WO2015103681A1 - L-asparaginase recombinante de zymomonas - Google Patents

L-asparaginase recombinante de zymomonas Download PDF

Info

Publication number
WO2015103681A1
WO2015103681A1 PCT/BR2014/000455 BR2014000455W WO2015103681A1 WO 2015103681 A1 WO2015103681 A1 WO 2015103681A1 BR 2014000455 W BR2014000455 W BR 2014000455W WO 2015103681 A1 WO2015103681 A1 WO 2015103681A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
asparaginase
seq
dnas
recombinant
asparaginases
Prior art date
Application number
PCT/BR2014/000455
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tito Lívio MOITINHO ALVES
Karen EISNFELDT
Isis CAVALCANTE BAPTISTA
Rodrigo VOLCAN ALMEIDA
Elaine Sobral Da Costa
Maria Cecília MENKS RIBEIRO
Marcelo Greradin POIROT LAND
Ariane Leites LARENTIS
Original Assignee
Coppe/Ufrj, Instituto Alberto Luiz Coimbra De Pós-Graduação E Pesquisa De Engenharria
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Coppe/Ufrj, Instituto Alberto Luiz Coimbra De Pós-Graduação E Pesquisa De Engenharria filed Critical Coppe/Ufrj, Instituto Alberto Luiz Coimbra De Pós-Graduação E Pesquisa De Engenharria
Priority to EP14877857.4A priority Critical patent/EP3093344A4/en
Priority to US15/110,697 priority patent/US20160348085A1/en
Publication of WO2015103681A1 publication Critical patent/WO2015103681A1/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C12N9/82—Asparaginase (3.5.1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01001—Asparaginase (3.5.1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to the construction and optimization of the synthetic L-asparaginase gene of Zymomonas sp., Preferably Zymomonas mobilis, as well as the construction of plasmids for expression of the intracellular and extracellular enzyme in bacteria and yeast.
  • the invention relates to the production of this enzyme in submerged culture for use in L-asparaginase-based pharmaceutical preparations used in the treatment of cancer, tumors, cell proliferative diseases, as well as other medical applications.
  • L-asparaginase L-asparagine amino hydrolase, EC 3.5.1.1
  • the antineoplastic activity of L-asparaginase causes exhaustion of exogenous L-asparagine supplies to cells, as malignant cells slowly synthesize L-asparagine compared to their need and rely on an exogenous supply of this amino acid.
  • L-asparaginase obtained from a different microorganism or conjugated to polyethylene glycol
  • a new source of the enzyme L-asparaginase is the bacterium Zymomonas mobilis.
  • the bacterium Zymomonas mobilis is reported to have therapeutic properties. There are reports of therapeutic applications of Zymomonas cultures in cases of bacterial enterocolitis and gynecological infections (Wanik and Silva. Journal of the Antibiotic Institute. 11, 69-71, 1971; Lopes et al. Journal of the Antibiotic Institute. 20, 69- 77, 1980).
  • the bacterium Escherichia coli is one of the most widely used recombinant protein expression systems, including on a commercial scale (Baneyx. Current Opinion in Biotechnology. 10, 411-421, 1999; Terpe. Applied Microbiology and Biotechnology. 72, 211-222, 2006 ), because, in addition to offering several advantages, such as the ability to grow rapidly at high cell concentrations and on cheap substrates, it has well-characterized genetics and there are several commercially available mutant vectors and strains (Baneyx. Current Opinion in Biotechnology.
  • Escherichia coli bacterium is one of the most widely used recombinant protein expression systems, including on a commercial scale (Baneyx. Current Opinion in Biotechnology. 10, 411 -421, 1999; Terpe. Applied Microbiology and Biotechnology. 72, 211-222, 2006 ).
  • Several patent documents use E. coli as a microorganism for expression of recombinant proteins, including L-asparaginases.
  • L-asparaginases As well as some patent documents produce recombinant L-asparaginases of different microorganisms in hosts such as Escherichia coli and yeast.
  • WO2003 / 0186380 describes recombinant methods for producing a polypeptide with at least 70% identity to the Bacillus L-asparaginase amino acid sequence.
  • US2012 / 0100121 relates to the chemically modified form of Erwinia's L-asparaginase enzyme, conjugated to polyethylene glycol molecule, particularly with molecular weight less than or equal to 5000 Da, and its clinical use.
  • US20100284982 describes compositions for transporting L-asparaginase across the erythrocyte cell membrane, the process of preparing such compositions and the method of their clinical use.
  • WO2008 / 011234A2 describes the cloning and production of Escherichia coli L-asparaginase II using Escherichia coli as a host, resulting in a recombinant E.
  • coli strain with an extrachromosomal vector and chromosomal DNA encoding the same L - asparaginase II.
  • WO2010 / 015264A1 reports cloning, production and characterization of Helicobacter pylori CCUG 17874 L-asparaginase enzyme using Escherichia coli as host.
  • Brazilian patent application PI0406168-3 relates to the production of Saccharomyces cerevisiae L-asparaginase by cloning the gene encoding such enzyme into a methylotrophic yeast.
  • Patent application PI 0404952-7 the filer of which is the same as the present application, relates to the process of obtaining the native Zymomonas mobilis L-asparaginase enzyme by cultivating wild Zymomonas mobilis for enzyme production, in which 37.79 Ul / g cell activity was obtained in 33 hours of cultivation.
  • the present invention relates to the construction and optimization of the synthetic Zymomonas mobilis L-asparaginase gene, as well as to the construction of plasmids for expression of the intra and extracellular enzyme in Escherichia colij and the subsequent insertion of these plasmids into Escherichia coli bacteria. enzyme in submerged fermentation.
  • This recombinant enzyme use in pharmaceutical compositions intended for use in medical applications, such as are in the treatment of cancer, tumors and diseases in which cell proliferation is involved, providing an alternative to existing drugs.
  • the products developed in this invention represent a novel way of treating cancer, tumors and diseases in which cell proliferation is involved.
  • the developed techniques provide a high production and productivity gain, which is reflected in lower cost of the final product.
  • Figure 1 shows the alignment using CLUSTAL 2.0.1 Multiple Sequence Alignment software of the l-asparaginase gene (original) with the l-asparaginase gene (optimized). Nucleotides in bold type represent those which are part of the original gene signal peptide and which have been removed from the optimized gene. Underlined nucleotides refer to the histidine tail and enterokinase cleavage site added to the optimized gene.
  • Figure 2 represents the electrophoretic and digestion pattern of plasmids extracted from 3 Escherichia coli BL21 (DE3) / pET26b / asparaginase clones digested with the restriction enzyme (Xho ⁇ ).
  • the arrow indicates the 6368 bp fragment corresponding to the linearized pET26b / asparaginase vector.
  • Figure 3 represents the electrophoretic and digestion pattern of the plasmid extracted from the Escherichia coli BL21 (DE3) / pET28a / asparaginase clone digested with the restriction enzyme (Xho ⁇ ).
  • Figure 4 shows the graph of extracellular L-asparaginase production by Escherichia coli BL21 (DE3) / pET26b / asparaginase bacteria and cell growth in bioreactor using LB medium.
  • the Y axis represents the cell concentration (g / L).
  • the Z axis represents enzymatic activity (IU / mL).
  • the X axis represents time (minutes).
  • ⁇ - Enzyme Activity IU / mL
  • ⁇ - Cellular Concentration g / L
  • the bars represent the standard deviations.
  • Figure 5 presents the graph of intracellular L-asparaginase production by Escherichia coli BL21 (DE3) / pET28a / asparaginase bacteria and cell growth in bioreactor using LB medium.
  • the Y axis represents the cell concentration (g / L).
  • the Z axis represents enzymatic activity (IU / mL).
  • the X axis represents time (minutes).
  • ⁇ - Enzyme Activity IU / mL
  • ⁇ - Cellular Concentration g / L
  • the bars represent the standard deviations.
  • Figure 6 shows the graph of specific activity of intracellular (using Escherichia coli BL21 (DE3) / pET28a / asparaginase) and extracellular (using Escherichia ⁇ l ⁇ BL21 (DE3) / pET26b / asparaginase) activity produced in bioreactor using LB medium.
  • Y axis represents Activity L-Asparaginase Specific (Ul / mg).
  • the X axis represents time (minutes).
  • ⁇ - Intracellular L-Asparaginase (Ul / mg) ⁇ - Extracellular L-Asparaginase (Ul / mg).
  • Figure 7 shows the flow cytometry analysis of cell viability analysis by propidium iodide (PI) labeling in a primary bone marrow sample exposed to different concentrations of recombinant Z mobilis L-asparaginase.
  • the Y axis represents the lateral dispersion of the cells.
  • the X axis represents the fluorescence intensity by PI.
  • 1- control 2- 1.0 IU / ml, 3- 0.5 IU / ml, 4- 0.1 IU / ml, 5- 0.05 IU / ml, 6- 0.025 IU / ml
  • Zymomonas mobilis L-asparaginase a vector for expression of the intracellular enzyme and another vector for expression of the extracellular enzyme.
  • the gene encoding the enzyme L-asparaginase was based on the sequence of Zymomonas mobilis subsp. mobilis ZM4 filed in genbank database ID 3189240 for gene and YP_163418.1 for amino acid sequence which can be accessed at http://www.ncbt.nlm.nih.gov.
  • the Zymomonas mobilis l-asparaginase type II gene was synthesized chemically by Epoch Life Science Inc. The design of the gene was performed from the 11 nucleotide sequence of the Zymomonas mobilis subsp strain gene. mobilis ZM4, deposited in genbank database ID 3189240 and illustrated herein as SEQ ID NO: 2, which sequence encodes a 366 amino acid protein. The gene was synthesized based on the sequence of the Zymomonas mobilis subsp l-asparaginase gene. mobilis ZM4 above, and nucleotides encoding the first 29 amino acids of this sequence are removed as they make part of a signal sequence (signal peptide).
  • nucleotide sequence encoding six histidines, allowing expression of the fused protein with a histidine tail at its N-terminal end.
  • Nucleotides encoding the amino acid sequence were also added: Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, an enterokinase enzyme cleavage site, for subsequent removal of the histidine tail.
  • the codons used in the synthetic gene were optimized for the most frequent codons used by Escher ⁇ chia coli.
  • the synthetic gene flanked by the restriction enzymes ⁇ / col and Xho ⁇ , was inserted into the pET26b vector (Novagen), which has a signal sequence (signal peptide), pelB (native of Erwinia carotovora), to export the protein into space.
  • periplasmic from where it will be secreted into the culture medium.
  • This same synthetic gene flanked by restriction enzymes Nco ⁇ and Xho ⁇ was also inserted into the vector pET28a (Novagen) to express the protein in the cytoplasm.
  • the sequence of the optimized and synthesized gene is illustrated in SEQ ID NO: 1.
  • the sequence of plasmid pET26b containing the optimized gene is illustrated in SEQ ID NO: 3 and the sequence of plasmid pET28a containing the optimized gene is illustrated in SEQ ID NO: 4.
  • the optimized sequence SEQ ID NO: 1 has translation represented in SEQ ID NO: 5.
  • Electrocompetent E. coli DH21a and E. coli BL21 (DE3) cells were used as hosts for the pET26b / asparaginase and pET28a / asparaginase plasmids. The insertion of these plasmids into cells was performed by electroporation. For electroporation were gently mixed to avoid the formation of bubbles, the plasmids and 100 pL of electrocompetent E. coli. Each mixture was transferred to a 0.2 cm thick cuvette between the electrodes, and then subjected to an electrical discharge for about 5 ms, with 2.5 kV voltage, 25 pF capacitance and 200 resistência resistance in one.
  • plasmid-transformed clones was done by spreading the cells on LB agar medium with selective pressure (use of antibiotic, kanamycin). To make the selection, some colonies present on the plate were selected, and each inoculated into 10 mL of liquid LB medium (5 g / L yeast extract, 10 g / L Tryptone, 10 g / L NaCl) with 50 pg / ml kanamycin and 1% glucose and incubated at 37 ° C and 200 rpm for 16 hours. From these cultures were made glycerol stocks (called Mother Bank), stored at -8 ° C, and plasmid extractions to confirm the clones (electrophoretic and digestion standard).
  • liquid LB medium 5 g / L yeast extract, 10 g / L Tryptone, 10 g / L NaCl
  • each recombinant bacterium E coli BL21 (DE3) / p T28a / asparaginase and E coli BL21 (DE3) / pET26b / asparaginase
  • each pre-inoculum was prepared by inoculating 10 pL of the E. coli BL21 (DE3) / pET28a / asparaginase and E ⁇ li BL21 (DE3) / pET26b / asparaginase recombinant bacteria Working Lot into 10 ml LB medium with 1 % glucose and 50 pg / ml kanamycin.
  • the pre-inoculum of each bacterium was incubated for 16 hours at 37 ° C and 200 rpm in 50 mL shake flasks. After 16 hours, the inoculum of each bacterium was prepared with 50 ml LB medium with 1% glucose and 50 pg / ml kanamycin and inoculated with 1 ml pre-inoculum in 250 ml vials. Cultures were incubated at 37 ° C and 200 rpm until they reached the exponential growth phase (600nm absorbance approximately 1.0). At this point, protein expression was induced by 0.55 mM IPTG (isopropyl-PD-thiogalactopyranoside) for 4 hours.
  • IPTG isopropyl-PD-thiogalactopyranoside
  • the precipitates were resuspended by adding 1 mL of 0.02M sodium phosphate buffer, pH 7.3, and then sonicated for five 10-second cycles at 30% amplitude in sonicator. These samples were then used for enzymatic activity analysis.
  • 10 ml of the cell-free culture medium were removed from the cultures after 4 hours of expression. These culture medium samples were concentrated 10-fold and the culture medium was replaced with 0.02 M sodium phosphate buffer pH 7.3 using 10 kDa membrane ultrafiltration units (Amicon Ultra-15, illipore) and centrifugations. at 4000g for 30 minutes.
  • the samples were then used for enzymatic activity analysis.
  • 50 pL of the sample was added to 50 pL of 5 g / L asparagine. This reaction was incubated at 37 ° C for 30 minutes, immediately after this time, 40 ⁇ l of this reaction was added to 10 ⁇ l of 1.5 M TCA (trichloroacetic acid).
  • TCA trichloroacetic acid
  • To this resulting 50 ⁇ l is added 2 mL of a compound reagent. by a mixture of Sodium Salicylate, Sodium Nitroprusside and disodium EDTA and the mixture is stirred. Following, 2 mL of a second reagent composed of Sodium Hypochlorite and Sodium Hydroxide (Tabacco et al. Clinical Chemistry.
  • L-asparaginase enzyme was produced in bioreactors.
  • a bioreactor was used for Cultivation of recombinant E. coli bacteria * BL21 (DE3) / pET28a / asparaginase and enzyme production in the bacterial cytoplasm
  • another btorreator was used for the cultivation of E. coli recombinant bacteria BL21 (DE3) / pET26b / asparaginase and enzyme production in the culture medium.
  • Two pre-inocula were made, one with E. coli BL21 (DE3) / pET28a / asparaginase and one with E. coli BL21 (DE3) / pET26b / asparaginase.
  • recombinant L-asparaginase For treatment with recombinant L-asparaginase, cells were washed with RPMI 1640 culture medium, centrifuged and resuspended in RPMI 1640 culture medium without L-glutamine supplemented with 20% fetal bovine serum, 2 mmol / L L-glutamine. 100 IU / mL penicillin and 100 vglmL streptomycin. Cells were inoculated into 24-well tissue culture plates, 10 6 cells / well in 1 ml medium with increasing concentrations of recombinant L-asparaginase. In the control no enzyme was added. Both were incubated at 37 ° C in a humid 5% CO2 atmosphere for 48h.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

A presente invenção relata a construção e otimização de genes sintéticos a partir do gene de L-asparaginase de Zymomonas mobilis, sua clonagem e expressão em Escherichia coli. A obtenção de tal enzima tem por objetivo produzir altos níveis de uma nova L-asparaginase para uso em composições farmacêuticas a base de L-asparaginase a serem utilizadas no tratamento de câncer, tumores, doenças com proliferação celular, assim como outras aplicações médicas.

Description

L-ASPARAGINASE RECOMBINANTE DE ZYMOMONAS
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se à construção e otimização do gene de L- asparaginase sintético de Zymomonas sp., preferencialmente Zymomonas mobilis, bem como a construção de plasmídeos para expressão da enzima intracelular e extracelular em bactéria e levedura. A invenção relata a produção desta enzima, em cultivo submerso, para uso em preparações farmacêuticas a base de L-asparaginase utilizadas no tratamento de câncer, tumores, doenças com proliferação celular, assim como outras aplicações médicas.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Para o tratamento de uma variedade de desordens linfoproliferativas e linfomas, principalmente para leucemia linfoblástica aguda (ALL), a enzima L- asparaginase (L-asparagina amino hidrolase, E.C. 3.5.1.1) é utilizada como agente quimioterapêutico (Narta et al. Criticai Reviews in Oncology/Hematology. 61, 208-221 , 2007; Verma et al. Criticai Reviews in Biotechnology. 27, 45-62, 2007). A atividade antineoplásica da L-asparaginase faz com que ocorra o esgotamento dos suprimentos exógenos de L-asparagina para as células, uma vez que as células malignas sintetizam lentamente L-asparagina em comparação com a sua necessidade e dependem de um fornecimento exógeno deste aminoácido. Já as células normais conseguem sintetizar normalmente o aminoácido necessário, e então não são prejudicadas pelo uso da L- asparaginase (Lee et al. Applied Biochemistry and Biotechnology. 22 (1), 1-11 , 1989; Duval et al. Blood. 99 (8), 2734-2739, 2002; Kotzia e Labrou. Journal of Biotechnology. 119, 309-323, 2005, Rizzari et al. Current Opinion in Oncology. 25, S1-S9, 2013).
No mercado, estão disponíveis formulações da enzima nativa obtidas através dos microrganismos Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi e da L- asparaginase de E. coli conjugada ao polietilenoglicol (PEG) (Kurtzberg. In: Holland-Frei Câncer Medicine, 5 ed., Editora Hamilton (ON): BC Decker, 2000, Van Den Berg. Leukemia & Lymphoma, 52 (2), 168-178, 2011). Durante o tratamento, o principal problema no uso de L-asparaginase é a hipersensibilidade clínica desenvolvida pelos pacientes tratados com formas não modificadas da enzima. Estudos feitos com L-asparaginases de £ coli e Erwinia chrysanthemi mostraram que ambas enzimas apresentam alta imunogenicidade (Narta et al. Criticai Revie s in Oncology/Hematology. 61 , 208-221, 2007). No entanto, estas enzimas (provenientes de E. coli e Erwinia chrysanthemi) servem como alternativa caso o paciente desenvolva sensibilidade a uma delas (Kotzia e Labrou. Journal of Biotechnology. 119, 309-323, 2005, Rizzari et al. Current Opinion in Oncology. 25, S1-S9, 2013). Outra alternativa, para o problema da hipersensibilidade, é a utilização de outro tipo de L-asparaginase (obtida de microrganismo diferente ou conjugada ao polietilenoglicol), por este motivo é muito importante a busca por novas fontes de L-asparaginase que apresentem atividade antileucêmica. Uma nova fonte da enzima L-asparaginase é a bactéria Zymomonas mobilis.
A bactéria Zymomonas mobilis é relatada por ter propriedades terapêuticas. Há relatos de aplicações terapêuticas de culturas de Zymomonas em casos de enterocolites bacterianas e infecções ginecológicas (Wanik e Silva. Revista do Instituto de Antibióticos. 11, 69-71, 1971; Lopes et al. Revista do Instituto de Antibióticos. 20, 69-77, 1980).
No entanto, a baixa produtividade da enzima L-asparaginase por Z. mobilis torna-se um obstáculo para o estudo e produção da enzima a partir deste microrganismo. Este obstáculo pode ser superado pela produção da enzima recombinante, em altas concentrações, utilizando engenharia genética.
Para atender a demanda industrial, proteínas de interesse podem ser produzidas em elevadas quantidades através da utilização da engenharia genética (Demain e Vaishnav. Biotechnology Advances. 27, 297-306, 2009). A bactéria Escherichia coli é um dos mais utilizados sistemas de expressão de proteínas recombinantes, inclusive em escala comercial (Baneyx. Current Opinion in Biotechnology. 10, 411-421, 1999; Terpe. Applied Microbiology and Biotechnology. 72, 211-222, 2006), isto porque, além de oferecer várias vantagens, como a capacidade de crescer rapidamente em altas concentrações celulares e em substratos baratos, possui genética bem caracterizada e existem vários vetores e cepas mutantes disponíveis comercialmente (Baneyx. Current Opinion in Biotechnology. 10, 411-421, 1999; Peti e Page. Protein Expression and Purification. 51 , 1-10, 2007). Além disso, as células de E, coli têm capacidade de acumular mais de 80% da sua massa seca em proteína recombinante (Demain e Vaishnav. Biotechnology Advances. 27, 297-306, 2009).
TÉCNICA RELACIONADA
A técnica de manipulação genética tem sido amplamente utilizada para desenvolver sistemas de produção dos mais diferentes tipos de proteínas com diversas finalidades. O livro Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.) descreve detalhadamente o processo de manipulação genética para obtenção de células reGombinantes;
A bactéria Escherichia coli é um dos mais utilizados sistemas de expressão de proteínas recombinantes, inclusive em escala comercial (Baneyx. Current Opinion in Biotechnology. 10, 411 -421 , 1999; Terpe. Applied Microbiology and Biotechnology. 72, 211-222, 2006). Vários documentos de patente utilizam E. coli como micro-organismo para expressão de proteínas recombinantes, incluindo L-asparaginases. Assim como alguns documentos de patente produzem L-asparaginases recombinantes de diferentes microorganismos em hospedeiros como Escherichia coli e leveduras. No entanto, não existem documentos que relatem a clonagem e expressão da L-asparaginase recombinante de Zymomonas sp. em qualquer micro-organismo.
No documento de patente WO2003/0186380 são descritos métodos recombinantes para a produção de um polipeptídeo com o mínimo de 70% de identidade com a sequência de aminoácidos de L-asparaginase de Bacillus
Figure imgf000004_0001
Existem documentos que relatam invenções de formas modificadas de L- asparaginase. A invenção US2012/0100121 se refere forma quimicamente modificada da enzima L-asparaginase de Erwinia, conjugada a molécula de polietilenoglicol, particularmente com peso molecular menor ou igual a 5000 Da, e seu uso clínico. O documento US20100284982 descreve composições para o transporte de L-asparaginase através da membrana celular de eritrócitos, o processo de preparação dessas composições e o método de sua utilização clínica. No documento de patente WO2008/011234A2 é descrita a clonagem è produção de L-asparaginase II de Escherichia coli utilizando Escherichia coli como hospedeiro, resultando em uma cepa recombinante de E. coli com um vetor extracromossomal e o DNA cromossomal que codificam para a mesma L- asparaginase II. O documento WO2010/015264A1 relata a clonagem, produção e caracterização da enzima L-asparaginase de Helicobacter pylori CCUG 17874 utilizando Escherichia coli como hospedeiro. Já o pedido de patente brasileiro PI0406168-3 refere-se a produção de L-asparaginase de Saccharomyces cerevisiae por meio de clonagem do gene que codifica para tal enzima em uma levedura metilotrófica. O pedido de patente PI 0404952-7, cuja depositante é a mesma do presente pedido, refere-se ao processo de obtenção da enzima L- asparaginase nativa de Zymomonas mobilis, por meio de cultivo da Zymomonas mobilis selvagem para produção da enzima, no qual foi obtida atividade de 37,79 Ul/g de célula em 33 horas de cultivo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a construção e otimização do gene de L- asparaginase sintético de Zymomonas mobilis, bem como a construção de plasmídeos para expressão da enzima intra e extracelular em Escherichia colij a posterior inserção destes plasmídeos na bactéria Escherichia coli e a produção da enzima, em fermentação submersa. A obtenção desta enzima recombinante visa uso em composições farmacêuticas a serem utilizadas em aplicações médicas, tais comos no tratamento do câncer, de tumores e de doenças em que a proliferação celular esteja envolvida, possibilitando uma alternativa aos medicamentos já existentes.
Os produtos desenvolvidos nesta invenção representam uma nova forma de se tratar câncer, tumores e doenças em que a proliferação celular esteja envolvida. Além disso, as técnicas desenvolvidas proporcionam um elevado ganho de produção e produtividade, que se refletem em custo mais baixo do produto final.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A Figura 1 mostra o alinhamento, utilizando o software CLUSTAL 2.0.1 Multiple Sequence Alignment, do gene l-asparaginase (original) com o gene l-asparaginase (otimizado). Os nucleotídeos grifados em negrito representam aqueles que fazem parte do peptídeo sinal do gene original e que foram retirados do gene otimizado. Os nucleotídeos sublinhados são referentes a cauda de histidina e ao sítio de clivagem de enteroquinase adicionados ao gene otimizado.
A Figura 2 representa o padrão eletroforético e de digestão dos plasmídeos extraídos de 3 clones de Escherichia coli BL21(DE3)/pET26b/asparaginase, digeridos com a enzima de restrição (Xho\). M- Marcador GeneRuler™ 1kb DNA Ladder (Fermentas), i- vetor pET26b/asparaginase intacto, d- vetor pET26b/asparaginase digerido com a enzima Xho\. A seta indica o fragmento de 6368 pb correspondente ao vetor pET26b/asparaginase linearizado.
A Figura 3 representa o padrão eletroforético e de digestão do plasmídeo extraído do clone de Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a/asparaginase, digerido com a enzima de restrição (Xho\). M- Marcador GeneRuler™ 1kb DNA Ladder (Fermentas), 1- vetor pET28a/asparaginase intacto, 2- vetor pET28a/asparaginase digerido com a enzima Xho A seta indica o fragmento de 6301 pb correspondente ao vetor pET28a/asparaginase linearizado,
A Figura 4 apresenta o gráfico de produção de L-asparaginase extracelular pela bactéria Escherichia coli BL21(DE3)/pET26b/asparaginase e o crescimento celular em bioreator utilizando meio LB. O eixo Y representa a concentração celular (g/L). O eixo Z representa a atividade enzimática (UI/mL). O eixo X representa o tempo (minutos). ■- Atividade Enzimática (UI/mL); ♦ - Concentração Celular (g/L). As barras representam os desvios padrões.
A Figura 5 apresenta o gráfico de produção de L-asparaginase intracelular pela bactéria Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a/asparaginase e o crescimento celular em bioreator utilizando meio LB. O eixo Y representa a concentração celular (g/L). O eixo Z representa a atividade enzimática (UI/mL). O eixo X representa o tempo (minutos). ■- Atividade Enzimática (UI/mL); ♦ - Concentração Celular (g/L). As barras representam os desvios padrões.
A Figura 6 apresenta o gráfico de atividade específica de L-asparaginase intracelular (utilizando Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a/asparaginase) e extracelular (utilizando Escherichia ∞lí BL21(DE3)/pET26b/asparaginase) produzidas em bioreator utilizando meio LB. O eixo Y representa a Atividade Específica de L-asparaginase (Ul/mg). O eixo X representa o tempo (minutos). ■- L-asparaginase intracelular (Ul/mg);♦ - L-asparaginase extracelular (Ul/mg). A Figura 7 apresenta o gráfico de análise de viabilidade celular por citometria de fluxo, através da marcação com iodeto de propídeo (PI), em amostra primária de medula óssea exposta a diferentes concentrações da L- asparaginase recombinante de Z mobilis. O eixo Y representa a dispersão lateral das células. O eixo X representa a intensidade de fluorescência por PI. 1- controle, 2- 1,0 Ul/ml, 3- 0,5 Ul/ml, 4- 0,1UI/ml, 5- 0,05UI/ml, 6- 0,025 UI/mL
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Foram construídos 2 vetores, contendo ò gene quê codifica para a enzima
L-asparaginase de Zymomonas mobilis, um vetor para expressão da enzima intracelular e outro vetor para expressão da enzima extracelular. Em ambos os vetores o gene que codifica a enzima L-asparaginase foi baseado na sequência de Zymomonas mobilis subsp. mobilis ZM4 depositada no banco de dados genbank com referência ID 3189240 para o gene e YP_163418.1 para a sequência de aminoácidos, o qual pode ser acessado no endereço http://www.ncbt.nlm.nih.gov. Através da inserção destes vetores em Escherichia coli foram obtidos dois clones distintos, ambos capazes de expressar a proteína L-asparaginase recombinante.
A invenção será detalhada por meio de exemplos no texto a seguir. A invenção não é limitada pelos exemplos apresentados a seguir, sendo estes exemplos de caráter ilustrativo, para melhor compreensão da invenção relatada no presente documento.
Exemplo 1 - Síntese do gene l-asparaginase
O gene l-asparaginase tipo II de Zymomonas mobilis foi sintetizado quimicamente pela empresa Epoch Life Science Inc. O desenho do gene foi realizado a partir da sequência de 1 01 nucleotídeos do gene da cepa Zymomonas mobilis subsp. mobilis ZM4, depositada no banco de dados genbank com referência ID 3189240 e ilustrada neste documento como SEQ ID NO: 2, sequencia esta, que codifica uma proteína de 366 aminoácidos. O gene foi sintetizado com base na sequência do gene l-asparaginase de Zymomonas mobilis subsp. mobilis ZM4 referido acima, sendo retirados os nucleotídeos que codificam os primeiros 29 aminoácidos desta sequência, já que estes fazem parte de uma sequência sinalizadora (peptídeo sinal). A esta sequência foi adicionada uma sequência de nucleotídeos que codificam seis histidinas, permitindo a expressão da proteína fusionada com uma cauda de histidina na sua extremidade N-terminal. Também foram adicionados nucleotídeos que codificam a sequência de aminoácidos: Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, um sítio de clivagem da enzima enteroquinase, para posterior retirada da cauda de histidina. Os códons utilizados no gene sintético foram otimizados para os códons mais frequentes utilizados por Escheríchia coli. O gene sintético, flanqueado pelas enzimas de restrição Λ/col e Xho\ foi inserido no vetor pET26b (Novagen), o qual possui uma sequência sinalizadora (peptídeo sinal), pelB (nativo de Erwinia carotovora), para exportar a proteína para o espaço periplasmátíco, de onde será secretada para o meio de cultivo. Este mesmo gene sintético flanqueado pelas enzimas de restrição Nco\ e Xho\, também foi inserido no vetor pET28a (Novagen) para expressar a proteína no citoplasma. A sequência do gene otimizado e sintetizado é ilustrada na SEQ ID NO: 1. A sequencia do plasmídeo pET26b contendo o gene otimizado é ilustrada na SEQ ID NO: 3 e a sequência do plasmídeo pET28a contendo o gene otimizado é ilustrada na SEQ ID NO: 4. A sequência otimizada SEQ ID NO: 1 , possui tradução representada na SEQ ID NO: 5.
O alinhamento do gene l-asparaginase original (SEQ ID NO: 2) com o gene l-asparaginase otimizado (SEQ ID NO: 1 ) é apresentado na Figura 1.
Exemplo 2 - Transformação em Escheríchia coli
Células de £ coli DH5a e E. coli BL21(DE3) eletrocompetentes forma utilizadas como hospedeiros para os plasmídeos pET26b/asparaginase e pET28a/asparaginase. A inserção destes plasmídeo nas células foi realizada por eletroporação. Para a eletroporação foram misturados delicadamente, para evitar a formação de bolhas, os plasmídeos e 100 pL de E. coli eletrocompetente. Cada mistura foi transferida para uma cubeta de 0,2 cm de espessura entre os eletrodos, e então submetida a uma descarga elétrica por cerca de 5 ms, com voltagem de 2,5 kV, capacitância de 25 pF e resistência de 200 Ω em um eletroporador Gene Pulser® II (Bio-Rad). Após o choque elétrico, rapidamente foram adicionados 1 mL de meio LB estéril e a mistura foi incubada a 37°C, sob agitação de 200 rpm, por 1 hora. Depois deste período, 200pL da mistura foram espalhada em placa de LB Agar contendo 50 pg/mL de canamictna. As placas foram incubadas em estufa a 37°C por 16 horas. Este procedimento foi realizado primeiramente com a cepa E. coli DH5et e depois da confirmação dos clones, os plasmídeos foram extraídos e transformados na cepa de expressão, E. coli BL21 (DE3).
A seleção dos clones transformados com os plasmídeos foi feita através do espalhamento das células em meio LB ágar com pressão seletiva (uso de antibiótico, canamicina). Para fazer a seleção, algumas colónias presentes na placa foram selecionadas, e cada uma inoculada em 10 mL de meio LB líquido (5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de triptona, 10 g/L de NaCI) com 50 pg/mL de canamicina e 1 % de glicose e incubadas a 37°C e 200 rpm por 16 horas. A partir destes cultivos foram feitos os estoques de glicerol (chamados de Banco Mãe), armazenados a -8Q°C, e as extrações plasmidiais para a confirmação dos clones (padrão eletroforético e de digestão). O padrão eletroforético e de digestão dos clones Escheríchia coli BL21 (DE3)/pET26b/asparaginase e Escherichia coli BL21 (DE3)/pET28a/asparaginase são mostrados nas Figuras 2 e 3, respectivamente. Após a confirmação dos clones, foram feitos os estoques de glicerol chamados de Lote de Trabalho. Para tanto foram inoculados 10 pL do Banco Mãe em 10 mL de meio LB, com 1% de glicose e 50 pg/mL de canamicina, e incubados a 37°C sob agitação de 200 rpm, até atingirem Absorbância (600nm) de aproximadamente 1 ,0. Foram preparadas várias alíquotas com 500 pL do cultivo e 500 pL de glicerol 50% estéril. As alíquotas (Lote de Trabalho) foram estocadas a -80°C.
Exemplo 3 - Análise da expressão da L-asparaginase em frascos agitados
Para analisar a expressão da enzima L-asparaginase foram realizados cultivos em triplicata de cada bactéria recombinante (E coli BL21 (DE3)/p T28a/asparaginase e E coli BL21 (DE3)/pET26b/asparaginase) em frascos agitados. Para tanto, cada pré-inóculo foi preparado inoculando 10 pL do Lote de Trabalho das bactérias recombinantes E. coli BL21(DE3)/pET28a/asparaginase e E∞li BL21(DE3)/pET26b/asparaginase em 10 mL de meio LB com 1 % de glicose e 50 pg/mL de canamicina. O pré-inóculo de cada bactéria foi incubado por 16 horas a 37°C e 200 rpm, em frascos agitados de 50 mL. Após as 16 horas, o inoculo de cada bactéria foi preparado com 50 mL de meio LB com 1% de glicose e 50 pg/mL de canamicina e inoculados com 1mL do pré-inóculo, em frascos de 250 mL. Os cultivos foram incubados a 37°C e 200 rpm até atingirem a fase exponencial de crescimento (Absorbância 600nm aproximadamente 1 ,0). Neste ponto, a expressão da proteína foi induzida por 0,55 mM de IPTG (isopropil-P-D-tiogalactopiranosídeo) por 4 horas. No final das 4 horas de expressão o crescimento celular dos cultivos foi avaliado através de Absorbância 600nm (Abs600nm). Foram retiradas amostras de 1 mL dos cultivos E. coli BL21(DE3)/pET28a/asparaginase e de 10mL dos cultivos de E. coli BL21 (DE3)/pET26b/asparaginase para analisar a expressão de L-asparaginase através de atividade enzimática. Para avaliar a expressão da proteína obtida a partir da bactéria E. coli BL21(DE3)/pET28a/asparaginase foram utilizados os precipitados celulares obtidos das amostras de 1 mL retiradas dos cultivos após as 4 horas de expressão. Os precipitados foram ressuspensos adicionando 1 mL de tampão fosfato de sódio 0.02M, pH 7,3, e então submetidos a ultra-som por cinco ciclos de 10 segundos com amplitude de 30% em sonicador. Estas amostras foram então utilizadas para análise de atividade enzimática. Para avaliar a expressão da proteína obtida a partir da bactéria E. coli BL21(OE3)/pET26b/asparaginase foram utilizados 10 mL do meio de cultivo livre de células, retirados dos cultivos após as 4 horas de expressão. Estas amostras do meio de cultivo foram concentradas 10 vezes e o meio de cultivo foi substituído por tampão fosfato de sódio 0,02 M pH 7,3, utilizando unidades de ultrafiltração com membrada de 10 kDa (Amicon Ultra-15, illipore) e centrifugações a 4000g por 30 minutos. As amostras foram então utilizadas para análise de atividade enzimática. Para as análises de atividade enzimática, 50 pL da amostra foram adicionados a 50 pL de asparagina 5 g/L. Esta reação foi incubada a 37°C por 30 minutos, imediatamente após este tempo, 40 pL desta reação foram adicionados a 10 pL de TCA (ácido tricíoroacético) 1,5 M. A estes 50 pL resultantes são adicionados 2 mL de um reagente composto por uma mistura de Salicilato de Sódio, Nitroprussiato de Sódio e EDTA dissódico e a mistura é agitada. Na sequencia são adicionados 2 mL de um segundo reagente composto por Hipoclorito de Sódio e Hidróxido de Sódio (Tabacco et ai. Clinicai Chemistry. 25 (2), 336-337, 1979). Isto porque os íons amónio na presença destes reagentes formam um composto cromógeno azul esverdeado. A mistura é incubada a 37°C por 5 minutos. A amostra é então submetida a leitura de absorbância no comprimento de onda de 600nm. A partir de uma curva padrão foram determinadas as concentrações do íon amónio liberado durante a reação enzimática. Uma unidade internacional de asparaginase (Ul) foi definida como a quantidadede enzima capaz de liberar 1 μιηοΙ de amónia por minuto a 37°C e pH 7,3. Os resultados obtidos nestes experimentos, tanto crescimento celular, quanto expressão de L-asparaginase, podem ser visualizados na Tabela 1 e 2. Os resultados de atividade enzimática são apresentados como UI/mL de meio de cultivo.
TABELA 1
Média da Concentração Desvio
Bactéria Recombinante
celular (g/L) Padrão
E.coli BL21 (DE3)/pET28a/asparaginase 0,4565 0,018
E.coli BL21 (DE3)/pET26b/asparaginase 0,8986 0,011
TABELA 2
Desvio
Bactéria Recombinante UI/mL (média)
Padrão
E.coli BL21 (DE3)/pET28a/asparaginase 7,630 0,844
E.coli BL21 (DE3)/pET26b/asparagínase 0,189 0,038
Os resultados obtidos nestes experimentos mostram que o gene de L- asparaginase de Zymomonas mobilis foi expresso em ambas as bactérias recombinantes produzidas. A L-asparaginase foi secretada no meio de cultivo quando a bactéria recombinante E. coli BL21(DE3)/pET26b/asparaginase foi utilizada para a expressão, e quando a outra bactéria recombinante produzida neste trabalho (£. coli BL21(DE3)/pET28a/asparaginase) foi utilizada, ocorreu a expressão da proteína no citoplasma.
Exemplo 4 - Produção de L-asparaginase em Bioreator
A enzima L-asparaginase foi produzida em bioreatores. Um bioreator foi utilizado para o Cultivo da bactéria * recombinante E. coli BL21(DE3)/pET28a/asparaginase e produção da enzima no citoplasma da bactéria, outro btorreator foi utilizado para o cultivo da bactéria recombinante E. coli BL21(DE3)/pET26b/asparaginase e produção da enzima no meio de cultura. Foram feitos dois pré-inóculos, um com a bactéria E. coli BL21(DE3)/pET28a/asparaginase e outro com a bactéria E. coli BL21(DE3)/pET26b/asparaginase. Para tanto, 10 pL do Lote de Trabalho das bactérias foram inoculados em 50 mL de meio LB com 1 % de glicose e 50 pg/mL de canamicina em frascos de 250 mL. O pré-inóculo de cada bactéria foi incubado por 16 horas a 37°C com agitação de 200 rpm. Após este tempo, foram utilizados 8 mL do pré-inóculo para inocular o biorreator contendo 400mL de meio LB com 1% de glicose e 50 pg/mL de canamicina. Os cultivos foram conduzidos a 37°C sob agitação de 200 rpm - 800 rpm. O pH dos cultivos foi mantido em 7,0. Quando o crescimento celular atingiu Absorbância 600nm de aproximadamente 2,0, a expressão da proteína foi induzida por 0,55 mM de IPTG por 4 horas. Foram retiradas amostras a cada hora para avaliar o crescimento celular através de medidas de Absorbância 600nm e depois da indução foram também retiradas amostras para avaliar a expressão da proteína através de análise de atividade enzimática. As análises de atividade enzimática foram conduzidas conforme descrito anteriormente na análise das amostras retiradas dos experimentos em frascos agitados.
No cultivo utilizando a cepa E. coli BL21(DE3)/pET26b/asparaginase com produção da L-asparaginase extracelular foi obtida atividade de 0,132 UI/mL de meio de cultivo ou 172,7 Ul/g de célula após 4 horas de indução da expressão. Os resultados de crescimento celular e produção de proteína deste cultivo são apresentados na Figura 4. No cultivo utilizando a cepa E. coli BL21(DE3)/pET28a/asparaginase com produção da L-asparaginase intracelular foi obtida atividade de 3,57 UI/mL de meio de cultivo ou 5185 Ul/g de célula após 4 horas de indução da expressão. Os resultados de aescimento celular e produção de proteína deste cultivo são apresentados na Figura 5. Também são apresentados os valores de atividade específica de cada cultivo (Ul/mg de proteína total), L-asparaginase extracelular e intracelular, na Figura 6.
Destaca-se que os valores de produção de L-asparaginase apresentados no presente pedido de patente são superiores aos apresentados pelo micro- organismo nativo desta L-asparaginase {Zymomonas mobilis), conforme cultivo em meio líquido em frascos agitados, descrito no pedido de patente brasileiro PI 0404952-7, cuja depositante é a mesma do presente pedido, no qual foi obtida atividade de 37,79 Ul/g de célula em 33 horas de cultivo. Está claro que após a nossa intervenção, apresentada no presente pedido de patente, foi possível obter aproximadamente 135 vezes mais Ul/g de célula, em um tempo 4 vezes menor.
Exemplo 5 - Análises de citotoxicidade de L-asparaginase
Nestes experimentos foi utilizada a enzima L-asparaginase recombinante de Z. mobilis produzida pela bactéria recombinante £ co/f BL21(DE3)/pET26b/asparaginase descrita no presente pedido de patente. Para verificar a citotoxicidade in vitro de L-asparaginase sobre as células leucêmicas de um paciente com Leucemia Linfoblástica Aguda, foi utilizada uma amostra primária de medula óssea obtida ao diagnóstico. Foram obtidas células mononucleares, de amostra de medula óssea humana de uma paciente de 4 anos de idade portadora de Leucemia Linfoblástica Aguda, no momento de seu diagnóstico, isoladas por um gradiente de densidade por Ficoll-Paque. Para o tratamento com L-asparaginase recombinante, as células foram lavadas com meio de cultura RPMI 1640, centrifugadas e ressuspensas em meio de cultura RPMI 1640 sem L-glutamina, suplementado com 20% de soro fetal bovino, 2 mmol/L L-glutamina, 100 UI/mL penicilina e 100 vglmL de estreptomicina. As células foram inoculadas em placas de cultura de tecidos de 24 poços, 106 células/poço em 1 mL de meio com concentrações crescentes da L- asparaginase recombinante. No controle nâo foi adicionada a enzima. Ambos foram incubados a 37°C em atmosfera úmida 5% CO2 por 48h. Após este período, foram feitas análises de viabilidade celular por citometria de fluxo. Para avaliar a viabilidade, as células foram marcadas com iodeto de propídeo (PI). Antes da aquisição, foi adicionado às amostras, um padrão composto de dois tipos de microesferas fluorescentes. A aquisição de dados foi feita usando o software FACSDIVA em um citômetro de fluxo FACSCANTO II (Becton Dickinson, Sans José, CA, USA). A análise de dados foi realizada usando o programa Infinicyte (Cytognos SL, Salamanca, Espanha). O efeito das diferentes concentrações testadas sobre a viabilidade celular, é mostrado através da marcação pelo fluoroforo iodeto de propídeo (PI) na Figura 7, sendo que as células mortas são marcadas por PI e emitem fluorescência. O número de eventos e os percentuais de morte são apresentados na Tabela 3. Observou-se que o percentual de células mortas nas amostras que receberam tratamento foi maior que no controle para todas as concentrações utilizadas da enzima, atingindo mais de 80% de morte na concentração 1,0 UI/mL, mas já chega a aproximadamente 79% na concentração de 0,1 UI/mL
TABELA 3
Concentração Número de Número de % células
%Microesferas
(UI/mL) eventos células mortas mortas
1,0 140.608 100.769 12.18 80.78
0,5 189.904 107.939 12.56 79.42
0,1 143.780 98.944 11.53 78.94
0,05 133.302 73.271 15.46 68.71
0,025 113.126 74.911 16.95 75.33
0,00* 129.324 38.851 16.01 30.04
*Controle
A descrição que se fez até aqui do processo de produção de L- asparaginases por meio da construção de genes sintéticos e sua inserção em Escherichia coli, objeto da presente invenção, deve ser considerada apenas como uma possível ou possíveis concretizações, e quaisquer características particulares nelas introduzidas devem ser entendidas como ilustrativas, visando apenas facilitar a compreensão. Desta forma, não podem de forma alguma ser consideradas como limitantes da invenção, a qual está limitada ao escopo das reivindicações que seguem. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
SEQ ID NO: 1.
>l-asparaginase otimrzado
atgggccacc atcatcatca ccactccagc ggtcatatcg acgatgatga caaaatgaac aatcaggttc actctatcca aactctgccg cgtatcctgg tgctggcaac cggcggtacc atctctggca agaagaacgg catgtccgaa attggttata acgcaggcgg tgttactggc aagcagctgg tagaagacat tccagaactg gcgaaactgg cagaaatcaa cgtagagcag atcgcgaaca ttggtagcca ggacatgaac gatgcaatct ggctgcgcct ggcgaagcgt atccaggatg cggtagcgca caatgaagca gatggcatcg tgatcaccca cggtaccgat actatggaag aaaccgcatt cttcctggac accgttattc gtaccgataa accgatcatc ctgaccggtg caatgcgtcc gtccaccgca atcggtgccg acggtccggc taacctgtac gaagcaatcg aagtggcagc gaccccgaaa gcaaaggacc acggtgtaat gattgttatg aacgatacca ttcatgcggc gcgttgggca tctaagaccc acactactgc cgtagaaacc ttccagtcta tcaacgctgg cccgatcggt tatgtagacc cggcatctgt tcgtttcatt gaaccgaaga agcagccggt tccgtcctat ggtctgccga ccactgcccc gctgccggcg gtggaaatcc tgtatgcaca ctctggcatg ggcgcttcca tcatcaacga tctgattaaa accggcgtaa aaggcatcat tctggcaggc gtgggtgatg gtaactcctc taaagaagca atggctgcac tgaacctggc ggttaaacaa ggtgtgattg ttgtacgttc tagccgtacc ggtagcggtt tcgtaaaccg taacgttgaa gtaaacgacg ataagaacga ttttgtggtg agctatgacc tgagcccgca gaaggctcgc atcctgctgc aaatcctgat cgccaatggc aagaacaagc tgagcgatat ccagagcgca ttcgaagcgg gtttctaa
SEQ ID NO: 2
atgatgattt ttaaaatccc tgttaaggcc tcttctgctg cggccttggc aatatgcatg atgatggggg ctactccggc gatatctatg aataatcagg ttcattcaat tcagacgtta ccgcgcattt tagttctggc aacgggcggc acgatttccg gcaagaaaaa tggaatgtct gaaatcggct ataatgcagg cggcgttact ggaaaacagc tcgttgaaga tataccggaa ttagctaaac tcgctgaaat caatgtcgaa caaattgcca atatcggctc gcaagatatg aatgatgcga tatggctgcg cttggccaag cgcatccaag acgccgtcgc ccataacgaa gcggatggta ttgtgattac ccatggcacc gataccatgg aagaaaccgc ctttttcctt gatacggtta ttcgcaccga caagccgatt attctgacag gcgccatgcg ccctagcact gccattggtg cagatggtcc cgccaattta tatgaggcga ttgaagtcgc ggccaccccc aaggccaaag atcatggcgt catgatcgtc atgaatgaca ctattcatgc agccagatgg gcaagcaaaa cccacacaac cgccgtcgaa acctttcagt ccatcaatgc aggacctatc ggttatgtcg atccggcttc ggtgcggttt attgagccga aaaaacagcc tgtcccaagc tatggccttc cgacgactgc gcctttgcct gcggtcgaaa tcctttacgc ccatagcggt atgggggctt caattatcaa tgatctcatc aaaacgggcg tgaaaggcat tattcttgcc ggtgttggtg acgggaatag ttcaaaagaa gcgatggctg ccctcaatct tgccgtcaaa caaggcgtga ttgttgtgcg ttcatccaga accggatcag gctttgtgaa tcgcaatgtc gaggtcaatg atgacaaaaa cgactttgtt gtctcttatg atctttcgcc ccagaaagcc cgcatccttc ttcagatttt aatagccaat ggcaaaaaca aactttctga tatccaatct gcatttgaag ctggttttta a
SEQ ID NO: 3. >sequencia pET26b/asparaginase otimizado
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagttagaaa cccgcttcga atgcgctctg gatatcgctc agcttgttct tgccattggc gatcaggatt tgcagcagga tgcgagcctt ctgcgggctc aggtcatagc tcaccacaaa atcgttctta tcgtcgttta cttcaacgtt acggtttacg aaaccgctac cggtacggct agaacgtaca acaatcacac cttgtttaac cgccaggttc agtgcagcca ttgcttcttt agaggagtta ccatcaccca cgcctgccag aatgatgcct tttacgccgg ttttaatcag atcgttgatg atggaagcgc ccatgccaga gtgtgcatac aggatttcca ccgccggcag cggggcagtg gtcggcagac cataggacgg aaccggctgc ttcttcggtt caatgaaacg aacagatgcc gggtctacat aaccgatcgg gccagcgttg atagactgga aggtttctac ggcagtagtg tgggtcttag atgcccaacg cgccgcatga atggtatcgt tcataacaat cattacaccg tggtcctttg ctttcggggt cgctgccact tcgattgctt cgtacaggtt agccggaccg tcggcaccga ttgcggtgga cggacgcatt gcaccggtca ggatgatcgg tttatcggta cgaataacgg tgtccaggaa gaatgcggtt tcttccatag tatcggtacc gtgggtgatc acgatgccat ctgcttcatt gtgcgctacc gcatcctgga tacgcttcgc caggcgcagc cagattgcat cgttcatgtc ctggctacca atgttcgcga tctgctctac gttgatttct gccagtttcg ccagttctgg aatgtcttct accagctgct tgccagtaac accgcctgcg ttataaccaa tttcggacat gccgttcttc ttgccagaga tggtaccgcc ggttgccagc accaggatac gcggcagagt ttggatagag tgaacctgat tgttcatttt gtcatcatcg tcgatatgac cgctggagtg gtgatgatga tggtggccca tggccatcgc cggctgggca gcgaggagca gcagaccagc agcagcggtc ggcagcaggt atttcatatg tatatctcct tcttaaagtt aaacaaaatt atttctagag gggaattgtt atccgctcac aattccccta tagtgagtcg tattaatttc gcgggatcga gatctcgatc ctctacgccg gacgcatcgt ggccggcatc accggcgcca caggtgcggt tgctggcgcc tatatcgccg acatcaccga tggggaagat cgggctcgcc acttcgggct catgagcgct tgtttcggcg tgggtatggt ggcaggcccc gtggccgggg gactgttggg cgccatctcc ttgcatgcac cattccttgc ggcggcggtg ctcaacggcc tcaacctact actgggctgc ttcctaatgc aggagtcgca taagggagag cgtcgagatc ccggacacca tcgaatggcg caaaaccttt cgcggtatgg catgatagcg cccggaagag agtcaattca gggtggtgaa tgtgaaacca gtaacgttat acgatgtcgc agagtatgcc ggtgtctctt atcagaccgt ttcccgcgtg gtgaaccagg ccagccacgt ttctgcgaaa acgcgggaaa aagtggaagc ggcgatggcg gagctgaatt acattcccaa ccgcgtggca caacaactgg cgggcaaaca gtcgttgctg attggcgttg ccacctccag tctggccctg cacgcgccgt cgcaaattgt cgcggcgatt aaatctcgcg ccgatcaact gggtgccagc gtggtggtgt cgatggtaga acgaagcggc gtcgaagcct gtaaagcggc ggtgcacaat cttctcgcgc aacgcgtcag tgggctgatc attaactatc cgctggatga ccaggatgcc attgctgtgg aagctgcctg cactaatgtt ccggcgttat ttcttgatgt ctctgaccag acacccatca acagtattat tttctcccat gaagacggta cgcgactggg cgtggagcat ctggtcgcat tgggtcacca gcaaatcgcg ctgttagcgg gcccattaag ttctgtctcg gcgcgtctgc gtctggctgg ctggcataaa tatctcactc gcaatcaaat tcagccgata gcggaacggg aaggcgactg gagtgccatg tccggttttc aacaaaccat gcaaatgctg aatgagggca tcgttcccac tgcgatgctg gttgccaacg atcagatggc gctgggcgca atgcgcgcca ttaccgagtc cgggctgcgc gttggtgcgg atatctcggt agtgggatac gacgataccg aagacagctc atgttatatc ccgccgttaa ccaccatcaa acaggatttt cgcctgctgg ggcaaaccag cgtggaccgc ttgctgcaac tctctcaggg ccaggcggtg aagggcaatc agctgttgcc cgtctcactg gtgaaaagaa aaaccaccct ggcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtaagttagc tcactcatta ggcaccggga tctcgaccga tgcccttgag agccttcaac ccagtcagct ccttccggtg ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact tatgactgtc ttctttatca tgcaactcgt aggacaggtg ccggcagcgc tctgggtcat tttcggcgag gaccgctttc gctggagcgc gacgatgatc ggcctgtcgc ttgcggtatt cggaatcttg cacgccctcg ctcaagcctt cgtcactggt cccgccacca aaegtttcgg cgagaagcag gccattatcg ccggcatggc ggccccacgg gtgcgcatga tcgtgctcct gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga atgaatcacc gatacgcgag cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct gagcaacaac atgaatggtc ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt cagcgccctg caccattatg ttccggatct gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg gaacacctac atctgtatta acgaagcgct ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt cccgccgcat ccataccgcc agttgtttac cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt catcatcagt aacccgtatc gtgagcatcc tctctcgttt catcggtatc attaccccca tgaacagaaa tcccccttac acggaggcat cagtgaccaa acaggaaaaa accgccctta acatggcccg ctttatcaga agccagacat taacgcttct ggagaaactc aacgagctgg acgcggatga acaggcagac atctgtgaat cgcttcacga ccacgctgat gagctttacc gcagctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttcca aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gçgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgââ aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaac aataaaactg tctgcttaca taaacagtaa tacaaggggt gttatgagcc atattcaacg ggaaacgtct tgctctaggc cgcgattaaa ttccaacatg gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg tcgggcaatc aggtgcgaca atctatcgat tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt ttctgaaaca tggcaaaggt agcgttgcca atgatgttac agatgagatg gtcagactaa actggctgac ggaatttatg cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt actcctgatg atgcatggtt actcaccact gcgatccccg ggaaaacagc attccaggta ttagaagaat atcctgattc aggtgaaaat attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc cggttgcatt cgattcctgt ttgtaattgt ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgtctc gctcaggcgc aatcacgaat gaataacggt ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag cgtaatggct ggcctgttga acaagtctgg aaagaaatgc ataaactttt gccattctca ccggattcag tcgtcactca tggtgatttc tcacttgata accttatttt tgacgagggg aaattaatag gttgtattga tgttggacga gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt gccatcctat ggaactgcct cggtgagttt tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta ttgataatcc tgatatgaat aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag tttttctaag aattaattca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gaaattgtaa acgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtccc attcgcca
SEQ ID NO: 4.
>sequencia pET28a/asparaginase otimizado
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagttagaaa cccgcttcga atgcgctctg gatatcgctc agcttgttct tgccattggc gatcaggatt tgcagcagga tgcgagcctt ctgcgggctc aggtcatagc tcaccacaaa atcgttctta tcgtcgttta cttcaacgtt acggtttacg aaaccgctac cggtacggct agaacgtaca acaatcacac cttgtttaac cgccaggttc agtgcagcca ttgcttcttt agaggagtta ccatcaccca cgcctgccag aatgatgcct tttacgccgg ttttaatcag atcgttgatg atggaagcgc ccatgccaga gtgtgcatac aggatttcca ccgccggcag cggggcagtg gtcggcagac cataggacgg aaccggctgc ttcttcggtt caatgaaacg aacagatgcc gggtctacat aaccgatcgg gccagcgttg atagactgga aggtttctac ggcagtagtg tgggtcttag atgcccaacg cgccgcatga atggtatcgt tcataacaat cattacaccg tggtcctttg ctttcggggt cgctgccact tcgattgctt cgtacaggtt agccggaccg tcggcaccga ttgcggtgga cggacgcatt gcaccggtca ggatgatcgg tttatcggta cgaataacgg tgtccaggaa gaatgcggtt tcttccatag tatcggtacc gtgggtgatc acgatgccat ctgcttcatt gtgcgctacc gcatcctgga tacgcttcgc caggcgcagc cagattgcat cgttcatgtc ctggctacca atgttcgcga tctgctctac gttgatttct gccagtttcg ccagttctgg aatgtcttct accagctgct tgccagtaac accgcctgcg ttataaccaa tttcggacat gccgttcttc ttgccagaga tggtaccgcc ggttgccagc accaggatac gcggcagagt ttggatagag tgaacctgat tgttcatttt gtcatcatcg tcgatatgac cgctggagtg gtgatgatga tggtggccca tggtatatct ccttcttaaa gttaaacaaa attatttcta gaggggaatt gttatccgct cacaattccc ctatagtgag tcgtattaat ttcgcgggat cgagatctcg atcctctacg ccggacgcat cgtggccggc atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg ccgacatcac cgatggggaa gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat ggtggcaggc cccgtggccg ggggactgtt gggcgccatc tccttgcatg caccattcct tgcggcggcg gtgctcaacg gcctcaacct actactgggc tgcttcctaa tgcaggagtc gcataaggga gagcgtcgag atcccggaca ccatcgaatg gcgcaaaacc tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg aaaaagtgga agcggcgatg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac tggcgggcaa acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc cgtcgcaaat tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg tgtcgatggt agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg cgcaacgcgt cagtgggctg atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg tggaagctgc ctgcactaat gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca tcaacagtat tattttctcc catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg cattgggtca ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg gcatcgttcc cactgcgatg ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg ccattaccga gtccgggctg cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga tacgacgata ccgaagacag ctcatgttat atcccgccgt taaccaccat caaacaggat tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtaagtt agctcactca ttaggcaccg ggatctcgac cgatgccctt gagagccttc aacccagtca gctccttccg gtgggcgcgg ggcatgacta tcgtcgccgc acttatgact gtcttcttta tcatgcaact cgtaggacag gtgccggcag cgctctgggt cattttcggc gaggaccgct ttcgctggag cgcgacgatg atcggcctgt cgcttgcggt attcggaatc ttgcacgccc tcgctcaagc cttcgtcact ggtcccgcca ccaaacgttt cggcgagaag caggccatta tcgccggcat ggcggcccca cgggtgcgca tgatcgtgct cctgtcgttg aggacccggc taggctggcg gggttgcctt actggttagc agaatgaatc accgatacgc gagcgaacgt gaagcgactg ctgctgcaaa acgtctgcga cctgagcaac aacatgaatg gtcttcggtt tccgtgtttc gtaaagtctg gaaacgcgga agtcagcgcc ctgcaccatt atgttccgga tctgcatcgc aggatgctgc tggctaccct gtggaacacc tacatctgta ttaacgaagc gctggcattg accctgagtg atttttctct ggtcccgccg catccatacc gccagttgtt taccctcaca acgttccagt aaccgggcat gttcatcatc agtaacccgt atcgtgagca tcctctctcg tttcatcggt atcattaccc ccatgaacag aaatccccct tacacggagg catcagtgac caaacaggaa aaaaccgccc ttaacatggc ccgctttatc agaagccaga cattaacgct tctggagaaa ctcaacgagc tggacgcgga tgaacaggca gacatctgtg aatcgcttca cgaccacgct gatgagcttt accgcagctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg aacaataaaa ctgtctgctt acataaacag taatacaagg ggtgttatga gccatattca acgggaaacg tcttgctcta ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac taaactggct gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc ccgggaaaac agcattccag gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc
agtgttcctg cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta
acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg aafcgaataac
ggtttggttg atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt
tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataaact tttgccattc tcaccggatt
cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag
gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg
ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt
cattacagaa acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg
aataaattgc agtttcattt gatgctcgat gagtttttct aagaattaat
tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg
gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgaaattg taaacgttaa
tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta
accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc
gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa
gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg
gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc
cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg
acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag
gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc
accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt cccattcgcc
a
SEQ ID NO: 5.
Met Gly His His His His His His Ser Ser Gly His Ile Asp Asp Asp
Asp Lys Met Asn Asn Gln Val His Ser Ile Gln Thr Leu Pro Arg Ile
Leu Val Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile Ser Gly Lys Lys Asn Gly Met
Ser Glu Ile Gly Tyr Asn Ala Gly Gly Val Thr Gly Lys Gln Leu Val
Glu Asp Ile Pro Glu Leu Ala Lys Leu Ala Glu Ile Asn Val Glu Gln
Ile Ala As Ile Gly Ser Gln Asp Met Asn Asp Ala Ile rp Leu Arg
Leu Ala Lys Arg Ile Gln Asp Ala Val Ala His As Glu Ala Asp Gly
Ile Val Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Met Glu Glu Thr Ala Phe Phe
Leu Asp Thr Val Ile Arg Thr Asp Lys Pro Ile Ile Leu Thr Gly Ala
Met Arg Pro Ser Thr Ala Ile Gly Ala Asp Gly Pro Ala Asn Leu Tyr
Glu Ala Ile Glu Val Ala Ala Thr Pro Lys Ala Lys Asp His Gly Val
Met Ile Val Met Asn Asp Thr Ile His Ala Ala Arg Trp Ala Ser Lys
Thr His Thr Thr Ala Val Glu Thr Phe Gln Ser Ile Asn Ala Gly Pro
Ile Gly Tyr Val Asp Pro Ala Ser Val Arg Phe Ile Glu Pro Lys Lys
Gln Pro Val Pro Ser Tyr Gly Leu Pro Thr Thr Ala Pro Leu Pro Ala
Val Glu Ile Leu Tyr Ala His Ser Gly Met Gly Ala Ser Ile Ile Asn
Asp Leu Ile Lys Thr Gly Val Lys Gly Ile Ile Leu Ala Gly Val Gly
Asp Gly Asn Ser Ser Lys Glu Ala Met Ala Ala Leu Asn Leu Ala Val
Lys Gln Gly Val Ile Val Val Arg Ser Ser Arg Thr Gly Ser Gly Phe
Val Asn Arg Asn Val Glu Val Asn Asp Asp Lys Asn Asp Phe Val Val
Ser Tyr Asp Leu Ser Pro Gln Lys Ala Arg Ile Leu Leu Gln Ile Leu lie Ala Asn Gly Lys Asn Lys Leu Ser Asp lie Gln Ser Ala Phe Glu Ala Gly Phe

Claims

REIVINDICAÇÕES
1- ÁCIDOS DESOXIRIBONUCLÉICOS (DNAs) SINTÉTICOS, caracterizados por compreenderem sequências de nucleotídeos otimizadas que codificam para L- asparaginases de Zymomonas.
2- ÁCIDOS DESOXIRIBONUCLÉICOS (DNAs) SINTÉTICOS, conforme reivindicação 1, caracterizados por codificarem as L-asparaginases de Zymomonas mobilis.
3- ÁCIDO DESOXIRIBONUCLÉICO (DNA) SINTÉTICO, conforme reivindicação 1, caracterizado pela SEQ ID NO: 1.
4- VETORES DE EXPRESSÃO EM BACTÉRIA caracterizados pelas SEQ !D NO: 3, SEQ ID NO: 4.
5- BACTÉRIAS E LEVEDURAS RECOMBINANTES caracterizadas por serem transformadas com os DNAs especificados na reivindicação 1.
6- BACTÉRIAS RECOMBINANTES caracterizadas por se tratar de Escherictria coH contendo os DNAs especificados na reivindicação 1 ,
7- LEVEDURAS RECOMBINANTES caracterizadas por se tratar de Pichia pastoris contendo os DNAs especificados na reivindicação 1.
8- PROTEÍNA DE FUSÃO, caracterizada pela SEQ D NO: 5 obtida a partir de ácido desoxirribonucléico conforme reivindicação 1 , representado pela SEQ ID NO 1.
9- PROCESSO DE PRODUÇÃO DE L -ASPARAGINASES POR BACTÉRIA, caracterizado por compreender a construção de DNAs sintéticos conforme a reivindicação 1 , sua inserção no na bactéria Escherichia co//, de modo que esta passe a produzir L-asparaginases em elevados níveis de expressão e com alta produtividade
10- PROCESSO DE PRODUÇÃO DE L-ASPARAGINASES POR LEVEDURA, caracterizado por compreender a construção de DNAs sintéticos conforme a reivindicação 1 , sua inserção na levedura Pichia pastoris, de modo que esta passe a produzir L-asparaginases em elevados níveis de expressão e com alta produtividade. 11- PROCESSO DE PRODUÇÃO DE L-ASPARAGINASES POR MEIO DE MODIFICAÇÃO GENÉTICA DE BACTÉRIAS OU LEVEDURAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o cultivo ser conduzido entre 15 e 37°C sob agitação de 200 a 800rpm e pH do cultivo ser mantido entre 5,0 e 7,0. 12- COMPOSIÇÃO caracterizada por compreender L-asparaginase obtida a partir de processos de acordo com as reinvidicações 9 e 10, composta por L-asparaginase com ou sem excipientes como manitol, sorbítol, cloreto de sódio, dextrose.
13- USO DA L-ASPARAGINASE para preparar as formulações a base de L- asparagínase utilizadas no tratamento de câncer, tumores, doenças com proliferação celular, assim como outras aplicações médicas.
14- MÉTODO DE TRATAMENTO de câncer utilizando a composição de acordo com a reivindicação 12.
PCT/BR2014/000455 2014-01-10 2014-12-29 L-asparaginase recombinante de zymomonas WO2015103681A1 (pt)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14877857.4A EP3093344A4 (en) 2014-01-10 2014-12-29 Recombinant l-asparaginase from zymomonas
US15/110,697 US20160348085A1 (en) 2014-01-10 2014-12-29 Recombinant l-asparaginase from zymomonas

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BR102014000585-4A BR102014000585B1 (pt) 2014-01-10 2014-01-10 l-asparaginase recombinante de zymomonas
BRBR102014000585-4 2014-01-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015103681A1 true WO2015103681A1 (pt) 2015-07-16

Family

ID=53523393

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/BR2014/000455 WO2015103681A1 (pt) 2014-01-10 2014-12-29 L-asparaginase recombinante de zymomonas

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20160348085A1 (pt)
EP (1) EP3093344A4 (pt)
BR (1) BR102014000585B1 (pt)
WO (1) WO2015103681A1 (pt)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2018354067B2 (en) 2017-10-27 2023-03-30 Pfenex Inc. Method for production of recombinant Erwinia asparaginase
JP7358347B2 (ja) 2017-10-27 2023-10-10 フェネックス インク． 組み換えＥ．ｃｏｌｉアスパラギナーゼの製造のための方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030186380A1 (en) 2002-04-01 2003-10-02 Novozymes Biotech, Inc. Methods for producing secreted polypeptides having L-asparaginase activity
BRPI0404952A (pt) 2004-11-10 2006-06-20 Coppe Ufrj processo de produção de asparaginase pela bactéria zymomonas mobilis e uso do caldo fermentativo e/ou da enzima purificada no tratamento de doenças
BRPI0406168A (pt) 2004-12-09 2006-09-12 Fundacao Oswaldo Cruz processo para produção da enzima antileucêmica asparaginase a partir da clonagem do gene asp3 de saccharomyces cerevisiae em uma levedura metilotrófica
WO2008011234A2 (en) 2006-06-30 2008-01-24 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Recombinant host for producing l-asparaginase ii
WO2010015264A1 (en) 2008-08-06 2010-02-11 Universita' Degli Studi Di Pavia L-asparaginase from helicobacter pylori
US20100284982A1 (en) 2007-12-20 2010-11-11 Yang Victor C Erythrocyte-encapsulated L-asparaginase for enhanced acute lymphoblastic leukemia therapy
US20120100121A1 (en) 2009-07-06 2012-04-26 Thierry Abribat Pegylated L-Asparaginase

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030186380A1 (en) 2002-04-01 2003-10-02 Novozymes Biotech, Inc. Methods for producing secreted polypeptides having L-asparaginase activity
BRPI0404952A (pt) 2004-11-10 2006-06-20 Coppe Ufrj processo de produção de asparaginase pela bactéria zymomonas mobilis e uso do caldo fermentativo e/ou da enzima purificada no tratamento de doenças
BRPI0406168A (pt) 2004-12-09 2006-09-12 Fundacao Oswaldo Cruz processo para produção da enzima antileucêmica asparaginase a partir da clonagem do gene asp3 de saccharomyces cerevisiae em uma levedura metilotrófica
WO2008011234A2 (en) 2006-06-30 2008-01-24 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Recombinant host for producing l-asparaginase ii
US20100284982A1 (en) 2007-12-20 2010-11-11 Yang Victor C Erythrocyte-encapsulated L-asparaginase for enhanced acute lymphoblastic leukemia therapy
WO2010015264A1 (en) 2008-08-06 2010-02-11 Universita' Degli Studi Di Pavia L-asparaginase from helicobacter pylori
US20120100121A1 (en) 2009-07-06 2012-04-26 Thierry Abribat Pegylated L-Asparaginase

Non-Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABUD, ANA KARLA DE SOUZA. ET AL.: "Estudo do controle de Qualidade da Produção de L-Asparaginase por Zymomonas mobilis.", TESE DE D.SC., PROGRAMA DE ENGENHARIA QUIMICA/COPPE/UFRJ, November 2005 (2005-11-01), RIO DE JANEIRO, RJ, BRASIL, XP055355631 *
BANEYX, CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY, vol. 10, 1999, pages 411 - 421
DEMAIN; VAISHNAV, BIOTECHNOLOGY ADVANCES, vol. 27, 2009, pages 297 - 306
DUVAL ET AL., BLOOD, vol. 99, no. 8, 2002, pages 2734 - 2739
KOTZIA LABROU, JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 119, 2005, pages 309 - 323
KOTZIA; LABROU, JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 119, 2005, pages 309 - 323
KURTZBERG: "Holland-Frei Cancer Medicine, 5th ed.,", 2000, HAMILTON PUBLISHER (ON): BC DECKER
LEE ET AL., APPLIED BIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 22, no. 1, 1989, pages 1 - 11
LOPES ET AL., JOURNAL OF ANTIBIOTICS INSTITUTE, vol. 20, 1980, pages 69 - 77
NARTA ET AL., CRITICAL REVIEWS IN ONCOLOGY / HEMATOLOGY, vol. 61, 2007, pages 208 - 221
NARTA ET AL., CRITICAL S REVIE IN ONCOLOGY / HEMATOLOGY, vol. 61, 2007, pages 208 - 221
PAGE AND PETI PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, vol. 51, 2007, pages 1 - 10
RIZZARI ET AL., CURRENT OPINION IN ONCOLOGY, vol. 25, 2013, pages S1 - S9
SAMBROOK J; FRITSCH EF; MANIATIS T: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
See also references of EP3093344A4 *
TABACCO ET AL., CLINICAL CHEMISTRY, vol. 25, no. 2, 1979, pages 336 - 337
TERPE, APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 72, 2006, pages 211 - 222
VAN DEN BERG, LEUKEMIA & LYMPHOMA, vol. 52, no. 2, 2011, pages 168 - 178
VERMA ET AL., CRITICAL REVIEWS IN BIOTECHNOLOGY, vol. 27, 2007, pages 45 - 62
WANIK; SILVA, ANTIBIOTICS INSTITUTE JOURNAL, vol. 11, 1971, pages 69 - 71

Also Published As

Publication number Publication date
BR102014000585B1 (pt) 2021-01-12
EP3093344A1 (en) 2016-11-16
BR102014000585A2 (pt) 2016-03-15
US20160348085A1 (en) 2016-12-01
EP3093344A4 (en) 2017-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019200735B2 (en) Immunomodulatory minicells and methods of use
CN105838733A (zh) Cas9 介导的香石竹基因编辑载体和应用
CN111909953B (zh) 用于桑黄遗传表达的重组载体及构建方法和遗传转化方法
CN110777134B (zh) 一种突变的几丁质酶及其应用
CN109456973A (zh) SpCas9n&PmCDA1&UGI碱基编辑系统在植物基因编辑中的应用
CN106916828A (zh) 一种调控杨树叶片发育的生长调节因子基因及其应用
CN112358534B (zh) 一种调控杨树纤维长度的生长素响应因子基因及其应用
CN111534535A (zh) 一种构建麦角硫因生产菌的方法
CA2255683A1 (en) Over-expression of proteins
WO2015103681A1 (pt) L-asparaginase recombinante de zymomonas
CN107619833B (zh) 用于构建布鲁氏菌突变株的质粒pZF17-30及其构建方法和应用
TW202235620A (zh) 用於治療癌症的ａｍｕｃ＿１１００和免疫檢查點調節劑的組合療法
KR20170088866A (ko) 공발현 플라스미드
CN113215136B (zh) 一种壳聚糖酶突变体CsnT及其应用
CN108165579B (zh) 一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法
CN110184290B (zh) 一种用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒及工程菌与应用
CN114774427B (zh) 一种提高金银花中木犀草素含量的重组基因及其应用
CN114174519A (zh) 用于生产包含重组内肽酶的酶组合物的方法
PL183598B1 (pl) Buforowy roztwór i sposób ekstrakcji białka
CN110923258A (zh) 一种真姬菇的遗传转化方法
CN113171448A (zh) 一种前列腺癌核酸疫苗
CN112011563A (zh) 一种基于ai-2群体感应自诱导蛋白表达载体及应用
CN113122556A (zh) 振荡型基因表达系统、构建方法及其在鼠李糖脂发酵中的应用
CN108893487A (zh) 一种含有C-Myc蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法
BRPI0215958B1 (pt) métodos para produção de metionina

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14877857

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15110697

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2014877857

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014877857

Country of ref document: EP