WO2015036637A1 - Procedimiento de síntesis de kojibiosa y su aplicación en la elaboración de composiciones alimentarias y farmaceúticas - Google Patents

Procedimiento de síntesis de kojibiosa y su aplicación en la elaboración de composiciones alimentarias y farmaceúticas Download PDF

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yeast
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fermentation
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Marina DIEZ MUNICIO
Francisco Javier Moreno Andujar
Miguel HERRERO CALLEJA
Antonia Montilla Corredera
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    • A23V2200/00—Function of food ingredients

Definitions

  • the present invention relates to the field of the agri-food and pharmaceutical industry, since it specifically refers to an efficient and economical process for obtaining kojibiosa disacáhdo.
  • Said disaccharide is applicable in the elaboration of functional foods useful for the improvement of the health of the gastrointestinal system and in pharmaceutical compositions useful for the therapeutic treatment of viral diseases, as well as for the treatment of problems associated with diseases such as diabetes mellitus. , prediabetes, gastritis, tooth decay or obesity.
  • Kojibiosa is a disaccharide found naturally in koji extract (obtained after the fermentation process of steamed rice and / or a seed mixture derived from inoculation with Aspergillus oryzae), in beer, honey and in starch hydrolyzate.
  • natural levels are very low, making it difficult to obtain kojibiosa on a large scale.
  • the kojibiosa has a great prebiotic potential because the a- (1 ⁇ 2) bond has a high resistance to gastrointestinal digestion in humans and animals (Valette P, et al. J. Sci. Food Agr., 1993, 62, 121-127; Remaud-Siméon M, et al. J. Molec. Catal.
  • kojibiosa is a glucosidase inhibitor, with the ability to inhibit the elimination of terminal glucose from the ma ⁇ osa / V-oligosaccharide (Glc) 3 (Man) 9 (GlcNAc) 2 from both a free oligosaccharide and a bound oligosaccharide to the amino group of a protein.
  • Glucosidases inhibitors have been shown to have an important antiviral activity (Tan A, et al. J. Biol. Chem., 1991, 266, 14504-14510).
  • kojibiosa as an inhibitor is based on the fact that it specifically inhibits a-glucosidase I in different target tissues and organs (European Patent 0 830 365 B1, 2002). This property is of particular importance for the development of new drugs, especially of the "pseudodisaccharide" class for the treatment of human immunodeficiency virus (HIV) type 1 infections (Borges de Meló E, et al. Tetrahedron, 2006, 62 , 10277-10302).
  • HIV human immunodeficiency virus
  • the inhibition of ⁇ -glucosidase I prevents the elimination of glucose residues during normal processing of the membrane protein of the HIV gp120 virus, which results in modified structure glycoproteins involved in the breaking of the replication cycle of said virus.
  • Kojibiosa has been shown to inhibit the action of ⁇ -glucosidase I in mammary glands of bovine origin (Shailubhai K, et al. Biochem. J., 1987, 247, 555-562,) or in hepatic microsomes in rats (Takeuchi M, et al. J. Biol. Chem., 1990, 108, 42-46), among other targets.
  • kojibiosa in other types of viral diseases such as hepatitis B and C has also been suggested (Goffin D, et al. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 201 1, 51, 394-409).
  • kojibiosa could be used to delay the digestion of carbohydrates ingested in the diet such as starch and sucrose, in therapeutic applications of other diseases, such as obesity, diabetes mellitus, prediabetes, gastritis, duodenal and gastric ulcers, caries or cancer (European Patent 0 830 365 B1, 2002; Goffin D, et al. Crit. Rev. Food Sci. Nutr, 201 1, 51, 394-409).
  • Some methods described so far for obtaining kojibiosa include its synthesis from partially acetylated dextran (Matsuda K, et al. Nature, 1961, 191, 278); from glycosidases, such as a-glucosidase, (Takahashi M, et al. Agrie. Biol. Chem., 1969, 33, 1399-1410); from glucoamylase (Fujimoto H, et al. Agrie. Biol. Chem., 1988, 52, 1345-1351); from sucrose phosphorylase (Kitao S, et al. Biosci. Biotech.
  • This document proposes an alternative procedure for obtaining kojibiosa, which has a high yield and a reduced cost, and which makes it possible to obtain it industrially in a viable way, which will allow its subsequent use through functional or nutraceutical foods designed for Improvement of the health of the gastrointestinal system or of drugs designed for the treatment of viral infections or other pathologies.
  • the technical problem solved by the present invention is the synthesis of kojibiosa by means of a simple, economical and high-performance procedure that allows it to be obtained at a price much lower than its current market value, thus enabling the development of products that allow exploiting its potential activity in the health field.
  • a first object of the invention is a method of synthesis of kojibiosa that starts from a reaction mixture comprising as main component trisaccharide 2-aD-glucopyranosyl-lactose, ⁇ - ⁇ -D-galactopyranosyl- (1 ⁇ 4) -0 - [aD-glucopyranosyl- (1 ⁇ 2)] - pD-glucopyranoside, as well as leucrose, lactose, fructose, glucose and sucrose, obtained by a transglycosylation reaction that uses sucrose and lactose as starting substrates, and characterized by be carried out at a temperature between 20 and 60 ° C and to comprise at least the following steps:
  • step (a) fermentation of the previously diluted starting reaction mixture to a concentration of sugars between 5 and 30 g / 100 mL and preferably 20 g / 100 mL, using a yeast of the Saccharomycetaceae family, in a ratio between 5 and 50 g of yeast per 100 g of sugars, and b) hydrolysis of the fermented reaction mixture in step (a) at a pH between 5 and 8, which is preferably 7, by the addition of an enzyme with ⁇ -galactosidase activity at a concentration between 10 and 100 U / mL
  • the synthesis process uses Saccharomyces cerevisiae as a yeast in a ratio of 16 g of yeast per 100 grams of sugar, and the hydrolysis step (b) is carried out at a pH of 7 with the enzyme Kluyveromyces lactis ⁇ -galactosidase with a concentration of 65 U / mL, obtaining a production yield of kojibiosa greater than 25%, which is preferably greater than 35%, and more preferably is greater than 45%.
  • the synthesis process comprises an additional stage (c) of purification, subsequent to step (b) of hydrolysis, which is performed using a technique selected from fermentation with the remaining yeast added during stage ( a) or chromatography or nanofiltration, and in any case it obtains a kojibiosa with a percentage of wealth in weight with respect to the dry extract, between 60 and 100%.
  • an additional step (d) of lyophilization or atomization is included, subsequent to the stage (c) of purification.
  • the kojibiosa obtained according to the synthesis procedure constitutes a second object of the invention.
  • the third object of the invention constitutes the use of the kojbiosa obtained by the synthesis procedure in the preparation of a prebiotic food composition useful for preventing gastrointestinal pathologies, or in the preparation of a pharmaceutical composition useful for the treatment of viral-type diseases or to delay carbohydrate digestion.
  • the fourth object of the invention constitutes a prebiotic food composition useful for preventing gastrointestinal pathologies characterized in that it comprises the kojibiosa obtained by the synthesis procedure.
  • the fifth object of the invention constitutes a pharmaceutical composition useful for the treatment of viral diseases or for delaying carbohydrate digestion, characterized in that it comprises a therapeutically effective amount of kojibiosa obtained by the synthesis procedure, a salt, or a solvate. thereof pharmaceutically acceptable.
  • the present invention is based on the observation that a synthesis process using a starting reaction mixture comprising trisaccharide 2-aD-glucopyranosyl-lactose, 0-pD-galactopyranosyl- (1 ⁇ 4) -0- [aD - glucopyranosyl- (1 ⁇ 2)] - pD-glucopyranoside, leucose, lactose, fructose, glucose and sucrose, which is obtained from an enzymatic transglycosylation reaction of lactose using a dextransacarase, and characterized by comprising a fermentation stage with Saccharomyces cerevisiae yeast, and a hydrolysis stage using a ⁇ -galactosidase from Kluyveromyces lactis, allows obtaining a disaccharide of high added value and difficult to obtain, such as kojibiosa (see Examples 1 to 4).
  • kojibiosa means a disaccharide defined by the formula 2-OaD-glucopyranosyl-aD-glucopyranoside with bioactive and / or functional properties due to its structural characteristics.
  • mesenteroides B512-F which allows the transfer of the glucose unit from sucrose (donor substrate) to lactose (acceptor substrate) (D ⁇ ez-Municio M, et al. J. Agrie. Food. Chem. 2012, 60, 1945-1953), hereinafter starting reaction mixture.
  • the starting reaction mixture is composed of a combination of carbohydrates comprising the above trisaccharide, leucose, lactose, fructose, glucose and sucrose.
  • concentration of sugars or sugar means a mixture of carbohydrates whose composition may vary depending on the stage of the process to which it refers.
  • the first object of the invention constitutes a kojibious synthesis process that starts from the starting reaction mixture, and which is characterized by being carried out at a temperature between 20 and 60 ° C, which is preferably 30 ° C and by comprise at least the following steps: a) fermentation of the previously diluted starting reaction mixture to a concentration of sugars between 5 and 30 g / 100 mL, and preferably 20 g / 100 mL, using a yeast of the Saccharomycetaceae family, in a ratio between 5 and 50 g of yeast per 100 g of sugar, and
  • step (a) hydrolysis of the fermented reaction mixture in step (a) at a pH between 5 and 8, which is preferably 7, by the addition of an enzyme with ⁇ -galactosidase activity at a concentration between 10 and 100 U / mL
  • "2-aD-glucopyranosyl-lactose, ⁇ - ⁇ -D-galactopyranosyl- (1 ⁇ 4) -0- [aD-glucopyranosyl- (1 ⁇ 2)] - pD-glucopyranoside” means a trisaccharide kojibious galactosylate, glycosylated derivative of lactose, 4'-galactosyl-kojibose or oligosaccharide derived from kojibiosa.
  • the starting reaction mixture used in the synthesis process of the invention is obtained from abundant and low-cost substrates such as sucrose and lactose disaccharides. However, it is possible to replace it with by-products of the low-cost and easily obtainable agro-food industry such as whey permeate or by-products derived from the sugar industry.
  • transglycosylation reaction is meant the enzymatic reaction of transferring a glycosidic residue to another carbohydrate that acts as an acceptor.
  • the function of the yeast in the synthesis process of the invention is the purification of the starting reaction mixture, eliminating the fructose released in the synthesis reaction thereof, which is an enzyme inhibitor with ⁇ -galactosidase activity, which It is used in step (b) of hydrolysis.
  • Yeast also removes traces of sucrose and glucose. More specifically, the reaction produced by yeast is the removal of sugars through glycolysis in which anaerobic carbohydrates are converted to ethanol and C0 2.
  • yeasts of the Saccharomycetaceae family that are used within the scope of the invention are those of the genus Saccharomyces and Kluyveromyces, and preferably Saccharomyces cerevisiae, which is characterized by its selective ability to remove carbohydrates by fermentation (Yoon, SH, et al. ., 2003. Carbohyd. Res., 338, 1 127-1 132).
  • the yeast used in stage (a) of fermentation is Saccharomyces cerevisiae and is used in a ratio of 16 g of yeast per OO g of sugar.
  • alginate immobilized yeast is used.
  • the function of the enzyme with ⁇ -galactosidase activity is to hydrolyze lactose (P-D-galactopyranosyl- (1 ⁇ 4) -D-glucose) and trisaccharide 2-a-D-glucopyranosyllactose, which will lead to the release of kojibiosa.
  • lactose P-D-galactopyranosyl- (1 ⁇ 4) -D-glucose
  • trisaccharide 2-a-D-glucopyranosyllactose which will lead to the release of kojibiosa.
  • Examples of enzymes that can be used within the scope of the invention are ⁇ -galactosidases of microbial and food grade origin, and preferably of Kluyveromyces lactis.
  • the enzyme with ⁇ -galactosidase activity that is used in the scope of the invention, prioritizes the hydrolytic capacity over the ability to transgalactosilar, thus allowing to obtain a final product with greater purity and free of galactobioses and / or other di and trisaccharides other than kojibiosa that would not be achieved with the use of other enzymes.
  • step (b) of hydrolysis is carried out at a pH of 7, the enzyme with ⁇ -galactosidase activity is Kluyveromyces lactis and is used with a concentration of 65 U / mL
  • the synthesis process of the invention achieves the obtaining of a compound comprising kojibiosa and other products such as leucrose.
  • the synthesis process of the invention achieves a production yield of kojibiosa that is greater than 25%, preferably greater than 35%, and more preferably greater than 45%.
  • the synthesis process of the invention includes a purification step (c) subsequent to the hydrolysis stage (b) to obtain a product with a high degree of purity that facilitates its subsequent applications, and which is performed using a technique selected, by way of illustration and not limitation, between fermentation with the remaining yeast added during step (a) of fermentation or chromatography or nanofiltration.
  • the purification step (c) is carried out by allowing the remaining yeast reacted during the fermentation stage (a) followed by centrifugation or filtration and kojibiosa is obtained with a percentage of wealth in weight with respect to the dry extract, superior to 60%.
  • chromatographic techniques as a purification method results in a considerable reduction in the duration of the process, as well as an increase in the purity of the product, in relation to for example the application of the continued yeast treatment.
  • chromatographic techniques that include the scope of the present invention are molecular exclusion chromatography (SEC) and liquid chromatography with refractive index detector (LC-RID).
  • SEC Molecular exclusion chromatography
  • the step (c) of purification is carried out by means of molecular exclusion chromatography (SEC), prior to centrifugation or filtering and kojibiosa is obtained with a percentage of richness in weight with respect to the extract dry, more than 70%.
  • SEC molecular exclusion chromatography
  • LC-RID liquid chromatography with refractive index detector
  • the purification step (c) is carried out by liquid chromatography with refractive index detector (LC-RID), prior to centrifugation or filtering, and achieves kojibiosa with a percentage of wealth in weight with respect to the dry extract, greater than 95%.
  • LC-RID refractive index detector
  • the process of the invention includes an additional step (d) of lyophilization or atomization of the kojibiosa after the stage (c) of purification that allows to obtain a final powder product.
  • beneficial bacteria such as, for example, Bifidobacterium and Lactobacillus
  • kojibiosa as an inhibitor of the enzyme a-glucosidase, gives it an important antiviral activity and ability to delay the digestion of carbohydrates ingested in the diet, such as starch and sucrose, by the inhibition of intestinal glucosidases, allowing its use in therapeutic applications for different diseases, which are preferably obesity, diabetes mellitus, prediabetes, gastritis or caries.
  • the use of the kojibiosa of the invention for the preparation of a prebiotic food composition hereinafter use of the invention, which is useful for preventing pathologies related to the gastrointestinal system or for the preparation of a composition pharmaceutical that is useful for the treatment of viral diseases or to delay the digestion of starch and sucrose in diseases such as obesity, diabetes mellitus, prediabetes or caries.
  • viral disease is chosen, by way of indication and not limitation, from among human immunodeficiency virus (HIV) type 1, or hepatitis B virus or hepatitis virus C.
  • prebiotic food composition for preventing gastrointestinal pathologies, hereinafter prebiotic food composition of the invention, characterized by comprising the kojibiosa of the invention.
  • prebiotic food composition means any combination of ingredients constituting a solid or liquid food product, which in addition to its nutritional characteristics, includes specific functions of resistance to gastrointestinal digestion and selective stimulation of growth and activity of one or more strains of bacteria in the digestive system, which help improve health and reduce the risk of disease.
  • composition of the invention characterized by comprising a therapeutically effective amount of the kojibiosa of the invention, a pharmaceutically acceptable salt, solvate or pro-drug thereof, hereinafter pharmaceutical composition of the invention.
  • pharmaceutical composition of the invention is used in its broadest sense and encompasses those derivatives that are converted in vivo into kojibious derivatives suitable for the treatment of the pathologies described above.
  • the pharmaceutical composition of the invention additionally comprises at least one pharmaceutically acceptable excipient, adjuvant and / or vehicles.
  • the pharmaceutical composition of the invention additionally includes at least one other active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be administered by any appropriate route of administration, for example, oral, parenteral (subcutaneous, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, etc.), rectal, etc.
  • the food composition of the invention is used in the preventive treatment of gastrointestinal pathologies.
  • the pharmaceutical composition of the invention is used for the treatment of viral type infections, which are preferably human immunodeficiency virus (HIV) type 1, hepatitis B virus or the virus of hepatitis C, or to delay the digestion of starch and sucrose in therapeutic applications of other diseases, which are preferably obesity, diabetes mellitus, prediabetes or caries.
  • viral type infections which are preferably human immunodeficiency virus (HIV) type 1, hepatitis B virus or the virus of hepatitis C
  • HIV human immunodeficiency virus
  • Figure 1 Structure of trisaccharide 2-aD-glucopyranosyl-lactose ( ⁇ - ⁇ -D-galactopyranosyl- (1 ⁇ 4) -0- [aD-glucopyranosyl- (1 ⁇ 2)] - pD-glucopyranoside) derived from galactosylated Kojibiosa present in the starting reaction mixture.
  • Figure 2 Profile obtained by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) of the sugar mixture obtained by transglycosylation reaction of the enzyme-catalyzed lactose Leuconostoc mesenteroides B-512F dextransacarase and subsequent treatment with the yeast Saccharomyces cerevisiae and with the ⁇ -galactosidase of Kluyveromyces lactis according to Example 1 with stage (c) of yeast purification, where the synthesis of kojibiosa is observed with high yield and percentage of purity
  • GC-MS mass spectrometry
  • Example 1 Starting from a reaction mixture comprising trisaccharide 2-a-D-glucopyranosyl-lactose, leucrose, lactose, fructose, glucose and sucrose, obtained by a transglycosylation reaction with sucrose and lactose (equimolar ratio) as starting substrates.
  • the initial transglycosylation reaction using sucrose and lactose, was carried out according to D ⁇ ez-Municio M, et al. (J. Agrie. Food. Chem. 2012, 60, 1945-1953).
  • a solution of 250 g / L of sucrose and 250 g / L of lactose in 20 mM sodium acetate buffer with pH 5.2, supplemented with 1 mM calcium chloride, to which 0.8 U was added was prepared.
  • / mL of dextransacarase enzyme from L. mesenteroides B-512F Said reaction mixture was incubated at 30 ° C temperature and stirring of 500 rpm for 24 h.
  • the resulting mixture has as main compound trisaccharide 2-a-D-glucopyranosyl lactose.
  • the synthesis process of the invention was carried out at a temperature of 30 ° C.
  • First the fermentation step was carried out, for this the mixture was diluted with water to a total sugar concentration of 200 g / L, S. cerevisiae yeast was added, at a concentration of 32 g / L and kept up under strong stirring (1000 rpm) for 4 hours until the yeast had fermented all of the sucrose and residual glucose, as well as much of the fructose (90-95%).
  • a hydrolysis step was carried out, for this purpose the pH of the reaction medium was adjusted to 7 (with potassium hydroxide) and 10 mM magnesium chloride and the enzyme ⁇ -galactosidase of K.
  • lactis (Lactozym) were added Puree 6500 L) at a concentration of 65 U / mL and kept under strong stirring (1000 rpm) for an additional 90 min. In this way, the non-transglycosylated lactose was hydrolyzed to glucose and galactose (monosaccharides that are consumed by yeast). On the other hand, the main compound of the mixture, trisaccharide 2-aD-glucopyranosyl-lactose, gives rise to kojibiosa (product of interest resistant to fermentation of yeast) and galactose (fermented).
  • a purification step was carried out, using a method selected from among, to continue with the treatment of yeast initiated prior to hydrolysis with ⁇ -galactosidase, molecular exclusion chromatography (SEC) and liquid chromatography with refractive index detector (LC-RID) obtaining different degrees of purity of the kojibiosa.
  • SEC molecular exclusion chromatography
  • LC-RID liquid chromatography with refractive index detector
  • yeast After hydrolysis with ⁇ -galactosidase, the remaining yeast was allowed to act for an additional 42 hours to eliminate the monosaccharides derived from the hydrolysis of lactose and the galactose residue of trisaccharide 2-aD-glucopyranosyl lactose. After the reaction time has elapsed, the mixture of Obtained sugars were filtered or centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes to remove yeast.
  • the synthesized compound has a high percentage in kojibiosa, this being around 65% of the dry extract, according to the quantification performed by gas chromatography with flame ionization detector (GC-FID).
  • GC-FID gas chromatography with flame ionization detector
  • the final product obtained has a high percentage in kojibiosa, this being around 76% (with respect to the value of the dry extract determined (96%), according to the quantification performed by gas chromatography with flame ionization detector (GC- FID)
  • GC- FID gas chromatography with flame ionization detector
  • filtration was carried out immediately after the hydrolysis stage with ⁇ -galactosidase of K. lactis. centrifugation at 10,000 rpm for 5 min to remove yeast. Subsequently, a column purification process took place for 25 min by means of liquid chromatography with refractive index detector (LC-RID) using a linked amino column and using acetronitrile as the mobile phase: water (75:25, v: v), In Socratic mode.
  • LC-RID refractive index detector
  • This type of purification of carbohydrate mixtures by LC-RID can be performed at an analytical, semi-preparative or preparative level, obtaining in all cases a kojibiosa with a degree of purity close to 100%.
  • the dimensions of the analytical column are 150 - 250 mm in length and 4.6 mm in internal diameter, the workflow of 0.5 - 1.0 mL / min and the injection volume of 50 - 100 ⁇ , obtaining 1 - 10 mg of the product of interest.
  • the semi-preparative column has dimensions of 250 mm in length and 10 mm of internal diameter, the workflow of 4.0 - 5.0 mL / min and the injection volume of 500 ⁇ (obtaining 10 - 50 mg of the product of interest).
  • a column with dimensions of 250 mm in length and 21.2 mm of internal diameter, the workflow of 21.0 mL / min and the injection volume of 2-3 mL are obtained (obtaining 50 - 100 mg of the product of interest).
  • Example 2 Starting from a reaction mixture comprising trisaccharide 2-aD-glucopyranosyl-lactose, leucose, lactose, fructose, glucose and sucrose obtained by a transglycosylation reaction with sucrose and lactose (ratio 1: 2.5) as starting substrates
  • Example 1 Exactly the same steps were followed as those indicated in Example 1 (with the stage of purification of the yeast treatment and subsequent centrifugation), with the proviso that in this case it was based on a solution of 100 g / L sucrose and 250 g / L of lactose.
  • the non-transglycosylated lactose was 20% more than when using a sucrose ratio: equimolar lactose, which resulted in a decrease in yield (28% by weight with respect to the initial amount of lactose) .
  • the synthesized compound has a high percentage in kojibiosa, being around 52% (considering the value of the dry extract determined), based on the quantification performed by gas chromatography with flame ionization detector (GC-FID).
  • Example 3 Starting from a reaction mixture comprising trisaccharide 2-aD-glucopyranosyl-lactose, leucrose, lactose, fructose, glucose and sucrose, obtained by a transglycosylation reaction with sucrose and whey permeate (sucrose ratio: equimolar lactose) as starting substrates
  • Example 2 Exactly the same steps were followed as those indicated in Example 1, with the proviso that in this case it was based on a solution of 250 g / L sucrose and 320 g / L permeate from dairy whey of bovine origin (quantity equivalent to 250 g / L lactose).
  • kojibiosa a byproduct of the dairy industry, kojibiosa is obtained with greater yield than when lactose is used as a substrate (Example 1), synthesized kojibiosa with a 48% yield by weight with respect to the initial lactose amount , which means that starting from 128 g of serum permeate, 48 g of kojibiosa are obtained.
  • the purification step was carried out using a method selected from among, continuing with the yeast treatment initiated prior to hydrolysis with ⁇ -galactosidase, molecular exclusion chromatography (SEC) and liquid chromatography with detector of refractive index (LC-RID) under the same conditions as specified in that example.
  • SEC molecular exclusion chromatography
  • LC-RID liquid chromatography with detector of refractive index
  • the final product obtained has, as in Example 1, a high and similar percentage in kojibiosa ( ⁇ 65%), accompanied by leucrose, and a low proportion of trisaccharides and metabolites produced by yeast.
  • SEC molecular exclusion chromatography
  • the final product obtained showed a high and very similar percentage in kojibiosa ( ⁇ 75%) accompanied by a low proportion of leucrose.
  • the product synthesized according to Example 1 and including a purification step with continued yeast treatment presented 65% kojibiosa, 19% leucrose disaccharide, synthesized in the reaction catalyzed by dextransacarase when the fructose acts as an acceptor, a % of trisaccharides (mainly galactosylated derivatives such as aD-Glucopyranosyl- [1 -4] -pD-Galactopyranosyl- [1-6] -pD-Galactose), and 8% of metabolites produced by yeast, such as poly-alcohols (see Figure 2).
  • the concentration in mineral salts was 2%.
  • Example 1 The product synthesized according to Example 1 and purified by SEC showed a simpler composition with 76% kojibiosa and 24% leucrose, considering the value of the determined dry extract (96%). Also, following the same Example 1 and applying LC-RID as a purification step led to a purity of ⁇ 100% in kojibiosa.
  • the product synthesized according to Example 2 consisted of 52% kojibiosa, 16% disaccharides derived from the hydrolysis of lactose and subsequent transgalactosylation (alolactose, galactobiosa, among others), 14% of trisaccharides (mainly galactosylated derivatives of lactose as aD- Glucopyranosyl- [1 -4] -pD-Galactop ⁇ ranos ⁇ l- [1 -6] -pD-Galactose), 8% of the leucrose disaccharide, synthesized in the reaction catalyzed by dextransacarase when acting Fructose as an acceptor and 8% of metabolites produced by yeast, such as poly-alcohols.
  • the composition in mineral salts was 2%. All these data refer to the dry extract content that was 93%.
  • the kojibiosa and leucrosa have been identified by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) by analyzing their corresponding trimethylsilyloxime (TMSO) and comparing with the previously derivatized commercial pattern.
  • GC-MS gas chromatography coupled to mass spectrometry
  • TMSO trimethylsilyloxime
  • the mass spectrum of the kojibiosa obtained according to Example 1 with stage (c) of yeast purification (see Figure 3) was characterized by presenting the ions with a mass / charge ratio (m / z) of: 319, 73, 147 , 217, 361 and 205 (in decreasing order of abundance).

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Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento de síntesis de kojibiosa caracterizado por su sencillez y alto rendimiento, que utiliza una mezcla de reacción de partida que contiene como compuesto principal al trisacárido2-α- D-glucopiranosil-lactosa,O-β-D-galactopiranosil-(1→4)-O-[α-D-glucopiranosil- (1→2)]-β-D-glucopiranosa, así como leucrosa, lactosa, fructosa, glucosa y sacarosa y, que comprende etapas de fermentación, hidrólisis y purificación permitiendo la obtención de un disacárido de alto valor añadido, como la kojibiosa, de forma económica. La invención también se refiere a la kojibiosa que se obtiene mediante el procedimiento de la invención y al uso de la misma en la elaboración de composiciones prebióticas alimentarias con utilidad para prevenir patologías relacionadas con el sistema gastrointestinal y composiciones farmacéuticas con utilidad para el tratamiento de enfermedades de tipo vírico o para retrasar la digestión de carbohidratos.

Description

PROCEDIMIENTO DE SÍNTESIS DE KOJIBIOSA Y SU APLICACIÓN EN LA ELABORACIÓN DE COMPOSICIONES ALIMENTARIAS Y FARMACEÚTICAS DESCRIPCIÓN SECTOR DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con el campo de la industria agro- alimentaria y farmacéutica, ya que específicamente se refiere a un procedimiento eficiente y económico para la obtención del disacáhdo kojibiosa. Dicho disacárido resulta de aplicación en la elaboración de alimentos funcionales útiles para la mejora de la salud del sistema gastrointestinal y en composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento terapéutico de enfermedades de tipo vírico, así como para el tratamiento de problemáticas asociadas a enfermedades como la diabetes mellitus, prediabetes, gastritis, caries u obesidad.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La kojibiosa es un disacárido que se encuentra de forma natural en el extracto de koji (obtenido tras el proceso de fermentación de arroz vaporizado y/o una mezcla de semillas derivado de la inoculación con Aspergillus oryzae), en la cerveza, la miel y en el hidrolizado de almidón. Sin embargo, los niveles naturales son muy bajos lo que dificulta la obtención de kojibiosa a gran escala. La kojibiosa presenta un gran potencial prebiótico debido a que el enlace a- (1→2) cuenta con una alta resistencia a la digestión gastrointestinal en seres humanos y animales (Valette P, et al. J. Sci. Food Agr., 1993, 62, 121 -127; Remaud-Siméon M, et al. J. Molec. Catal. B: Enzym., 2000, 10, 1 17-128), y a la estimulación selectiva de las bacterias beneficiosas presentes en el intestino grueso. En este sentido se ha demostrado, tanto el crecimiento de seis cepas pertenecientes a Bifidobacterium, Lactobacillus, y Eubacterium durante la incubación de cultivos puros con kojibiosa, como con kojioligosacáridos con grados de polimerización 3 y 4 (Nakada T, et al. Oligosaccharides in Food and Agriculture. ACS Symposium Series; Eggleston, G.; Cóté, G. L, Eds.; American Chemical Society: Washington, DC, 2003; Vol. 849, pp. 104-1 17). Por su parte, Sanz ML, et al. (J. Agrie. Food Chem. 2005, 53, 5192-5199) estudiaron la influencia de las uniones glicosídicas y la composición de monosacáridos en la selectividad de la fermentación microbiana en 20 disacáridos tras la fermentación in vitro de cultivos de heces humanas, encontrando los mayores índices prebióticos para la kojibiosa, señalando a ésta y a sus potenciales oligosacáridos como prometedores carbohidratos beneficiosos para la salud intestinal.
Adicionalmente, la kojibiosa es un inhibidor de la glucosidasa, con capacidad de inhibir la eliminación de la glucosa terminal del /V-oligosacárido de mañosa (Glc)3(Man)9(GlcNAc)2 tanto desde un oligosacárido libre como de un oligosacárido unido al grupo amino de una proteína. Los inhibidores de glucosidasas han mostrado poseer una importante actividad antiviral (Tan A, et al. J. Biol. Chem., 1991 , 266, 14504-14510). La principal ventaja de la kojibiosa como inhibidor se basa en el hecho de que inhibe de forma específica la a- glucosidasa I en diferentes tejidos y órganos diana (European Patent 0 830 365 B1 , 2002). Esta propiedad resulta de especial importancia para el desarrollo de nuevos fármacos, especialmente de la clase "pseudodisaccharide" para el tratamiento de infecciones del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tipo 1 (Borges de Meló E, et al. Tetrahedron, 2006, 62, 10277-10302). La inhibición de la α-glucosidasa I impide la eliminación de los residuos de glucosa durante el procesado normal de la proteína de membrana del virus VIH gp120, lo que da lugar a glicoproteínas de estructura modificada implicadas en la rotura del ciclo de replicación de dicho virus. Por tanto, los inhibidores podrían ser considerados como agentes terapéuticos (European Patent 0 830 365 B1 , 2002). La kojibiosa ha mostrado inhibir la acción de la α-glucosidasa I en glándulas mamarias de origen bovino (Shailubhai K, et al. Biochem. J., 1987, 247, 555- 562,) o en microsomas hepáticos en ratas (Takeuchi M, et al. J. Biol. Chem., 1990, 108, 42-46), entre otras dianas.
También se ha sugerido el potencial uso de la kojibiosa en otro tipo de enfermedades víricas como la hepatitis B y C (Goffin D, et al. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 201 1 , 51 , 394-409). Asimismo, y como consecuencia de esta capacidad de inhibición de la enzima α-glucosidasa, la kojibiosa podría utilizarse para retrasar la digestión de carbohidratos ingeridos en la dieta como el almidón y la sacarosa, en aplicaciones terapéuticas de otras enfermedades, como la obesidad, diabetes mellitus, prediabetes, gastritis, úlceras duodenales y gástricas, caries o cáncer (European Patent 0 830 365 B1 , 2002; Goffin D, et al. Crit. Rev. Food Sci. Nutr, 201 1 , 51 , 394-409).
Algunos métodos descritos hasta el momento para la obtención de kojibiosa, incluyen su síntesis a partir de dextrano parcialmente acetilado (Matsuda K, et al. Nature, 1961 , 191 , 278); a partir de glicosidasas, como por ejemplo la a- glucosidasa, (Takahashi M, et al. Agrie. Biol. Chem., 1969, 33, 1399-1410); a partir de glucoamilasa (Fujimoto H, et al. Agrie. Biol. Chem., 1988, 52, 1345- 1351 ); a partir de sacarosa fosforilasa (Kitao S, et al. Biosci. Biotech. Biochem., 1994, 58, 790-791 ); o a partir de kojibiosa fosforilasa (Chaen H, et al. J. Biosci. Bioeng., 2001 , 92, 173-176), utilizando normalmente substratos como β-D- glucosa-1 -fosfato y 1 ,6-anhidro-p-D-glucopiranosa. Estos métodos exigen la utilización de reactivos y substratos muy costosos y poco accesibles, además de ser tediosos y llevar implícitos la formación de subproductos y/o la baja eficiencia de producción. Esto explica tanto la limitada disponibilidad de este producto, ya que son escasas las casas comerciales que apuestan por su comercialización, como que el precio de dicho producto (comercializado como patrón) sea muy elevado. Por tanto, el empleo de la kojibiosa está muy limitado a pesar de las numerosas aplicaciones potenciales que presenta en el campo de la industria agro-alimentaria y farmacéutica.
En este documento se plantea un procedimiento alternativo de obtención de la kojibiosa, que presenta un elevado rendimiento y un reducido coste, y que posibilita su obtención industrial de forma viable, lo que permitirá su posterior utilización a través de alimentos funcionales o nutracéuticos diseñados para la mejora de la salud del sistema gastrointestinal o de fármacos diseñados para el tratamiento de infecciones víricas o de otras patologías.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Breve descripción de la invención
El problema técnico que resuelve la presente invención es la síntesis de kojibiosa mediante un procedimiento sencillo, económico y de alto rendimiento que permite su obtención a un precio muy inferior al de su actual valor de mercado, posibilitando así el desarrollo de productos que permitan explotar su potencial actividad en el campo de la salud.
Constituye un primer objeto de la invención un procedimiento de síntesis de kojibiosa que parte de una mezcla de reacción que comprende como componente principal al trisacárido 2-a-D-glucopiranosil-lactosa, Ο-β-D- galactopiranosil-(1→4)-0-[a-D-glucopiranosil-(1→2)]-p-D-glucopiranosa, así como leucrosa, lactosa, fructosa, glucosa y sacarosa, obtenida por una reacción de transglucosilación que utiliza sacarosa y lactosa como substratos de partida, y que se caracteriza por llevarse a cabo a una temperatura comprendida entre 20 y 60 °C y por comprender, al menos, las siguientes etapas:
a) fermentación de la mezcla de reacción de partida previamente diluida hasta una concentración de azúcares comprendida entre 5 y 30 g/100 mL y que preferentemente es 20 g/100 mL, utilizando una levadura de la familia Saccharomycetaceae, en una relación comprendida entre 5 y 50 g de levadura por cada 100 g de azúcares, y b) hidrólisis de la mezcla de reacción fermentada en la etapa (a) a un pH comprendido entre 5 y 8, que preferentemente es 7, mediante la adición de una enzima con actividad β-galactosidasa a una concentración comprendida entre 10 y 100 U/mL.
En realizaciones preferidas de la invención, el procedimiento de síntesis utiliza como levadura Saccharomyces cerevisiae en una relación de 16 g de levadura por 100 gramos de azúcar, y la etapa (b) de hidrólisis se lleva a cabo a un pH de 7 con la enzima β-galactosidasa de Kluyveromyces lactis con una concentración de 65 U/mL, obteniendo un rendimiento de producción de kojibiosa superior al 25%, que preferentemente es superior al 35%, y que más preferentemente es superior al 45%.
En un aspecto de la invención, el procedimiento de síntesis comprende una etapa adicional (c) de purificación, posterior a la etapa (b) de hidrólisis, que se realiza utilizando una técnica seleccionada de entre fermentación con la levadura remanente añadida durante la etapa (a) o cromatografía o nanofiltración, y en todo caso obtiene una kojibiosa con un porcentaje de riqueza en peso con respecto al extracto seco, comprendido entre el 60 y el 100%.
En otro aspecto de la invención, se incluye una etapa (d) adicional de liofilización o atomizado, posterior a la etapa (c) de purificación. Constituye un segundo objeto de la invención la kojibiosa obtenida según el procedimiento de síntesis.
Constituye el tercer objeto de la invención el uso de la kojbiosa obtenida por el procedimiento de síntesis en la preparación de una composición alimentaria prebiótica útil para prevenir patologías gastrointestinales, o en la preparación de una composición farmacéutica útil para el tratamiento de enfermedades de tipo vírico o para retrasar la digestión de carbohidratos. Constituye el cuarto objeto de la invención una composición alimentaria prebiótica útil para prevenir patologías gastrointestinales caracterizada por que comprende la kojibiosa obtenida por el procedimiento de síntesis.
Constituye el quinto objeto de la invención una composición farmacéutica útil para el tratamiento de enfermedades de tipo vírico o para retrasar la digestión de carbohidratos, caracterizada por que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de kojibiosa obtenida por el procedimiento de síntesis, una sal, o un solvato de la misma farmacéuticamente aceptables.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa en la observación de que un procedimiento de síntesis que utiliza una mezcla de reacción de partida que comprende al trisacárido 2-a-D-glucopiranosil-lactosa, 0-p-D-galactopiranosil-(1→4)-0-[a-D- glucopiranosil-(1→2)]-p-D-glucopiranosa, leucrosa, lactosa, fructosa, glucosa y sacarosa, que se obtiene a partir de una reacción de transglucosilación enzimática de la lactosa empleando una dextransacarasa, y caracterizado por comprender una etapa de fermentación con levadura Saccharomyces cerevisiae, y una etapa de hidrólisis utilizando una β-galactosidasa procedente de Kluyveromyces lactis, permite la obtención de un disacárido de alto valor añadido y de difícil obtención, como es la kojibiosa (ver Ejemplos 1 a 4).
Adicionalmente se ha observado que la duración del procedimiento puede acortarse considerablemente si se añade un paso de purificación cromatográfica en columna, lo que impli ;aría además la obtención de kojibiosa con mayor pureza (ver Ejemplos 1 y 3).
Las principales ventajas técnicas de la presente invención, se indican a continuación:
a) con respecto al procedimiento: -es sencillo y económico; tiene lugar a temperatura moderada; tanto las enzimas, como la levadura, como los productos de partida utilizados presentan un coste reducido; el equipamiento requerido es sencillo, a diferencia de lo que por ejemplo sucede en los métodos referidos en el apartado del estado de la técnica,
-presenta un rendimiento de producción elevado, que alcanza hasta el 50% y con una pureza comprendida entre el 65-100% en función del paso de purificación final empleado, valores muy superiores a los que se obtienen en los procesos descritos en el estado de la técnica (Nakada T, et al. In Oligosaccharides in Food and Agriculture. ACS Symposium Series; Eggleston, G.; Cóté, G. L, Eds.; American Chemical Society: Washington, DC, 2003; Vol. 849, pp. 104-1 17), así como una reducida formación de subproductos de reacción,
-es fácilmente escalable, y
-permite la revalorización de subproductos de la industria agro- alimentaria, como por ejemplo, el permeado de suero de quesería, rico en lactosa, que se utiliza para la síntesis de la mezcla de reacción de partida, lo que redunda en una mejora medioambiental y de reducción de costes por tratamiento de residuos de las empresas generadoras;
b) con respecto a la kojibiosa obtenida:
-podría presentar un precio reducido con respecto a otras kojibiosas comerciales, como por ejemplo la de la casa comercial Sigma-Aldrich, que presenta un precio de 144€/mg de kojibiosa, y
-se trata de un producto de buena calidad microbiológica y que no presenta toxicidad ya que todos los sustratos y enzimas empleados en el proceso de síntesis son reconocidos como seguros, de grado alimentario y en ninguna etapa de la producción se originan residuos tóxicos o difíciles de eliminar. En la presente invención por "kojibiosa" se entiende un disacárido definido por la fórmula 2-O-a-D-glucopiranosil-a-D-glucopiranosa con propiedades bioactivas y/o funcionales debido a sus características estructurales. Los solicitantes de esta solicitud de patente han descubierto que una alternativa interesante para la obtención de la kojibiosa pasa por la utilización de una mezcla de reacción que se obtiene gracias a un procedimiento de síntesis del trisacárido 2-a-D-glucopiranosil-lactosa, Ο-β-D-galactopiranosil- (1→4)-0-[a-D-glucopiranosil-(1→2)]-p-D-glucopiranosa (ver Figura 1 ) consistente en una reacción enzimática de transglucosilación empleando una dextransacarasa (EC 2.4.1 .5) comercial de L. mesenteroides B512-F, que permite la transferencia de la unidad de glucosa de la sacarosa (substrato donador) a la lactosa (substrato aceptor) (Díez-Municio M, et al. J. Agrie. Food. Chem. 2012, 60, 1945-1953), en adelante mezcla de reacción de partida.
La mezcla de reacción de partida está compuesta por una combinación de carbohidratos que comprende al trisacárido anterior, leucrosa, lactosa, fructosa, glucosa y sacarosa. En el ámbito de la presente invención por "concentración de azúcares o azúcar" se entiende a una mezcla de carbohidratos cuya composición puede variar en función de la etapa del procedimiento a la que se refiera. Constituye el primer objeto de la invención un procedimiento de síntesis de kojibiosa que parte de la mezcla de reacción de partida, y que se caracteriza por llevarse a cabo a una temperatura comprendida entre 20 y 60 °C, que preferentemente es 30 °C y por comprender, al menos, las siguientes etapas: a) fermentación de la mezcla de reacción de partida previamente diluida hasta una concentración de azúcares comprendida entre 5 y 30 g/100 mL, y que preferentemente es 20 g/100 mL, utilizando una levadura de la familia Saccharomycetaceae, en una relación comprendida entre 5 y 50 g de levadura por cada 100 g de azúcar, y
b) hidrólisis de la mezcla de reacción fermentada en la etapa (a) a un pH comprendido entre 5 y 8, que preferentemente es 7, mediante la adición de una enzima con actividad β-galactosidasa a una concentración comprendida entre 10 y 100 U/mL. En la presente invención por "2-a-D-glucopiranosil-lactosa, Ο-β-D- galactopiranosil-(1→4)-0-[a-D-glucopiranosil-(1→2)]-p-D-glucopiranosa" se entiende un trisacárido galactosilado de la kojibiosa, derivado glucosilado de la lactosa, 4'-galactosil-kojib¡osa u oligosacárido derivado de la kojibiosa.
La mezcla de reacción de partida que se utiliza en el procedimiento de síntesis de la invención, se obtiene a partir de sustratos abundantes y de bajo coste como los disacáridos sacarosa y lactosa. Sin embargo es posible su sustitución por subproductos de la industria agro-alimentaria de bajo coste y de fácil obtención como el permeado de suero de quesería o subproductos derivados de la industria azucarera.
Por "reacción de transglicosilación" se entiende la reacción enzimática de transferencia de un residuo glicosídico a otro carbohidrato que actúa como aceptor.
La función de la levadura en el procedimiento de síntesis de la invención es la purificación de la mezcla de reacción de partida, eliminando la fructosa liberada en la reacción de síntesis de la misma, que es un inhibidor del enzima con actividad β-galactosidasa, que se utiliza en la etapa (b) de hidrólisis. La levadura también elimina trazas de sacarosa y glucosa. Más concretamente, la reacción producida por la levadura es la eliminación de azúcares mediante una glicólisis anaeróbica en la que los carbohidratos son convertidos en etanol y C02.
Ejemplos de levaduras de la familia Saccharomycetaceae que se utilizan dentro del ámbito de la invención son las de género Saccharomyces y Kluyveromyces, y preferentemente la Saccharomyces cerevisiae, que se caracteriza por su capacidad selectiva de eliminación de carbohidratos por fermentación (Yoon, SH, et al., 2003. Carbohyd. Res., 338, 1 127-1 132). En una realización preferida del primer objeto de la invención, la levadura que se utiliza en la etapa (a) de fermentación es la Saccharomyces cerevisiae y se utiliza en una relación de 16 g de levadura por cadal OO g de azúcar. Alternativamente a la utilización directa de la levadura, se utiliza levadura inmovilizada en alginato.
La función de la enzima con actividad β-galactosidasa es hidrolizar la lactosa (P-D-galactopiranosil-(1→4)-D-glucosa) y el trisacárido 2-a-D-glucopiranosil- lactosa, que dará lugar a la liberación de kojibiosa. Ejemplos de enzimas que se pueden utilizar dentro del ámbito de la invención son β-galactosidasas de origen microbiano y de grado alimentario, y preferentemente de Kluyveromyces lactis. La enzima con actividad β-galactosidasa que se utiliza en el ámbito de la invención, prioriza la capacidad hidrolítica frente a la capacidad de transgalactosilar, permitiendo de este modo obtener un producto final con una mayor pureza y libre de galactobiosas y/o otros di y trisacáridos diferentes a la kojibiosa que no se conseguiría con la utilización de otro tipo de enzimas.
En otra realización preferida del procedimiento de síntesis de la invención, la etapa (b) de hidrólisis se lleva a cabo a un pH de 7, la enzima con actividad β- galactosidasa es la Kluyveromyces lactis y se utiliza con una concentración de 65 U/mL.
El procedimiento de síntesis de la invención consigue la obtención de un compuesto que comprende kojibiosa y otros productos como leucrosa.
En un aspecto de la invención, el procedimiento de síntesis de la invención consigue un rendimiento de producción de kojibiosa que es superior al 25%, preferentemente superior al 35%, y más preferentemente superior al 45%. En otro aspecto de la invención, el procedimiento de síntesis de la invención incluye una etapa de purificación (c) posterior a la etapa (b) de hidrólisis para obtener un producto con un alto grado de pureza que facilite sus aplicaciones posteriores, y que se realiza utilizando una técnica seleccionada, a título ilustrativo y no limitativo, de entre fermentación con la levadura remanente añadida durante la etapa (a) de fermentación o cromatografía o nanofiltración.
En una realización particular del procedimiento de síntesis de la invención, la etapa (c) de purificación se lleva a cabo dejando reaccionar la levadura remanente añadida durante la etapa (a) de fermentación seguida de centrifugación o filtrado y se obtiene kojibiosa con un porcentaje de riqueza en peso con respecto al extracto seco, superior al 60%.
Los inventores de la presente solicitud han descubierto que la utilización de técnicas cromatográficas como método de purificación da lugar a una reducción considerable del tiempo de duración del proceso, así como a un aumento de la pureza del producto, en relación a por ejemplo la aplicación del tratamiento continuado con levadura. Ejemplos de técnicas cromatográficas que incluye el ámbito de la presente invención son la cromatografía de exclusión molecular (SEC) y la cromatografía de líquidos con detector de índice de refracción (LC- RID).
La cromatografía de exclusión molecular (SEC) separa por grado de polimerización, obteniéndose en este caso una fracción de disacáridos compuesta por kojibiosa y leucrosa. De esta técnica cabe destacar la ventaja de ser medioambientalmente limpia puesto que la fase móvil que se utiliza es agua, lo que además simplifica el posterior proceso de liofilización (si se desea obtener el producto en polvo) al no requerir un paso previo de evaporación, como ocurre si se emplean disolventes orgánicos. Resulta de especial interés cuando se desea realizar la purificación a gran escala, empleando una columna preparativa, como la utilizada en los ejemplos de la presente solicitud de patente, de 120 cm de longitud y 5 cm de diámetro interno, rellena con Bio-Gel P2, con diámetro de poro entre 1 .000 y 1 .800 Da, que permite purificar varios gramos de kojibiosa por inyección.
En otra realización particular del primer objeto de la invención, la etapa (c) de purificación se lleva a cabo mediante cromatografía de exclusión molecular (SEC), previa centrifugación o filtrado y se obtiene kojibiosa con un porcentaje de riqueza en peso con respecto al extracto seco, superior al 70%.
Otra alternativa en cuanto a técnica cromatográfica es la cromatografía de líquidos con detector de índice de refracción (LC-RID) empleando una columna con fase estacionaria tipo amino ligada y utilizando como fase móvil acetronitrilo:agua (75:25, v:v), en modo ¡socrático. Este tipo de purificación de mezclas de carbohidratos mediante LC-RID se puede realizar a nivel analítico, sem ¡preparativo o preparativo, obteniendo un producto con un grado de pureza superior al 95%.
En otra realización particular del primer objeto de la invención, la etapa (c) de purificación se lleva a cabo mediante cromatografía de líquidos con detector de índice de refracción (LC-RID), previa centrifugación o filtrado, y consigue kojibiosa con un porcentaje de riqueza en peso con respecto al extracto seco, superior al 95%.
En otro aspecto de la invención, el procedimiento de la invención incluye una etapa adicional (d) de liofilización o atomización de la kojibiosa posterior a la etapa (c) de purificación que permite obtener un producto final en polvo.
Constituye el segundo objeto de la invención, la kojibiosa obtenida por el procedimiento de síntesis de la invención, en adelante kojibiosa de la invención.
La alta resistencia de las uniones a-(1→2) de la kojibiosa a los enzimas digestivos de humanos y animales, y su potencial de estimulación selectiva de bacterias intestinales en el intestino, ampliamente especificados en el apartado del estado de la técnica, le confieren un gran potencial como prebiótico en la estimulación selectiva de bacterias beneficiosas como por ejemplo, Bifidobacterium y Lactobacillus, presentes en el intestino grueso y, en particular, en el colon, que pueden ejercer efectos beneficiosos sobre trastornos como la diarrea, inflamaciones, el cáncer, etc., mediante la modulación de las funciones fisiológicas, metabólicas e inmunológicas del hospedador. Por otra parte, la capacidad de la kojibiosa como inhibidor de la enzima a- glucosidasa, le confiere una importante actividad antiviral y capacidad para retrasar la digestión de carbohidratos ingeridos en la dieta, como el almidón y sacarosa, por la inhibición de glucosidasas intestinales, permitiendo su empleo en aplicaciones terapéuticas para distintas enfermedades, que preferentemente son obesidad, diabetes mellitus, prediabetes, gastritis o caries.
Constituye el tercer objeto de la invención, el uso de la kojibiosa de la invención para la elaboración de una composición alimentaria prebiótica, en adelante uso de la invención, que es útil para prevenir patologías relacionadas con el sistema gastrointestinal o para la elaboración de una composición farmacéutica que es útil para el tratamiento de enfermedades de tipo vírico o para retrasar la digestión de almidón y sacarosa en enfermedades como la obesidad, diabetes mellitus, prediabetes o caries. En el ámbito de la presente invención la enfermedad de tipo vírico, se elige, a título indicativo y no limitativo, de entre el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tipo 1 , o el virus de la hepatitis B o el virus de la hepatitis C.
Constituye un cuarto objeto de la invención, una composición alimentaria prebiótica para prevenir patologías gastrointestinales, en adelante composición alimentaria prebiótica de la invención, caracterizada por comprender la kojibiosa de la invención. Se entiende por "composición alimentaria prebiótica" cualquier combinación de ingredientes constitutiva de un producto alimentario sólido o líquido, que adicionalmente a sus características nutricionales, comprende funciones específicas de resistencia a la digestión gastrointestinal y de estimulación selectiva del crecimiento y actividad de una o varias cepas de bacterias en el sistema digestivo, que ayudan a mejorar la salud y a reducir el riesgo de contraer enfermedades. Constituye un quinto objeto de la invención, una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades de tipo vírico, o para retrasar la digestión del almidón y sacarosa en aplicaciones terapéuticas en enfermedades que afecten al tracto gastrointestinal, tal y como se definen en el presente documento, en adelante composición farmacéutica de la invención, caracterizada por comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de la kojibiosa de la invención, una sal, un solvato o un pro-fármaco de la misma farmacéuticamente aceptables, en adelante composición farmacéutica de la invención. El término "pro-fármaco" se usa en su sentido más amplio y abarca aquellos derivados que se convierten in vivo en derivados de la kojibiosa adecuados para el tratamiento de las patologías descritas anteriormente.
En otro aspecto de la invención, la composición farmacéutica de la invención adicionalmente, comprende al menos un excipiente, un adyuvante y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
En otro aspecto de la invención, la composición farmacéutica de la invención, incluye adicionalmente, al menos, otro principio activo. La composición farmacéutica de la invención se puede administrar por cualquier vía de administración apropiada, por ejemplo, oral, parenteral (subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, etc.), rectal, etc. En otro aspecto de la invención, la composición alimentaria de la invención se utiliza en el tratamiento preventivo de patologías gastrointestinales.
En otro aspecto de la invención, la composición farmacéutica de la invención se utiliza para el tratamiento de infecciones de tipo vírico, que preferentemente son el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tipo 1 , el virus de la hepatitis B o el virus de la hepatitis C, o para retrasar la digestión del almidón y sacarosa en aplicaciones terapéuticas de otras enfermedades, que preferentemente son obesidad, diabetes mellitus, prediabetes o caries. En el ámbito de la presente invención, también se incluyen los métodos de tratamiento preventivo de patologías gástricas, o de tratamiento de infecciones de tipo vírico, que preferentemente son el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tipo 1 , el virus de la hepatitis B o el virus de la hepatitis C, y para retrasar la digestión del almidón y sacarosa en aplicaciones terapéuticas de enfermedades, que afecten al tracto gastrointestinal, que preferentemente son obesidad, diabetes mellitus, prediabetes o caries, caracterizados por consistir en la administración de la composición alimentaria de la invención o de la composición farmacéutica de la invención. Breve explicación de las figuras
Figura 1. Estructura del trisacárido 2-a-D-glucopiranosil-lactosa (Ο-β-D- galactopiranosil-(1→4)-0-[a-D-glucopiranosil-(1→2)]-p-D-glucopiranosa) derivado galactosilado de la kojibiosa presente en la mezcla de reacción de partida.
Figura 2. Perfil obtenido por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) de la mezcla de azúcares obtenida mediante reacción de transglucosilación de la lactosa catalizada por la enzima dextransacarasa de Leuconostoc mesenteroides B-512F y posterior tratamiento con la levadura Saccharomyces cerevisiae y con la β-galactosidasa de Kluyveromyces lactis según el Ejemplo 1 con etapa (c) de purificación con levadura, donde se observa la síntesis de kojibiosa con alto rendimiento y porcentaje de pureza.
Figura 3. Espectro de masas de la kojibiosa sintetizada (A) obtenida según el Ejemplo 1 con etapa (c) de purificación con levadura y comercial (B) obtenido por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) mediante el análisis de sus correspondientes trimetilsililoximas (TMSO).
MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN A. SÍNTESIS DE LA KOJIBIOSA
Ejemplo 1. Partiendo de una mezcla de reacción que comprende al trisacárido 2-a-D-glucopiranosil-lactosa, leucrosa, lactosa, fructosa, glucosa y sacarosa, obtenida por una reacción de transglucosilación con sacarosa y lactosa (ratio equimolar) como substratos de partida.
La reacción de transglucosilación de partida, utilizando sacarosa y lactosa, se llevó a cabo según Díez-Municio M, et al. (J. Agrie. Food. Chem. 2012, 60, 1945-1953). Para ello, se preparó una solución de 250 g/L de sacarosa y 250 g/L de lactosa en tampón acetato sódico 20 mM con pH 5,2, suplementado con cloruro de calcio 1 mM, a la que se añadió 0,8 U/mL de enzima dextransacarasa de L. mesenteroides B-512F. Dicha mezcla de reacción se incubó a 30 °C de temperatura y agitación de 500 r.p.m durante 24 h. La mezcla resultante presenta como compuesto principal el trisacárido 2-a-D- glucopiranosil-lactosa.
Sobre la mezcla obtenida según el paso anterior, se llevó a cabo el procedimiento de síntesis de la invención a una temperatura de 30 °C. En primer lugar se llevó a cabo la etapa de fermentación, para ello la mezcla se diluyó con agua hasta una concentración total de azúcares de 200 g/L, se añadió la levadura S. cerevisiae, a una concentración de 32 g/L y se mantuvo en agitación fuerte (1000 r.p.m.) durante 4 horas hasta que la levadura hubo fermentado la totalidad de la sacarosa y la glucosa residual, así como gran parte de la fructosa (90-95%). En segundo lugar se llevó a cabo una etapa de hidrólisis, para ello se ajustó el pH del medio de reacción a 7 (con hidróxido de potasio) y se añadió cloruro de magnesio 10 mM y el enzima β-galactosidasa de K. lactis (Lactozym Puré 6500 L) a una concentración de 65 U/mL y se mantuvo en agitación fuerte (1000 r.p.m.) durante 90 min más. De esta forma, la lactosa no transglucosilada, se hidrolizó a glucosa y galactosa (monosacáridos que son consumidos por la levadura). Por otra parte, el compuesto principal de la mezcla, el trisacárido 2-a-D-glucopiranosil-lactosa, da lugar a kojibiosa (producto de interés resistente a la fermentación de la levadura) y galactosa (fermentado).
Tras las dos primeras etapas del procedimiento de síntesis se consigue sintetizar kojibiosa con un 38% de rendimiento en peso con respecto a la cantidad de lactosa inicial, lo que significa que partiendo de 100 g de lactosa se obtienen 38 g de kojibiosa.
En tercer lugar se realizó una etapa de purificación, utilizando un método seleccionado de entre, continuar con el tratamiento de levadura iniciado previo a la hidrólisis con β-galactosidasa, cromatografía de exclusión molecular (SEC) y cromatografía de líquidos con detector de índice de refracción (LC-RID) obteniendo distintos grados de pureza de la kojibiosa. Tal y como se indica a continuación, la elección del método de purificación pudo suponer modificaciones en las etapas primera y segunda del procedimiento.
-Aplicación del tratamiento continuado con levaduras
Tras la hidrólisis con β-galactosidasa, se dejó actuar la levadura remanente durante 42 horas más para eliminar los monosacáridos derivados de la hidrólisis de la lactosa y el residuo de galactosa del trisacárido 2-a-D- glucopiranosil-lactosa. Transcurrido el tiempo de reacción, la mezcla de azúcares obtenida se filtró o se centrifugó a 10.000 r.p.m. durante 5 minutos para eliminar la levadura.
El compuesto sintetizado presenta un alto porcentaje en kojibiosa, siendo éste de en torno al 65% del extracto seco, atendiendo a la cuantificación realizada por cromatografía de gases con detector de ionización de llama (GC-FID).
-Aplicación de cromatografía de exclusión molecular (SEC)
En este caso inmediatamente después de la etapa de hidrólisis con β- galactosidasa de K. lactis se llevó a cabo la filtración o centrifugación a 10.000 r.p.m. durante 5 min para eliminar la levadura. Posteriormente, tuvo lugar un proceso de purificación en columna durante 18 h mediante cromatografía de exclusión molecular (SEC). Se empleó una columna preparativa con unas dimensiones de 120 cm de longitud y 5 cm de diámetro interno, rellena con Bio- Gel P2, con diámetro de poro entre 1 .000 y 1 .800 Da, y en la que tiene lugar una separación por grado de polimerización. En este caso, la fase móvil es agua (lo que supone una ventaja medioambiental) y el flujo de trabajo utilizado 10 ml/min permitiendo purificar varios gramos de kojibiosa por inyección. El producto final obtenido presenta un alto porcentaje en kojibiosa, siendo éste de en torno al 76% (respecto al valor del extracto seco determinado (96%), atendiendo a la cuantificación realizada por cromatografía de gases con detector de ionización de llama (GC-FID). El resto de producto está únicamente constituido por un 24% del disacárido leucrosa, sintetizada en la reacción catalizada por la dextransacarasa al actuar la fructosa como aceptor, ya que con este tipo de separación se consigue obtener aislada la fracción de disacáridos.
-Aplicación de cromatografía de líquidos con detector de índice de refracción (LC-RID)
Al igual que en el caso anterior, inmediatamente después de la etapa de hidrólisis con β-galactosidasa de K. lactis se llevó a cabo la filtración o centrifugación a 10.000 r.p.m. durante 5 min para eliminar la levadura. Posteriormente tuvo lugar un proceso de purificación en columna durante 25 min mediante cromatografía de líquidos con detector de índice de refracción (LC-RID) empleando una columna amino ligada y utilizando como fase móvil acetronitrilo:agua (75:25, v:v), en modo ¡socrático.
Este tipo de purificación de mezclas de carbohidratos mediante LC-RID se puede realizar a nivel analítico, sem ¡preparativo o preparativo, obteniendo en todos los casos una kojibiosa con un grado de pureza próximo al 100%. Las dimensiones de la columna analítica son 150 - 250 mm de longitud y 4,6 mm de diámetro interno, el flujo de trabajo de 0,5 - 1 ,0 mL/min y el volumen de inyección de 50 - 100 μί, obteniendo 1 - 10 mg del producto de interés. La columna semipreparativa tiene unas dimensiones de 250 mm de longitud y 10 mm de diámetro interno, el flujo de trabajo de 4,0 - 5,0 mL/min y el volumen de inyección de 500 μί (obteniéndose 10 - 50 mg del producto de interés). A nivel preparativo se trabaja con una columna con dimensiones de 250 mm de longitud y 21 ,2 mm de diámetro interno, el flujo de trabajo de 21 ,0 mL/min y el volumen de inyección de 2-3 mL (obteniéndose 50 - 100 mg del producto de interés).
Ejemplo 2.- Partiendo de una mezcla de reacción que comprende al trisacárido 2-a-D-glucopiranosil-lactosa, leucrosa, lactosa, fructosa, glucosa y sacarosa obtenida por una reacción de transglucosilación con sacarosa y lactosa (ratio 1 :2,5) como substratos de partida
Se siguieron exactamente los mismos pasos que los indicados en el Ejemplo 1 (con etapa de purificación del tratamiento con levadura y posterior centrifugado), con la salvedad de que en este caso se partió de una solución de 100 g/L de sacarosa y 250 g/L de lactosa.
En este caso, se detectó que la lactosa no transglucosilada fue un 20% más que cuando se utiliza un ratio sacarosa: lactosa equimolar, lo que se tradujo en una disminución del rendimiento (28% en peso con respecto a la cantidad inicial de lactosa). El compuesto sintetizado presenta un alto porcentaje en kojibiosa, siendo éste de en torno al 52% (considerando el valor del extracto seco determinado), atendiendo a la cuantificación realizada por cromatografía de gases con detector de ionización de llama (GC-FID).
Ejemplo 3.- Partiendo de una mezcla de reacción que comprende al trisacárido 2-a-D-glucopiranosil-lactosa, leucrosa, lactosa, fructosa, glucosa y sacarosa, obtenida por una reacción de transglucosilación con sacarosa y permeado de suero de quesería (ratio sacarosa: lactosa equimolar) como substratos de partida
Se siguieron exactamente los mismo pasos que los indicados en el Ejemplo 1 , con la salvedad de que en este caso se partió de una solución de 250 g/L de sacarosa y 320 g/L de permeado de suero de quesería de origen bovino (cantidad equivalente a 250 g/L de lactosa).
Utilizando el permeado de suero de quesería, subproducto de la industria láctea, se obtiene kojibiosa con mayor rendimiento que cuando se utiliza lactosa como substrato (Ejemplo 1 ), sintetizándose kojibiosa con un 48% de rendimiento en peso con respecto a la cantidad de lactosa inicial, lo que significa que partiendo de 128 g de permeado de suero se obtienen 48 g de kojibiosa.
Del mismo modo que en el Ejemplo 1 la etapa de purificación se realizó utilizando un método seleccionado de entre, continuar con el tratamiento de levadura iniciado previamente a la hidrólisis con β-galactosidasa, cromatografía de exclusión molecular (SEC) y cromatografía de líquidos con detector de índice de refracción (LC-RID) en las mismas condiciones que las especificadas en dicho ejemplo.
-Aplicación del tratamiento continuado con levaduras El producto final obtenido presenta, al igual que en el Ejemplo 1 un alto y similar porcentaje en kojibiosa (~65%), acompañada de leucrosa, y una baja proporción de trisacáridos y metabolitos producidos por la levadura. -Aplicación de cromatografía de exclusión molecular (SEC)
El producto final obtenido presentó un alto y muy similar porcentaje en kojibiosa (~75%) acompañada por una baja proporción de leucrosa.
-Aplicación de cromatografía de líquidos con detector de índice de refracción (LC-RID)
El producto final obtenido presentó un porcentaje de pureza próximo al 100%. Dependiendo de la columna utilizada (analítica, semipreparativa o preparativa) se obtiene una menor o mayor cantidad de producto purificado. B. CARACTERIZACIÓN DE LA KOJIBIOSA SINTETIZADA
Ejemplo 4. Caracterización de la kojibiosa obtenida según los Ejemplos 1 y 2
El producto sintetizado según el Ejemplo 1 e incluyendo una etapa de purificación con el tratamiento continuado con levadura presentó un 65% de kojibiosa, un 19% del disacárido leucrosa, sintetizada en la reacción catalizada por la dextransacarasa al actuar la fructosa como aceptor, un 6% de trisacáridos (principalmente derivados galactosilados como a-D-Glucopiranosil- [1 -4]-p-D-Galactopiranosil-[1 -6]-p-D-Galactosa), y un 8% de metabolitos producidos por la levadura, como poli-alcoholes (ver Figura 2). La concentración en sales minerales fue de un 2%. Estos datos están referidos al contenido en extracto seco que fue de un 93% y se determinó gravimétricamente mediante el secado de las muestras en estufa a 102 °C hasta peso constante, de acuerdo con el método 950.01 de la AOAC (Association of Official Analytical Chemists). Además, para conocer la composición de los principales elementos del producto final se realizó una determinación porcentual de carbono, hidrógeno, nitrógeno y azufre mediante microanálisis (Analizador Elemental LECO CHNS-932) así como un análisis sem ¡cuantitativo multielemental (hasta 72 elementos) y posterior análisis cuantitativo de los elementos mayoritarios (potasio, magnesio y sodio), mediante espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS) (ELAN 6000 Perkin Elmer Sciex). Dichos análisis revelaron la baja presencia de sales en el producto final (2%).
El producto sintetizado según el Ejemplo 1 y purificado por SEC presentó una composición más sencilla con un 76% de kojibiosa y un 24% de leucrosa, considerando el valor del extracto seco determinado (96%). Asimismo, siguiendo el mismo Ejemplo 1 y aplicando LC-RID como paso de purificación condujo a una pureza de ~100% en kojibiosa.
El producto sintetizado según el Ejemplo 2 estuvo constituido por un 52% de kojibiosa, un 16% de disacáridos derivados de la hidrólisis de la lactosa y posterior transgalactosilación (alolactosa, galactobiosa, entre otros), un 14% de trisacáridos (principalmente derivados galactosilados de la lactosa como a-D- Glucopiranosil-[1 -4]-p-D-Galactop¡ranos¡l-[1 -6]-p-D-Galactosa), un 8% del disacárido leucrosa, sintetizada en la reacción catalizada por la dextransacarasa al actuar la fructosa como aceptor y un 8% de metabolitos producidos por la levadura, como poli-alcoholes. La composición en sales minerales fue de un 2%. Todos estos datos están referidos al contenido en extracto seco que fue de un 93%.
Por otra parte, se llevó a cabo un análisis para evaluar la calidad microbiológica del producto final, en el que se estudió la presencia de mohos y levaduras, bacterias aerobias totales, aerobios esporulados y enterobacterias. El recuento (expresado en unidades formadoras de colonias por gramo (ufc/g)) de mohos y levaduras se realizó en agar Sabouraud con cloranfenicol, incubando a 25 °C durante 5 días; las bacterias aerobias totales en agar nutritivo de recuento (PCA) a 30 °C durante 72 h; los aerobios esporulados en agar nutritivo de recuento (PCA) a 37 °C durante 48 h previo tratamiento térmico de la dilución madre a 80 °C durante 10 minutos y las enterobacterias en agar dextrosa bilis rojo violeta a 30 °C durante 24 h. Los datos obtenidos demostraron la buena calidad microbiológica del producto final.
Los datos de la caracterización química y microbiológica llevada a cabo en los productos finales obtenidos según se muestran en la siguiente Tabla 1 :
Tabla 1. Características del producto obtenido según los Ejemplos 1 y 2, con alto porcentaje en kojibiosa
Ejemplol Ejemplo 2
Caracterización Química
Extracto Seco (EST) 93% sobre producto 93% sobre producto
Kojibiosa 65% sobre EST 52% sobre EST
Leucrosa 19% sobre EST 8% sobre EST
Disacáridos
- 16% sobre EST
(derivados galactosilados)
Trisacáridos 6% sobre EST 14% sobre EST
Metabolitos de la levadura 8% sobre EST 8% sobre EST
Sales Minerales 2% sobre EST 2% sobre EST
Potasio 1 ,40% 1 ,40%
Magnesio 0,20% 0,20%
Nitrógeno 0,10% 0,10%
Sodio 0,10% 0,10%
Otros 0,10% 0,10%
PH 5,0 * 5,0 *
Análisis Microbiológico
Mohos y levaduras < 3 x 101 cfu/g < 3 x 101 cfu/g
Aerobios totales viables a
< 3 x 101 cfu/g < 3 x 101 cfu/g
30°C
Aerobios esporulados a
< 1 x 101 cfu/g < 1 x 101 cfu/g
30°C
Enterobacterias < 1 x 101 cfu/g < 1 x 101 cfu/g
* Valor obtenido al medir el pH de una disolución de 10 mg de producto disuelto en 1 mi de agua ultra pura. Como era de esperar, partiendo de una solución de 100 g/L de sacarosa y 250 g/L de lactosa (ver Ejemplo 2), la relación kojibiosa/leucrosa que se obtiene se ve favorecida. Esto es debido a una menor síntesis del disacárido leucrosa (en torno a un 40% menos), al encontrarse menos fructosa libre en el medio. Sin embargo, no se llega a obtener kojibiosa con mayor pureza debido a que se produce una considerable formación de productos derivados de la hidrólisis y posterior transgalactosilación de la lactosa libre, ya que ésta se encuentra en más cantidad. La kojibiosa y la leucrosa se han identificado por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) mediante el análisis de sus correspondientes trimetilsililoximas (TMSO) y la comparación con el patrón comercial previamente derivatizado. El espectro de masas de la kojibiosa obtenida según el Ejemplo 1 con etapa (c) de purificación con levaduras (ver Figura 3) se caracterizó por presentar los iones con una relación masa/carga (m/z) de: 319, 73, 147, 217, 361 y 205 (por orden decreciente de abundancia).

Claims

REIVINDICACIONES
1 . - Procedimiento de síntesis de kojibiosa que parte de una mezcla de reacción de partida que comprende al trisacárido 2-a-D-glucopiranosil-lactosa, Ο-β-D- galactopiranosil-(1→4)-0-[a-D-glucopiranosil-(1→2)]-p-D-glucopiranosa, leucrosa, lactosa, fructosa, glucosa y sacarosa obtenida por una reacción de transglucosilación que utiliza sacarosa y lactosa como substratos de partida, caracterizado por llevarse a cabo a una temperatura comprendida entre 20 y 60 °C y por comprender, al menos, las siguientes etapas:
a) fermentación de la mezcla de reacción de partida previamente diluida hasta una concentración de azúcares comprendida entre 5 y 30 g/100 ml_, utilizando una levadura de la familia Saccharomycetaceae, en una relación comprendida entre 5 y 50 g de levadura por cada 100 g de azúcar, y
b) hidrólisis de la mezcla de reacción fermentada en la etapa (a) a un pH comprendido entre 5 y 8, mediante la adición de una enzima con actividad β- galactosidasa a una concentración comprendida entre 10 y 100 U/mL.
2. - Procedimiento según la reivindicación 1 , caracterizado por que la levadura de la etapa (a) pertenece a los géneros Saccharomyces y Kluyveromyces.
3. - Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que la levadura es Saccharomyces cerevisiae y se utiliza en una relación de 16 g de levadura por 100 cada gramos de azúcar.
4.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la etapa (b) de hidrólisis se lleva a cabo a un pH de 7 y la enzima con actividad β-galactosidasa es Kluyveromyces lactis que se utiliza en una concentración de 65 U/mL.
5.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por un rendimiento de producción de kojibiosa superior al 25%.
6. - Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por un rendimiento de producción de kojibiosa superior al 35%.
7. - Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por un rendimiento de producción de kojibiosa superior al 45%.
8. - Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que adicionalmente comprende una etapa (c) de purificación, posterior a la etapa (b) de hidrólisis, que se realiza utilizando una técnica seleccionada de entre fermentación con la levadura remanente añadida durante la etapa (a) de fermentación o cromatografía o nanofiltración.
9. - Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado por que cuando la etapa (c) de purificación consiste en dejar reaccionar la levadura remanente añadida durante la etapa (a) de fermentación, seguida de centrifugación o filtrado, se consigue un porcentaje de riqueza en peso con respecto al extracto seco superior al 60%.
10. - Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado por que cuando la cromatografía, previa centrifugación o filtrado, es cromatografía de exclusión molecular (SEC) consigue un porcentaje de riqueza en peso con respecto al extracto seco superior al 70%, o por que cuando es cromatografía de líquidos con detector de índice de refracción (LC-RID) consigue un porcentaje de riqueza en peso con respecto al extracto seco superior al 95%.
1 1 . - Procedimiento según una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que incluye una etapa (d) adicional de liofilización o atomizado posterior a la etapa (c) de purificación.
12.- Kojibiosa obtenida según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 .
13. - Uso de la kojibiosa según la reivindicación 12 en la preparación de una composición alimentaria prebiótica útil para prevenir patologías gastrointestinales, o en la preparación de una composición farmacéutica útil para el tratamiento de enfermedades de tipo vírico o para retrasar la digestión de carbohidratos.
14. - Uso según la reivindicación 13, caracterizado por que la enfermedad de tipo vírico se selecciona de entre el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tipo 1 , o el virus de la hepatitis B o el virus de la hepatitis C.
15. - Composición alimentaria prebiótica útil para prevenir patologías gastrointestinales, caracterizada por que comprende kojibiosa según una cualquiera de las reivindicaciones 12 y 13.
16.- Composición farmacéutica útil para el tratamiento de enfermedades de tipo vírico o para retrasar la digestión de carbohidratos, caracterizada por que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de kojibiosa, una sal, o un solvato de la misma farmacéuticamente aceptables, según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.
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