WO2015032494A2 - Helminthosporium turcicum-resistente pflanze - Google Patents

Helminthosporium turcicum-resistente pflanze Download PDF

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WO2015032494A2
WO2015032494A2 PCT/EP2014/002386 EP2014002386W WO2015032494A2 WO 2015032494 A2 WO2015032494 A2 WO 2015032494A2 EP 2014002386 W EP2014002386 W EP 2014002386W WO 2015032494 A2 WO2015032494 A2 WO 2015032494A2
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Daniela SCHEUERMANN
Beat Keller
Simon Krattinger
Thomas Wicker
Gerhard HERREN
Severine HURNI
Bettina KESSEL
Thomas PRESTERL
Carsten Knaak
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Definitions

  • the present invention relates to the field of modification of plants by molecular biological methods and marker technology and genetic engineering. It relates to a novel Helminthosporium ft / rc / cum-resistant plant, in particular a maize plant comprising a polynucleotide with one or more resistance-conferring genes on a modified chromosome fragment from the accession Pepitilla, as well as a cell, a tissue, a part, grain and seeds thereof, an isolated polynucleotide comprising one or more resistance-conferring genes against Helminthosporium turcicum, a vector, a transgenic plant cell and a transgenic plant containing that polynucleotide. Also contemplated by the invention are suitable molecular markers and their use for introducing the resistance locus or transgene into a plant, as well as the identification of improved maize plants having a modified chromosome fragment.
  • NCL Northern Com Leaf Blight
  • Phenotype appears and is influenced by additional and partially dominant genes, the qualitative resistance is typically race-specific and can be inherited by single mostly dominant genes such as Ht1, Ht2, Ht3, Html or Htn1 (Lipps et al., 1997;
  • Htn1 mediates resistance by delaying the onset of sporulation and thus counteracts the development of lesions.
  • Htn1 gene requires the development of additional specific markers to further simplify genotyping.
  • the MAS (marker assisted-selection) technology then allows 'stacking' or 'pyramiding' of several resistance genes efficiently (Miner a /., 2012).
  • the introgression lines B37Htn1 or ⁇ N22Htn1 were used (Raymundo et al., 1981a, b; Simsox & Bennetzen, 1993, Bar-Zur et al., 1998; Coates & White, 1998).
  • WO 201 1/163590 discloses the genotype PH99N as an alternative source of NCLB resistance on chromosome 8 bin 5, which, however, does not correspond to the accession Pepitilla.
  • PH99N For generated backcrossing population from PH99N, essentially only resistances to H. turcicum races 0 and 1 were identified. Also, the resistance phenotype was not clearly determined. Nevertheless, the authors conclude that the resistance is due to the Htn1 gene. Although succeeded for PH99N the
  • Htn1 An alternative approach to harnessing the Htn1 gene is to identify and clone the resistance gene and use it in a transgenic approach.
  • the chromosomal fragment is not derived from Pepitilla, but from theariahybride DK888, which has multiple disease resistance. Investigations to
  • qNLB8.06 DK888 is either identical, allelic, tightly linked, or functionally linked to Ht2 but not to Htn1.
  • the resistance locus qNLB8.06 D K8S8 could be assigned to a chromosome fragment of 0.46 Mb Genomic annotations of this chromosomal fragment indicated 12 putative open reading frames, three of which each contained a tandem protein kinase-like gene (GRMZM2G135202; GRMZM2G164612) or a protein phosphatase similar gene (GRMZM2G1 19720) and each as a promising candidate gene for the same Resistance genes Ht2 are favored (Chung et al., 2010). A functional proof is not described.
  • WO 201 1/163590 A1 also annotates the putative Htn1 gene in the
  • Resistance source PH99N as a tandem protein kinase-like gene (GRMZM2G451 147) and discloses its genetic sequence, but does not demonstrate their functionality, for example in a transgenic maize plant also.
  • the present invention has been made in light of the above-described prior art, which is an object of the present invention
  • Corn plant provide a resistance to the pathogen
  • agronomic features is superior to the known maize plants with resistance from the donor Pepitilla.
  • the task is solved on the one hand by a corn plant, in the genome
  • Chromosome fragment from the donor pepitilla is integrated, wherein the chromosome fragment comprises an interval of the donor (hereinafter referred to as first interval or interval 1), which donor alleles according to the haplotype of Table 2 shows and has a polynucleotide, which in the corn plant resistance to Helminthosporium turcicum
  • the second interval or interval 2 between a marker in a first marker region (M1) flanked by the markers SYN14136 and PZE-108076510 and a marker in a second marker region (M2) identified by the markers SYN24931 and PZE-108077560 is flanked, does not contain.
  • B37HtN can be used to integrate the H77V7 locus to produce a Corn plant according to the invention almost all known maize genotypes in whose genome, in particular on chromosome 8 bin 5 or 6, an introgression of the HTT resistance locus from Pepitilla was inserted.
  • the chromosome fragment originates from the donor B37HTN1 or another maize genotype mentioned above.
  • B37HTN1 can be ordered through the Maize Genetics COOP Stock Center with Stock ID 65749.
  • the chromosome fragment integrated into the genome of the maize plant according to the invention is derived from donor pepitilla, which is known to have the resistance locus HTN1.
  • the introgression of this resistance locus is localized on the long arm of chromosome 8, 8.05 - 8.06.
  • the integrated chromosomal fragment includes the first
  • the polynucleotide comprises one or more resistance-conferring genes of the HTN1 locus from Pepitilla (Table 1) or gene alleles thereof. Gen or genallele can cause a resistance phenotype with the HTN1 -atn characteristics under attack conditions with H. turcicum.
  • the polynucleotide comprises one or more resistance-conferring genes of the HTN1 locus preferably selected from Pepitilla selected from RLK1 and EXT1 (see Table 1) or genallele thereof, which under attack conditions with H. turcicum a
  • the polynucleotide particularly preferably comprises a nucleotide sequence which codes for a polypeptide according to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6 or a homologue of a polypeptide according to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6 which under attack conditions with H. turcicum
  • HTN1 Effect resistance phenotype with the characteristics typical of HTN1.
  • These typical HTN1 features include, for example, delayed onset of sporulation, decreased development of lesions, development of smaller lesions, reduced sporulation zones, and / or no or only isolated chlorotic-necrotic lesions.
  • the polynucleotide is characterized in that it comprises a nucleic acid molecule, (a) the one nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 or 15 (b) the one nucleotide sequence having an identity of at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% to one the nucleotide sequences according to SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 13 or 15 preferably over the entire
  • Nucleic acid molecule according to (a) or (b) hybridized under stringent conditions, (d) which encodes a polypeptide having an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 or 16, (e) the A polypeptide having an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to any one of the amino acid sequences (d), encodes or (f) the partial sequence of a
  • nucleic acid Having nucleic acid according to (a) to (e).
  • nucleic acid a preferred embodiment that is
  • Polynucleotide characterized in that it comprises a nucleic acid molecule, (aa) which has a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1 or 5, (bb) the one
  • Nucleic acid molecule for the purposes of the present invention may be at least 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 or at least 100 consecutive nucleotides
  • the polynucleotide may be present in the heterozygous or homozygous state in the genome of the maize plant according to the invention.
  • the polynucleotide is in the homozygous state.
  • Table 1 Potential resistance-conferring genes of the HTN1 locus from Pepitilla; Gene name (column 1); Reference to corresponding SEQ ID NOs of the genomic exon sequence (column 2); Reference to corresponding SEQ ID NOs of the predicted amino acid / protein sequence (column 3); annotated homologous gene from the B73 reference genome (column 4).
  • the first interval in the chromosome fragment showing donor alleles according to the haplotype of Table 2 is by the sequence of donor alleles according to the
  • the first interval shows at least the donor allele which describes the resistance-conferring gene from Table 1, optionally with donor allele of the marker MA0008. Furthermore, the first interval preferably shows at least the donor alleles according to the haplotype according to Table 2 from MA0021 to MA0022 (ie MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA001 1, MA0012, MA0022) or from MA0005 to MA0022 (ie MA0005, MA0021 , MA0007, MA0008, MA0009, MA00 0, MA001 1, MA0012 and MA0022) or from MA0005 to
  • MA0013 ie MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA001 1, MA0012, MA0022 and MA0013 or MA0005 to MA0014 (ie MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011, MA0012, MA0022, MA0013 and MA0014) or from MA0005 to MA0015 (ie MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA001 1, MA0012, MA0022, MA00 3, MA0014 and MA0015) or from MA0005 to MA0015 (ie MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA001 1, MA0012, MA0022, MA00 3, MA0014 and MA0015) or from MA0005 to
  • MA0016 (ie MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA001 1, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015 and MA0016), more preferably from MA0005 to MA0017 (ie MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010 , MA001 1, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016 and MA0017), MA0005 to MA0018 (ie MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA001 1, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016 , MA0017 and MA0018), MA0005 to PZE-108095998 (ie MA0005, MA0021, MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA001, MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018 and
  • the first interval between the markers MA0004 and PZE-108097482, between the markers MA0004 and MA0022 is located between the markers MA0005 and PZE-108097482 or between the markers MA0005 and MA0022.
  • the first interval describes a portion of the chromosome fragment which can mediate HTN1-type resistance. As such, it is a carrier of the above polynucleotide.
  • each corn plant according to the invention is an Ht-resistant maize plant.
  • the Ht resistance mediated by the integration of the chromosomal fragment can be determined by means of
  • Ht-resistant maize plants according to the invention exhibit an increased resistance to H. turcicum of at least 1 credit score, preferably of at least 2 credit score or at least 3 credit score, and more preferably of at least 4 credit score.
  • a corn plant according to the invention preferably exhibits resistance to at least one species of Helmithosporium turcicum which does not correspond to the known breed specificity as known from the prior art.
  • a corn plant according to the invention is resistant to all known breeds of Helmithosporium turcicum, ie the mediated resistance is race-unspecific and can lead to the formation of a broad
  • Table 3 Boniturnot Scheme for phenotyping experiments in field trials at various locations with natural and artificial H. turcicum vaccination (according to the German Maize Committee (DMK); AG Varieties 27.02.02; (DMK J. Rath; RP Freiburg H.J. Imgraben)
  • the leaf area is affected.
  • the specification discloses the genetic or molecular structure of the HTN locus by indicating a haplotype, by mapping prominent markers, and by
  • the corn plant according to the invention proved to be in genotype and
  • Corn plant according to the invention the time of flowering that of an isogenic
  • the delay was at least 2 days, at least 3 days, at least 5 days, or at least 7 days. This noted difference in
  • the flowering time is an important agronomic feature. It can directly and significantly influence the yield potential of a corn plant. A delayed flowering time usually leads to a reduced yield.
  • the QTL with the HTN1 resistance from the donor B37HTN1 or Pepitilla was amplified by the SSR markers bnlg1067, umc1 121, MA0002, MA0003, bnlg1782, umc1287, umc1960 and bnlg240 in the store generations on chromosome 8 (bin 8.06) between the markers MA0002 (Table 4) and ümc1287 (Table 5) in a range of 23.1 cM (see Figure 1).
  • the location of the genomic donor sequence portion responsible for the identified linkage drag of the time of flowering was clearly determined at a further, second interval of the donor on the chromosomal fragment (Example 3B, Figure 3).
  • a chromosome fragment is integrated which does not contain the second interval of the donor.
  • the second interval originates for example from a recurrent parent who is not carrier of the linkage drug of the time of flowering or from an exogenously introduced homologous DNA fragment which is not carrier of the linkage drug on a suitable donor vector for targeted homologous
  • the second interval is proximal and tightly coupled to the
  • the second interval is an interval between a marker in a first marker region (M1) flanked by markers SYN14136 and PZE-108076510 and a marker in a second marker region
  • Marker region (M2) which is flanked by the markers SYN24931 and PZE-108077560.
  • the flanking markers can be found in Table 4.
  • SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 and PZE-108077560 are SNP markers for use in the KBioscience KASP system (www.lgcgenomics.com/genotyping/kaspgenotyping- responsents / kasp-overview /). They clearly define the marker regions M1 and M2, on both sides of the sequence section, which carries in the donor B37HTN1 or Pepitilla the linkage drag of the flowering time. In addition, as polymorphic markers, they are also suitable for distinguishing between the Pepitilla donor allele and, for example, the allele of the recurrent parent. All information on the use of these markers as KASP markers can be found in Table 4. Suitable exemplary primer hybridization parameters for the PCR are given in Example 2. A person skilled in the art will also be able to determine other suitable hybridization parameters. It is further.
  • markers SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 and PZE-108077560 or self-developed markers in M1 and / or M2 it is easy for the skilled person to determine whether in a maize plant in whose genome a chromosome fragment with HTN1 resistance locus from the Donor Pepitilla is integrated, the second interval of the donor described above is or is not included.
  • a chromosomal interval from the donor comprising, for example, genomic sequences representing drag linkage can be removed from the integrated chromosome fragment by genetic / homologous recombination.
  • the interval of the Pepitilla donor can be replaced by the corresponding interval of the recurrent pus genome or by an exogenously introduced homologous DNA fragment.
  • markers in general and the markers disclosed here can be used to assist selection. By way of example, a possible use of markers for the detection of an allele is reproduced below:
  • detecting an allele may include (a) isolating at least one
  • Nucleic acid molecule from the genome of a plant or plant cell / maize plant or maize plant cell comprising: (b) assaying the isolated nucleic acid molecule with at least one marker, and optionally (c) sequencing the allele in one and / or more genotypes, (d) detecting one and / or more polymorphisms and / or (e) the restriction with a restriction endonuclease capable of producing different sized fragments on a label allele.
  • a preferred embodiment of the maize plant according to the invention is a corn plant described above, wherein the chromosome fragment is the second interval of the corn plant
  • the corn plant according to the invention shows a different time of male and / or female flowering in comparison with the Pepitilla-converted line or plant such as B37HTN1, which shows the interval 2 between a marker in a first marker region (M1) passing through flanking markers SYN14136 and PZE-108076510, and containing a marker in a second marker region (M2) flanked by the markers SYN24931 and PZE-108077560, where different time means that the converted line or plant has a delay of at least 2 days, of at least 3 days, of at least 5 days or of at least 7 days.
  • B37HTN1 Pepitilla-converted line or plant
  • a further preferred embodiment of the maize plant according to the invention is a corn plant described above, wherein the chromosome fragment further comprises an interval of the donor (hereinafter referred to as third interval or interval 3) between a marker in the second marker region M2 and a marker in a third marker region M3 passing through the Marker PZE-108093423 (Table 4) and PZE-108093748 (Table 4), does not contain.
  • the markers PZE-108093423 and PZE-08093748 are SNP markers for use in the KBioscience KASP system (www.lgcgenomics.com/genotyping/kasp- genotyping-reagents / kasp-overview /): they clearly define the marker region M3.
  • polymorphic markers they are also suitable between donor alleles and
  • the third interval of the donor described above is or is not included.
  • Another preferred embodiment of the maize plant according to the invention is a maize plant as described above, wherein the chromosome fragment has a genetic portion which comprises the second interval and the third interval of the donor and is flanked a) by the markers SVN14136 and PZE-108093423, b) by the markers PZE-108076510 and PZE-108093423, c) of the markers SYN14136 and PZE-108093748 or d) of the markers PZE-108076510 and PZE-108093748, not included.
  • Chromosomfragment be determined, which under non-infestation conditions with H.
  • iurcicum can cause a significant negative impact on the yield potential of a maize plant with a chromosome fragment integrated with the HTN1 resistance locus from donor pepitilla in its genome. So show regardless of the above
  • a maize plant according to the invention which has a corresponding interval without linkage drag, for example from the recurrent parent, in the HTN1 intrafragment fragment from Pepitilla, instead of the fourth linkage drag carrying the linkage drag, shows no reduced silage yield and thus a yield, in particular a silage yield which corresponds to that of a comparable line without introgression (eg isogenic line or starting line).
  • Corn plant with linkage Drag of silage yield may increase by more than 2%, as 3%, as 4%, as 5%, as 6%, as 7%, as 8%, as 9%, as 10%, as 15% or as Be 20% higher.
  • the fourth interval is proximal and closely coupled to the resistance locus HTN1 and the first interval, respectively.
  • the fifth interval is distal and closely coupled to the
  • a particularly preferred embodiment of the maize plant according to the invention is a maize plant as described above, wherein the chromosome fragment further comprises i) the fourth interval of the donor between a marker in the third marker region M3 and a marker in a fourth marker region M4 flanking the markers MA0004 and MA0005 or ii) a genetic section with the fourth interval between does not contain a marker in the third marker region M3 and a marker in a seventh marker region M7 flanked by the markers MA0005 and MA0021; and / or wherein the chromosomal fragment further comprises i) the fifth interval of the donor between a marker in a fifth marker region M5 which by the markers
  • the flanking markers can be found in Table 4.
  • the markers MA0004, MA0005, MA0006, MA0013, MA0021, MA0022, PZE-108097482, PZE-108107671 and SYN4196 are SNP markers for
  • markers in particular polymorphic markers, in M4, in M5, in M6, in M7 and / or in M8.
  • the markers described in M3 it is easy for the skilled person to determine whether in a maize plant in the genome a chromosome fragment with HTN1 resistance locus from the donor Pepitilla is integrated, the fourth interval of the donor described above and / or the fifth interval described above is included or not included.
  • Another particularly preferred embodiment of the maize plant according to the invention is a maize plant as described above, wherein the chromosome fragment (i) has a genetic section containing the second interval, the third interval and the fourth interval of the donor and flanked a) from the markers SYN14136 and MA0004, b) from the markers PZE-108076510 and MA0004, c) from the markers SYN14136 and MA0005 or d) from the markers PZE-08076510 and MA0005, does not contain, or (ii ) a genetic segment comprising and flanking the second interval and the third interval of the donor a) from the markers SYN14136 and PZE-108093423, b) from the markers PZE-108076510 and PZE-108093423, c) from the markers SYN14136 and PZE-108093748 or d) from the markers PZE-108076510 and PZE-108093748, and does not contain the fifth interval of the donor, or (iii) a genetic
  • the chromosome fragment comprises (i) a genetic portion which includes and is flanked by the second interval, the third interval and the fourth interval of the donor a) from the markers SYN14136 and MA0021 or b) not containing the markers PZE-08076510 and MA0021, or (ii) a genetic segment comprising and flanking the second interval, the third interval and the fourth interval of the donor a) from the markers SYN14136 and MA0021 or b) from the markers PZE-108076510 and MA0021, and does not contain the fifth interval of the donor, or (iii) a genetic segment comprising and flanking the second interval, the third interval and the fourth interval of the donor a) of the Markers SYN14136 and MA0021, or b) of markers PZE-108076510 and MA0021, and a second genetic section representing the fifth interval de s donor comprises and is flanked a)
  • the object underlying the present invention is alternatively by a
  • chromosome fragment comprises the first interval of the donor, which shows donor alleles according to the haplotype of Table 2 and the polynucleotide, which mediates resistance to Helminthosporium turcicum in the corn plant and wherein the chromosomal fragment i) is the fourth interval of the donor between a marker in the third marker region flanked by the markers PZE-108093423 and PZE-108093748 and a marker in the fourth marker region flanking the markers MA0004 and MA0005 or ii) does not contain a fourth interval genetic segment between a marker in the third marker region M3 and a marker in the seventh marker region M7 flanked by the markers MA0005 and MA0021.
  • markers to the polynucleotide or to the phenotyping, applies correspondingly to these and any further alternative solution of the problem as well as disclosed embodiments.
  • a preferred embodiment of this maize plant according to the invention is a maize plant as described above, wherein the chromosome fragment i) the fourth interval of the donor flanking la) from the markers PZE-108093423 and MA0004, b) from the markers PZE-108093748 and MA0004, c) of the markers PZE-08093423 and MA0005 or d) of the markers PZE-108093748 and MA0005, not containing or ii) a genetic portion which covers the fourth interval of the donor and is flanked a) by the markers PZE-108093423 and MA0021 or b ) from the markers PZE-108093748 and MA0021, not included.
  • a further preferred embodiment of the corn plant according to the invention is a corn plant described above, wherein the chromosome fragment further does not contain the third interval of the donor between a marker in the second marker region M2 and a marker in the third marker region M3.
  • a further preferred embodiment of the maize plant according to the invention is a maize plant as described above, wherein the chromosome fragment comprises a genetic section which comprises the third interval and the fourth interval of the donor a) from the markers SYN24931 and MA0004, b) from the markers PZE- 108077560 and MA0004, c) from the markers SYN24931 and MA0005, d) from the markers PZE-108077560 and MA0005, e) from the markers SYN24931 and MA0021 or f) from the markers PZE-108077560 and MA0021.
  • a further preferred embodiment of the maize plant according to the invention is a corn plant described above, wherein the chromosome fragment i) further comprises the fifth interval of the donor between a marker in the fifth marker region M5 and a marker in the sixth marker region M6 or ii) a genetic section with the fifth interval between a marker in the eighth marker region M8 and a marker in the sixth marker region M6 not included.
  • Another particularly preferred embodiment of the maize plant according to the invention is a maize plant as described above, wherein the chromosome fragment i) is flanked by a genetic section which includes the third interval and the fourth interval of the donor a) from the markers SYN24931 and MA0004, b) the markers PZE-108077560 and MA0004, c) of the markers SYN24931 and MA0005 or d) of the markers PZE-108077560 and MA0005, and does not contain the fifth interval, or ii) a genetic section containing the third interval and the fourth
  • the interval of the donor comprises and is flanked a) by the markers SYN24931 and MA0004, b) by the markers PZE-108077560 and MA0004, c) by the markers SYN24931 and MA0005 or d) by the markers PZE-108077560 and MA0005, and a second mark genetic section that encompasses and flanks the fifth interval a) of the markers MA0022 and S
  • Another particularly preferred embodiment of the maize plant according to the invention is a maize plant as described above, wherein the chromosome fragment i) is flanked by a genetic segment which includes the third interval and the fourth interval of the donor a) from the markers SYN24931 and MA00021 or b) from or the markers PZE-108077560 and MA00021, and the fifth interval does not contain, or ii) a genetic segment comprising and flanking the third interval and the fourth interval of the donor a) from the markers SYN24931 and MA00021 or b) from the Markers PZE-108077560 and MA00021, and a second genetic segment that encompasses and flanking the fifth interval a) of the markers MA0022 and PZE-108107671, b) of the markers MA0022 and SYN4196, c) of the markers MA0013 and PZE -108107671 or from the markers MA0013 and SYN4196, not included.
  • the object underlying the present invention is further alternatively solved by a maize plant, in the genome of which a chromosome fragment from the donor pepitilla is integrated, the chromosome fragment comprising the first interval of the donor, which shows donor alleles according to the haplotype according to Table 2 and the polynucleotide having in the maize plant resistance to Helminthosporium turcicum
  • chromosomal fragment i) is the fifth interval of the donor between a marker in the fifth marker region flanked by markers MA0006 and PZE-108097482 and a marker in the sixth marker region identified by markers PZE-108107671 and SYN4196 or ii) a fifth interval genetic segment between a marker in the eighth M8 marker region flanked by markers MA0022 and MA0013 and a marker in the sixth
  • Marker region M6 which is flanked by the markers PZE-108107671 and SYN4196, does not contain.
  • a further preferred embodiment of the corn plant according to the invention is a corn plant described above, wherein the chromosome fragment further does not contain the third interval of the donor between a marker in the second marker region M2 and a marker in the third marker region M3.
  • a further particularly preferred embodiment of the maize plants according to the invention is one of the maize plants described above, wherein the chromosome fragment is flanked a) by a marker in the second marker region M2 and a marker in the sixth marker region M6, b) by a marker in the third marker region M3 and a marker in the sixth marker region M6, c) from a marker in the fourth marker region M4 and a marker in the sixth marker region M6, d) from a marker in the seventh
  • Corn plants is one of the maize plants described above, with the chromosome fragment flanked a) by the markers SYN24931 and SYN4196, b) by the markers PZE-108077560 and SYN4196, c) by the markers SYN24931 and PZE-108107671, d) by the markers PZE E) by markers PZE-108093423 and SYN4196, f) by markers PZE-108093748 and SYN4196, g) by markers PZE-108093423 and PZE-108107671, h) by markers PZE-108093748 and PZE-108107671, i) by markers MA0004 and SYN4196, j) by markers MA0005 and SYN4196, k) by markers MA0004 and PZE-108107671, I) by markers MA0005 and PZE-108107671, m) by markers MA0021 and SYN4196, n) by markers MA0021 and PZE-
  • a further particularly preferred embodiment of the maize plants according to the invention is one of the maize plants described above, wherein the chromosome fragment a) between a marker in the second marker region M2 and a marker in the sixth
  • the present invention further relates to a seed or a grain, a tissue, an organ, a part and a cell of the corn plants according to the invention described above.
  • the seed or grain is a seed or a grain, in whose genome the chromosome fragment of the embodiments of the invention described above is integrated.
  • the present invention relates to a method of identifying a H. turcicum resistant maize plant having in its genome a donor Pepitilla ghromosome fragment comprising detecting at least two alleles in the genome of the plant, wherein at least one allele is in a genomic Is located by a marker in the first marker region M1, the second marker region M2, the third marker region M3, the fourth marker region M4 or the seventh
  • Marker region M7 and flanked by the above-described polynucleotide conferring resistance to H. turcicum in the maize plant, and wherein at least one allele is in; is located in a genomic region flanked by the polynucleotide and by a marker in the sixth marker region M6, the fifth marker region M5 or the eighth marker region M8.
  • the marker regions as well as exemplary markers in these marker regions are described above.
  • Corn plant a corn plant according to the invention.
  • the invention further relates to a maize plant which has been identified by said method of identification.
  • the present invention provides a method for increasing the yield of a H. turcicum resistant maize plant into its genome
  • Chromosome fragment from the donor pepitilla comprising a step which effects the removal of the second interval of the donor, fourth interval of the donor or fifth interval of the donor, and wherein the chromosomal fragment comprises the above-described first interval of the donor, which donor Alleles according to the haplotype according to Table 2 shows and has a polynucleotide, which in the
  • Corn plant resistance to Helminthosporium turcicum mediates. For example, clearance can be achieved by genetic recombination during a crossing process between two corn plants, with a parent maize plant carrying the HTN1 resistance locus from Pepitilla.
  • clearance can be achieved by genetic recombination during a crossing process between two corn plants, with a parent maize plant carrying the HTN1 resistance locus from Pepitilla.
  • Breeding techniques for generating genetic recombination which, as a result, has the replacement of at least one of the above-identified linkage drag donor intervals by genomic sequences of the recurrent parent, which are preferably free of undesired genes, provides modern biotechnology with various other tools to those skilled in the art available, which allow a precise genome engineering.
  • Known tools include, for example, (meganucleases (Silva et al., 201 1), homing endonucleases (Chevalier 2002), zinc finger nucleases, TALE nucleases (WO 2010/079430, WO 201 1/072246) or CRISPR (Gaj et al., 2013), which are artificially nuclease fusion proteins that are capable of selectively double-stranded
  • nucleic acid molecules such as plant DNA and thereby generate double strand breaks at desired positions in the genome.
  • homologous recombination or nonhomologous end-joining may then be effected, which may result in drag-carrying intervals of the donor to remove linkage.
  • Suitable target sequences in the genome for the recognition domains of protruding nucleases can be found, for example, in the sequence information on the SNP markers (Table 4) or at their intervals.
  • SNP markers Table 4
  • Marker regions which are suitable as target sequences for the recognition domain of the nucleases.
  • the above molecular tools are capable of inducing DNA double strand breaks at defined locations in the genome of a plant.
  • Particularly advantageous here is the use of TALE nucleases (TALENs) or
  • Zinc Finger Nucleases The TALE or ZF recognition domain allows specific binding at any point in the genome. Knowing the sequence at the target area, one can tailor the TALE or ZF indoctrination domain so that it binds exclusively at the desired site in the genome. If the recognition sequence is fused, for example, with a nonspecific endonuclease such as Fokl, a double-strand break (DSB) can be induced at a defined site in the genome, which enables targeted genome engineering (Tzfira et al., 2012, Li et al., 201 1; Puchta enn Hohn 2010). The person skilled in the art is familiar with the handling of Fokl endonucleases and the preparation of suitable TALENs and ZFNs from the prior art.
  • a nonspecific endonuclease such as Fokl
  • DSB double-strand break
  • Induced double-strand breakage may, for example, stimulate homologous recombination between an endogenous target gene locus (e.g., one of the above marker regions) and an exogenously introduced homologous DNA fragment, which is not, for example, a carrier of Linkage Drag (e.g., on a suitable donor vector).
  • an endogenous target gene locus e.g., one of the above marker regions
  • an exogenously introduced homologous DNA fragment which is not, for example, a carrier of Linkage Drag (e.g., on a suitable donor vector).
  • This so-called 'gene replacement' or 'genome editing' can be performed in vitro and does not require a step of crossing between two plants.
  • the DNA fragment can hereby be a plant of the same
  • Species originate and correspond, for example, to the chromosomal segment which is to be replaced, only without linkage Drag.
  • cells with modified genome can be regenerated into plants and selected for whether the linkage drag was successfully removed and the previously transiently transformed DNA elements were lost again in the course of regenerative cell division.
  • markers described above can also be used. Methods for transformation and regeneration are known from the prior art and will be explained again below.
  • TALENs and ZFNs can also be used transgenically in the process of meiosis, where they induce double-strand breaks at predetermined sites in the genome and thus the probability of recombination at these sites in the genome Increase step of crossing over.
  • Linkage Drag can be significantly favored. It is known to a person skilled in the art how, after completion of the meiosis, he can obtain linkage-drag-free and TALENs or ZFNs-free from the haploid cells
  • the present invention relates to a process for producing a maize plant according to the invention, which comprises the following steps: (A) providing a first maize plant in its genome
  • Chromosome fragment from the donor Pepitilla is integrated, wherein the chromosome fragment comprises a first interval of the donor, which donor alleles according to the haplotype of Table 2 shows and has a polynucleotide, which mediates resistance to Helminthosporium turcicum in the maize plant, and wherein the chromosome fragment a second Contains interval of the donor and / or the fourth interval of the donor and / or the fifth interval of the donor, (B) providing a second maize plant, (C) crossing the maize plant (A) with the maize plant (B) and (D) Select one
  • Corn plant according to the invention preferably using at least one marker described above.
  • the present invention relates to a process for producing a maize plant according to the invention comprising the following steps: (A) Transiently transforming a corn plant cell having a first nucleotide sequence which is suitable for a first protein having endonuclease activity (eg a TALE or ZF endonuclease activity). Fusion protein) capable of inducing a double strand break of the DNA in the corn plant cell genome between marker region M2 and M4, and a second nucleotide sequence encoding a second protein having endonuclease activity (eg a TALE or ZF endonuclease activity).
  • a first protein having endonuclease activity eg a TALE or ZF endonuclease activity
  • Fusion protein capable of inducing a double strand break of the DNA in the corn plant cell genome between marker region M2 and M4, and a second nucleotide sequence
  • Fusion protein capable of inducing a double strand break of the DNA in the corn plant cell genome between marker region M5 and M6;
  • B transiently introducing a donor vector into the first maize plant cell carrying a chromosome fragment from donor pepitilla, the chromosome fragment first interval of the donor comprises welc Hessian donor alleles according to the haplotype of Table 2 and having a polynucleotide conferring resistance to Helminthosporium turcicum in the corn plant, and wherein the chromosomal fragment further comprises the chromosomal portions of the donor Pepitilla between the sites of double strand breaks (A) such that between homologous recombination takes place in the genome of the first corn plant cell and the chromosomal fragment of the donor vector, (C) regeneration of a maize plant from the corn plant cell, (D) identification of a corn plant according to the invention, preferably using at least one marker as described above. Particularly preferred are transiently introduced first and second Nunklein Acid
  • the above-described markers are detected by the present invention as oligonucleotides, in particular primer oligonucleotides.
  • the oligonucleotides are isolated oligonucleotides.
  • An oligonucleotide comprises
  • the resistance is from donor pepitilla and is HTN1.
  • transgenic plant in particular a transgenic maize plant, which comprises a transgenic plant cell described below.
  • the invention also relates to a part of this plant according to the invention, wherein a part may be a cell, a tissue, an organ or a combination of several cells, tissues or organs. An association of several organs is e.g. a flower or a seed.
  • the invention relates to a seed from the transgenic plant, wherein the seed comprises the polynucleotide according to the invention described below as a transgene.
  • a transgenic plant of the present invention shows a higher residual abundance than H. turcicum than a corresponding untransformed plant (isogenic plant without the transgene).
  • a transgenic Ht-resistant plant according to the invention exhibits an increased resistance to H. turcicum of at least 1 credit score, preferably of at least 2 note notes or at least 3 score notes and more preferably of at least 4 score notes (see rating scheme in Table 3).
  • the invention provides a method of producing a transgenic plant which comprises a step of introducing the polynucleotide or the vector of the present invention described below into a plant cell and optionally a step of selecting a transgenic plant cell. Furthermore, such a method for producing a transgenic plant by a
  • subsequent step characterized by the regeneration of the transgenic plant includes the transgenic plant cell generated in the first step.
  • Regeneration methods are known to those skilled in the art.
  • the present invention discloses the polynucleotide comprising one or more resistance-conferring genes of the HTN1 locus from Pepitilla (Table 1) or selected from RLK1 and EXT1 (see Table 1) or gene alleles thereof. Gen or genallele can be treated with H. turcicum under infestation conditions
  • the polynucleotide is characterized in that it comprises a nucleic acid molecule, (a) which has a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 or 15, (b) which has a nucleotide sequence with a nucleotide sequence Identity of at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% to one of the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1, 3 , 5, 7, 9, 11, 13 and 15 preferably over the entire sequence length, (c) hybridizing to the complementary strand of a nucleic acid molecule of (a) or (b) under stringent conditions, (d) the one polypeptide with a
  • Amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 or 16 encodes, or (e) that a polypeptide having an amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% is identical to one of
  • the polynucleotide is characterized in that it comprises a nucleic acid molecule (aa) which has a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1 or 5, (bb) the one
  • nucleotide sequence having an identity of at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% to one of the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1 or 5 preferably over the entire sequence length, (cc) that with the
  • the polynucleotide may be isolated and / or purified from its natural genetic environment, or is in substantially pure or homogeneous form.
  • the polynucleotide is DNA, and more preferably cDNA, ie, the polynucleotide comprises the cDNA from one or more resistance-conferring genes (Table 1). But it can also present as RNA.
  • a polynucleotide of the invention encodes at least one polypeptide capable of conferring resistance to the pathogen Helminthosporium turcicum in a plant in which the polypeptide is expressed.
  • the present invention further relates to a polypeptide which is capable of conferring resistance to H. turcicum in a plant in which the polypeptide is expressed and which is encoded by the polynucleotide or a part thereof of the present invention, the polypeptide being preferred an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 or 16 or particularly preferably one
  • polypeptide may be an isolated polypeptide.
  • the present invention relates to a vector comprising the polynucleotide of the invention.
  • the vector may be a plasmid, cosmid, phage or expression vector, transformation vector, shuttle vector or cloning vector, double or single stranded, linear or circular, or may be a prokaryotic or eukaryotic host, either by integration transform into its genome or extrachromosomally.
  • the polynucleotide of the invention is operably linked in an expression vector having one or more regulatory sequences which allow transcription and optionally expression in a prokaryotic or eukaryotic host cell.
  • the polynucleotide is under the control of a suitable promoter or terminator.
  • suitable promoters may be promoters which are constitutively induced (for example: 35S promoter from the cauliflower mosaic virus (Odell et al.
  • promoters which are pathogen-inducible for example: PR1 promoter from parsley (Rushton et al., 1996).
  • pathogen-inducible promoters are synthetic or chimeric promoters which are not naturally active occur, are composed of several elements and one
  • Minimal promoter include and upstream of the minimal promoter have at least one cis-regulatory element, which serves as a binding site for special
  • a suitable terminator is, for example, the nos terminator (Depicker et al., 1982).
  • the present invention also provides a method comprising introducing a described vector into a host cell.
  • the vector can be introduced, for example, by conjugation, mobilization, biolistic transformation, Agrobacterium -mediated transformation, transfection, transduction, vacuum infiltration or electroporation.
  • conjugation, mobilization, biolistic transformation, Agrobacterium -mediated transformation, transfection, transduction, vacuum infiltration or electroporation Such methods as well as methods for the preparation of described vectors are familiar to the person skilled in the art (Sambrook et al., 2001).
  • the present invention relates to a host cell comprising the polynucleotide or vector of the present invention.
  • a host cell according to the invention may be a prokaryotic (e.g., bacterial) or
  • the host cell is an Agrobacterium such as Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes or a plant cell comprising the polynucleotide or vector of the present invention.
  • Agrobacterium such as Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes
  • a plant cell comprising the polynucleotide or vector of the present invention.
  • the skilled worker is both numerous methods such as conjugation or electroporation known with which he
  • polynucleotide or vector of the present invention in one
  • Agrobacterium as well as methods such as various transformation methods (biolistic transformation, Agrobacterium -mediated transformation), with which he can introduce the polynucleotide according to the invention or the vector of the present invention into a plant cell (Sambrook et al., 2001).
  • the present invention relates to a transgenic plant cell which comprises the polynucleotide according to the invention as transgene or the vector of the
  • Such a transgenic plant cell is for example a plant cell which is transformed with the polynucleotide according to the invention or with the vector of the present invention, preferably stable.
  • the polynucleotide is operatively linked to one or more regulatory sequences which allow transcription and optionally expression in the plant cell.
  • the polynucleotide of the invention and the regulatory sequence (s) may then be the transgene.
  • Such regulatory sequences include, for example Promoter or a terminator. Those skilled in the art are aware of numerous plant-applicable functional promoters and terminators.
  • a transgenic shows
  • Plant cell of the present invention in particular a cell of a plant of the species Zea mays against H. turcicum a higher resistance than a
  • Transgenic Ht-resistant plant cells according to the invention exhibit increased resistance to H. turcicum of at least 1 credit score, preferably of at least 2 credit score or at least 3 credit score, and more preferably of at least 4 credit score (see rating scheme in Table 3). Furthermore, the present invention relates
  • the invention also provides a method of producing a transgenic plant cell of the present invention comprising a step of introducing the polynucleotide or vector of the present invention into a plant cell.
  • the insertion may take place by transformation
  • Electroporation is known to those skilled in the art (Sambrook et al., 2001).
  • the present invention also relates to a method for
  • Mediation or enhancement of resistance to H. turcicum in a plant preferably a plant of the species Zea mays, comprising a step of transforming a plant cell with the polynucleotide or vector of the present invention.
  • this method leads to increased resistance to H. turcicum of at least 1 Boniturnote, preferably of at least 2
  • Bonus notes or at least 3 bonus notes, and more preferably of at least 4 bonus notes (see rating scheme in Table 3).
  • the present invention also includes a method of modifying the resistance phenotype of a plant, particularly a maize plant, to the pathogen Helminthosporium turcicum, which comprises a step of mutating the resistance-conferring gene of the HTN1 locus from Pepitilla or a genallele thereof; one.
  • the resistance-conferring genes of the HTN1 locus from Pepitilla encodes a polypeptide according to SEQ ID NO: 2 or a homolog of one
  • Polypeptide according to SEQ ID NO: 2 which causes a resistance phenotype with the HTN1 -atn characteristics under infestation conditions with H. turcicum.
  • the resistance-conferring gene of the HTN1 locus from Pepitilla or a genallele thereof may be transgenic or endogenous in the genome of the plant. Modification of the resistance phenotype can a change in the pathogen racial specificity and / or a change in the resistance level measured as Boniturnote based on phenotypic characteristics such as affected leaf area (see Table 3) or measured as AUDPC value (see Example 1 C) mean.
  • the resistance level after modification of the resistance phenotype is between the resistance level of a plant expressing the non-mutated resistance-mediating gene of the HTN1 locus from Pepitilia and the resistance level of an isogenic plant containing the resistance-conferring gene of the HTN1 locus from Pepitilia not expressed; but it can also be above the resistance level of a plant that has not mutated
  • the level of resistance is between the level of resistance of a plant expressing the polypeptide of SEQ ID NO: 2 and the level of resistance of an isogenic one
  • the term mutating can be used as a human-performed one
  • mutagenesis Modification of the genetic sequence (mutation) can be understood. Examples of these are that plants, plant cells or parts of plants are exposed to a high dose of chemical, radiological or other mutagensens and then selected for mutants. Alternatively, mutagenesis can also be performed, for example, with the aid of tilling, TALE nucleases, zinc finger nucleases or a
  • mutating the resistance-conferring gene of the HTN1 locus from Pepitilia results in at least one amino acid substitution, at least two
  • Amino acid substitution at least three amino acid substitutions, at least five or more amino acid substitutions. In the case of multiple amino acid changes, these may also be present on different genallines of the resistance-conferring gene of the Pepitilia HTN1 locus, i. the mutation may be heterozygous or homozygous.
  • Resistance phenotype of a plant results in mutation of the resistance-conferring gene of the Pepitilia HTN1 locus to a point mutation in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 at position 1365 with the base exchange of a G to an A or at position 1490 with base exchange of one G to an A. Furthermore, this relates Design also mutating, leading to an amino acid exchange in the
  • mutating the resistance-conferring gene of the HTN1 locus from Pepitilla results in a point mutation resulting in an amino acid substitution in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 between position 1365 and position 1490 or the embodiment refers to the mutation that results in an amino acid substitution in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 between position 455 and position 497.
  • the invention relates to a method of producing a plant, in particular a maize plant, having a modified resistance phenotype to the pathogen Helminthosporium turcicum, which comprises a step of mutating the resistance-conferring gene of the HTN1 locus from Pepitilla or a genallele thereof in at least a cell of the plant or in at least one cell from which the plant is regenerated.
  • the method can thus be a step of
  • Resistance-mediating gene of the HTN1 locus from Pepitilla for a polypeptide according to SEQ ID NO: 2 or a homologue of a polypeptide according to SEQ ID NO: 2, which under
  • H. turcicum causes a resistance phenotype with the characteristics typical of HTN1.
  • the resistance-conferring gene of the HTN1 locus from Pepitilla or a genallele thereof may be transgenic or endogenous in the genome of the plant.
  • a modified resistance phenotype may be a change in pathogen racial specificity and / or a change in resistance level measured as bonus score based on phenotypic characteristics such as affected leaf area (see Table 3) or measured as AU DPC value (see Example 1C). This is preferably
  • Resistance level of the modified resistance phenotype between the resistance level of a plant expressing the non-mutated resistance-conferring gene of the HTN1 locus from Pepitilla and the resistance level of an isogenic plant not expressing the resistance-conferring gene of the Pepitilla HTN1 locus; but it can also be over the
  • Resistance level of a plant expressing the non-mutated resistance-conferring gene of the HTN1 locus from Pepitilla is particularly preferred.
  • the term mutating can be used as a human-made alteration of the genetic sequence
  • Mutagensien are exposed and then selected for mutants.
  • mutation may also be performed, for example, by Tillingj TALE nucleases, zinc finger nucleases or a CRISPR / Cas system or by fusion, insertion, deletion or substitutions in the DNA sequence or the amino acid sequence.
  • the person skilled in the art from known prior art receives sufficient technical instructions for action.
  • mutating the resistance-mediating gene of the Pepitilla HTN1 locus results in at least one amino acid replacement, at least two amino acid changes, at least three amino acid changes, at least five or more amino acid changes. In the case of multiple amino acid substitutions, these can also be on different
  • Genes of the resistance-conferring gene of the HTN1 locus from Pepitilla are present, i. the mutation may be heterozygous or homozygous.
  • mutating the resistance-mediating gene of the HTN1 locus from Pepitilla leads to a point mutation in the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1 at position 1365 the base exchange of a G to an A or at position 1490 with the
  • this embodiment also relates to the mutation leading to an amino acid substitution in the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2 at position 455 of M (methionine) to I (isoleucine) or at position 497 of G
  • the mutation of the resistance-conferring gene of the HTN1 locus from Pepitilla results in a point mutation resulting in an amino acid substitution in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 between position 1365 and position 1490 or the embodiment relates to the mutation leading to an amino acid substitution in the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2 between position 455 and position 497.
  • the invention also includes plants or a part thereof which can be produced by a method of producing a plant having a modified resistance phenotype to the pathogen Helminthosporium turcicum.
  • the invention further encompasses a plant or part thereof which has a mutation in the resistance-conferring gene of the HTN1 locus from Pepitilla or a genallele thereof.
  • the mutation results in a modified resistance phenotype as described above.
  • the resistance-conferring gene of the HTN1 locus from Pepitilla codes for a polypeptide according to SEQ ID NO: 2 or a homolog of a polypeptide according to SEQ ID NO: 2, which under resistance conditions with H.
  • the resistance-conferring gene of the HTN1 locus from Pepitilla or a genallele thereof may be transgenic or endogenous in the genome of the plant.
  • the mutation is a point mutation in the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1 at position 1365 with the base exchange of a G to an A or at position 1490 with the base exchange of a G to an A.
  • this embodiment also relates to a mutation leading to an amino acid exchange in the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2 at position 455 of M (methionine) to I.
  • the mutation of the resistance-mediating gene of the HTN1 locus from Pepitilla is a point mutation which results in an amino acid exchange in the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1 between the position 1365 and the Position 1490 or the embodiment relates to a mutation leading to an amino acid substitution in the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2 between position 455 and position 497.
  • allele refers to one of two or more nucleotide sequences on one
  • a first allele is found on one chromosome, a second on a second chromosome in the same position. If the two alleles are heterozygous, the same alleles are homozygous.
  • Different alleles of a gene differ in at least one SNP. Depending on the context of the description, an allele means only a single SNP, the For example, a distinction between donor of HTN1 (Pepitilla) and recurrent parent allowed.
  • chromosome fragment is a specific chromosomal DNA segment of a particular chromosome comprising at least one gene.
  • Chromosome fragment derived from a donor source may correspond to that sequence as found in the original chromosome fragment of the donor source.
  • the integrated chromosome fragment can be present unaltered over the entire length of the corresponding chromosome fragment in the donor source.
  • a chromosome fragment or part thereof may represent a specific "haplotype", the chromosome fragment then having certain SNPs by which the haplotype is also uniquely specified and can be identified.
  • distal and proximal refer to the location of a chromosomal interval or portion in relation to a particular reference location
  • a particular polynucleotide, another chromosomal interval or a gene on a total chromosome, where distal means that the interval or the portion on the opposite side of the chromosome centromere
  • Reference location is located, and proximal means that the interval or section is located on the chromosome centromere side of the reference site.
  • “Closely coupled” or “tightly linked” means two loci, two intervals, two genetic sections or two markers (marker loci) which are less than 15 cM, less than 12 cM, which are less than 10 cM, which are less than 8 cM less than 7 cM, which is less than 6 cM, which is less than 5 cM, which is less than 4 cM, which is less than 3 cM, which is less than 2 cM, which is less than 1 cM, which is less than 0.5 cM less than 0.2 cM, which are less than 0.1 cM as determined by the IBM2 neighbors 4 genetic map publicly available on the Maize GDB website.
  • yield in the context of the present invention relates to the productivity per
  • corn yield is usually measured in metric tons of seeds or grain per hectare (ha) and season or in metric tons of dry biomass per hectare (ha) and season. Unless otherwise specified or specified, the yield may be the absolute fresh or dry mass, the relative fresh or dry
  • silage yield also called Silo Maize yield or Total Dry Matter Yield
  • the yield is influenced by genetic and environmental factors and consists in principle of numerous agronomic
  • agronomic properties that represent genetic element-based traits of a plant and contribute to eventual yield throughout the season. These individual agronomic properties include, for example, seed emergence, vegetative vitality, stress tolerance, disease resistance or tolerance, herbicide resistance, branching tendency, flowering time, seed batch, seed density, stableness and tending, dryness (uniform maturity), etc.
  • genetic portion having a more specified interval is to be understood as a genetic portion which includes or includes the specified interval, that is, is not limited to the specified interval, for example, a genetic portion means the fifth interval between a Markers in the eighth marker region M8 flanked by the markers MA0022 and MA0013, and a marker in the sixth marker region M6 flanked by the markers PZE-108107671 and SYN4196, that the genetic portion comprises the fifth interval and the genetic portion between a marker in the eighth marker region M8 flanked by markers MA0022 and MA0013, and a marker in the sixth marker region M6 flanked by markers PZE-108107671 and SYN4196.
  • hybridization or “hybridization” is meant a process in which a single-stranded nucleic acid molecule to a largely complementary
  • Nucleic acid strand attaches i. deals with this base pairings. Standard methods for hybridization are described, for example, in Sambrook et al. 2001 described. Preferably, it is understood that at least 60%, more preferably at least 65%, 70%, 75%, 80% or 85%, more preferably 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98% or 99% of the bases of the nucleic acid molecule are base paired with the
  • stringency refers to the hybridization conditions High stringency is given when base pairing is difficult, low stringency when base pairing is facilitated
  • the stringency of the hybridization conditions depends, for example, on salt concentration or ionic strength and temperature.
  • the stringency may be due to an increase in temperature and / or a
  • Stringent Hybridization conditions are to be understood as meaning those conditions in which hybridization occurs predominantly only between homologous nucleic acid molecules The term” hybridization conditions “does not only refer to the conditions prevailing during the actual attachment of the nucleic acids, but also to the conditions prevailing in the subsequent washing steps , stringent
  • Hybridization conditions are, for example, conditions under which predominantly only those nucleic acid molecules which have at least 70%, preferably at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at least 95% sequence identity hybridize.
  • Stringent hybridization conditions are
  • stringent hybridization conditions may also mean hybridization at 68 ° C in 0.25 M sodium phosphate, pH 7.2, 7% SDS, 1 mM EDTA and 1% BSA for 16 hours and then washing twice with 2x SSC and 0.1% SDS at 68 ° C. Preferably, hybridization takes place under stringent conditions.
  • interval means a continuous linear segment on genomic DNA which is present in a single chromosome in planta or on a chromosome fragment and which is usually indicated by two markers indicating the endpoints of the interval to the distal and represent proximal side is defined.
  • the markers defining the interval terminal can itself also be part of the interval.
  • two different intervals can also overlap.
  • an interval is specified by the phrase "between marker A and marker B."
  • a terminal marker of an interval can also be located in a defined marker region to one side of the interval, and a marker region is then defined by the designation of two flanking markers and flanking markers determine the endpoints of a marker region and are themselves still part of the marker region If both terminal markers of one interval are markers in different marker regions on either side of a marker
  • an interval is specified by the term "between a marker in a marker region X flanked by markers C and D and a marker in a marker region Y flanked by markers E and F."
  • a marker region may extend over up to 500,000 Baasencrue (bp), may be preferred between 100,000 and 400,000 bp, or more preferably between 140,000 and 315,000 bp in size.
  • introduction is meant, in the context of the present invention, the transfer of at least one desired gene allele on a genetic locus from one genetic background to another.
  • introduction is meant, in the context of the present invention, the transfer of at least one desired gene allele on a genetic locus from one genetic background to another.
  • Offspring can be transmitted by sexual cross between two parents of the same species.
  • isolated polypeptide is meant a polypeptide liberated from its native environment, and the term also includes a synthetically produced polypeptide.
  • Pathogen interacts with a plant host tissue.
  • fungi such as Ascomycetes or in ⁇ omyceten the outgrowth of hyphae or the
  • Donor Pepitilla "Accession Pepitilla” or “Pepitilla” in addition to the landrace Pepitilla itself also other maize genotypes, in whose genome, in particular on chromosome 8 is 5 or 6, an introgression of / - / 7 V7 resistance locus preferably inserted from Pepitilla
  • HTN1 Resistance source that mediates the resistance phenotype with the characteristics typical of HTN1 after introgression into a susceptible maize line / maize plant.
  • These typical HTN1 features include, for example, delayed onset of sporulation, decreased lesion development, development of smaller lesions, reduced
  • locus is a location on a chromosome where there are one or more genes that cause or affect an agronomic trait.
  • locus here means the HTN1 resistance locus which confers resistance to the pathogen Helminthosporium turcicum or at least to a race of Helminthosporium turcicum.
  • a "maize plant” is a plant of the species Zea mays and their subspecies such as Zea mays spp. Mays, Zea mays spp. Mexicana or Zea mays ssp.
  • a “marker” is a nucleotide sequence that is used as a reference or landmark.
  • a marker for recognizing a recombination event should be able to accommodate differences or polymorphisms within a plant population
  • markers these differences are found at the DNA level and are, for example, polynucleotide sequence differences such as simple sequence repeats (SSRs), restriction fragment length polymorphisms (RFLPs), fragment length polymorphisms (FLPs) or single nucleotide polymorphisms (SNPs).
  • SSRs simple sequence repeats
  • RFLPs restriction fragment length polymorphisms
  • FLPs fragment length polymorphisms
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • the markers may be derived from genomic or expressed nucleic acids, such as spliced RNA, cDNA or ESTs, and may also refer to nucleic acids used and useful as probes or primer pairs
  • markers in the description may also mean a specific chromosome in the genome of a species where a specific marker (eg, SNP) can be found. Such a marker position can be used to track the presence of a linked locus, eg, a linked locus capable of expressing a particular phenotypic locus
  • the marker locus can also be used to control the segregation of alleles at a locus (QTL or
  • “Operably linked” means joined in a common nucleic acid molecule in a manner such that the joined elements are positioned and oriented with respect to each other such that transcription of the nucleic acid molecule may occur.
  • a DNA which is operably linked to a promoter is under the transcriptional control of this promoter.
  • Vegetable “organs” mean, for example, leaves, stem axis, stem, roots, vegetative buds, meristems, embryos, anthers, ovules or fruits.
  • Plant “parts” mean an association of several organs, e.g. a flower or seed, or part of an organ, e.g. a cross section of the stem axis.
  • Plant “tissues” are, for example, callus tissue, storage tissue, meristematic tissues, leaf tissue, shoot tissue, root tissue, plant tumor tissue or reproductive tissue.
  • plant “cells” are meant, for example, isolated cells with a cell wall or aggregates thereof or protoplasts.
  • a "plant” within the meaning of the invention may, unless otherwise indicated, be of any species of the dicotyledonous, monocotyledonous and gymnospermic plants.
  • plants are monocotyled and are of interest in agriculture or horticulture or for the production of bioenergy (bioethanol, biogas, etc.).
  • bioenergy bioethanol, biogas, etc.
  • plants include, by way of example, Gossypium sp., Zea mays, Brachypodium distaehyon, Triticum sp. , Hordeum vulgare, Oryza sativa, Sorghum sp., Musa sp., Saccharum officinarum, Seeale cereale, Avena sp., Grass and forage grass.
  • a plant according to the invention is preferably a plant of the genus Zea, in particular of the species Zea mays, or sorghum.
  • the term "regulatory sequence” refers to a nucleotide sequence which influences the specificity and / or the level of expression, for example by the regulatory sequence having a particular one
  • Such a regulatory sequence may be located upstream of, but also downstream of, the transcription initiation point of a minimal promoter, such as in a transcribed but untranslated leader sequence or within an intron.
  • resistance-conferring genes from the accession Pepitilla be encoded.
  • the resistance may be complete or partial and may be pathogen-specific or non-pathogenic-specific.
  • a pathogen race-specific resistance among the virulent races of Helminthosporium turcicum, for example, N, 1N, 2N, 23N or 123N, avirulent races may include, for example, 0, 1, 2, 3, 12, 23 or 123.
  • Mediated resistance may be a newly-acquired resistance or an increase in existing partial resistance.
  • a “transgenic plant” refers to a plant in whose genome at least one polynucleotide, preferably a heterologous polynucleotide, is integrated.
  • the polynucleotide is stably integrated, which means that the integrated polynucleotide is stably maintained in the plant, expressed and can be stably inherited to the offspring.
  • the stable introduction of a polynucleotide into the genome of a plant also includes integration into the genome of a plant of the preceding one
  • heterologous means that the introduced polynucleotide, for example, originates from one cell or organism having a different genetic background of the same species or species, or is homologous to the prokaryotic or eukaryotic host cell, but in a different genetic environment is localized and thus of a possibly naturally existing
  • corresponding polynucleotide is different.
  • a heterologous polynucleotide may be present in addition to a corresponding endogenous gene.
  • Figure 1 Calculated QTL range of 23.1 cM on chromosome 8 using 8 markers in 528 F2 individuals of the hybrid RP1 x RP1 HTN1.
  • the black bar (HtN) indicates the condicence interval. Position information of the markers in cM.
  • Figure 3 Description of the marker regions M1 to M6, which the chromosomal
  • Interval 1 includes the resistance locus HTN1
  • Interval 2 comprises sequence regions which are responsible for the linkage drag of the flowering time in the donor
  • Intervals 4 and 5 comprise sequence regions, which are responsible in the donor for the linkage drag of the silage yield.
  • Figure 4 BAC contig on its RP4H ⁇ N1 BAC library with corresponding sequence scaffold and gene annotations. Candidate genes are presented as checkered boxes.
  • Black arrows represent additional annotated genes which are not candidate genes of HTN resistance.
  • the donor B37HTN1 as a source of HT resistance has been crossed into various genetic backgrounds from elite lines with distinctly distinct susceptibility to H. turcicum, and near-dissected lines that emerge from the prone baseline essentially only by the introgression
  • B37HTN1 differ.
  • phenotyping experiments after artificial inoculation as described above, those lines were selected which showed an improvement in HT resistance by introducing at least 2 to 3 credit score, preferably from 3 to 4 credit score, by introducing resistance-conferring introgression from B37HTN1.
  • the present invention is described in more detail below on the two selected recurrent parents RP1 and RP3.
  • the results of said phenotyping experiments are summarized in Table 5.
  • the recurrent parent RP1 without introgression showed average score from 7 to 9, which was improved by 3 to 4 notes due to the introgression from B37HTN1.
  • the recurrent parent RP3 showed credit score between 4 and 6 without introgression and an improvement of 2 to 3 credit score by the introgression.
  • the recurrent parent RP4 showed a score of 6 without introgression and an improvement of 2-3 credit notes by the introgression.
  • Table 5 Phenotyping data for HT resistance from genotypes RP1, RP3, and RP4 with and without resistance-conferring introgression from B37HTN1 (score was determined according to the scheme of Table 3).
  • yield data for RP3 containing different-duration resistance-inducing introgression fragments from B37HTN1 and Pepitilla, respectively, and a comparative Elite line were determined.
  • the lines RP3, RP3HTNA and RP3HTNK were measured with a tester (Flintmais, interpool
  • the frequency of infestation was used for the classification of the investigated plants, with AUDPC of 0-100 resistant, 101-450 heterozygotes, and> 450 susceptible.
  • HT 1-resistance locus on chromosome 8 (bin 8.06) in many genotypes by means of new and / or optimized molecular marker examined and fine-mapped.
  • Molecular markers used for this purpose were developed on the basis of single nucleotide polymorphisms (SNP) or already publicly available simple sequence repeat markers (SSRs):
  • the DNA from the genotypes for the application of the marker was isolated either by the method NucleoSpin 96 Plant II according to the manufacturer (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Germany) or by the method Klear Gene DNA Extraction 384 (LGC Genomics GmbH, Germany).
  • the SSR marker primer sequences were already available from the National Database for Biotechnology Information (NCBI) public database
  • the PCR reaction mix of bnlg1782, umc1960, bnlg240, umc1121 and bnlg1067 comprised 10 ⁇ and consisted of a single concentration of 4x buffer B (sol
  • the PGR reaction was performed with an initial denaturation time of 900 seconds at 94 ° C, an amplification cycle of 25-40 cycles with 15 seconds 94 ° C, 30 seconds 50-55 ° C and 120 seconds at 72 ° C, and a final step for 300
  • the SNP markers were either (a) from publicly available resources, (b) from comparative amplicon sequencing, or (c) from a sequence comparison of BAC sequences from RP4HTN1 (see section Molecular analysis) and B73 reference genome AGPv02 ( www.maizesequence.org) developed and used.
  • (a) SNPs were converted from the publicly available SNP resource of the corn community 50K lllumina chip (Ganal et al., 2011) into KASP markers (LGC Genomics GmbH, Germany). For this purpose, new primers were developed that ensured the amplification of the crucial alleles in the KASP marker assay (see Table 4). The entire workflow was performed with Kraken TM software (LGC Genomics GmbH, Germany).
  • a KASP marker assay 5-20 ng of DNA, 0.02 ⁇ of an oligo-assay mix (12 ⁇ primer allele 1 (forward), 12 ⁇ primer allele 2 (forward), 30 ⁇ reverse primer) and 1 , 5 ⁇ of an IxKASPar Reagent Kit for 1536 plates.
  • a standard PCR setup consisted of 94 ° C for 15 min, 10 cycles of 94 ° C for 20 seconds, 61-55 ° C touch down for 1 minute, 26 cycles of 94 ° C for 20 seconds and 55 ° C for 1 minute.
  • the evaluation of the alleles per genotype was carried out using the Kraken TM software (LGC Genomics GmbH, Germany).
  • the HT 1 resistance locus from the donors B37HTN1 was crossed in elite lines as described under Example 1.A) and localized on chromosome 8 (bin 8.06) using the SSR and SNP markers from Example 2 (see FIG. 1). NILs of the crosses RP1 x RP1 HTN1 and RP3 x RP3HTN1 were analyzed at two sites over several years with two replications under natural infection conditions
  • the NILs showed on average an improved resistance response by 4 score points compared to the original line.
  • a QTL mapping was performed using 528 F2 individuals (hybridization RP1 x RP1 HTN1) using the 8 markers (from Figure 1 QTL mapping marker Tables 4 and 6 listed) performed.
  • the QTL region comprising the HTN1 resistance locus was located on chromosome 8 between markers MA0002 and umc1287 in a range of 23.1 cM.
  • the donor B37HTN1 was crossed with KWS.elite, an elite maize line from KWS SAAT AG (Germany) and backcrossed with KWS.elite for five generations.
  • KWS.elite an elite maize line from KWS SAAT AG (Germany)
  • KWS.elite an elite maize line from KWS SAAT AG (Germany)
  • KWS.elite an elite maize line from KWS SAAT AG (Germany)
  • molecular markers were used to select plants that were heterozygous for the target HTN region.
  • a selected plant of the fifth backcross generation was selfed and molecular markers were used to identify homozygous plants for the HTN target region.
  • B37HTN1 KWS.elite and KWS.elite were used.
  • B37HTN1 as described in Example 1. The phenotypic data of HT resistance and the flowering time recorded. The genotypes with HTN1 antgression showed the expected HT resistance with credit score of 1 to 3, while the starting line KWS.elite credit score of 5-7 received. Unexpectedly, the KWS.elite dismissed. B37HTN1 also compared to
  • KWS.elite delayed by at least 2 days on both the female and the male flower represent a linkage drag-based negative agronomic trait for maize, which has not yet been described in this form after introgression of HT resistance from B37HTN1.
  • Marker analyzes allowed the localization of the linkage drag, which is responsible for the delayed flowering time, to be located in an area between two marker regions on the B37HTN1 introgression, between M1 and M2. For this, the genotypes B37HTN1, KWS.elite and KWS.elite were used.
  • B37HTN1 for example, with the KASP markers SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 and PZE-108077560 analyzed (see Figure 3 and Table 4).
  • SYN14136 and PZE-108076510 were used for the specific detection of marker region M1, SYN24931 and PZE-108077560 for the specific detection of region M2.
  • the marker region M1 is 5 'from the locus of the Linkage Drags and the marker region M2 3' to.
  • the donor B37HTN1 was crossed with RP3 and backcrossed with RP3 for three generations. Molecular markers were used in each backcross generation. First, plants that were heterozygous for the HTN1 target region were selected and then these plants were probed with markers evenly distributed throughout the genome to select against the donor genome. Subsequently, a selected plant of the third backcross generation was self-sacrificed and molecular markers were used to identify homozygous plants for the HTN1 target region.
  • the donor B37HTN1 was also crossed with the recurrent parent RP3 and RP4 and a line RP3HTNA and RP4HTNA through several steps of the
  • the phenotyping of RP3 and RP3HTNA also included the detection of grain and silage yield. While the grain yield in the genotypes was not significantly different, the characteristic of silage yield in RP3HTNA showed a definite statistically demonstrable reduction of at least 14 quintals per hectare (dt / ha) over RP3, or a reduction of more than 5%.
  • a line RP1 HTN1 could be selected from the junction of B37HTN1 and the recurrent parent RP1, which did not show any bleeding-time delaying linkage drag, but also a silage yield reduction, such as she was observed for RP3HTNA showed.
  • RP1 further developed HTN1 and created a F2 population with 724 individuals from the RP1 x RP1 HTN1 junction. Subsequently, the F3 generation was selfed and selected F4 plants were genotyped and phenotyped. Genotyping was performed using markers of Table 6 in the detected QTL range of 23.1 cM. Phenotyping was performed at two sites in two replicates (see Example 1). Recombinant plants for the QTL region were selected and correlated with the phenotypic data. The selection included plants that
  • PZE-108093423 should have the allele of the recurrent parent RP3 and PZE-108093748 the allele of the donor B37HTN1.
  • PZE-108107671 carries the allele of the donor B37HTN1 and SYN4196 the allele of the recurrent parent RP3.
  • the RP3HTNA (hereinafter referred to as A version) introgression corresponds to the donor B37HTN1 between the marker regions M3 and M6, but outside this region to the recurrent parent, or to another line that does not carry the alleles in the region between M1 and M2 of the donor B37HTN1.
  • This A version has been introduced into various other genetic backgrounds and again subjected to yield tests, resistance phenotyping and flowering time determination. The results were comparable to those described for RP3HTNA. Thus, the flowering time was not shifted compared to the corresponding line without introgression and the line showed improved resistance to Helminthosporium turcicum, compared to the baseline, but still the reduction in silage yield.
  • the line RP3HTNA As donor the line RP3HTNA was used. This was crossed with RP3 and self-sacrificed over six generations. In each self-generating gene, molecular markers were used in the target area to shrink the donor fragment. Since all regions of the genome outside the target region had already been selected in the RP3HTNA to RP3 genome line, markers only examined the area around the HTN target region. Homozygous plants were identified for a reduced HTN target region. At the same time, intensive marker development took place in the target area.
  • a line RP3HTNK was identified that describes the B37HTN1 donor fragment from a marker region M4 flanked by the markers MA0004 and MA0005, where MA0004 describes the allele of the recurrent parent RP3 and MA0005 the allele of the donor B37HTN1 in RP3HTNK, to a marker region M5 flanked by the markers MA0006 and PZE-108097482, where MA0006 describes the allele of the donor B37HTN1 and PZE-108097482 the allele of the recurrent parent RP3.
  • RP3HTNK's introgression (hereafter referred to as ⁇ - ⁇ ersiön) in RP3HTNK results in improved HTN1 resistance by 3 to 4 bonus notes compared to RP3, the same flowering time as its baseline RP3 (no delay in flowering), and no significant yield reduction of silage -Ertrags (see Figure 2) more.
  • ⁇ - ⁇ ersiön the same flowering time as its baseline RP3 (no delay in flowering), and no significant yield reduction of silage -Ertrags (see Figure 2) more.
  • the K version has a haplotype from B37HTN1 and Pepitilla, respectively, which carries the donor alleles described in Table 4 at the physical positions relative to B73 AGPv02 in bp.
  • the haplotype description is here for marker MA0008
  • B37HTN1, RP3, RP3HTNA, RP3HTNK determine the allele "T” for B37HTN1, RP3HTNA, RP3HTNK and the allele "C” for RP3.
  • This marker also differentiates for this locus the putative HTN1 resistance source PH99N (WO 201 1/163590), which also contains an allele "C” at this position, of which one is used herein
  • the introgression-inserted and truncated chromosome fragment was molecularly examined.
  • the resistance locus Htm from the accession Pepitilla was thus reduced to a distinct target region, a chromosomal interval of 700 kb, and sequenced in the genotype RP4HTN1.
  • BAC clones were isolated from RP4HTN1, sequenced and assembled into a sequence scaffold.
  • the sequence scaffold was annotated and the annotated genes from this interval were compared with EST / cDNA sequence information. From a variety of annotated genes, the expression genes were then identified by differential expression studies (see Table 1).
  • a BAC bank was created from the genotype RP4HTN1.
  • the creation of the BAC bench and the 3D matrix pools of leaf material as well as the sifting of the SD matrix pools were performed:
  • the primers for the screening of the 3D matrix pools were based on the B73 AGPv01 sequence from 149957158 bp to 152977351 bp on chromosome 8
  • BAC clones 144N24, 119F13, 219G11, 86N21, 16B06, 84L18, 128D02, 25M23, 19J24, 96H10, 136A01, 75H06, 137F07 were sequenced using the 454 technique (Margulies et al., 2005). Automated assembly of the BAC clones' raw sequences was performed using the software "Newbler" (454 runAssembly Software, Software Release 2.3) The sequence contigs per BAC thus generated were correctly arranged in manual analysis using the following techniques:
  • Sequences of overlapping BACs could be roughly classified into overlapping and non-overlapping regions.
  • sequence contigs were annotated manually. Initially, only repetitive elements (transposons and retrotransposons, or "TEs") were annotated. Since sequence gaps occur mainly in TEs, the TE annotation can help to arrange sequence contigs correctly. That is, if one end of a TE is on a sequence contig and the other end is on another, the two contigs can be arranged accordingly. In such cases, a sequence of 100 Ns was inserted to fill the gap between the sequence contigs. Also, the information of TEs that are interleaved (i.e., TEs that had been inserted into other TEs) was used to arrange sequence contigs.
  • TEs that are interleaved
  • LTR long terminal repeat
  • CDS coding sequences
  • RNA from the second leaf was extracted from the tested maize plants, reverse transcribed into cDNA, and expression measured by qPCR. Each second leaf was harvested, frozen, and the RNA extracted with the SV Total RNA Isolation System Kit (Z3100;
  • RNA was reverse transcribed with the iScript RT Supermix (170-8841, Bio-Rad, Cressier, Switzerland) in a reaction volume of 20 ⁇ according to the manufacturer's instructions.
  • RT minus In order to exclude possible contamination by genomic DNA (RT minus), a reaction was simultaneously incubated from each sample without the addition of the reverse transcriptase.
  • RT-qPCR Quantitative Real Time PCR
  • Table 9 Primer pairs for the candidate genes with their amplicon length in bp and the appropriate annealing temperature.
  • Tiliing population Suturing and detection of mutants For the candidate genes (Table 1), a Tiliing population of 10000 plants can be seen that express the introgression Pepitilla bears on chromosome 8 in the range of 151688552 - 153139596 bp compared to the B73 reference AGPv02 (www.maizesequence.org) (RP3HTN1) and has a resistance to Helminthosporium turcicum.
  • the mutations can be either silent nucleotide changes, amino acid substitutions or stop codons, and serve to demonstrate the function of the candidate gene.
  • Race 1 is predominant in Europe, although it has already been possible to detect races 2 or 3 or a combination of these in individual regions (Hanekamp et al., 2013).
  • New recombinant plants were selected for the QTL region and included with the
  • FIG. 4 shows that this region only comprises the three genes RLK4, EXT1 and RLK1.
  • the identified mutants were selfed in the greenhouse and seed of the homozygous plants with wild-type allele and mutation allele per mutation event were harvested for a phenotypic assay.
  • Table 12 AUDPG values of homozygous plants with wild-type allele and mutation allele of genes RLK1 and RLK4.
  • phenotype means 0 - 100 resistant, 101 - 450 heterozygotes, and> 450 susceptible.
  • TAL nucleases hybrid proteins composed of TAL effectors and Fokl DNA-cleavage domain. Nucleic acids research, 39 (1), 359-372.

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Abstract

Durch die vorliegende Erfindung wird eine verbesserte Helminthosporium turcicum-resistente Pflanze, insbesondere eine Maispflanze, welche ein Polynukleotid mit einem oder mehreren Resistenz-vermittelnden Genen beispielsweise auf einem trunkierten Chromosomfragment aus der Akzession Pepitilla umfasst, sowie eine Zelle, ein Gewebe, ein Teil, Körn und Samen davon, ein isoliertes Polynukleotid, das ein oder mehrere Resistenz-vermittelnden Genen gegen Helminthosporium turcicum umfasst, einen Vektor, eine transgene Pflanzenzelle und eine transgene Pflanze, enthaltend dieses Polynukleotid. Ferner sind von der Erfindung auch geeignete Marker und deren Verwendung zum Einbringen der Resistenz oder des Transgens in eine Pflanze sowie die Identifikation von verbesserten Maispflanzen, die ein trunkiertes Chromosomfragment aufweisen, miterfasst.

Description

HELMINTHOSPORIUM TURCICUM-RESISTENTE PFLANZE
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Modifikation von Pflanzen mittels molekularbiologischer Methoden und Markertechnologie und der Gentechnik. Sie betrifft eine neue Helminthosporium ft/rc/cum-resistente Pflanze, insbesondere eine Maispflanze, welche ein Polynukleotid mit einem oder mehreren Resistenz-vermittelnden Genen auf einem modifizierten Chromosomfragment aus der Akzession Pepitilla umfasst, sowie eine Zelle, ein Gewebe, ein Teil, Korn und Samen davon, ein isoliertes Polynukleotid, das ein oder mehrere Resistenz-vermittelnden Gene gegen Helminthosporium turcicum umfasst, einen Vektor, eine transgene Pflanzenzelle und eine transgene Pflanze, enthaltend dieses Polynukleotid. Ferner sind von der Erfindung auch geeignete molekulare Marker und deren Verwendung zum Einbringen des Resistenzlocus oder des Transgens in eine Pflanze sowie die Identifikation von verbesserten Maispflanzen, die ein modifiziertes Chromosomfragment aufweisen, miterfasst.
Hintergrund der Erfindung
In Mais (Zea mays L.) findet man eine große Zahl von pilzlichen Pathogenen die
Blatterkrankungen hervorrufen. Der Pilz, der unter tropischen aber auch den gemäßigten Klimabedingungen, wie sie in großen Teilen Europas und Nordamerikas, aber auch Afrika und Indien vorherrschen, den mit Abstand größten Schaden verursachen kann, ist unter Helminthosporium turcicum oder syn. auch Exserohilum turcicum (Pass.) Leonard et Suggs (Teleomorphe: Setosphaeria turcica (Luttrell) Leonard & Suggs) bekannt. H. turcicum ist der Verursacher der Blattfleckenkrankheit 'Northern Com Leaf Blight' (NCLB), die in feuchten Jahren als Epidemie gegenüber anfälligen Maissorten hoch schädigend auftreten kann und dann beträchtlichen Ertragseinbußen von 30% und mehr über große Flächen zur Folge hat (Perkins & Pedersen, 1987; Raymundo & Hooker, 1981 a; Ullstrup & Miles, 1957). Seit den 1970er Jahren wurde daher in genetischem Material nach natürlichen Resistenzen gesucht. Heute sind quantitative und qualitative Resistenzen bekannt. Während die oligo- oder polygenisch vererbte quantitative Resistenz unvollständig und rassenunspezifisch im
Phänotyp erscheint und durch zusätzliche und partiell-dominante Gene beeinflusst wird, ist die qualitative Resistenz typischerweise rassenspezifisch und kann durch einzelne zumeist dominante Gene wie Ht1, Ht2, Ht3, Html oder Htn1 vererbt werden (Lipps et at. , 1997;
BESTÄTIGUNGSKOPIE Welz & Geiger, 2000). Durch Rückkreuzungen gelang in zahlreichen häufig verwendeten Inzucht-Maislinien wie W22, A619, B37 oder B73 die Introgression der Ht-Gene, wo sie eine partielle Dominanz und eine Expression in Abhängigkeit vom jeweiligen genetischen Hintergrund zeigten (Welz, 1998).
Trotz dieser komplexen genetischen Architektur der NCLB-Resistenz im Mais war bislang vornehmlich die Verwendung des Gens Ht1 in Mais zusammen mit einer partiellen quantitativen Resistenz ausreichend, um die Helminthosporiosis zu kontrollieren (Welz, 1998). Der Grund hierfür ist, dass die Rasse 0 von H. turcicum weltweit mit ca. 55% mit Abstand vorherrschend ist (Lipps et al., 1997; Ferguson & Carson, 2007), während andere Rassen wie 2N und 23N dagegen nur sehr selten und häufig geographisch begrenzt auftreten (Moghaddam & Pataky, 1994; Jordan et at., 1983; Lipps & Hite, 1982; Thakur et al., 1989; Welz, 1998). Diese Rasse 0 ist gegenüber einer Maispflanze mit Ht1 avirulent, sodass diese versehen mit einer geeigneten quantitative Resistenz insgesamt eine ausreichende NCLB-Resistenz aufzeigt. Zahlreiche Studien berichten jedoch von einer zunehmenden Verbreitung der weniger häufigen Rassen (Jordan et al., 1983; Welz, 1998; Pratt & Gordon, 2006). Gründe hierfür liegen in der Populationsdynamik eines Pathogens, welche durch neue Mutationen auf Avirulenzgenen und neue Kombinationen vorhandener Virulenzgene Veränderungen in der Pathogenvirulenz erlaubt. Dies kann letztendlich zum Auftauchen neuer, angepasster, teils aggressiverer pathogener Rassen führen. In Brasilien beispielsweise scheint die H. furc/cum-Population schon deutlich diverser im Hinblick auf die Rassenzusammensetzung zu sein als zum Beispiel in Nordamerika. Gianasi et al.
(1996) berichtet von H. turcicum Rassen, die bereits die Resistenz, welche durch das Ht1- Gen vermittelt wird, durchbrochen haben. Hinzu kommt dabei auch die Instabilität der Resistenzgene gegenüber bestimmten Umweltfaktoren wie Temperatur und Lichtintensität in einigen Klimazonen (Thakur er al. , 1989). Diese Entwicklung hat zur Folge, dass global gesehen die Verwendung der bisher weniger beachteten oder neuer Ηί-Resistenzgehe zur Herstellung kommerzieller Maispflanzen zunehmend an Bedeutung gewinnt, um das Ziel einer breiten und dauerhaften Resistenz gegenüber H. turcicum in Mais herbeizuführen. Erste Ansätze hierzu wurden bereits von Pataky ei al. im Jahr 1998 vorgestellt. Durch Verwendung einer Kombination von Ht1 und Htn1 konnte die NCLB-Resistenz in sh2- Elitekörnermais verbessert werden.
Ein Ursprung der monogenischen /- fni-Resistenz ist die Mexikanische Landrasse 'Pepitilla' (Gevers, 1975). Die /-//n -lntrogressionslinien zeigen eine Kartierung des Gens auf dem langen Arm des Chromosoms 8 ungefähr 10 cM distal von Ht2 und 0,8 cM distal vom RFLP Marker umd 17 (bin 8.06) (Simcox & Bennetzen, 1993). Anders als die übrigen Ht- Resistenzgene vermittelt Htn1 eine Resistenz durch eine Verzögerung des Einsetzens der Sporulation und wirkt somit der Entwicklung von Läsionen entgegen. Im Ergebnis führt dies zu weniger und kleineren Läsionen sowie reduzierten Sporulationszonen (Raymundo et ai , 1981 b, Simcox & Bennetzen, 1993). Chlorotisch-nekrotische Läsionen, wie sie bei Ht1, Ht2 oder /-/f3-vermittelter Resistenz auftreten, werden nicht ausgebildet (Gevers, 1975). Jedoch ist die Resistenzreaktion im heterozygoten Zustand des Htn1 -Gens deutlich ineffektiver als im homozygoten Zustand (Raymundo ei a/., 1981 b).
Eine verbesserte züchterische Handhabbarkeit des Htn1 -Gens setzt die Entwicklung von zusätzlichen spezifischen Markern voraus, um die Genotyp-Bestimmung weiter zu vereinfachen. Durch die MAS (marker assisted-selection) Technologie wird dann ein 'Stacking' oder 'Pyramiding' von mehreren Resistenzgenen effizient möglich (Min er a/. , 2012). In vielen Studien zur Kartierung des Resistenzlocus und zur Identifikation der Resistenzquelle wurden die Introgressionslinien B37Htn1 oder \N22Htn1 herangezogen (Raymundo et al. , 1981 a, b; Simsox & Bennetzen, 1993, Bar-Zur et at., 1998; Coates & White, 1998). Angaben zu Markern, die zur Selektion des Resistenzlocus für Htn1 aus der Akzession Pepitilla verwendet werden könnten, sind dabei jedoch nur begrenzt vorhanden (Simsox & Bennetzen, 1993). Die bekannten Marker für Htn1 funktional und flankierend zum Resistenzlocus aus der Akzession Pepitilla kartieren immer noch annähernd 22,2 cM auseinander, was im besten Fall das Selektieren eines großen Chromsosomfragments gestattet. Dabei besteht jedoch oft das Risiko, dass innerhalb dieses Fragments zwischen den Markern eine doppelte genetische Rekombination stattfindet, was eine falsch-positive Selektion für den Htn 7-Resistenzlocus zur Folge haben könnte. Zudem steigt in einigen Fällen mit der Größe des introgressierten Chromosomenfragments auch die
Wahrscheinlichkeit unerwünschte genetische Bereiche in eine Introgressionslinie zu übernehmen und über Generationen von Elitelinien mitzuführen. Solche genetischen Bereiche, insbesondere wenn sie eng gekoppelt sind mit dem Hf/i -Locus, und zu deutlichnegativen Auswirkungen auf ein oder mehrere agronomische Merkmale führen, werden als Linkage Drag bezeichnet. Aus bekannten Studien, die Introgressionslinien mit Htn 1 aus Pepitilla untersuchten und nutzten, sind jedoch solche negativen Effekte nicht bekannt. Auch die sehr umfangreichen Forschungsarbeiten von Welz (1998), die unter anderen auch an B37Htn1 durchgeführt wurden, postulieren, dass im Hinblick auf beispielsweise Ertrag und Reife durch die Introgression des Htn1-Locus keine signifikanten Nachteile auszumachen sind. So finden sich im Stand der Technik auch keine ernsthaften Bestrebungen das große Chromsosomfragment gezielt weiter zu verkürzen.
Dagegen offenbart WO 201 1/163590 den Genotyp PH99N als alternative Quelle für eine NCLB-Resistenz auf Chromosom 8 bin 5, welche jedoch nicht der Akzession Pepitilla entspricht. Für erzeugte Rückkreuzungspopulation aus PH99N wurden im Wesentlichen nur Resistenzen gegenüber den H. turcicum-Rassen 0 und 1 identifiziert. Auch der Resistenz- Phänotyp wurde nicht eindeutig bestimmt. Dennoch schlussfolgern die Autoren, dass die Resistenz auf das Htn1-Gen zurückzuführen sei. Es gelang zwar für PH99N den
Resistenzlocus auf ein Chromosomfragment von nur noch ~224 kb Länge zu beschränken, eine resistente Maispflanze mit dem 224 kb-Fragment und somit dem vermeintlichen Htn1 , wurde jedoch nicht offenbart. Zudem ist der Genotyp PH99N der Öffentlichkeit durch
Hinterlegung auch nicht zugänglich gemacht.
Ein alternativer Ansatz zur Nutzbarmachung des Htn1-Gens ist die Identifizierung und Klonierung des Resistenzgens und deren Verwendung in einem transgenen Ansatz.
Mit der Absicht der Identifikation der Resistenzgene für NCLB veröffentlichten Chung et al. 2010 eine Studie zur Feinkartierung des Resistenzlocus bin 8.06. Das untersuchte
Chromosomfragment stammt jedoch nicht aus Pepitilla, sondern aus der Maishybride DK888, welche eine multiple Krankheitsresistenz aufweist. Untersuchungen zur
He/m/f/70spor/i7m-Rassenspezifität legten zunächst nahe, dass der Resistenzlocus auf DK888, bezeichnet als qNLB8.06DK888, eng verknüpft oder funktionell verbunden ist mit dem Ht2- und dem Htn1-Gen, da Helminthosporium-Stämme 23 und 23N virulent waren (Chung et al., 2008). Ein endgültiger Nachweis für das Vorhandensein von Htn1 wurde in Mangel eines reinen N-Isolates von H. turcicum jedoch nicht durchgeführt. Zudem entsprach der Resistenz-Phänotyp mit qNLB8.06DK888 auch nicht dem zu erwartenden Phänotyp im
Hinblick auf Entstehung von chlorotischen Läsionen und der Verzögerung der
Läsionsbildung. Weiterführende Komplementationsstudien in Chung et at. (2010) ergaben letztendlich Hinweise, dass qNLB8.06DK888 entweder identisch, allelisch, eng verknüpft oder funktionell verbunden ist mit Ht2, aber nicht mit Htn1. Der Resistenzlocus qNLB8.06DK8S8 konnte einem Chromosomfragment von 0,46 Mb zugeordneten werden Genomische Annotationen von diesem Chromosomfragment wiesen auf 12 putative offene Leserahmen hin, von denen drei jeweils ein Tandem-Proteinkinase-ähnliches Gen (GRMZM2G135202; GRMZM2G164612) oder ein Proteinphosphatase-ähnliches Gen (GRMZM2G1 19720) darstellen könnten und jedes gleichermaßen als vielversprechendes Kandidatengen für das Resistenzgen Ht2 favorisiert werden (Chung et al. , 2010). Ein funktioneller Nachweis wird nicht beschrieben.
Ferner annotiert auch WO 201 1/163590 A1 das vermeintliche Htn1-Gen in der
Resistenzquelle PH99N als ein Tandem-Proteinkinase-ähnliches Gen (GRMZM2G451 147) und offenbart deren genetische Sequenz, weist aber deren Funktionalität zum Beispiel in einer transgenen Maispflanze auch nicht nach.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wurde vor dem Hintergrund des vorstehend beschriebenen Stands der Technik gemacht, wobei es Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, eine
Maispflanze bereitzustellen, die eine Resistenz gegenüber dem Pathogen
Helminthosporium turcicum aus dem Donor Pepitilla aufweist und hinsichtlich
agronomischer Merkmale den bekannten Maispflanzen mit Resistenz aus dem Donor Pepitilla überlegen ist.
Die Aufgabe ist zum einen durch eine Maispflanze gelöst, in deren Genom ein
Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla integriert ist, wobei das Chromosomfragment ein Intervall des Donors (nachfolgend erstes Intervall oder Intervall 1 genannt) umfasst, welches Donor-Allele gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 aufzeigt und ein Polynukleotid aufweist, das in der Maispflanze Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum
vermittelt, und wobei das Chromosomfragment ein weiteres Intervall des Donors
(nachfolgend zweites Intervall oder Intervall 2 genannt) zwischen einem Marker in einer ersten Markerreg ion (M1 ), welche durch die Marker SYN14136 und PZE- 108076510 flankiert ist, und einem Marker in einer zweiten Markerregion (M2), welche durch die Marker SYN24931 und PZE-108077560 flankiert ist, nicht enthält. Diese und weiter unten beschriebene alternative Lösungen der Aufgabe können auf einem Züchtungsprogramm zur Integration des Htn1-Locus aus Pepitilla in Maislinien beruhen. Wahlweise sind jedoch auch gentechnische Ansätze anwendbar, über welche Pflanzen der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können. Beispielhaft werden gentechnische Ansätze weiter Unten näher ausgeführt. Zur Erzeugung der Pflanzen der vorliegenden Erfindung kann auf diverse Genotypen aus dem Stand der Technik zurückgreifen kann. Insbesondere B37HTN1 , das den Resistenzlocus der Ländrasse .Pepitilla' aufweist, wurde als Ausgangslinie verwendet. Neben Pepitilla selbst und B37HTN1 (auch aus dem Stand der Technik bekannt als
B37HtN) kann man zur Integration des H77V7-Locus zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Maispflanze nahezu jeden bekannten Maisgenotypen heranziehen, in dessen Genom, insbesondere auf Chromosom 8 bin 5 oder 6, eine Introgression des HTT -Resistenzlocus aus Pepitilla inseriert wurde. Aus dem Stand der Technik sind hier zahlreiche Genotyp-Beispiele bekannt, zum Beispiel: W22Htn (z.B. Bar-Zur et al.,1998); H6314/-/f/7 (Z. B. Bar-Zur et al., 1998), B73HtN (z.B. Shimoni et al., Journal of Phytopathology 131 :4 (1991 ), 315-321 ), B68HtN und A632Hf/V (z.B. Carson, Plant Disease 79 (1995), 717- 720) und A619W/V (z.B. Stankovic et al, Genetika 39:2 (2007), 227 -240). In einer erfindungsgemäßen Maispflanze stammt das Chromosomfragment aus dem Donor
Pepitilla, in einer bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze stammt das Chromosomfragment aus dem Donor B37HTN1 oder einem anderen oben genannten Maisgenotyp. B37HTN1 kann beispielsweise über das Maize Genetics COOP Stock Center mit der Stock ID 65749 bestellt werden.
Das in das Genom der erfindungsgemäßen Maispflanze integrierte Chromosomfragment stammt aus dem Donor Pepitilla, welcher bekanntermaßen den Resistenzlocus HTN1 aufweist. Die Introgression dieses Resistenzlocus ist auf dem langen Arm des Chromosoms 8, bin 8.05 - 8.06 lokalisiert. Das integrierte Chromosomfragment umfasst das erste
Intervall des Donors, welches ein Polynukleotid aufweist, das in der erfindungsgemäßen Maispflanze Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum vermittelt. Dabei umfasst das Polynukleotid ein oder mehrere Resistenz-vermittelnde Gene des HTN1 -Locus aus Pepitilla (Tabelle 1 ) oder Genallele davon. Gen oder Genallel können unter Befallsbedingungen mit H. turcicum einen Resistenzphänotyp mit den HTN1 -typischen Merkmalen bewirken.
Vorzugsweise umfasst das Polynukleotid ein oder mehrere Resistenz-vermittelnde Gene des HTN1 -Locus bevorzugt aus Pepitilla ausgewählt aus RLK1 und EXT1 (siehe Tabelle 1 ) oder Genallele davon, welche unter Befallsbedingungen mit H. turcicum einen
Resistenzphänotyp mit den HTN1 -typischen Merkmalen bewirken. Besonders bevorzugt umfasst das Polynukleotid eine Nukleotidsequenz, welche eine Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 6 oder ein Homolog eines Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 6 kodiert, welche unter Befallsbedingungen mit H. turcicum einen
Resistenzphänotyp mit den HTN1 -typischen Merkmalen bewirken. Zu diesen HTN1- typischen Merkmalen gehören beispielsweise verzögertes Einsetzen der Sporulation, verminderte Entwicklung von Läsionen, Entwicklung von kleineren Läsionen, reduzierte Sporulationszonen und/oder keine oder nur vereinzelte chlorotisch-nekrotische Läsionen. Strukturell ist das Polynukleotid dadurch gekennzeichnet, dass es ein Nukleinsäuremolekül umfasst, (a) das eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13 oder 15 aufweist, (b) das eine Nukleotidsequenz mit einer Identität von mindestens 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% zu einer der Nukleotidsequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13 oder 15 vorzugsweise über die gesamte
Sequenzlänge, aufweist, (c) das mit dem komplementären Strang eines
Nukleinsäuremoleküls nach (a) oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, (d) das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 oder 16 kodiert, (e) das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch ist mit einer der Aminosäuresequenzen nach (d), kodiert oder (f) das eine Teilsequenz einer
Nukleinsäure nach (a) bis (e) aufweist. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das
Polynukleotid dadurch gekennzeichnet, dass es ein Nukleinsäuremolekül umfasst, (aa) das eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder 5 aufweist, (bb) das eine
Nukleotidsequenz mit einer Identität von mindestens 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% zu einer der Nukleotidsequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 oder 5 vorzugsweise über die gesamte Sequenzlänge, aufweist, (cc) das mit dem komplementären Strang eines Nukleinsäuremoleküls nach (aa) oder (bb) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, (dd) das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder 6 kodiert, (ee) das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch ist mit einer der Aminosäuresequenzen nach (dd), kodiert oder (ff) das eine
Teilsequenz einer Nukleinsäure nach (aa) bis (ee) aufweist. Eine Teilsequenz eines
Nukleinsäuremoleküls im Sinne der vorliegenden Erfindung kann mindestens 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 oder mindestens 100 aufeinander folgende Nukleotide, weiter
mindestens 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 oder 1000
aufeinander folgende Nukleotide umfassen. Das Polynukleotid kann im heterozygoten oder homozygoten Zustand im Genom der erfindungsgemäßen Maispflanze vorliegen;
vorzugsweise liegt das Polynukleotid im homozygoten Zustand vor.
Tabelle 1 : Potentielle Resistenz-vermittelnde Gene des HTN1 -Locus aus Pepitilla; Genname (Spalte 1); Verweis auf korrespondierende SEQ ID NOs der genomischen Exon-Sequenz (Spalte 2); Verweis auf korrespondierende SEQ ID NOs der vorhergesagten Aminosäure- /Proteinsequenz (Spalte 3); annotiertes homologes Gen aus dem B73-Referenzgenom (Spalte 4).
cDNA Proteinsequenz
Genname Homologes B73 Gen
SEQ ID NO: SEQ ID NO: RLK1 1 2 GRMZM2G451147
RLK4 3 4 GRMZM2G 144028
EXT1 5 6 GRMZM2G445338
DUF1 7 8 AC209075.3_FG007
ZNF1 9 10 GRMZM2G175661
CYT1 1 1 12 GRMZM2G092018
RET1 13 14 GRMZM2G091973
HYD 15 16 GRMZM2G144021
Weiterhin ist das erste Intervall im Chromosomfragment, welches Donor-Allele gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 aufzeigt, durch die Abfolge von Donor-Allelen gemäß dem
Haplotyp nach Tabelle 2 charakterisiert, aber nicht auf diese Abfolge von Donor-Allelen gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 beschränkt. Dies bedeutet, dass das erste Intervall mindestens das Donor-Allel, welches das Resistenz-vermittelnde Gen aus Tabelle 1 beschreibt, optional mit Donor-Allel des Markers MA0008, zeigt. Weiterhin zeigt das erste Intervall bevorzugt mindestens die Donor-Allele gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 von MA0021 bis MA0022 (d.h. MA0021 , MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA001 1 , MA0012, MA0022) oder von MA0005 bis MA0022 (d.h. MA0005, MA0021 , MA0007, MA0008, MA0009, MA00 0, MA001 1 , MA0012 und MA0022) oder von MA0005 bis
MA0013 (d.h. MA0005, MA0021 , MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA001 1 , MA0012, MA0022 und MA0013) oder von MA0005 bis MA0014 (d.h. MA0005, MA0021 , MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA0011 , MA0012, MA0022, MA0013 und MA0014) oder von MA0005 bis MA0015 (d.h. MA0005, MA0021 , MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA001 1 , MA0012, MA0022, MA00 3, MA0014 und MA0015) oder von MA0005 bis
MA0016 (d.h. MA0005, MA0021 , MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA001 1 , MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015 und MA0016), besonders bevorzugt von MA0005 bis MA0017 (d.h. MA0005, MA0021 , MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA001 1 , MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016 und MA0017), MA0005 bis MA0018 (d.h. MA0005, MA0021 , MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA001 1 , MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017 und MA0018), MA0005 bis PZE-108095998 (d.h. MA0005, MA0021 , MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA001 , MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018 und PZE-108095998), MA0005 bis PZE-108096011 (d.h. MA0005, MA0021 , MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA001 1 , MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, A0017, MA0018, PZE-108095998 und PZE-10809601 1) oder MA0005 bis MA0019 (d.h. MA0005, MA0021 , MA0.007, MA0008, MA0009, MA0010, MA001 1 , MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE-10809601 1 und MA0019), ganz besonders bevorzugt von MA0005 bis PZE-108096610 (d.h. MA0005, MA0021 , MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA001 1 , MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE-10809601 1 , MA0019 und PZE-108096610), MA0005 bis MA0020 (d.h. MA0005, MA0021 , MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA001 1 , MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE-10809601 1 , MA0019, PZE-108096610 und MA0020), MA0005 bis PZE- 08096791 (d.h. MA0005, MA0021 , MA0007, MA0008, MA0009, MA0010, MA001 1 , MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA00 6, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE-10809601 1 , MA0019, PZE-108096610, MA0020 und PZE-108096791 ) oder MA0005 bis MA0006 (d.h. MA0005, MA0021 , MA0007,
MA0008, MA0009, MA0010, MA001 1 , MA0012, MA0022, MA0013, MA0014, MA0015, MA0016, MA0017, MA0018, PZE-108095998, PZE-10809601 1 , MA0019, PZE-108096610, MA0020, PZE-108096791 und MA0006) auf. Dieser resistente Haplotyp erlaubt eine eindeutige Spezifizierung und Identifikation der Resistenzquelle Pepitilla. Insbesondere ist das erste Intervall zwischen den Markern MA0004 und PZE-108097482, zwischen den Markern MA0004 und MA0022, zwischen den Markern MA0005 und PZE-108097482 oder zwischen den Markern MA0005 und MA0022 lokalisiert. Vorzugsweise beschreibt das erste Intervall einen Abschnitt des Chromosomfragments, welcher die HTN1 -typische Resistenz vermitteln kann. Als solcher ist er Träger des oben genannten Polynukleotids.
Tabelle 2: Resistenter Haplotyp aus B37HTN1 ;
Position in bp auf Allele Donor
Marker Bezeichnung
B73 AGPv02 B37HTN1
151831049 C MA0005
151907173 G MA0021
152045106 T MA0007
152045141 T MA0008 152045402 T ΜΑ0009
152045516 c ΜΑ0010
152045912 τ ΜΑ0011
152046502 τ ΜΑ0012
152046529 Α ΜΑ0022
152133057 G ΜΑ0013
152133380 Α ΜΑ0014
152144310 Α ΜΑ0015
152250992 Α ΜΑ00 6
152301656 Α ΜΑ0017
152304127 Α ΜΑ0018
152433358 Α ΡΖΕ-108095998
152435855 Α ΡΖΕ-108096011
152630794 C ΜΑ0019
152703579 G ΡΖΕ-108096610
152753635 Α ΜΑ0020
152887338 G ΡΖΕ- 10809679
152888374 Α ΜΑ0006
Weiterhin ist jede erfindungsgemäße Maispflanze eine Ht-resistente Maispflanze. Die durch die Integration des Chromosomfragments vermittelte Ht-Resistenz kann mittels
Bestimmung von Boniturnoten in Phänotypisierungsexperimenten nach Schema gemäß Tabelle 3 und Beispiel 1. A) quantifiziert werden, wobei das Resistenzlevel von 1 nach 9 hin abnimmt. Erfindungsgemäße Ht-resistente Maispflanzen zeigen eine erhöhte Resistenz gegenüber H. turcicum von mindestens 1 Boniturnote, bevorzugt von mindestens 2 Boniturnoten oder mindestens 3 Boniturnoten und besonders bevorzugt von mindestens 4 Boniturnoten. Bevorzugt zeigt eine erfindungsgemäße Maispflanze Resistenz gegenüber mindestens einer Rasse von Helmithosporium turcicum, welche nicht der bekannten Rassenspezifität entspricht wie sie aus dem Stand der Technik bekannt ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann ist eine erfindungsgemäße Maispflanze resistent gegenüber sämtlichen bekannten Rassen von Helmithosporium turcicum, d.h. die vermittelte Resistenz ist rassenunspezifisch und kann zur Ausbildung einer breiten
Resistenz gegenüber Helmithosporium turcicum besonders vorteilhaft geeignet sein.
Tabelle 3: Boniturnoten-Schema für Phänotypisierungsexperimente in Feldversuchen an verschiedenen Standorten mit natürlicher und künstlicher H. turcicum- e mpfung (nach dem Deutschem Maiskomitee (DMK); AG Sortenwesen 27.02.02; (DMK J. Rath; RP Freiburg H.J. Imgraben)
Boniturnote Phänotyp
1 Pflanzen zeigen keine Krankheitssymptome 0%
2 Befallsbeginn, erste kleine Flecken (kleiner als 2cm) sichtbar. Weniger als 5% der Blattfläche ist betroffen.
3 Einige Flecken haben sich auf einer Blattetage entwickelt. Zwischen 5-10%
der Blattfläche ist betroffen.
4 10-20% der Blattfläche ist betroffen. Deutliche Flecken auf mehreren
Blattetagen.
5 20-40% der Blattfläche ist betroffen. Flecken fangen an zusammenzufließen.
6 40-60% der Blattfläche ist betroffen. Systematischer Befall auf den Blättern
sichtbar.
7 60-80% der Blattfläche ist betroffen. Etwa die Hälfte der Blätter ist wegen
Pilzbefalls zerstört bzw. vertrocknet
8 80-90% der Blattfläche ist betroffen. Mehr als die Hälfte der Blätter ist wegen
Pilzbefalls zerstört bzw. vertrocknet
9 90-100% der Blattfläche ist betroffen. Die Pflanzen sind nahezu vollständig
vertrocknet. Die Beschreibung offenbart die genetische bzw. molekulare Struktur des HTN -Locus durch Angabe eines Haplotyps, durch Kartierung prominenter Marker sowie durch
Identifizierung von Kandidaten-Genen für die Resistenzvermittlung gegenüber dem
Pathogen Helminthosporium turcicum.
Überraschenderweise erwies sich die erfindungsgemäße Maispflanze in Geno- und
Phänotypisierungsexperimenten in Feld und Gewächshaus als agronomisch überlegen. Denn während andere konvertierte Linien aus einem Züchtungsprogramm zur Integration des HTNI-Locus aus Pepitilla sowie aus dem Stand der Technik bekannte konvertierte Linien wie B37HTN1 neben der vermittelten Ht-Resistenz unter Nichtbefallsbedingungen mit /-/, turcicum und unter vergleichbaren Umweltbedingungen (Temperatur,
Nährstoffversorgung, Standort etc.) eine deutliche Verzögerung im Zeitpunkt der
männlichen und/oder weiblichen Blüte im Vergleich zu der entsprechenden Linie ohne Introgression (z.B. isogene Linie oder Ausgangslinie) zeigen, entspricht bei der
erfindungsgemäßen Maispflanze der Blühzeitpunkt demjenigen einer isogenen
Vergleichsmaispflanze, in deren Genom ein Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla nicht integriert ist. Blühzeitpunkte entsprechen einander, wenn sie um weniger als 2 Tage voneinander abweichen. Die Größenordnung der beobachteten Verzögerung ist dabei stark abhängig von der Maissorte bzw. dem Maisgenotypen, den vorherrschenden
Umweltfaktoren wie beispielsweise Bodenbeschaffenheit, Feuchtigkeit, Niederschlag, Temperatur etc. und/oder von biotischem Stress wie beispielsweise Pathogenbefall mit nicht H. turcicum. Die Verzögerung betrug mindestens 2 Tage, mindestens 3 Tage, mindestens 5 Tage oder mindestens 7 Tage. Dieser festgestellte Unterschied im
Blühzeitpunkt ist auf Linkage Drag als Teil der Introgression zurückzuführen, was
besonders überraschend ist, da derartige Beobachtungen aus dem Stand der Technik nicht bekannt sind. Der Blühzeitpunkt ist ein wichtiges agronomisches Merkmal. Er kann unmittelbar und wesentlich das Ertragspotential einer Maispflanze beeinflussen. Ein verspäteter Blühzeitpunkt führt dabei in der Regel zu einem verminderten Ertrag.
Zur Klärung der genetischen Ursache dieses Nachteils und zur Identifikation des Linkage Drags wurden beispielsweise ausgedehnte Rückkreuzungsprogramme, begleitet von Geno- und Phänotypisierungen, durchgeführt. Unterstützt wurden die Arbeiten von einer intensiven Entwicklung zielgenauer und spezifischer molekularer Marker auf dem HTN1- tragenden Chromosomfragment. Die Technologie zur Marker-gestützten Selektion (MAS) und die Durchführung von zielgerichteten Rückkreuzungsprogrammen (z.B. zum 'map based cloning') kann dem Stand der Technik entnommen werden (Gupta & Varshney, 2013). Der QTL mit der HTN1 -Resistenz aus den Donor B37HTN1 bzw. Pepitilla wurde mit Hilfe der SSR Marker bnlg1067, umc1 121 , MA0002, MA0003, bnlg1782, umc1287, umc1960 und bnlg240 in den Filialgenerationen auf Chromosom 8 (bin 8.06) zwischen den Markern MA0002 (Tabelle 4) und ümc1287 (Tabelle 5) in einem Bereich von 23,1 cM lokalisiert (siehe Figur 1 ). In Maispflanzen mit dem verzögerten Blühzeitpunkt gelang es die Lage des genomischen Donor-Sequenzabschnitts, der für den identifizierten Linkage Drag des Blühzeitpunktes verantwortlich ist, eindeutig auf einem weiteren, zweiten Intervall des Donors auf dem Chromosomfragment zu bestimmen (Beispiel 3B; Figur 3). In einer erfindungsgemäßen Maispflanze ist ein Chromosomfragment integriert, welches das zweite Intervall des Donors nicht enthält. Hier stammt das zweite Intervall beispielsweise von einem rekurrenten Elter, der nicht Träger des Linkage Drags des Blühzeitpunkts ist, oder von einem exogen eingebrachten homologen DNA-Fragment, welches nicht Täger des Linkage Drags ist, auf einem geeigneten Spendervektor für gezielte homologe
Rekombination. Das zweite Intervall ist proximal gelegen und eng gekoppelt zu dem
Resistenzlocus HTN1 bzw. zu dem ersten Intervall. Das zweite Intervall ist ein Intervall zwischen einem Marker in einer ersten Markerregion (M1 ), welche durch die Marker SYN14136 und PZE-108076510 flankiert ist, und einem Marker in einer zweiten
Markerregion (M2), welche durch die Marker SYN24931 und PZE-108077560 flankiert ist. Die flankierenden Marker können der Tabelle 4 entnommen werden. Die Marker
SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 und PZE-108077560 sind SNP-Marker zur Verwendung im KBioscience-KASP-System (www.lgcgenomics.com/genotyping/kasp- genotyping-reagents/kasp-overview/). Sie definieren eindeutig die Markerregionen M1 und M2, zu beiden Seiten des Sequenzabschnitts, der im Donor B37HTN1 bzw. Pepitilla den Linkage Drag des Blühzeitpunktes trägt. Als polymorphe Marker sind sie überdies auch geeignet zwischen Pepitilla-Donor-Allel und beispielsweise dem Allel des rekurrenten Elter zu unterscheiden. Alle Angaben zur Nutzung dieser Marker als KASP-Marker können der Tabelle 4 entnommen werden. Geeignete exemplarische Primer-Hybridisierungsparameter für die PCR werden in Beispiel 2 wiedergegeben. Ein Fachmann ist darüber hinaus auch in der Lage, andere geeignete Hybridisierungsparameter zu bestimmen. Ferner ist es
Routinetätigkeit eines Fachmanns in Kenntnis der beschriebenen Markerregionen neben den genannten Markern andere Marker, insbesondere polymorphe Marker, in M1 und/oder in M2 zu entwickeln. Unter Verwendung der hier aufgeführten Marker SYN14136, PZE- 108076510, SYN24931 und PZE-108077560 oder selbst entwickelter Marker in M1 und/oder M2 fällt es dem Fachmann leicht festzustellen, ob in einer Maispflanze, in deren Genom ein Chromosomfragment mit HTN1 -Resistenzlocus aus dem Donor Pepitilla integriert ist, das vorstehend beschriebene zweite Intervall des Donors enthalten ist oder nicht enthalten ist. Auch ist einem Fachmann bewusst, das beispielsweise im Laufe eines Züchtungsprozesses oder eines gentechnisch Ansatzes zur gezielten Rekombination ein chromosomales Intervall von dem Donor, das beispielsweise genomische Sequenzen umfasst, die Linkage Drag darstellen, durch genetische/homologe Rekombination von dem integrierten Chromosomfragment entfernt werden können. Dabei kann das Intervall des Pepitilla-Donors durch das korrespondierende Intervall des rekurrenten Eitergenoms oder von einem exogen eingebrachten homologen DNA-Fragment ersetzt werden. Marker im Allgemeinen und die hier offenbarten Marker im Besonderen können dabei insbesondere bei der Selektion unterstützend eingesetzt werden. Beispielhaft sei im Folgenden eine mögliche Verwendung von Markern zur Detektion eines Allels wiedergegeben: Das
Detektieren eines Allels kann beispielsweise (a) das Isolieren von mindestens einem
Nukleinsäuremolekül aus dem Genom einer Pflanze oder Pflanzenzelle/Maispflanze oder Maispflanzenzelle und (b) das Untersuchen des isolierten Nukleinsäuremolekül mit mindestens einem Marker umfassen, sowie optional (c) das Sequenzieren des Allels in einem und/oder mehreren Genotypen, (d) die Detektion von einem und/oder mehreren Polymorphismen und/oder (e) die Restriktion mit einer Restriktions-Endonuklease, die unterschiedlich große Fragmente an einem Markerallel erzeugen kann.
Eine bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment das zweite Intervall des
Donors, welches flankiert ist a) von den Markern SYN14136 und PZE-108077560, b) von den Markern PZE-108076510 und PZE-108077560, c) von den Markern SYN14136 und SYN24931 oder d) von den Markern PZE-108076510 und SYN24931 , nicht enthält.
In einer bevorzugten Ausgestaltung zeigt die erfindungsgemäße Maispflanze einen abweichenden Zeitpunkt der männlichen und/oder weiblichen Blüte im Vergleich mit der Pepitilla-konvertierten Linie oder -konvertierte Pflanze wie B37HTN1 , welche das Intervall 2 zwischen einem Marker in einer ersten Markerregion (M1), die durch die Marker SYN14136 und PZE-108076510 flankiert ist, und einem Marker in einer zweiten Markerregion (M2), die durch die Marker SYN24931 und PZE-108077560 flankiert ist, enthält, wobei abweichender Zeitpunkt bedeutet, dass die konvertierten Linie oder konvertierte Pflanze eine Verzögerung von mindestens 2 Tagen, von mindestens 3 Tagen, von mindestens 5 Tagen oder von mindestens 7 Tagen aufweist. Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment weiterhin ein Intervall des Donors (nachfolgend drittes Intervall oder Intervall 3 genannt) zwischen einem Marker in der zweiten Markerregion M2 und einem Marker in einer dritten Markerregion M3, welche durch die Marker PZE-108093423 (Tabelle 4) und PZE-108093748 (Tabelle 4) flankiert ist, nicht enthält. Die Marker PZE-108093423 und PZE- 08093748 sind SNP-Marker zur Verwendung im KBioscience-KASP-System (www.lgcgenomics.com/genotyping/kasp- genotyping-reagents/kasp-overview/): Sie definieren eindeutig die Markerregion M3. Als polymorphe Marker sind sie überdies auch geeignet zwischen Donor-Allel und
beispielsweise dem Allel des rekurrenten Elter zu unterscheiden. Alle Angaben zur Nutzung dieser Marker als KASP-Marker können der Tabelle 4 entnommen werden. Geeignete exemplarische Primer-Hybridisierungsparameter für die PCR werden in Beispiel 2 wiedergegeben. Ein Fachmann ist darüber hinaus auch in der Lage, andere geeignete Hybridisierungsparameter zu bestimmen. Ferner ist es Routinetätigkeit eines Fachmanns in Kenntnis der beschriebenen Markerregion neben den genannten Markern andere Marker, insbesondere polymorphe Marker, in M3 zu entwickeln. Unter Verwendung der oben genannten Marker der M2 und der hier aufgeführten Marker PZE-108093423 und PZE- 108093748 oder selbst entwickelter Marker in M3 fällt es dem Fachmann leicht
festzustellen, ob in einer Maispflanze, in deren Genom ein Chromosomfragment mit HTN1 - ResistenzLocus aus dem Donor Pepitilla integriert ist, das vorstehend beschriebene dritte Intervall des Donors enthalten ist oder nicht enthalten ist.
Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment einen genetischen Abschnitt, der das zweite Intervall und das dritte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SVN14136 und PZE-108093423, b) von den Markern PZE-108076510 und PZE-108093423, c) von den Markern SYN14136 und PZE-108093748 oder d) von den Markern PZE-108076510 und PZE-108093748, nicht enthält.
In einem weiteren Aspekt konnten weitere genetische Abschnitte auf dem
Chromosomfragment bestimmt werden, welche unter Nichtbefallsbedingungen mit H.
iurcicum einen signifikanten negativen Einfluss auf das Ertragspotential einer Maispflanze, in deren Genom ein Chromosomfragment mit HTN1-Resistenzlocus aus dem Donor Pepitilla integriert ist, verursachen können. So zeigen unabhängig von der oben
beschriebenen Verzögerung des Blühzeitpunktes konvertierte Linien ebenso wie aus dem Stand der Technik bekannte konvertierte Linien wie B37HTN1 neben der vermittelten Ht- Resistenz einen deutlich reduzierten Ertrag, insbesondere einen deutlich reduzierten Silageertrag im Vergleich zu der entsprechenden Linie ohne Introgression (z.B. isogene Linie oder Ausgangslinie). Dies gilt selbst für Linien, in deren Genom ein genetischer Abschnitt des Donors, bestehend aus Intervall 2 (zwischen einem Marker aus M1 und M2) oder Intervall 2 und 3 (zwischen einem Marker aus M1 und M3) nicht mehr vorhanden ist. Derartige Beobachtungen waren für einen Fachmann nicht zu erwarten, da er aus dem Stand der Technik keinen Hinweis auf einen derartigen Linkage Drag in HTN1- Introgressionslinien erhält. Zur Klärung der genetischen Ursache dieses agronomischen Nachteils wurden beispielsweise ausgedehnte Rückkreuzungsprogramme, begleitet von Geno- und Phänotypisierungen durchgeführt. Unterstützt wurden die Arbeiten von einer intensiven Entwicklung zielgenauer und spezifischer molekularer Marker auf dem HTN1 - tragenden Chromosomfragment. In Maispflanzen mit dem reduziertem Ertrag (Silageertrag) gelang es die Lage der genomischen Sequenzabschnitte, die für den identifizierten Linkage Drag des Silageertrags verantwortlich sind, eindeutig auf zwei weiteren Intervallen des Donors (nachfolgend viertes Intervall oder Intervall 4 und fünftes Intervall oder Intervall 5 genannt) auf dem Pepitilla-Chromosomfragment zu bestimmen (Beispiel 3C; Figur 3). Eine erfindungsgemäße Maispflanze, welche im HTN1-lntrogressionsfragment aus Pepitilla, anstatt des Linkage Drag tragenden vierten und/oder fünften Intervalls des Donors ein entsprechendes Intervall ohne Linkage Drag z.B. aus dem rekurrenten Elter aufweist, zeigt keinen reduzierten Silageertrag und somit einen Ertrag, insbesondere einen Silageertrag, welcher demjenigen einer vergleichbaren Linie ohne Introgression (z.B. isogene Linie oder Ausgangslinie) entspricht. Der Silageertrag einer erfindungsgemäßen Maispflanze ohne vierten und/oder fünften Intervall des Donors im Vergleich mit einer vergleichbare
Maispflanze mit Linkage Drag des Silageertrags kann um mehr als 2%, als 3%, als 4%, als 5%, als 6%, als 7%, als 8%, als 9%, als 10%, als 15% oder als 20% höher sein. Das vierte Intervall ist proximal gelegen und eng gekoppelt zu dem Resistenzlocus HTN1 bzw. zu dem ersten Intervall. Das fünfte Intervall ist distal gelegen und eng gekoppelt zu dem
Resistenzlocus HTN1 bzw. zu dem ersten Intervall.
Daher ist eine besonders bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze eine oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment weiterhin i) das vierte Intervall des Donors zwischen einem Marker in der dritten Markerregion M3 und einem Marker in einer vierten Markerregion M4, welche durch die Marker MA0004 und MA0005 flankiert ist, oder ii) einen genetischen Abschnitt mit dem vierten Interval zwischen einem Marker in der dritten Markerregion M3 und einem Marker in einer siebten Markerregion M7, welche durch die Marker MA0005 und MA0021 flankiert ist, nicht enthält und/oder wobei das Chromosomfragment weiterhin i) das fünfte Intervall des Donors zwischen einem Marker in einer fünften Markerregion M5, welche durch die Marker
MA0006 und PZE-108097482 flankiert ist, und einem Marker in einer sechsten
Markerregion M6, welche durch die Marker PZE-108107671 und SYN4196 flankiert ist, oder ii) einen genetischen Abschnitt mit dem fünften Interval zwischen einem Marker in einer achten Markerregion M8, welche durch die Marker MA0022 und MA0013 flankiert ist, und einem Marker in einer sechsten Markerregion M6, welche durch die Marker PZE- 108107671 und SYN4196 flankiert ist, nicht enthält. Die flankierenden Marker können der Tabelle 4 entnommen werden. Die Marker MA0004, MA0005, MA0006, MA0013, MA0021 , MA0022, PZE-108097482, PZE-108107671 und SYN4196 sind SNP-Marker zur
Verwendung im KBioscience-KASP-System (www.lgcgenomics.com/genotyping/kasp- genotyping-reagents/kasp-overview/). Sie definieren eindeutig die Markerregionen M4, M5, M6, M7 und M8, welche zusammen mit M3 die Sequenzabschnitte festlegen, welche im Donor B37HTN1 bzw. Pepitilla den Linkage Drag des Silageertrages tragen. Als
polymorphe Marker sind sie überdies auch geeignet zwischen Donor-Allel und
beispielsweise dem Allel des rekurrenten Elter zu unterscheiden. Alle Angaben zur Nutzung dieser Marker als KASP-Marker können der Tabelle 4 entnommen werden. Geeignete exemplarische Primer-Hybridisierungsparameter für die PCR werden in Beispiel 2 wiedergegeben. Ein Fachmann ist darüber hinaus auch in der Lage, andere geeignete Hybridisierungsparameter zu bestimmen. Ferner ist es Routinetätigkeit eines Fachmanns in Kenntnis der beschriebenen Markerregionen neben den genannten Markern andere
Marker, insbesondere polymorphe Marker, in M4, in M5, in M6, in M7 und/oder in M8 zu entwickeln. Unter Verwendung der hier aufgeführten Marker MA0004, MA0005, MA0006, MA0013, MA0021 , MA0022, PZE-108097482, PZE-108107671 und SYN4196 oder selbst entwickelter Marker in M4, in M5, in M6, in M7 und/oder M8 zusammen mit oben
beschriebenen Markern in M3 fällt es dem Fachmann leicht festzustellen, ob in einer Maispflanze, in deren Genom ein Chromosomfragment mit HTN1-Resistenzlocus aus dem Donor Pepitilla integriert ist, das vorstehend beschriebene vierte Intervall des Donors und/oder das vorstehend beschriebene fünfte Intervall enthalten ist oder nicht enthalten ist.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment (i) einen genetischen Abschnitt, der das zweite Intervall, das dritte Intervall und das vierte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SYN14136 und MA0004, b) von den Markern PZE-108076510 und MA0004, c) von den Markern SYN14136 und MA0005 oder d) von den Markern PZE- 08076510 und MA0005, nicht enthält, oder (ii) einen genetischen Abschnitt, der das zweite Intervall und das dritte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SYN14136 und PZE-108093423, b) von den Markern PZE- 108076510 und PZE-108093423, c) von den Markern SYN14136 und PZE-108093748 oder d) von den Markern PZE-108076510 und PZE-108093748, und das fünfte Intervall des Donors nicht enthält, oder (iii) einen genetischen Abschnitt der das zweite Intervall, das dritte Intervall und das vierte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SYN14136 und MA0004, b) von den Markern PZE-108076510 und MA0004, c) von den Markern SYN14136 und MA0005 oder d) von den Markern PZE-108076510 und MA0005, und das fünfte Intervall des Donors nicht enthält.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment (i) einen genetischen Abschnitt, der das zweite Intervall, das dritte Intervall und das vierte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SYN14136 und MA0021 oder b) von den Markern PZE- 08076510 und MA0021 , nicht enthält, oder (ii) einen genetischen Abschnitt, der das zweite Intervall, das dritte Intervall und das vierte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SYN14136 und MA0021 oder b) von den Markern PZE- 108076510 und MA0021 , und das fünfte Intervall des Donors nicht enthält, oder (iii) einen genetischen Abschnitt, der das zweite Intervall, das dritte Intervall und das vierte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SYN14136 und MA0021 oder b) von den Markern PZE-108076510 und MA0021 , und einen zweiten genetischen Abschnitt, der das fünfte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern MA0022 und PZE-108107671 , b) von den Markern MA0022 und SYN4196, c) von den Markern MA0013 und PZE-108107671 oder von den Markern MA0013 und SYN4196, nicht enthält, oder (iv) einen genetischen Abschnitt, der das zweite Intervall und das dritte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SYN14136 und PZE-108093423, b) von den Markern PZE-108076510 und PZE-108093423, c) von den Markern SYN14136 und PZE-108093748 oder d) von den Markern PZE-108076510 und PZE-108093748, und einen zweiten genetischen Abschnitt, der das fünfte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern MA0022 und PZE-108107671 , b) von den Markern MA0022 und SYN4196, c) von den Markern MA0013 und PZE-108107671 oder von den Markern MA0013 und SYN4196, nicht enthält, oder (v) einen genetischen Abschnitt, der das zweite Intervall, das dritte Intervall und das vierte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SYN14136 und MA0021 oder b) von den Markern PZE-108076510 und MA0021 , und einen zweiten genetischen Abschnitt, der das fünfte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern MA0022 und PZE- 08107671 , b) von den Markern MA0022 und SYN4196, c) von den Markern MA0013 und PZE-108107671 oder von den Markern MA0013 und SYN4196, nicht enthält.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist alternativ durch eine
Maispflanze gelöst, in deren Genom ein Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla integriert ist, wobei das Chromosomfragment das erste Intervall des Donors umfasst, welches Donor-Allele gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 aufzeigt und das Polynukleotid aufweist, das in der Maispflanze Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum vermittelt, und wobei das Chromosomfragment i) das vierte Intervall des Donors zwischen einem Marker in der dritten Markerregion, welche durch die Marker PZE-108093423 und PZE-108093748 flankiert ist, und einem Marker in der vierten Markerregion, welche durch die Marker MA0004 und MA0005 flankiert ist, oder ii) einen genetischen Abschnitt mit dem vierten Intervall zwischen einem Marker in der dritten Markerregion M3 und einem Marker in der siebten Markerregion M7, welche durch die Marker MA0005 und MA0021 flankiert ist, nicht enthält. Die obige Beschreibung im Hinblick beispielsweise auf Marker, auf das Polynukleotid oder auf die Phänotypisierung gilt entsprechend auch für diese und jede weitere alternative Lösung der Aufgabe sowie offenbarten Ausgestaltungen.
Eine bevorzugte Ausgestaltung dieser erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment i) das vierte Intervall des Donors, welches flankiert isla) von den Markern PZE-108093423 und MA0004, b) von den Markern PZE-108093748 und MA0004, c) von den Markern PZE- 08093423 und MA0005 oder d) von den Markern PZE-108093748 und MA0005, nicht enthält oder ii) einen genetischen Abschnitt, der das vierte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern PZE-108093423 und MA0021 oder b) von den Markern PZE-108093748 und MA0021 , nicht enthält.
Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine vorstehend beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment weiterhin das dritte Intervall des Donors zwischen einem Marker in der zweiten Markerregion M2 und einem Marker in der dritten Markerregion M3 nicht enthält. Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment einen genetischen Abschnitt, der das dritte Intervall und das vierte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SYN24931 und MA0004, b) von den Markern PZE-108077560 und MA0004, c) von den Markern SYN24931 und MA0005, d) von den Markern PZE-108077560 und MA0005, e) von den Markern SYN24931 und MA0021 oder f) von den Markern PZE- 108077560 und MA0021 nicht enthält.
Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine vorstehend beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment i) weiterhin das fünfte Intervall des Donors zwischen einem Marker in der fünften Markerregion M5 und einem Marker in der sechsten Markerregion M6 oder ii) einen genetischen Abschnitt mit dem fünften Interval zwischen einem Marker in der achten Markerregion M8 und einem Marker in der sechsten Markerregion M6 nicht enthält.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine vorstehend beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment i) einen genetischen Abschnitt, der das das dritte Intervall und das vierte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SYN24931 und MA0004, b) von den Markern PZE-108077560 und MA0004, c) von den Markern SYN24931 und MA0005 oder d) von den Markern PZE-108077560 und MA0005, und das fünfte Intervall nicht enthält, oder ii) einen genetischen Abschnitt, der das das dritte Intervall und das vierte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SYN24931 und MA0004, b) von den Markern PZE-108077560 und MA0004, c) von den Markern SYN24931 und MA0005 oder d) von den Markern PZE-108077560 und MA0005, und einen zweiten genetischen Abschnitt, der das das fünfte Intervall umfasst und flankiert ist a) von den Markern MA0022 und SYN4196, b) von den Markern MA0022 und PZE-108107671 , c) von den Markern MA0013 und
SYN4196 oder von den Markern MA0013 und PZE-108107671 , nicht enthält.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine vorstehend beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment i) einen genetischen Abschnitt, der das das dritte Intervall und das vierte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SYN24931 und MA00021 oder b) von den Markern PZE-108077560 und MA00021 , und das fünfte Intervall nicht enthält, oder ii) einen genetischen Abschnitt, der das das dritte Intervall und das vierte Intervall des Donors umfasst und flankiert ist a) von den Markern SYN24931 und MA00021 oder b) von den Markern PZE-108077560 und MA00021 , und einen zweiten genetischen Abschnitt, der das das fünfte Intervall umfasst und flankiert ist a) von den Markern MA0022 und PZE- 108107671 , b) von den Markern MA0022 und SYN4196, c) von den Markern MA0013 und PZE-108107671 oder von den Markern MA0013 und SYN4196, nicht enthält.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist ferner alternativ durch eine Maispflanze gelöst, in deren Genom ein Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla integriert ist, wobei das Chromosomfragment das erste Intervall des Donors umfasst, welches Donor-Allele gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 aufzeigt und das Polynukleotid aufweist, das in der Maispflanze Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum
vermittelt, und wobei das Chromosomfragment i) das fünfte Intervall des Donors zwischen einem Marker in der fünften Markerregion, welche durch die Marker MA0006 und PZE- 108097482 flankiert ist, und einem Marker in der sechsten Markerregion, welche durch die Marker PZE-108107671 und SYN4196 flankiert ist, oder ii) einen genetischen Abschnitt mit dem fünften Intervall zwischen einem Marker in der achten Markerregion M8, welche durch die Marker MA0022 und MA0013 flankiert ist, und einem Marker in der sechsten
Markerregion M6, welche durch die Marker PZE-108107671 und SYN4196 flankiert ist, nicht enthält.
Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanze ist eine vorstehend beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment weiterhin das dritte Intervall des Donors zwischen einem Marker in der zweiten Markerregion M2 und einem Marker in der dritten Markerregion M3 nicht enthält.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanzen ist eine der oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment flankiert ist a) von einem Marker in der zweiten Markerregion M2 und einem Marker in der sechsten Markerregion M6, b) von einem Marker in der dritten Markerregion M3 und einem Marker in der sechsten Markerregion M6, c) von einem Marker in der vierten Markerregion M4 und einem Marker in der sechsten Markerregion M6, d) von einem Marker in der siebten
Markerregion M7 und einem Marker in der sechsten Markerregion M6, e) von einem Marker in der Markerregion M1 und einem Marker in der Markerregion M5, f) von einem Marker in der zweiten Markerregion M2 und einem Marker in der fünften Markerregion M5, g) von einem Marker in der dritten Markerregion M3 und einem Marker in der fünften Markerregion M5, h) von einem Marker in der vierten Markerregion M4 und einem Marker in der fünften Markerregion M5, i) von einem Marker in der siebten Markerregion M7 und einem Marker in der fünften Markerregion M5, j) von einem Marker in der Markerregion M1 und einem
Marker in der Markerregion M8, k) von einem Marker in der zweiten Markerregion M2 und einem Marker in der achten Markerregion M8, I) von einem Marker in der dritten
Markerregion M3 und einem Marker in der achten Markerregion M8, m) von einem Marker in der vierten Markerregion M4 und einem Marker in der achten Markerregion M8, oder n) von einem Marker in der siebten Markerregion M7 und einem Marker in der achten
Markerregion M8.
Eine weitere ganz besonders bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen
Maispflanzen ist eine der oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment flankiert ist a) durch die Marker SYN24931 und SYN4196, b) durch die Marker PZE- 108077560 und SYN4196, c) durch die Marker SYN24931 und PZE-108107671 , d) durch die Marker PZE-108077560 und PZE-108107671 , e) durch die Marker PZE-108093423 und SYN4196, f) durch die Marker PZE-108093748 und SYN4196, g) durch die Marker PZE- 108093423 und PZE-108107671 , h) durch die Marker PZE-108093748 und PZE- 108107671 , i) durch die Marker MA0004 und SYN4196, j) durch die Marker MA0005 und SYN4196, k) durch die Marker MA0004 und PZE-108107671 , I) durch die Marker MA0005 und PZE-108107671 , m) durch die Marker MA0021 und SYN4196, n) durch die Marker MA0021 und PZE-108107671 , o) durch die Marker PZE-108076510 und MA0006, p) durch die Marker SYN14136 und MA0006, q) durch die Marker PZE-108076510 und PZE- 108097482, r) durch die Marker SYN14136 und PZE-108097482, s) durch die Marker SYN24931 und PZE-108097482, t) durch die Marker PZE-108077560 und PZE-108097482, u) durch die Marker SYN24931 und MA0006, v) durch die Marker PZE-108077560 und MA0006, w) durch die Marker PZE-108093423 und PZE-108097482, x) durch die Marker PZE-108093748 und PZE-108097482, y) durch die Marker PZE-108093423 und MA0006, z) durch die Marker PZE-108093748 und MA0006, aa) durch die Marker MA0004 und PZE- 108097482, ab) durch die Marker MA0005 und PZE-108097482, ac) durch die Marker MA0004 und MA0006, ad) durch die Marker MA0005 und MA0006, ae) durch die Marker MA0021 und PZE-108097482, af) durch die Marker MA0021 und MA0006, ag) durch die Marker PZE-108076510 und MA0013, ah) durch die Marker SYN 14136 und MA0013, ai) durch die Marker PZE-108076510 und MA0022, aj) durch die Marker SYN 14136 und MA0022, ak) durch die Marker SYN24931 und MA0013, al) durch die Marker PZE- 108077560 und MA00 3, am) durch die Marker SYN24931 und MA0022, an) durch die Marker PZE-108077560 und MA0022, ao) durch die Marker PZE-108093423 und MA00 3, ap) durch die Marker PZE-108093748 und MA0013, aq) durch die Marker PZE-108093423 und MA0022, ar) durch die Marker PZE-108093748 und MA0022, as) durch die Marker MA0004 und MA0013, at) durch die Marker MA0005 und MA0013, au) durch die Marker MA0004 und MA0022, av) durch die Marker MA0005 und MA0022, aw) durch die Marker MA0021 und MA0013, ax) durch die Marker MA0021 und MA0022.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Maispflanzen ist eine der oben beschriebene Maispflanze, wobei das Chromosomfragment a) zwischen einem Marker in der zweiten Markerregion M2 und einem Marker in der sechsten
Markerregion M6, b) zwischen einem Marker in der dritten Markerregion M3 und einem Marker in der sechsten Markerregion M6, c) zwischen einem Marker in der vierten
Markerregion M4 und einem Marker in der sechsten Markerregion M6, d) zwischen einem Marker in der siebten Markerregion M7 und einem Marker in der sechsten Markerregion M6, e) zwischen einem Marker in der ersten Markerregion M1 und einem Marker in der fünften Markerregion M5 f) zwischen einem Marker in der zweiten Markerregion M2 und einem Marker in der fünften Markerregion M5, g) zwischen einem Marker in der dritten Markerregion M3 und einem Marker in der fünften Markerregion M5, h) zwischen einem Marker in der vierten Markerregion M4 und einem Marker in der fünften Markerregion M5, i) zwischen einem Marker in der siebten Markerregion M7 und einem Marker in der fünften Markerregion M5, j) zwischen einem Marker in der Markerregion M1 und einem Marker in der Markerregion M8, k) zwischen einem Marker in der zweiten Markerregion M2 und einem Marker in der achten Markerregion M8, I) zwischen einem Marker in der dritten Markerregion M3 und einem Marker in der achten Markerregion M8, m) zwischen einem Marker in der vierten Markerregion M4 und einem Marker in der achten Markerregion M8, oder n) zwischen einem Marker in der siebten Markerregion M7 und einem Marker in der achten Markerregion M8 lokalisiert ist.
Tabelle 4: KASP-Marker Primer-Sequenzen und die Zuordnung zum B37HTN1-Donor Allele stammend aus der Landrasse Pepitilla (Allel X und Allel Y: beschreiben die biallelischen Werte der SNPs)
SNP-Marker MarkerPrimer Primer GemeinB37HTN1 Markerposition Allele Allele samer Donor region
AGPv02 X(5'-3') Υ(5' -3') Primer Allele
(5'-3') (SNP)
[SEQ ID [SEQ ID
Figure imgf000025_0001
MA0016 152250992 86 87 88 A
MA0017 152301656 89 90 91 A
MA0018 52304127 92 93 94 A
MA0019 152630794 95 96 97 C
MA0020 152753635 98 99 100 A
PZE-108095998 152433358 101 102 103 T
PZE-108096011 152435855 104 105 106 A
PZE-108096610 152703579 107 108 109 C
PZE-108096791 152887338 110 1 11 112 G
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auch auf einen Samen oder ein Korn, ein Gewebe, ein Organ, einen Teil und eine Zelle der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Maispflanzen. Dabei ist der Samen oder das Korn ein Samen oder ein Korn, in deren Genom das Chromosomfragment der oben beschriebenen Ausgestaltungen der Erfindung integriert ist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer H. turcicum resistenten Maispflanze, in deren Genom ein Ghromosomfragment aus dem Donor Pepitilla integriert ist, umfassend den Nachweis von mindestens zwei Allelen im Genom der Pflanze, wobei mindestens ein Allel in einem genomischen Abschnitt lokalisiert ist, welcher durch einen Marker in der ersten Markerregion M1 , der zweiten Markerregion M2, der dritten Markerregion M3, der vierten Markerreg ion M4 oder der siebten
Markerregion M7 und durch das oben beschriebene Polynukleotid, das in der Maispflanze Resistenz gegenüber H. turcicum vermittelt, flankiert ist, und wobei mindestens ein Allel in ; einem genomischen Abschnitt lokalisiert ist, welcher durch das Polynukleotid und durch einen Marker in der sechsten Markerregion M6, der fünften Markerregion M5 oder der achten Markerregion M8 flankiert ist. Die Markerregionen sowie beispielhafte Marker in diesen Markerregionen sind oben beschrieben. Vorzugsweise ist die identifizierte
Maispflanze eine erfindungsgemäße Maispflanze. Die Erfindung betrifft weiterhin auch eine Maispflanze, welche mit dem genannten Verfahren zur Identifizierung identifiziert wurde. In einem weiteren Aspekt erfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags einer H. turcicum resistenten Maispflanze, in deren Genom ein
Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla integriert ist, wobei das Verfahren einen Schritt umfasst, welcher die Entfernung des zweiten Intervalls des Donors, vierten Intervalls des Donors oder fünften Intervalls des Donors bewirkt und wobei das Chromosomfragment das oben beschriebene erste Intervall des Donors umfasst, welches Donor-Allele gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 aufzeigt und ein Polynukleotid aufweist, das in der
Maispflanze Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum vermittelt. Beispielsweise kann die Entfernung durch genetische Rekombination während eines Kreuzungsprozesses zwischen zwei Maispflanzen erreicht werden, wobei eine Elter-Maispflanze den HTN1 - Resistenzlocus aus Pepitilla trägt. Neben der Verwendung von konventionellen
Züchtungstechniken zur Erzeugung einer genetischen Rekombination, die als Ergebnis das Ersetzen von mindestens einem der oben identifizierten Donor-Intervalle mit Linkage Drag durch genomische Sequenzen des rekurrenten Elter, welche bevorzugt frei sind von unerwünschten Genen, hat, stellt die moderne Biotechnologie dem Fachmann diverse weitere Werkzeuge zur Verfügung, welche ein präzises Genom-Engineering ermöglichen. Zu den bekannten Werkzeugen zählen beispielsweise (Meganukleasen (Silva et al., 201 1 ), Homing-Endonukleasen (Chevalier 2002), Zinkfinger-Nukleasen, TALE-Nukleasen (WO 2010/079430; WO 201 1/072246) oder CRISPR (Gaj et al., 2013). Hierbei handelt es sich um artifiziell Nuklease-Fusionsproteine, die in der Lage sind gezielt doppelsträngige
Nukleinsäuremoleküle wie pflanzliche DNA zu schneiden und damit Doppelstrangbrüche an gewünschten Positionen im Genom zu erzeugen. Unter Nutzbarmachung der zelleigenen Mechanismen zur Reparatur von induzierten Doppelstrangbrüchen kann dann eine homologe Rekombination oder ein ,nonhomologous end-joining' bewirkt werden, welche zur Entfernung der Linkage Drag-tragenden Intervalle des Donors führen kann. Geeignete Zielsequenzen im Genom für die Erkennungsdomänen vorstehender Nukleasen können beispielsweise den Sequenzinformationen zu den SNP-Markern (Tabelle 4) oder in deren Intervallen entnommen werden. Ein Fachmann ist jedoch auch in der Lage, andere
Sequenzen, bevorzugt innerhalb oder zwischen den oben beschriebenen sechs
Markerregionen, zu identifizieren, welche als Zielsequenzen für die Erkennungsdomäne der Nukleasen geeignet sind.
Im Folgenden sollen hierzu zwei gentechnische Ansätze näher erläutert werden, mit deren Hilfe die Eliminierung von Linkage Drag-tragenden Nukleotidsequenzen aus einem pflanzlichen Genom unterstützt wird oder unmittelbar erreicht wird. Folgende Verfahren, sowie auch die konventionellen Züchtungsverfahren, können zur Herstellung der erfindungsgemäßen Maispflanzen herangezogen werden.
Wie bereits ausgeführt sind vorstehende molekulare Werkzeuge in der Lage an definierten Orten im Genom einer Pflanze DNA-Doppelstrangbrüche zu induzieren. Als besonders vorteilhaft zeigt sich hierbei die Verwendung von TALE-Nukleasen (TALENs) oder
Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs). Die TALE- oder ZF-Erkennungsdomäne erlaubt es an beliebiger Stelle im Genom spezifisch zu binden. In Kenntnis der Sequenz am Zielbereich kann man die TALE- oder ZF Erkehnungsdomäne maßgeschneidert designen, so dass sie ausschließlich an gewünschter Stelle im Genom bindet. Ist die Erkennungssequenz beispielsweise mit eine unspezifischen Endonukease wie Fokl fusioniert, kann man an definierter Stelle im Genom einen Doppelstrangbruch (DSB) induzieren, was ein gezieltes Genom-Engineering ermöglicht (Tzfira et al., 2012; Li et al., 201 1 ; Puchta änd Hohn 2010). Dem Fachmann ist der Umgang mit Fokl-Endonukleasen sowie die Erstellung von geeigneten TALENs und ZFNs aus dem Stand der Technik bekannt.
Ein induzierter Doppelstrangbruch kann beispielsweise eine homologe Rekombination zwischen einem endogenen Ziel-Genlocus (z.B. eine der vorstehenden Markerregionen) und einem exogen eingebrachten homologen DNA-Fragment, welches beispielsweise nicht Täger von Linkage Drag ist (z.B. auf einem geeigneten Spendervektor), stimulieren. Dieses sogenannte ,gene replacement' oder .genome editing' kann in vitro durchgeführt werden und bedarf keines Schrittes der Kreuzung zwischen zwei Pflanzen. Hierfür müssen die zu modifizierenden Pflanzen zum einen mit Nukleinsäuren, kodierend für die designten
TALENs oder ZFNs, und zum anderen mit dem exogenen DNA-Fragment transient transformiert werden. Das DNA-Fragment kann hierbei aus einer Pflanze derselben
Spezies stammen und entspricht beispielsweise dem chromosomalen Abschnitt, welcher ersetzt werden soll, nur ohne Linkage Drag. Nach Abschluss der induzierten homologen Rekombination können Zellen mit modifizierten Genom zu Pflanzen regeneriert werden und dahingehend selektiert werden, ob der Linkage Drag erfolgreich entfernt wurde und die zuvor transient transformierten DNA-Elemente im Zuge der regenerativen Zellteilung wieder verloren gegangen sind . Hierzu können auch oben beschriebene Marker eingesetzt werden. Methoden zur Transformation und Regeneration sind aus dem Stand der Technik bekannt und werden auch weiter unten nochmals erläutert.
Weiterhin können vorstehende TALENs und ZFNs auch im Prozess der Meiose transgen eingesetzt werden, wo sie an vorbestimmten Stellen im Genom Doppelstrangbrüche induzieren und somit die Wahrscheinlichkeit für eine Rekombination an diesen Stellen im Schritt des .Crossing over' erhöhen. Dadurch kann die Elimierung von Linkage Drag deutlich begünstigt werden. Einem Fachmann ist bekannt, wie er nach Abschluss der Meiose aus den haploiden Zellen Linkage-Drag-freie und TALENs bzw. ZFNs-freie
Pflanzen erzeugt.ln einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Maispflanze, welches die folgenden Schritte umfasst: (A) Bereitstellen einer ersten Maispflanze, in deren Genom ein
Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla integriert ist, wobei das Chromosomfragment ein erstes Intervall des Donors umfasst, welches Donor-Allele gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 aufzeigt und ein Polynukleotid aufweist, das in der Maispflanze Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum vermittelt, und wobei das Chromosomfragment ein zweites Intervall des Donors und/oder das vierte Intervall des Donors und/oder das fünfte Intervall des Donors enthält, (B) Bereitstellen einer zweiten Maispflanze, (C) Kreuzen der Maispflanze aus (A) mir der Maispflanze aus (B) und (D) Selektieren einer
erfindungsgemäßen Maispflanze, vorzugsweise unter Verwendung von mindestens einem oben beschriebenen Marker. Alternati betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Maispflanze, welches die folgenden Schritte umfasst: (A) Transientes Transformieren einer Maispflanzenzelle mit einer ersten Nukleotidsequenz, welche für ein erstes Protein mit Endonuklease-Aktivität (z.B. ein TALE- oder ZF- Endonuklease- Fusionsprotein) kodiert, das in der Lage ist zwischen Markerregion M2 und M4 eine Doppelstrangbruch der DNA im Genom der Maispflanzenzelle zu induzieren, und mit einer zweiten Nukleotidsequenz, welche für ein zweites Protein mit Endonuklease- Aktivität (z.B. ein TALE- oder ZF-Endonuklease- Fusionsprotein) kodiert, das in der Lage ist zwischen Markerregion M5 und M6 eine Doppelstrangbruch der DNA im Genom der Maispflanzenzelle zu induzieren, (B) Transientes Einbringen eines Spendervektors in die erste Maispflanzenzelle, welcher ein Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla trägt, wobei das Chromosomfragment ein erstes Intervall des Donors umfasst, welches Donor- Allele gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 aufzeigt und ein Polynukleotid aufweist, das in der Maispflanze Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum vermittelt, und wobei das Chromosomfragment weiterhin die chromosomalen Abschnitte des Donors Pepitilla zwischen den Stellen der Doppelstrangbrüche aus (A) aufweist, sodass zwischen dem Genom der ersten Maispflanzehzelle und dem Chromsomfragment des Spendervektors eine homologe Rekombination stattfindet, (C) Regenation einer Maispflanze aus der Maispflanzenzelle, (D) Identifikation einer erfindungsgemäßen Maispflanze, vorzugsweise unter Verwendung von mindestens einem oben beschriebenen Marker. Besonders bevorzugt sind transient eingebrachte erste und zweite Nunkleinsäuresequenzen und Spedervektor wieder verloren gegangen. Dem Fachmann ist bekannt wir er dieses erreicht und nachweisen kann.
In einem weiteren Aspekt sind von der vorliegenden Erfindung die oben beschriebenen Marker als Oligonukleotide, insbesondere Primer-Oligonukleotide erfasst. Vorzugsweise sind die Oligonukleotide isolierte Oligonukleotide. Ein Oligonukleotid umfasst ein
Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus einer der SEQ ID NOs: 41 -49, 53-100 und 229-250. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Oligonukleotids, welches ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus einer der SEQ ID NOs: 17-250, umfasst, zur Identifizierung einer H. turcicum
resistenten Maispflanze. Vorzugsweise stammt die Resistenz aus dem Donor Pepitilla und ist HTN1 .
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist weiterhin alternativ durch eine transgene Pflanze, insbesondere eine transgene Maispflanze, gelöst, welche eine unten beschriebene transgene Pflanzenzelle umfasst. Ferner betrifft die Erfindung auch einen Teil dieser erfindungsgemäßen Pflanze, wobei ein Teil eine Zelle, ein Gewebe, ein Organ oder ein Zusammenschluss von mehreren Zellen, Geweben oder Organen sein kann. Ein Zusammenschluss von mehreren Organen ist z.B. eine Blüte oder ein Samen. In einer besonderen Ausgestaltung betrifft die Erfindung einen Samen von der transgenen Pflanze, wobei der Samen das weiter unten beschriebene erfindungsgemäße Polynukleotid als Transgen umfasst. Bevorzugt zeigt eine transgene Pflanze der vorliegenden Erfindung, insbesondere eine Pflanze der Spezies Zea mays, gegenüber H. turcicum eine höhere Reststenz als eine korrespondierende nicht-transformierte Pflanze (isogene Pflanze ohne das Transgen). Eine erfindungsgemäße transgene Ht-resistente Pflanze zeigt eine erhöhte Resistenz gegenüber H. turcicum von mindestens 1 Boniturnote, bevorzugt von mindestens 2 Böniturnoten oder mindestens 3 Boniturnoten und besonders bevorzugt von mindestens 4 Boniturnoten (siehe Boniturschema in Tabelle 3).
Ferner stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze bereit, welches einen Schritt des Einbringens des erfindungsgemäßen Polynukleotids oder des weiter unten beschriebenen Vektors der vorliegenden Erfindung in eine pflanzliche Zelle und optional einen Schritt der Selektion einer transgenen Pflanzenzelle umfasst. Weiterhin ist ein solches Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze durch einen
anschließenden Schritt gekennzeichnet, der die Regenerierung der transgenen Pflanze aus der im ersten Schritt erzeugten transgenen Pflanzenzelle einschließt. Methoden zur Regeneration sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt.
In einem zusätzlichen Aspekt offenbart die vorliegende Erfindung das Polynukleotid, welches ein oder mehrere Resistenz-vermittelnde Gene des HTN1 -Locus aus Pepitilla (Tabelle 1 ) oder ausgewählt aus RLK1 und EXT1 (siehe Tabelle 1 ) oder Genallele davon. Gen oder Genallel können unter Befallsbedingungen mit H. turcicum einen
Resistenzphänotyp mit den HTN1 -typischen Merkmalen bewirken. Strukturell ist das Polynukleotid dadurch gekennzeichnet, dass es ein Nukleinsäuremolekül umfasst, (a) das eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13 oder 15 aufweist, (b) das eine Nukleotidsequenz mit einer Identität von mindestens 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% zu einer der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13 und 15 vorzugsweise über die gesamte Sequenzlänge, aufweist, (c) das mit dem komplementären Strang eines Nukleinsäuremoleküls nach (a) oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, (d) das ein Polypeptid mit einer
Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 oder 16 kodiert, oder (e) das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch ist mit einer der
Aminosäuresequenzen nach (d), kodiert. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das Polynukelotid dadurch gekennzeichnet, dass es ein Nukleinsäuremolekül umfasst, (aa) das eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder 5 aufweist, (bb) das eine
Nukleotidsequenz mit einer Identität von mindestens 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% zu einer der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder 5 vorzugsweise über die gesamte Sequenzlänge, aufweist, (cc) das mit dem
komplementären Strang eines Nukleinsäuremoleküls nach (aa) oder (bb) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, (dd) das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder 6 kodiert, oder (ee) das ein Polypeptid mit einer Aminösäuresequenz, die zu mindestens 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch ist mit einer der Aminosäuresequenzen nach (dd), kodiert. Vorzugsweise kann das Polynukleotid isoliert und/oder gereinigt von seiner natürlichen genetischen Umgebung sein oder liegt in im Wesentlichen reiner oder homogener Form vor. Bevorzugt ist das Polynukelotid DNA, und besonders bevorzugt cDNA, d.h. das Polynukleotid umfasst die cDNA vom einem oder mehreren Resistenz-vermittelnde Genen (Tabelle 1 ). Es kann aber auch als RNA vorliegen. Dem Fachmann ist bekannt, wie er aus der hier offenbarten Sequenzinformation die genomische DNA-Sequenz ableiten kann. Ein erfindungsgemäßes Polynukleotid kodiert mindestens ein Polypeptid, das in der Lage ist, eine Resistenz gegenüber dem Pathogen Helminthosporium turcicum in einer Pflanze, in welcher das Polypeptid exprimiert wird, zu vermitteln. Bevorzugt vermittelt das Polypeptid, welches durch das erfindungsgemäße Polynukleotid oder Teilen davon kodiert wird, insbesondere in einer Pflanze der Gattung Zea oder in einer Pflanze der Spezies Zea mays eine Resistenz gegenüber dem Pathogen Helminthosporium turcicum.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin auch ein Polypeptid, welches in der Lage ist eine Resistenz gegenüber H. turcicum in einer Pflanze, in welcher das Polypeptid exprimiert wird, zu vermitteln und welches durch das erfindungsgemäße Polynukleotid oder einem Teil davon kodiert wird, das Polypeptid weist bevorzugt eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 oder 16 oder besonders bevorzugt eine
Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder 6. Bei dem Polypeptid kann es sich um ein isoliertes Polypeptid handeln.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor, welcher das erfindungsgemäße Polynukleotid umfasst. Bei dem Vektor kann es sich um ein Plasmid, ein Cosmid, eine Phage oder einen Expressionsvektor, einen Transformationsvektor, Shuttle- Vektor oder Klonierungsvektor handelt, er kann doppel- oder einzelsträngig, linear oder zirkulär sein oder kann einen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt entweder durch Integration in dessen Genom oder extrachromosomal transformieren. Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Polynukleotid in einem Expressionsvektor mit einer oder mehreren regulatorischen Sequenzen, welche die Transkription und optional die Expression in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle erlauben, operativ verknüpft.
Beispielsweise steht das Polynukleotid unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors oder eines Terminators. Geeignete Promotoren können Promotoren sein, welche konstitutiv induziert werden (Bsp.: 35S-Promoter aus dem„Cauliflower mosaic virus" (Odell et al.
1985), besonders geeignet sind solche Promotoren, welche pathogen-induzierbar sind (Bsp.: PR1 -Promotor aus Petersilie (Rushton et l., 1996). Besonders geeignete Pathogen- induzierbare Promotoren sind synthetische bzw. Chimäre Promotoren, welche in der Natur nicht vorkommen, aus mehreren Elementen zusammengesetzt sind und einen
Minimalpromotor beinhalten sowie stromaufwärts des Minimalpromotors mindestens ein cis-regulatorisches Element aufweisen, welches als Bindungsstelle für spezielle
Transkriptionsfaktoren dient. Chimäre Promotoren werden den gewünschten Anforderungen nach konzipiert und werden durch unterschiedliche Faktoren induziert oder reprimiert. Beispiele für solche Promotoren finden sich in WO 2000/29592 und WO
2007/147395. Ein geeigneter Terminator ist beispielsweise der nos-Terminator (Depicker et al., 1982).
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Vektoren, stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren bereit, das die Einbringung eines beschriebenen Vektors in eine Wirtszelle umfasst. Der Vektor kann beispielsweise durch Konjugation, Mobilisation, biolistische Transformation, Agrobakterium -vermittelte Transformation, Transfektion, Transduktion, Vakuuminfiltration oder Elektroporation eingebracht werden. Solche Verfahren ebenso wie Verfahren zur Präparation von beschriebenen Vektoren sind dem Fachmann geläufig (Sambrook et al. 2001 ).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle, welche das erfindungsgemäße Polynukleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst. Eine Wirtszelle im Sinne der Erfindung kann eine prokaryotische (z.B. bakteriell) oder
eukaryotische Zelle (z.B. eine pflanzliche Zelle oder eine Hefezelle) sein. Vorzugsweise ist die Wirtszelle ein Agrobakterium wie Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes oder eine Pflanzenzelle, welche das erfindungsgemäße Polynukleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfassen. Dem Fachmann sind sowohl zahlreiche Methoden wie Konjugation oder Elektroporation bekannt, mit denen er das
erfindungsgemäße Polynukleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung in ein
Agrobakterium einbringen kann, als auch Methoden wie diverse Transformationsverfahren (biolistische Transformation, Agrobakterium-vermittelte Transformation), mit denen er das erfindungsgemäße Polynukleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle einbringen kann (Sambrook et al. 2001).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine transgene Pflanzenzelle, welche das erfindungsgemäße Polynukleotid als Transgen oder den Vektor der
vorliegenden Erfindung umfasst. Eine solche transgene Pflanzenzelle ist beispielsweise eine Pflanzenzelle, welche mit dem erfindungsgemäßen Polynukleotid oder mit dem Vektor der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise stabil, transformiert ist. In einer bevorzugten Ausgestaltung der transgenen Pflanzenzelle ist, das Polynukleotid mit einer oder mehreren regulatorischen Sequenzen, welche die Transkription und optional die Expression in der Pflanzenzelle erlauben, operativ verknüpft. Das Gesamtkonstrukt aus dem
erfindungsgemäßen Polynukleotid und der/den regulatorischen Sequenz(en) können dann das Transgen darstellen. Solche regulatorische Sequenzen sind beispielsweise ein Promoter oder ein Terminator. Dem Fachmann sind zahlreiche in Pflanzen anwendbare, funktionelle Promotoren und Terminatoren bekannt. Bevorzugt zeigt eine transgene
Pflanzenzelle der vorliegenden Erfindung, insbesondere eine Zelle einer Pflanze der Spezies Zea mays gegenüber H. turcicum eine höhere Resistenz als eine
korrespondierende nicht-transformierte Pflanzenzelle (die (isogene) Pflanzenzelle ohne das Transgen). Erfindungsgemäße transgene Ht-resistente Pflanzenzelle zeigen eine erhöhte Resistenz gegenüber H. turcicum von mindestens 1 Boniturnote, bevorzugt von mindestens 2 Boniturnoten oder mindestens 3 Boniturnoten und besonder bevorzugt von mindestens 4 Boniturnoten (siehe Boniturschema in Tabelle 3). Weiterhin betrifft die vorliegende
Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle der vorliegenden Erfindung, welches einen Schritt des Einbringens des erfindungsgemäßen Polynukleotids oder des Vektors der vorliegenden Erfindung in eine pflanzliche Zelle umfasst. Beispielsweise kann das Einbringen durch Transformieren stattfinden,
vorzugsweise durch stabiles Transformieren. Die geeigneten Techniken zur Einbringung wie biolistische Transformation, Agrobakterium-vermittelte Transformation oder
Elektroporation sind dem Fachmann bekannt (Sambrook et al. 2001 ).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur
Vermittlung oder Erhöhung einer Resistenz gegenüber H. turcicum in einer Pflanze, bevorzugt einer Pflanze der Spezies Zea mays, welche einen Schritt des Transformierens einer Pflanzenzelle mit dem erfindungsgemäßen Polynukleotid oder dem Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst. Bevorzugt führt dieses Verfahren zu erhöhter Resistenz gegenüber H. turcicum von mindestens 1 Boniturnote, bevorzugt von mindestens 2
Boniturnoten oder mindestens 3 Boniturnoten und besonder bevorzugt von mindestens 4 Boniturnoten (siehe Boniturschema in Tabelle 3).
In einem zusätzlichen Aspekt schließt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Modifikation des Resistenzphänotyps einer Pflanze, insbesondere einer Maispflanze, gegenüber dem Pathogen Helminthosporium turcicum, welches einen Schritt des Mutierens des Resistenz-vermittelnden Gens des HTN1 -Locus aus Pepitilla oder eines Genallele davon umfasst, ein. Vorzugsweise kodiert das Resistenz-vermittelnde Gene des HTN1 - Locus aus Pepitilla für ein Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 oder ein Homolog eines
Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2, welches unter Befallsbedingungen mit H. turcicum einen Resistenzphänotyp mit den HTN1 -typischen Merkmalen bewirkt. Das Resistenzvermittelnde Gen des HTN1 -Locus aus Pepitilla oder eines Genallele davon kann transgen oder endogen im Genom der Pflanze vorliegen. Modifikation des Resistenzphänotyps kann eine Änderung der Pathogen-Rassenspezifität und/oder eine Änderung des Resistenzlevels gemessen als Boniturnote basierend auf phänotypische Kennzeichen wie beispielsweise betroffene Blattfläche (siehe Tabelle 3) oder gemessen als AUDPC-Wert (siehe Beispiel 1 C) meinen. Bevorzugt liegt das Resistenzlevel nach Modifikation des Resistenzphänotyps zwischen dem Resistenzlevel einer Pflanze, die das nicht-mutierte Resistenz-vermittelnde Gen des HTN1-Locus aus Pepitilia exprimiert, und dem Resistenzlevel einer isogenen Pflanze, die das Resistenz-vermittelnde Gen des HTN1 -Locus aus Pepitilia nicht exprimiert; es kann aber auch über dem Resistenzlevel einer Pflanze, die das nicht-mutierte
Resistenz-vermittelnde Gen des HTN1 -Locus aus Pepitilia exprimiert, liegen. Besonders bevorzugt liegt das Resistenzlevel zwischen dem Resistenzlevel einer Pflanze, die das Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 exprimiert, und dem Resistenzlevel einer isogenen
Pflanze, die das Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 nicht exprimiert; es kann aber auch über dem Resistenzlevel einer Pflanze, die das Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 exprimiert, liegen. Der Ausdruck Mutieren kann hierbei als eine vom Menschen durchgeführte
Änderung der genetischen Sequenz (Mutation) verstanden werden. Beispiele hierfür sind, dass Pflanzen, Pflanzenzellen oder Pflanzenteile einer hohen Dosis von chemischen, radiologischen oder anderen Mutagensien ausgesetzt werden und anschließend auf Mutanten selektiert wird. Alternativ kann das Mutieren auch durchgeführt werden zum Beispiel mit Hilfe von Tilling, TALE-Nukleasen, Zink-Finger-Nukleasen oder einem
CRISPR/Cas System oder durch Fusion, Insertion, Deletion oder Austausche in der DNA- Sequenz oder der Aminosäuresequenz. Zur Durchführung des Schritts des Mutierens erhält der Fachmann aus bekannten Stands der Technik eine ausreichende technische Anleitung zum Handeln. Bevorzugt führt das Mutieren des Resistenz-vermittelnden Gens des HTN1- Locus aus Pepitilia zu mindestens einem Aminosäureaustausch, mindestens zwei
Aminosäureaustauschen, mindestens drei Aminosäureaustauschen, mindestens fünf oder mehr Aminosäureaustauschen. Im Falle von mehreren Aminosäureaustauschen können diese auch auf unterschiedlichen Genallelen des Resistenz-vermittelnden Gens des HTN1 - Locus aus Pepitilia vorliegen, d.h. die Mutation kann heterozygot aber auch homozygot vorliegen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens zur Modifikation des
Resistenzphänotyps einer Pflanze führt das Mutieren des Resistenz-vermittelnden Gens des HTN1 -Locus aus Pepitilia zu einer Punktmutation in der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 an der Position 1365 mit dem Basenaustausch eines G zu einem A oder an der Position 1490 mit dem Basenaustausch eines G zu einem A. Weiterhin betrifft diese Ausgestaltung auch das Mutieren, das zu einem Aminosäureaustausch in der
Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 an Position 455 von M (Methionin) zu I
(Isoleucin) oder an Position 497 von G (Glycin) zu E (Glutaminsäure) führt. In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens führt das Mutieren des Resistenzvermittelnden Gens des HTN1-Locus aus Pepitilla zu einer Punktmutation, welche einen Aminosäureaustausch zur Folge hat, in der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 zwischen der Position 1365 und der Position 1490 oder die Ausgestaltung betrifft das Mutieren, das zu einem Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 zwischen Position 455 und Position 497 führt.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, insbesondere einer Maispflanze, mit einem modifizierten Resistenzphänotyp gegenüber dem Pathogen Helminthosporium turcicum, welches einen Schritt des Mutierens des Resistenz-vermittelnden Gens des HTN1 -Locus aus Pepitilla oder eines Genallele davon in mindestens einer Zelle der Pflanze oder in mindestens einer Zelle, aus welcher die Pflanze regeneriert wird, umfasst. Weiterhin kann das Verfahren somit einen Schritt der
Regeneration von mindestens einer Pflanze aus der mindestens einen mutierten Zelle und Selektion der regenerierten Pfalnezn auf Basis des modifizierten Resistenzphänotyps gegenüber dem Pathogen Helminthosporium turcicum. Vorzugsweise kodiert das
Resistenz-vermittelnde Gen des HTN1 -Locus aus Pepitilla für ein Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 oder ein Homolog eines Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2, welches unter
Befallsbedingungen mit H. turcicum einen Resistenzphänotyp mit den HTN1 -typischen Merkmalen bewirkt. Das Resistenz-vermittelnde Gen des HTN1 -Locus aus Pepitilla oder eines Genallele davon kann transgen oder endogen im Genom der Pflanze vorliegen. Ein modifizierter Resistenzphänotyp kann eine Änderung der Pathogen-Rassenspezifität und/oder eine Änderung des Resistenzlevels gemessen als Boniturnote basierend auf phänotypische Kennzeichen wie beispielsweise betroffene Blattfläche (siehe Tabelle 3) öder gemessen als AU DPC-Wert (siehe Beispiel 1 C) meinen. Bevorzugt liegt das
Resistenzlevel des modifizierten Resistenzphänotyps zwischen dem Resistenzlevel einer Pflanze, die das nicht-mutierte Resistenz-vermittelnde Gen des HTN1 -Locus aus Pepitilla exprimiert, und dem Resistenzlevel einer isogenen Pflanze, die das Resistenz-vermittelnde Gen des HTN1-Locus aus Pepitilla nicht exprimiert; es kann aber auch über dem
Resistenzlevel einer Pflanze, die das nicht-mutierte Resistenz-vermittelnde Gen des HTN1 - Locus aus Pepitilla exprimiert, liegen. Besonders bevorzugt liegt das Resistenzlevel zwischen dem Resistenzlevel einer Pflanze, die das Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 exprimiert, und dem Resistenzlevel einer isogenen Pflanze, die das Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 nicht exprimiert; es kann aber auch über dem Resistenzlevel einer Pflanze, die das Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 exprimiert, liegen. Der Ausdruck Mutieren kann hierbei als eine vom Menschen durchgeführte Änderung der genetischen Sequenz
(Mutation) verstanden werden. Beispiele hierfür sind, dass Pflanzen, Pflanzenzellen oder Pflanzenteile einer hohen Dosis von chemischen, radiologischen oder anderen
Mutagensien ausgesetzt werden und anschließend auf Mutanten selektiert wird. Alternativ kann das Mutieren auch durchgeführt werden zum Beispiel mit Hilfe von Tillingj TALE- Nukleasen, Zink-Finger-Nukleasen oder einem CRISPR/Cas System oder durch Fusion, Insertion, Deletion oder Austausche in der DNA-Sequenz oder der Aminosäuresequenz. Zur Durchführung des Schritts des Mutierens erhält der Fachmann aus bekannten Stands der Technik eine ausreichende technische Anleitung zum Handeln. Bevorzugt führt das Mutieren des Resistenz-vermittelnden Gens des HTN1 -Locus aus Pepitilla zu mindestens einem Aminosäureaustausch, mindestens zwei Aminosäureaustauschen, mindestens drei Aminosäureaustauschen, mindestens fünf oder mehr Aminosäureaustauscheh. Im Falle von mehreren Aminosäureaustauschen können diese auch auf unterschiedlichen
Genallelen des Resistenz-vermittelnden Gens des HTN1 -Locus aus Pepitilla vorliegen, d.h. die Mutation kann heterozygot aber auch homozygot vorliegen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens zur Herstellung einer Pflanze mit einem modifizierten Resistenzphänotyp gegenüber dem Pathogen Helminthosporium turcicum führt das Mutieren des Resistenz-vermittelnden Gens des HTN1 -Locus aus Pepitilla zu einer Punktmutation in der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 an der Position 1365 mit dem Basenaustausch eines G zu einem A oder an der Position 1490 mit dem
Basenaustausch eines G zu einem A. Weiterhin betrifft diese Ausgestaltung auch das Mutieren, das zu einem Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 an Position 455 von M (Methionin) zu I (Isoleucin) oder an Position 497 von G
(Glycin) zu E (Glutaminsäure) führt. In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens führt das Mutieren des Resistenz-vermittelnden Gens des HTN1-Locus aus Pepitilla zu einer Punktmutätion, welche einen Aminosäureaustausch zur Folge hat, in der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 zwischen der Position 1365 und der Position 1490 oder die Ausgestaltung betrifft das Mutieren, das zu einem Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 zwischen Position 455 und Position 497 führt. Die Erfindung schließt ebenfalls Pflanzen oder einen Teil davon ein, welche durch ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit einem modifizierten Resistenzphänotyp gegenüber dem Pathogen Helminthosporium turcicum hergestellt werden können.
Die Erfindung erfasst ferner eine Pflanze oder einen Teil davon, welche eine Mutation in dem Resistenz-vermittelnden Gen des HTN1 -Locus aus Pepitilla oder eines Genallele davon aufweist. Vorzugsweise führt die Muation zu einem modifizierten Resistenzphänotyp wie oben beschrieben. Vorzugsweise kodiert das Resistenz-vermittelnde Gen des HTN1- Locus aus Pepitilla für ein Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 oder ein Homolog eines Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2, welches unter Befallsbedingungen mit H. turcicum einen Resistenzphänotyp mit den HTN1 -typischen Merkmalen bewirkt. Das Resistenzvermittelnde Gen des HTN1 -Locus aus Pepitilla oder eines Genallele davon kann transgen oder endogen im Genom der Pflanze vorliegen. In einer bevorzugten Ausgestaltung der Pflanze oder des Teils davon ist die Mutation eine Punktmutation in der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 an der Position 1365 mit dem Basenaustausch eines G zu einem A oder an der Position 1490 mit dem Basenaustausch eines G zu einem A. Weiterhin betrifft diese Ausgestaltung auch eine Mutation, die zu einem Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 an Position 455 von M (Methionin) zu I
(Isoleucin) oder an Position 497 von G (Glycin) zu E (Glutaminsäure) führt. In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Pflanze oder des Teils davon ist die Mutation des Resistenz-vermittelnden Gens des HTN1-Locus aus Pepitilla eine Punktmutation, welche einen Aminosäureaustausch zur Folge hat, in der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 zwischen der Position 1365 und der Position 1490 oder die Ausgestaltung betrifft eine Mutation, die zu einem Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 zwischen Position 455 und Position 497 führt.
Einige der in dieser Anmeldung verwendeten Begriffe werden nachfolgend näher erläutert:
Der Begriff "Allel" betrifft eine von zwei oder mehr Nukleotidsequenzen an einem
bestimmten Locus im Genom. Ein erstes Allel findet sich auf ejnem Chromosom, ein zweites auf einem zweiten Chromosom an derselben Position. Unterscheiden sich die beiden Allele liegen diese heterozygot vor, sind es dieselben Allele liegen sie homozygot vor. Verschiedene Allele eines Gens (Genallele) unterscheiden sich in mindestens einem SNP. Je nach Kontext der Beschreibung meint ein Allel auch nur ein einzelnes SNP, das beispielsweise eine Unterscheidung zwischen Donor von HTN1 (Pepitilla) und rekurrentem Elter erlaubt.
Der Ausdruck "Chromosomfragment" ist ein spezifischer chromosomaler DNA-Abschnitt eines bestimmten Chromosoms, der mindestens ein Gen umfasst. Ein integriertes
Chromosomfragment stammt aus einer Donor-Quelle. Im Sinne der Erfindung kann die sequenzielle Abfolge der Gene innerhalb eines integrierten Chromosomfragments derjenigen Abfolge entsprechen, wie sie im ursprünglichen Chromosomfragment der Donor- Quelle vorliegt. Somit kann das integrierte Chromosomfragment über die gesamte Länge unverändert zum entsprechenden Chromosomfragment in der Donor-Quelle vorliegen. Ein Chromosomfragment oder ein Teil davon kann einen spezifischen "Haplotyp" darstellen, wobei das Chromosomfragment dann bestimmte SNPs aufweist, durch die der Haplotyp auch eindeutig spezifiziert ist und identifiziert werden kann.
Die Begriffe "distal" und "proximal" bezeichnen die Position einer chromosomalen Intervalls bzw. eines genetischen Abschnitts in Relation zu einem bestimmten Bezugsort
(beispielsweise einem bestimmten Polynukleotid, einem anderen chromosomalen Intervall oder einem Gen) auf einem Gesamtchromosom, wobei distal bedeutet, dass das Intervall oder der Abschnitt auf der dem Chromosom-Centromer abgewandten Seite des
Bezugsortes lokalisiert ist, und proximal bedeutet, dass das Intervall oder der Abschnitt auf der dem Chromosom-Centromer zugewandten Seite des Bezugsortes lokalisiert ist.
"Eng gekoppelt" oder„eng verknüpft" meint zwei Loci, zwei Intervalle, zwei genetische Abschnitte oder zwei Marker (Markerloci), welche weniger als 15 cM, weniger als 12 cM, welche weniger als 10 cM, welche weniger als 8 cM, welche weniger als 7 cM, welche weniger als 6 cM, welche weniger als 5 cM, welche weniger als 4 cM, welche weniger als 3 cM, welche weniger als 2 cM, welche weniger als 1 cM, welche weniger als 0,5 cM, welche weniger als 0,2 cM, welche weniger als 0,1 cM, festgelegt durch die IBM2 neighbors 4 genetic map öffentlich zugänglich auf der Maize GDB Website, voneinander entfernt sind.
Der Begriff "Ertrag" im Sinne der vorliegenden Erfindung betrifft die Produktivität pro
Flächeneinheit eines bestimmten Pflanzenproduktes mit kommerziellem Wert.
Beispielsweise wird der Ertrag von Mais gewöhnlich gemessen in metrischen Tonnen Samen oder Korn pro Hektar (ha) und Saison oder in metrischen Tonnen Trockenbiomasse pro Hektar (ha) und Saison. Sofern nicht ausdrücklich anders angegeben oder spezifiziert, kann der Ertrag die absolute Frisch- oder Trockenmasse, die relative Frisch- oder
Trockenmasse, den Silageertrag (auch Silomaisertrag oder Total Dry Matter Yield genannt) oder den Körnerertrag betreffen. Der Ertrag wird durch genetische und umweltbedingte Faktoren beeinflusst und setzt sich prinzipiell aus zahlreichen agronomischen
Eigenschaften zusammen, die auf genetischen Elementen beruhende Merkmale einer Pflanze darstellen und im Verlauf der Saison zum letztendlichen Ertrag beitragen. Zu diesen individuellen agronomischen Eigenschaften gehören beispielsweise Saataufgang, vegetative Vitalität, Stresstoleranz, Krankheitsresistenz oder -toleranz, Herbizidresistenz, Verzweigungsneigung, Blühzeitpunkt, Samenansatz, Samendichte, Standfestigkeit und Lagerneigung, Druschfähigkeit (gleichmäßige Abreife), etc.
Der Ausdruck„genetischer Abschnitt mit" einem näher spezifizierten Intervall ist zu verstehen als ein genetischer Abschnitt, welcher das näher spezifizierte Intervall einschließt oder umfasst, d.h. nicht beschränkt ist auf das näher spezifizierte Intervall. Zum Beispiel meint ein genetischer Abschnitt mit dem fünften Intervall zwischen einem Marker in der achten Markerregion M8, welche durch die Marker MA0022 und MA0013 flankiert ist, und einem Marker in der sechsten Markerregion M6, welche durch die Marker PZE-108107671 und SYN4196 flankiert ist, dass der genetische Abschnitt das fünfte Intervall umfasst und der genetische Abschnitt zwischen einem Marker in der achten Markerregion M8, welche durch die Marker MA0022 und MA0013 flankiert ist, und einem Marker in der sechsten Markerregion M6, welche durch die Marker PZE-108107671 und SYN4196 flankiert ist, lokalisiert ist.
Unter„Hybridisieren" oder„Hybridisierung" wird ein Vorgang verstanden, bei dem sich ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül an einen weitestgehend komplementären
Nukleinsäurestrang anlagert, d.h. mit diesem Basenpaarungen eingeht. Standardverfahren zur Hybridisierung sind beispielsweise in Sambrook et al. 2001 beschrieben. Vorzugsweise wird darunter verstanden, dass mindestens 60%, weiter bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80% oder 85%, besonders bevorzugt 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% der Basen des Nukleinsäuremoleküls eine Basenpaarung mit dem
weitestgehend komplementären Nukleinsäurestrang eingehen. Die Möglichkeit einer solchen Anlagerung hängt von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen ab. Der Begriff„Stringenz" bezieht sich auf die Hybridisierungsbedingungen. Hohe Stringenz ist dann gegeben, wenn eine Basenpaarung erschwert ist, niedrige Stringenz, wenn eine Basenpaarung erleichtert ist. Die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen hängt beispielsweise von der Salzkonzentration bzw. lonenstärke und der Temperatur ab.
Generell kann die Stringenz durch eine Erhöhung der Temperatur und/oder eine
Erniedrigung des Salzgehaltes erhöht werden. Unter„stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung überwiegend nur zwischen homologen Nukleinsäuremolekülen stattfindet. Der Begriff„Hybridisierungsbedingungen" bezieht sich dabei nicht nur auf die bei der eigentlichen Anlagerung der Nukleinsäuren herrschenden Bedingungen, sondern auch auf die bei den anschließenden Waschschritten herrschenden Bedingungen. Stringente
Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise Bedingungen, unter denen überwiegend nur solche Nukleinsäuremoleküle hybridisieren, die mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95% Sequenzidentität aufweisen. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind
beispielsweise: Hybridisieren in 4 x SSC bei 65 °C und anschließendes mehrfaches
Waschen in 0,1 x SSC bei 65 °C für insgesamt etwa 1 Stunde. Der hier verwendete Begriff "stringente Hybridisierungsbedingungen" kann auch bedeuten: Hybridisieren bei 68 °C in 0,25 M Natriumphosphat, pH 7,2, 7 % SDS, 1 mM EDTA und 1 % BSA für 16 Stunden und anschließendes zweimaliges Waschen mit 2 x SSC und 0,1 % SDS bei 68 °C. Bevorzugt findet eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen statt.
Der Begriff„Intervall" oder„chromosomales Intervall" meint einen durchgängigen linearen Abschnitt auf einer genomischen DNA, welcher in einem einzelnen Chromosom in planta oder auf einem Chromosomfragment vorliegt und welcher gewöhnlicherweise durch die Angabe von zwei Markern, welche die Endpunkte des Intervalls zur distalen und proximalen Seite hin darstellen, definiert ist. Dabei können die Marker, die das Intervall endständig definieren selbst auch Teil des Intervalls sein. Weiterhin können zwei unterschiedliche Intervalle auch überlappen. In der Beschreibung wird ein Intervall durch die Angabe „zwischen Marker A und Marker B" spezifiziert. Ein endständiger Marker eines Intervalls kann auch in einer definierten Markerregion zu einer Seite des Intervalls lokalisiert sein. Eine Markerregion wird dann durch die Angabe von zwei flankierenden Markern definiert und stellt einen chromosomalen Abschnitt dar, auf dem neben den flankierenden Markern noch weitere Marker liegen können. Flankierende Marker bestimmen die Endpunkte einer Markerregion und sind selbst noch Teil der Markerregion. Sind beide endständigen Marker eines Intervalls Marker in unterschiedlichen Markerregionen zu beiden Seiten eines
Intervalls, wird in der Beschreibung ein Intervall durch die Angabe„zwischen einem Marker in einer Markerregion X, welche durch die Marker C und D flankiert ist, und einem Marker in einer Markerregion Y, welche durch die Marker E und F flankiert ist" spezifiziert. Eine Markerregion kann sich über bis zu 500.000 Baasenpaare (bp) erstrecken, kann bevorzugt zwischen 100.000 und 400.000 bp groß sein oder kann besonders bevorzugt zwischen 140.000 und 315.000 bp groß sein.
Unter "Introgression" versteht man im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Übertragung von mindestens einem gewünschten Genallel auf einem genetischen Locus von einem genetischen Hintergrund in einen anderen. Beispielsweise kann eine
Introgression eines gewünschten Genallels an einen spezifischen Locus auf einen
Nachkommen durch sexuelle Kreuzung zwischen zwei Eltern derselben Spezies übertragen werden. Alternativ kann zum Beispiel die Übertragung eines Genallels auch durch
Rekombination zwischen zwei Donorgenomen in einem fusionierten Protoplasten auftreten, wobei mindestens ein Donor-Protoplast das gewünschte Genallel in seinem Genom trägt. In jedem Fall können die Nachkommen, die dann das gewünschte Genallel umfassen, anschließend wiederholt mit einer Linie, die einen vorzüglichen genetischen Hintergrund aufweist, rückgekreuzt und auf das gewünschte Genallel selektiert werden. Das Ergebnis ist eine Fixierung des gewünschten Genallels in einem ausgewählten genetischen
Hintergrund.
Unter einem„isolierten Nukleinsäuremolekül" oder„isolierten Polynukleotid" wird ein aus seiner natürlichen bzw. ursprünglichen Umgebung herausgelöstes Nukleinsäuremolekül oder Polynukleotid verstanden. Der Begriff umfasst auch ein synthetisch hergestelltes Nukleinsäuremolekül. Unter einem„isolierten Polypeptid" wird ein aus seiner natürlichen bzw. ursprünglichen Umgebung herausgelöstes Polypeptid verstanden. Der Begriff umfasst auch ein synthetisch hergestelltes Polypeptid.
Unter einer "Pathogeninfektion" ist der früheste Zeitpunkt zu verstehen, zu dem ein
Pathogen mit einem pflanzlichen Wirtsgewebe interagiert. Beispielsweise gehören bei Pilzen wie Ascomyceten oder bei Öomyceten das Auswachsen von Hyphen oder die
Bildung von spezifischen Infektionsstrukturen wie Penetrationshyphen und Appressorien. Im Detail kann die Infektion durch Helminthosporium turcicum bereits mittels diverser Färbetechniken (z.B: Trypan-Blau) untersucht (Chung et al., BMC Plant Biology 10 (2010), 103; Walsh et al. (2008), Posterpräsentation P 192, 50th Maize Genetics Conference in Washington D.C.).
„Donor Pepitilla",„Akzession Pepitilla" oder„Pepitilla" meint neben der Landrasse Pepitilla selbst auch andere Maisgenotypen, in deren Genom, insbesondere auf Chromosom 8 bin 5 oder 6, eine Introgression des /-/7 V7-Resistenzlocus bevorzugt aus Pepitilla inseriert wurde. Solche sind beispielsweise W22Htn (z.B. Bar-Zur et al.,1998), H6314Hfn (z.B. Bar-Zur et al.,1998), B73HtN (z.B. Shimoni et al., Journal of Phytopathology 131 :4 (1991 ), 315-321 ), B68HtN und A632Hf/V (z.B. Carson, Plant Disease 79 (1995), 717-720) und A619HW (z.B. Stankovic et al, Genetika 39:2 (2007), 227 -240). Weiterhin schließt Pepitilla jede
Resistenzquelle, welche den Resistenzphänotyp mit den HTN1 -typischen Merkmalen nach Introgression in eine anfällige Maislinie/Maispflanze vermitteln. Zu diesen HTN1 -typischen Merkmalen gehören beispielsweise verzögertes Einsetzen der Sporulation, verminderte Entwicklung von Läsionen, Entwicklung von kleineren Läsionen, reduzierte
Sporulationszonen und/oder keine oder nur vereinzelte chlorotisch-nekrotische Läsionen.
Ein "Locus" ist eine Position auf einem Chromosom, wo sich ein oder mehrere Gene befinden, welche ein agronomisches Merkmal verursachen oder beeinflussen.
Insbesondere meint Locus hier den HTN1-Resistenzlocus, welcher Resistenz gegenüber den Pathogen Helminthosporium turcicum bzw. mindestens gegenüber eine Rasse von Helminthosporium turcicum vermittelt.
Eine„Maispflanze" ist eine Pflanze der Spezies Zea mays sowie deren Subspezies wie beispielsweise Zea mays ssp. mays, Zea mays ssp. mexicana oder Zea mays ssp.
parviglumis ve rsta n d e n .
Ein "Marker" ist eine Nukleotidsequenz, die als Bezugs- oder Orientierungspunkt verwendet wird. Ein Marker zum Erkennen eines Rekombinationsereignisses sollte geeignet sein, Unterschiede oder Polymorphismen innerhalb einer pflanzlichen Population zu
überwachen. Für Marker finden sich diese Unterschiede auf DNA-Ebene und sind beispielsweise Polynukleotidsequenzunterschiede wie zum Beispiel SSRs (simple sequence repeats), RFLPs (restriction fragment length polymorphisms), FLPs (fragment length polymorphisms) oder SNPs (Single nueleotide polymorphisms). Die Marker können von genomischen oder exprimierten Nukleinsäuren wie beispielsweise gespleißter RNA, cDNA oder ESTs abgeleitet sein und können sich auch auf Nukleinsäuren beziehen, die als Sonden oder Primer-Paare eingesetzt werden und als solche geeignet sind, ein
Sequenzfragment unter Verwendung PCR-basierter Verfahren zu amplifizieren. Marker, welche genetische Polymorphismen zwischen Teilen einer Population betreffen, können mittels etablierter Verfahren aus dem Stand der Technik nachgewiesen werden (An
Introduction to Genetic Analysis. 7th Edition, Griffiths, Miller, Suzuki et al., 2000). Dazu gehören z.B.: DNA-Sequenzierung, PCR-basierte, sequenzspezifische Amplifikation, Nachweis von RFLPs, Nachweis von Polynukleotidpolymorphismen mittels Allel- spezifischer Hybridisierung (ASH), Detektion von SSRs, SNPs oder AFLPs. Darüber hinaus sind auch Verfahren zur Detektion von ESTs (expressed sequence tags) und RAPD (randomly amplified Polymorphie DNA) bekannt. Je nach Kontext kann der Begriff Marker in der Beschreibung auch eine spezifische Chromosomposition in dem Genom einer Spezies, wo ein spezifischer Marker (z.B. SNP) gefunden werden kann, meinen. Ein solche Marker- Position kann genutzt werden, um die Anwesenheit eines gekoppelten Locus zu verfolgen, z.B. ein gekoppelter Locus, der zur Expression eines bestimmten phänotypischen
Merkmals beiträgt (z.B. HTN1 oder Linkage Drag). Beispielsweise kann der Marker-Locus auch genutzt werden, um die Segregation von Allelen an einem Locus (QTL oder
Einzelgen), die genetisch oder physikalisch eng gekoppelt sind mit dem Marker-Position, zu beobachten.
"Operativ verknüpft" meint verbunden in einem gemeinsamen Nukleinsäuremolekül, in einer Weise, dass die verbundenen Elemente derart zueinander positioniert und orientiert sind, dass eine Transkription des Nukleinsäuremolekül stattfinden kann. Eine DNA, welche operativ mit einem Promotor verknüpft ist, steht unter der transkriptioneilen Kontrolle dieses Promotors.
Pflanzliche "Organe" meinen beispielsweise Blätter, Sprossachse, Stamm, Wurzeln, vegetative Knospen, Meristeme, Embryos, Antheren, Ovula oder Früchte. Pflanzliche "Teile" meinen einen Zusammenschluss mehrerer Organe, z.B. eine Blüte oder ein Samen, oder einen Teil eines Organs, z.B. einen Querschnitt aus der Sprossachse. Pflanzliche "Gewebe" sind zum Beispiel Kallusgewebe, Speichergewebe, meristematische Gewebe, Blattgewebe, Sprossgewebe, Wurzelgewebe, Pflanzentumorgewebe oder reproduktives Gewebe. Unter pflanzlichen "Zellen" sind beispielsweise isolierte Zellen mit einer Zellwand oder Aggregate davon oder Protoplasten zu verstehen.
Eine "Pflanze" im Sinne der Erfindung kann, sofern nicht anders angegeben von jeder Spezies aus den dikotyledonen, monokotyledonen und gymnospermen Pflanzen sein.
Vorzugsweise sind Pflanzen monokotyl und sind in Agrikultur oder Hortikultur oder zur Erzeugung von Bioenergie (Bioethanol, Biogas etc.) interessant. Hierzu zählen beispielhaft Gossypium sp., Zea mays, Brachypodium distaehyon, Triticum sp. , Hordeum vulgare, Oryza sativa, Sorghum sp.-, Musa sp., Saccharum officinarum, Seeale cereale, Avena sp., Rasen- und Futtergras. Eine erfindungsgemäße Pflanze ist vorzugsweise eine Pflanze der Gattung Zea, insbesondere der Spezies Zea mays, oder Sorghum. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Begriff "regulatorische Sequenz" eine Nukleotidsequenz, welche die Spezifität und/oder die Expressionsstärke beeinflusst, zum Beispiel indem die regulatorische Sequenz eine bestimmte
Gewebespezifität vermittelt. Eine solche regulatorische Sequenz kann stromaufwärts des Transkriptionsinitiationspunkts eines Minimalpromotors, aber auch stromabwärts davon wie beispielsweise in einer transkribierten aber nicht translatierten Leader-Sequenz oder innerhalb eines Introns lokalisiert sein.
Der Ausdruck "Resistenz" oder "resistent" gegenüber einem Pathogen ist als die
Widerstandsfähigkeit einer Pflanze oder pflanzlichen Zelle gegenüber die schädlichen Einflüsse des Pathogens zu verstehen und erstreckt sich von einer Verzögerung in der Krankheitsentwicklung bis hin zu einer kompletten Unterdrückung der
Krankheitsentwicklung. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist eine
Pflanze/Pflanzenzelle resistent oder besitzt eine Pflanze/Pflanzenzelle eine Resistenz gegenüber dem Pathogen Helminthosporium turcicum (H. turcicum oder Ht), d.h. somit gegenüber der Blattkrankheit Northern Com Leaf Blight (NCLB). Die Resistenz wird vermittelt durch ein oder mehrere Proteine, die durch ein Gen oder durch Gene
(resistenzvermittelnden Gene) aus der Akzession Pepitilla kodiert werden. Die Resistenz kann vollständig oder partiell sein und kann Pathogenrassen-spezifisch oder nicht- Pathogenrassen-spezifisch ausgeprägt sein. Im Fall einer Pathogenrassen-spezifischen Resistenz können zu den virulenten Rassen von Helminthosporium turcicum beispielsweise N, 1 N, 2N, 23N oder 123N, zu den avirulenten Rassen beispielsweise 0, 1 , 2, 3, 12, 23 oder 123 gehören. Eine vermittelte Resistenz kann eine neu-erworbene Resistenz sein oder die Erhöhung einer bereits existierenden partiellen Resistenz.
Eine "Transgene Pflanze" bezieht sich auf einen Pflanze, in dessen Genom mindestens ein Polynukleotid, vorzugsweise ein heterologes Polynukleotid, integriert ist. Bevorzugt ist das Polynukleotid stabil integriert, was bedeutet, dass das integrierte Polynukleotid in der Pflanze stabil erhalten bleibt, exprimiert wird und auch stabil an die Nachkommen vererbt werden kann. Das stabile Einbringen eines Polynukleotids in das Genom einer Pflanze schließt auch die Integration in das Genom einer Pflanze der vorhergehenden
Parentalgeneration mit ein, wobei das Polynukleotid stabil weitervererbt werden kann. Der Begriff "heterolog" bedeutet, dass das eingebrachte Polynukleotid beispielsweise von einer Zelle oder einem Organismus mit einem arideren genetischen Hintergrund derselben Spezies oder einer anderen Spezies stammt, oder homolog ist zu der prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle, dann aber in einer unterschiedlichen genetischen Umgebung lokalisiert ist und sich so von einem eventuell natürlicherweise vorhandenen
korrespondierenden Polynukleotid unterscheidet. Ein heterologes Polynukleotid kann zusätzlich zu einem entsprechenden endogenen Gen vorhanden sein.
Ausgestaltungen und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in
exemplarischer Weise mit Bezug auf die angehängten Figuren und Sequenzen
beschrieben:
Figur 1 : Errechneter QTL-Bereich von 23,1 cM auf Chromosom 8 mittels 8 Markern in 528 F2-Individuen der Kreuzung RP1 x RP1 HTN1 . Der schwarze Balken (HtN) zeigt das con /dence-lntervall an. Positions-Angaben der Marker in cM.
Figur 2: Silageertrag-Versuch über 5 Standorten in Deutschland und in zwei
Wiederholungen mit dem rekurrenten Elter RP3 und der A-Version des Donorfragments aus B37HTN1 (RP3HTNA) und der K-Version des Donorfragments aus B37HTN1 (RP3HTNK). Balken geben signifikante Unterschiede gemäß t-Test mit p=0, 05 wieder.
Figur 3: Beschreibung der Markerregionen M1 bis M6, welche die chromosomalen
Intervalle (Int.1 bis lnt.5) definieren, die in den Introgressionslinien das Resistenzvermittelnde Polynukleotid aufweisen und im vom Donor-stammenden
Chromosomfragment den Linkage Drag tragen. Chromosomale Abschnitte des Donor .Pepitilla' sind gepunktet, solche des rekurrenten Elter (ohne Linkage Drag) sind diagonal gestreift dargestellt. Intervall 1 (lnt.1) umfasst den Resistenzlocus HTN1 , Intervall 2 (lnt.2) umfasst Sequenzbereiche, welche im Donor für den Linkage Drag des Blühzeitpunkts verantwortlich sind, Intervalle 4 und 5 (lnt.4 und lnt.5) umfassen Sequenzbereiche, welche im Donor für den Linkage Drag des Silageertrages verantwortlich sind.
Figur 4: BAC-contig auf seiner RP4H†N1 BAC-Bank mit entsprechendem Sequenz scaffold und Gen-Annotationen. Kandidatengene sind als karierte Kästchen wiedergegeben.
Schwarze Pfeile Stellen weitere annotierte Gene dar, welche keine Kandidatengene der HTN-Resistenz sind.
1 Phänotypisierungexperimente
A) Durchführung von Feld-Versuchen zur Bestimmung der HT-Resistenz unter natürlicher und künstlicher Beimpfung/Infektion und des Blühzeitpunkts: An einem Standort wurden pro zu untersuchenden Mais-Genotyp jeweils mindestens 20 Individuen in einer Reihe ausgepflanzt. Die Inokulation erfolgte natürlich oder künstlich. Die natürliche Beimpfung/Infektion erfolgt durch natürlich auftretende Sporen von H. turcicum. Die künstliche Beimpfung/Infektion erfolgte mittels infiziertem und gemahlenem Blattmaterial, welches auf die zu untersuchenden Pflanzen gegeben wurde. Letztere Art der Inokulation ermöglichte die Simulation eines vergleichbaren H. turcicum-BefaWs in unterschiedlichen Versuchsjahren und an unterschiedlichen
Standorten unabhängig von den jeweils vorherrschenden natürlichen
Befallsbedingungen. Als Kontroll-Genotypen wurden entsprechend der untersuchten Kreuzungspopulation ein anfälliger Elter und ein Elter mit HtN1 -Introgression aus dem Donor B37HTN1 kultiviert. Die Bonitur des Merkmals HT-Resistenz fand zu mindestens drei Zeitpunkten während der Vegetationsperiode statt. Das einheitlich verwendete Boniturschema ist in Tabelle 3 wiedergegeben.
Der Donor B37HTN1 als Quelle der HT-Resistenz wurde in verschiedene genetische Hintergründe aus Elite-Linien mit unterschiedlichen stark ausgeprägten Anfälligkeit gegenüber H. turcicum eingekreuzt und nahisogene Linien entwickelt, welche sich von den anfälligen Ausgangslinien im Wesentlichen nur durch die Introgression aus
B37HTN1 unterscheiden. In Phänotypisierungsexperimenten wurden nach künstlicher Inokulation wie oben beschrieben solche Linien selektiert, welche durch Einbringen der Resistenz-vermittelnden Introgression aus B37HTN1 eine Verbesserung der HT- Resistenz um mindestens 2 bis 3 Boniturnoten, bevorzugt von 3 bis 4 Boniturnoten aufzeigten. Beispielhaft wird die vorliegende Erfindung im Weiteren an den beiden selektierten rekurrenten Eltern RP1 und RP3 näher beschrieben. Die Ergebnisse der genannten Phänotypisierungsexperimente sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Der rekurrente Elter RP1 ohne Introgression zeigte durchschnittliche Boniturnoten von 7 bis 9, die sich durch die Introgression aus B37HTN1 um 3 bis 4 Noten verbessert wurden. Der rekurrente Elter RP3 zeigte Boniturnoten zwischen 4 und 6 ohne Introgression und eine Verbesserung um 2 bis 3 Boniturnoten durch die Introgression. Der rekurrente Elter RP4 zeigte eine Boniturnoten von 6 ohne Introgression und eine Verbesserung um 2-3 Boniturnoten durch die Introgression.
Tabelle 5: Phänotypisierungsdaten zur HT-Resistenz aus Genotypen RP1 , RP3, und RP4 mit und ohne Resistenz-vermittelnder Introgression aus B37HTN1 (Boniturnoten wurden gemäß Schema aus Tabelle 3 bestimmt).
Genotyp Durchschnittliche Verbesserung der
Boniturnoten HT-Resistenz mit (n=20) ohne Introgression aus
Introgression aus B37HTN1
B37HTN1
RP1 7 bis 9 3 bis 4
RP3 4 bis 6 2 bis 3
RP4 6 2 bis 3
Neben der HT-Resistenz wurde zudem für jeden Genotyp der Zeitpunkt der weiblichen und männlichen Blüte in Tagen nach Aussaat erfasst. Der Zeitpunkt der weiblichen Blüte ist durch das Auftreten von Narbenfäden, der männlichen Blüte durch das Auftreten der Rispe festgelegt. Die Ergebnisse sind unter Beispiel 3. B) näher ausgeführt.
B) Durchführung von Feld-Versuchen zur Bestimmung des Korn- und Silage-Ertrags:
Neben vorstehenden Daten zu HT-Resistenz und Blühzeitpunkt wurden Ertragsdaten für RP3, enthaltend unterschiedlich lange Resistenz-vermittelnde Introgressionsfragmente aus B37HTN1 bzw. Pepitilla, und für eine vergleichende Elite-Linie ermittelt. Die Linien RP3, RP3HTNA und RP3HTNK wurden mit einem Tester (Flintmais, interpool
Einfachkreuzung) des komplementären Genpools (Flintmais) bestäubt, um Saatgut für Testhybriden zu erzeugen. Diese Testhybriden wurden jeweils zweifach in einem
Feldversuch an fünf für den Maisanbau repräsentativen Standorten in Deutschland angebaut. Die Testhybriden sind an diese Anbauregion in Bezug auf die Reife gut angepasst. Der Feldversuch wurde in zwei Wiederholungen in 4-reihigen Parzellen mit 6 m Länge und 0,75 m Reihenabstand durchgeführt. Die Bestandsdichte betrug 9 Pflanzen je m2 in der ersten und 11 Pflanzen je m2 in der zweiten Wiederholung. Zum Zeitpunkt der Silomaisreife wurden nur die beiden mittleren Reihen jeder Parzelle geerntet, um Konkurrenzeffekte zu minimieren, Am Erntegut wurde das Gewicht je Parzelle und der Wassergehalt bestimmt, um den Silomaisertrag (auch Silageertrag oder Total Dry Matter Yield) und den Trockensubstanzgehalt (Total Dry Matter Content) zu berechnen.
C) Durchführung von Gewächshaus-Versuchen zur Bestimmung der HT-Resistenz: Es wurden 20 Individuen pro Genotyp in Töpfen angezogen. Als Kontrollen dienten je nach Kreuzung Genotypen eines anfälligen Elters und eines nah-isogenen Elters (NIL) mit Resistenz-vermittelnder Introgression aus B37HTN1. 14 Tagen nach Aussaat erfolgte eine künstliche Infektion (siehe oben). Nach weiteren 2 bis 3 Wochen
entwickelten sich erste Krankheitssymptome. Ab dem Zeitpunkt des Auftretens erster Symptome wurden alle zwei Tage die Bonituren des Merkmals HT-Resistenz sowie die Anzahl der Pflanzen mit Symptomen erfasst. Daraus wurde dann der AUDPC (area under disease progress curve) bestimmt. Die Befallshäufigkeit (in % / Zeit x Zeitraum) wurde für die Einteilung der untersuchten Pflanzen verwendet, wobei AUDPC von 0 - 100 resistent, 101 - 450 heterozygot, und > 450 anfällig entspricht.
Markerentwicklung für die HTN1 -Target-Region
Neben den Boniturversuchen wurde die Target-Region um den HT 1-Resistenzlocus auf Chromosom 8 (bin 8.06) in zahlreichen Genotypen mittels neuer und/oder optimierter molekularer Marker genauer untersucht und feinkartiert. Hierzu eingesetzte molekulare Marker wurden auf Grund von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNP) oder bereits öffentlich verfügbaren simple sequence repeat Marker (SSR) entwickelt:
Die DNA aus den Genotypen zur Anwendung der Marker wurde entweder mittels der Methode NucleoSpin 96 Plant II nach Herstellerangaben (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Deutschland) oder mittels der Methode Klear Gene DNA Extraction 384 (LGC Genomics GmbH, Deutschland) isoliert.
Die Primersequenzen der SSR-Marker waren bereits aus der öffentlichen Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists bekannt; die Primersequenzen der Marker bnlg1782, umc1960, bnlg240, umc1121 , bnlg1067 und umc1287, welche zur Untersuchung der Targetregion verwendet wurden, zusammen mit den vorgenommenen Modifikationen sind in Tabelle 6 zusammengefasst.
Tabelle 6: Primer Sequenzen der SSR Marker (NED: 2'-chloro-5'-fluoro-7',8'-fused phenyl- 1.4-dichloro-6-carboxyfluorescein; FAM: 6-carboxyfluorescein; M13: Kernsequenz der Phage M13)
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umc1287 123 keine 124 keine M13 + FAM
Der PCR-Reaktions-Mix von bnlg1782, umc1960, bnlg240, umc1121 und bnlg1067 umfasste 10 μΙ und bestand aus einer Einfach-Konzentration des 4x PufferB (Solis
BioDyne, Estland), 0,5 pmol des forward Primers, 0,5 pmol des reversen Primers, 10-30 ng DNA, 0,25 Units HotFirepol TAQ-Polymerase (Solis BioDyne, Estland). Der Reaktionsmix von umd 287 umfasste 10 μΙ und bestand aus einer Einfach-Konzentration des 4x PufferB (Solis BioDyne, Estland), 0,5 pmol des forward Primers, 2,5 pmol des reversen Primers, 0,3 pmol des zusätzlichen Primers M13, 10-30 ng DNA, 0,25 Units HotFirepol TAQ-Polymerase (Solis BioDyne, Estland).
Die PGR-Reaktion wurde mit einer anfänglichen Denaturierungszeit von 900 Sekunden bei 94 °C, einem Amplifikations-Zyklus von 25-40 Zyklen mit 15 Sekunden 94 °C, 30 Sekunden 50-55 °C und 120 Sekunden bei 72°C, und einem abschließenden Schritt für 300
Sekunden bei 72°C durchgeführt. Im Anschluss erfolgte eine 2 h Inkubation der PCR- Reaktion bei 65 °C. Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte auf einem ABI3730xl (Life Technologies™, USA) nach den Angaben des Herstellers für die Auftrennung von
Fragmenten von 50-400 bp.
Die SNP Marker wurden entweder (a) aus öffentlich verfügbaren Ressourcen, (b) aus einer vergleichenden Amplicon-Sequenzierung oder (c) aus einem Sequenz- Vergleich von BAC- Sequenzen aus RP4HTN1 (siehe Abschnitt Molekulare Analyse) und B73 Referenz-Genom AGPv02 (www.maizesequence.org) entwickelt und verwendet. (a) Aus der öffentlich verfügbare SNP Ressource des Mais Community 50K-lllumina- Chip (Ganal et al., 2011) wurden SNPs in KASP-Marker (LGC Genomics GmbH, Deutschland) umgewandelt. Dazu wurden neue Primer entwickelt, die im KASP- Marker-Assay die Amplifikation der entscheidenden Allele gewährleisteten (siehe Tabelle 4). Der gesamte Arbeitsablauf wurde mit der Kraken™ Software (LGC Genomics GmbH, Deutschland) durchgeführt. Für einen KASP-Marker-Assay wurden 5-20 ng DNA, 0,02 μΙ eines Oligo-Assay-Mixes (12 μΜ Primer Allele 1 (forward); 12 μΜ Primer Allele 2 (forward); 30 μΜ reverse Primer) und 1 ,5 μΙ eines IxKASPar Reagent Kits für 1536-Platten verwendet. Ein Standard-PCR-Setup bestand aus 94°C für 15 min, 10 Zyklen mit 94°C für 20 Sekunden, 61-55°C touch down für 1 Minute, 26 Zyklen mit 94°C für 20 Sekunden und 55°C für 1 Minute. Die Auswertung der Allele pro Genotyp wurde mittels der Kraken™ Software (LGC Genomics GmbH, Deutschland) durchgeführt.
(b) Die vergleichende Amplicon-Sequenzierung wurde mittels Sanger-Sequenzierung durchgeführt. Die Genotypen in der vergleichenden Sequenzierung umfassten jeweils den Donor B37HTN1 , sowie B37, RP1 , RP1 HTN1 , RP3, RP3HTN1
(Versionen A, B, K), RP4, RP4HTN1. Die DNA wurde aus vermahlenen Körnern mittels der CTAB-Methode (Maniatis et al., 1982) isoliert. Die Primersequenzen für die Amplicon-Sequenzierung sind in Tabelle 4 aufgelistet. Ein Standard-PCR- Protokoll für die Amplifikation der entsprechenden Bereiche bestand aus einer Denaturierung bei 94°C für 5 Minuten, 35 Zyklen mit jeweils 94°C für 1 Minute, 60°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten und einem abschließendem Schritt bei 72°C für 10 Minuten. Die PCR-Produkte wurden mit der Sanger-Methode (Sanger & Coulson, 1975) sequenziert. Die Sequenzauswertung erfolgte mit der DNAStar Lasergene Software (DNASTAR Inc., USA). Die detektierten Polymorphismen wurden wie unter (a) beschrieben in KASP-Marker umgewandelt.
(c) Die BAC-Sequenz-Contigs wurden mittels Blast-Algorithmus
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) gegen das B73 Referenz-Genom AGPv02 projiziert um Einzel-Nukleotid-Poiymorphismen (SNP) zu detektieren. Die
Polymorphismen wurden mit der Lasergene Software (DNASTAR Inc., USA) detektiert und sind zusammen mit den flankierenden Sequenzen in Tabelle 4 aufgeführt. Zu den flankierenden Sequenzen eines SNPs wurden Primer entwickelt und die identifizierten SNPs wie unter (a) beschrieben in KASP-Marker
umgewandelt. Lokalisierung des HTN1-Resistenzlocus auf Chromosom 8 durch Verwendung der SSR- Marker
A) Lokalisierung des HT 1-Resistenzlocus:
Der HT 1-Resistenzlocus aus den Donoren B37HTN1 wurde wie unter Beispiel 1.A) beschrieben in Elite-Linien eingekreuzt und mit Hilfe der SSR und SNP Marker aus Beispiel 2. auf Chromosom 8 (bin 8.06) lokalisiert (siehe Figur 1 ). NILs der Kreuzungen RP1 x RP1 HTN1 und RP3 x RP3HTN1 wurden an zwei Standorten über mehrere Jahre mit zwei Wiederholungen unter natürlichen Infektionsbedingungen gemäß
Boniturschema nach Tabelle 3 phänotypisiert. Die NILs zeigten im Mittel eine um 4 Boniturnoten verbesserte Resistenzantwort im Vergleich zur Originallinie. Die
Entwicklung der lokalen Läsionen auf den Blättern war um etwa 2 Wochen im Vergleich zum anfälligen Genotyp verschoben/ Eine QTL-Kartierung wurde mit 528 F2 Individuen (Kreuzung RP1 x RP1 HTN1) unter Verwendung von den 8 Markern (aus Figur 1 QTL Kartierung - Marker sind Tabellen 4 und 6 aufgeführt) durchgeführt. Der QTL-Bereich, weicher den HTN1-Resistenzlocus umfasst, wurde auf Chromosom 8 zwischen den Markern MA0002 und umc1287 in einem Bereich von 23,1 cM lokalisiert.
B) Einkreuzen des B37HTN1 Donor Fragmentes in eine Elite-Maislinien und Identifikation und Eliminierung des Linkage Drags für verspäteten Blühzeitpunkt:
Der Donor B37HTN1 wurde mit KWS.elite, einer Elite-Maislinie der KWS SAAT AG (Deutschland) gekreuzt und über fünf Generationen fortgesetzt mit KWS.elite rückgekreuzt. In jeder Rückkreuzungsgeneration wurden molekulare Marker genutzt um Pflanzen zu selektieren, die heterozygot für die HTN-Zielregion waren. Anschließend wurde eine selektierte Pflanze der fünften Rückkreuzungsgeneration fortgesetzt geselbstet und mit molekularen Markern wurden homozygote Pflanzen für die HTN- Zielregion identifiziert.
Diese Linien wurden in Feldversuchen an mehreren Standorten getestet. Dabei wurden für die Genotypen B37HTN1 , KWS.elite und KWS.elite. B37HTN1 wie unter Beispiel 1. beschrieben die phänotypischen Daten der HT-Resistenz und der Blühzeitpunkte erfasst. Die Genotypen mit HTN1-lntrogression zeigten die erwartete HT-Resistenz mit Boniturnoten von 1 bis 3, während die Ausgangs-Linie KWS.elite Boniturnoten von 5-7 erhielt. Unerwarteterweise wies die KWS.elite. B37HTN1 zudem im Vergleich zu
KWS.elite einen um mindestens 2 Tage verschobenen Zeitpunkt sowohl der weiblichen als auch der männlichen Blüte auf. Diese verschobenen Blühzeitpunkte stellen ein auf Linkage Drag beruhendes negatives agronomisches Merkmal für Mais dar, welches in dieser Form nach Introgression der HT-Resistenz aus B37HTN1 noch nicht beschreiben wurde. Marker-Analysen ermöglichten die Lokalisierung des Linkage Drags, welcher für den verzögerten Blühzeitpunkt verantwortlich ist, in einem Bereich zwischen zwei Markerregionen auf der Introgression aus B37HTN1 , zwischen M1 und M2. Dafür wurden die Genotypen B37HTN1 , KWS.elite und KWS.elite. B37HTN1 beispielsweise mit den KASP-Markern SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 und PZE-108077560 analysiert (siehe Figur 3 und Tabelle 4). SYN14136 und PZE-108076510 wurden zur spezifischen Detektion der Markerregion M1 , SYN24931 und PZE-108077560 zur spezifischen Detektion des Region M2 herangezogen. Danach liegt die Markerregion M1 5' vom Locus des Linkage Drags und die Markerregion M2 3' dazu. Die Marker-Analyse zeigte, dass B37HTN1 und KWS.elite.B37HTN1 j beide mit einer um zwei Tage späteren Blüte, gemeinsame Allele für die Regionen M1 und M2 sowie dem Intervall zwischen diesen Regionen zeigten, während KWS.elite mit einem normalen Blühzeitpunkt andere Allele für die Regionen M1 und M2 und dem Intervall dazwischen aufwiesen.
Der Donor B37HTN1 wurde mit RP3 gekreuzt und über drei Generationen fortgesetzt mit RP3 rückgekreuzt. In jeder Rückkreuzungsgeneration wurden molekulare Marker genutzt. Zunächst wurden Pflanzen, die heterozygot für die HTN1 -Zielregion waren selektiert und anschließend wurden diese Pflanzen mit gleichmäßig über das Genom verteilten Markern untersucht, um gegen das Donorgenom zu selektieren. Anschließend wurde eine selektierte Pflanze der dritten Rückkreuzungsgeneration fortgesetzt geselbstet und mit molekularen Markern wurden homozygote Pflanzen für die HTN1- Zielregion identifiziert.
Weiterhin wurde der Donor B37HTN1 auch mit den rekurrenten Elter RP3 und RP4 gekreuzt und eine Linie RP3HTNA und RP4HTNA über mehrere Schritte der
Rückkreuzung erzeugt. Die Phänotypisierung auf HT-Resistenz zeigte eine
Verbesserung der Boniturnoten von 5 bis 7 für die Ausgangslinie RP3 auf 1 bis 3 für RP3HTNA und eine Verbesserung der Boniturnoten von 6 für die Ausgangslinie RP4 auf 2 bis 3 für RP4HTNA. Die Phänotypisierung auf Blühzeitpunkte zeigte vergleichbare Blühzeitpunkte für RP3 und RP3HTNA und RP4 und RP4HTNA. Durch Verwendung der KASP-Marker SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 und PZE-108077560 konnte nachgewiesen werden, dass RP3 und RP3HTNA gemeinsame Allele für die Regionen M1 und M2 tragen. Diese entsprachen nicht dem Donor B37HTN1. Im Ergebnis liegt somit der Blühzeitpunkt-verzögernde chromosomale Abschnitt der Introgression aus B37HTN1 auf einem chromosomalen Intervall zwischen den Markerregionen M1 und M2. Mit der Linie RP3HTNA war es somit gelungen diesen Linkage Drag zu entfernen. Die verwendeten KASP-Marker SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 und PZE- 108077560 stellten sich als wirksames Werkzeuge zur„assistierten Selektion" dar.
Die Phänotypisierung der RP3 und RP3HTNA umfasste zudem auch die Erfassung des Korn- und des Silageertrags. Während der Kornerträg in den Genotypen nicht signifikant unterschiedlich war, zeigte das Merkmal Silageertrag bei RP3HTNA eine eindeutige statistisch belegbare Reduktion um mindestens 14 Dezitonnen pro Hektar (dt/ha) gegenüber RP3, oder eine Reduktion um mehr als 5%.
Mit Hilfe der entwickelten KASP-Marker SYN14136, PZE-108076510, SYN24931 und PZE-108077560 konnten aus der Kreuzung von B37HTN1 und dem rekurrenten Elter RP1 eine Linie RP1 HTN1 selektiert werden, die keinen Blühzeitverzögernden Linkage Drag mehr aufwies, aber ebenfalls eine Silageertragsreduktion, wie sie für RP3HTNA beobachtet wurde, zeigte. Zur verfeinerten molekularen Charakterisierung wurde
RP1 HTN1 weiterentwickelt und eine F2-Population mit 724 Individuen aus der Kreuzung RP1 x RP1 HTN1 erstellt. Anschließend wurde die F3-Generation geselbstet und selektierte F4-Pflanzen wurden geno- und phänotypisiert. Die Genotypisierung wurde mittels Marker der Tabelle 6 im detektierten QTL-Bereich von 23, 1 cM durchgeführt. Die Phänotypisierung wurde an mehreren Standorten in zwei Wiederholungen durchgeführt (siehe Beispiel 1.). Es wurden rekombinante Pflanzen für den QTL-Bereich selektiert und mit den phänotypischen Daten korreliert. Die Selektion umfasste Pflanzen, die
unterschiedliche Bereiche der Targetregion abdeckten, sowie heterozygote Pflanzen, mit dem Ziel neue rekombinante Pflanzen zu erhalten. Es wurden in jedem Jahr zwei Rückkreuzungen mit RP1 und selektierten Einzelpflanzen durchgeführt und somit neue Rekombinante erstellt. Neue Rekombinante wurden im Feld- und
Gewächshausversuchen phänotypisiert (siehe unter 1.) und für die Entwicklung neuer molekularer Marker gemäß 2. genotypisiert.
Die Anwendung dieser neuen Marker auf den Genotyp RP3HTNA ermöglichte die Identifizierung einer Markerregion M3, welche im 5'-Bereich die Introgression begrenzt und mit den flankierenden Markern PZE- 08093423 und PZE-108093748 beschrieben werden kann. Dabei sollte PZE-108093423 das Allele des rekurrenten Elter RP3 und PZE-108093748 das Allele des Donors B37HTN1 aufweisen. Im 3'-Bereich wird die Introgression von RP3HTNA von den Markern PZE-108107671 und SYN4196 in einer weiteren Markerregion M6 beschrieben (siehe Figur 3). Dabei trägt PZE-108107671 das Allele des Donors B37HTN1 und SYN4196 das Allele des rekurrenten Elter RP3. Die Introgression aus RP3HTNA (nachfolgend A-Version genannt) entspricht zwischen den Markerregionen M3 und M6 dem Donor B37HTN1 , aber außerhalb dieses Bereichs dem rekurrenten Elter, oder einer anderen Linie, die nicht die Allele im Bereich zwischen M1 und M2 des Donors B37HTN1 trägt. Diese A-Version wurde in verschiedene andere genetische Hintergründe eingebracht und erneut Ertragsprüfungen, Resistenz- Phänotypisierungen und Blühzeitpunkt-Bestimmung unterzogen. Die Ergebnisse waren vergleichbar mit denjenigen beschrieben für RP3HTNA. So war der Blühzeitpunkt im Vergleich zur entsprechenden Linie ohne Introgression nicht verschoben und die Linie zeigte eine verbesserte Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum, im Vergleich mit der Ausgangslinie, allerdings weiterhin die Reduktion des Silageertrags.
Identifikation und Eliminierung des Linkage Drags für reduzierten Silageertrag:
Als Donor wurde die Linie RP3HTNA verwendet. Diese wurde mit RP3 gekreuzt und über sechs Generationen fortgesetzt geselbstet. In jeder Selbstungsgeneratipn wurden molekulare Marker im Zielbereich genutzt, um das Donorfragment zu verkleinern. Da alle Regionen des Genoms außerhalb der Zielregion bereits in der Linie RP3HTNA auf RP3 Genom selektiert worden waren, wurde mit Markern nur noch der Bereich um die HTN- Zielregion untersucht. Dabei wurden homozygote Pflanzen für eine verkleinerte HTN- Zielregion identifiziert. Parallel dazu fand eine intensive Markerentwicklung im Target- Bereich statt. Neben vielen anderen gelang es eine Linie RP3HTNK zu identifizieren, die das B37HTN1-Donor-Fragment von einer Markerregion M4, flankiert durch die Marker MA0004 und MA0005, wobei MA0004 das Allele des rekurrenten Elter RP3 und MA0005 das Allele des Donors B37HTN1 in RP3HTNK beschreibt, bis zu einer Markerregion M5, flankiert durch die Marker MA0006 und PZE-108097482, wobei MA0006 das Allele des Donors B37HTN1 und PZE-108097482 das Allele des rekurrenten Elter RP3 beschreibt, trägt. Die Introgression aus RP3HTNK (nachfolgend Κ-Λ ersiön genannt) bewirkt in RP3HTNK eine verbesserte HTN1 -Resistenz um 3 bis 4 Boniturnoten im Vergleich zu RP3, einen gleichen Blühzeitpunkt wie ihre Ausgangslinie RP3 (keine Verzögerung in der Blüte) und keine signifikante Ertragsreduktion des Silage-Ertrags (siehe Figur 2) mehr. Mit Hilfe der beschriebenen Marker konnten auch aus der Ausgangslinie RP1 durch Kreuzung Linkage Drag-freie Linien erstellt werden, welche die K-Version der Introgression aufwiesen.
D) Resistenz-vermittelnder Haplotyp aus B37HTN1 bzw. aus Pepitilla
Die K-Version besitzt einen Haplotyp aus B37HTN1 bzw. Pepitilla, der die in Tabelle 4 beschriebenen Donor-Allele an den physischen Positionen bezogen auf B73 AGPv02 in bp trägt. Exemplarisch sei die Haplotypbeschreibung hier an Marker MA0008
beschrieben: Verwendet man den Marker MA0008 und bestimmt die Allele für
B37HTN1 , RP3, RP3HTNA, RP3HTNK so wird das Allele„T" für B37HTN1 , RP3HTNA, RP3HTNK bestimmt und das Allele„C" für RP3. Dieser Marker unterscheidet für diesen Locus ebenfalls die mutmaßliche HTN1 -Resistenzquelle PH99N (WO 201 1/163590), die an dieser Position ebenfalls ein Allel„C" enthält, von der für hier verwendeten
Resistenzquelle.
4. Molekulare Analyse der fein-kartierten Region
Weiterhin wurde das durch Introgression inserierte und trunkierte Chromosomfragment molekular untersucht. Der Resistenzlocus Htm aus der Akzession Pepitilla wurde so auf eine distinkte Zielregion, ein chromosomales Intervall von 700 kb, reduziert und in dem Genotyp RP4HTN1 sequenziert. Wie im Folgenden näher ausgeführt wurden BAC Klone aus RP4HTN1 isoliert, sequenziert und zu einem Sequenz Scaffold assembliert. Der Sequenz scaffold wurde annotiert und den annotierten Genen aus diesem Intervall wurden EST/cDNA- Sequenzinformationen gegenübergestellt. Aus einer Vielzahl von annotierten Genen wurden dann durch differentielle Expressionsstudien die Kandidaten-Gene identifiziert (siehe Tabelle 1).
A) BAC Bank- und Pool-Erstellung, BAC Bank Sichtung, BAC Sequenzierung
Eine BAC Bank wurde aus dem Genotyp RP4HTN1 erstellt. Es erfolgte die Erstellung der BAC Bank und der 3D-Matrix-Pools aus Blattmaterial sowie die Sichtung der SD- Matrix-Pools: Die Primer für die Sichtung der 3D-Matrix-Pools wurden auf Grund der B73 AGPv01 Sequenz von 149957158 bp bis 152977351 bp auf Chromosom 8
(www.maizesequence.org) und dem Programm Primer 3 (http://simgene.com/Primer3; Rozen & Skaletsky, 2000). Die Parameter für die Primerauswahl waren ein
durchschnittlicher GC-Gehalt von 50%, Primerlänge von 20-25 bp, Schmelztemperatur zwischen 70-90°C und Amplicon Länge zwischen 70-80 bp. Mit den Primerpaaren in Tabelle 7 wurden die 3D-Pools mittels RT-PCR gesichtet. Die Werte der beiden
Parameter Schmelz-Temperatur und CP-Wert sind für die BAC-Klone angegeben. Es konnten 26 BAC Klone für den ausgewählten Bereich identifiziert werden. Alle BAC Klone wurden aus der BAC Bank isoliert und als E.co//'-Kultur zur DNA Isolation und Sequenzierung genutzt. Die Sequenzierung wurde mit einem Standard GS-FLX Titanium Laufs (454 Life Sciences, USA) durchgeführt. Die erhaltene Sequenzinformation der BAC Klone 144N24, 1 19F13, 219G11 , 86N21 , 16B06, 84L18, 128D02, 25M23, 96H10, 19J24, 136A01 , 75H06, 135F07 ist in Tabelle 8 zusammengestellt.
Tabelle 7: Primerpaare zur Detektion von BAC-Klonen aus der RP4HTN-BAC-Bank
Figure imgf000057_0001
Figure imgf000058_0001
579ZMPM0 128F; 209;
77,99 24,05 77
579ZMPM0 128R 210
5M22
579ZMPM0 136F; 21 1 ;
78,65 26,46 78
579ZMPM0 136R 212
579ZMPM0 131 F; 213;
76,58 26,54 78
579ZMPM0 131 R 214
14616
579ZMPM0 137F; 215;
83,7 25,42 73
579ZMPM0 137R 216
579ZMPM0 138F; 217;
79,38 24,8 79
579ZMPM0 138R 218
147015
579ZMPM0 147F; 219;
79,63 26,77 80
579ZMPM0 147R 220
579ZMPM0 145F; 221 ;
81 ,51 27,61
579ZMPM0 145R 222 76
88K17
579ZMPM0 262F; 223;
75,7 25,82 80
579ZMPM0 262R 224
579ZMPM0 161 F; 225;
80,21 25,16 73
579ZMPM0 161 R 226
180G22
579ZMPM0 265F; 227;
79,3 24,7 79
579ZMPM0 265R 228
Tabelle 8: Sequenzgehalt der 13 analysierten BAC-Klone
Figure imgf000059_0001
B) BAC Sequenz Assembly, -Annotation und Kandidaten-Gen-Selektion:
Erstellung eines Sequenz Scaffolds: Die BAC Klone 144N24, 119F13, 219G11 , 86N21 , 16B06, 84L18, 128D02, 25M23, 19J24, 96H10, 136A01 , 75H06, 137F07 wurden mittels der 454-Technik sequenziert (Margulies et al., 2005). Das automatische Assembly der Roh-Sequenzen der BAC Klone wurde mit der Software „Newbler" (454 runAssembly Software, Software Release 2.3) durchgeführt. Die so erzeugten Sequenz-Contigs pro BAC wurden in manueller Analyse korrekt angeordnet, wobei folgende Techniken angewandt wurden:
1. Sequenzen von überlappenden BACs konnten grob in überlappende und nicht überlappende Bereiche eingeteilt werden.
2. Sequenz-Contigs von verschiedenen überlappenden BACs wurden in den
überlappenden Bereichen verglichen. Etwa 20% der Sequenz-Contigs konnten so angeordnet werden und Lücken zwischen ihnen geschlossen werden (z.B. wenn ein Contig des einen BACs zwei Contigs des anderen BACs abdeckt oder verbindet).
3. Alle Sequenz-Contigs wurden manuell annotiert. Hier wurden zunächst nur Repetitive Elemente (Transposons und Retrotransposons, kurz "TEs") annotiert. Da Sequenzlücken vor allem in TEs auftreten, kann die TE Annotation helfen, Sequenz-Contigs korrekt anzuordnen. Das heißt, wenn das eine Ende eines TEs auf einem Sequenz-Contig liegt und das andere Ende auf einem anderen, können die zwei Contigs entsprechend angeordnet werden. In solchen Fällen wurde jeweils eine Sequenz von 100 Ns eingefügt, um die Lücke zwischen den Sequenz-Contigs zu füllen. Auch die Information von TEs, die verschachtelt sind (d.h. TEs, welche sich in andere TEs inseriert hatten) wurde verwendet, um Sequenz-Contigs anzuordnen.
4. In manchen Bereichen konnten weder Informationen von überlappenden BACs noch TE- Annotationen verwendet werden (dies war v.a. der Fall in Bereichen, die nur von einem BAC abgedeckt wurden). Dort wurden die Sequenz-Contigs willkürlich angeordnet und die Lücken zwischen ihnen mit Sequenzen von 200 Ns gefüllt.
5. Viele der TEs im Maisgenom sind "Long Terminal Repeat" (LTR) Retrotransposons, die von langen (1-2 kb) LTR-Sequenzen flankiert werden: Diese LTRs können bis 100% identisch sein. In einigen Fällen wurden daher Roh-Sequenzen der beiden LTRs in eine Konsensus-Sequenz assembliert (d.h. eine Kopie der LTR is nicht im Assembly vorhanden. In diesen Fällen wurden die Sequenz-Lücken mit der Anzahl N's gefüllt die der Länge des zweiten LTR entsprechen würde.
6. Gene wurden manuell annotiert. Hierzu wurden die kodierenden Sequenzen (CDS) des publizierten B73 Maisgenoms als Referenz benutzt
(http://www.maizegdb.org/gene_model.php). Die CDS wurden via DotPlot
(http://www.dotplot.org/) mit der RP4HTN-Sequenz aliniert und so die Positionen von Exons und Introns bestimmt. Kandidatengene wurden einerseits durch die Beschreibung Ihrer Funktion (falls öffentlich bekannt) bestimmt. Andererseits wurden die CDS der resistenten RP4HTN mit der den anfälligen B73 AGPv02 verglichen. Falls Unterschiede vorhanden waren, wurde das jeweilige Gen in die Liste der Kandidaten aufgenommen. Die fertige Sequenz hat eine Länge von 1 '328'253 bp. Die Liste der Kandidaten-Gene ist in Tabelle 1 wiedergegeben.
5. Molekulare Analyse der Kandidaten-Gene:
Expressionanalyse; Die Expression der verschiedenen Kandidatengene wurde auf 21 Tage alten (nach Aussaat), nicht infizierten Pflanzen (Infektionstag = 0 dpi) als auch auf 36 Tage alten mit Ή. turcicum infizierten und nicht infizierten (15 Tage nach der Infektion =15 dpi inf/ni) Pflanzen getestet.
RNA vom zweiten Blatt wurde aus den getesteten Maispflanzen extrahiert, in cDNA revers transkribiert und die Expression mittels qPCR gemessen. Jeweils das zweite Blatt wurde geerntet, eingefroren und die RNA mit dem SV Total RNA Isolation System Kit (Z3100;
Promega, Dübendorf, Schweiz), gleich wie beschrieben (Brunner et al., 201 1 ; Risk et al., 2012) extrahiert, quantifiziert und auf die Qualität und Reinheit hin geprüft.
1 μg RNA wurde mit dem iScript RT Supermix (170-8841 ; Bio-Rad, Cressier, Schweiz) in einem Reaktionsvolumen von 20 μΙ gemäss Herstellerangaben revers transkribiert. Um eine mögliche Kontamination durch genomische DNA auszuschliessen (RT minus), wurde parallel von jeder Probe eine Reaktion ohne die Zugabe der reversen Transkriptase mit inkubiert.
Quantitative Real Time PCR (RT-qPCR) wurde in technischen Triplikaten oder Duplikaten in einem Reaktionsvolumen von 10 μΙ und Zugabe von 4 μ1 1 : 10 verdünnter (10mM Tris HCL pH8, 0,1 mM EDTA) cDNA 5 ul SsoFast EvaGreen® Supermix (172-5201 ; Bio-Rad, Schweiz) und einer Primerkonzentration von 400 nM auf dem C1000 Touch Cycler (Bio-Rad, Schweiz) durchgeführt. Für die Amplifikation wurde folgendes Programm verwendet: 95° C für 30
Sekunden, gefolgt von 40 Zyklen 95°C für 3 Sekunden, dann 60-63 °C (gern Tabelle 2) für 5 Sekunden. Zur Analyse der Schmelzkurve (ausschliessen von Primer Dimeren) wurde das PCR Produkt in 0,5 °C Schritten von 65 °C auf 95 °C aufgeheizt. Amplifikatiönskurven und
Schmelzkurven wurden in Programm CFX Manager V 3.0 (Bio-Rad, Schweiz) überprüft und die Cq-Werte (quantification cycle) in das Programm qbasePLUS V 2.3 (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgien) zur Bestimmung der Relativen Expression exportiert.
Primer für die Kandidatengene wurden mithilfe von Primer-BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) bestimmt, um unspezifische Amplifikation auf bereits bekannten Transkripten möglichst auszuschliessen. Zur Evaluation geeigneter
Amplikons wurden die PCR Produkte mittels Agarose Gel Elektrophorese aufgetrennt und auf eine einzelne Bande und ihre Grösse hin überprüft. Weiter wurden Amplikons gem. Tabelle 1 von RPI HtN als auch NILHtN sequenziert. Zur Normalisierung der Expressionsdaten wurden 1 - 3 Referenzgene (LUG, MEP, FPGS) verwendet (Manoli et al., 2012).
Alle Kandidaten-Gene sind im anfälligen Genotyp RP1 und im resistenten Genotyp RP1 HTN exprimiert. Eine differentielle Expression zwischen RP1 und RP1 HTN konnte für RLK1 gezeigt werden. RLK1 ist in den anfälligen Pflanzen bis zu 4 mal stärker exprimiert als in den
resistenten Pflanzen.
Tabelle 9: Primerpaare für die Kandidaten-Gene mit ihrer Amplicon-Länge in bp und der geeigneten Annealing Temperatur.
Figure imgf000062_0001
Tiliing-Population Sichtung und Detektion von Mutanten: Für die Kandidaten-Gene (Tabelle 1) kann eine Tiliing-Population von 10000 Pflanzen gesichtet werden, die die Introgression aus Pepitilla auf Chromosom 8 im Bereich von 151688552 - 153139596 bp im Vergleich zur B73- Referenz AGPv02 (www.maizesequence.org) trägt (RP3HTN1) und eine Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum aufweist. Die Mutationen können entweder stille Nukleotid- Austausche, Aminosäure-Austausche oder Stop-Codons sein und dienen zum Nachweis der Funktion des Kandidaten-Gens.
Transformation: Kandidaten-Gene können beispielsweise in den anfälligen Genotyp A188 durch Agrobacterium tumefanciens-vermittelte Transformation eingebracht werden. Dieser Genotyp zeichnet sich durch AUDPC-Werten von 702 im GWH-Test (n=18 Pflanzen) aus, so dass eine Transformation mit dem Resistenz-Gen eine deutliche Resistenzantwort ergibt.
6. Bestimmung der Rassenspezifität; Nachweis, dass HTN1 auch rassenunspezifisch Resistenz vermittelt
Das Screening der Genotypen mit HtN Gen erfolgt an vielen Standorten in allen Befallsregionen Europas. Bisher wurde diese Resistenz noch nicht gebrochen, sodass wir davon ausgehen, dass sie bisher rassenunspezifisch wirkt, solange, bis eine Rasse N gefunden wird.
Vorherrschend in Europa ist die Rasse 1 , wobei auch in einzelnen Regionen schon die Rassen 2 oder 3 oder eine Kombination dieser nachgewiesen werden konnte (Hanekamp et al., 2013).
7. Phänotypischer Test von weiteren rekombinanten Pflanzen
Es wurden neue rekombinante Pflanzen für den QTL-Bereich selektiert und mit den
phänotypischen Daten korreliert. Die Selektion umfasste Pflanzen, die unterschiedliche
Bereiche der Targetregion abdeckten. Es konnten rekombinante Pflanzen identifiziert werden, die zwischen den Markern MA0005 und MA0021 - Markerreg ion M7 und den Markern MA0013 und MA0022 - Markerregion M8 eine Introgression des Donors B37HTN1 im genetischen Hintergrund von RP1 aufweisen. In der Figur 4 ist dargestellt, dass dieser Bereich nur noch die drei Gene RLK4, EXT1 und RLK1 umfasst. Diese rekombinanten Pflanzen, die den Bereich M7 - M8 umfassen, zeigen sowohl im Feld unter künstlicher Inokulation, als auch im
Gewächshaus-Test den resistenten Phänotyp.
8. Identifikation des resistenz-vermittelnden Kandidaten-Gen Zur Identifikation des resistenz-vermittelnden Gens wurde die Tilling-Population von 10000 Pflanzen gesichtet, die die Introgression aus Pepitilla auf Chromosom 8 im Bereich von 151688552 - 153139596 bp im Vergleich zur B73-Referenz AGPv02
(http://www.genome.arizona.edu) trägt (RP3HTN1 ) und eine Resistenz gegenüber
Helminthosporium turcicum aufweist.
Für die Gene RLK4 und RLK1 wurden Amplicons entwickelt (Tabelle 10) und diese nach Amplifikation der Einzelpflanzen-DNA der Tilling-Population mittels Sanger-Sequenzierung sequenziert.
Tabelle 10: Primersequenzen der Amplicons
Figure imgf000064_0001
Die Amplicon-Sequenzen wurden mit der Software DNASTAR Lasergene ausgewertet und Basen-Mutationen identifiziert. In der Tabelle 1 1 ist eine Auswahl von gefundenen Mutationen aufgelistet. Tabelle 11 : Identifizierte Mutationen für die Gene RLK4 und RLK1
Figure imgf000065_0001
Die identifizierten Mutanten wurden im Gewächshaus geselbstet und Saatgut der homozygoten Pflanzen mit Wildtyp-Allel und Mutations-Allel pro Mutationsereignis für einen phänotypischen Test geerntet.
Jeweils 15 homozygote Einzelpflanzen mit Wildtyp-Allel und Mutations-Allel der Mutanten RLK1 b, RLK1d, RLK4d und RLK4f und die Kontrollen RP1 und RP1 HTN1 wurden wie oben beschrieben im Gewächshaus mit H. turcicum inokuliert. Im Zeitraum von 1 1 bis 25 Tage nach Inokulation wurde der Befall an jedem Tag bestimmt. Die AUDPC-Werte aller getesteten Pflanzen sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Durch die Änderung der Aminosäure im resistenten Elter der Tilling-Population RP3HTN1 wird eine Anfälligkeit der homozygoten Mutanten erwartet.
Tabelle 12: AUDPG-Werte der homozygoten Pflanzen mit Wildtyp-Allel und Mutations-Allel der Gene RLK1 und RLK4. In der Spalte Phänotyp bedeutet 0 - 100 resistent, 101 - 450 heterozygot, und > 450 anfällig.
Mutanten Name Allele AUDPC Phänotyp
RLK4d Horn. Mutante 33,3 resistent
Horn. Wildtyp 0,0 resistent
RLK4f Horn. Mutante 46,7 resistent
Horn. Wildtyp 96,7 resistent
RLK1 b Horn. Mutante 346,7 heterozygot
Horn. Wildtyp 46,4 resistent
RLK1d Horn. Mutante 406,7 heterozygot
Horn. Wildtyp 83,3 resistent
RP1 1030,0 anfällig
RP1 HTN1 0,0 resistent Referenzen
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Claims

1 Patentansprüche
1. Maispflanze, in deren Genom ein Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla
integriert ist, wobei das Chromosomfragment ein Intervall des Donors umfasst, welches Donor-Allele gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 aufzeigt und ein Polynukleotid aufweist, das in der Maispflanze Resistenz gegenüber Helmintbosporium turcicum vermittelt, und wobei das Chromosomfragment a) ein Intervall des Donors zwischen einem Marker in einer ersten Markerregion,
welche durch die Marker SYN14136 und PZE-108076510 flankiert ist, und einem Marker in einer zweiten Markerregion, welche durch die Marker SYN24931 und PZE-108077560 flankiert ist, und/oder b) ein Intervall des Donors zwischen einem Marker in einer dritten Markerregion,
welche durch die Marker PZE-108093423 und PZE-108093748 flankiert ist, und einem Marker in einer vierten Markerregion, welche durch die Marker MA0004 und MA0005 flankiert ist, und/oder c) ein Intervall des Donors zwischen einem Marker in einer fünften Markerregion,
welche durch die Marker MA0006 und PZE-108097482 flankiert ist, und einem Marker in einer sechsten Markerregion, welche durch die Marker PZE-108107671 und SYN4196 flankiert ist, nicht enthält.
2. Maispflanze nach Anspruch 1 . wobei das Chromosomfragment weiterhin ein Intervall des Donors zwischen einem Marker in der zweiten Markerregion und einem Marker in der dritten Markerregion nicht enthält.
3. Maispflanze nach Anspruch 1 , wobei der Blühzeitpunkt der Maispflanze und/oder der Silageertrag der Maispflanze demjenigen einer Vergleichsmaispflanze, in deren Genom das Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla nicht integriert ist, entspricht.
4. Maispflänze nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polynukleotid ein
Nukleinsäuremolekül umfasst,
(a) das eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13 oder 15
aufweist, 2
(b) das eine Nukleotidsequenz mit einer Identität von mindestens 80% zu einer der Nukleotidsequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, oder 15
vorzugsweise über die gesamte Sequenzlänge, aufweist,
(c) das mit dem komplementären Strang eines Nukleinsäuremoleküls nach (a) oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
(d) das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 oder 16 kodiert,
(e) das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80% identisch ist mit einer der Aminosäuresequenzen nach (d), kodiert, oder
(f) das eine Teilsequenz einer Nukleinsäure nach (a) bis (e) aufweist.
5. Zelle, Gewebe oder Teil der Maispflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
6. Korn oder Samen von der Maispflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
7. Verfahren zur Identifizierung einer Helminthosporium turcicum resistenten Maispflanze, in deren Genom ein Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla integriert ist, umfassend den Nachweis von mindestens zwei Allelen im Genom der Pflanze, wobei mindestens ein Allel in einem genomischen Abschnitt lokalisiert ist, welcher durch einen Marker in der ersten Markerregion, der zweiten Markerregion, der dritten Markerregion oder der vierten Markerregion und durch das Polynukleotid, das in der Maispflanze Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum vermittelt, flankiert ist, und wobei mindestens ein Allel in einem genomischen Abschnitt lokalisiert ist, welcher durch das Polynukleotid und durch einen Marker in der sechsten Markerregion oder der fünften Markerregion flankiert ist.
8. Verfahren zur Erhöhung des Ertrags einer H. turcicum resistenten Maispflanze, in
deren Genom ein Chromosomfragment aus dem Donor Pepitilla integriert ist, wobei das Chromosomfragment ein Intervall des Donors umfasst, welches Donor-Allele gemäß dem Haplotyp nach Tabelle 2 aufzeigt und ein Polynukleotid aufweist, das in der Maispflanze Resistenz gegenüber Helminthosporium turcicum vermittelt, umfassend den Schritt der Entfernung a) eines Intervalls des Donors zwischen einem Marker in einer ersten Markerregion, welche durch die Marker SYN14136 und PZE-108076510 flankiert ist, und einem 3
Marker in einer zweiten Markerregion, welche durch die Marker SYN24931 und PZE- 108077560 flankiert ist, und/oder b) eines Intervalls des Donors zwischen einem Marker in einer dritten Markerregion, welche durch die Marker PZE-108093423 und PZE-108093748 flankiert ist, und einem Marker in einer vierten Markerregion, welche "durch die Marker MA0004 und MA0005 flankiert ist, und/oder c) eines Intervalls des Donors zwischen einem Marker in einer fünften Markerregion, welche durch die Marker MA0006 und PZE-108097482 flankiert ist, und einem Marker in einer sechsten Markerregion, welche durch die Marker PZE-108107671 und
SYN4196 flankiert ist.
9. Oligonukleotid, das ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus einer der SEQ ID NOs: 41-49, 53-100 oder 229-250, umfasst.
10. Verwendung eines Oligonukleotids, das ein Nukleinsäuremolekül mit einer
Nukleotidsequenz, ausgewählt aus einer der SEQ ID NOs: 17-250, umfasst, zur
Identifizierung einer Helminthosporium ft/rc/ci/m-resistenten Maispflanze.
11. Polynukleotid, das ein Nukleinsäuremolekül umfasst,
(a) das eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13 oder 15
aufweist,
(b) eine Nukleotidsequenz mit einer Identität von mindestens 80% zu einer der
Nukleotidsequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13 oder 15 vorzugsweise über die gesamte Sequenzlänge, aufweist,
(c) das mit dem komplementären Strang eines Nukleinsäuremoleküls nach (a) oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
(d) das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 oder 16 kodiert, oder
(e) das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80% identisch ist mit einer der Aminosäuresequenzen nach (d), kodiert.
12. Vektor oder mobiles genetisches Element, umfassend ein Polynukleotid gemäß
Anspruch 1 1. 4
13. Transgene Pflanzenzelle, umfassend ein Polynukleotid gemäß Anspruch 1 1 als Transgen oder einen Vektor oder mobiles genetisches Element nach Anspruch 12.
14. Transgene Pflanze, umfassend ein Polynukleotid gemäß Anspruch 1 1 als Transgen oder einen Vektor oder mobiles genetisches Element nach Anspruch 12 oder eine
Pflanzenzelle nach Anspruch 13.
15. Korn oder Samen von der Pflanze nach Anspruch 14, wobei das Korn oder der Samen ein Polynukleotid gemäß Anspruch 11 als Transgen umfasst.
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