JP6359819B2

JP6359819B2 - 蛍光イメージング装置

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Publication number: JP6359819B2
Application number: JP2013224399A
Authority: JP
Inventors: 尚宜高本; 光人間瀬; 與儀　修; 修與儀; 厳建部
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 2013-10-29
Filing date: 2013-10-29
Publication date: 2018-07-18
Anticipated expiration: 2033-10-29
Also published as: JP2015087171A

Description

本発明は、蛍光イメージング装置に関するものである。

一般に、イメージセンサで取得した画像に基づいて３次元画像を構築する手法として、視差を利用する場合が多い。この手法は、２台のカメラを利用し、両カメラの間の視差を基準に画像再構築が行われる。しかしながら、この手法を蛍光イメージングに適用する場合、高感度化のイメージセンサを用いる必要があり、コストの増加につながる。また、カメラの位置を移動しながら撮像して３次元画像を構築する手段も有るが、この手法は、メカニカルな機構を必要とするので、コストの増加となる。一方、蛍光イメージングでは、共焦点レーザ顕微鏡を用いた光学断層像から３次元蛍光イメージングを行う例が多数報告されているが、この技術は、装置が大掛かりであり、価格が高いなどの問題がある。

安価に３次元蛍光イメージングを行うことができる装置が望まれている。３次元イメージングを安価に行うためには、安価な光源や固体イメージセンサを組み合わせて装置を構築することが重要である。例えば、ロックインイメージセンサ技術を用いたＴＯＦ（Time of Flight）方式のセンサによる３次元イメージング（距離イメージング）が好適である。この距離イメージングを行うことができる素子として、例えば、浜松ホトニクス株式会社製の２次元距離画像センサＳ１１９６２(Ｘ)、Ｓ１１９６３（Ｘ）等が実用化されている。

この距離イメージセンサを用いた蛍光寿命イメージングの手法として、周波数ドメイン法では特許文献１に開示された発明が知られており、時間ドメイン法では特許文献２に開示された発明が知られている。また、固体イメージセンサにおいて変調光と同期して蛍光を検出する技術は、非特許文献１にて発表されており、ロックインイメージセンサ技術が提唱されている。しかしながら、これは、２次元蛍光画像を取得するものであり、距離イメージングの機能を有していない。

特許文献３の図１５に周波数ドメイン法を用いた蛍光イメージングの例が記載されているが、これは、蛍光造影剤の２次元的な分布の取得に留まっており、３次元的な情報を取り出す仕組みとはなっていない。また、ＦＬＩＭ（蛍光寿命イメージング顕微鏡法）の応用として、レーザ顕微鏡において２光子吸収を用いて時間相関光子計数を行う技術が非特許文献２に記載されているが、この文献には距離を識別する手順の記載はない。

米国特許第７５０８５０５号明細書特開２００８−１０３６４７号公報特表２０００−５００２２８号公報

T. Spirig, P. Seitz, O. Vietze,and F. Heitger, "The Lock-In CCD Two-DimensionalSynchronous Detection of Light," IEEE Journal QuantumElectronics, Vol.31, No.9, pp1705-1708, September 1995. Stringari C, Cinquin A, CinquinO, Digman MA, Donovan PJ, and Gratton E (2011) Phasor approach tofluorescence lifetime microscopy distinguishes different metabolic states ofgerm cells in a live tissue. Proc Natl Acad Sci USA 108:13582-13587.

本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、対象物に含まれる蛍光成分を判別するとともに距離情報を求めることができ安価かつ簡易な蛍光イメージング装置を提供することを目的とする。

本発明の蛍光イメージング装置は、周波数ドメイン法における位相シフト法を用いて蛍光イメージングを行う装置であって、(1) 単一の周波数ｆで時間的に強度変調された励起光を対象物に照射する励起部と、(2) 励起部による励起光照射によって対象物で発生した蛍光の画像を周波数ｆで同期して撮像する撮像部と、(3) 撮像部により撮像された蛍光画像の各画素について蛍光強度変化の変調度ｍおよび位相θを求め、蛍光画像中の基準点に対応する特定画素に対する他の画素の位相θの差を求めて、蛍光画像の各画素について蛍光成分の判別を行い基準点からの相対的距離情報を求める解析部と、を備えることを特徴とする。

本発明の蛍光イメージング装置では、解析部が、ｘ＝ｍ・cosθ，ｙ＝ｍ・sinθ としたときのｘｙ平面であるｍθプロットにおいて、特定画素について、ｘｙ位置に基づいて周波数ｆにおける蛍光成分の蛍光寿命τを求め、変調度ｍおよび位相θに対応する点を原点（０，０）の周りに中心（０.５，０）で半径０.５の円弧上に達するまで回転させて位相θを補正し、特定画素以外の他の画素について、特定画素と同じ位相θの補正をした後、特定画素との位相θの差に基づいて相対的距離情報を求めるのが好適である。

本発明の蛍光イメージング装置では、蛍光画像において複数の蛍光成分が存在する場合に、解析部が、ｘ＝ｍ・cosθ，ｙ＝ｍ・sinθ としたときのｘｙ平面であるｍθプロットにおいて、特定画素について、ｘｙ位置に基づいて周波数ｆにおける複数の蛍光成分それぞれの蛍光寿命τを求め、変調度ｍおよび位相θに対応する点を原点（０，０）の周りに特定の既知のｍθ位置に達するまで回転させて位相θを補正し、複数の蛍光成分を個々に分離して、特定画素以外の他の画素について、特定画素と同じ位相θの補正をした後、特定画素との位相θの差に基づいて相対的距離情報を求めるのが好適である。特定の既知のｍθ位置は、中心（０.５，０）で半径０.５の円弧上の位置であってもよいし、該円弧上の既知の２つのｍθ点を結ぶ弦上の位置であってもよい。また、特定画素は、単一の蛍光成分を有する画素であってもよいし、任意の点に対応する画素であってもよい。

本発明によれば、安価かつ簡易な構成で、対象物に含まれる蛍光成分を判別するとともに距離情報を求めることができる。

本実施形態の蛍光イメージング装置１の構成を示す図である。他の実施形態の蛍光イメージング装置２の構成を示す図である。周波数ドメイン法により蛍光寿命を計測する際の一般的な手順を示すフローチャートである。図３中の励起光像の取得（ステップＳ１０）および蛍光像の取得（ステップＳ１２）の手順を示すフローチャートである。図３中の励起光の変調度ｍ_exおよび位相θ_exの算出（ステップＳ１１）ならびに蛍光の変調度ｍ_flおよび位相θ_flの算出（ステップＳ１３）の手順を示すフローチャートである。蛍光強度（ＤＣ成分）の画像を示す図である。励起光強度（ＤＣ成分）の画像を示す図である。蛍光の真の変調度ｍの画像を示す図である。蛍光の真の位相θの画像を示す図である。ｍθプロットの２次元ヒストグラムを示す図である。励起光強度（ＤＣ成分）の画像を示す図である。距離画像を示す図である。３次元蛍光イメージングの手順を示すフローチャートである。図１３中の装置関数の取得（ステップＳ４０）の手順を示すフローチャートである。試料を傾斜させたときに得られた蛍光強度（ＤＣ成分）の画像を示す図である。装置関数で補正した周波数応答を示すｍθプロットの２次元ヒストグラムを示す図である。距離画像を示す図である。図１７中の中心位置（基準点）を含む水平ライン上の距離分布を示す図である。蛍光プローブが２成分以上であって特に各画素において蛍光成分が単一である場合のｍθプロットを示す図である。蛍光プローブが２成分であって各画素において蛍光成分が２つ存在する場合のｍθプロットを示す図である。

以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。

図１は、本実施形態の蛍光イメージング装置１の構成を示す図である。蛍光イメージング装置１は、励起部１０、レンズ１１、励起フィルタ１２、撮像部２０、レンズ２１、バリヤフィルタ２２、解析部３０およびダイクロイックミラー４０を備え、対象物５０の蛍光画像を取得して、該蛍光画像の各画素について蛍光成分の判別を行い相対的距離情報を求めることができる。

励起部１０は、対象物５０に照射すべき励起光を出力する。この励起光は、対象物５０に含まれる蛍光成分を励起し得る波長であって、周波数ｆで強度変調された光である。励起部１０から出力された励起光は、投影用のレンズ１１および励起フィルタ１２を経て、ダイクロイックミラー４０で反射されて、対象物９０に照射される。励起光照射によって対象物９０で発生した蛍光は、ダイクロイックミラー４０を透過し、バリヤフィルタ２２および撮像用のレンズ２１を経て撮像部２０により受光される。撮像部２０は、励起光照射によって対象物９０で発生した蛍光の画像を周波数ｆで同期して撮像する。

解析部３０は、撮像部２０により撮像された蛍光画像の各画素について蛍光強度変化の変調度ｍおよび位相θを求め、蛍光画像中の基準点に対応する特定画素に対する他の画素の変調度ｍおよび位相θの差を検出し、その検出結果に基づいて、蛍光画像の各画素について蛍光成分の判別を行い基準点からの相対的距離情報を求める。

例えば、撮像部２０は、浜松ホトニクス株式会社製の２次元距離画像センサＳ１１９６２(Ｘ)、Ｓ１１９６３（Ｘ）またはＳ１１９６２に列ゲインアンプを組み込んだ構成を有する。このセンサは、ＣＣＤと同様な構造が１画素毎にＣＭＯＳプロセスで作製されたものであって、２つの電荷蓄積領域を有し、ゲート電極動作により高速電荷転送（例えばｆ＝５０ＭＨｚ）が可能である。また、このセンサは、構造的には２tap型のロックインイメージセンサの形態であり、読み出し時における受光部の電荷をリセットするためのゲート電極動作機能も有することで、高効率・高精度な光検出が可能である。

例えば、励起部１０は発光ダイオードを含む構成を有する。蛍光成分がAlexaFluor^R 488の蛍光色素である場合、励起部１０は青色発光ダイオードを含む。また、この場合、ダイクロイックミラー４０は中心波長が５０５ｎｍであり、励起フィルタ１２は透過帯域４５０〜４９０ｎｍのバンドパスフィルタであり、バリヤフィルタ２２はカットオフ波長５２０ｎｍのロングパスフィルタである。

蛍光イメージング装置１は、励起光像および蛍光像を個別に取得することができる。すなわち、蛍光像は、上述した構成により取得することができる。一方、励起光像を取得する際には、対象物９０をミラーまたは拡散板に交換し、ダイクロイックミラー４０をハーフミラーに交換するとともに、バリヤフィルタ２２をＮＤフィルタおよびバンドパスフィルタ（透過帯域４５０〜４９０ｎｍ）の組み合わせに交換することにより、励起光像を取得することができる。解析部３０は、励起光画像に基づいて励起光の周波数応答である変調度と位相を求め、蛍光画像に基づいて蛍光の周波数応答である変調度と位相を求め、これらに基づいて所要の解析を行って、光画像の各画素について蛍光成分の判別を行い相対的距離情報を求める。

図２は、他の実施形態の蛍光イメージング装置２の構成を示す図である。この蛍光イメージング装置２は、ダイクロイックミラーを備えていない。励起部１０から対象物９０への励起光の光路と、対象物９０から撮像部２０への蛍光の光路とは、別個のものとなっている。この蛍光イメージング装置２は、ダイクロイックミラーを必要としないので、イメージ伝送が可能な光ファイバを用いたシステムとすることができる。

次に、蛍光イメージング装置を用いた周波数応答計測について説明する。撮像部２０に含まれる２tap型ロックインイメージセンサから周波数ｆのデジタル信号が出力されており、この信号を用いて励起部１０は周波数ｆで直接強度変調した励起光を出力する。例えば、撮像部２０から出力される周波数ｆのデジタル信号をバンドパスフィルタ（中心周波数ｆ）に入力させて該バンドパスフィルタから正弦波信号を出力し、さらに電力増幅しバイアスを調節して、励起部１０に含まれる発光ダイオードに印加される周波数ｆの駆動信号とする。これにより、２tap型ロックインイメージセンサにおけるゲート電極動作に同期した励起光の強度変調が行われる。

２tap型ロックインイメージセンサを周波数ｆ＝５０ＭＨｚ（周期Ｔ＝２０nsec）で駆動した場合、１０nsecのゲート電極動作では、周期Ｔに対し、０〜Ｔ／２（０〜１０nsec）の区間で検出された光電子は一方の電荷蓄積領域へ同期した転送がなされ、Ｔ／２〜Ｔ（１０〜２０nsec）の区間で検出された光電子は他方の電荷蓄積領域へ同期した転送がなされる。これを３０msec毎に読みだすと、０〜Ｔ／２、Ｔ／２〜Ｔといった位相に同期した光検出（ロックイン検出）がなされる。また、読み出し期間中の受光部の電荷は、電荷蓄積領域への電荷転送の後にリセット用のゲート電極動作を行ってから、次の電荷蓄積を行うので、正確なロックイン検出を行うことができる。

さらに、撮像部２０から出力される周波数ｆのデジタル信号に対して、励起部１０に印加される周波数ｆの駆動信号に遅延（位相シフト量φ）を与えることで、位相シフト法による光の波形計測を行うことができる。撮像部２０の２tap型ロックインイメージセンサの２つの出力をVout1、Vout2とする。各画素について、０〜Ｔ／２の区間をVout1側とし、Ｔ／２〜Ｔの区間をVout2側として、電荷転送および電荷蓄積を行うと、撮像部２０に入力する光を全て検出することができる。正弦波に強度変調された光を検出することを前提にすると、位相πずれた区間をそれぞれ光検出していることになる。

撮像部２０に入力する変調光の強度Ｉを下記（１）式で表す。ここで、ωは強度変調の角周波数であり、θは初期位相であり、φは同期における位相シフト量である。θは、励起部１０から対象物９０を経て撮像部２０に到るまでの光路の長さに応じたものである。各画像に入力する変調光をロックイン検出したときに得られる出力値Vout1、Vout2は、（１）式を定積分した結果に比例する。

ロックイン検出により常に同位相にて検出を行うことができるので、２tap型ロックインイメージセンサの出力Vout1を０〜Ｔ／２（０〜１０nsec）の区間の電荷蓄積結果とし、出力Vout2をＴ／２〜Ｔ（１０〜２０nsec）の区間の電荷蓄積結果とした場合、３０msecの電荷蓄積後のセンサからの出力は下記（２）式で表される。

この（２）式は、２tap型ロックインイメージセンサのゲート電極動作に対して位相シフト量φ（遅延時間）を変化させた際に、（１）式の変調光が変換された形で復元されたものである。これは、一般的に周波数ドメイン法における位相シフト法と呼ばれるもので、（２）式によりセンサに入力する変調光を計測することができることを意味している。

（２）式での変調度ｍは、交流成分（ＡＣ成分）と直流成分（ＤＣ成分）との比となって、ｍ＝２Ｂ／πＡなる式で表される。位相はθである。（２）式の余弦関数の符号から、Vout1とVout2とは位相がπだけ異なる。位相シフト量φに対して、周波数ｆにおける変調度ｍおよび位相θを見積もることができる。

Vout1、Vout2の出力波形については、個別に解析してもよいし、位相がπだけ異なる２波形として同時に解析してもよい。後者で、２tap型ロックインイメージセンサを利用した場合、光検出した信号を無駄なく処理できるので効率の良い計測を行うことができる。

次に、蛍光イメージング装置を用いた蛍光寿命計測について説明する。蛍光物質における蛍光寿命は、周波数ドメイン法の場合、任意の周波数における応答（すなわち、変調度ｍ、位相θ）という形で表現することができる。この場合、単に蛍光の周波数応答だけを計測しても、これには装置全体の周波数応答が重畳されている。そこで、励起光の変調度ｍ_ex、位相θ_exとし、蛍光の変調度ｍ_fl、位相θ_flとして、下記（３）式により、蛍光物質の入力側に対する出力側における周波数ｆにおける応答を計測することで、蛍光の真の周波数応答を導くことができる。

また、蛍光の真の周波数応答（（３）式の変調度ｍ、位相θ）と蛍光物質の蛍光寿命τとの間の関係は、単一成分を計測した場合、下記（４）式となる。したがって、励起光像および蛍光像について、（２）、（３）式から画素毎に変調度ｍおよび位相θを求めることで、蛍光寿命τに対する画像へのマッピングを行うことができる。

非特許文献２に記載されているように、ｘ＝ｍ・cosθ，ｙ＝ｍ・sinθ としたときのｘｙ平面であるｍθプロット（２次元ヒストグラム）と蛍光強度画像とを組み合わせた蛍光寿命マッピングがある。この方法では、複数の蛍光物質に対してマッピングや蛍光寿命の経時変化を検出することができる。特に、蛍光物質の周波数応答である変調度ｍや位相θを高精度に計測することで、その解析能力が高まる。

図３は、周波数ドメイン法により蛍光寿命を計測する際の一般的な手順を示すフローチャートである。このフローチャートは、これまでに説明した蛍光寿命計測の手順を示すものである。ステップＳ１０において励起光像を取得し、ステップＳ１１において励起光像の各画素について励起光の変調度ｍ_exおよび位相θ_exを求める。ステップＳ１２において蛍光像を取得し、ステップＳ１３において蛍光像の各画素について蛍光の変調度ｍ_flおよび位相θ_flを求める。そして、ステップＳ１４において、（３）式を用いて蛍光の真の変調度ｍおよび位相θを求め、（４）式を用いて蛍光寿命τを計算する。

図４は、図３中の励起光像の取得（ステップＳ１０）および蛍光像の取得（ステップＳ１２）の手順を示すフローチャートである。ステップＳ２０において、周波数ｆ、位相シフト増分Δφ、積算時間および画像積算回数などのパラメータを設定する。ステップＳ２１において、励起光像または蛍光像を取得する。ステップＳ２２において、位相シフト量φをΔφだけ変化させる。ステップＳ２３において、周波数ｆに対し１周期の光強度波形の推定を行うことができるか否かを判断する。周波数ｆに対し１周期の光強度波形の推定が行えるまでステップＳ２１〜Ｓ２３を繰り返す。画像のＳＮ比が悪い場合には、ステップＳ２０のパラメータ設定において、蓄積時間または画像積算回数を増やすことでＳＮ比の改善を図る。

図５は、図３中の励起光の変調度ｍ_exおよび位相θ_exの算出（ステップＳ１１）ならびに蛍光の変調度ｍ_flおよび位相θ_flの算出（ステップＳ１３）の手順を示すフローチャートである。図４の処理により位相シフト量φの各値についての画像（位相シフト増分Δφに対応する時間間隔の時系列の画像）が取得されているので、ステップＳ３０において、この時系列の画像に基づいて画素毎に光強度波形データを求める。この光強度波形データは（２）式と等価な性質を有するので、ステップＳ３１において、（２）式への波形フィッティングを行うことにより、周波数ｆにおける周波数応答を計算することができる。ステップＳ３２において、全画素について計算が終了したか否かを判断する。全画素の計算が終了するまでステップＳ３０〜Ｓ３２を繰り返す。ステップＳ３３において、励起光像については各画素の変調度ｍ_exおよび位相θ_exを計算することができ、蛍光像については各画素の変調度ｍ_flおよび位相θ_flを計算することができる。

次に、蛍光イメージング装置を用いて蛍光寿命計測を行った結果を図６〜図１０に示す。励起部１０として青色発光ダイオードを用い、計測時間については位相シフト毎に１フレーム３０msecの蓄積時間として、読み出し後に１０回加算平均を行って画像を取得した。蛍光物質としてAlexa Fluor^R 488蛍光色素を用い、これを水に溶解させて濃度１０μＭとし、この液滴を白色の紙に５滴落とし、変調周波数f＝５０ＭＨｚにおける蛍光の周波数応答を計測した。励起光像を取得する際には、対象物９０を拡散板に置き換えた。

位相シフト増分Δφを２.５nsec相当とし、位相シフト量φを０〜１５nsec相当の範囲として、７枚の画像を取得した。これら７枚の画像から、画素毎に、光強度波形データを求め、（２）式への波形フィッティングを行うことにより、周波数ｆにおける周波数応答を計算した。図６は、蛍光強度（ＤＣ成分）の画像を示す図である。図７は、励起光強度（ＤＣ成分）の画像を示す図である。これらのＤＣ成分は、（２）式の右辺の第１項（ＡＴ／２）に相当する。

また、（３）式を用いて、蛍光の真の変調度ｍおよび位相θを求めた。図８は、蛍光の真の変調度ｍの画像を示す図である。図９は、蛍光の真の位相θの画像を示す図である。このように、変調周波数f＝５０ＭＨｚにおける周波数応答が画素毎にマッピングされることになる。

図８および図９に示された蛍光の真の変調度ｍおよび位相θに基づいて解析をすると、蛍光寿命τは４.７５nsであると見積もられる。図１０は、ｍθプロットの２次元ヒストグラムを示す図である。ｍθプロットは、周波数応答を評価する際に用いられる手法で、下記（５）式に従って変調度ｍおよび位相θをｘｙ平面上の位置に表すものである。

図１０中の円弧（半円）Ｌ１は、蛍光成分が単一である場合におけるωτの軌跡である。円弧Ｌ１は、位置（０.５，０）を中心とし、半径が０.５である。変調周波数ｆ＝５０ＭＨｚの場合に蛍光寿命τ＝４.７５nsであるとき、原点（０，０）を通りｘ軸となす角度がθである直線Ｌ２と円弧Ｌ１との交点が蛍光の周波数応答になる。すなわち、各画素に対しｍθプロットの２次元ヒストグラムを作成して、その分布を評価することにより、蛍光成分数を確認することができる。同図から、蛍光寿命は単一成分と判定することができる。

次に、蛍光イメージング装置を用いて距離計測を行った結果を図１１，図１２に示す。蛍光イメージング装置１，２は、画素毎に励起部１０から対象物９０（または拡散板）を経て撮像部２０に到るまでの光路の長さ、すなわち、対象物９０（または拡散板）の３次元形状を計測することができる。ここでは、対象物９０を略平坦な表面を有する拡散板に置き換え、この拡散板を傾斜させて、位相シフト法を用いて距離計測を行った。

図１１は、励起光強度（ＤＣ成分）の画像を示す図である。このＤＣ成分は、（２）式の右辺の第１項（ＡＴ／２）に相当する。図７に示された傾斜していないときの励起光強度と、図１１に示される傾斜しているときの励起光強度とに基づいて、画素毎の位相θを求めて、距離画像を求めた。図１２は、距離画像を示す図である。

図１２に示されるように、拡散板を傾けることにより、拡散板の左端から右端まで距離７０ｍｍ程度の差が検出された。位相θは、励起部１０から出力された励起光が拡散板で反射されて撮像部２０に到るまでの光路長に相当する。したがって、位相θの１/２の値がセンサから拡散板までの距離に相当する。周波数ｆ＝５０ＭＨｚでは、１周期（２π）が２０nsecとなるので、光速度を用いて距離に換算することができる。

次に、蛍光イメージング装置を用いた３次元蛍光イメージングについて説明する。以下に説明する３次元蛍光イメージングは、これまでに説明してきた蛍光イメージング装置を用いた蛍光寿命計測と距離計測とを組み合わせたものである。図１３は、３次元蛍光イメージングの手順を示すフローチャートである。図１４は、図１３中の装置関数の取得（ステップＳ４０）の手順を示すフローチャートである。

図１３に示されるように、先ずステップＳ４０において、装置関数を取得する。装置関数の取得は、図４および図５に示されたフローチャートに従って行われ得る。装置関数の取得（ステップＳ４０）の手順は図１４に示されている。

図１４に示されるように、ステップＳ６０において励起光像を取得し、ステップＳ６１において励起光像に基づいて周波数応答（励起光の変調度ｍ_exおよび位相θ_ex）を求める。ステップＳ６２において、対象物に含まれる蛍光プローブが既知であるか否かを判断する。蛍光プローブが既知でなければ、ステップＳ６３において蛍光像を取得し、ステップＳ６４において蛍光像に基づいて周波数応答（蛍光の変調度ｍ_flおよび位相θ_fl）を求め、ステップＳ６５において蛍光寿命τを計算して蛍光成分を特定する。

なお、装置関数の取得は、略平坦な対象物または拡散板を用いて行われる。ステップＳ６０，Ｓ６３は、図４に示されたフローチャートに従って行われる。また、ステップＳ６１，Ｓ６４は、図５に示されたフローチャートに従って行われる。ここで取得された装置関数は、後の補正の為に用いられる。

装置関数の取得に際して、励起光強度を変化させたときに変調度ｍ_exの変動が見られる場合、センサ出力のリニアリティの補正を行う。また、センサ内部の配線が非常に複雑であることから、画素毎にゲートタイミングのズレが生じるので、このようなタイミングの補正も行う。これらは、センサ特有のエラーであるので、固定パターンとして補正することが可能である。

図１３に示されるように、ステップＳ４０に続くステップＳ４１において蛍光像を取得する。ステップＳ４１は、図４に示されたフローチャートに従って行われる。続くステップＳ４２において蛍光像に基づいて周波数応答（蛍光の変調度ｍ_flおよび位相θ_fl）を求める。ステップＳ４２は、図５に示されたフローチャートに従って行われる。

ステップＳ４３において、蛍光画像中の任意の点を基準点とし、その基準点に対応する画素を特定画素とする。以降のステップにおいて、この特定画素に対する他の画素の変調度ｍおよび位相θの差を検出し、その検出結果に基づいて、蛍光画像の各画素について蛍光成分の判別を行い前記基準点からの相対的距離情報を求める。

ステップＳ４４において、対象物に含まれる蛍光プローブが１成分であるか否かを判断する。蛍光プローブが１成分である場合、ステップＳ４５，Ｓ４６の後にステップＳ５０〜Ｓ５３を行う。蛍光プローブが２成分以上である場合、ステップＳ４７〜Ｓ４９の後にステップＳ５０〜Ｓ５３を行う。

蛍光プローブが１成分である場合、ステップＳ４５において蛍光画像の各画素について周波数応答（変調度ｍおよび位相θ）を算出し、ステップＳ４６において各画素について位相θを補正する。基準点に対応する特定画素の蛍光寿命から求められる位相θを基準として定義し、他の各画素の位相の変動を相対距離として分離し換算する（位相θの補正）。

蛍光プローブが１成分である場合、図６に蛍光像が示された測定結果は、図１０に示されたｍθプロットから単一成分であることが判る。図１５は、試料を傾斜させたときに得られた蛍光強度（ＤＣ成分）の画像を示す図である。図１６は、装置関数で補正した周波数応答を示すｍθプロットの２次元ヒストグラムを示す図である。図１６中の原点を中心とする円弧（１/４円）Ｌ３は、既知である蛍光物質の周波数応答に対し、変調度ｍが変化せず一定であって位相θのみが変化した際の軌跡を示している。図１６のｍθプロット（ヒストグラム）は、図１５の画像中心部を基準点として位相θを補正した結果を示す。

図１０と図１６とは、同じ試料を測定した結果を示している。両図を対比すると、図１６での分布の変化を距離の変動として検知することができ、各画素について距離に換算すると図１７および図１８に示す結果を得ることができる。図１７は、距離画像を示す図である。同図は、基準点に対応する特定画素と各画素との位相の差だけを距離に換算したもので、画素間における関連性を全く考慮していない結果である。図１８は、図１７中の中心位置（基準点）を含む水平ライン上の距離分布を示す図である。図１８から、試料の左端から右端までの差が略７０ｍｍであることが判る。

蛍光プローブが２成分以上である場合、図１３中のステップＳ４７において蛍光成分を分離し、ステップＳ４８において各蛍光成分・各画素について周波数応答（変調度ｍおよび位相θ）を算出し、ステップＳ４９において各蛍光成分・各画素について位相θを補正する。

蛍光プローブが２成分以上であって特に各画素において蛍光成分が単一である場合では、ｍθプロットを行うと、図１９に示されるように、変調度ｍおよび位相θは、円弧Ｌ１付近に離散的に分布することになる。蛍光成分が既知であるので、どの蛍光成分がｍθプロットのどの領域に分布するかを予測することができ、その情報を基に蛍光成分の区別をし、その後に各画素について位相θの補正を行うことで、基準点との相対距離を求めることができる。この場合、基準点が円弧Ｌ１上に分布するように位相θを補正するが、その他の画素についても蛍光成分の分離後にｘｙ座標の原点を中心として回転移動させ、円弧Ｌ１上のそれぞれの成分との回転角の差を求めることで距離情報を求めることができる。さらに、基準点における位相θの補正を適用することで、基準点との距離情報を求めることができる。

また、蛍光プローブが２成分であって各画素において蛍光成分が２つ存在する場合では、ｍθプロットを行うと、図２０に示されるように、変調度ｍ_ｉおよび位相θ_ｉは、円弧Ｌ１上のωτ_１とωτ_２とを結ぶ弦Ｌ４上の領域に分布することになる。τ_１、τ_２は蛍光寿命である。また、この場合、弦Ｌ４上の点で分けられる線分の比率が蛍光強度比に対応するので、蛍光強度比が蛍光物質濃度比に依存する場合、τマッピングが可能である。蛍光物質が既知であるので、蛍光画像中で基準点を決めた場合、その基準点に対応する特定画素の変調度ｍについて、ｘｙ座標の原点を中心として特定の既知のｍθ位置に達するまで回転させて位相θの補正を行う。特定の既知のｍθ位置は、中心（０.５，０）で半径０.５の円弧Ｌ１上の位置であってもよいし、該円弧Ｌ１上の既知の２つのｍθ点を結ぶ弦Ｌ４上の位置であってもよい。また、特定画素は、単一の蛍光成分を有する画素であってもよいし、任意の点に対応する画素であってもよい。特定画素以外の他の画素についても、ｘｙ座標の原点を中心として同じ位相θの補正をすることで距離情報に換算することができ、且つ位相θの補正をすることで基準点との距離情報を求めることができる。また、いずれの場合においても、蛍光成分が分離されているのでτマッピングの表示を行うことができる。

図１３中のステップＳ５０において上述したような距離計算を行い、ステップＳ５１において上述したようなτマッピングを行う。ステップＳ５２において３次元画像構築を行い、ステップＳ５３において計測を終了したか否かを判断する。蛍光物質が既知であるので、蛍光寿命の異なる複数の蛍光物質を使ったとしても、ｍθプロット上で、各蛍光物質の分布を決めることができ、ｘｙ座標の原点に対して回転移動させ、どの位置に一致するかで蛍光物質の識別を行うことができる。さらに、その回転角は距離情報を示す。識別を容易にするために、周波数ｆを変更して計測を行い、複数の周波数におけるｍθプロットにて評価すると更に効果的である。また、基準点の回転角を位相θの補正とすることで距離ゼロ点を決めることができるので、前者の回転角と位相θの補正とにより３次元情報を構築することができる。これを厳密に実行するために、装置関数の補正を行い、さらに光検出条件（蓄積時間、積算回数）の最適化によるＳＮ比の向上等を的確に行うことで、３次元蛍光イメージングは達成される。

本実施形態では、図１または図２に示される蛍光イメージング装置を用い、図１３に示される処理を行うことで、３次元蛍光イメージングを行うことができる。周波数ドメイン法における位相シフト法を用い、蛍光寿命に関係する変調度ｍおよび位相θを計測することで、既知蛍光物質の判別および蛍光強度比等をマッピングすることができ、且つ、３次元構造体の相対的な位置情報をも取得することができる。周波数ｆを可変にすることで、ｍθプロットにおける蛍光物質または蛍光プローブの分布を変更することができるので、位相θの補正を複数の周波数にて評価することができ、この場合、測定精度の向上を図ることができる。また、３次元構造体について、その位置情報が既知の場合においては、本実施形態を応用することで、２次元分布に変換することが可能となり、未知蛍光寿命を計測することもできる。

本実施形態では、機械的な動作を有しない一台の撮像部を用いて、蛍光像から相対距離情報を見積もることができ、さらに既知の蛍光物質または蛍光プローブの分布を３次元的に計測できる。すなわち、本実施形態では、安価かつ簡易な構成で、対象物に含まれる蛍光成分を判別するとともに距離情報を求めることができる。また、本実施形態では、位相シフト法の周波数応答解析から距離情報の分離を行うことができ、短時間で画像計測を行うことができる。簡易な装置構成による３次元蛍光イメージングは、生体における蛍光腫瘍イメージングに応用することができ、且つ、複数の蛍光プローブを同時に利用することで生体分子の相互作用に関連した解析にも活用することができる。３次元構造を有する蛍光寿命解析において、その位置情報が既知であるの場合、未知蛍光物質の蛍光寿命を推定することができる。

１，２…蛍光イメージング装置、１０…励起部、１１…レンズ、１２…励起フィルタ、２０…撮像部、２１…レンズ、２２…バリヤフィルタ、３０…解析部、４０…ダイクロイックミラー、９０…対象物。

Claims

周波数ドメイン法における位相シフト法を用いて蛍光イメージングを行う装置であって、
単一の周波数ｆで時間的に強度変調された励起光を対象物に照射する励起部と、
前記励起部による励起光照射によって前記対象物で発生した蛍光の画像を前記周波数ｆで同期して撮像する撮像部と、
前記撮像部により撮像された蛍光画像の各画素について蛍光強度変化の変調度ｍおよび位相θを求め、蛍光画像中の基準点に対応する特定画素に対する他の画素の位相θの差を求めて、蛍光画像の各画素について蛍光成分の判別を行い前記基準点からの相対的距離情報を求める解析部と、
を備えることを特徴とする蛍光イメージング装置。
前記解析部が、
ｘ＝ｍ・cosθ，ｙ＝ｍ・sinθとしたときのｘｙ平面であるｍθプロットにおいて、
前記特定画素について、ｘｙ位置に基づいて前記周波数ｆにおける蛍光成分の蛍光寿命τを求め、変調度ｍおよび位相θに対応する点を原点（０，０）の周りに中心（０.５，０）で半径０.５の円弧上に達するまで回転させて位相θを補正し、
前記特定画素以外の他の画素について、前記特定画素と同じ位相θの補正をした後、前記特定画素との位相θの差に基づいて前記相対的距離情報を求める、
ことを特徴とする請求項１に記載の蛍光イメージング装置。
蛍光画像において複数の蛍光成分が存在する場合に、
前記解析部が、
ｘ＝ｍ・cosθ，ｙ＝ｍ・sinθとしたときのｘｙ平面であるｍθプロットにおいて、
前記特定画素について、ｘｙ位置に基づいて前記周波数ｆにおける前記複数の蛍光成分それぞれの蛍光寿命τを求め、変調度ｍおよび位相θに対応する点を原点（０，０）の周りに特定の既知のｍθ位置に達するまで回転させて位相θを補正し、
前記複数の蛍光成分を個々に分離して、前記特定画素以外の他の画素について、前記特定画素と同じ位相θの補正をした後、前記特定画素との位相θの差に基づいて前記相対的距離情報を求める、
ことを特徴とする請求項１に記載の蛍光イメージング装置。