：１→９０：１０：１）により精製し、化合物１（５５１ｍｇ、収率５７％）を無色粉末として得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：7.25-7.15 (m, 5H, -NH), 7.05-6.90 (m, 2H, -NH), 6.70-6.61 (m, 2H, -NH), 6.45 (s, 1H, -NH), 5.35 (br.s, 3H, H-4 of GalNAc), 5.20 (m, 3H, H-3 of GalNAc), 4.61 (d, J = 8.3 Hz, 3H, H-1 of GalNAc), 4.22-4.01 (m, 9H), 3.98-3.89 (m, 6H), 3.83 (dd, J = 14.0, 6.9 Hz, 3H, H-6 of GalNAc), 3.72-3.62 (m, 12H), 3.59 (dd, J = 14.0, 8.0 Hz, 3H, H-6 of GalNAc), 3.56-3.47 (m, 3H), 3.36-3.10 (m, 12H), 2.65 (t, J = 7.2 Hz, 2H, -OCH2CH2CN), 2.47-2.40 (m, 6H), 2.32-2.18 (m, 6H), 2.15 (s, 9H), 2.05 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.80-1.52 (12H, m), 1.37-1.20 (24H, m), 1.19 (d, J = 6.5 Hz, -CH(CH3)2), 1.18 (d, J = 6.5 Hz, -CH(CH3)2).
２）化合物２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
　化合物１０５（１．２０ｇ、０．６２９ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（１２ｍＬ）に室温でトリエチルアミン（０．２１８ｍｌ、１．５７ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（７６ｍｇ、０．７５５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。反応液を濃縮した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：４０ｇ、クロロホルム：メタノール＝７５：２５→クロロホルム：メタノール：水＝６：４：１）により精製し、化合物２（６１２ｍｇ、収率５１％）を無色粉末として得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：5.35 (br.s, 3H, H-4 of GalNAc), 5.19 (m, 3H, H-3 of GalNAc), 4.61 (d, J = 8.2 Hz, 3H, H-1 of GalNAc), 4.22-4.01 (m, 9H), 3.97-3.89 (m, 6H), 3.79-3.57 (m, 12H), 3.57-3.45 (m, 3H), 3.37-3.17 (m, 12H), 2.66-2.57 (m, 2H), 2.52-2.37 (m, 6H), 2.31-2.18 (m, 2H), 2.15 (s, 9H), 2.05 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.72-1.52 (18H, m).
３）化合物３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
　国際公開第２０１２／０３７２５４号の実施例２に記載の方法にて合成した。
４）化合物４の合成　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
工程１　化合物１０９の合成
　Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，１１，３８３―３８６（２００１）に記載の方法に従って、化合物１０８より２工程で合成した。

工程２　化合物１１０の合成
　化合物１０９（１１．８４ｇ、１９．２ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド溶液（５０ｍＬ）に室温でイミダゾール（１．５７ｇ、２３．１ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．）、第３ブチルジメチルシリルクロリド（１．５９ｇ、２１．２ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）を順次加え、室温で２時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去し、化合物１１０（１４．３５ｇ、粗製）を得た。
工程３　化合物１１１の合成
　化合物１１０（１４．３５ｇ、粗製）のＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド溶液（５０ｍＬ）にピペリジンを加え、室温で５．５時間撹拌した後、反応液を減圧下濃縮することにより、化合物１１１（１４．４６ｇ）の粗生成物を得た。

工程４　化合物１１２の合成
　１２－メトキシ－１２－オキソードデカン酸（１．８１ｇ、７．４０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド溶液（１０ｍｌ）に室温で、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（４．３１ｍｌ、２４．７ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３．２７ｇ、８．６３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間撹拌した後、化合物１１１（４．８３ｇ、６．１６ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド溶液（８ｍｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈した後、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：３２０ｇ、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝６０：４０：１→４０：６０：１）により精製し、化合物１１２（２．９４ｇ、化合物１０９からの収率６５％）を無色泡状物質として得た。
工程５　化合物１１３の合成
　化合物１１２（２．７０ｇ、３．６８ｍｍｏｌ）のメタノール（２０ｍｌ）－テトラヒドロフラン（８ｍｌ）に室温で２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液（３．６８ｍｌ、２ｅｑ．）を加え、室温で２時間撹拌した。－７８℃で反応液に２ｍｏｌ／Ｌの塩酸を加えることにより中和した後、酢酸エチルで希釈し、飽和食塩水にて順次洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去することにより、化合物１１３（２．２３ｇ、収率　８８％）を得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：7.39 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.28 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 7.25-7.21 (m, 2H), 7.18 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.79 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 5.66 (d, J = 8.2 Hz, 1H, -NH), 4.11 (m, 1H), 3.79 (dd, J = 9.7, 3.4 Hz, 1H), 3.75 (s, 6H), 3.66 (dd, J = 9.7, 6.0 Hz, 1H), 3.31 (dd, J = 8.7, 4.5 Hz, 1H), 3.04 (dd, J = 8.7, 6.1 Hz, 1H), 2.23 (br.s, 2H), 2.06 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.62-1.45 (m, 4H), 1.32-1.10 (m, 14H), 0.81 (s, 9H), -0.02 (s, 4H) 
工程６　化合物１１４の合成
　化合物１１３（６７１ｍｇ，１７．１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド溶液（５ｍＬ）に室温でＮ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（０．５４９ｍｌ、３．１４ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３５８ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間撹拌した後、化合物１０５（１．２０ｇ、０．６２９ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド溶液（５ｍＬ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（０．１３２ｍｌ、０．７５５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈した後、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：４０ｇ、クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝９５：５：１→９０：１０：１）により精製し、化合物１１４（６８５ｍｇ、収率４４％）を得た。
ESI-MS (m/z): 1271 (M/2 + Na). 
1H-NMR（CDCl3）δ：7.41 (d, J = 8.0Hz, 2H), 7.29 (d, J = 8.7 Hz, 4H), 7.29-7.16 (m, 8H), 7.07-6.96 (m, 8H), 6.82 (d, J = 8.7 Hz, 4H), 6.79-6.70 (m, 2H, -NH), 6.53 (m, 1H, -NH), 5.68 (d, J = 8.5 Hz, -NH), 5.35 (d, J = 3.0 Hz, 3H, H-4 of GalNAc), 5.24-5.16 (m, 3H, H-3 of GalNAc), 4.61 (d, J = 8.3 Hz, 3H, H-1 of GalNAc), 4.21-4.01 (m, 12H), 3.98-3.88 (m, 6H), 3.79 (s, 6H), 3.75-3.61 (m, 12H), 3.56-3.46 (m, 3H), 3.39-3.19 (m, 12H), 3.07 (m, 1H), 2.98 (m, 1H), 2.45-2.39 (m, 6H), 2.35-2.16 (m, 6H), 2.17-2.06 (m, 4H), 2.15 (s, 9H), 2.04 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.80-1.51 (22H, m), 1.30-1.21 (12H, m), 0.82 (s, 9H), 0.02 (s, 3H), 0.00 (s, 3H). 
工程７　化合物１１５の合成
　化合物１１４（５６３ｍｇ、０．２２６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（３ｍｌ）に室温で１ｍｏｌ／Ｌ　テトラブチルアンモニウムフロリドーテトラヒドロフラン溶液（０．５１０ｍｌ、２．２５ｅｑ．）を加え、室温で１２時間撹拌した後、反応液を減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：２４ｇ、クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝９５：５：１→９０：１０：１）により精製し、化合物１１５（４８５ｍｇ、収率９０％）を得た。
ESI-MS (m/z): 1214 (M/2 + Na).
工程８　化合物４の合成
　化合物１１５（４８５ｍｇ、０．２０４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３ｍｌ）に室温でジメチルアミノピリジン（５０ｍｇ、０．４０７ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ．）、無水コハク酸（３１ｍｇ、０．３０５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を加え、室温で２時間撹拌した後、反応液を減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：２４ｇ、クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝９５：５：１→８０：２０：１）により精製し、化合物４（４３５ｍｇ、収率８６％）を得た。
ESI-MS (m/z): 1263 (M/2 + Na). 
1H-NMR（CDCl3）δ：7.40 (d, J =7.7 Hz, 2H), 7.29 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 7.21 (m, 1H), 7.02-7.02 (m, 3H, -NH), 6.83 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 6.65 (m, 1H, -NH), 6.19 (d, J = 8.2 Hz, -NH), 5.35 (d, J = 3.0 Hz, 3H, H-4 of GalNAc), 5.19 (m, 3H, H-3 of GalNAc), 4.61 (d, J = 8.3 Hz, 3H, H-1 of GalNAc), 4.35 (m, 1H), 4.31-4.27 (m, 2H), 4.21-4.01 (m, 9H), 3.99-3.88 (m, 6H), 3.79 (s, 6H), 3.75-3.61 (m, 12H), 3.55-3.45 (m, 3H), 3.38-3.19 (m, 12H), 3.21-3.12 (m, 2H), 2.88-2.80 (m, 2H), 2.54 (br.s, 2H), 2.46-2.40 (m, 6H), 2.32-2.18 (m, 3H), 2.18-2.08 (m, 6H), 2.15 (s, 9H), 2.04 (s, 9H), 1.99 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.80-1.50 (22H, m), 1.32-1.21 (12H, m).
５）化合物５の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
工程１　化合物１１７の合成
　化合物１１６（１０．０ｇ、３０．９ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（４０ｍｌ）に室温で４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（１１．０ｇ、３２．５ｍｍｏｌ、１．０５ｅｑ．）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去し、化合物１１７（２２．９５ｇ、粗製）を得た。

工程２　化合物１１８の合成
　化合物１１７（２２．８５ｇ、粗製）のＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド溶液（７０ｍｌ）にピペリジン（３．６５ｍｌ、３６．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した後、反応液を減圧下濃縮することにより、化合物１１８（２２．７５ｇ）の粗生成物を得た。
工程３　化合物１１９の合成
　化合物４の工程４と同様な手法により、化合物１１９を無色泡状物質として得た（化合物１１７からの収率６９％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲでは６：４のロータマー混合物として観測された。
1H-NMR（CDCl3）δ：(Major) 7.79-7.74 (m, 2H), 7.65-7.55 (m, 2H), 7.44-7.34 (m, 5H), 7.39-7.26 (m, 7H), 7.21 (m, 1H), 6.85-6.76 (m, 4H), 5.64 (d, J = 8.7 Hz, 1H. -NH), 4.58 (m, 1H), 4.38 (m, 1H), 4.38-4.26  (m, 2H), 4.18 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.68-3.58 (m, 2H), 3.58-3.44 (m, 2H), 2.81 (m, 1H), 2.01-1.70 (m, 4H), 0.75 (s, 9H), -0.11 (s, 3H), -0.06 (s, 3H). (Minor) 7.79-7.74 (m, 2H), 7.65-7.55 (m, 2H), 7.44-7.34 (m, 5H), 7.39-7.26 (m, 7H), 7.10 (m, 1H), 6.85-6.76 (m, 4H), 5.58 (d, J = 7.9 Hz, 1H. -NH), 4.66 (m, 1H), 3.70 (s, 6H), 3.25-3.13 (m, 2H), 2.01-1.70 (m, 4H), 0.87 (s, 9H), 0.04 (s, 3H), 0.03 (s, 3H).
工程４　化合物１２０の合成
　工程２と同様の方法により、化合物１２０を粗生成物として得た。

工程５　化合物１２１の合成
　化合物４の工程４と同様の手法により、化合物１２１を無色泡状物質として得た（化合物１１９からの収率４６％）を得た。
ESI-MS (m/z): 854 (M +Na), 830 (M-H).
工程６　化合物１２２の合成
　化合物４の工程５と同様の手法により、化合物１２２を無色泡状物質として得た（収率９０％）を得た。
ESI-MS (m/z): 816 (M - H). 
1H-NMR（CDCl3）δ：7.42-7.35 (m, 2H), 7.32-7.24 (m, 6H), 7.19 (m, 1H), 6.82 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.81 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.94 (m, 1H, -NH), 4.35 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.75 (dd, J = 8.4, 4.8 Hz, 0.5H), 3.70-3.54 (m, 4H), 3.52 (dd, J = 8.4, 3.6 Hz, 0.5H), 3.25 (dd, J = 10.0, 5.6 Hz, 0.5H), 3.16 (dd, J = 10.0, 3.9 Hz, 0.5H), 2.81 (m, 1H), 2.40-2.30 (m, 2H), 2.19 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.03-1.80 (m, 4H), 1.70-1.47 (m, 4H), 1.42-1.20 (m, 14H), 0.84 (s, 3H), 0.72 (s, 6H), -0.09 (s, 2H), -0.16 (s, 2H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
工程７　化合物１２３の合成
　化合物４の工程６と同様の手法により、化合物１２３を無色泡状物質として得た（収率６１％）を得た。
ESI-MS (m/z): 1319 (M/2 + Na). 
1H-NMR（CDCl3）δ：7.43-7.35 (m, 2H), 7.32-7.24 (m, 9H), 7.24-7.14 (m, 3H), 7.03-6.92 (m, 3H), 6.85-6.72 (m, 4H), 6.67-6.77 (m, 2H), 5.35 (d, J = 2.8 Hz, 3H, H-4 of GalNAc), 5.22-5.15 (m, 3H, H-3 of GalNAc), 4.61 (d, J = 8.3 Hz, 3H, H-1 of GalNAc), 4.21-4.03 (m, 9H), 3.98-3.88 (m, 6H), 3.78 (s, 6H), 3.78-3.53 (m, 14H), 3.53-3.47 (m, 3H), 3.38-3.18 (m, 14H), 2.46-2.40 (m, 6H), 2.32-2.16 (m, 6H), 2.18-2.12 (m, 4H), 2.15 (s, 9H), 2.05 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.80-1.50 (20H, m), 1.33-1.21 (18H, m).

工程８　化合物１２４の合成
　化合物１２３（７８０ｍｇ、０．３０１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（５ｍｌ）に室温で１ｍｏｌ／Ｌテトラブチルアンモニウムフロリドーテトラヒドロフラン溶液（０．４５１ｍｌ、１．５５ｅｑ．）を加え、室温で１２時間撹拌した後、反応液を減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：２４ｇ、クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝９５：５：１→７５：２５１）により精製し、化合物１２４（６３５ｍｇ、収率８５％）を得た。
ESI-MS (m/z): 1262 (M/2 + Na).
工程９　化合物５の合成
　化合物１２４（５４５ｍｇ、０．２２０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４ｍｌ）に室温でトリエチルアミン（０．０６１ｍｌ、０．４４０ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ．）、無水コハク酸（３３ｍｇ、０．３３０ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）、ジメチルアミノピリジン（５ｍｇ）を加え、室温で２時間撹拌した後、反応液を減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：２４ｇ、クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝１００：０：１→７５：２５：１）にて精製し、化合物５（４７１ｍｇ、収率８３％）を無色粉末として得た。
ESI-MS (m/z): 1289 (M/2-H). 
1H-NMR（CDCl3）δ：7.40-7.33 (m, 2H), 7.33-7.19 (m, 6H), 7.20 (m, 1H), 711-7.00 (m, 3H, -NH), 6.82 (d, J = 7.7 Hz, 4H), 6.67 (d, J = 7.8 Hz, 1H, -NH), 6.64 (br.s, 1H, -NH), 5.35 (d, J = 2.9 Hz, 3H, H-4 of GalNAc), 5.22-5.15 (m, 3H, H-3 of GalNAc), 5.12-5.01 (m, 2H), 4.61 (d, J = 8.3 Hz, 3H, H-1 of GalNAc), 4.31 (m, 1H), 4.28-4.00 (m, 9H), 3.98-3.88 (m, 6H), 3.79 (s, 6H), 3.73-3.50 (m, 12H), 3.58-3.47 (m, 3H), 3.49-3.21(m, 12H), 3.28-3.11 (m, 2H), 2.93-2.82 (m, 3H), 2.57-2.43 (m, 3H), 2.47-2.40 (m, 6H), 2.34-2.08 (m, 11H), 2.17 (s, 9H), 2.04 (s, 9H), 1.99 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.80-1.50 (24H, m), 1.34-1.22 (14H, m).
６）化合物６の合成
　以下に示すように、化合物５と同様の工程にて合成する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
７）化合物７の合成　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
工程１　化合物１３３の合成
　化合物１１１（６２０ｍｇ、粗製）のジクロロメタン溶液（２．５ｍｌ）に室温でトリエチルアミン（０．１６９ｍｌ、１．２２ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（８９ｍｇ、０．８９３ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した後、反応液を減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：２４ｇ、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝５０：５０：１→クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝９５：５：１→７５：２５：１）にて精製し、化合物１３３（４５３ｍｇ、化合物１０９からの収率７９％）を無色泡状物質として得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：7.43 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 8.7 Hz, 4H), 7.27 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.20 (dd, J = 7.9, 7.1 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 8.7 Hz, 4H), 6.59 (m, 1H, -NH), 4.14 (m, 1H), 3.80 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.71 (m, 1H), 3.71 (dd, J = 9.5, 6.5 Hz, 1H), 3.71 (dd, J = 8.7, 4.5 Hz, 1H), 3.08 (dd, J = 8.7, 5.8 Hz, 1H), 2.54 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.46 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 0.82 (s, 9H), 0.01 (s, 4H)
工程２　化合物１３４の合成
　化合物４の工程６と同様な手法により、化合物１３４を無色泡状物質として得た（収率５７％）。
1H-NMR（CDCl3）δ：7.40 (d, , J = 7.7 Hz, 2H), 7.28 (d, , J = 8.7 Hz, 4H), 7.26-7.24 (m, 2H), 7.20 (dd, , J = 7.7, 7.7 Hz, 1H), 7.02-6.89 (m, 3H, -NH), 6.84-6.74 (m, 3H, -NH), 6.82 (d, J = 8.7 Hz, 4H), 6.72 (br.s, 1H, -NH), 6.16 (m, 1H, -NH), 5.35 (d, J = 2.9 Hz, 3H, H-4 of GalNAc), 5.22-5.14 (m, 3H, H-3 of GalNAc), 4.62 (d, J = 8.4 Hz, 3H, H-1 of GalNAc), 4.21-4.02 (m, 10H), 3.97-3.87 (m, 6H), 3.80 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.69 (m, 1H), 3.65-3.58 (m, 12H), 3.55-3.47 (m, 3H), 3.35-3.19 (m, 12H), 3.18 (t, , J = 7.3 Hz, 2H), 2.49-2.42 (m, 4H), 2.42-2.35 (m, 6H), 2.27-2.18 (m, 6H), 2.14 (s, 9H), 2.04 (s, 9H), 1.99 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.79-1.52 (12H, m), 0.82 (s, 9H), 0.01 (s, 2H), -0.01 (s, 2H).

工程３　化合物１３５の合成
　化合物４の工程７と同様の工程により、化合物１３５を無色粉末として得た（収率６０％）。
ESI-MS (m/z): 1157 (M+Na).

工程４　化合物７の合成
　化合物４の工程８と同様の手法により、化合物７を得る。
８）化合物８の合成　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
工程１　化合物１３６の合成
　化合物７の工程１と同様な手法により、化合物１３６を無色泡状物質として得た（収率８５％）。１Ｈ－ＮＭＲでは６３：３７のロータマー混合物として観測された。
ESI-MS (m/z): 703 (M-H). 
1H-NMR（CDCl3）δ：(Major) 7.44-7.35 (m, 2H), 7.32-7.24 (m, 6H), 7.19 (dd, J=7.0, 7.0Hz, 1H), 7.13 (dd, J=8.0 Hz, 1H, -NH), 6.86-6.76 (m, 4H), 4.83 (m, 1H), 4.36 (m, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.72-3.41 (m, 6H), 2.63-2.57 (m, 2H), 2.55-2.48 (m, 2H), 2.04-1.68 (m, 4H), 0.72 (s, 9H), -0.08 (s, 3H), -0.15 (s, 3H). (Minor) 7.44-7.35 (m, 2H), 7.32-7.24 (m, 6H), 7.19 (dd, J=7.0, 7.0Hz, 1H), 6.96 (dd, J=7.5 Hz, 1H, -NH), 6.86-6.76 (m, 4H), 4.89 (m, 1H), 4.36 (m, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.72-3.41 (m, 6H), 2.63-2.57 (m, 2H), 2.55-2.48 (m, 2H), 2.04-1.68 (m, 4H), 0.85 (s, 9H), 0.03 (s, 3H), 0.01 (s, 3H).

工程２　化合物１３７の合成
　化合物４の工程６と同様の手法により、化合物１３７を無色泡状物質として得た（収率５０％）。１Ｈ－ＮＭＲでは７０：３０のロータマー混合物として観測された。
ESI-MS (m/z): 1263 (M/2+Na). 
1H-NMR（CDCl3）δ：(Major) 7.38 (dd, J=7.8, 7.8Hz, 2H), 7.35-7.23 (m, 9H), 7.19 (dd, J=7.0, 7.0Hz, 1H), 7.12-6.86 (m, 4H), 6.85-6.77 (m, 6H), 6.68 (s, 1H), 5.35 (d, J = 2.8 Hz, 3H, H-4 of GalNAc), 5.25-5.17 (m, 3H, H-3 of GalNAc), 4.74 (m, 1H), 4.66-4.59 (m, 3H, H-1 of GalNAc), 4.22-3.98 (m, 9H), 3.97-3.86 (m, 6H), 3.79 (s, 6H), 3.75-3.57 (m, 16H), 3.57-3.39 (m, 5H), 3.36-3.11 (m, 13H), 2.51-2.45 (m, 4H), 2.44-2.36 (m, 8H), 2.30-2.13 (m, 8H), 2.15 (s, 9H), 2.04 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.78-1.52 (18H, m), 0.74 (s, 9H), -0.07 (s, 3H), -0.13 (s, 3H). (Minor) 7.38 (dd, J=7.8, 7.8Hz, 2H), 7.35-7.23 (m, 9H), 7.19 (dd, J=7.0, 7.0Hz, 1H), 7.12-6.86 (m, 4H), 6.85-6.77 (m, 6H), 6.64 (s, 1H), 5.35 (d, J = 2.8 Hz, 3H, H-4 of GalNAc), 5.25-5.17 (m, 3H, H-3 of GalNAc), 4.74 (m, 1H), 4.66-4.59 (m, 3H, H-1 of GalNAc), 4.22-3.98 (m, 9H), 3.97-3.86 (m, 6H), 3.79 (s, 6H), 3.75-3.57 (m, 16H), 3.57-3.39 (m, 5H), 3.36-3.11 (m, 13H), 2.51-2.45 (m, 4H), 2.44-2.36 (m, 8H), 2.30-2.13 (m, 8H), 2.15 (s, 9H), 2.04 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.78-1.52 (18H, m), 0.85 (s, 9H), 0.03 (s, 3H), 0.01 (s, 3H).
工程３　化合物１３８の合成
　化合物５の工程８と同様の手法により、化合物１３８を無色泡状物質として得た（収率８０％）。

工程４　化合物８の合成
　化合物５の工程９と同様の手法により、化合物８を無色泡状物質として得た（収率８２％）。
ESI-MS (m/z): 1255 (M/2+Na). 
1H-NMR（CDCl3）δ：7.40-7.30 (m, 5H), 7.30-7.22 (m, 6H), 7.20 (m, 1H), 7.11-6.96 (m, 4H), 6.94-6.79 (m, 4H), 6.81 (d, J=8.1 Hz, 4H), 5.35 (d, J = 2.8 Hz, 3H, H-4 of GalNAc), 5.25-5.16 (m, 3H, H-3 of GalNAc), 4.62 (d, J = 8.3 Hz, 3H, H-1 of GalNAc), 4.35 (dd, J=11.4, 4.3Hz, 1H), 4.29 (m, 1H), 4.22-4.02 (m, 10H), 3.98-3.85 (m, 6H), 3.79 (s, 6H), 3.74-3.58 (m, 14H), 3.56-3.45 (m, 4H), 3.38-3.19 (m, 12H), 3.21-3.11 (m, 2H), 2.62-2.43 (m, 8H), 2.45-2.38 (m, 6H), 2.32-2.14 (m, 8H), 2.15 (s, 9H), 2.04 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.80-1.50 (18H, m).
９）化合物９の合成　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
工程１　化合物１４０の合成
　化合物７の工程１と同様な手法により、化合物１４０を無色泡状物質として得た（収率５７％）。
ESI-MS (m/z): 663 (M-H). 
1H-NMR（CDCl3）δ：7.39 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.32-7.24 (m, 6H), 7.20 (dd, J = 7.3, 7.3 Hz, 1H), 7.02 (t, J = 5.5 Hz, NH), 6.84 (d, J = 10.6 Hz, NH), 6.82 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 4.41 (ddd, J = 10.6, 6.8, 3.8 Hz), 4.05 (dd, J = 9.6, 3.8 Hz, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.61 (dd, J = 9.6, 6.8 Hz, 1H), 3.49 (m, 1H), 3.41 (m, 1H), 3.22 (dt, J = 9.1, 6.0 Hz, 1H), 3.14 (dt, J = 9.1, 6.0 Hz, 1H), 2.66 (dt, J = 16.4, 6.3 Hz, 1H), 2.58 (dt, J = 16.4, 6.3 Hz, 1H), 2.48 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 0.85 (s, 9H), 0.04 (s, 6H).

工程２　化合物１４１の合成
　化合物４の工程６と同様の手法により、化合物１４１を無色泡状物質として得た（収率５７％）。
ESI-MS (m/z): 1355 (M/2 + Na). 
1H-NMR（CDCl3）δ：7.40 (d, J=7.8 Hz, 2H), 7.33-7.16 (m,12H), 7.08-6.86 (m, 3H), 6.85-6.71 (m, 4H), 6.81 (d, J=8.6 Hz, 2H), 5.39-5.31 (m, 3H, H-4 of GalNAc), 5.25-5.15 (m, 3H, H-3 of GalNAc), 4.62 (d, J=8.1 Hz, 3H, H-1 of GalNAc),4.38 (m, 1H), 4.22-3.97 (m, 10H), 3.97-3.86 (m, 6H), 3.79 (s, 6H), 3.71-3.56 (m, 14H), 3.55-3.45 (m, 3H), 3.40-3.06 (m, 15H), 2.63-2.44 (m, 4H), 2.43-2.34 (m, 6H), 2.32-2.16 (m, 4H), 2.15 (s, 9H), 2.04 (s, 9H), 1.99 (s, 9H), 1.94 (s, 9H), 1.79-1.52 (18H, m), 0.84 (s, 9H), 0.02 (s, 3H), 0.01 (s, 3H).
工程３　化合物１４２の合成
　化合物５の工程８と同様の手法により、化合物１４２を無色泡状物質として得た（収率６８％）。
ESI-MS (m/z): 1186 (M/2 + Na).

工程４　化合物９の合成
　化合物５の工程９と同様の手法により、化合物９を無色泡状物質として得た（収率８３％）。
ESI-MS (m/z): 1235 (M/2 + Na). 
1H-NMR（CDCl3）δ：7.46 (m, 1H), 7.41 (d, J=7.6 Hz, 2H), 7.36-7.22 (m,11H), 7.19 (dd, J=7.0, 7.0Hz, 1H), 7.05 (m, 1H), 7.02-6.95 (m, 2H), 7.00 (br s, 1H), 6.86-6.77 (m, 2H), 6.81 (d, J=8.6 Hz, 4H), 5.39-5.32 (m, 3H, H-4 of GalNAc), 5.25-5.14 (m, 3H, H-3 of GalNAc), 4.62 (d, J=8.3Hz, H-1 of GalNAc), 4.56-4.39 (m, 2H), 4.22-4.03 (m, 9H), 3.98-3.91 (m, 6H), 3.79 (s, 6H), 3.70-3.55 (m, 13H), 3.55-3.46 (m, 4H), 3.35-3.14 (m, 15H), 2.63-2.47 (m, 5H), 2.47-2.34 (m, 9H), 2.29-2.16 (m, 6H), 2.14 (s, 9H), 2.04 (s, 9H), 1.99 (s, 9H), 1.94 (s, 9H), 1.79-1.52 (18H, m).
１０）化合物１４の合成　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
 　
工程１　化合物１４４の合成
　化合物１４３（１０．０ｇ，３７．７ｍｍｏｌ）の１，２－ジメトキシエタン溶液（１００ｍＬ）に室温で（４－第三ブトキシカルボニル）フェニル）ボロン酸（９．２１ｇ、４１．５ｍｍｏｌ）、２ｍｏｌ／Ｌ 炭酸カリウム水溶液（５６．６ｍｌ、１１３ｍｍｏｌ）、ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）（３．０７ｇ、３．７７ｍｍｏｌ）を加えた後、８０℃で１時間撹拌した。冷却後、反応液を酢酸エチルで希釈した後、飽和食塩水にて洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣にｎ－ヘキサンを加えて、粉末化した後、酢酸エチルおよびｎ－ヘキサンにて洗浄、７０℃で減圧乾燥することにより、化合物１４４（１３．５ｇ、収率９９％）を黒色粉末として得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：8.64 (s, 1H), 8.11 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.11 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.10 (s, 1H), 8.05 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.00 (s, 3H), 1.63 (s, 9H).

工程２　化合物１４５の合成
　化合物１４４（３．０ｇ，８．２８ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸（６０ｍｌ）―ジクロロメタン（１０ｍｌ）の懸濁し、２５℃で１時間撹拌した。反応液より不溶物をろ取し、ｎ－ヘキサンにて洗浄、７０℃で減圧乾燥することにより、化合物１４５（１３．５ｇ、収率９９％）を無色固体として得た。
1H-NMR（d6-DMSO）δ：8.71 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.29 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.17 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.12 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 8.06 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H).
工程３　化合物１４６の合成
　化合物４の工程４と同様の手法により、化合物１４６を無色固体として得た（収率７４％）。　
ESI-MS (m/z): 892 (M-H). 

工程４　化合物１４７の合成
　化合物４の工程５と同様に処理した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝９７．５：２．５：１→９０：１０：１）にて精製することにより、化合物１４７を無色固体として得た（収率４７％）。１Ｈ－ＮＭＲでは６０：４０のロータマー混合物として観測された。
ESI-MS (m/z): 878 (M+). 
1H-NMR（CDCl3）δ：(Major) 8.56 (s, 1H), 8.11 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.91-7.84 (m, 3H), 7.67 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.66 (m, 1H), 7.43 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.36-7.18 (m, 7H), 6.85-6.74 (m, 4H), 5.06 (m, 1H), 4.43 (m, 1H), 3.93 (dd, 1H, J = 9.5, 5.5 Hz), 3.85-3.60 (m, 4H), 3.78 (s, 6H), 3.56 (dd, 1H, J = 9.0, 3.8 Hz), 3.28 (m, 1H), 2.07-1.78 (m, 4H), 0.77 (s, 9H), -0.02 (s, 3H), -0.08 (s, 3). (Minor) 8.61 (s, 1H), 8.16 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.99 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.91-7.84 (m, 3H), 7.73 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.72 (m, 1H), 7.39 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.36-7.18 (m, 7H), 6.85-6.74 (m, 4H), 5.15 (m, 1H), 4.52 (m, 1H), 4.00 (dd, 1H, J = 9.5, 4.7 Hz), 3.85-3.60 (m, 4H), 3.67 (s, 3H), 3.64 (s, 3H), 3.56 (dd, 1H, J = 9.0, 3.8 Hz), 3.23 (m, 1H), 2.07-1.78 (m, 4H), 0.89 (s, 9H), 0.07 (s, 3H), 0.06 (s, 3).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
工程５　化合物１４８の合成
　化合物４の工程６と同様の手法により、化合物１４８を無色泡状物質として得た（収率５２％）。１Ｈ－ＮＭＲでは５９：４１のロータマー混合物として観測された。
ESI-MS (m/z): 1350 (M/2+H). 
1H-NMR（CDCl3）δ: (Major) 8.40 (br.s, 1H), 8.11 (br.s, 1H), 8.08 (dd, J=8.5, 2.0Hz, 1H), 7.99-7.88 (m, 4H), 7.83 (m, 1H), 7.80 (d, J=8.3Hz, 2H), 7.45-7.41 (m, 2H), 7.36-7.08 (m, 12H), 6.93-6.86 (m, 3H), 6.85-6.81 (m, 4H), 6.77 (t, J=9.0Hz, 3H, -NH), 5.34 (d, J=3.0Hz, 3H, H-4 of GalNAc), 5.18 (dd, J=11.0, 3.0Hz, 3H, H-3 of GalNAc), 5.05 (m, 1H), 4.60 (d, J=8.0Hz, 3H, H-1 of GalNAc), 4.42 (m, 1H), 4.20-4.04 (m, 10H), 3.94-3.84 (m, 13H), 3.82-3.73 (m, 6H), 3.79 (s, 6H), 3.57-3.45 (m, 5H), 3.31-3.15 (m, 12H), 2.49 (t, J=5.5Hz, 6H), 2.26-2.11 (m, 8H), 2.14 (s, 9H), 2.04 (s, 9H), 1.99 (s, 9H), 1.92 (s, 9H), 1.81-1.49 (20H, m), 0.76 (s, 9H), -0.04 (s, 3H), -0.10 (s, 3H). (Minor) 8.40 (br.s, 1H), 8.11 (br.s, 1H), 8.08 (dd, J=8.5, 2.0Hz, 1H), 7.99-7.88 (m, 4H), 7.83 (m, 1H), 7.80 (d, J=8.3Hz, 2H), 7.40-7.36 (m, 2H), 7.36-7.08 (m, 12H), 6.93-6.86 (m, 3H), 6.85-6.81 (m, 4H), 6.77 (t, J=9.0Hz, 3H, -NH), 5.34 (d, J=3.0Hz, 3H, H-4 of GalNAc), 5.18 (dd, J=11.0, 3.0Hz, 3H, H-3 of GalNAc), 5.05 (m, 1H), 4.60 (d, J=8.0Hz, 3H, H-1 of GalNAc), 4.51 (m, 1H), 4.20-4.04 (m, 10H), 3.94-3.84 (m, 13H), 3.82-3.73 (m, 6H), 3.79 (s, 6H), 3.57-3.45 (m, 5H), 3.31-3.15 (m, 12H), 2.49 (t, J=5.5Hz, 6H), 2.26-2.11 (m, 8H), 2.14 (s, 9H), 2.04 (s, 9H), 1.99 (s, 9H), 1.92 (s, 9H), 1.81-1.49 (20H, m), 0.89 (s, 9H), -0.07 (s, 3H), -0.05 (s, 3H).

工程６　化合物１４９の合成
　化合物５の工程８と同様の手法により、化合物１４９を無色泡状物質として得た（収率％）。

工程７　化合物１４の合成
　化合物５の工程９と同様の手法により、化合物１４を無色泡状物質として得た（収率８２％）。
ESI-MS (m/z): 1343 (M/2+H). 
1H-NMR（CDCl3）δ: 7.99-7.87 (m, 4H), 7.84-7.75 (m, 3H), 7.47-7.35 (m, 2H), 7.34-7.25 (m, 7H), 7.25-7.06 (m, 6H), 6.94-6.73 (m, 5H), 6.83 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 5.35 (d, J=3.0Hz, 3H, H-4 of GalNAc), 5.21-5.13 (m, 3H, H-3 of GalNAc), 4.59-4.53 (m, 3H, H-1 of GalNAc), 4.41-4.25 (m, 2H), 4.20-4.05 (m, 9H), 3.95-3.84 (m, 12H), 3.81-3.73 (m, 6H), 3.79 (s, 6H), 3.50-3.40 (m, 4H), 3.29-3.21 (m, 2H), 3.21-3.06 (m, 12H), 2.53-2.42 (m, 10H), 2.25-2.08 (m, 10H), 2.13 (s, 9H), 2.03 (s, 9H), 2.01 (s, 9H), 1.98 (s, 9H), 1.75-1.43 (18H, m).
１１）化合物１８の合成　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
工程１　化合物１５１の合成
　化合物１５０（１８．１ｇ，７６．０ｍｍｏｌ）とアクリル酸メチル（５．０ｇ，５．２３ｍｍｏｌ）が溶解したテトラヒドロフラン溶液（１００ｍＬ）に、０℃で水素化ナトリウム（１１６ｍｇ、２．９０ｍｍｏｌ）を加えた後、同温度で２時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈した後、飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和食塩水にて洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：３２０ｇ、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝６０：４０→４０：６０）にて精製し、化合物１５１（１１．８ｇ、収率６２％）を無色油状物として得た。
ESI-MS (m/z): 327 (M+H). 
1H-NMR（CDCl3）δ：7.38-7.31 (m, 4H), 7.29 (m, 1H), 4.57 (s, 2H), 3.75 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.71-3.60 (m,15H), 2.60 (t, J = 6.5 Hz, 2H).

工程２　化合物１５２の合成
　化合物１５１（１．０２ｇ，３．１３ｍｍｏｌ）が溶解したメタノール（１０ｍＬ）溶液に１０％パラジウム炭素（２００ｍｇ）を加え、常圧水素気流下、室温で１２時間撹拌した後、反応液より触媒を濾別し、濾液を濃縮した。
　得られた残渣をアセトニトリル（５ｍｌ）－水（５ｍｌ）の混合溶液に溶解した後、室温で２，２，６，６-テトラメチルピペリジン １-オキシル（９８ｍｇ，０．６２５ｍｍｏｌ）、ヨードベンゼンジアセタート（２．２２ｇ，６．８８ｍｍｏｌ）を加え、同温度で１時間撹拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液に空けた後、水層を酢酸エチルで洗浄した。得られた水層に２ｍｏｌ／Ｌ　塩酸を加えて、酸性にした後、クロロホルムにて抽出し、硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：３０ｇ、クロロホルム：メタノール＝９７．５：２．５→７５：２５→クロロホルム：メタノール：水＝６：４：１）にて精製し、化合物１５２（４８３ｍｇ、収率６２％）を無色油状物として得た。
ESI-MS (m/z): 251 (M+H). 
1H-NMR（CDCl3）δ：4.09 (s, 2H), 3.76 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.74-3.60 (m,8H), 3.69 (s, 3H), 2.61 (t, J = 6.6 Hz, 2H).
工程３　化合物１５３の合成
　化合物４の工程４と同様な手法により、化合物１５３を無色油状物として得た（収率７０％）。１Ｈ－ＮＭＲでは６０：４０のロータマー混合物として観測された。
ESI-MS (m/z): 859 (M+Na). 
1H-NMR（CDCl3）δ：(Major) 7.40 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.32-7.22 (m, 7H), 7.19 (m,1H), 6.84-6.78 (m, 4H), 4.87 (m, 1H), 4.38 (m, 1H), 4.02 (d, 1H, J = 14.3 Hz), 3.96 (d, 1H, J = 14.3 Hz), 3.86-3.53 (m, 18H), 3.76 (s, 6H), 3.49 (dd, 1H, J = 8.7, 3.4 Hz), 2.60 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 2.03-1.71 (m, 4H), 0.74 (s, 9H), -0.07 (s, 3H), -0.13 (s, 3). (Minor) 7.37 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.32-7.22 (m, 7H), 7.19 (m,1H), 6.84-6.78 (m, 4H), 4.94 (m, 1H), 4.38 (m, 1H), 3.86-3.53 (m, 18H), 3.76 (s, 6H), 3.49 (dd, 1H, J = 8.7, 3.4 Hz), 3.17 (m, 1H), 3.13 (m, 1H), 2.03-1.71 (m, 4H), 0.86 (s, 9H), 0.03 (s, 3H), 0.02 (s, 3).

工程４　化合物１５４の合成
　化合物４の工程５と同様に処理した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝９７．５：２．５：１→８５：１５：１）にて精製することにより、化合物１５４を無色泡状物質として得た（収率７４％）。１Ｈ－ＮＭＲでは６５：３５のロータマー混合物として観測された。
1H-NMR（CDCl3）δ：(Major) 8.56 (s, 1H), 8.11 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.91-7.84 (m, 3H), 7.67 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.66 (m, 1H), 7.43 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.36-7.18 (m, 7H), 6.85-6.74 (m, 4H), 5.06 (m, 1H), 4.43 (m, 1H), 3.93 (dd, 1H, J = 9.5, 5.5 Hz), 3.85-3.60 (m, 4H), 3.78 (s, 6H), 3.56 (dd, 1H, J = 9.0, 3.8 Hz), 3.28 (m, 1H), 2.07-1.78 (m, 4H), 0.77 (s, 9H), -0.02 (s, 3H), -0.08 (s, 3). (Minor) 8.61 (s, 1H), 8.16 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.99 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.91-7.84 (m, 3H), 7.73 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.72 (m, 1H), 7.39 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.36-7.18 (m, 7H), 6.85-6.74 (m, 4H), 5.15 (m, 1H), 4.52 (m, 1H), 4.00 (dd, 1H, J = 9.5, 4.7 Hz), 3.85-3.60 (m, 4H), 3.67 (s, 3H), 3.64 (s, 3H), 3.56 (dd, 1H, J = 9.0, 3.8 Hz), 3.23 (m, 1H), 2.07-1.78 (m, 4H), 0.89 (s, 9H), 0.07 (s, 3H), 0.06 (s, 3).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
工程５　化合物１５５の合成
　化合物４の工程６と同様の手法により、化合物１５５を無色泡状物質として得た（収率４６％）。１Ｈ－ＮＭＲでは６０：４０のロータマー混合物として観測された。
1H-NMR（CDCl3）δ：(Major) 7.42-7.35 (m, 2H), 7.33-7.15 (m, 11H), 7.04-6.92 (m, 3H), 6.85-6.76 (m, 6H), 6.75-6.68 (m, 2H), 5.35 (d, J=3.0Hz, 3H, H-4 of GalNAc), 5.25-5.20 (m, 3H, H-3 of GalNAc), 4.84 (m, 1H), 4.66-4.59 (m, 3H, H-1 of GalNAc), 4.35 (m, 1H), 4.22-3.98 (m, 11H), 3.98-3.88 (m, 6H), 3.79 (s, 6H), 3.75-3.57 (m, 27H), 3.55-3.41 (m, 4H), 3.37-3.12 (m, 12H), 2.47-2.19 (m, 8H), 2.32-2.17 (m, 8H), 2.15 (s, 9H), 2.05 (s, 9H), 1.99 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.99-1.52 (m, 20H), 0.75 (s, 9H), -0.06 (s, 3H), -0.11 (s, 3H) (Minor) 7.42-7.35 (m, 2H), 7.33-7.15 (m, 11H), 7.04-6.92 (m, 3H), 6.85-6.76 (m, 6H), 6.75-6.68 (m, 2H), 5.35 (d, J=3.0Hz, 3H, H-4 of GalNAc), 5.25-5.20 (m, 3H, H-3 of GalNAc), 4.92 (m, 1H), 4.66-4.59 (m, 3H, H-1 of GalNAc), 4.40 (m, 1H), 4.22-3.98 (m, 11H), 3.98-3.88 (m, 6H), 3.79 (s, 6H), 3.75-3.57 (m, 27H), 3.55-3.41 (m, 4H), 3.37-3.12 (m, 12H), 2.47-2.19 (m, 8H), 2.32-2.17 (m, 8H), 2.15 (s, 9H), 2.05 (s, 9H), 1.99 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.99-1.52 (m, 20H), 0.86 (s, 9H), 0.03 (s, 3H), 0.02 (s, 3H).

工程６　化合物１５６の合成
　化合物５の工程８と同様の手法により、化合物１５６を無色泡状物質として得た（収率６６％）。　
ESI-MS (m/z): 1242 (M/2+H).

工程７　化合物１８の合成
　化合物５の工程９と同様の手法により、化合物１８を無色泡状物質として得た（収率７５％）。
ESI-MS (m/z): 1315 (M/2 + Na). 
1H-NMR（CDCl3）δ：7.60 (m, 1H), 7.37 (dd, J=7.5, 7.5Hz, 2H), 7.38-7.30 (m, 9H), 7.20 (m, 1H), 7.13-6.98 (m, 3H), 6.94-6.76 (m, 4H), 6.82 (d, J=8.6 Hz, 4H), 5.35 (d, J=3.1Hz, 3H, H-4 of GalNAc), 5.20 (dd, J=11.0, 3.1Hz, 3H, H-3 of GalNAc), 5.07 (m, 1H), 4.62 (d, J=8.4Hz, 3H, H-1 of GalNAc), 4.26-3.98 (m, 12H), 3.97-3.88 (m, 6H), 3.79 (s, 6H), 3.75-3.58 (m, 24H), 3.55-3.46 (m, 4H), 3.40-3.21 (m, 12H), 3.22-3.14 (m, 2H), 2.87-2.77 (m, 2H), 2.56 (br s, 2H), 2.54-2.46 (m, 2H), 2.46-2.38 (m, 8H), 2.32-2.18 (m, 8H), 2.15 (s, 9H), 2.04 (s, 9H), 1.99 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.80-1.52 (18H, m).
１２）化合物１９の合成　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
工程１　化合物１５７の合成
　国際公開第２０１１／１４８９２２号に記載の方法に従って合成した。

工程２　化合物１５８の合成
　Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，１１，３８３―３８６（２００１）に記載の方法と同様な手法にて、化合物１５７より化合物１５８を２工程で合成した。

工程３　化合物１５９の合成
　化合物４の工程２および工程３と同様の手法にて反応し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：３２０ｇ、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝２００：１００：３）により精製することにより、化合物１５９を無色泡状物質として得た（収率９１％）。
1H-NMR（CDCl3）δ：7.44-7.41 (m, 2H), 7.34-7.28 (m, 4H), 7.27-7.25 (m, 2H), 7.19(m, 1H), 6.84-6.79 (m, 4H), 3.78 (s, 6H), 3.68 (dd, J=10.0, 5.9 Hz, 1H), 3.63 (dd, J=10.0, 5.6 Hz, 1H), 3H), 3.15 (dd, J=9.2, 5.3 Hz, 1H), 3.63 (dd, J=9.2, 5.9 Hz, 1H), 2.68 (m, 1H), 2.35 (s, 3H), 0.85 (s, 9H), 0.02 (s, 6H). 
工程４　化合物１６０の合成
　化合物４の工程４と同様の手法により、化合物１６０を無色泡状物質として得た（収率５２％）。１Ｈ－ＮＭＲでは５７：４３のロータマー混合物として観測された。
1H-NMR（CDCl3）δ：(Major) 7.42 (m, 2H), 7.32-7.23 (m, 6H), 7.21 (dd, J=7.3, 7.3 Hz, 1H), 6.84-6.76 (m, 4H), 4.15 (m, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.71 (m, 1H), 3.66 (s, 3H), 3.59-3.51 (m, 1H), 3.17-3.12 (m, 2H), 2.67 (s, 3H), 2.48 (m, 1H), 2.34-2.25 (m, 3H), 1.73-1.54 (m, 4H), 1.40-1.25 (m, 12H), 0.81 (s, 9H), -0.02 (s, 3H), -0.03 (s, 3H) . (Minor) 7.42 (m, 2H), 7.32-7.23 (m, 6H), 7.21 (dd, J=7.3, 7.3 Hz, 1H), 6.84-6.76 (m, 4H), 4.79 (m, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.71 (m, 1H), 3.66 (s, 3H), 3.59-3.51 (m, 1H), 3.28 (dd, J=9.5, 5.0 Hz, 1H), 3.18 (dd, J=9.5, 8.0 Hz, 1H), 2.89 (s, 3H), 2.48 (m, 1H), 2.34-2.25 (m, 3H), 1.73-1.54 (m, 4H), 1.40-1.25 (m, 12H), 0.78 (s, 9H), -0.04 (s, 6H) 

工程５　化合物１６１の合成
　化合物４の工程５と同様の手法により、化合物１６１を無色泡状物質として得た（収率９０％）。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
工程６　化合物１６２の合成
　化合物４の工程６と同様の手法により、化合物１６２を無色泡状物質として得た（収率５１％）。１Ｈ－ＮＭＲでは５８：４２のロータマー混合物として観測された。
1H-NMR（CDCl3）δ：(Major) 7.39 (dd, J=9.3, 9.3 Hz, 2H), 7.33-7.23 (m, 9H), 7.21 (dd, J=7.5, 7.5Hz, 1H), 7.14-7.00 (m, 3H, -NH), 6.98-6.86 (m, 3H), 6.84-6.81 (m, 4H), 6.62 (m, 1H, -NH), 5.39-5.33 (m, 3H, H-4 of GalNAc), 5.23-5.16 (m, 3H, H-3 of GalNAc), 4.65-4.59 (m, 3H, H-1 of GalNAc), 4.21-4.04 (m, 10H), 3.98-3.83 (m, 6H), 3.791 (s, 6H), 3.73-3.63 (m, 13H), 3.59-3.55 (m, 2H), 3.55-3.46 (m, 3H), 3.37-3.20 (m, 12H), 3.19-3.13 (m, 2H), 2.69-2.65 (m, 3H), 2.47-2.39 (m, 6H), 2.37-2.13 (m, 10H), 2.15 (s, 9H), 2.04 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.80-1.51 (18H, m), 1.40-1.24 (12H, m), 0.81 (s, 9H), -0.018 (s, 3H), -0.04 (s, 3H). (Minor) 7.39 (dd, J=9.3, 9.3 Hz, 2H), 7.33-7.23 (m, 9H), 7.21 (dd, J=7.5, 7.5Hz, 1H), 7.14-7.00 (m, 3H, -NH), 6.98-6.86 (m, 3H), 6.84-6.81 (m, 4H), 6.62 (m, 1H, -NH), 5.39-5.33 (m, 3H, H-4 of GalNAc), 5.23-5.16 (m, 3H, H-3 of GalNAc), 4.65-4.59 (m, 3H, H-1 of GalNAc), 4.21-4.04 (m, 10H), 3.98-3.83 (m, 6H), 3.785 (s, 6H), 3.73-3.63 (m, 13H), 3.59-3.55 (m, 2H), 3.55-3.46 (m, 3H), 3.37-3.20 (m, 12H), 3.19-3.13 (m, 2H), 2.85-2.80 (m, 3H), 2.47-2.39 (m, 6H), 2.37-2.13 (m, 10H), 2.15 (s, 9H), 2.04 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.80-1.51 (18H, m), 1.40-1.24 (12H, m), 0.78 (s, 9H), -0.026 (s, 3H), -0.024 (s, 3H).

工程７　化合物１６３の合成
　化合物４の工程７と同様の手法により、化合物１６３を無色泡状物質として得た（収率８３％）。
ESI-MS (m/z): 1220 (M/2 + Na).

工程８　化合物１９の合成
　化合物４の工程８と同様の手法により、化合物１９を無色泡状物質として得た（収率７１％）。
ESI-MS (m/z): 1248 (M/2+H), 1247 (M/2). 
1H-NMR（CDCl3）δ：7.40-7.34 (m, 2H), 7.34-7.18 (m, 11H), 7.14-7.03 (m, 3H, -NH), 6.94-6.80 (m, 2H), 6.85-6.81 (m, 4H), 6.68 (m, 1H, -NH), 5.35 (d, J = 3.0 Hz, 3H, H-4 of GalNAc), 5.24-5.16 (m, 3H, H-3 of GalNAc), 4.61 (d, J = 8.0 Hz, 3H, H-1 of GalNAc), 4.32 (m, 1H), 4.22-4.04 (m, 11H), 3.98-3.86 (m, 5H), 3.79 (s, 6H), 3.75-3.60 (m, 13H), 3.55-3.45 (m, 3H), 3.36-3.14 (m, 15H), 2.95-2.84 (s, 3H), 2.61-2.54 (m, 4H), 2.49-2.40 (m, 8H), 2.35-2.18 (m, 6H), 2.15 (s, 9H), 2.03 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.80-1.51 (18H, m), 1.39-1.18 (16H, m).
１３）化合物２０の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
工程１　化合物１６５の合成
　化合物１６４（米国特許出願公開第２０１２／０１５７５０９号明細書）（９０ｍｇ，０．４８９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３．６ｍＬ）に塩化オキサリル（１７１μＬ，１．９５ｍｍｏｌ）を加え、室温で ２１時間撹拌し後、溶媒を留去した。得られた残渣をジクロロメタン（１．８ｍＬ）に溶解させ、氷冷下、化合物１０５（８７７ｍｇ，０．４８９ｍｍｏｌ）とピリジン（１５８μＬ，１．９６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５．４ｍＬ）を加え、７時間撹拌した。反応液へ１０％クエン酸水溶液を加えてクロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒を留去して化合物１６５（３６５ｍｇ，収率３８％）を淡黄色固体物質として得た。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）＝１９５９．８．（Ｍ＋Ｈ）
ＨＰＬＣ　Ｐｅａｋ　ＲＴ　＝　１．４２　ｍｉｎｕｔｅｓ

工程２　化合物２０の合成
　化合物１６５（１５０ｍｇ，０．０７７ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（３．５ｍＬ）に、室温下、水（３．０ｍＬ）とトリエチルアミン（２．０ｍＬ）を加えて１９時間撹拌した。メタノールとトリエチルアミンを減圧留去した後、残渣へＤｏｗｅｘ（登録商標）－５０Ｗ×８－２００（シグマアルドリッチ社から購入）（６００ｍｇ）を加え、室温下、４５分間緩やかに撹拌した後、ろ過した。溶媒を留去して化合物２０（１１３ｍｇ，９３％）を淡黄色固体物質として得た。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）＝１９８１．８．（Ｍ＋Ｈ）
ＨＰＬＣ　Ｐｅａｋ　ＲＴ　＝　０．７１　ｍｉｎｕｔｅｓ
１４）化合物２１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
工程１　化合物１６７の合成
　欧州特許出願公開第６２４３７７号明細書に記載の方法に従って調製した化合物１６６（１６１ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（１ｍＬ）にジエチルアミン（８４ｕＬ，０．８０ｍｍｏｌ）を加えて、室温下３時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮することでジエチルアミンならびにＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを留去し、反応液重量を１ｇとした。続いて、化合物２（２００ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２ｍＬ）にＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５５ｕＬ，　０．３２ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（４４ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）を室温下加えて、１０分間撹拌した。そこへ前述の化合物１６７反応液から０．５ｇ（０．１３ｍｍｏｌ相当）を加えて、さらに２４時間撹拌した。氷冷下、反応液に水を加えて水層をクロロホルムで洗浄した。水層を減圧濃縮して得られた残渣をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解した。シリカゲル（２ｇ）を加えて減圧濃縮して乾式クロマトグラフィー（ＳｉＯ　１０ｇ）（クロロホルム：メタノール＝９０：１０　→６０：４０）にて精製し、化合物１６７を淡褐色個体（６０ｍｇ，収率２５％）として得た。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ） ＝ １１２９［Ｍ＋２Ｈ］２＋，７５３［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ　Ｐｅａｋ　ＲＴ ＝ １．３１　ｍｉｎｕｔｅｓ

工程２　化合物２１の合成
　化合物１６７（１０ｍｇ，　４．４３μｍｏｌ）のＮ－メチルピロリドン溶液（０．１５ｍＬ）にＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（７．７μＬ，　４４μｍｏｌ）およびクロロギ酸４－ニトロフェニル（５ｍｇ，　２２ｕｍｏｌ）を加えて室温下２４時間撹拌した。その後、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（７．７μＬ，　４４μｍｏｌ）およびクロロギ酸４－ニトロフェニル（５ｍｇ，　２２μｍｏｌ）を加えて、さらに室温下２４時間撹拌した。ＬＣ／ＭＳ測定にて、原料の消失ならびに化合物２１の生成を確認した。精製工程を省略して、反応液を実施例３（７－１０）に用いた。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）　＝　１２１１［Ｍ＋２Ｈ］２＋，８０８［Ｍ＋３Ｈ］３＋
ＨＰＬＣ　Ｐｅａｋ　ＲＴ　＝　１．７３　ｍｉｎｕｔｅｓ
　同様に以下の化合物も合成することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
実施例２　アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体を含有する化合物の樹脂への固相化
１）化合物１００１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000086
　化合物３（２９０ｍｇ、１００μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２ｍＬ）にジイソプロピルエチルアミン（５０μＬ）を加えてから、氷冷下撹拌した。クロロギ酸イソブチル（１３μＬ，１００μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（０．２ｍＬ）を加えて、３分間撹拌した。ＰｒｉｍｅｒＳｕｐｐｏｒｔ２００（ｕｎｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ　ｓｕｐｐｏｒｔ）（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）（１ｇ）のＤＭＦ懸濁液にジイソプロピルエチルアミン（３５０μＬ）を加えた後、前述の化合物３反応液を加えて室温下２４時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＰｒｉｍｅｒＳｕｐｐｏｒｔをアセトニトリル（４０ｍＬ）で洗浄後、通気乾燥した。乾燥したＰｒｉｍｅｒＳｕｐｐｏｒｔに無水酢酸（２０％ｖ／ｖ）、ピリジン（２０％ｖ／ｖ）、Ｎ－メチルイミダゾール（１０％ｖ／ｖ）のアセトニトリル溶液（１０ｍＬ）を加えて、室温下１時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、アセトニトリル（４０ｍＬ）及びジクロロメタン（２０ｍＬ）で洗浄後、減圧下で乾燥した。化合物３の担持量はＤＭＴｒカチオンの比色定量により算出し、３０μｍｏｌ／ｇの化合物１００１を得た。
　同様の方法で、実施例１で合成した化合物４、５、８、９、１４を固相化することができる。
２）化合物１００２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
化合物１００２　樹脂担持量　６２μｍｏｌ／ｇ
３）化合物１００３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
化合物１００３　樹脂担持量　５２μｍｏｌ／ｇ
４）化合物１００４の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
化合物１００４　樹脂担持量　５３μｍｏｌ／ｇ
５）化合物１００５の合成（樹脂への固相化）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
化合物１００５　樹脂担持量　６４μｍｏｌ／ｇ
６）化合物１００６の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000091
化合物１００６　樹脂担持量　２０μｍｏｌ／ｇ
実施例３　オリゴヌクレオチドの合成
　以下の方法で表２～４に記載のオリゴヌクレオチドＳＥＱ－１～ＳＥＱ－３６を合成した。

１）アミダイト合成
　標準的な保護基を有するＤＮＡアミダイト、ＲＮＡアミダイト、２’ＯＭｅ－ＲＮＡアミダイトは、Ｐｒｏｌｉｇｏ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ社より購入した。具体的には、以下を使用した。
・Ｎ６－ベンゾイル－５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’デオキシアデノシン－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホロアミダイト
・５’－Ｏ－ジメトキシトリチルチミジン－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホロアミダイト
・Ｎ２－ｔｅｒｔブチルフェノキシアセチル－５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’デオキシグアノシン‐３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホロアミダイト
・Ｎ４－ベンゾイル－５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’デオキシシチジン－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホロアミダイト
・Ｎ６－ベンゾイル－５’－Ｏ－ジメトキシトリチルアデノシン－２’ｔｅｒｔブチルジメチルシリル－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホロアミダイト
・５’－Ｏ－ジメトキシトリチルウリジン－２’ｔｅｒｔブチルジメチルシリル－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホロアミダイト
・Ｎ２－イソブチリル－５’－Ｏ－ジメトキシトリチルグアノシン－２’ｔｅｒｔブチルジメチルシリル、３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホロアミダイト
・Ｎ４－ベンゾイル－５’－Ｏ－ジメトキシトリチルシチジン－２’ｔｅｒｔブチルジメチルシリル－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホロアミダイト
・Ｎ６－ベンゾイル－５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－アデノシン－２’－Ｏ－メチル－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホロアミダイト
・５’－Ｏ－ジメトキシトリチルウリジン－２’－Ｏ－メチル－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホロアミダイト
・Ｎ２－イソブチリル－５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－グアノシン－２’－Ｏ－メチル‐３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホロアミダイト
・Ｎ４－ベンゾイル－５’－Ｏ－ジメトキシトリチルシチジン－２’－Ｏ－メチル－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホロアミダイト
　ＡｍＮＡアミダイトは、国際公開第２０１１／０５２４３６号に記載の方法及び以下に記載の方法に基づき、合成した。
（１－１）（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシキルオキシ）－２－ヒドロキシメチル－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－４－（２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－メチルアセタミド）テトラヒドロフラン－２－カルボン酸カリウム（化合物９１４）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
工程１　化合物９０９の合成
　窒素雰囲気下、化合物９０１（合成法はＯｒｇａｎｉｃ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，７，１５６９－１５７２（２００５）に記載の方法に準じる、１３００ｇ、２．５３ｍｏｌ）のＤＭＦ（３．９Ｌ）懸濁液に、ＴＢＳクロリド（１７１７ｇ、１１．３９ｍｏｌ）のＤＭＦ（２．６Ｌ）溶液を内温５～１５℃で滴下した。続いて、内温１０～２０℃でヨウ化ナトリウム（１１３８ｇ、７．５９ｍｏｌ）を加え、同温下でＮ－メチルイミダゾール（９９９ｍＬ、１２．７ｍｏｌ）を滴下した。内温２０～３０℃で６時間撹拌した後、終夜で静置した。反応液を酢酸エチル（３．９Ｌ）と氷水（１０．４Ｌ）の混合物に注加し、更に酢酸エチル（２．６Ｌ）、水（２．６Ｌ）を加えた。有機層を１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（６．５Ｌ）、１０％炭酸ナトリウム水溶液（６．５Ｌ）、１０％食塩水（６．５Ｌ）で順次洗浄した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣（２．６８ｋｇ）にメタノール（２．６Ｌ）を加えた。再び溶媒を減圧留去し、化合物９０９の粗生成物（２．６２ｋｇ）を得た。
工程２　化合物９１０の合成
　工程１で得た化合物９０９の粗生成物（２．６２ｋｇ）のメタノール（６．５Ｌ）溶液に、３５％塩酸（６３３ｍＬ、７．５９ｍｏｌ）を内温２０～３０℃で滴下し、４時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（６．５Ｌ）と氷水（３．９Ｌ）の混合物に注加し、更にジイソプロピルエーテル（６．５Ｌ）、水（２．６Ｌ）を加えた。水層をジイソプロピルエーテル（３．２５Ｌ）で洗浄した後、炭酸ナトリウム（１０７３ｇ、１０．１ｍｏｌ）の水（６．５Ｌ）溶液を加え、酢酸エチル（１９．５Ｌ及び６．５Ｌ）で抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣にテトラヒドロフラン（２．６Ｌ）を加えた。再び溶媒を減圧留去し、化合物９１０の粗生成物（１．０８ｋｇ）を得た。
1H-NMR（DMSO-d6）δ：0.13 (s, 6H), 0.91 (s, 9H), 1.40-1.55 (br, 1H), 1.79 (s, 3H), 2.28 (s, 3H), 3.15-3.20 (d, J = 4.1Hz, 1H), 3.52-3.65 (m, 2H), 3.85 (s, 1H), 4.30-4.35  (d, J = 4.1Hz, 1H), 5.18-5.24 (br, 1H), 5.64-5.70 (d, J = 7.3Hz), 7.73 (s, 1H), 11.34 (s, 1H).
工程３　化合物９１１の合成
　窒素雰囲気下、工程２で得た化合物９１０の粗生成物（１７．７ｇ）及びピリジン（１０．１ｍＬ、１２５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（８０ｍＬ）溶液に、内温０～１０℃でトリフルオロ酢酸無水物（１７．８ｍＬ、１２５ｍｍｏｌ）を滴下し、１時間撹拌した。反応液を氷冷下、２０％炭酸ナトリウム水溶液（１１２ｍＬ）へ注加し、テトラヒドロフラン（２４ｍＬ）及び水（４８ｍＬ）を加えた。氷冷下で２０分間、室温で１時間撹拌した後、酢酸エチル（１１２ｍＬ）、ｎ－ヘキサン（８０ｍＬ）、１０％食塩水（３２ｍＬ）及び水（１７６ｍＬ）を加えた。有機層を２ｍｏｌ／Ｌ塩酸（８０ｍＬ）、０．４ｍｏｌ／Ｌ塩酸（８０ｍＬ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（８０ｍＬ）、１０％食塩水（８０ｍＬ）で順次洗浄した。各水層はそれぞれ酢酸エチル（８０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣に酢酸エチル（２４ｍＬ）を加え、６０℃に加熱して溶解させた後、ｎ－ヘキサン（７２ｍＬ）を加えた。生じたスラリーを室温まで冷却した後、ろ過して得られた固体を酢酸エチル／ｎ－ヘキサン（３．２ｍＬ／６０．８ｍＬ）で洗浄した後、通風乾燥を１日行い、化合物９１１（１５．８ｇ、工程１からの通算収率７９．１％）を得た。
1H-NMR（DMSO-d6）δ：-0.01 (2.1H, s), 0.02 (0.9H, s), 0.08 (2.1H, s), 0.09 (s, 0.9H, s), 0.86 (6.3H, s), 0.87 (2.7H, s), 1.78 (0.9H, d, J = 0.8Hz), 1.79 (2.1H, d, J = 0.8Hz), 3.12 (0.9H, s), 3.20 (2.1H, s), 3.61-3.57 (1.0H, m), 3.72-3.67 (1.0H, m),  3.99 (0.7H, q, J = 3.3Hz), 4.02 (0.3H, m), 4.45 (0.3H, m), 4.45 (0.3H, m), 4.52 (0.7H, dd, J = 6.8, 3.3Hz), 4.77 (0.7H, dd, J = 7.6, 6.8Hz), 5.30 (0.7H, t, J = 4.7Hz), 5.38  (0.3H, t, J = 4.7Hz), 6.37 (0.3H, m), 6.39 (0.7H, d, J = 7.6Hz), 7.73 (1.0H, s), 11.44  (0.7H, brs), 11.5 (0.3H, brs).
工程４　化合物９１２の合成
　窒素雰囲気下、化合物９１１（４５０ｇ、９３５ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（１．３５Ｌ）溶液に、ＥＤＣ（５３８ｇ、２８００ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（６７５ｍＬ）、パラトルエンスルホン酸ピリジニウム（２３５ｇ、９３５ｍｍｏｌ）及びジメチルスルホキシド（２２５ｍＬ）を順次加え、内温２０～３０℃で２．５時間撹拌した。続いて内温１０～２０℃で酢酸エチル（４．５Ｌ）、水（２．２５Ｌ）及び酢酸エチル（２．２５Ｌ）を順次加えた。有機層を水（２．２５Ｌ）で２回洗浄した後、溶媒を減圧留去し、得られた残渣にアセトニトリル（９００ｍＬ）を加えた。再び溶媒を減圧留去し、化合物９１２の粗生成物（５４０ｇ）を得た。
工程５　化合物９１３の合成
　工程４で得られた化合物９１２の粗生成物（５４０ｇ）のアセトニトリル（１．８Ｌ）溶液に、３７％ホルマリン水溶液（９００ｍＬ）、Ｎ－メチルモルホリン（９００ｍＬ）を順次加え、内温７０～８０℃で４時間撹拌した。反応液を内温２０～３０℃へ冷却した後、酢酸エチル（２．２５Ｌ）を加え、続いて内温１０～２０℃で４ｍｏｌ／Ｌ塩酸（２．２５Ｌ）を加えた。有機層を水（２．２５Ｌ）で２回洗浄し、化合物９１３を含有する酢酸エチル溶液を得た。
工程６　化合物９１４の合成
　工程５で得られた化合物９１３を含有する酢酸エチル溶液にリン酸二水素ナトリウム２水和物（２９２ｇ、１８７０ｍｍｏｌ）の水（１．３５Ｌ）水溶液、スクアレン（８９８ｍＬ、１８７０ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（１．３５Ｌ）を順次加えた。内温２０～３０℃で亜塩素酸ナトリウム（４２３ｇ、４６７０ｍｍｏｌ）の水（２．２５Ｌ）溶液を滴下し、３時間撹拌した。続いて内温１０～１５℃で０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（３．６Ｌ）、チオ硫酸ナトリウム５水和物（１１６０ｇ、４６７０ｍｍｏｌ）を順次加え、内温５～１５℃で２０分間撹拌した。反応液に酢酸エチル（９００ｍＬ）及び水（９００ｍＬ）を加え、有機層を水（９００ｍＬ）で洗浄した。水層を合わせて酢酸エチル（９００ｍＬ）で洗浄した後、水層に酢酸エチル（５．４Ｌ）及び２ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液（２．２５Ｌ）を加えた。有機層を１０％食塩水（２．２５Ｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。混合物をろ過、乾燥剤を酢酸エチル（１．３５Ｌ）で洗浄して得られたろ液に酢酸カリウム（８２．５ｇ、８４１ｍｍｏｌ）及びエタノール（３３８ｍＬ）を加えた。混合物を内温２０～３０℃で１時間撹拌した。生じたスラリーをろ過して得られた固体を酢酸エチル／エタノール（３８６０ｍＬ／１９３ｍＬ）で洗浄した後、通風乾燥を１日行い、化合物９１４（２８３ｇ、工程４からの通算収率５３．８％）を得た。
1H-NMR（DMSO-d6）δ ：-0.11 (1.8H, s), -0.09 (1.2H, s), 0.09 (1.8H, s), 0.10 (1.2H, s), 0.82 (3.6H, s), 0.83 (5.4H, s), 1.77 (1.2H, s), 1.78 (1.8H, s), 3.18 (1.2H, s),  3.33 (1.8H, s), 3.54 (1.0H, d, J = 10.8Hz), 3.68 (0.6H, d, J = 10.8Hz), 3.69 (0.4H,  d, J = 10.8Hz), 4.18 (0.4H, dd, J = 8.6, 7.8Hz), 4.49 (0.4H, d, J = 8.6Hz), 4.51 (0.6H,  d, J = 8.6Hz), 4.73 (0.6H, dd, J = 8.6, 7.8Hz), 6.1 (1H, br), 6.90 (0.4H, d, J = 7.8Hz),  6.92 (0.6H, d, J = 7.8Hz), 7.61 (0.6H, s), 7.65 (0.4H, s).
（１－２）Ｔアミダイトの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000093
工程１　化合物９１５の合成
　窒素雰囲気下、化合物９１４（４５５ｍｇ、０．８０７ｍｍｏｌ）のピリジン（４ｍＬ）懸濁液に、１ｍｏｌ／Ｌ　テトラブチルアンモニウムフロリド－テトラヒドロフラン溶液（０．８８８ｍＬ、０．８８８ｍｍｏｌ）を滴下し、内温６０～７０℃で９時間撹拌した後、終夜室温で静置した。翌日さらに内温６０～７０℃で９時間撹拌した後、終夜室温で静置した。ＥＤＣ塩酸塩（３１０ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）を加え、内温６０～７０℃で９時間撹拌した後、ＥＤＣ塩酸塩（３１０ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）を追加し、終夜室温で静置した。４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（５４７ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ）を加えて室温で５時間撹拌した後、さらに４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（５４７ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ）を加え、２時間撹拌した。反応液に５％炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（１０ｍＬ）で抽出した後、水（５ｍＬ）で３回洗浄した。それぞれの水洗浄液は酢酸エチル（５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム－メタノール）により精製し、化合物９１５（３３４ｍｇ、収率６９．１％）を得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：1.70 (s, 3H), 1.97 (d, J = 5.1Hz, 1H), 3.02 (s, 3H), 3.61 (d, J = 12.3Hz, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.95 (d, J = 12.3Hz, 1H), 4.11 (s, 1H), 4.37 (d, J = 4.9Hz, 1H), 5.41 (s, 1H), 6.85 (dd, J = 8.5, 2.5Hz, 4H), 7.23-7.36 (m, 7H), 7.45 (d, J = 7.7Hz, 2H), 7.76 (s, 1H), 8.55 (s, 1H).
工程２　化合物９１６（Ｔアミダイト）の合成
　国際公開第２０１１／０５２４３６号に記載の方法に準じた方法に従って、化合物９１６を合成した。
（１－３）Ａ（Ｂｚ）アミダイトの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000094
工程１　化合物９１７の合成
　窒素雰囲気下、化合物９１４（１７０ｇ、２７１ｍｍｏｌ）及び６－Ｎ－ベンゾイルアデニン（６４．９ｇ、２７１ｍｍｏｌ）のシクロペンチルメチルエーテル（１７００ｍＬ）懸濁液に、Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（４６６ｍＬ、１９００ｍｍｏｌ）及びＴＭＳＯＴｆ（９８ｍＬ、５４３ｍｍｏｌ）を加え、７０～７３℃で４時間撹拌した。反応液に氷冷下、テトラヒドロフラン（２９２０ｍＬ）、２ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１７００ｍＬ）及び水（１０２０ｍＬ）を加えた後、有機層と水層に分配し、有機層を０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１７００ｍＬ）及び水（１７００ｍＬ）で洗浄した。溶媒を減圧留去して得られた残渣にクロロホルム（３４０ｍＬ）を加え、２０分攪拌して得られたスラリーをろ過した。ろ取した固体をクロロホルム（５１０ｍＬ）で洗浄した後、風乾することにより化合物９１７（１６５ｇ、収率８０．９％）を得た。
1H-NMR（DMSO-d6）δ：-0.06 (s, 3H), 0.13 (s, 2.1H), 0.14 (s, 0.9H), 0.89 (s, 9H), 3.22 (s, 0.9H), 3.31 (s, 2.1H), 3.82 (d, J = 12.0Hz, 1H), 3.89-3.95 (m, 1H), 4.70 (d, J = 7.3Hz, 0.3H), 4.75 (d, J = 7.3Hz, 0.7H), 5.04 (t, J = 7.5Hz, 0.3H), 5.41 (brs, 0.7H), 5.49 (t, J = 8.0Hz, 0.7H), 5.55 (brs, 0.3H), 7.02 (d, J = 8.5Hz, 0.3H), 7.04 (d, J = 8.5Hz, 0.7H), 7.56 (t, J = 7.4Hz, 2H), 7.66 (t, J = 7.4Hz, 1H), 8.04 (d, J = 7.8Hz, 2H), 8.78 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 11.31 (s, 1H), 13.34 (brs, 1H).
工程２　化合物９１８の合成
　窒素雰囲気下、化合物９１７（４．７５ｇ、７．４４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２５ｍＬ）溶液に、１ｍｏｌ／Ｌ　テトラブチルアンモニウムフロリド－テトラヒドロフラン溶液（１４．９ｍＬ、１４．９ｍｍｏｌ）を滴下し、内温６０～６５℃で３．５時間撹拌した。ＥＤＣ塩酸塩（１．７１ｇ、８．９２ｍｍｏｌ）を加え、内温６０～６５℃で１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣にアセトニトリル（５０ｍＬ）を加え、再び溶媒を減圧留去することを３回繰り返し、化合物９１８の粗生成物（９．１２ｇ）を得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：3.14 (s, 3H), 4.09 (dd, J = 13.8, 6.8Hz, 1H), 4.18 (dd, J = 14.0, 3.3Hz, 1H), 4.37 (s, 1H), 4.64 (s, 1H), 5.26 (m, 1H), 5.89 (s, 1H), 6.46(brs, 1H), 7.52 (t, J = 7.5Hz, 2H), 7.60 (t, J = 7.3Hz, 1H), 8.01 (d, J = 7.7Hz, 2H), 8.56(s, 1H), 8.78 (s, 1H), 9.31 (s, 1H).
工程３　化合物９１９の合成
　窒素雰囲気下、工程２で得た化合物９１８の粗生成物（９．１２ｇ）のジクロロメタン（２５ｍＬ）溶液に、ＤＡＢＣＯ（２．０９ｇ、１８．６ｍｍｏｌ）及び４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（５．０４ｇ、１４．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（１．２６ｇ、３．７２ｍｍｏｌ）を追加し、さらに２時間撹拌した。反応液に５％炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）及びジクロロメタン（５０ｍＬ）を加え、有機層を水（５０ｍｌ）で洗浄し、水洗浄液はジクロロメタン（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせてメタノール（５０ｍＬ）を加え、重量が６０ｇになるまで溶媒を留去した後、再びメタノール（５０ｍＬ）を加え、重量が６７ｇになるまで溶媒を留去した。再びメタノール（２５ｍＬ）を加え、室温で３０分間撹拌して得られたスラリーをろ過した。ろ取した固体をメタノール（３５ｍＬ）で洗浄した後、風乾することにより化合物９１９（４．３１ｇ、工程２からの通算収率８１．３％）を得た。
1H-NMR（DMSO-d6）δ：2.98 (s, 3H), 3.26 (d, J = 11.0Hz, 1H), 3.42 (d, J = 11.7Hz, 1H), 3.73 (s, 6H), 4.67 (s, 1H), 4.79 (brs, 1H), 6.14 (s, 1H), 6.19 (brs, 1H), 6.88 (d, J = 8.3Hz, 4H), 7.21-7.32 (m, 7H), 7.39 (d, J = 7.8Hz, 2H), 7.57 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.67 (t, J = 7.4Hz, 1H), 8.06 (d, J = 7.4Hz, 2H), 8.53 (s, 1H), 8.84 (s, 1H), 11.33 (brs, 1H).
1H-NMR（CDCl3）δ：8.98(1H, s), 8.81 (1H, s), 8.39 (1H, s), 8.03 (1H, d, J=8.0 Hz), 7.63 (1H, t, J=8.0 Hz), 7.55 (2H, t, J=8.0 Hz), 7.46 (2H, d, J=8.0 Hz), 7.38-7.24 (7H, m), 6.86 (4H, d, J=8.0 Hz), 5.89 (1H, s), 4.51 (1H, s), 4.47 (1H, m), 3.91 (1H, d, J=12.0 Hz), 3.79 (6H, s), 3.73 (1H, d, J=12.0 Hz), 3.15 (3H, s), 2.07 (1H, br s, 4.0 Hz).
LC-MS: UPLC 4min base 2.28 min M+H = 713
工程４　化合物９２０（Ａアミダイト）の合成
　窒素雰囲気下、化合物９１９（５００ｍｇ、０．７０２ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（０．３６８ｍＬ、２．１１ｍｍｏｌ）のピリジン（２ｍＬ）懸濁液に氷冷下、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミジト（０．２３５ｍＬ、１．０５ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で２時間撹拌した。反応液に氷冷下、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（５ｍＬ）を加え、酢酸エチル（５ｍＬ）で抽出した。有機層を３％塩化ナトリウム水溶液（５ｍＬ）で２回洗浄し、洗浄液はそれぞれ酢酸エチル（５ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル）により精製し、化合物９２０（３９１ｍｇ、収率６１．０％）を得た。
1H-NMR（DMSO-d6）δ：0.87 (d, J = 6.8Hz, 2H), 0.92 (d, J = 6.5Hz, 4H), 1.06 (d, J = 6.8Hz, 2H), 1.08 (d, J = 6.8Hz, 4H), 2.55 (dd, J = 11.7, 5.4Hz, 1.3H), 2.70 (m, 0.7H), 2.99 (s, 2H), 3.01 (s, 1H), 3.18 (d, J = 11.5Hz, 0.7H), 3.22 (d, J = 11.5Hz, 0.3H), 3.43-3.57 (m, 4.3H), 3.65-3.70 (m, 0.7H), 3.72 (s, 2H), 3.73 (s, 4H), 4.98 (s, 1H), 5.04 (d, J = 4.8Hz, 0.3H), 5.12 (d, J = 7.8Hz, 0.7H), 6.28 (s, 0.7H), 6.29 (s, 0.3H), 6.85-6.89 (m, 4H), 7.21-7.31 (m, 7H), 7.36-7.39 (m, 2H), 7.57 (t, J = 7.5Hz, 2H), 7.66 (t, J = 7.3Hz, 1H), 8.06 (d, J = 7.5Hz, 2H), 8.50 (s, 0.3H), 8.52 (s, 0.7H), 8.83 (s, 1H), 11.31 (brs, 1H).
31P-NMR（DMSO-d6）δ：150.13 (s, 0.3H), 150.42 (s, 0.7H).
（１－４）Ｇ（Ｐａｃ）アミダイトの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000095
工程１　化合物９２１の合成
　窒素雰囲気下、化合物９１４（１５．０ｇ、２６．６ｍｍｏｌ）及びグアニン（４．０２ｇ、２６．６ｍｍｏｌ）のシクロペンチルメチルエーテル（１３５ｍＬ）懸濁液にＮ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（６５．１ｍＬ、２６６ｍｍｏｌ）及びシクロペンチルメチルエーテル（７．５ｍＬ）を加え、内温６０～７０℃で１０分間攪拌した後、ＴＭＳＯＴｆ（１１．８３ｇ、５３．２０ｍｍｏｌ）及びシクロペンチルメチルエーテル（７．５ｍＬ）を加え、２時間撹拌した。反応液に内温２０～３０℃で酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加え、さらに内温１５～３０℃で２ｍｏｌ／Ｌ塩酸（７５ｍＬ）、テトラヒドロフラン（１５０ｍＬ）及び水（７５ｍＬ）を加え、有機層を水（１５０ｍＬ）で２回洗浄した。洗浄液は合わせて酢酸エチル（１５０ｍＬ）で抽出し、水（７５ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせて溶媒を減圧留去し、得られた残渣に酢酸エチル（３７．５ｍＬ）及びｎ－ヘキサン（１１２．５ｍＬ）を加え、室温で２０分間撹拌した。得られたスラリーをろ過し、ろ取した固体を酢酸エチル－ｎ－ヘキサン（１：９、７５ｍＬ）で洗浄した後、風乾することにより化合物９２１（１４．３５ｇ、収率９１．８％）を得た。
1H-NMR（DMSO-d6）δ：-0.09 (3H, s), 0.11 (3H, s), 0.85 (9H, s), 3.10 - 3.60 (4H, m), 3.74 (1H, dd, J = 11.8, 6.8Hz), 3.90 (1H, dd, J = 11.9, 9.4Hz), 4.65 (1H, m), 5.09 (1H, t, J = 8.2Hz), 6.50 - 6.70 (3H, m), 8.00 (1H, d, J = 9.0Hz), 10.74 (1H, s), 13.24 (1H, brs).
工程２　化合物９２２の合成
　窒素雰囲気下、化合物９２１（１４．０ｇ、２３．９ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルイミダゾール（７．６０ｍＬ、９５．４ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’－ジメチルアセタミド（７０ｍＬ）溶液に、１ｍｏｌ／Ｌ　テトラブチルアンモニウムフロリド－テトラヒドロフラン溶液（２８．６ｍＬ、２８．６ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’－ジメチルアセタミド（１４ｍＬ）を加え、内温７０～８０℃で８時間撹拌した。ＥＤＣ塩酸塩（１３．７２ｇ、７１．５５ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’－ジメチルアセタミド（７ｍＬ）を内温２０～３０℃で加え、４時間撹拌した。反応液にＮ－メチルイミダゾール（７．６０ｍＬ、９５．４ｍｍｏｌ）を加えた後、ＴＢＳクロリド（１４．３８ｇ、９５．４０ｍｍｏｌ）を内温２０℃以下で加え、室温で２時間撹拌した。反応液に酢酸エチル（２８０ｍＬ）及び１０％食塩水（１４０ｍＬ）を加え、有機層を水（１４０ｍＬ）で２回洗浄した。洗浄液はそれぞれ酢酸エチル（１４０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて溶媒を減圧留去し、得られた残渣にアセトニトリル（５６ｍＬ）、イソプロピルアルコール（２８ｍＬ）及び水（２６６ｍＬ）を室温で順次加え、内温０～１０℃で１時間撹拌した。得られたスラリーをろ過し、ろ取した固体をアセトニトリル－水（１：９、７０ｍＬ）で洗浄した後、減圧下、６０℃で乾燥し、化合物９２２（７．７１ｇ、収率７４．１％）を得た。
1H-NMR（DMSO-d6）δ ：-0.09 (3H, s), 0.10 (3H, s), 0.81 (9H, s), 2.92 (3H, s), 3.89 (2H, dd, J = 33.0, 12.7Hz), 4.33 (2H, s), 5.67 (1H, s), 5.93 (1H, brs), 6.54 (2H, brs), 7.69 (1H, s), 10.72 (1H, brs).
工程３　化合物９２３の合成
　窒素雰囲気下、化合物９２２（７．５０ｇ、１７．２ｍｍｏｌ）のピリジン（３７．５ｍＬ、４６４ｍｍｏｌ）懸濁液に、内温１０～２０℃でトリメチルシリルクロリド（９．３３ｇ、８５．９ｍｍｏｌ）を滴下した後、室温で３０分間撹拌した。次に内温０～５℃でフェノキシアセチルクロリド（３．５２ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）を滴下した後、室温で１時間撹拌した。反応液を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で希釈した後、内温０～１０℃で１０％食塩水（３７．５ｍＬ）及び濃塩酸（３０．０ｍＬ）の混合液を滴下した。有機層を１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（７５ｍＬ）及び水（７５ｍＬ）で２回洗浄し、次に酢酸エチル（３７．５ｍＬ）及び２ｍｏｌ／Ｌ塩酸メタノール溶液（３８．７ｍＬ、７７．４ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１時間撹拌した。得られたスラリーにメタノール（１５ｍＬ）を加え、室温で３０分間撹拌した後、ろ過し、ろ取した固体を酢酸エチル（４５ｍＬ）で洗浄した後、風乾することにより化合物９２３（５．５１ｇ、収率７０．３％）を得た。
1H-NMR（DMSO-d6）δ：2.95 (3H, s), 3.68 (1H, d, J = 13.6Hz), 3.82 (1H, d, J = 13.3Hz), 4.35 (1H, s), 4.41 (1H, s), 4.92 (2H, s), 5.80 (1H, s), 6.99 (3H, m), 7.32 (2H, m), 8.19(1H, s), 11.82(2H, br).
工程４　化合物９２４（Ｇアミダイト）の合成
　窒素雰囲気下、化合物９２３（５００ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）のジメチルアセタミド（３．５ｍＬ）溶液に、４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（１．１１ｇ、３．２９ｍｍｏｌ）及びＤＡＢＣＯ（３６９ｍｇ、３．２１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２．５時間撹拌した。反応液に１０℃以下でＤＡＢＣＯ（３６９ｍｇ、３．２１ｍｍｏｌ）及び２－シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト（０．５８７ｍＬ、２．６３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液に酢酸エチル（１０ｍＬ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（２．５ｍＬ）及び１０％食塩水（２．５ｍＬ）を加え、有機層を１０％食塩水（５ｍＬ）で２回洗浄した。洗浄液は合わせて酢酸エチル（２．５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）により精製し、化合物９２４（７２０ｍｇ、酢酸エチル９．９ｗｔ％含有、収率６１．７％）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 11.87 (1.0H, br s), 11.77 (1.0H, br s), 8.07 (1.0H, s), 7.40 (1.9H, t, J = 7.4 Hz), 7.35-7.23 (9.0H, m), 7.02-6.97 (3.0H, m), 6.93-6.88 (4.0H, m), 6.08 (1.0H, s), 4.91 (2.0H, s), 4.78 (1.0H, s), 4.64 (0.7H, d, J = 8.8 Hz), 4.59 (0.3H, d, J = 6.0 Hz), 3.75 (4.2H, s), 3.74 (1.8H, s), 3.72-3.60 (0.6H, m), 3.60-3.49 (1.3H, m), 3.48-3.39 (1.4H, m), 3.21 (0.7H, dd, J = 15.4, 11.6 Hz), 2.98 (0.9H, s), 2.97 (2.1H, s), 2.70 (0.6H, dd, J = 10.1, 5.4 Hz), 2.58 (1.4H, t, J = 5.9 Hz), 1.09-1.05 (6.0H, m), 0.91-0.83 (6.0H, m).
31P-NMR (CDCl3) δ: 148.90, 149.98
（１－５）ＭｅＣ（Ｂｚ）アミダイトの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000096
工程１　化合物９２５の合成
　化合物９１５　１０８．１ｇ（純度：９２．５３％、含量：１００ｇ、０．１６７ｍｏｌ）、ＤＭＦ　３００ｍｌ、イミダゾール４７．８ｇ（４．２ｅｑ．）、ＴＢＳクロリド　５１．６ｇ（２．０５ｅｑ．）を仕込み２５℃付近で２３時間撹拌を行った。酢酸エチル　６００ｍｌ、水　６００ｍｌを加えて分液を行い、水層を酢酸エチル　３００ｍｌで再抽出を行った。有機層を混合し、５％炭酸水素ナトリウム水溶液　６００ｍｌ、５％食塩水　６００ｍｌで洗浄を行い、溶媒を回収した。ＴＢＳＯＨの除去を目的にトルエン　５００ｍｌ×３回溶媒置換を行った後、アモルファスを固化させたものをほぐして目的の化合物９２５（１３２．６ｇ、粗収率　１１１．２％）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.33 (1H, s), 7.89 (1H, s), 7.41 (2H, d, J = 7.0 Hz), 7.33-7.21 (7H, m), 6.82 (4H, dd, J = 8.8, 5.6 Hz), 5.43 (1H, s), 4.50 (1H, s), 4.04 (1H, s), 3.87 (1H, d, J = 11.8 Hz), 3.789 (3H, s), 3.787 (3H, s), 3.41 (1H, d, J = 11.8 Hz), 3.00 (3H, s), 1.56 (3H, s), 0.75 (9H, s), 0.04 (2H, s), -0.04 (2H, s).
工程２　化合物９２６の合成
　化合物９２５　１３２．６ｇ（０．１６７ｍｏｌ相当）、アセトニトリル　８００ｍｌ、トリエチルアミン　５０．７ｇ（３ｅｑ．）、４－ジメチルアミノピリジン　２．０ｇ（０．１ｅｑ．）、２’，４’，６’－トリイソプロピルスルホニルクロリド　６５．８ｇ（１．３ｅｑ．）を加え、２５℃付近で２２時間撹拌した。２５％アンモニア水　８００ｍｌを加え２５℃付近で２時間撹拌した。アセトニトリルを粗く回収し、酢酸エチル　４００ｍｌ、水　４００ｍｌを加えて分液を行い、水層を酢酸エチル　３００ｍｌで再抽出した。有機層を混合し、５％食塩水　４００ｍｌ×２回洗浄を行い、溶媒を回収した。アモルファスを固化させたものをほぐして目的の化合物９２６（１９２．８ｇ、化合物９１５からの粗収率　１６１．９％）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.97 (1H, s), 7.53 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.35-7.25 (7H, m), 6.83 (4H, dd, J = 8.8, 6.8 Hz), 5.51 (1H, s), 4.46 (1H, s), 4.19 (1H, s), 3.88 (1H, d, J = 11.7 Hz), 3.79 (6H, s), 3.39 (1H, d, J = 11.7 Hz), 3.02 (3H, s), 1.85 (3H, s), 1.66 (3H, s), 0.74 (9H, s), 0.04 (2H, s), -0.04 (2H, s).
工程３　化合物９２７の合成
　化合物９２６　１９２．８ｇ（０．１６７ｍｏｌ相当）、ＤＭＦ　５００ｍｌ、安息香酸無水物　７５．６ｇ（２ｅｑ．）を加え、２５℃付近で２２時間撹拌した。酢酸エチル　１０００ｍｌ、５％炭酸水素ナトリウム　１０００ｍｌを加えて分液を行い、水層を酢酸エチル　５００ｍｌで再抽出した。有機層を混合し、５％炭酸水素ナトリウム水溶液　５００ｍｌ、５％食塩水　５００ｍｌで洗浄を行い、溶媒を回収して化合物９２７の粗生成物を得た。シリカゲル１．３ｋｇ、展開溶媒ヘキサン／酢酸エチル＝８／２→６／４で精製を行い、アモルファスを固化させたものをほぐして目的の化合物９２７（１２４．１ｇ、化合物９１５からの収率　９１％）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.33 (2H, d, J = 7.2 Hz), 8.05 (1H, s), 7.53 (1H, dd, J = 7.4, 7.4 Hz), 7.49-7.41 (5H, m), 7.35-7.28 (7H, m), 7.25 (1H, m), 6.84 (4H, dd, J = 8.8, 6.4 Hz), 5.49(1H, s), 4.51 (1H, s), 4.10 (1H, s), 3.90 (1H, d, J = 11.7 Hz), 3.803 (3H, s), 3.800 (3H, s), 3.42 (1H, d, J = 11.7 Hz), 3.11 (3H, s), 1.85 (3H, s), 0.74 (9H, s), 0.04 (2H, s), -0.04 (2H, s).
工程４　化合物９２８の合成
化合物９２７　１２４．１ｇ（０．１５２ｍｏｌ）、テトラヒドロフラン　８６９ｍｌ、１ｍｏｌ／Ｌ テトラブチルアンモニウムフロリド／テトラヒドロフラン　１８２ｍｌ（１．２ｅｑ．）を加え２時間撹拌を行った。溶媒を回収し、酢酸エチル　６２０ｍｌ、５％炭酸水素ナトリウム水溶液　６２０ｍｌを加えて分液を行った。５％食塩水　６２０ｍｌで洗浄し溶媒を回収した。ＴＢＳＯＨの除去を目的にトルエン　６２０ｍｌ×３回溶媒置換を行った後、アモルファスを固化させたものをほぐして目的の化合物９２８（１１９．２ｇ、化合物９２７からの収率　１１９％）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 13.44 (1H, br s), 8.32 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.92 (1H, s), 7.55 (1H, dd, J = 7.3, 7.3 Hz), 7.50-7.43 (4H, m), 7.40-7.30 (7H, m), 7.26 (1H, m), 6.86 (4H, dd, J = 8.8, 3.6 Hz), 5.46 (1H, s), 4.37 (1H, br.s), 4.16 (1H, s), 3.92 (1H, d, J = 12.3 Hz), 3.803 (3H, s), 3.800 (3H, s), 3.57-3.42 (4H, m), 3.63 (1H, d, J = 12.3 Hz), 3.03 (3H, s), 1.90 (3H, s).
工程５　化合物９２９（ＭｅＣ（Ｂｚ）アミダイト）の合成
　化合物９２８　１０８．２ｇ（０．１３８ｍｏｌ相当）、ジクロロメタン　５６４ｍｌ、Ｎ，　Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン　３５．７ｇ（２ｅｑ．）を仕込み、５℃以下で２－シアノエチルジイソプロピルクロロホスフォロアミダイト　４９．０ｇ（１．５ｅｑ．）を滴下した。その後、２５℃付近で２時間撹拌した。５％炭酸水素ナトリウム水溶液　５６４ｍｌを加え分液し、溶媒を回収してＭｅＣ（Ｂｚ）の粗生成物を得た。シリカゲル２．３ｋｇ、展開溶媒ヘキサン／酢酸エチル＝７／３→５／５で精製を行い、アモルファスを固化させたものをほぐして目的の化合物９２９（ＭｅＣ（Ｂｚ）アミダイト、１０５．２ｇ、化合物９２７からの収率　８４％、２種のジアステレオマー比（ＨＰＬＣの積分値より算出）＝５４：４６）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ:（major diastereomer）13.47 (1H, br s), 8.33 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.98 (1H, s), 7.52 (1H, dd, J = 7.4, 7.4 Hz),7.50-7.42 (4H, m), 7.37-7.24 (8H, m), 6.86 (4H, dd, J = 8.8, 6.6 Hz), 5.52 (1H, s), 4.64 (1H, d, J = 6.9 Hz), 4.37 (1H, s), 3.92 (1H, d, J = 11.7 Hz), 3.812 (3H, s), 3.807 (3H, s), 3.57-3.42 (4H, m), 3.51 (1H, d, J = 11.7 Hz), 3.02 (3H, s), 2.36 (2H, t, J = 5.9 Hz), 1.77 (3H, s), 1.14 (6H, d, J = 6.8 Hz), 1.05 (6H, d, J = 6.8 Hz).（minor diastereomer）13.47 (1H, br s), 8.33 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.98 (1H, s), 7.56 (1H, dd, J = 7.3, 7.3 Hz), 7.47-7.43 (4H, m), 7.35-7.28 (7H, m), 7.22 (1H, m), 6.86 (4H, dd, J = 8.8, 5.5 Hz), 5.51 (1H, s), 4.60 (1H, d, J = 4.3 Hz), 4.43 (1H, s), 3.88 (1H, d, J = 11.7 Hz), 3.802 (3H, s), 3.798 (3H, s), 3.64 (1H, m), 3.52 (1H, d, J = 11.7 Hz), 3.52-3.44 (3H, m), 3.04 (3H, s), 2.60-2.52 (2H, m), 1.79 (3H, s), 1.11 (6H, d, J = 6.8 Hz), 0.99 (6H, d, J = 6.8 Hz).
31P-NMR (CDCl3) δ: 151.24, 151.05.
２）固相合成
　すべてのオリゴヌクレオチドはＡＫＴＡ　Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ１０　（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ホスホロアミダイト法により合成した。モノマーは上記アミダイト合成で得られたアミダイトを用いて、０．１Ｍアセトニトリル溶液に調製した。カップリング時間は５～１０分間とし、１つのモノマーの縮合に４当量のアミダイト体を用いた。ＰＯ酸化にはヨウ素／ピリジン／水／＝１２．７／９／１（ｗ／ｖ／ｖ）を使用し、ＰＳ酸化には０．２ｍｏｌ／Ｌフェニルアセチルジスルフィドのアセトニトリル／３－ピコリン１／１（ｖ／ｖ）溶液を用いた。
３）脱保護Ｉ　（樹脂からの切り出し、塩基及びリン酸の脱保護）
　ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－１、１２）の切り出しは０．２ｍｏｌ／Ｌ　水酸化ナトリウム（メタノール／水＝４／１）を用いて、室温下で１５時間振とうした。樹脂を５０％エタノール水で洗浄後、ろ過液を５％クエン酸水溶液で中和して減圧下で濃縮した。
　ＳＥＱ－２～６、１３～１９、２７～２９、３３、３４、３６の切り出しは２８％アンモニア水／メチルアミン／エタノール＝６／２／２（ｖ／ｖ）を用いて、室温下で２４時間振とうした。樹脂を５０％エタノール水で洗浄後、ろ過液を減圧下で濃縮した後、凍結乾燥にて白色粉末を得た。
４）脱保護ＩＩ　（２’－ＴＢＳ基の脱保護）
　得られた白色粉末に、Ｎ－メチルピロリドン／トリエチルアミン／３－フッ化水素トリエチルアミン＝６／１／２（ｖ／ｖ）を加えて６５℃下で１．５時間撹拌した。反応液に同量のエトキシトリメチルシランを加えて室温下で１０分間激しく撹拌すると沈殿物が得られた。２５００ｘｇ（２分間）にて遠心分離後、有機溶媒層を注意深く除去した。得られた沈殿物にジエチルエーテルを加えて激しく撹拌後、同様に遠心分離を行い有機溶媒を除去して、粗ＲＮＡ体（白色固体）を得た。
５）精製
　ＳＥＱ－１、１２は陰イオン交換モードで精製を行った。ＳＥＱ－２～６、１３～１９、２７～２９、３３、３４、３６は逆相モードで精製を行った。

　陰イオン交換モードの条件
　移動相　Ａ液：２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）／　１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ
　　　　　Ｂ液：２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）／　１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ　２．０Ｍ　ＮａＢｒ
　Ｂ濃度グラジエント：１０－８０％
　Ｃｏｌｕｍｎ：ＳＯＵＲＣＥ　３０Ｑ（２６／１０）（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）
　流速：１９ｍＬ／ｍｉｎ
　カラム温度：室温
　検出ＵＶ：２６０ｎｍ

　逆相モードの条件は、ＳＥＱ－２は精製条件２を選択し、ＳＥＱ－３～６、１３～１９、２７～２９、３３、３４、３６は精製条件１を選択した。

精製条件１　
　移動相　Ａ液：１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＴＥＡＡ（ｐＨ７）
　　　　　Ｂ液：１０ｍＭ　ＴＥＡＡ（ｐＨ７）／アセトニトリル＝１／１（ｖ／ｖ）
　Ｂ濃度グラジエント：２０－６０％
　Ｃｏｌｕｍｎ：ＹＭＣ　Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８（２０ｘ１００ｍｍ）（ＹＭＣ社製）
　流速：１５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出ＵＶ：２６０ｎｍ

精製条件２
　移動相　Ａ液：５０ｍｍｏｌ／Ｌ　リン酸緩衝液（ｐＨ８）
　　　　　Ｂ液：アセトニトリル
　Ｂ濃度グラジエント：３０－６０％
　Ｃｏｌｕｍｎ：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ　Ｃ４（２０ｘ１００ｍｍ）（ＹＭＣ社製）
　流速：１５ｍＬ／ｍｉｎ
　カラム温度：室温
　検出ＵＶ：２６０ｎｍ
６）精製オリゴヌクレオチドの脱塩及び凍結乾燥
　得られたオリゴヌクレオチドはＶｉｖａＳｐｉｎ２０（ＭＷＣＯ　３０００）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）を用いて、限外濾過を繰り返すことでフラクションに含まれる塩成分を除去した。その後、凍結乾燥にて目的とするオリゴヌクレオチドを粉末として得た。　
７）各オリゴヌクレオチドについて
　ＰＯ酸化にはヨウ素／ピリジン／水／＝１２．７／９／１（ｗ／ｖ／ｖ）を使用し、ＰＳ酸化には０．２ｍｏｌ／Ｌフェニルアセチルジスルフィドのアセトニトリル／３－ピコリン１／１（ｖ／ｖ）溶液を用いた。
（７－１）ＳＥＱ－２の合成
　５’末端のα―トコフェロール体（化合物２０４）の導入は５’－Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ－ＣＥ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ｌｉｎｋ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社より購入）を用いた。
（７－２）ＳＥＱ－３又は４（リンカーがＬ６）の合成
　５’末端のアシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体（ＧａｌＮａｃ誘導体、化合物２０５）の導入には化合物１を用いた。
（７－３）ＳＥＱ－５、６又は１３（リンカーがＬ７）の合成
　３’末端のアシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体（ＧａｌＮａｃ誘導体、化合物２０５）の導入には合成固相担体として化合物１００１を用いた。
（７－４）ＳＥＱ－１４（リンカーがＬ８）の合成
　シグマアルドリッチ社から市販されているＭＭＴ－Ｈｅｘｙｌａｍｉｎｏｌｉｎｋｅｒ　ａｍｉｄｉｔｅを用いて５’末端にアミノ基を露出させた状態でオリゴヌクレオチド合成を終了した。その後、ＨＢＴＵを用いて化合物２と縮合することでアシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体（ＧａｌＮａｃ誘導体、化合物２０５）の導入を行い、切り出し、脱保護を行った。
（７－５）ＳＥＱ－１５、１６又は２８（リンカーがＬ９）の合成
　３’末端のアシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体（ＧａｌＮａｃ誘導体、化合物２０５）の導入には合成固相担体として化合物１００２を用いた。
（７－６）ＳＥＱ－２９（リンカーがＬ９）の合成
　３’末端のアシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体（ＧａｌＮａｃ誘導体、化合物２０５）の導入には合成固相担体として化合物１００２を用いた。ＬＮＡ（化合物２０３）を導入するためのアミダイト試薬はコスモ・バイオ株式会社から購入した。
（７－７）ＳＥＱ－１７（リンカーがＬ１０）、１８（リンカーがＬ１１）、１９（リンカーがＬ１２）又は３３（リンカーがＬ１３）の合成
　３’末端のアシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体（ＧａｌＮａｃ誘導体、化合物２０５）の導入には合成固相担体として、それぞれ化合物１００３、１００４、１００５又は１００６を用いた。
（７－８）ＳＥＱ－３４（リンカーがＬ９Ｌ１４）の合成
　３’末端のアシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体（ＧａｌＮａｃ誘導体、化合物２０５）の導入には合成固相担体として化合物１００２を用いた。また、ジスルフィド結合の導入にはＬｉｎｋＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から市販されているＴｈｉｏｌ－Ｍｏｄｉｆｉｅｒ－Ｃ６－Ｓ－Ｓ　ＣＥ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄｅｔｅ試薬を用いた。
（７－９）ＳＥＱ－３５（リンカーがＬ１５）の合成
　シグマアルドリッチ社から市販されているＭＭＴ－Ｈｅｘｙｌａｍｉｎｏｌｉｎｋｅｒ　ａｍｉｄｉｔｅを用いて５’末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチドを得る。その後、化合物２０と縮合させることでアシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体（ＧａｌＮａｃ誘導体、化合物２０５）を導入することができる。
（７－１０）ＳＥＱ－３６（リンカーがＬ１６）の合成
　シグマアルドリッチ社から市販されているＭＭＴ－Ｈｅｘｙｌａｍｉｎｏｌｉｎｋｅｒ　ａｍｉｄｉｔｅを用いて５’末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチドを樹脂上に合成した。この樹脂（１４ｍｇ、０．５μｍｏｌ相当）に対して、化合物２１のＮＭＰ溶液（０．１５ｍＬ、４μｍｏｌ相当）を加えて５０℃下で１日間加熱することで、アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体（ＧａｌＮａｃ誘導体、化合物２０５）の導入を行った。
（７－１１）オリゴヌクレオチドの購入
　オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ―２６）は株式会社ジーンデザイン社(大阪、日本)から購入した。
８）オリゴヌクレオチドの純度分析
　得られたオリゴヌクレオチドは、ＵＰＬＣ／ＭＳ測定による実測分子量が理論分子量と一致することで、目的の配列が合成できていることを確認した。
　Ｘｅｖｏ　Ｇ２　Ｔｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
　Ｃｏｌｕｍｎ：Ａｑｕｉｔｙ　ＯＳＴ　Ｃ１８（２．１ｘ５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ社製）
　移動相　Ａ液：２００ｍＭ　１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール／８ｍＭトリエチルアミン
　　　　　Ｂ液：メタノール
　Ｂ濃度グラジエント：１０－３０％（１０ｍｉｎ）
　温度：５０℃
　流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
　ＳＥＱ－１～６、１２～１９、２７～２９、３３、３４、３６に関し、精製後、ＬＣ／ＭＳ測定により分子量の理論値と実測値が一致することで、目的の配列が合成されていることを確認した。結果を表１に示す。



Figure JPOXMLDOC01-appb-T000097
９）二重鎖核酸の調製
　ＳＥＱ－７～１１、２０～２５、３０～３２の二重鎖核酸は以下のようにして調製した。各オリゴヌクレオチドを等モル量混合した後、蒸留水を加えて濃度０．５ｍｍｏｌ／Ｌ溶液とした。その後６０℃下で１０分間静置後、室温まで自然冷却させることで二重鎖核酸を得た。二重鎖形成の確認は、サイズ排除クロマトグラフィーにより実施した。
　Ｃｏｌｕｍｎ：ＹＭＣ－ＰＡＣ　Ｄｉｏｌ－１２０（４．６ｘ３００ｍｍ）（ＹＭＣ社製）
　移動相：１０％アセトニトリル含有１ｘＰＢＳ溶液
　流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ
　温度：室温
　同様に、ＳＥＱ－３７～４０の二重鎖核酸を調製することができる。
１０）オリゴヌクレオチドの配列
　合成したオリゴヌクレオチドを表２～４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000098
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000099
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000100
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000101
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000102
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000103
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000104
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000105
比較例　トコフェロールを含む二本鎖オリゴヌクレオチドのｉｎ　ｖｉｖｏ活性評価
　一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－１）とセンス鎖をトコフェロールを含む二本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－７）のマウス肝臓におけるＡＣＳＬ１のｍＲＮＡ発現量変化によるノックダウン活性評価を行った。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（オス７週齢、日本クレア社）に４週間、高脂脂肪食（６０％ｋｃａｌ脂肪：ＴｅｓｔＤｉｅｔ社製）を４週間与えることで食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスを作製した。ＤＩＯマウスへ、生理食塩水（大塚生食注、大塚製薬工場）に溶解したＳＥＱ－７の溶液、約０．２ｍＬを、マウス個体あたり投与量がアンチセンスオリゴ量換算で１．１ｍｇ／ｋｇ、３．３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇとなるように静脈投与あるいは皮下投与した。陽性対照として、ＳＥＱ－１の溶液を、マウス個体あたり投与量が１０ｍｇ／ｋｇとなるように投与した。投与７日後にソムノペンチル麻酔下で肝臓組織を採取した。肝臓からのＲＮＡ抽出はＲＮｅａｓｙ　９６　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてメーカー推奨プロトコル通りに行った。得られたＲＮＡのうち１０００ｎｇを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩＩ　Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ＳｕｐｅｒＭｉｘ　ｆｏｒ　ｑＲＴ－ＰＣＲ（Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、標準プロトコルに準じて逆転写を行うことでｃＤＮＡを得た。ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＩＩ（タカラバイオ社製）を用いて定量的ＰＣＲを行った。
　マウスＡＣＳＬ１の発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Ｆｗプライマー：ＡＧＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣ（配列番号：３）
Ｒｖプライマー：ＡＡＡＧＴＣＣＡＡＣＡＧＣＣＡＴＣＧＣＴＴＣ（配列番号：４）
を用い、
マウスＧＡＰＤＨの発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Ｆｗプライマー：ＴＧＴＧＴＣＣＧＴＣＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡ（配列番号：５）
Ｒｖプライマー：ＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＧＣＡＧＧＡＧ（配列番号：６）
を用いた。ノックダウン効率は、Ｇａｐｄｈで正規化したＡｃｓｌ１のｍＲＮＡ減少量について、生理食塩水投与群に対する割合として示した。
　内在性コントロールとしてＧＡＰＤＨを使用し、プライマーはｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験と同一のものを用いた。結果を図１に示す。ＧＡＰＤＨで正規化したＡＣＳＬ１のｍＲＮＡ量について、生理食塩水投与群に対する割合を示した。この結果、トコフェロールを含む二本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－７）は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－１）と比較して静脈投与においては約９倍のノックダウン活性の向上が確認されたが、皮下投与においてはノックダウン活性の向上は確認できなかった。
実施例４　本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのｉｎ　ｖｉｖｏ活性評価
（４－１）静脈投与又は皮下投与における本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのノックダウン活性
　本実施例では、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－１）とセンス鎖の５’末端にアシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体（ＧａｌＮＡｃ誘導体）を含む本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－８）のマウス肝臓におけるＡＣＳＬ１のｍＲＮＡ発現量変化によるノックダウン活性評価を行った。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（オス７週齢、日本クレア社）に４週間、高脂脂肪食（６０％ｋｃａｌ脂肪：ＴｅｓｔＤｉｅｔ社製）を４週間与えることで食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスを作製した。ＤＩＯマウスへ、生理食塩水（大塚生食注、大塚製薬工場）に溶解したＳＥＱ－８の溶液、約０．２ｍＬを、マウス個体あたり投与量がアンチセンス鎖量換算で２．２ｍｇ／ｋｇ、６．６ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇとなるように静脈投与あるいは皮下投与した。陽性対照として、ＳＥＱ－１の溶液を、マウス個体あたり投与量が２０ｍｇ／ｋｇとなるように投与した。投与７日後にソムノペンチル麻酔下で肝臓組織を採取し、活性評価を行った。結果を図２に示す。この結果、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－８）は、静脈投与及び皮下投与いずれにおいても投与量依存的にノックダウン活性が向上し、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－１）と比較して約９倍のノックダウン活性の向上が確認された。
（４－２）結合位置又はリン酸結合の異なる本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのノックダウン活性
　一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－１）とセンス鎖の５’末端あるいは３’末端にアシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体（ＧａｌＮＡｃ誘導体）を含む本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－８～１１）のマウス肝臓におけるＡＣＳＬ１のｍＲＮＡ発現量変化によるノックダウン活性評価を行った。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（オス７週齢、日本クレア社）に４週間、高脂脂肪食（６０％ｋｃａｌ脂肪：ＴｅｓｔＤｉｅｔ社製）を４週間与えることで食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスを作製した。ＤＩＯマウスへ、生理食塩水（大塚生食注、大塚製薬工場）に溶解したＳＥＱ－８～１１いずれかの溶液、約０．２ｍＬを、マウス個体あたり投与量がアンチセンス鎖換算量で２．２ｍｇ／ｋｇ、６．６ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇとなるように皮下投与した。陽性対照として、ＳＥＱ－１の溶液を、マウス個体あたり投与量が２０ｍｇ／ｋｇとなるように投与した。投与７日後にソムノペンチル麻酔下で肝臓組織を採取し、活性評価を行った。結果を図３に示す。この結果、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、皮下投与において、アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体の結合位置及びリン酸結合の違いによってノックダウン活性に差はなく、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－１）と比較して約９倍のノックダウン活性の向上が確認された。
（４－３）リン酸結合の異なる本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのノックダウン活性
　本実施例では、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－１２）とセンス鎖の３’末端にアシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体（ＧａｌＮＡｃ誘導体）を含む本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－２１又は２２）のマウス肝臓におけるＡＣＳＬ１のｍＲＮＡ発現量変化によるノックダウン活性評価を行った。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（オス７週齢、日本クレア社）に４週間、高脂脂肪食（６０％ｋｃａｌ脂肪：ＴｅｓｔＤｉｅｔ社製）を４週間与えることで食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスを作製した。ＤＩＯマウスへ、生理食塩水（大塚生食注、大塚製薬工場）に溶解したＳＥＱ－２１又は２２の溶液、約０．２ｍＬを、マウス個体あたり投与量がアンチセンス鎖量換算で２ｍｇ／ｋｇ及び４ｍｇ／ｋｇとなるように静脈投与あるいは皮下投与した。陽性対照として、ＳＥＱ－１２の溶液を、マウス個体あたり投与量が２０ｍｇ／ｋｇとなるように投与した。投与３日後及び７日後にソムノペンチル麻酔下で肝臓組織を採取し、活性評価を行った。結果を図４に示す。この結果、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－２１又は２２）は、投与量依存的にノックダウン活性が向上し、アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体を結合させるリン酸結合の違いによってノックダウン活性に差はなく、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－１２）と比較して１０分の１の投与量で同程度の活性を示した。
（４－４）リンカー部位構造の異なる本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのノックダウン活性
　本実施例では、センス鎖の３’末端に種々のリンカー構造を介して結合させたアシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体（ＧａｌＮＡｃ誘導体）を含む本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－２０，２３～２５）のマウス肝臓におけるＡＣＳＬ１のｍＲＮＡ発現量変化によるノックダウン活性評価を行った。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（オス８週齢、日本クレア社）へ、生理食塩水（大塚生食注、大塚製薬工場）に溶解した二本鎖オリゴヌクレオチドの溶液、約０．２ｍＬを、マウス個体あたり投与量がアンチセンス鎖量換算で２ｍｇ／ｋｇ及び４ｍｇ／ｋｇとなるように１週間おきに2回、皮下投与した。最終投与後７日目に、ソムノペンチル麻酔下で肝臓組織を採取し、活性評価を行った。結果を図５に示す。この結果、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド群（ＳＥＱ－２０，２３～２５）において、アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体を結合させるリンカー部位構造の違いによってノックダウン活性に大きな差は認められなかった。また、いずれの二本鎖オリゴヌクレオチドも投与量依存的にノックダウン活性が向上した。
（４－５）本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドと一本鎖オリゴヌクレオチドのノックダウン活性比較
　本実施例では、センス鎖の３’末端にアシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体（ＧａｌＮＡｃ誘導体）を含む本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－３１）と３’末端にアシアロ糖タンパク質受容体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－２９）のマウス肝臓におけるＡｐｏＢのｍＲＮＡ発現量変化によるノックダウン活性評価を行った。比較対象として、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－２６）、アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体を含まない二本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－３０）、アンチセンス鎖の３’末端にアシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘ｃ導体（ＧａｌＮＡｃ誘導体）を含む二本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－３２）を用いた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（オス７週齢、日本クレア社）へ、生理食塩水（大塚生食注、大塚製薬工場）に溶解した二本鎖オリゴヌクレオチドの溶液、約０．２ｍＬを、マウス個体あたり投与量がアンチセンス鎖量換算で０．２ｍｇ／ｋｇとなるように皮下投与した。投与後３日目にソムノペンチル麻酔下で肝臓組織を採取し、活性評価を行った。
　肝臓からのＲＮＡ抽出はＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてメーカー推奨プロトコル通りに行った。得られたＲＮＡのうち１０ｎｇを、Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＳＹＢＲ　ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＰＬＵＳ　　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、定量的ＰＣＲを行い ＡｐｏＢ ｍＲＮＡの発現量を評価した。
　マウスＡｐｏＢの発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Ｆｗプライマー：ＴＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＡＴＧＧＡＣＴＣＡＴＴＣ（配列番号：７）
Ｒｖプライマー：ＣＧＴＣＣＡＣＡＧＴＡＴＡＴＧＴＴＣＣＡＧＣＧＴＡ（配列番号：８）
を用いた。
　マウスＧａｐｄｈの発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Ｆｗプライマー：ＴＧＴＧＴＣＣＧＴＣＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡ（配列番号５）
Ｒｖプライマー：ＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＧＣＡＧＧＡＧ（配列番号６）
を用いた。
　各サンプル投与群におけるＧａｐｄｈのｍＲＮＡ発現量で正規化したＡｐｏＢの ｍＲＮＡ発現量について、生理食塩水投与群の発現量を１００％とした場合の相対値（％）を比較した。結果を図６に示す。この結果、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－３１）はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ－２６）が活性を示さない低投与量域においても８０％ノックダウン活性を示し、前述の実施例に示す結果と同様に、活性の向上が確認された。一方、アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体（ＧａｌＮＡｃ誘導体）を含まない二重鎖オリゴヌクレオチドであるＳＥＱ－３０、アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体（ＧａｌＮＡｃ誘導体）を含むものの、一本鎖構造であるＳＥＱ－２９や二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖に結合するＳＥＱ－３２では、ノックダウン活性の向上は認められなかった。
　以上の結果から、本発明の二重鎖オリゴヌクレオチドは、肝臓における標的遺伝子を効率よくノックダウンさせる最適な設計であることが明らかになった。
　以上の実施例から明らかなように、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、静脈注射投与、皮下投与のいずれであっても、肝臓における標的遺伝子の発現抑制活性が優れている。したがって、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは活性成分であるＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを肝臓へ効率よく輸送するため複合体として非常に有用である。

Claims (9)

  1. アンチセンス鎖が、ヌクレオシド誘導体を含んでいてもよい８～２５塩基のＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
    センス鎖が、ストリンジェントな条件で該アンチセンス鎖にハイブリダイズ可能な配列を含み、ＤＮＡヌクレオシド及び／又はヌクレオシド誘導体を含んでいてもよい８～３５塩基のＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、
    センス鎖の３’末端及び／又は５’末端に、
    リンカーを介して
    アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体
    が結合している二本鎖オリゴヌクレオチド。
  2. 糖誘導体が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    （式中、
    Ｐ１Ａ、Ｐ１Ｂ、Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ４Ｃ、Ｔ１Ａ、Ｔ１Ｂ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ及びＴ４Ｃはそれぞれ独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（＝Ｏ）、ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ又はＣＨ２Ｏであり、
    Ｑ１Ａ、Ｑ１Ｂ、Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ及びＱ４Ｃはそれぞれ独立して、存在しないか又は置換若しくは非置換のアルキレンであり、
    Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ及びＲ４Ｃはそれぞれ独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒ５）Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ（Ｒ５）ＮＨ、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、複素環、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    であり、
    Ｒ５は水素原子又はアミノ酸側鎖であり、
    ｑ１Ａ、ｑ１Ｂ、ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ及びｑ４Ｃはそれぞれ独立して、０～２０の整数であり、
    ＬＧ１Ａ、ＬＧ１Ｂ、ＬＧ２Ａ、ＬＧ２Ｂ、ＬＧ３Ａ、ＬＧ３Ｂ、ＬＧ４Ａ、ＬＧ４Ｂ及びＬＧ４Ｃはそれぞれ独立して、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    （式中、
    ＲＸ１、ＲＸ２及びＲＸ３はそれぞれ独立して、水素原子又は置換若しくは非置換のアルキルであり、
    ＲＸ４はＯＨ又はＮＨＣＯＲＸ４’（ＲＸ４’は置換又は非置換のアルキル）である）
    である、請求項１記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
  3. 糖誘導体が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    である、請求項２記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
  4. 糖誘導体が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    である、請求項３記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
  5. ヌクレオシド誘導体が、糖の２’位に置換基を有するヌクレオシド及び／又は糖の４’位と２’位との間に架橋構造を有するヌクレオシドである、請求項１～４いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
  6. 該置換基が、F、ＯＣＨ３又はＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である、請求項５記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
  7. 該架橋構造が、４’－（ＣＨ２）ｍ－Ｏ－２’（ｍは１～４の整数）又は４’－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲ６－２’（Ｒ６は、水素原子又はアルキルである）である、請求項５記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
  8. リンカーが、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    （式中、
    Ｌ１はセンス鎖の３’末端及び/又は５’末端に結合し、Ｌ５は糖誘導体に結合する。
    Ｌ１はＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    （式中、Ｒ７はアルキル又はアルキルオキシである）であり、
    Ｌ２はそれぞれ独立して、芳香族環を介していてもよい置換若しくは非置換の炭素数が１～２０のアルキレン又は芳香族環であり、
    Ｌ３はそれぞれ独立して、存在しないか、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ８（Ｒ８は水素又は置換若しくは非置換のアルキルである）、ＮＲ９Ｃ（＝Ｏ）（Ｒ９は水素又は置換若しくは非置換のアルキルであるか、Ｒ９はＬ２のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成してもよい）、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    であり、
    Ｌ４はそれぞれ独立して、存在しないか、芳香族環を介していてもよい置換若しくは非置換の炭素数が１～２０のアルキレン又は芳香族環であり、
    Ｌ５はＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＮＨ又はＯであり、
    ｎは１又は２である）
    である、請求項１～７いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
  9. 請求項１～８いずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物。
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