WO2015098018A1 - 光音響顕微鏡 - Google Patents

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義彰 村山
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Definitions

  • the present invention relates to a photoacoustic microscope.
  • Photoacoustic wave is a kind of elastic wave generated in the thermoelastic process that occurs when a substance is irradiated with light in the absorption wavelength range. Therefore, photoacoustic waves are attracting attention as a technique for imaging absorption characteristics.
  • photoacoustic microscopes that apply photoacoustic waves to imaging as detection signals
  • pulsed light that matches the absorption wavelength region of the observation object is used as excitation light
  • the excitation light is collected by the objective lens and collected in the specimen.
  • a method is used in which scanning is performed with a spot, and thereby a photoacoustic wave generated at each focused spot position is detected by a transducer or the like (see Patent Document 1).
  • a photoacoustic microscope when a specimen is scanned with a condensing spot, a photoacoustic wave is generated if an absorbing substance is present at the condensing spot position. Therefore, by detecting the photoacoustic wave, absorption within the specimen is performed. Characteristics can be imaged.
  • the depth of the absorbing material below the surface can be calculated based on the time delay from the light irradiation to the arrival of the photoacoustic wave in the optical depth range where the light reaches from the surface of the specimen. It is.
  • the shape of the acoustic wave is complicated, it is difficult to increase the time delay calculation accuracy.
  • the accuracy of the relative depth of other positions relative to an arbitrary position of the absorbent material is required, it has been difficult to calculate the relative depth of the absorbent material with the required level of accuracy. .
  • the present invention has been made in view of such a viewpoint, and an object thereof is to provide a photoacoustic microscope capable of calculating the relative depth of an absorbing material with high accuracy.
  • the photoacoustic microscope according to the present invention for achieving the above object is A light source that emits excitation light; An objective lens for condensing the excitation light in the specimen; An optical scanning unit that changes a relative position between the sample and a position where excitation light is collected by the objective lens; An acoustic wave detection unit for detecting a photoacoustic wave generated from the sample by irradiation of the excitation light; The waveform of the waveform due to the time change of the photoacoustic wave detected at the calculation target position other than the reference position in the sample with respect to the waveform due to the time change of the photoacoustic wave detected using any position in the scanning range of the sample as the reference position And a calculation unit that calculates a deviation based on the correlation coefficient and calculates depth information from the reference position at the calculation target position based on the deviation.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a main part of a photoacoustic microscope according to an embodiment of the present invention.
  • the photoacoustic microscope 10 deflects the excitation light L emitted from the pulse light source 11 by the optical scanning unit 12 and irradiates the sample S as a condensed spot through the photoacoustic wave reflection unit 14 by the objective lens 13.
  • the photoacoustic wave U generated from the sample S is reflected by the photoacoustic wave reflection unit 14 in a direction different from the optical path of the excitation light L and detected by the photoacoustic wave detection unit 15.
  • the pulsed light source 11 emits excitation light L having an absorption wavelength of hemoglobin.
  • the observation target is not limited to blood vessels, and can be applied to imaging of endogenous substances such as melanin.
  • the excitation light L may be light in the absorption wavelength region of the target substance. It can also be applied to imaging of exogenous substances such as phosphors and metal nanoparticles.
  • the excitation light L light in the absorption wavelength region of the target phosphor in the case of a phosphor is used, and light in the resonance wavelength region of the target metal nanoparticle in the case of a metal nanoparticle. Good.
  • the pulse light source 11 the light emission timing of the pulsed light is controlled by the control unit 16.
  • the optical scanning unit 12 includes, for example, two galvanometer mirrors, and is synchronized with the light emission timing of the pulsed light source 11 by the control unit 16 so that the inside of the sample S is two-dimensionally scanned by the condensed spot of the excitation light L. Drive controlled.
  • the optical scanning unit 12 only needs to be able to change the relative positional relationship between the condensing spot of the excitation light L and the sample. Therefore, the optical scanning unit 12 is a sample, a stage on which the sample is placed, or the like. It is also possible to change the position of.
  • Objective lenses 13 having different focal lengths are appropriately selected and mounted.
  • the photoacoustic wave reflection unit 14 includes two right-angled triangular prisms 14a and 14b, and the inclined surfaces thereof are coupled by a photoacoustic wave reflection member 14c.
  • the photoacoustic wave reflecting member 14c is transparent to the excitation light L, and is made of a member having different acoustic impedance, such as silicon oil or air, for the right triangular prism 14b on the sample S side. Since the difference between the acoustic impedance of the right triangular prism 14b and the acoustic impedance of the photoacoustic wave reflection member 14c satisfies a predetermined relationship, the photoacoustic wave U is reflected by the photoacoustic wave reflection member 14c.
  • a photoacoustic wave lens (not shown) may be arranged on the sample S side of the right triangular prism 14b.
  • the excitation light L that has passed through the objective lens 13 and the photoacoustic wave reflection unit 14 is condensed at the focal position of the objective lens 13.
  • the specimen S is arranged so as to overlap with the condensing spot of the excitation light L.
  • the photoacoustic wave U generated from the condensing spot position of the excitation light L of the sample S is incident on the right triangular prism 14b.
  • the photoacoustic wave U is reflected at a boundary surface between the right triangular prism 14b and the photoacoustic wave reflecting member 14c in a direction different from the optical path of the excitation light L, and is emitted from the right triangular prism 14b to the photoacoustic wave detecting unit 15. Is done.
  • At least the space between the objective lens 13 and the sample S and between the right triangular prism 14b and the photoacoustic wave detector 15 is filled with a photoacoustic wave transmission medium such as water through which the photoacoustic wave U easily propagates. It is preferable.
  • the photoacoustic wave detection unit 15 is, for example, a transducer that detects the photoacoustic wave U, and detects the photoacoustic wave U emitted from the right triangular prism 14b.
  • the photoacoustic wave detection unit 15 outputs the waveform of the intensity change of the photoacoustic wave U with respect to the time change to the signal processing unit 17 as an output signal.
  • the signal processing unit 17 includes an association unit 18, a calculation unit 19, a creation unit 20, and a work memory 21.
  • the associating unit 18 is synchronized with the driving of the optical scanning unit 12 by the control unit 16, that is, the irradiation timing of the excitation light L when the sample S is two-dimensionally scanned in a plane orthogonal to the optical axis O of the objective lens 13.
  • the irradiation position of the excitation light L and the output signal are associated with each other based on the output signal obtained from the photoacoustic wave detection unit 15 in synchronization with the output signal.
  • the association unit 18 further associates the start time of the output signal, that is, the start time of the intensity change (see FIG. 2) of the photoacoustic wave U with respect to the time change, and the emission timing of the pulsed light at the irradiation position. May be.
  • the calculation unit 19 calculates the correlation coefficient of the output signal at the calculation target position other than the reference position and the reference position as described below, and calculates the depth at the calculation target position based on the correlation coefficient. .
  • the reference position is a position where a substance similar to the substance at the calculation target position is present, and can be set to a position at which the same amount of local light as that applied to the calculation target position is irradiated. More specifically, it can be set to a position arbitrarily determined among all irradiation positions of the excitation light L.
  • the reference position may be determined by the observer specifying an arbitrary position on the image generated by the generation unit 20 and displayed on the display 22 using a pointing device such as a mouse. Good. Further, the reference position may be determined as a reference position by automatically analyzing the output signal obtained from the photoacoustic wave detection unit 15 to show a high intensity.
  • the depth can be calculated for the absorbing material that generates the photoacoustic wave U. Therefore, as shown in FIG. 3, it is preferable that the observer designates an arbitrary point of the image of the absorbing substance in the image IM created by the creating unit 20 as the reference position SP (see FIG. 3).
  • the calculation unit 19 detects the appearance time of the photoacoustic wave U in the output signal associated with the reference position SP.
  • the appearance time is a time when the absolute value of the intensity of the photoacoustic wave U exceeds a threshold in the waveform corresponding to the output signal, as shown in FIG.
  • the threshold value may be set to an arbitrary value that can exclude white noise generated in a state where the photoacoustic wave U does not appear, for example, a value that is three times the root mean square of the amplitude of white noise that is generally sampled. .
  • the calculation unit 19 determines the time position of the target period at the reference position SP based on the detected appearance time.
  • the target period is a period during which a part of the waveform corresponding to the output signal is extracted in order to calculate the correlation coefficient.
  • the target period is determined in advance to be equal to or greater than a value obtained by dividing the depth by the acoustic velocity.
  • the depth is set to the depth ⁇ ⁇ / NA 2 at the time of taking a photograph of the Berek equation ( ⁇ is the wavelength of the excitation light L, and NA is the numerical aperture of the objective lens 13).
  • the time position is a coordinate on the time coordinate axis and indicates a specific time.
  • the time position of the target period is determined at a time when the center of the target period is coincident with the passage of half of the total period of the target period and the search time range from the appearance time.
  • the search time range will be described later.
  • the calculation unit 19 extracts a waveform of the target period at the reference position SP (see FIG. 4, reference numeral “WF SP ”).
  • the target period may be stored in the storage unit 23 in association with the objective lens 13.
  • the calculation unit 19 determines a time position in the search time range.
  • the search time range will be described here. As will be described later, the calculation unit 19 compares the extracted waveform WF SP at the reference position SP with the waveform at the calculation target position CP (see FIG. 3). For comparison, waveforms within the target period at various time positions are also extracted from the output signal associated with the calculation target position CP.
  • the search time range indicates a time position range in which a waveform used for calculating a correlation coefficient is extracted from output signals at the calculation target position CP.
  • the length of the search time range is determined in advance to an arbitrary value less than the emission period of the pulsed excitation light L, for example, twice the value obtained by dividing the depth of the objective lens 13 by the acoustic velocity.
  • the time position of the search time range may be determined when the center of the search time range coincides with the center of the target period at the reference position SP (see FIG. 5).
  • the length of the search time range may be stored in the storage unit 23.
  • the calculation unit 19 first extracts the waveform WF CP1 at the calculation target position CP.
  • the start of the target period of the waveform WF CP1 coincides with the start of the search time range (see FIG. 6).
  • the length of the waveform WF CP1 is preferably the same as the length of the waveform WF SP .
  • the calculation unit 19 calculates correlation coefficients of the waveforms WF SP and WF CP1 in the target period at the extracted reference position SP and calculation target position CP.
  • the calculation unit 19 stores the calculated correlation coefficient in the work memory 21.
  • the calculation unit 19 extracts the waveform of the target period in which the time position of the target period at the calculation target position CP is shifted backward by the unit time ⁇ t (see FIG. 7).
  • the unit time ⁇ t may be determined in advance at an arbitrary interval, for example, the minimum time interval of the digitized output signal.
  • the calculating unit 19 calculates a correlation coefficient between the waveform at the reference position SP and the waveform of the target period at the newly extracted calculation target position CP.
  • the calculation unit 19 stores the calculated correlation coefficient in the work memory 21.
  • the unit time ⁇ t may be stored in the storage unit 23.
  • the calculation unit 19 changes the target at the calculation target position CP while displacing the time position of the target period at the calculation target position CP until the end of the target period coincides with the end of the search time range (see symbol E in FIG. 7).
  • the extraction of the waveform of the period, the calculation of the correlation coefficient with the waveform at the reference position SP using the newly extracted waveform, and the storage of the correlation coefficient are repeated.
  • the calculation unit 19 reads the correlation coefficient stored in the work memory 21 at each of a number of time positions within the search time range.
  • the correlation coefficient is a function represented by the equation (1), and it is common to draw a curve as shown in FIG.
  • R (x, y, ⁇ ) is a waveform of a target period having a time position ⁇ and a reference position SP (coordinate (x b )) at a calculation target position CP (coordinates (x, y)).
  • Y b )) is a correlation coefficient with the waveform of the target period.
  • a (x b , y b , t) is an amplitude at the reference position SP (coordinates (x b , y b )) at time t.
  • a (x, y, t ⁇ ) is an amplitude at the calculation target position CP in which the time position shifted by the time ⁇ with respect to the time position of the target period of the reference position SP is the target period.
  • t1 is the start of the target period at the reference position SP
  • t2 is the end of the target period at the reference position SP.
  • a ave, b is an average value of the amplitude of the reference position SP.
  • a ave, b is an average value of the amplitude of the calculation target position CP.
  • the calculation unit 19 calculates the difference between the time position of the target period at the calculation target position CP and the time position of the target period of the reference position SP, with the maximum correlation coefficient read out, and calculates the difference as the shift time. Let ⁇ max (x , y) .
  • the calculation unit 19 calculates the relative depth of the calculation target position CP with respect to the reference position SP at the calculation target position CP by multiplying the detected deviation time ⁇ max (x , y) by the acoustic velocity. Similarly, the calculation unit 19 calculates the relative depth with respect to the reference position SP at the other calculation target positions CP.
  • the calculation unit 19 detects a time position where the absolute value of the amplitude of the output signal associated with the reference position SP is maximum.
  • the calculation unit 19 calculates the depth of the absorbing material at the reference position SP based on the time position, the emission timing of the pulsed light, and the distance from the photoacoustic wave detection unit 15 to the sample surface.
  • a signal is emitted from the photoacoustic wave detector 15 toward the sample surface, and the return light from the sample surface to the photoacoustic wave detector 15 is output. It may be calculated from the arrival time.
  • the calculation unit 19 calculates the depth of each calculation target position CP by adding the depth of the reference position SP to the relative depth of each calculation target position CP.
  • the calculation unit 19 stores the calculated depth in the work memory 21 in association with each calculation target position CP.
  • the creation unit 20 detects the maximum value of the absolute value of the amplitude and the time position at which the maximum value is detected by the photoacoustic wave detection unit 15 in the output signal associated with each irradiation position of the excitation light L. To do.
  • the creation unit 20 calculates a value corresponding to the maximum absolute value of the amplitude at each irradiation position as a luminance value at each irradiation position. That is, the creation unit 20 determines the intensity of the photoacoustic wave U of the sample S based on the irradiation position specified by the relative change amount of the condensing position of the excitation light L with respect to the sample and the detected photoacoustic wave U, that is, the output signal.
  • An image IM (see FIG. 3) corresponding to the distribution is created. As described above, in order to designate the reference position SP, the creating unit 20 transmits an image IM before correction, which will be described later, to the display 22 for display.
  • the creation unit 20 has a time range in which the time position at which the maximum value is detected by the photoacoustic wave detection unit 15 corresponds to a depth twice the depth of ⁇ / NA 2 with the focal position of the objective lens 13 as the center.
  • the luminance value is calculated only for the irradiation position within.
  • the creating unit 20 images only the absorbing substance that exists within the range twice the focal depth of the objective lens 13.
  • the creation unit 20 corrects the luminance of the image IM corresponding to the intensity distribution of the photoacoustic wave U based on the reference position SP calculated by the calculation unit 19 and the depth of the calculation target position CP.
  • the amplitude of the photoacoustic wave U changes in accordance with the intensity of light applied to the absorbing material. As shown in FIG. 9, the light intensity is maximum at the focal position of the objective lens 13, and decreases according to the distance from the focal position. Therefore, the intensity of the photoacoustic wave U of an arbitrary absorbing material decreases according to the distance from the focal position. Therefore, the creation unit 20 corrects the absorbing material existing at any depth so that the image IM is based on the photoacoustic wave U when the same intensity of light is irradiated.
  • the intensity of light with respect to the distance from the focal position can be calculated by a PSF (point spread function) unique to the combination of the excitation light L and the sample S. Therefore, the creation unit 20 performs correction for the light intensity (symbol “code“) corresponding to the difference between the depth of the reference position SP and each calculation target position CP (see “D”) and the focal position in the depth direction. LI ”) is read from the previously stored PSF. The creation unit 20 calculates a correction coefficient obtained by dividing the light intensity at the focal position by the read light intensity. The creation unit 20 performs correction by multiplying the luminance value at the reference position SP and each calculation target position CP by a correction coefficient.
  • PSF point spread function
  • the luminance value of all the absorbing substances in an arbitrary sample S may be corrected to be converted into a specific value.
  • the absorption substance to be observed by the photoacoustic microscope 10 may be a single type of absorption substance for the specimen S as desired, such as a capillary blood vessel on the surface of the specimen S. Therefore, it can be assumed that the photoacoustic wave U having the same intensity is generated for the light having the same intensity.
  • the creating unit 20 has the above-described luminance only with respect to the absorbing substance existing within the range of the depth of ⁇ / NA 2 from the focal position of the objective lens 13, particularly within the range of twice the depth in consideration of aberration. Correct the value.
  • the creation unit 20 outputs the image IM on which the luminance value has been corrected to the display 22 and displays it.
  • the control unit 16 controls the overall operation of the photoacoustic microscope 10.
  • a storage unit 23 is connected to the control unit 16.
  • the storage unit 23 stores an operation program or the like by the control unit 16 as necessary.
  • the storage unit 237 may be a built-in memory of the control unit 16.
  • the photoacoustic microscope According to the photoacoustic microscope according to the present embodiment as described above, to the photoacoustic wave detection unit 15 of the photoacoustic wave U at the calculation target position CP with respect to the photoacoustic wave U at the reference position SP based on the correlation coefficient. Can be calculated with high accuracy. Since there is a correlation between the deviation of the arrival time with high accuracy and the depth of the absorbing material, in the present embodiment, the relative depth of the absorbing material can be calculated with high accuracy based on the deviation of the arrival time.
  • the image IM is corrected based on the depth of the absorbing material, so that the same type of absorbing material is changed from a different type of absorbing material due to a difference in luminance due to a difference in depth. Misidentification can be suppressed.
  • the image IM based on the depth is corrected based on the PSF, so that the photoacoustic wave U in a state where the light having the same intensity is irradiated regardless of the depth is imaged. Is possible. Therefore, the observer can more appropriately grasp the state of the sample S.
  • correction is performed to adjust the luminance to a constant value regardless of the depth, so that it is possible to suppress misidentification of the same type of absorbing material as a different type of absorbing material. .
  • correction is performed regardless of the depth, high-load image processing is not necessary.
  • the absorbing substance existing in the range twice the depth of the objective lens 13 is imaged, the absorbing substance existing in the region near the position corresponding to the focal length is visually recognized. It becomes possible. Note that imaging of the absorbing substance outside the range can be performed by adjusting the focal position of the objective lens 13.
  • the luminance of the image IM of the absorbing substance existing within the depth range of the objective lens 13 is corrected, so that the absorbing substance having a similar position in the depth direction has the same luminance. It can be displayed. Therefore, the observer can visually recognize the absorbing substance group relatively close to the position corresponding to the focal length and the absorbing substance group relatively distant from the focal position.
  • the target period is determined to be equal to or greater than the value obtained by dividing the depth of the objective lens 13 by the acoustic velocity, so that it is possible to calculate a correlation coefficient that highly reflects the similarity of waveforms. It is. As a result, the relative depth can be calculated with high accuracy.
  • the center position of the target period at the reference position SP is determined from the appearance time of the photoacoustic wave U at the time of half of the total period of the target period and the search time range.
  • the target period at the calculation target position CP can be set after the appearance time of the photoacoustic wave U at the reference position SP. Therefore, it is possible to suppress the burden of calculating the correlation coefficient uselessly before the appearance of the photoacoustic wave U.

Abstract

　光音響顕微鏡（１０）は光源（１１）と対物レンズ（１３）と光走査部（１２）と音響波検出部（１５）と算出部（１９）とを備える。光源（１１）は励起光を出射する。対物レンズ（１３）は励起光を標本内に集光させる。光走査部（１２）は励起光によって標本を走査させる。音響波検出部（１５）は音響波を検出する。算出部（１９）は基準位置と算出対象位置との光音響波の時間変化による波形のズレを相関係数により算出する。算出部（１９）はズレに基づいて算出対象位置における基準位置からの深さを算出する。

Description

光音響顕微鏡 関連出願の相互参照
　本出願は、２０１３年１２月２５日に日本国に特許出願された特願２０１３－２６７３９８の優先権を主張するものであり、この先の出願の開示全体をここに参照のために取り込む。
　本発明は、光音響顕微鏡に関するものである。
　光音響波とは、物質に吸収波長域の光を照射した際に生じる熱弾性過程にて発生する弾性波の一種である。そのため、光音響波は、吸収特性をイメージングする手法として注目されている。
　光音響波を検出信号としてイメージングに適用する光音響顕微鏡では、観察対象物の吸収波長域に合わせたパルス光を励起光として用い、該励起光を対物レンズにより集光して標本内を集光スポットにより走査し、これにより各集光スポット位置で発生する光音響波をトランスデューサ等で検出する手法が用いられている（特許文献１参照）。かかる光音響顕微鏡によると、標本を集光スポットで走査した際に、集光スポット位置に吸収物質が存在すると光音響波が発生するので、その光音響波を検出することにより、標本内の吸収特性をイメージングすることができる。
特表２０１１－５１９２８１号公報
　光音響顕微鏡において、標本の表面から光が到達する光学深度の範囲内では、光の照射から光音響波のトランスデューサへの到達までの時間遅れに基づいて表面下の吸収物質の深さを算出可能である。しかし、音響波の形状が複雑なため時間遅れの算出精度を上げることが難しい。特に、吸収物質の任意の位置に対する他の位置の相対的深さの精度が求められている一方で、吸収物質の相対的深さを要求される水準の精度で算出することは困難であった。
　本発明は、かかる観点に鑑みてなされたもので、吸収物質の相対的な深さを高い精度で算出可能な光音響顕微鏡を提供することを目的とするものである。
　上記目的を達成する本発明に係る光音響顕微鏡は、
　励起光を出射する光源と、
　前記励起光を標本内に集光させる対物レンズと、
　前記対物レンズによる励起光の集光位置と前記標本との相対位置を変化させる光走査部と、
　前記励起光の照射により前記標本から発生される光音響波を検出する音響波検出部と、
　前記標本の走査範囲内の任意の位置を基準位置として検出した光音響波の時間変化による波形に対する、前記標本内の前記基準位置以外の算出対象位置において検出した光音響波の時間変化による波形のズレを相関係数により算出し、該ズレに基づいて該算出対象位置における前記基準位置からの深さ情報を算出する算出部とを備える
　ことを特徴とするものである。
　本発明によれば、吸収物質の相対的深さを高い精度で算出可能な光音響顕微鏡を提供することができる。
本発明の一実施形態に係る光音響顕微鏡の要部の概略構成を示す模式図である。 図１の光音響波検出部において検出される光音響波の強度の、時間変化に対する変化を示すグラフである。 標本の光音響波の強度分布に対応する画像の一例を示す図である。 基準位置に対応付けられた出力信号の波形を示すグラフである。 基準位置における対象期間の時間位置に対する、探索時間範囲の時間位置を説明する図である。 算出対象位置に対応付けられた出力信号の波形を示すグラフである。 算出対象位置において抽出される波形の対象期間の複数の時間位置の関係を説明する図である。 ズレ時間に対する相関係数の変化を示すグラフである。 励起光の焦点距離に相当する位置近傍における深さ方向の位置に対する光の強度を示すグラフである。
　以下、本発明の一実施形態について、図面を参照して説明する。
　図１は、本発明の一実施形態に係る光音響顕微鏡の要部の構成を示す模式図である。光音響顕微鏡１０は、パルス光源１１から出射される励起光Ｌを、光走査部１２により偏向して、対物レンズ１３により光音響波反射部１４を経て標本Ｓ内に集光スポットとして照射させる。また、標本Ｓから発生する光音響波Ｕは、光音響波反射部１４により励起光Ｌの光路とは異なる方向に反射されて光音響波検出部１５により検出される。
　パルス光源１１は、例えば、標本Ｓが生体で、生体内の血管をイメージングする場合、ヘモグロビンの吸収波長の励起光Ｌを射出する。なお、観察対象は血管に限定するものではなく、メラニン等の内因性物質のイメージングに適用することが可能である。この際、励起光Ｌは対象となる物質の吸収波長域の光を用いればよい。また、蛍光体や金属ナノ粒子等の外因性物質のイメージングに適用することも可能である。この際、励起光Ｌは、蛍光体の場合には対象となる蛍光体の吸収波長域の光を、金属ナノ粒子の場合には対象となる金属ナノ粒子の共鳴波長域の光をそれぞれ用いればよい。また、標本Ｓ内に複数の吸収物質が存在する場合には、観察対象物の特徴的な吸収スペクトルのピークの波長の光を用いるのが望ましい。パルス光源１１は、制御部１６によりパルス光の発光タイミングが制御される。
　光走査部１２は、例えば、２個のガルバノミラーを有し、標本Ｓ内を励起光Ｌの集光スポットにより二次元走査するように、制御部１６によりパルス光源１１の発光タイミングに同期して駆動制御される。なお、光走査部１２は、励起光Ｌの集光スポットと、標本との相対的な位置関係を変化させることができれば良いため、光走査部１２は、標本あるいは、標本を載置するステージ等の位置を変化させる態様であってもよい。
　対物レンズ１３は、焦点距離の異なるものが適宜選択されて装着される。
　光音響波反射部１４は、２個の直角三角プリズム１４ａ、１４ｂを有し、それらの斜面同士が光音響波反射部材１４ｃにより結合されて構成される。光音響波反射部材１４ｃは、励起光Ｌに対しては透明で、標本Ｓ側の直角三角プリズム１４ｂに対しては、音響インピーダンスが異なる部材、例えばシリコンオイル、あるいは空気からなる。直角三角プリズム１４ｂの音響インピーダンスと、光音響波反射部材１４ｃの音響インピーダンスと、の差が所定の関係を満たすので、光音響波Ｕは、光音響波反射部材１４ｃによって反射される。なお、直角三角プリズム１４ｂの標本Ｓ側に、不図示の光音響波レンズを配置してもよい。
　対物レンズ１３および光音響波反射部１４を透過した励起光Ｌは、対物レンズ１３の焦点位置に集光する。標本Ｓは励起光Ｌの集光スポットと重なるように配置される。標本Ｓの励起光Ｌの集光スポット位置から発生する光音響波Ｕは、直角三角プリズム１４ｂに入射される。そして、光音響波Ｕは、直角三角プリズム１４ｂと光音響波反射部材１４ｃとの境界面で、励起光Ｌの光路と異なる方向に反射されて直角三角プリズム１４ｂから光音響波検出部１５に射出される。なお、少なくとも対物レンズ１３と標本Ｓとの間、及び直角三角プリズム１４ｂと光音響波検出部１５との間には、光音響波Ｕが伝播し易い水等の光音響波伝達媒質が充填されるのが好ましい。
　光音響波検出部１５は、例えば、光音響波Ｕを検出するトランスデューサであって、直角三角プリズム１４ｂから射出される光音響波Ｕを検出する。光音響波検出部１５は、時間変化に対する光音響波Ｕの強度変化の波形を、出力信号として信号処理部１７に出力する。
　信号処理部１７は、対応付け部１８、算出部１９、作成部２０、およびワークメモリ２１を有する。
　対応付け部１８は、制御部１６による光走査部１２の駆動に同期して、すなわち標本Ｓを対物レンズ１３の光軸Ｏと直交する平面内で二次元走査する際の励起光Ｌの照射タイミングに同期して、光音響波検出部１５から得られる出力信号に基づいて、励起光Ｌの照射位置と出力信号とを対応付ける。なお、対応付け部１８は、更に、出力信号の始期、すなわち時間変化に対する光音響波Ｕの強度変化（図２参照）の始期と、を当該照射位置におけるパルス光の出射時期と、を対応付けてもよい。
　算出部１９は、以下に説明するように、基準位置および基準位置以外の算出対象位置における出力信号の相関係数を算出し、当該相関係数に基づいて、算出対象位置における深さを算出する。
　基準位置とは、算出対象位置における物質と同様な物質が存在する位置であって、算出対象位置に照射される光と同程度の郷土の光が照射される位置に設定することができる。より具体的には、励起光Ｌの全照射位置の中で任意に定められる位置に設定することができる。基準位置は、例えば、後述するように、作成部２０により作成され、ディスプレイ２２において表示される画像上の任意の位置を観察者がマウスなどのポインティングデバイスを用いて指定することにより、定めてもよい。また、基準位置は、光音響波検出部１５から得られる出力信号を自動的に分析することで、高い強度を示す位置を基準位置と定めてもよい。なお、深さの算出は、光音響波Ｕを発生させる吸収物質に対して、可能である。そのため、図３に示すように、作成部２０により作成された画像ＩＭ内の吸収物質の像の任意の一点を、観察者が基準位置ＳＰに指定することが好ましい（図３参照）。
　算出部１９は、基準位置ＳＰに対応付けられた出力信号において、光音響波Ｕの出現時期を検出する。出現時期とは、図４に示すように、出力信号に対応する波形において、光音響波Ｕの強度の絶対値が閾値を超える時期である。なお、閾値は、光音響波Ｕが出現しない状態において生じるホワイトノイズを除外し得る任意の値、例えば一般的にサンプルされるホワイトノイズの振幅の２乗平均の３倍の値に定めてもよい。
　算出部１９は、検出した出現時期に基づいて、基準位置ＳＰにおける対象期間の時間位置を決定する。対象期間とは、相関係数の算出のために、出力信号に相当する波形の一部を抽出する期間である。対象期間は、対物レンズ１３の深度を定めるときに、当該深度を音響速度で除した値以上に、予め定められる。深度は、Ｂｅｒｅｋの式の写真撮影時の深度±λ／ＮＡ2とする（λは励起光Ｌの波長、ＮＡは対物レンズ１３の開口数である。）。時間位置とは、時間座標軸における座標であって、特定の時期を示す。対象期間の時間位置は、対象期間の中心が、出現時期から対象期間および探索時間範囲の合計期間の半期の経過時に合致する時期に、定められる。探索時間範囲については、後述する。算出部１９は、基準位置ＳＰにおける対象期間の波形（図４、符号“ＷＦSP”参照）を抽出する。なお、対象期間は、対物レンズ１３と対応させて、記憶部２３に保存されていてもよい。
　算出部１９は、探索時間範囲の時間位置を決定する。探索時間範囲について、ここで説明する。算出部１９は、後述するように、基準位置ＳＰにおける抽出した波形ＷＦSPと、算出対象位置ＣＰ（図３参照）における波形とを比較する。比較のために、算出対象位置ＣＰに対応付けられた出力信号からも、多様な時間位置における対象期間内の波形が抽出される。探索時間範囲は、算出対象位置ＣＰにおける出力信号の中から、相関係数の算出のために用いる波形を抽出する時間位置の範囲を示す。探索時間範囲の長さは、パルス状の励起光Ｌの発光周期未満で任意の値、例えば、対物レンズ１３の上記深度を音響速度で除した値の２倍の値に、予め定められる。探索時間範囲の時間位置は、探索時間範囲の中心が基準位置ＳＰにおける対象期間の中心と一致する時期に、定めてもよい（図５参照）。なお、探索時間範囲の長さは、記憶部２３に保存されていてもよい。
　算出部１９は、算出対象位置ＣＰにおいて、まず波形ＷＦCP1を抽出する。波形ＷＦCP1の対象期間の始期は探索時間範囲の始期に一致する（図６参照）。波形ＷＦCP1の長さは、波形ＷＦSPの長さと同様であることが好ましい。算出部１９は、抽出した基準位置ＳＰおよび算出対象位置ＣＰにおける対象期間の波形ＷＦSP、ＷＦCP1の相関係数を算出する。算出部１９は、算出した相関係数をワークメモリ２１に保存する。
　算出部１９は、次に算出対象位置ＣＰにおける、対象期間の時間位置を、単位時間Δｔだけ後方にずらした対象期間の波形を抽出する（図７参照）。単位時間Δｔは、任意の間隔、例えば、デジタル化した出力信号の最小時間間隔に予め定めてもよい。算出部１９は、基準位置ＳＰにおける波形と、新たに抽出した算出対象位置ＣＰにおける対象期間の波形との相関係数を算出する。算出部１９は、算出した相関係数をワークメモリ２１に保存する。なお、単位時間Δｔは、記憶部２３に保存されていてもよい。
　算出部１９は、以後、対象期間の終期が探索時間範囲の終期に一致する（図７符合Ｅ参照）まで、算出対象位置ＣＰにおける対象期間の時間位置を変位させながら、算出対象位置ＣＰにおける対象期間の波形の抽出、および新たに抽出した波形を用いて基準位置ＳＰにおける波形との相関係数の算出、および相関係数の保存を繰返す。
　算出部１９は、ワークメモリ２１に保存された、探索時間範囲内の多数の時間位置それぞれにおける相関係数を読出す。なお、相関係数は、（１）式で表わされる関数であり、図８に示すような曲線を描くことが一般的である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　（１）式において、Ｒ（ｘ、ｙ、τ）は、算出対象位置ＣＰ（座標（ｘ、ｙ））において、時間位置をτとする対象期間の波形と、基準位置ＳＰ（座標（ｘb、ｙb））における対象期間の波形との相関係数である。また、ａ（ｘb、ｙb、ｔ）は、時期ｔにおける基準位置ＳＰ（座標（ｘb、ｙb））における振幅である。ａ（ｘ、ｙ、ｔ－τ）は、基準位置ＳＰの対象期間の時間位置に対して、時間τずらした時間位置を対象期間とする算出対象位置ＣＰにおける振幅である。ｔ１は基準位置ＳＰにおける対象期間の始期であり、ｔ２は基準位置ＳＰにおける対象期間の終期である。ａave,bは、基準位置ＳＰの振幅の平均値である。ａave,bは、算出対象位置ＣＰの振幅の平均値である。
　算出部１９は、読出した中で最大の相関係数の、算出対象位置ＣＰにおける対象期間の時間位置と、基準位置ＳＰの対象期間の時間位置との差分を算出して、その差分をズレ時間τmax(x、y)とする。算出部１９は、検出したズレ時間τmax(x、y)に音響速度を乗じることにより、算出対象位置ＣＰおける、基準位置ＳＰに対する算出対象位置ＣＰの相対的深さを算出する。算出部１９は、他の算出対象位置ＣＰにおいて、同様に、基準位置ＳＰに対する相対的深さを算出する。
　算出部１９は、基準位置ＳＰに対応付けられた出力信号の振幅の絶対値が最大となる時間位置を検出する。算出部１９は、当該時間位置、パルス光の出射時期、並びに、光音響波検出部１５から標本表面までの距離に基づいて基準位置ＳＰの吸収物質の深さを算出する。なお、光音響波検出部１５から標本表面までの距離については、光音響波検出部１５から標本表面に向けて信号を出射して、標本表面からの戻り光の光音響波検出部１５への到達時刻から算出してもよい。
　算出部１９は、各算出対象位置ＣＰの相対的深さに、基準位置ＳＰの深さを加えることにより、各算出対象位置ＣＰの深さを算出する。算出部１９は、算出した深さを各算出対象位置ＣＰに対応付けて、ワークメモリ２１に記憶させる。
　作成部２０は、励起光Ｌの各照射位置にそれぞれ対応付けられた出力信号において、振幅の絶対値の最大値と、当該最大値が光音響波検出部１５に検出される時間位置とを検出する。作成部２０は、各照射位置における振幅の絶対値の最大値に応じた値を、各照射位置における輝度値として算出する。すなわち、作成部２０は、励起光Ｌの集光位置の標本に対する相対的な変化量によって特定される照射位置および検出された光音響波Ｕ、すなわち出力信号によって標本Ｓの光音響波Ｕの強度分布に対応する画像ＩＭ（図３参照）を作成する。前述のように、基準位置ＳＰを指定させるために、作成部２０は、後述する補正前の画像ＩＭをディスプレイ２２に送信し、表示させる。
　ただし、作成部２０は、最大値が光音響波検出部１５に検出される時間位置が、対物レンズ１３の焦点位置を中心に、λ／ＮＡ2の深度の２倍の深度に相当する時間範囲内にある照射位置のみに対して、輝度値の算出を行う。すなわち、作成部２０は、対物レンズ１３の焦点深度の２倍の範囲内に存在する吸収物質のみを画像化する。
　作成部２０は、算出部１９が算出した基準位置ＳＰおよび算出対象位置ＣＰの深さに基づいて、光音響波Ｕの強度分布に相当する画像ＩＭの輝度を補正する。光音響波Ｕの振幅は吸収物質に照射する光の強度に応じて変化する。光の強度は、図９に示すように、対物レンズ１３の焦点位置において最大であり、焦点位置からの距離に応じて低下する。したがって、任意の吸収物質の光音響波Ｕの強度は、焦点位置から距離に応じて低下する。そこで、作成部２０は、どの深さに存在する吸収物質に対しても、同じ強度の光が照射された場合の光音響波Ｕに基づく画像ＩＭとなるように補正する。
　焦点位置からの距離に対する光の強度は、励起光Ｌおよび標本Ｓの組合わせに固有のＰＳＦ（点拡がり関数）によって算出可能である。そこで、作成部２０は、補正のために、基準位置ＳＰおよび各算出対象位置ＣＰの深さ（符号“Ｄ”参照）と深さ方向における焦点位置との差分に対応する光の強度（符号“ＬＩ”参照）を、予め記憶したＰＳＦから読出す。作成部２０は、焦点位置における光の強度を、読出した光の強度で除した補正係数を算出する。作成部２０は、基準位置ＳＰおよび各算出対象位置ＣＰにおける輝度値に補正係数を乗じることにより、補正を実行する。
　または、任意の標本Ｓ内の全ての吸収物質の輝度値を特定に値に変換する補正をしてもよい。光音響顕微鏡１０による、観察対象となる吸収物質は、標本Ｓの表面化の毛細血管などのように、任意に標本Ｓに対して単一の種類の吸収物質が観察対象となることがある。それゆえ、同じ強度の光に対して同じ強度の光音響波Ｕを発生すると仮定可能だからである。
　なお、作成部２０は、対物レンズ１３の焦点位置からλ／ＮＡ2の深度の範囲内、特に収差を考慮して深度の２倍の範囲内に存在する吸収物質に対してのみ、上述の輝度値の補正を行う。作成部２０は、輝度値の補正を行った画像ＩＭをディスプレイ２２に出力し、表示させる。
　制御部１６は、光音響顕微鏡１０の全体の動作を制御する。制御部１６には、記憶部２３が接続される。記憶部２３には、必要に応じて制御部１６による動作プログラム等が記憶される。なお、記憶部２３７は、制御部１６の内蔵メモリであってもよい。
　以上のような本実施形態に係る光音響顕微鏡によれば、相関係数に基づいて、基準位置ＳＰにおける光音響波Ｕに対する、算出対象位置ＣＰの光音響波Ｕの光音響波検出部１５への到達時間のズレを高い精度で算出可能である。高精度の到達時間のズレと吸収物質の深さには相関があるので、本実施形態では、到達時間のズレに基づいて、吸収物質の相対的な深さを高い精度で算出可能である。
　また、本実施形態の光音響顕微鏡によれば、吸収物質の深さに基づいて画像ＩＭを補正するので、深さの違いによる輝度の違いにより、同じ種類の吸収物質を異なる種類の吸収物質と誤認することを抑制可能である。
　また、本実施形態の光音響顕微鏡によれば、深さに基づく画像ＩＭを、ＰＳＦに基づいて補正するので、深さによらず同じ強度の光を照射した状態における光音響波Ｕを画像化可能である。したがって、観察者にとっては、標本Ｓの状態をより適切に把握可能となる。
　また、本実施形態の光音響顕微鏡によれば、深さによらず輝度を一定の値に合わせる補正を行うので、同じ種類の吸収物質を異なる種類の吸収物質と誤認することを抑制可能である。また、深さによらず補正を行うので、高負荷の画像処理が不要である。
　また、本実施形態の光音響顕微鏡によれば、対物レンズ１３の深度の２倍の範囲内に存在する吸収物質を画像化するので、焦点距離相当の位置近傍の領域に存在する吸収物質を視認可能となる。なお、当該範囲外の吸収物質の画像化は、対物レンズ１３の焦点位置を調整することにより実行可能である。
　また、本実施形態の光音響顕微鏡によれば、対物レンズ１３の深度の範囲内に存在する吸収物質の画像ＩＭの輝度を補正するので、深さ方向の位置が近い吸収物質を同等の輝度で表示可能となる。したがって、観察者は、焦点距離相当の位置から比較的近い吸収物質の群と、焦点位置から比較的離れた吸収物質の群を区分けして視認可能となる。
　また、本実施形態の光音響顕微鏡によれば、対象期間が、対物レンズ１３の深度を音響速度で除した値以上に定められるので、波形の類似性を高く反映させた相関係数を算出可能である。結果として、相対的な深さを高精度で算出可能となる。
　また本実施形態の光音響顕微鏡によれば、基準位置ＳＰにおける対象期間の中心位置が、光音響波Ｕの出現時期から、対象期間および探索時間範囲の合計期間の半期の経過時に定められるので、算出対象位置ＣＰにおける対象期間を基準位置ＳＰにおける光音響波Ｕの出現時期以後に設定可能となる。したがって、光音響波Ｕの出現前に無駄に相関係数を算出する負担の発生を抑止可能である。
　本発明を諸図面や実施形態に基づき説明してきたが、当業者であれば本開示に基づき種々の変形や修正を行うことが容易であることに注意されたい。従って、これらの変形や修正は本発明の範囲に含まれることに留意されたい。
　１０　光音響顕微鏡
　１１　パルス光源
　１２　光走査部
　１３　対物レンズ
　１４　光音響波反射部
　１４ａ、１４ｂ　直角三角プリズム
　１４ｃ　光音響波反射部材
　１５　光音響波検出部
　１６　制御部
　１７　信号処理部
　１８　対応付け部
　１９　算出部
　２０　作成部
　２１　ワークメモリ
　２２　ディスプレイ
　２３　記憶部
　ＡＭ　吸収物質の像
　ＣＰ　算出対象位置
　ＩＭ　画像
　Ｌ　励起光
　Ｏ　光軸
　Ｓ　標本
　ＳＰ　基準位置
　Ｕ　光音響波
　ＷＦSP　基準位置における対象期間の波形
　ＷＦCP1　算出対象位置における対象期間の波形

Claims (11)

  1. 　励起光を出射する光源と、
    　前記励起光を標本内に集光させる対物レンズと、
    　前記対物レンズによる励起光の集光位置と前記標本との相対位置を変化させる光走査部と、
    　前記励起光の照射により前記標本から発生される光音響波を検出する音響波検出部と、
    　前記標本の走査範囲内の任意の位置を基準位置として検出した光音響波の時間変化による波形に対する、前記標本内の前記基準位置以外の算出対象位置において検出した光音響波の時間変化による波形のズレを相関係数により算出し、該ズレに基づいて該算出対象位置における前記基準位置からの深さを算出する算出部と、
    　とを備える
    　ことを特徴とする光音響顕微鏡。
  2. 　請求項１に記載の光音響顕微鏡であって、前記音響波検出部が検出した光音響波と前記光走査部による前記励起光の集光位置の標本に対する相対的な変化量との複数の組合わせに基づいて、前記標本の光音響波の分布に対応する画像を作成する作成部を、更に備えることを特徴とする光音響顕微鏡。
  3. 　請求項２に記載の光音響顕微鏡であって、前記作成部は、前記深さに基づいて、前記画像を補正することを特徴とする光音響顕微鏡。
  4. 　請求項３に記載の光音響顕微鏡であって、前記作成部は、前記対物レンズの集光位置から光軸に沿って前記深さに基づいて変位させた位置における点拡がり関数に基づいて、前記画像を補正することを特徴とする光音響顕微鏡。
  5. 　請求項２に記載の光音響顕微鏡であって、前記作成部は、前記標本内の吸収物質における光音響波の強度を一定の値に変換することを特徴とする光音響顕微鏡。
  6. 　請求項２から５のいずれか１項に記載の光音響顕微鏡であって、前記作成部は、前記深さに基づいて、前記標本の中で、前記対物レンズの深度の２倍以内の範囲内に存在する吸収物質の、光音響波の分布に対応する前記画像を作成することを特徴とする光音響顕微鏡。
  7. 　請求項３または４に記載の光音響顕微鏡であって、前記作成部は、前記深さに基づいて、前記対物レンズの深度の２倍以内の範囲内に存在する吸収物質に関して、前記画像を補正することを特徴とする光音響顕微鏡。
  8. 　請求項１から７のいずれか１項に記載の光音響顕微鏡であって、前記算出部は、前記対物レンズの深度の２倍以内の範囲内にて、相関係数を算出することを特徴とする光音響顕微鏡。
  9. 　請求項１から８のいずれか１項に記載の光音響顕微鏡であって、
    　前記算出部は、
    　前記基準位置における時間位置が定められた対象期間の前記光音響波の波形と、前記算出対象位置における前記対象期間の前記光音響波の波形との相関係数を、前記算出対象位置の前記対象期間の時間位置を所定の探索時間範囲の中で変位させながら、算出し、最大の相関係数になる前記対象期間の前記探索時間範囲内における時間位置に基づいて、前記算出対象位置における前記深さを算出する
    　ことを特徴とする光音響顕微鏡。
  10. 　請求項９に記載の光音響顕微鏡であって、前記対象期間が、前記対物レンズの深度を音響速度で除した値以上であることを特徴とする光音響顕微鏡。
  11. 　請求項９または１０に記載の光音響顕微鏡であって、前記基準位置における前記対象期間の中心の時間位置が、前記光音響波の出現時期から、前記対象期間および前記探索時間範囲の合計期間の半期の経過時であることを特徴とする光音響顕微鏡。
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