WO2015068809A1 - 乳酸菌を含む腸管バリア機能亢進剤 - Google Patents

乳酸菌を含む腸管バリア機能亢進剤 Download PDF

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lactobacillus crustorum
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intestinal barrier
food
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浩之 星子
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サントリーホールディングス株式会社
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    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to a food and drink containing lactic acid bacteria, an intestinal barrier function enhancer, and a pharmaceutical composition and a food and drink containing the intestinal barrier function enhancer. More specifically, the present invention relates to a food and drink containing Lactobacillus crustorum, an intestinal barrier function enhancer, and a pharmaceutical composition and food and drink containing the intestinal barrier function enhancer.
  • metabolic syndrome a condition having any two or more of hyperglycemia, hypertension, and hyperlipidemia is called metabolic syndrome (metabolic syndrome or visceral fat syndrome).
  • metabolic syndrome a condition having any two or more of hyperglycemia, hypertension, and hyperlipidemia.
  • Non-patent Documents 2 and 3 Mild chronic inflammation in the living body has been pointed out as a common pathological condition of metabolic syndrome. Saturated fatty acids, alcohols, periodontal disease bacteria, and the like are known as substances that induce inflammation.
  • Non-patent Document 4 In recent years, the relationship between intestinal bacteria and intestinal environment and obesity with chronic inflammation has been pointed out (Non-patent Document 4).
  • Some of the enteric bacteria can cause an inflammatory response in vivo.
  • lipopolysaccharide (LPS) a cell wall component of gram-negative bacteria in the intestine, promotes the release of inflammatory cytokines in mice and humans (Non-patent Document 4).
  • intestinal epithelial cells Under the intestinal epithelial cells, there are many cells of the immune system such as macrophages, dendritic cells, T cells, and B cells. Usually, intestinal epithelial cells are firmly bonded to each other by a tight junction structure, and high molecular weight substances are strictly controlled so as not to permeate cell gaps. Intestinal epithelial cells also have a transporter for discharging hydrophobic foreign substances from the cells. These tight junction structures and transporters have an intestinal barrier function that prevents foreign substances from entering. However, when the intestinal barrier is damaged due to causes such as saturated fatty acids and alcohol, and the intestinal permeability increases, high-molecular-weight substances such as intestinal bacteria and their bacterial components exist in the living body through the intercellular spaces. It promotes the release of inflammatory cytokines by stimulating immune system cells and induces inflammation.
  • Lactic acid bacteria which are bacteria that produce lactic acid, are known to play an important role in balancing the intestinal flora and maintaining a healthy intestinal environment.
  • Lactobacillus that can adhere to intestinal cells improves the intestinal permeability of minerals such as calcium (Patent Document 1).
  • Lactobacillus rhamnosus OLL2838, Lactobacillus delbrueckii subsp. Patent Document 2.
  • An object of the present invention is to provide an intestinal barrier function-enhancing agent capable of enhancing the intestinal barrier function and thereby preventing or treating metabolic syndrome, and pharmaceuticals and foods and drinks containing the same.
  • Lactobacillus crustorum increases the transmembrane resistance value, which is an index of intestinal barrier function, in cultured human intestinal epithelial cells.
  • Lactobacillus crustorum induces expression of tight junction-related genes in cultured human intestinal epithelial cells and mouse small intestinal epithelium.
  • Lactobacillus crustorum was administered to mice fed with a high-fat diet, it was found that the effect of inhibiting glucose metabolism abnormality was shown, and the present invention was completed.
  • the present invention includes, but is not limited to, the following.
  • a food / beverage product comprising a bacterial body of Lactobacillus crustorum or a treated product thereof.
  • An intestinal barrier function enhancer comprising Lactobacillus crustorum cells or treated cells.
  • the intestinal barrier function-enhancing agent according to [4] or [5] comprising viable cells of Lactobacillus crustorum.
  • a food or drink comprising the intestinal barrier function enhancer according to any one of [4] to [6].
  • the pharmaceutical composition or food / beverage product is for the prevention or treatment of one or more conditions or diseases selected from the group consisting of diabetes, hypertension, hyperlipidemia, and obesity Manufacturing method.
  • the production method according to [14], wherein the condition or disease is diabetes.
  • the production method according to [14], wherein the condition or disease is a combination of obesity and one or more diseases selected from the group consisting of diabetes, hypertension and hyperlipidemia.
  • the intestinal barrier function-enhancing agent of the present invention can enhance the intestinal barrier function by including a bacterial body or a processed bacterial body of Lactobacillus crushtorum. Further, the intestinal barrier function-enhancing agent of the present invention is a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of a condition or disease caused by disorders of intestinal barrier function such as diabetes, hypertension, hyperlipidemia, obesity, and metabolic syndrome. Or it can be used effectively for food and drink.
  • FIG. 1 shows the evaluation results of Lactobacillus crushtorum enhancement of intestinal barrier function using human intestinal epithelial cells Caco2.
  • FIG. 2 shows the results of microarray analysis of intestinal epithelial cells Caco2 co-cultured with Lactobacillus crustorum.
  • FIG. 3 shows changes in Claudin 1 (CLDN1) gene expression in small intestinal epithelial tissue in mice administered with Lactobacillus crustorum.
  • FIG. 4 shows the glucose metabolism abnormality-inhibiting effect of Lactobacillus crustorum on high-fat diet load model mice.
  • FIG. 5 shows the inhibitory effect of Lactobacillus crustorum on glucose metabolism abnormality in high-fat diet-loaded model mice.
  • Lactobacillus crustorum is a kind of lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus, which has been proposed to be isolated from wheat sourdough and classified as a new species (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2007), 57, 146101467).
  • Sourdough refers to a bread type obtained by fermenting a dough obtained by mixing wheat flour, rye flour and water using a plurality of microorganisms including lactic acid bacteria and yeast.
  • Lactobacillus crustorum has the following mycological properties. Morphological properties (1) Neisseria gonorrhoeae, 2-15 ⁇ m long, 0.5-1 ⁇ m wide (2) Motility: none (3) Sporulation: none Cultural properties (1) Anaerobic in liquid or solid MRS medium (2) Growth at 15 ° C .: 5, 6, and 7% in the presence of sodium chloride (3) Growth at 45 ° C .: 5, 6, and 7% Physiological properties growing in the presence of salt (1) Gram staining: positive (2) catalase test: (3) Fermentation format: homolactic fermentation (4) Ammonium production (from arginine): None (5) Gas production (glucose or gluconate): None (6) Presence of acid production (LMG 23699 strain, LMG 23701 strain) About LMG 23702 and R-30103) Galactose, glucose, fructose, mannose, N-acetylglucosamine, esculin and salicin: yes Glycerol, eryth
  • Any strain may be used in the present invention as long as it is a bacterium classified as Lactobacillus crustorum having the above mycological properties.
  • SAM2695 strain, SAM2697 strain, SAM2698 strain, etc. separated at Tokyo University of Agriculture can be exemplified.
  • SAM2695 is under the accession number NITE BP-01721
  • SAM2697 is under the accession number NITE BP-01722
  • SAM2698 is under the accession number NITE BP-01723.
  • National Institute for Technology and Technology (NPMD) has been deposited (2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818).
  • Lactobacillus crustorum LMG 23699 T which is a type culture and can be obtained from the Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms, can be used. Lactobacillus crustorum LMG 23699 T can also be obtained as JCM 15951 T from the Japan Collection of Microorganisms, RIKEN BioResource Center. In the present invention, one of these strains may be used, or a combination of two or more strains may be used.
  • the intestinal barrier function enhancer of the present invention may contain one type of Lactobacillus crustorum strain, or may contain two or more types of Lactobacillus crustorum strains.
  • the Lactobacillus crustorum used for the present invention can be cultured using any liquid or solid medium capable of culturing lactic acid bacteria.
  • media include MRS media (MRS bouillon) and MRS agar media (Sharpe® M., et al, “Identification of the Lactic Acid Bacteria” in ”Identification Method for Microbiologists Part A” London and NeworYork, Academic Press, pages 65-79, 1966).
  • MRS medium and the MRS agar medium may be prepared according to a conventional method, and for example, those commercially available from Kanto Chemical Co., Inc. may be used.
  • milk from mammals such as cows, horses and sheep can also be used as the medium.
  • the culture temperature of Lactobacillus crustorum can be appropriately set between 15 and 45 ° C, preferably 30 ° C.
  • As the culture conditions for Lactobacillus crustorum either anaerobic culture or aerobic culture can be used.
  • the intestinal barrier function-enhancing agent of the present invention contains Lactobacillus crustorum cells or treated cells, and has an intestinal barrier function-enhancing action.
  • the intestinal barrier function refers to a function of preventing invasion of substances from outside the intestinal epithelial cells (inside the intestinal tract) into the body.
  • a state in which the invasion of a substance from the outside of the intestinal epithelial cell into the body is promoted as compared with a normal state is a state in which the permeability in the intestinal epithelial cell is increased.
  • the enhancement of the intestinal barrier function means both suppression of increase in permeability in intestinal epithelial cells and reduction in permeability in intestinal epithelial cells. For example, normalizing or strengthening the tight junction structure that adheres intestinal epithelial cells to each other, or normalizing or enhancing the function of the transporter that exists in the intestinal epithelial cells and discharges foreign substances from the cells Is enhanced.
  • the effects of intestinal barrier function enhancement include, for example, a decrease in the amount of substance that moves from the intestinal side of the intestinal epithelial cell to the inside of the body, and the electrical resistance value of the intestinal epithelial cell (transepithelial electric resistance: TER) ) Is indicated by a rise.
  • TER in human intestinal epithelial cells
  • the method can be suitably used. Specifically, when a test substance is added to Caco2 monolayer cultured cells and TER is increased compared to control cells, it can be evaluated that the test substance has an intestinal barrier function enhancing effect. it can.
  • the intestinal barrier function-enhancing agent of the present invention contains Lactobacillus crustorum cells or treated cells.
  • bacteria is used as a term meaning both live cells and dead cells.
  • the cells may be purified by removing the culture supernatant, or may contain impurities such as a solid medium and a liquid medium.
  • the microbial cell contained in the intestinal barrier function enhancer of the present invention may be in a wet state or a dry state.
  • the wet microbial cells may include, for example, a culture containing Lactobacillus crustorum microbial cells and a solid or liquid medium as it is, or a concentrate obtained by concentrating the culture may be included in the intestinal barrier function-enhancing agent of the present invention. it can.
  • the dried microbial cells can be added to the intestinal barrier function-enhancing agent of the present invention as they are, or powdered and granulated from the dried microbial cells by a method such as spray drying, freeze drying, or vacuum drying. .
  • a dead cell is obtained by sterilizing a culture of Lactobacillus crustorum, a concentrate of the culture, a purified cell, or a dried cell by heat treatment, radiation treatment, or the like.
  • the intestinal barrier function enhancer of the present invention can also contain a Lactobacillus crustorum treated bacterial product.
  • the treated cell product is a lysed cell lysate obtained by enzymatic treatment such as crushed cell material, crushed cell material, cell wall degrading enzyme, etc.
  • Means a culture after removing the microbial cells such as immobilized microbial cells immobilized on a solid carrier, microcapsules, etc. or microbial cell culture supernatant.
  • Lactobacillus crustorum cells or treated cells can be used as they are as intestinal barrier function enhancers.
  • filler to the microbial cell of Lactobacillus crustorum, or a microbial cell processed material can also be used as an intestinal barrier function enhancer.
  • the carrier include a medium, water, physiological saline, ethanol, propylene glycol, glycerin and the like.
  • excipients examples include glucose, sucrose, lactose, dextrin, cyclodextrin, xanthan gum, guar gum, gum arabic, tragacanth gum, gellan gum, locust bean gum, carrageenan, pectin, agar and the like.
  • emulsifiers, tonicity agents (isotonic agents), buffers, solubilizers, preservatives, stabilizers, antioxidants, and the like that are generally used in formulation can be appropriately blended.
  • the content of Lactobacillus crustorum microbial cells or processed microbial cells, which are active ingredients of the intestinal barrier function enhancer of the present invention, can be arbitrarily determined in view of the effect.
  • the dry weight of the cells is preferably contained in the intestinal barrier function enhancer in an amount of 0.00001 to 99.9% by weight, and 0.0005 to 50% by weight. More preferably, it is contained in an amount of 0.0001 to 10% by weight.
  • the number of cells is preferably in the range of 1.0 ⁇ 10 2 to 1.0 ⁇ 10 12 cells / g, and in the range of 1.0 ⁇ 10 6 to 1.0 ⁇ 10 12 cells / g.
  • a treated product of Lactobacillus crustorum as an active ingredient, it is preferably contained in the intestinal barrier function enhancer as a solid component weight in an amount of 0.00001 to 99.9% by weight, and 0.0005 to 50% by weight. More preferably, it is contained in an amount of 0.0001 to 10% by weight.
  • the Lactobacillus crustorum microbial cells and the treated microbial products are used in combination as active ingredients, the dry weight of the microbial cells and the solid component weight of the treated microbial cells are combined and 0 in the intestinal barrier function enhancer.
  • the content is preferably 0.0001 to 99.9% by weight, more preferably 0.0005 to 50% by weight, and still more preferably 0.0001 to 10% by weight.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising the above intestinal barrier function enhancer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains an intestinal barrier function enhancer, it is effective for the prevention and treatment of conditions or diseases associated with abnormal intestinal barrier function.
  • Conditions or diseases associated with abnormal bowel barrier function include, but are not limited to, obesity, diabetes, hypertension, hyperlipidemia, inflammatory bowel disease, food allergies and the like.
  • the obese state refers to a state in which the proportion of body weight is larger than the height due to an increase in the number of fat cells or excessive accumulation of fat droplets in the fat cells.
  • the state of obesity includes a state that does not lead to obesity as a disease (a pathological condition that is associated with or is predicted to be associated with obesity caused by obesity).
  • a condition in which one or more diseases selected from the group consisting of diabetes, hypertension and hyperlipidemia are present can be regarded as a pre-stage of metabolic syndrome.
  • a state in which two or more diseases selected from the group consisting of diabetes, hypertension and hyperlipidemia are combined is also called metabolic syndrome.
  • preventing a condition or disease refers to increasing the resistance of a subject to the condition or disease and preventing the onset of the condition or disease.
  • treatment of a condition or disease refers to restoring a subject from the condition or disease, improving the severity of the condition or disease, or preventing progression of the condition or disease. .
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated according to the purpose by a general method together with pharmacologically acceptable carriers and excipients.
  • the carrier include a medium, water, physiological saline, ethanol, propylene glycol, glycerin and the like.
  • excipients include glucose, sucrose, lactose, dextrin, cyclodextrin, xanthan gum, guar gum, gum arabic, tragacanth gum, gellan gum, locust bean gum, carrageenan, pectin, agar and the like.
  • emulsifiers, tonicity agents (isotonic agents), buffers, solubilizers, preservatives, stabilizers, antioxidants, and the like that are generally used in formulation can be appropriately blended.
  • the pharmaceutical composition of the present invention does not impair the intestinal barrier function enhancing effect of Lactobacillus crustorum cells or treated cells, that is, it has an unfavorable interaction by combining with Lactobacillus crustorum cells or treated cells.
  • other additives such as minerals; vitamins such as vitamin E, vitamin C, and vitamin A; nutritional ingredients; fragrances; Any of these additives commonly used in pharmaceuticals can be used.
  • one or more other physiologically active ingredients can be mixed in the pharmaceutical composition of the present invention as long as the effect of enhancing the intestinal barrier function of the Lactobacillus crustorum cells or the treated cells is not impaired.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used in combination with other drugs.
  • the pharmaceutical composition of the present invention and other drugs may be used as one composition, and the pharmaceutical composition of the present invention and other drugs You may use for the combined administration in which a chemical
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered before, simultaneously with, or after administration of other drugs.
  • anti-obesity drugs such as mazindol and orlistat, tolbutamide, nateglinide, acarbose, metformin, pioglitazone, sitagliptin, epalrestat and other antidiabetic drugs, chlorthalidone, hydrochlorothiazide, indapamide, furosemide, torasemide, spironolactone, etc.
  • Diuretics calcium antagonists such as nifedipine, amlodipine and diltiazem, angiotensin converting enzyme inhibitors such as imidapril and benazepril, angiotensin receptor antagonists such as losartan and valsartan, direct renin inhibitors such as aliskiren, phentolamine and prazosin ⁇ receptor blocker, ⁇ receptor blocker such as atenolol and seriprolol, ⁇ 1 ⁇ blocker such as carvedilol, and ⁇ 2 receptor stimulation such as clonidine Drugs, statin lipid lowering drugs such as mevastatin, pravastatin and atorvastatin, fibrate lipid lowering drugs such as bezafibrate and fenofibrate, resins (bile acid binding drugs) such as colestimide, and other lipid lowering drugs such as probucol and ezetimibe Can be mentioned.
  • calcium antagonists such as nifedip
  • the form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and is, for example, a solid form such as a powder, a granule, or a tablet; a liquid such as a solution, an emulsion, or a dispersion; or a paste It can be prepared in any form such as a semi-solid form.
  • Specific examples of the dosage form include powders, granules, fine granules, tablets, pills, troches, capsules (including soft capsules and hard capsules), chewable agents, and solutions.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises Lactobacillus crustorum cells in an amount of preferably 0.00001 to 99.9% by weight, more preferably 0.0001 to 10% by weight, based on the dry weight of the cells. Contains. Also, as one aspect, the pharmaceutical composition of the present invention comprises a treated product of Lactobacillus crustorum, preferably 0.00001 to 99.9% by weight, more preferably 0.0001 to 10% by weight as a solid component weight. Contained in an amount. Moreover, as one aspect, the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0 in the amount of Lactobacillus crustorum cells and the treated product thereof, which is the combined amount of the dry weight of the cells and the solid component weight of the treated product. It is contained in an amount of 0.0001 to 99.9% by weight, more preferably 0.0001 to 10% by weight.
  • the dosage amount and dosage form of the pharmaceutical composition of this invention according to a subject, a disease state, its progress, and other conditions.
  • the Lactobacillus crustorum cells are 0.01 per day. It may be taken orally in 1 to 3 times a day so that the dose is about 1000 mg, preferably about 0.1 to 200 mg, more preferably about 0.3 to 2 mg.
  • the number of cells per day is 1.0 ⁇ 10 6 or more / kg body weight, preferably 1.0 ⁇ 10 7 or more / kg body weight, more preferably 1.0 ⁇ 10 8 or more / kg body weight. It is recommended to take orally in 1 to several times.
  • the Lactobacillus crustorum treated cells for example, for oral administration for the purpose of obtaining an effect of enhancing intestinal barrier function in humans (adults), the Lactobacillus crustorum treated cells must be treated as a solid component.
  • the dose may be continuously administered about 1 to 3 times a day so that the weight is 0.01 to 1000 mg per day, preferably 0.1 to 200 mg, more preferably about 0.3 to 2 mg.
  • Lactobacillus crustorum cells and treated cells are used in combination, for example, in the case of oral administration for the purpose of obtaining an intestinal barrier function enhancement effect in humans (adults), Lactobacillus crustorum cells and The amount of the treated microbial cell product is 0.01 to 1000 mg, preferably 0.1 to 200 mg, more preferably 0.3, per day as the total amount of the dry weight of the microbial cell and the solid component weight of the microbial cell processed product. It may be administered continuously about 1 to 3 times a day so that the dose is about 2 mg.
  • the present invention also provides a food or drink containing the intestinal barrier function enhancer.
  • the food / beverage product of the present invention contains an intestinal barrier function-enhancing agent, obesity, diabetes, hypertension, hyperlipidemia, inflammatory bowel disease, food allergies, or other conditions or diseases associated with abnormal intestinal barrier function. It is also effective for prevention and treatment.
  • the food and drink of the present invention may be in any form, for example, juices, milk, milk drinks, soft drinks, tea drinks, drinks such as drinks, liquid foods such as soups and stews, pastes such as jams and yogurt Foods, semi-solid foods such as jelly and gummi, solid foods such as bread, cakes, strawberries, cookies and gums, oil-containing foods such as dressings and mayonnaise, and forms of pharmaceutical preparations such as capsules, tablets and troches be able to.
  • Further examples of the food and drink of the present invention include nutritional supplements, health foods, functional foods, infant foods, infant formulas, premature infant formulas, elderly foods, beverages, etc. It is not limited.
  • Nutritional supplements are foods that are enriched with specific nutritional ingredients.
  • the health food refers to food that is considered healthy or healthy, and includes nutritional supplements (supplements), natural foods, diet foods, and the like.
  • Functional food means food for replenishing nutritional components that fulfill the body's regulatory functions, and is synonymous with food for specified health insurance use.
  • Infant food refers to food for children up to about 6 years old.
  • the food for the elderly refers to food that has been processed so that it can be easily digested and absorbed as compared to untreated food.
  • Infant formula refers to formula for feeding to children up to about 1 year old.
  • Premature infant formula refers to formula that is given to premature infants until about 6 months after birth.
  • the form of the food or drink of the present invention is not particularly limited, and is, for example, a solid state such as powder, granule, tablet, etc .; a liquid such as solution, emulsion, or dispersion; or a semisolid such as paste It can be prepared in any form such as a shape.
  • Specific examples of the dosage form include powders, granules, fine granules, tablets, pills, troches, capsules (including soft capsules and hard capsules), chewable agents, and solutions.
  • the food / beverage product of the present invention does not impair the intestinal barrier function enhancing effect of Lactobacillus crustorum cells or treated cells, that is, it causes an unfavorable interaction by combining with Lactobacillus crustorum cells or treated products.
  • minerals; vitamins such as vitamin E, vitamin C, and vitamin A; nutritional ingredients; fragrances; other additives such as pigments can be mixed. Any of these additives commonly used for food and drink can be used.
  • one or more other physiologically active ingredients can be mixed in the food or drink of the present invention as long as the effect of enhancing the intestinal tract barrier function of the Lactobacillus crustorum cells or the processed microbial cells is not impaired.
  • the food or drink of the present invention is a microbial cell of Lactobacillus crustorum, preferably in an amount of 0.00001 to 99.9% by weight, more preferably 0.0001 to 10% by weight, as the dry weight of the cell. contains. Also, as one aspect, the food or drink of the present invention is preferably a Lactobacillus crustorum cell-treated product, preferably 0.00001 to 99.9% by weight, more preferably 0.0001 to It is contained in an amount of 10% by weight.
  • the food / beverage products of this invention Preferably as a quantity which combined the dry weight of a microbial cell, and the solid component weight of a microbial cell processed material of the microbial cell and microbial cell processed product of Lactobacillus crustorum. It is contained in an amount of 00001 to 99.9% by weight, more preferably 0.0001 to 10% by weight.
  • the agent for enhancing the intestinal tract barrier function of the clock gene of the present invention contains, as an active ingredient, a bacterial body of Lactobacillus crustorum or a treated product thereof, thereby enhancing the intestinal barrier function and preventing a state or disease based on an abnormality in the intestinal barrier function. Can be prevented or treated. And it can provide as a pharmaceutical composition or food-drinks.
  • the present invention is a method for producing a pharmaceutical composition or a food or drink comprising a step of blending a Lactobacillus crushtorum fungus body or an intestinal barrier function enhancer containing a treated cell product.
  • Lactobacillus crustorum SAM2695 strain Lactobacillus crustorum SAM2697 strain
  • Lactobacillus crustorum SAM2698 strain As Lactobacillus crustorum, Lactobacillus crustorum SAM2695 strain, Lactobacillus crustorum SAM2697 strain, Lactobacillus crustorum SAM2698 strain, and type culture Lactobacillus crustorum JCM 15951 T were used.
  • human intestinal epithelial cells Caco2 were used. These cells are derived from human colon cancer and are widely used as an in vitro small intestine model, and it is known that there is a high correlation between the cell's barrier function and transepithelial resistance ( ⁇ TER). The positive change of TER value due to co-culture of Lactobacillus crustorum and Caco2 was evaluated as an index of intestinal barrier hyperfunction.
  • ⁇ Method> Preparation of Bacteria
  • 10 ⁇ l of MRS medium was inoculated with 100 ⁇ l from a storage vial of each strain and cultured at 30 ° C. for 24 hours.
  • 1 liter of MRS medium was inoculated with 10 ml of the preculture and cultured at 30 ° C. for 24 hours.
  • the culture solution was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was removed. Sterile water was added for washing, followed by centrifugation under the same conditions. The supernatant was removed, washed once more, and finally suspended with sterilized water.
  • Caco2 was seeded on apical wells on a Millicell 24-well cell culture plate (MERCK MILLIPORE) at 0.7 ⁇ 10 5 cells / well and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 2 weeks.
  • Medium is Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Sigma-Aldrich, D6429), Fetal Bovine Serum (FBS) (Equiteck Bio, Inc) and Antibiotic-Antimycotic Mixed Stock Solution (100x) (Nacalai Tesque, Inc.) as an antibiotic. It was.
  • the medium was prepared by adding 50 ml FBS and 5 ml antibiotics to 500 ml DMEM.
  • the medium was added to 400 ⁇ l in the apical well and 800 ⁇ l in the basolateral well. The medium was changed every 2-3 days.
  • Caco2 monolayer cells having a membrane resistance value of 300 ⁇ ⁇ cm 2 or more before addition of Lactobacillus crustorum were used in the assay as sufficiently tight junctions were formed.
  • Pre-culture was performed by inoculating 10 ⁇ ml MRS medium with 100 ⁇ l ⁇ l from the strain storage vial and culturing at 30 ° C for 24 hours. Thereafter, 1 liter of MRS medium was inoculated with 10 ml of the preculture and cultured at 30 C for 24 hours. Next, the culture solution was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was removed. Sterile water was added for washing, followed by centrifugation under the same conditions. The supernatant was removed, washed once more, and finally suspended with sterilized water.
  • Caco2 cells were seeded on a 12-well cell culture plate (BD Falcon) under conditions of 0.63 ⁇ 10 5 cells / 2 ml / well and cultured for 2 weeks under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Medium is Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Sigma-Aldrich, D6429), Fetal Bovine Serum (FBS) (Equiteck Bio, Inc), and Antibiotic-Antimycotic Mixed Stock Solution (100x) (Nacalai Tesque, Inc.) as an antibiotic. It was.
  • the medium was prepared by adding 50 ml FBS and 5 ml antibiotics to 500 ml DMEM. The medium was changed every 2-3 days.
  • FIG. 2 shows the results of analysis focusing on the tight junction-related gene claudin.
  • the expression level of claudin 1 (CLDN 1) was increased in Caco2 cells co-cultured with Lactobacillus crustorum SAM 2698 (about 1.1 times).
  • the expression levels of CLDN 3 and CLDN4 were also significantly increased (about 1.6 times each).
  • Lactobacillus crustorum SAM 2698 strain was used as Lactobacillus crustorum.
  • test animals used were C57BL / 6J mice, males and 7 weeks old.
  • the test group was a group administered with sterilization and Lactobacillus crustorum SAM 2698 bacterium. The number of n in each group was 6.
  • RNA from small intestinal epithelial tissue 150-212 ⁇ m glass beads (manufactured by SIGMA) were added to the small intestinal epithelial tissue and treated at 3000 rpm for 3 minutes using a multi-bead shocker (manufactured by YASUI KIKAI). Thereafter, RNA was prepared using RNeasy Mini Kit (QIAGEN) according to the protocol.
  • Primer design Primer sequences for the mouse CLDN1 gene were designed based on publicly available gene sequence information. The sequence is as follows. Mouse CLDN1 forward primer: CCTATGCTGGGGACAACATC / mouse CLDN1 reverse primer: TGCACCTCATCATCTTCCAG. In the expression analysis, GAPDH gene expression was used as a control. The primer sequence for the GAPDH gene was designed with reference to Housekeeping Gene Primers for RT-PCR published by ShineGene Molecular Biotech, Inc. The sequence is as follows. Mouse GAPDH F49: GGTGAAGGTCGGTGTGAACG / R281: CTCGCTCCTGGAAGATGGTG.
  • RNA-to-CTTM 1-Step Kit (Applied Biosystems) according to the protocol of the kit.
  • FIG. 3 shows the results of analysis focusing on the tight junction-related gene CLDN1.
  • CLDN 1 claudin 1
  • Lactobacillus crustorum SAM2695 strain Lactobacillus crustorum SAM2698 strain
  • type culture Lactobacillus crustorum JCM 15951 T were used.
  • test animals used were C57BL / 6J mice, males and 7 weeks old.
  • the test group was a group in which each live Lactobacillus crushtorum was administered to a normal diet group, a 60% high fat diet group, and a 60% high fat diet.
  • the number of n in each group was 10.
  • Test period was 25 days, and the live cells were orally administered with 250 ⁇ l (3 billion cells / day / animal) of a suspension of 12 billion cells / ml.
  • Animal Experiment Feed Normal diet and 60% high-fat diet used Research Diet's refined diet 10kcal% fat (lard) and refined diet 60kcal% fat (lard).
  • Glucose metabolism abnormality suppression test (sugar tolerance test) On the 25th day of the test, a glucose tolerance test was performed. A 20% glucose solution was orally administered under conditions of 1 g / kg (5 ml / kg), and blood was collected from the tail vein before administration and 15, 30, 60 and 90 minutes after administration. Blood glucose was measured at Glutest neo super (Sanwa Chemical Laboratory Co., Ltd.).
  • the intestinal barrier function-enhancing agent of the present invention can enhance the intestinal barrier function by including a bacterial body or a processed bacterial body of Lactobacillus crushtorum.
  • the intestinal barrier function-enhancing agent of the present invention is a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of conditions or diseases caused by diabetes, hypertension, hyperlipidemia, obesity, and disorders of intestinal barrier function such as metabolic syndrome, or food and drink It can be used effectively for goods.

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Abstract

　腸管バリア機能を亢進することができ、それによってメタボリックシンドロームを予防または治療することができる腸管バリア機能亢進剤、ならびにそれを含む医薬品および飲食品を提供する。　Lactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物を含む腸管バリア機能亢進剤。本発明の腸管バリア機能亢進剤は、腸管バリア機能を亢進させ、また、メタボリックシンドローム等の腸管バリア機能の障害に起因する状態または疾患の予防及び治療に有効に機能する。

Description

乳酸菌を含む腸管バリア機能亢進剤
　本発明は、乳酸菌を含む飲食品及び腸管バリア機能亢進剤、ならびに腸管バリア機能亢進剤を含む医薬組成物および飲食品に関する。より詳細には、Lactobacillus crustorumを含む飲食品及び腸管バリア機能亢進剤、ならびに腸管バリア機能亢進剤を含む医薬組成物および飲食品に関する。
　糖尿病、高血圧、高脂血症等の生活習慣病と呼ばれる疾患は、内臓脂肪型肥満と密接に関連している。内臓脂肪型肥満に加えて、高血糖、高血圧、高脂血症のうちいずれか２つ以上をあわせもった状態はメタボリックシンドローム（代謝症候群または内臓脂肪症候群）と呼ばれる。特に飽食状態にある先進国ではメタボリックシンドローム患者数が増加傾向にあり、医療費が増大する懸念もあることから、メタボリックシンドロームの対策が急務となっている。
　メタボリックシンドロームの共通の基盤病態として、生体における軽度の慢性的な炎症が指摘されている（非特許文献２、３）。炎症を誘発する物質としては、飽和脂肪酸、アルコール、および歯周病菌等が知られている。
　近年、腸内細菌や腸内環境と、慢性的な炎症を伴う肥満との関係も指摘されている（非特許文献４）。ヒトの腸内には一人あたり１００種類以上、１００兆個以上の腸内細菌が腸内フローラ（腸内微生物叢）を形成している。腸内細菌のうちのあるものは生体内で炎症反応を引き起こしうる。たとえば、マウスやヒトにおいて、腸内のグラム陰性細菌の細胞壁成分であるリポ多糖（lipopolysaccharide, LPS）が炎症性サイトカインの放出を促すことが示されている（非特許文献４）。
　腸管上皮細胞の下には、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞のような免疫系の細胞が多数存在している。通常、腸管上皮細胞はタイトジャンクション構造によって互いに強固に接着されており、高分子量物質は細胞間隙を透過しないよう厳密に制御されている。また、腸管上皮細胞には疎水性の異物を細胞から排出するためのトランスポーターも存在する。これらのタイトジャンクション構造やトランスポーターなどが、異物の侵入を防ぐ腸管バリア機能を担っている。しかし、飽和脂肪酸やアルコール等の原因によって腸管バリアが傷害されて腸管透過性が上昇すると、腸管内に存在する腸内細菌やその菌体成分等の高分子量物質が、細胞間隙を介して生体内へ移行し、免疫系細胞を刺激するなどして炎症性サイトカインの放出を促し、炎症を誘発する。
　腸管バリア機能を亢進して慢性的な炎症を防ぎ、それによってメタボリックシンドロームを予防または治療することができる手段が望まれている。
　乳酸を産生する細菌である乳酸菌は、腸内フローラのバランスを整え、健康な腸内環境を維持するために重要な役割を果たしていることが知られている。腸管バリア機能に対する乳酸菌の影響を検討した例としては、腸細胞に付着することができるラクトバチルス菌がカルシウム等のミネラルの腸管透過性を向上させることが報告されている（特許文献１）。また、Lactobacillus rhamnosus OLL2838、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus MEP190901、Lactobacillus gasseri MEP190903、およびLactobacillus gasseri MEP190903、ならびにそれらの菌体成分であるリポテイコ酸に腸管透過性の上昇を抑制する作用があることが報告されている（特許文献２）。
特表2002-507997 特開2008－212006
平成２３年　国民健康・栄養調査 FEBS Lett., 582, 97-105 (2008) J. Clin. Invest., 116, 1793-1801 (2006) 腸内細菌学雑誌, 24, 193-201 (2010)
　本発明は、腸管バリア機能を亢進することができ、それによってメタボリックシンドロームを予防または治療することができる腸管バリア機能亢進剤、ならびにそれを含む医薬品および飲食品を提供することを目的とする。
　本発明者らは、Lactobacillus crustorumが培養ヒト腸管上皮細胞において腸管バリア機能の指標である経上皮膜抵抗値を上昇させることを見出した。また、Lactobacillus crustorumが、培養ヒト腸管上皮細胞およびマウス小腸上皮においてタイトジャンクション関連遺伝子の発現を誘導することも見出した。さらに、高脂肪食を摂取させたマウスにLactobacillus crustorumを投与すると、糖代謝異常抑制効果が示されることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、これらに限定されるわけではないが以下を包含する。
［１］　Lactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物を含む、飲食品。
［２］　Lactobacillus crustorumがLactobacillus crustorum SAM2695株、Lactobacillus crustorum SAM2697株、Lactobacillus crustorum SAM2698株、Lactobacillus crustorum JCM 15951T株、または２以上のこれらの組み合わせである、請求項１に記載の飲食品。
［３］　Lactobacillus crustorumの生菌体を含む、［１］または［２］に記載の飲食品。
［４］　Lactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物を含む、腸管バリア機能亢進剤。
［５］　Lactobacillus crustorumがLactobacillus crustorum SAM2695株、Lactobacillus crustorum SAM2697株、Lactobacillus crustorum SAM2698株、Lactobacillus crustorum JCM 15951T株、または２以上のこれらの組み合わせである、請求項４に記載の腸管バリア機能亢進剤。
［６］　Lactobacillus crustorumの生菌体を含む、［４］または［５］に記載の腸管バリア機能亢進剤。
［７］　［４］～［６］のいずれかに記載の腸管バリア機能亢進剤を含む、糖尿病、高血圧、高脂血症、および肥満からなる群より選択される１以上の状態もしくは疾患の予防または治療のための医薬組成物。
［８］　［４］～［６］のいずれかに記載の腸管バリア機能亢進剤を含む飲食品。
［９］　糖尿病、高血圧、高脂血症、および肥満からなる群より選択される１以上の状態もしくは疾患の予防または治療のための、［８］に記載の飲食品。
［１０］　状態または疾患が糖尿病である、［７］に記載の医薬組成物または［９］に記載の飲食品。
［１１］　状態または疾患が肥満と、糖尿病、高血圧および高脂血症からなる群より選択される１以上の疾患との組み合わせである、［７］に記載の医薬組成物または［９］に記載の飲食品。
［１２］　糖尿病が２型糖尿病である、［７］～［１１］のいずれかに記載の医薬組成物または飲食品。
［１３］　［４］～［６］のいずれかに記載の腸管バリア機能亢進剤を配合する工程を含むことを特徴とする、医薬組成物または飲食品の製造方法。
［１４］　医薬組成物または飲食品が糖尿病、高血圧、高脂血症、および肥満からなる群より選択される１以上の状態もしくは疾患の予防または治療のためのものである、［１３］に記載の製造方法。
［１５］　状態または疾患が糖尿病である、［１４］に記載の製造方法。
［１６］　状態または疾患が肥満と、糖尿病、高血圧および高脂血症からなる群より選択される１以上の疾患との組み合わせである、［１４］に記載の製造方法。
［１７］　糖尿病が２型糖尿病である、［１３］～［１６］のいずれかに記載の製造方法。
　本発明の腸管バリア機能亢進剤は、Lactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物を含むことにより、腸管バリア機能を亢進させることができる。また、本発明の腸管バリア機能亢進剤は、糖尿病、高血圧、高脂血症、および肥満、ならびにメタボリックシンドローム等の腸管バリア機能の障害に起因する状態もしくは疾患の予防又は治療のための医薬組成物または飲食品のために効果的に用いることができる。
図１は、ヒト腸管上皮細胞Caco2を用いたLactobacillus crustorumの腸管バリア機能亢進の評価結果を示す。 図２は、Lactobacillus crustorumと共培養した腸管上皮細胞Caco2におけるマイクロアレイ解析結果を示す。 図３は、Lactobacillus crustorumを投与したマウスにおける小腸上皮組織のクラウディン１（CLDN1）遺伝子発現の変化を示す。 図４は、高脂肪食負荷モデルマウスに対するLactobacillus crustorumの糖代謝異常抑制効果を示す。 図５は、高脂肪食負荷モデルマウスに対するLactobacillus crustorumの糖代謝異常抑制効果を示す。
＜Lactobacillus crustorum＞
　Lactobacillus crustorumはラクトバチルス属に属する乳酸菌の一種で、小麦サワードウから分離され、新規な種として分類することが提唱されたものである（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2007), 57, 146101467）。サワードウとは、乳酸菌および酵母を含む複数の微生物を用いて、小麦粉やライ麦粉と水を混ぜた生地を発酵させたパン種をいう。
　Lactobacillus crustorumは以下の菌学的性質を有する。
形態的性質
（１）桿菌、２－１５μｍの長さ、０．５－１μｍの幅
（２）運動性：なし
（３）胞子形成：なし
培養的性質
（１）液体または固体ＭＲＳ培地中、嫌気的条件又は好気的条件においてよく生育する
（２）１５℃での生育：５、６、および７％食塩の存在下で生育する
（３）４５℃での生育：５、６、および７％食塩の存在下で生育する
生理学的性質
（１）グラム染色：陽性
（２）カタラーゼ試験：
（３）発酵形式：ホモ乳酸発酵
（４）アンモニウム産生（アルギニンから）：なし
（５）ガス産生（グルコースまたはグルコン酸塩）：なし
（６）酸の産生の有無（LMG 23699株、LMG 23701株、LMG 23702株、R-30103株について）：
　ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン、エスクリンおよびサリシン：あり
　グリセロール、エリスリトール、Ｄ－アラビノース、Ｌ－アラビノース、リボース、Ｄ－キシロース、Ｌ－キシロース、アドニトール、β－メチル－Ｄ－キシロシド、ソルボース、ダルシトール、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、α－メチル－Ｄ－マンノシド、α－メチル－Ｄ－グルコシド、メリビオース、ショ糖、イヌリン、メレジトース、ラフィノース、スターチ、グリコーゲン、キシリトール、Ｄ－ツラノース、Ｄ－リキソース、Ｄ－フコース、Ｌ－フコース、Ｄ－アラビトール、Ｌ－アラビトール、グルコネート、２－ケトグルコネート、および５－ケトグルコネート：なし。
　本発明には、上記の菌学的性質を有するLactobacillus crustorumに分類される細菌であればどのような株を用いてもよい。たとえば、東京農業大学で分離されたSAM2695株、SAM2697株、SAM2698株等を例示することができる。SAM2695株は受託番号NITE BP-01721として、SAM2697株は受託番号NITE BP-01722として、およびSAM2698株は受託番号NITE BP-01723として、いずれも平成25年10月17日付けで独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)（〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）寄託されている。また、タイプカルチャーであり、ベルギー微生物共同コレクション（Belgian  Co-ordinated Collections of Micro-organisms）から入手することができるLactobacillus crustorum LMG 23699Tも用いることができる。Lactobacillus crustorum LMG 23699Tは、JCM 15951Tとして独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（Japan Collection of Microorganisms）からも入手することができる。本発明においては、これらの菌株のうちの１種類を用いてもよいし、また、２種類以上の菌株の組み合わせを用いてもよい。たとえば、本発明の腸管バリア機能亢進剤は、1種類のLactobacillus crustorumの菌株を含んでいてもよいし、２種類以上のLactobacillus crustorumの菌株を含んでいてもよい。
　本発明のために用いるLactobacillus crustorumは、乳酸菌を培養することのできる液体培地または固体培地であればいかなるものを用いても培養することができる。培地の例としては、ＭＲＳ培地（ＭＲＳブイヨン）およびＭＲＳ寒天培地が挙げられる（Sharpe M., et al, "Identification of the Lactic Acid Bacteria" in "Identification Method for Microbiologists Part A" London and New York, Academic Press, pages 65-79, 1966）。ＭＲＳ培地およびＭＲＳ寒天培地は、定法に従って調製してもよいし、たとえば関東化学株式会社等から市販されているものを用いてもよい。また、ウシ、ウマ、ヒツジ等の哺乳類の乳を培地として用いることもできる。Lactobacillus crustorumの培養温度は１５～４５℃の間で適宜設定することができるが、３０℃が好ましい。Lactobacillus crustorumの培養条件は、嫌気培養および好気培養のいずれをも用いることができる。
＜腸管バリア機能亢進剤＞
　本発明の腸管バリア機能亢進剤は、Lactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物を含み、腸管バリア機能亢進作用を有する。
　本発明において、腸管バリア機能とは、腸管上皮細胞外（腸管内）から体内への物質の侵入を防ぐ機能をいう。正常な状態と比べて腸管上皮細胞外から体内への物質の侵入が促進されている状態を、腸管上皮細胞における透過性が上昇した状態と呼ぶ。腸管バリア機能の亢進とは、腸管上皮細胞における透過性の上昇を抑制すること、および腸管上皮細胞における透過性を低下させることのいずれをも意味する。たとえば、腸管上皮細胞を互いに接着するタイトジャンクション構造を正常化または強化することや、腸管上皮細胞に存在して異物を細胞から排出するトランスポーターの機能を正常化または強化することによって、腸管バリア機能が亢進される。
　腸管バリア機能亢進効果は、たとえば、腸管上皮細胞の腸管側から体内側へ移動する物質の量が減少することや、腸管上皮細胞の電気抵抗値（経上皮膜抵抗値（transepithelial electric resistance: TER））が上昇することによって示される。当業者は目的に応じて腸管バリア機能亢進効果の具体的な評価方法を選択することができるが、たとえば後述する実施例に示したように、ヒト腸管上皮細胞（Caco2細胞）におけるTERを測定する方法を好適に用いることができる。具体的には、Caco2単層培養細胞に被検物質を添加し、コントロール細胞とくらべてTERの上昇が示されれば、その被検物質には腸管バリア機能亢進効果があると評価することができる。
　本発明の腸管バリア機能亢進剤は、Lactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物を含む。本明細書では、生菌体と死菌体のいずれをも意味する用語として「菌体」を用いる。菌体は培養上清を除いて精製したものでも、固体培地や液体培地等の夾雑物が含まれるものでもよい。また、本発明の腸管バリア機能亢進剤に含まれる菌体は、湿潤な状態または乾燥した状態のいずれの状態でもよい。湿潤な状態の菌体は、たとえばLactobacillus crustorumの菌体と固体培地または液体培地とを含む培養物をそのまま、あるいは培養物を濃縮した濃縮物を本発明の腸管バリア機能亢進剤に含ませることができる。乾燥した状態の菌体は、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥等の方法によって乾燥した菌体をそのまま、あるいは粉末化、顆粒化したものを本発明の腸管バリア機能亢進剤に含ませることができる。死菌体は、Lactobacillus crustorumの培養物、培養物の濃縮物、精製した菌体、または乾燥した菌体を加熱処理や放射線処理等によって殺菌処理して得られる。また、本発明の腸管バリア機能亢進剤は、Lactobacillus crustorum菌体処理物を含むこともできる。菌体処理物とは、超音波破砕や物理破砕等の破砕処理または粉砕処理によって得られる菌体破砕物や菌体粉砕物、細胞壁分解酵素等の酵素処理によって得られる菌体溶解物、菌体を固体担体やマイクロカプセル等に固定化した固定化菌体等や菌体培養液上清のように菌体を除去した後の培養物を意味する。
　本発明では、Lactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物をそのまま腸管バリア機能亢進剤として用いることができる。また、Lactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物に、薬理学的に許容可能な担体や賦形剤を添加したものを、腸管バリア機能亢進剤として用いることもできる。担体の例としては、培地、水、生理食塩水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等が挙げられる。賦形剤の例としては、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、デキストリン、シクロデキストリン、キサンタンガム、グァーガム、アラビアガム、トラガントガム、ジェランガム、ローカストビーンガム、カラギーナン、ペクチン、寒天等が挙げられる。また、製剤化において一般的に使用される乳化剤、緊張化剤（等張化剤）、緩衝剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化剤、抗酸化剤等を適宜配合することもできる。
　本発明の腸管バリア機能亢進剤の有効成分であるLactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物の含量は、効果面を考慮して任意に決定することができる。たとえば、有効成分としてLactobacillus crustorumの菌体を用いる場合は、菌体の乾燥重量として腸管バリア機能亢進剤中に０．００００１～９９．９重量％含まれることが好ましく、０．０００５～５０重量％含まれることがより好ましく、０．０００１～１０重量％含まれることがさらに好ましい。あるいは、菌体数として、１．０×１０２～１．０×１０１２個／ｇの範囲内であることが好ましく、１．０×１０６～１．０×１０１２個／ｇの範囲内であることがより好ましい。また、有効成分としてLactobacillus crustorumの菌体処理物を用いる場合は、固形成分重量として腸管バリア機能亢進剤中に０．００００１～９９．９重量％含まれることが好ましく、０．０００５～５０重量％含まれることがより好ましく、０．０００１～１０重量％含まれることがさらに好ましい。また、有効成分としてLactobacillus crustorumの菌体と菌体処理物とを組み合わせて用いる場合は、菌体の乾燥重量と菌体処理物の固形成分重量とを合わせて、腸管バリア機能亢進剤中に０．００００１～９９．９重量％含まれることが好ましく、０．０００５～５０重量％含まれることがより好ましく、０．０００１～１０重量％含まれることがさらに好ましい。
＜腸管バリア機能亢進剤を含む医薬組成物＞
　本発明は、上記腸管バリア機能亢進剤を含む医薬組成物も提供する。
　本発明の医薬組成物は、腸管バリア機能亢進剤を含むため、腸管バリア機能の異常が関連する状態または疾患の予防および治療のためにも有効である。腸管バリア機能の異常が関連する状態または疾患には、制限されないが、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、炎症性腸疾患、食物アレルギー等が含まれる。ここで肥満の状態とは、脂肪細胞の数が増加したり、脂肪細胞に脂肪滴が過剰に蓄積されることによって、身長に比べて体重の割合が大きくなっている状態をいう。肥満の状態は、疾患としての肥満症（肥満に起因ないし関連する健康障害を合併するか、その合併が予測される病態）には至らない状態をも含む。肥満に加え、糖尿病、高血圧および高脂血症からなる群より選択される１以上の疾患とが併発している状態は、メタボリックシンドロームの前段階と位置づけることができる。また、肥満に加え、糖尿病、高血圧および高脂血症からなる群より選択される２以上の疾患とが併発している状態は、メタボリックシンドロームとも呼ばれる。
　本明細書で「状態または疾患の予防」というときは、状態又は疾患に対する対象の抵抗性を高めること、状態または疾患の発症を防止することを指す。また、本明細書で「状態または疾患の治療」というときは、対象を状態または疾患から回復させること、状態または疾患の重篤度を改善すること、状態または疾患の進行を防止することを指す。
　本発明の医薬組成物は、薬理学的に許容される担体や賦形剤等と共に、一般的な方法により目的に応じて製剤化することができる。担体の例としては、培地、水、生理食塩水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等が挙げられる。賦形剤の例としては、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、デキストリン、シクロデキストリン、キサンタンガム、グァーガム、アラビアガム、トラガントガム、ジェランガム、ローカストビーンガム、カラギーナン、ペクチン、寒天等が挙げられる。また、製剤化において一般的に使用される乳化剤、緊張化剤（等張化剤）、緩衝剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化剤、抗酸化剤等を適宜配合することもできる。
　本発明の医薬組成物には、Lactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物の腸管バリア機能亢進効果を損なわない、すなわち、Lactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り、必要に応じて、ミネラル；ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＡ等のビタミン類；栄養成分；香料；色素などの他の添加物を混合することができる。これらの添加物はいずれも医薬品に一般的に用いられるものが使用できる。また、本発明の医薬組成物には、Lactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物の腸管バリア機能亢進効果を損なわない限り、１以上の他の生理活性成分を混合することもできる。
　本発明の医薬組成物は、他の薬剤と組み合わせて用いてもよい。本発明の医薬組成物を他の薬剤との組み合わせで用いる場合は、本発明の医薬組成物と他の薬剤を合わせた１つの組成物として用いてもよく、本発明の医薬組成物と他の薬剤とがそれぞれ別個の配合物中に含まれる併用投与に用いてもよい。併用投与の場合は、本発明の医薬組成物の投与が他の薬剤の投与の前に、それと同時に、またはその後に行われてよい。
　他の薬剤の例としては、たとえばマジンドール、オルリスタット等の抗肥満薬、トルブタミド、ナテグリニド、アカルボース、メトホルミン、ピオグリタゾン、シタグリプチン、エパルレスタット等の抗糖尿病薬、クロルタリドン、ヒドロクロロチアジド、インダパミド、フロセミド、トラセミド、スピロノラクトン等の利尿薬、ニフェジピン、アムロジピン、ジルチアゼム等のカルシウム拮抗薬、イミダプリル、ベナゼプリル等のアンジオテンシン変換酵素阻害薬、ロサルタン、バルサルタン等のアンジオテンシン受容体拮抗薬、アリスキレン等の直接的レニン阻害薬、フェントラミン、プラゾシン等のα受容体遮断薬、アテノロール、セリプロロール等のβ受容体遮断薬、カルベジロール等のα１β遮断薬、クロニジン等のα２受容体刺激薬、メバスタチン、プラバスタチン、アトルバスタチン等のスタチン系脂質降下薬、ベザフィブラート、フェノフィブラート等のフィブラート系脂質降下薬、コレスチミド等のレジン（胆汁酸結合薬）、プロブコール、エゼチミブ等のその他の脂質降下薬などが挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、その形態は特に制限されるものではなく、例えば、粉末状、顆粒状、錠剤状などの固体状；溶液状、乳液状、分散液状等の液状；またはペースト状等の半固体状等の、任意の形態に調製することができる。具体的な剤形としては、散剤、顆粒剤、細粒剤、錠剤、丸剤、トローチ剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤を含む）、チュアブル剤、溶液剤などが例示できる。
　一態様として、本発明の医薬組成物は、Lactobacillus crustorumの菌体を、菌体の乾燥重量として、好ましくは０．００００１～９９．９重量％、より好ましくは０．０００１～１０重量％の量で含有する。また、一態様として、本発明の医薬組成物は、Lactobacillus crustorumの菌体処理物を、固形成分重量として好ましくは０．００００１～９９．９重量％、より好ましくは０．０００１～１０重量％の量で含有する。また、一態様として、本発明の医薬組成物は、Lactobacillus crustorumの菌体および菌体処理物を、菌体の乾燥重量と菌体処理物の固形成分重量とを合わせた量として、好ましくは０．００００１～９９．９％重量％、より好ましくは０．０００１～１０重量％の量で含有する。
　本発明の医薬組成物の投与量や投与形態は、対象、病態やその進行状況、その他の条件によって適宜選択すればよい。たとえば、Lactobacillus crustorumの菌体を用いる場合は、例えば、ヒト（成人）を対象に腸管バリア機能亢進効果を得ることを目的として経口 摂取する場合には、Lactobacillus crustorumの菌体を１日当たり０．０１～１０００ ｍｇ、好ましくは０．１～２００ ｍｇ、さらに好ましくは０．３～２ｍｇ程度となるように、１日に1～3回程度に分けて経口摂取するとよい。あるいは、菌体数として、一日当たり１．０×１０6個以上／ｋｇ体重、好ましくは１．０×１０７個以上／ｋｇ体重、更に好ましくは、１．０×１０８個以上／ｋｇ体重となる量を、１～数回に分けて経口摂取するとよい。Lactobacillus crustorumの菌体処理物を用いる場合は、例えば、ヒト（成人）を対象に腸管バリア機能亢進効果を得ることを目的として経口投与する場合には、Lactobacillus crustorumの菌体処理物を、固形成分重量として１日当たり０．０１～１０００ ｍｇ、好ましくは０．１～２００ｍｇ、さらに好ましくは０．３～２ｍｇ程度となるように、１日に1～3回程度連続投与するとよい。Lactobacillus crustorumの菌体および菌体処理物を合わせて用いる場合は、例えば、ヒト（成人）を対象に腸管バリア機能亢進効果を得ることを目的として経口投与する場合には、Lactobacillus crustorumの菌体および菌体処理物を、菌体の乾燥重量と菌体処理物の固形成分重量とを合わせた量として１日当たり０．０１～１０００ ｍｇ、好ましくは０．１～２００ ｍｇ、さらに好ましくは０．３～２ｍｇ程度となるように、１日に1～3回程度連続投与するとよい。
＜飲食品＞
　本発明は、上記腸管バリア機能亢進剤を含む飲食品も提供する。
　本発明の飲食品は、腸管バリア機能亢進剤を含むため、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、炎症性腸疾患、食物アレルギーのような、腸管バリア機能の異常が関連する状態または疾患の予防および治療のためにも有効である。
　本発明の飲食品は、いかなる形態であってもよく、たとえばジュース、牛乳、乳飲料、清涼飲料、茶飲料、ドリンク剤等の飲料、スープ、シチュー等の液状食品、ジャム、ヨーグルト等のペースト状食品、ゼリー、グミ等の半固形状食品、パン、ケーキ、飴、クッキー、ガム等の固形状食品、ドレッシング、マヨネーズ等の油脂含有食品、カプセル、タブレット、トローチ等の医薬製剤の形態等とすることができる。
　本発明の飲食品のさらなる例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、乳児用調製乳、未熟児用調製乳、老人用食品、飲料等があげられるが、これらに限定されない。
　栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品（サプリメント）、自然食品、ダイエット食品等が含まれる。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保険保健用途食品と同義である。幼児用食品とは、約６歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。乳児用調製乳とは、約１歳までの子供に与えるための調製乳をいう。未熟児用調製乳とは、未熟児が生後約６ヶ月になるまで与えるための調製乳をいう。
　本発明の飲食品の形態は特に制限されるものではなく、例えば、粉末状、顆粒状、錠剤状などの固体状；溶液状、乳液状、分散液状等の液状；またはペースト状等の半固体状等の、任意の形態に調製することができる。具体的な剤形としては、散剤、顆粒剤、細粒剤、錠剤、丸剤、トローチ剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤を含む）、チュアブル剤、溶液剤などが例示できる。
　本発明の飲食品には、Lactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物の腸管バリア機能亢進効果を損なわない、すなわち、Lactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り、必要に応じて、ミネラル；ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＡ等のビタミン類；栄養成分；香料；色素などの他の添加物を混合することができる。これらの添加物はいずれも飲食品に一般的に用いられるものが使用できる。
　また、本発明の飲食品には、Lactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物の腸管バリア機能亢進効果を損なわない限り、１以上の他の生理活性成分を混合することもできる。
　一態様として、本発明の飲食品は、Lactobacillus crustorumの菌体を、菌体の乾燥重量として、好ましくは０．００００１～９９．９重量％、より好ましくは０．０００１～１０重量％の量で含有する。また、一態様として、本発明の飲食品は、Lactobacillus crustorumの菌体処理物を、菌体処理物の固形成分重量として好ましくは０．００００１～９９．９重量％、より好ましくは０．０００１～１０重量％の量で含有する。また、一態様として、本発明の飲食品は、Lactobacillus crustorumの菌体および菌体処理物を、菌体の乾燥重量と菌体処理物の固形成分重量とを合わせた量として、好ましくは０．００００１～９９．９％重量％、より好ましくは０．０００１～１０重量％の量で含有する。
＜医薬組成物または飲食品の製造方法＞
　本発明の時計遺伝子の腸管バリア機能亢進剤は、有効成分として、Lactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物を含むことにより、腸管バリア機能を亢進し、腸管バリア機能の異常に基づく状態もしくは疾患を予防または治療することができる。そして、医薬組成物または飲食品として提供することができる。
　すなわち、本発明は別の観点からは、Lactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物を含む腸管バリア機能亢進剤を配合する工程を含む医薬組成物または飲食品の製造方法である。
　以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
ヒト腸管上皮細胞Caco2を用いたLactobacillus crustorumの腸管バリア機能亢進の評価
＜材料＞
　Lactobacillus crustorumとして、Lactobacillus crustorum SAM2695株、Lactobacillus crustorum SAM2697株、Lactobacillus crustorum SAM2698株、およびタイプカルチャーであるLactobacillus crustorum JCM 15951Tを用いた。
　腸管バリア機能亢進の評価には、ヒト腸管上皮細胞Caco2を用いた。この細胞はヒト大腸癌由来でin vitro小腸モデルとして広く用いられており、細胞のバリア機能と経上皮膜抵抗値（transepithelial electric resistance: TER）に高い相関関係が見られることが知られている。Lactobacillus crustorumとCaco2を共培養したことによるTER値の正への変化を腸管バリア機能亢進の指標として評価した。
＜方法＞
菌の調製
　前培養では、各菌株の保存バイアルから100 μlを10 mlのMRS培地に接種し、24時間、30 ℃で培養した。次に、本培養では1リットルのMRS培地に前培養液10 mlを接種し、24時間、30 ℃で培養した。24時間の培養後、培養液を8000 rpmで10分間遠心分離し、上清を除いた。滅菌水を加えて洗浄し、同条件で遠心分離した。上清を除き、更に1回洗浄し、最後に滅菌水で縣濁した。
Caco2細胞の調製
　ミリセル24ウェルセルカルチャープレート(MERCK MILLIPORE)に0.7×105 細胞/wellの条件でアピカルウェルにCaco2を播種し、37 ℃、5%　CO2の条件下で2週間培養した。培地はDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)(Sigma-Aldrich, D6429)、Fetal Bovine Serum(FBS)(Equiteck Bio, Inc)および抗生物質としてAntibiotic‐Antimycotic Mixed Stock Solution(100x)(ナカライテスク株式会社)を用いた。培地は、500 mlのDMEMに50 mlのFBSおよび5 mlの抗生物質を添加して調製した。培地は、アピカルウェルに400 μl、バソラテラルウェルに800 μl添加した。培地は2～3日おきに交換した。
　Lactobacillus crustorum添加前の膜抵抗値が300 Ω・cm2以上を示したCaco2単層細胞を、十分にタイトジャンクションが形成されているものとしてアッセイに使用した。
実験方法
　2週間培養したCaco2細胞に、1×109 細胞/mlに調整した菌縣濁液を40 μl(コントロールは培地)添加し、37 ℃、5 % CO2の条件下で2時間共培養した。膜抵抗値の測定には、ミリセルERS-2電圧抵抗計(MERCK MILLIPORE)を用い、Lactobacillus crustorumの添加前および添加24時間後の膜抵抗値を測定した。実験は各n=6で実施した。
＜結果＞
　結果を図１に示す。
　Lactobacillus crustorum JCM 15951T, SAM 2695およびSAM 2698において、コントロールと比較して有意なTERの上昇を示した。SAM 2697はTER上昇の傾向を示した。
Lactobacillus crustorumと共培養した腸管上皮細胞Caco2におけるマイクロアレイ解析
　Caco2とLactobacillus crustorum SAM 2698株を共培養し、腸管バリア関連遺伝子の発現を調べた。
＜材料＞
菌の調製
　Lactobacillus crustorumとして、Lactobacillus crustorum SAM 2698株を用いた。
　前培養は、菌株の保存バイアルから100 μl を10 mlのMRS培地に接種し、24時間、30 ℃で培養した。その後、1リットルの MRS培地に前培養液10 mlを接種し、24 時間、30 ℃で培養した。次に、培養液を8000rpmで10分間遠心分離し、上清を除いた。滅菌水を加えて洗浄し、同条件で遠心分離した。上清を除き、更に1回洗浄し、最後に滅菌水で縣濁した。
Caco2細胞の調製
　12ウェルセルカルチャープレート(BD Falcon)に0.63×105 細胞/ 2 ml / ウェルの条件でCaco2細胞を播種し、37 ℃、5 % CO2の条件下で2週間培養した。培地はDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)(Sigma-Aldrich, D6429)、Fetal Bovine Serum(FBS)( Equiteck Bio, Inc)および抗生物質としてAntibiotic‐Antimycotic Mixed Stock Solution(100x)(ナカライテスク株式会社)を用いた。培地は、500mlのDMEMに50mlのFBSおよび5mlの抗生物質を添加して調製した。培地は2～3日おきに交換した。
＜方法＞
実験方法
　2週間培養したCaco2細胞に、DMEMで縣濁したLactobacillus crustorumを1×109細胞/2ml/well添加し、5時間共培養した。実験は全てn数を3で実施した。5時間後、上清を除き、PBS(-)で洗浄後した。回収した細胞から、RNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いてRNAを調製した。
マイクロアレイ解析
　タカラバイオ株式会社にAgilent Expression Array解析を依頼し、Human SurePrint G3 (8×60k) ver2.0を実施した。
マイクロアレイ解析結果
　タイトジャンクション関連遺伝子クラウディンに着目して解析した結果を図２に示す。コントロールと比較すると、Lactobacillus crustorum SAM 2698と共培養したCaco2細胞ではクラウディン1 (CLDN 1)の発現量が増加した(約1.1倍)。また、CLDN 3およびCLDN4の発現量も有意に増加した(各約1.6倍)。
Lactobacillus crustorumを投与したマウスにおける小腸上皮組織のCLDN1発現変化
　Lactobacillus crustorum SAM 2698 生菌をマウスに投与し、小腸上皮組織におけるCLDN1の発現変化を調べた。
＜材料＞
　Lactobacillus crustorumとして、Lactobacillus crustorum SAM 2698株を用いた。
　試験動物にはC57BL/6Jマウス、雄、7週齢を用いた。試験群は、滅菌投与およびLactobacillus crustorum SAM 2698 生菌を投与した群を設定した。各群のn数は6匹とした。
＜方法＞
実験方法
　生菌は120億細胞/mlの縣濁液250 μl (30億cells/mouse) を単回経口投与した。投与5時間後に小腸上皮組織を採取した。
小腸上皮組織からのRNA抽出
　小腸上皮組織に150-212 μmのグラスビーズ(SIGMA社製)を添加し、マルチビーズショッカー(YASUI KIKAI社製)を用いて3000rpm, 3分間処理した。その後、RNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用い、プロトコルに従ってRNAを調製した。
プライマーの設計
　マウスのCLDN1遺伝子のためのプライマー配列は、公開されている遺伝子配列情報をもとに設計した。配列は以下の通りである。マウスCLDN1フォワードプライマー : CCTATGCTGGGGACAACATC／マウスCLDN1リバースプライマー : TGCACCTCATCATCTTCCAG。発現解析はGAPDH遺伝子発現をコントロールとした。GAPDH遺伝子のためのプライマー配列は、ShineGene Molecular Biotech, Incが公開しているHousekeeping Gene Primers for RT-PCRを参考にして設計した。配列は以下の通りである。Mouse GAPDH F49 : GGTGAAGGTCGGTGTGAACG／R281 : CTCGCTCCTGGAAGATGGTG。
リアルタイムPCR条件
　発現解析はリアルタイムPCR (Step One Plus, Applied Biosystems社製)を用いて実施した。
　抽出したRNAはRNase Free水で100 ng/μlに調整し、10 μMの各プライマーを含む反応溶液18 μlにRNA溶液を2 μl加えてリアルタイムPCRを実施した。リアルタイムPCRはPower SYBR（登録商標）Green RNA-to-CTTM 1-Step Kit (Applied Biosystems社製)を用い、キットのプロトコルに従った。
＜結果＞
　タイトジャンクション関連遺伝子CLDN1に着目して解析した結果を図３に示す。滅菌水投与群と比較してLactobacillus crustorum SAM 2698を投与したマウスの小腸上皮において、クラウディン1 (CLDN 1)の発現が有意に増加した。
高脂肪食負荷モデルマウスに対するLactobacillus crustorumの糖代謝異常抑制効果
＜材料＞
　Lactobacillus crustorumとして、Lactobacillus crustorum SAM2695株、Lactobacillus crustorum SAM2698株、およびタイプカルチャーであるLactobacillus crustorum JCM 15951Tを用いた。
　試験動物にはC57BL/6Jマウス、雄、7週齢を用いた。試験群は、正常食群、60%高脂肪食群、60%高脂肪食に各Lactobacillus crustorum生菌を投与した群を設定した。各群のn数は10匹とした。
＜方法＞
実験方法
　試験期間は25日間で、生菌は120億細胞/mlの縣濁液250 μl (30億細胞/日/匹) を経口投与した。
動物実験飼料
　正常食および60%高脂肪食はリサーチダイエット社の精製飼料10kcal%の脂肪(ラード)および精製飼料60kcal%の脂肪(ラード)を用いた。
糖代謝異常抑制試験 (糖負荷試験)
　試験25日目に糖負荷試験を実施した。20%グルコース溶液を1g/kg(5ml/kg)の条件で経口投与し、投与前、投与後15、30、60及び90分後に尾静脈より採血した。血糖はグルテストneoスーパー(株式会社三和化学研究所)で測定した。
糖代謝異常抑制試験結果 (糖負荷試験)
　結果を図４および図５に示す。
　各群の糖負荷後の血中糖濃度を測定した結果、正常食摂取群と比較して、60%高脂肪食摂取群における15、30、60及び90分で有意に高値を示した。一方、60%高脂肪食にLactobacillus crustorum JCM 15951Tを投与した群において、60%高脂肪食摂取群と比較して15分で有意な血糖上昇抑制、30分で血糖上昇抑制の傾向を示した。60%高脂肪食にLactobacillus crustorum SAM 2695を投与した群において、60%高脂肪食摂取群と比較して30分および60分で有意な血糖の上昇抑制を示した。15分から90分のAUCにおいては、60%高脂肪食摂取群と比較して有意な血糖低下が認められた。次に、60%高脂肪食にLactobacillus crustorum SAM 2698を投与した群において、30、60および90分で有意な血糖の上昇抑制を示した。15分から90分のAUCにおいては、60%高脂肪食摂取群と比較して有意な血糖低下が認められた。
　本発明の腸管バリア機能亢進剤は、Lactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物を含むことにより、腸管バリア機能を亢進させることができる。本発明の腸管バリア機能亢進剤は、糖尿病、高血圧、高脂血症、および肥満、ならびにメタボリックシンドローム等の腸管バリア機能の障害に起因する状態もしくは疾患の予防又は治療のための医薬組成物または飲食品のために有効に利用することができる。

Claims (17)

  1. Lactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物を含む、飲食品。
  2. Lactobacillus crustorumがLactobacillus crustorum SAM2695株、Lactobacillus crustorum SAM2697株、Lactobacillus crustorum SAM2698株、Lactobacillus crustorum JCM 15951T株、または２以上のこれらの組み合わせである、請求項１に記載の飲食品。
  3. Lactobacillus crustorumの生菌体を含む、請求項１または２に記載の飲食品。
  4. Lactobacillus crustorumの菌体または菌体処理物を含む、腸管バリア機能亢進剤。
  5. Lactobacillus crustorumがLactobacillus crustorum SAM2695株、Lactobacillus crustorum SAM2697株、Lactobacillus crustorum SAM2698株、Lactobacillus crustorum JCM 15951T株、または２以上のこれらの組み合わせである、請求項４に記載の腸管バリア機能亢進剤。
  6. Lactobacillus crustorumの生菌体を含む、請求項４または５に記載の腸管バリア機能亢進剤。
  7. 請求項４～６のいずれかに記載の腸管バリア機能亢進剤を含む、糖尿病、高血圧、高脂血症、および肥満からなる群より選択される１以上の状態もしくは疾患の予防または治療のための医薬組成物。
  8. 請求項４～６のいずれかに記載の腸管バリア機能亢進剤を含む飲食品。
  9. 糖尿病、高血圧、高脂血症、および肥満からなる群より選択される１以上の状態もしくは疾患の予防または治療のための、請求項８に記載の飲食品。
  10. 状態または疾患が糖尿病である、請求項７に記載の医薬組成物または請求項９に記載の飲食品。
  11. 状態または疾患が肥満と、糖尿病、高血圧および高脂血症からなる群より選択される１以上の疾患との組み合わせである、請求項７に記載の医薬組成物または請求項９に記載の飲食品。
  12. 糖尿病が２型糖尿病である、請求項７～１１のいずれかに記載の医薬組成物または飲食品。
  13. 請求項４～６のいずれかに記載の腸管バリア機能亢進剤を配合する工程を含むことを特徴とする、医薬組成物または飲食品の製造方法。
  14. 医薬組成物または飲食品が糖尿病、高血圧、高脂血症、および肥満からなる群より選択される１以上の状態もしくは疾患の予防または治療のためのものである、請求項１３に記載の製造方法。
  15. 状態または疾患が糖尿病である、請求項１４に記載の製造方法。
  16. 状態または疾患が肥満と、糖尿病、高血圧および高脂血症からなる群より選択される１以上の疾患との組み合わせである、請求項１４に記載の製造方法。
  17. 糖尿病が２型糖尿病である、請求項１３～１６のいずれかに記載の製造方法。
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