JP2009015318A - レーザ走査顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】１ピクセル内での走査中にレーザ光源部からの出力制御を行うか否かを、高速に、且つ正確に決定可能なレーザ走査共焦点顕微鏡を提供する。
【解決手段】検出器からの出力を用いて試料の画像に変換する処理装置を備えたレーザ走査顕微鏡であって、処理装置は、走査光が前記画像中の１画素に対応する範囲を走査する時間をＵとするとき、Ｕより短い予め定められた時間Ｔ１の｛１／（２^ｎ―１）｝、又は｛１／２^ｎ｝（ｎは予め定められた自然数）の時間間隔毎に検出器の出力を読み込み、これらの値を用いて加算とビットシフトによる平均化処理から算出した値を検出器の時間Ｔ１における修正出力値とし、その修正出力値に応じてレーザ光源部からの光の出力を制御するか否か判断する機能を有することを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
【選択図】図３

Description

本発明は、レーザ走査顕微鏡に関するものである。

例えば、特許第３３６５８８４号公報（特許文献１）に記載される共焦点顕微鏡は、生体標本などの試料上に照明光を集光すると共にその試料上の集光部から射出する光束（蛍光）を共焦点絞り面に集光し、その共焦点絞りを通過した光束の光量を光検出器で検出するものである。また、その試料の二次元の画像を得るため、照明光をガルバノミラー型スキャナ等により走査光に変え、試料上を集光部（スポット）で走査しながらその検出を行う。
共焦点絞り面には、ピンホール部材が配置される。ピンホール部材はピンホール（開口）内に集光する光線のみを透過し、それ以外の光線をカットするので、試料上の特定の深さから射出した光線のみが光検出器に入射し、それ以外の深さから射出した光線は光検出器に入射しない。このため、共焦点顕微鏡によれば、観察対象を試料上の特定の深さに位置する薄い層の像のみに限定（セクショニング）することができる。そのセクショニング分解能（観察対象となる層の薄さ）を変更するためには、ピンホール部材の開口径を変更すればよい。開口径を大きくするとセクショニング分解能が低くなり、開口径を小さくするとセクショニング分解能が高くなる。

図１に、このような共焦点顕微鏡の光学系の概要を示す。レーザ光源ユニット１から照射された照明光は、照明用レンズ２で平行光とされ、フィルタ３により特定波長のみが選択されて透過し、光分離手段であるダイクロイックミラー４により反射されて、走査手段であるガルバノスキャナ５で２次元の走査光に変えられ、対物レンズ６により、試料７の観察面に集光する。レーザ光源ユニット１と試料７の観察面は、照明レンズ２〜対物レンズ６までの照明光学系に対して共役となっている。又、試料７の観察面は、対物レンズ６の焦点面に一致している。

照射された試料７の観察面の照射点からは蛍光が発生し、対物レンズ６により集光される。対物レンズ６を出た蛍光は、ガルバノスキャナ５によりほぼ非走査光に変えられるが、その光路は、走査光であった照射光の光路を逆方向にした光路となる。

蛍光は、ダイクロイックミラー４を透過し、フィルタ８により余分な波長の光を除去されて、集光レンズ１１により、ピンホール板１２のピンホール上に試料７の観察面の照射点の像を結像する。

試料７の観察面の照射点とピンホール板１２のピンホールとは、対物レンズ６から集光レンズ１１までの結像光学系に対して共役となっている。すなわち、ピンホール板１２は、集光レンズ１１に対して、対物レンズ６の焦点面と共役な位置に設けられている。ピンホールを通過した光は、光検出器１３により検出されて積分され、その出力は２進数にＡ／Ｄ変換されて、コンピュータ１０に送られる。コンピュータ１０は、各画素ごとの光検出器１３の出力（Ａ／Ｄ変換器の出力）にとして２次元画像を形成し、モニタ１４に表示する。ダイクロイックミラーの代わりにハーフミラーを使用すれば、試料７からの蛍光でなく反射光による２次元画像を得ることができる。

このような共焦点顕微鏡は、細胞等の生体の観察に使用される場合が多く、そのような場合には、試料を損傷しないように、レーザ光の照射をできるだけ少なくすることが好ましい。このような方法の１例が、特表２００７−５００８８０号公報（特許文献２）に記載されている。その方法を図２を用いて説明する。図２において、横軸は走査時間であり、縦軸は光検出器１３の出力（実際にはＡ／Ｄ変換器の出力であるが説明の都合上、それと等価な光検出器１３の出力として説明する）である。

光検出器１３の出力（実際にはＡ／Ｄ変換器の出力であるが説明の都合上、それと等価な光検出器１３の出力として説明する）は、１画素（ピクセル）分の走査が終わる毎にリセットされる。１ピクセル分の走査時間をＵとする。

特許文献２に示される方法においては、１ピクセル走査時間Ｕの時間中において、光検出器１３の出力が、画像取得のために必要十分な電圧値として予め設定された第１の閾値（Ｖ_ｔｈＨ）を越えるか、あるいは、光検出器１３の出力が、予め設定した下限値判定時刻Ｔ_ｔｈＬにおいて予め設定した第２の閾値（Ｖ_ｔｈＬ）未満であるかどうかを判別する。

つまり、画像を取得するために必要十分な電圧値として予め第１の閾値であるＶ_ｔｈＨを設け、１ピクセル分の走査時間Ｕの時間中に光検出器１３の出力がこの値を超えたとき場合には、積分開始からの時間をＴ_ｎとして記憶するとともに、その時点でレーザ光源ユニット１からのレーザ光の照射を停止する。そして、１ピクセル走査終了時の光検出器１３の出力Ｖ_Ｈは、Ｖ_Ｈ＝Ｖ_ｔｈＨ×Ｕ／Ｔ_ｎで算出される。

また、予め１ピクセル走査時間Ｕより短い下限値判定時刻Ｔ_ｔｈＬを設け、この時点での光検出器１３の出力が、予め設定した第２の閾値であるＶ_ｔｈＬ未満であるかどうかを判定する。そして、光検出器１３の出力がＶ_ｔｈＬ未満であった場合は、これ以上測定を行っても画像を形成するための十分な情報を取得できない、すなわち背景（バックグランド）情報のみを含むものであると判断し、その時点でレーザ光源ユニット１からのレーザ光の照射を停止する。第２の閾値Ｖ_ｔｈＬは、Ｖ_ＭＩＮ×Ｔ_ｔｈＬ／Ｕにより予め決定され、Ｖ_ＭＩＮは１ピクセル走査終了時に背景情報とみなせるとして設定される電圧値である。

このように、１ピクセル走査時間Ｕの時間中において、光検出器１３の出力が、画像取得のために必要十分な電圧値として予め設定された第１の閾値（Ｖ_ｔｈＨ）を越えるか、あるいは、光検出器１３の出力が、予め設定した下限値判定時刻Ｔ_ｔｈＬにおいて第２の閾値（Ｖ_ｔｈＬ）未満であるかを検出し、その場合にレーザ光源ユニット１からのレーザ光の照射を停止しているので、試料が浴びるレーザ光の量が少なくなり、試料がダメージを受ける可能性を低くすることができる。
特許第３３６５８８４号公報 特表２００７−５００８８０号公報

しかしながら、特許文献２に記載される方法では、１ピクセル内の走査の途中において、それぞれ１つのデータのみで、光検出器１３の出力が、第１の閾値を超えるかどうか、第２の閾値未満であるかどうかの判定を行っているので、ノイズの影響を受けやすいという問題点がある。特に、第２の閾値未満であるかどうかの判定においては、光検出器１３の出力が小さいため、Ｓ／Ｎ比が悪く、判定精度が悪くなるという問題点がある。

これを避けるためには、測定点を多くし、測定値を平均化することにより、判定精度を向上させる方法が考えられる。しかしながら、平均化処理には除算が必要であり、ソフトウエアで行うのが普通である。一方、１ピクセルの走査時間は、数μ秒〜数十μ秒と短いため、ソフトウエアを使用した除算を行うと演算速度が間に合わないことが多い。

本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、１ピクセル内での走査中にレーザ光源部からの出力制御を行うか否かを、高速に、且つ正確に決定可能なレーザ走査共焦点顕微鏡を提供することを課題とする。

前記課題を解決するための第１の手段は、レーザ光源部と、
前記レーザ光源部からの光を走査光にするとともに、試料に集光する照明光学系と、
前記試料からの光を集光する集光光学系と、
前記集光した光を検出する検出器と、
前記検出器からの出力を用いて前記試料の画像に変換する処理装置とを備え
たレーザ走査顕微鏡であって、
前記処理装置は、前記走査光が前記画像中の１画素に対応する範囲を走査する時間をＵとするとき、Ｕより短い予め定められた時間Ｔ１の｛１／（２^ｎ―１）｝、又は｛１／２^ｎ｝（ｎは予め定められた自然数）の時間間隔毎に前記検出器の出力を読み込み、これらの値を用いて加算とビットシフトによる平均化処理から算出した値を前記検出器の時間Ｔ１における修正出力値とし、その修正出力値に応じて前記レーザ光源部からの光の出力を制御するか否か判断する機能を有することを特徴とするレーザ走査顕微鏡である。

前記課題を解決するための第２の手段は、前記第１の手段であって、前記平均化処理は、前記時間Ｔ１の｛１／（２^ｎ―１）｝（ｎは予め定められた自然数）の時間間隔毎に前記検出器から出力された値をＡ（ｉ）（ｉ＝１〜２^ｎ）、２^ｎ＝Ｎ、Ａ（１）は時間０での値（＝０）とするとき

で行うことを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第３の手段は、前記第１の手段又は第２の手段であって、前記処理装置は、前記時間Ｔ１における前記検出器の修正出力値が予め定められた閾値未満のときに、それ以後、前記レーザ光源部からの光の出力を前記走査光が前記画素に対応する範囲を走査する時間、０とするか又は低下させる機能を有することを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第４の手段は、前記第１の手段又は第２の手段であって、前記処理装置は、前記時間Ｔ１における前記検出器の修正出力値が予め定められた閾値を越えるときに、それ以後、前記レーザ光源部からの光の出力を前記走査光が前記画素に対応する範囲を走査する時間、０とするか又は低下させる機能を有することを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第５の手段は、前記第３の手段又は第４の手段であって、前記Ｔ１が前記Ｕの１／２^ｍ（ｍは自然数）であり、前記処理装置は、前記時間Ｔ１で前記レーザ光源部からの光の出力が０とされた又は低下された場合に、前記画素に対応する前記検出器の出力Ｙを、

としてビットシフトにより求める機能を有することを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第６の手段は、前記第５の手段であって、ｎ＝ｍ＋１であることを特徴とするものである。

本発明によれば、１ピクセル内での走査中にレーザ光源部からの出力制御を行うか否かを、高速に、且つ正確に決定可能なレーザ走査共焦点顕微鏡を提供することができる。

以下、本発明の実施の形態の例を、図を用いて説明する。本発明の実施の形態であるレーザ走査共焦点顕微鏡の光学系の概要は、図１に示したものと同じであるのでその説明を省略し、データ処理方法についてのみ説明を行う。

図３は、本発明の実施の形態であるレーザ走査共焦点顕微鏡におけるデータ処理の例を説明するための図である。図３において、横軸は走査時間であり、１ピクセルを走査するのに必要な時間をＵとしている。縦軸は光検出器１３の出力（実際にはＡ／Ｄ変換器の出力であるが、説明の都合上、それと等価な光検出器１３の出力として説明する）である。光検出器１３の出力は、各ピクセルの走査の開始に先立ちリセットされ、走査が進行すると共に積分されて単純増加する。

時間Ｕの１／２^ｍ（ｍは予め定められた自然数）の時刻を下限値判定時刻Ｔとし（図３においては、ｍ＝２としている。よって、Ｔ＝Ｕ／４である。）、この時点でレーザ光源からのレーザ光の照射を停止するかどうかを判定するものとする。すなわち、下限値判定時刻Ｔにおいて、光検出器１３の出力の修正値Ｘ（修正値Ｘの算出方法については後述する）が閾値Ｖ_thL （＝Ｖ_ＭＩＮ×Ｔ／Ｕ）未満である場合、その時点でレーザ光源からのレーザ光の照射を停止し、各ピクセルにおける１ピクセル走査終了時の光検出器１３の出力Ｖ_Ｌは、Ｖ_Ｌ＝Ｘ×Ｕ／Ｔで算出する。なお、閾値Ｖ_thL以上の場合は、そのまま照射を続ける。

ここで、Ｖ_Ｌを計算する場合、Ｔ＝Ｕ／２^ｍなので、Ｘ×Ｕ／Ｔの値は、Ｘ×２^ｍとなり、修正値Ｘをハードウエアのレジスタに格納しておけば、ｍビットのシフトのみでＸ×２^ｍを求めることができ、ソフトウエアを使用した除算に比して、計算速度を著しく向上させることができる。もっとも、Ｙを計算する場合、ハードウエアに限らず、ソフトウエアによるビットシフトにより算出しても、計算速度を向上させることができる。

なお、修正値Ｘの値に応じて、レーザ光源ユニット１からのレーザ光の照射を停止するか否かの判断を行うようにしたが、レーザ光源ユニット１からのレーザ光の出力値を低下させるようにしてもよい。レーザ光源ユニット１は、レーザ光源とシャッタ（例えば、ＡＯＴＦ、ＡＯＭ、液晶シャッタ等）とを備え、レーザ光源ユニット１からのレーザ光の出力値を制御する（０にする又は低下する）場合は、シャッタにより行う。もっとも、レーザ光源としてレーザダイオードを用いた場合は、直接変調が可能であるので、通常シャッタは必要ない。また、レーザ光源は、異なる波長を出射する複数のレーザ光源にかえてもよい。

下限値判定時刻Ｔにおける光検出器１３の出力の修正値Ｘの計算は、以下のように行う。すなわち、Ｔを｛１／（２^ｎ−１）｝等分（ｎは予め定められた自然数）し、時刻０（このときの光検出器１３の出力は０）、及び時刻Ｔ×ｊ／（２^ｎ−１）（ｊ＝１〜（２^ｎ−１））において、光検出器１３の出力をサンプリングし、これらの値を順にＡ（ｉ）（ｉ＝１〜２^ｎ）とする（図３においては、ｎ＝２として、時間を３等分している。よって、サンプリング時刻は０、Ｔ／３、２Ｔ／３、Ｔである。）。すると、光検出器１３の出力の修正値Ｘは、２^ｎをＮとして、平均計算により、

で求まる。

Ｎ＝２^ｎであるので、この計算は、ハードウエアの加算器を用いた加算と、ビットシフトで行うことができ、ソフトウエアを使用した除算を伴わないので、極めて高速に行うことができる。もっとも、ハードウエアに限らず、ソフトウエアによるビットシフトにより算出しても、計算速度を向上させることができる。

特に、ｎ＝ｍ＋１とすると、

となり、加算のみでＹの値を求めることができる。

例えば、走査周期を１００Ｈｚとし、１走査区間を５１２画素に分解して測定する場合、１走査線の走査時間は、１０ミリ秒となるため、１画素の走査時間Ｕは、約２０マイクロ秒となる。

下限値判定時刻を２０マイクロ秒の２^３分の１、即ち１／８とすると、下限値判定時刻Ｔは、１画素の開始をゼロとした時、2.5マイクロ秒となる。又、測定平均回数を８回（Ｔを７分割）とすると、2.5マイクロ秒に８回の測定を行うため、１回の測定は約300ナノ秒以内に完了する必要がある。これは、高速のＡ／Ｄコンバータ（変換時間50ナノ秒程度）が容易に入手できるため、問題なく実現することができる。

以上の実施の形態では、光検出器１３の出力が、各ピクセルの走査の開始に先立ってリセットされ、１ピクセル内の走査が進行するとともに積分されて単純増加する方式の修正値Ｘの計算方法を示したが、他の修正値Ｘの計算として、１ピクセル内の走査であっても、時間間隔毎に光検出器１３の出力を読み出し、その度にリセットする方式を簡単に説明する。

時間Ｔを１／２^ｎ等分し、各１／２^ｎにおける光検出器からの出力を読み出した後、その度にリセットするということを２^ｎ回繰り返す。取得した各１／２^ｎにおける光検出器からの出力値の平均値を算出し、その平均値を２^ｎ倍し、その値を修正値Ｘとする。

なお、以上の説明においては、判定時刻Ｔを１ピクセル走査時間Ｕの１／２^ｍとし、かつ、Ｔを（２^ｎ−１）等分して光検出器１３の出力の修正値Ｘを平均化により求めたので、全ての計算を加算とビットシフトのみで行うことができたが、光検出器１３の出力の修正値Ｘの計算のみを、Ｔを（２^ｎ−１）等分して加算とビットシフトで行い、Ｔは、Ｕの１／２^ｍとせず、ピクセルにおける光検出器１３の出力をソフトウエアで除算を使用して行うようにしても、レーザ光源をオフする精度の向上と、ある程度の計算の高速化が可能である。

共焦点顕微鏡の光学系の概要を示す図である。 レーザ光の照射をできるだけ少なくする方法の例を説明するための図である。 本発明の実施の形態であるレーザ走査共焦点顕微鏡におけるデータ処理の例を説明するための図である。

符号の説明

１…レーザ光源ユニット、２…照明レンズ、３…フィルタ、４…ダイクロイックミラー、５…ガルバノスキャナ、６…対物レンズ、７…試料、８…フィルタ、１０…コンピュータ、１１…集光レンズ、１２…ピンホール板、１３…光検出器、１４…モニタ

Claims (6)

1. レーザ光源部と、
   前記レーザ光源部からの光を走査光にするとともに、試料に集光する照明光学系と、
   前記試料からの光を集光する集光光学系と、
   前記集光した光を検出する検出器と、
   前記検出器からの出力を用いて前記試料の画像に変換する処理装置とを備え
   たレーザ走査顕微鏡であって、
   前記処理装置は、前記走査光が前記画像中の１画素に対応する範囲を走査する時間をＵとするとき、Ｕより短い予め定められた時間Ｔ１の｛１／（２^ｎ―１）｝、又は｛１／２^ｎ｝（ｎは予め定められた自然数）の時間間隔毎に前記検出器の出力を読み込み、これらの値を用いて加算とビットシフトによる平均化処理から算出した値を前記検出器の時間Ｔ１における修正出力値とし、その修正出力値に応じて前記レーザ光源部からの光の出力を制御するか否か判断する機能を有することを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
2. 前記平均化処理は、前記時間Ｔ１の｛１／（２^ｎ―１）｝（ｎは予め定められた自然数）の時間間隔毎に前記検出器から出力された値をＡ（ｉ）（ｉ＝１〜２^ｎ）、２^ｎ＝Ｎ、Ａ（１）は時間０での値（＝０）とするとき
   

   

   で行うことを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査顕微鏡。
3. 前記処理装置は、前記時間Ｔ１における前記検出器の修正出力値が予め定められた閾値未満のときに、それ以後、前記レーザ光源部からの光の出力を前記走査光が前記画素に対応する範囲を走査する時間、０とするか又は低下させる機能を有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のレーザ走査顕微鏡。
4. 前記処理装置は、前記時間Ｔ１における前記検出器の修正出力値が予め定められた閾値を越えるときに、それ以後、前記レーザ光源部からの光の出力を前記走査光が前記画素に対応する範囲を走査する時間、０とするか又は低下させる機能を有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のレーザ走査顕微鏡。
5. 請求項３又は４に記載のレーザ走査顕微鏡であって、前記Ｔ１が前記Ｕの１／２^ｍ（ｍは自然数）であり、前記処理装置は、前記時間Ｔ１で前記レーザ光源部からの光の出力が０とされた又は低下された場合に、前記画素に対応する前記検出器の出力Ｙを、
   

   

   としてビットシフトにより求める機能を有することを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
6. ｎ＝ｍ＋１であることを特徴とする請求項５に記載のレーザ走査顕微鏡。

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