인간 혈액응고 7인자 유도체의 대량 생산 방법
본 발명은 인간 혈액응고 7인자를 대량 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 a) i) GC-풍부 영역(GC-Rich region)에서 하나 이상의 CCGCCC이 제거된 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코딩하는 염기서열; 및 ii) 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 유전자 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 인간 혈액응고 7인자 유도체를 코딩하는 염기서열을 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계; b) 상기 a) 단계의 발현벡터로 동물 세포주를 형질전환하는 단계; c) 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제의 존재 하에 상기 b)단계의 형질전환된 동물 세포주를 배양하여 고효율로 인간 혈액응고 7인자 유도체를 발현하는 세포주를 선별하는 단계; 및 d) 상기 c) 단계에서 선별된 동물 세포주를 소디움부틸레이트, 비타민 K, 및 배지 첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는, 인간 혈액응고 7인자 유도체를 대량 생산하는 방법 및 인간 혈액응고 7인자 유도체를 대량 생산하는 세포주에 관한 것이다.
인간 혈액응고 7인자(Factor Ⅶ; FⅦ)는 간에서 생산되어 혈액으로 분비되어 혈액응고 10인자(Factor X) 또는 혈액응고 9인자(Factor IX)를 활성화시킴으로 혈액을 응고시키는 세린 프로테아제(serine protease) 의 전구체이며, 분자량 50,000 Da인 단일 사슬 당단백질이다. FⅦ은 10a인자(Factor Xa), 12a인자(Factor XIIa), 9a인자(Factor IXa), 트롬빈(Thrombin)에 의해 두 개의 사슬 형태로 분해된 7a인자(Factor Ⅶa)으로 활성화 형태가 된다. 7a인자는 조직인자(tissue factor), 음전하를 띤 인지질 A에 결합함으로써 효소 활성이 강화된다고 알려져 있다(Nemerson et al, Thromb. Res, 1985, 40:351~358).
생체 내에서 7a인자(Factor Ⅶa)는 조직인자, 칼슘이온 존재하에서 10인자를 10a인자로 전환시키고, 10a인자는 5a인자, 칼슘 이온, 인지질의 존재하에서 프로트롬빈을 트롬빈으로 전화되어 혈액응고가 일어나게 된다.
7인자는 총 406개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 아르기닌 (152번째 아미노산)과 아이소루우신 (153번째 아미노산)사이의 단일 펩타이드 본드 사이의 잘림에 의해서 7a인자로 전환된다. 그 결과 light 체인 (152개의 아미노산 잔여물)과 heavy 체인 (254개의 아미노산 잔여물)이 다이설파이드 결합으로 연결된 구조를 가지게 된다. light 체인은 감마 카르복실 글루타민산 도메인 (Gla)와 2개의 EGF(epidermal growth factor) 도메인이 있으며 heavy 체인은 세린 프로테아제 작용부위가 있다.
7a인자의 생물학적 활성에 관여하는 N-말단의 10개 감마 카르복실 글루타민산을 형성시키기 위해서는 비타민 K가 요구되어 진다(Hagen et al, Natl.Acad. SC. U.S.A, 1986, 83:2412~2416). 이 Gla-도메인은 조직인자를 포함하고 있는 세포 표면에 7인자가 결합하는데 관여하는 것으로 알려져 있다(Sakai et al, J.Biol Chem, 1990, 265:1890~1894).
현재 7a인자를 생산하는 방법은 두 가지가 있다. 첫 번째 방법은 혈장으로부터 7인자를 분리 정제한 후 7a 인자로 활성화시키는 것이며(Broze et al, J. Biol.Chem, 1980, 225:1242~1247), 두 번째 방법은 7인자에 해당하는 DNA 서열을 주입한 동물세포의 배양을 통하여 얻는 것이다(Europena patent application no,86302855.1).
혈장 유래 제품은 제조 시 낮은 효율성과 공급의 불안정성을 갖고 있으며, 특히 안전성의 측면에서 많은 위험성을 내포하고 있다. 이에 반해, 유전자 재조합 제품은 유전공학 기술을 이용해 혈장 유래 제품의 단점을 극복할 수 있다.
하지만, 7인자를 유전자 재조합 기술을 이용하여 동물 세포주에서 생산하는 경우 대부분 발현 양이 적어 높은 생산성을 나타내기 어려운 문제점이 있다. 따라서 7인자를 치료제로서 사용하기 위해서는 안정적으로 대량 생산이 가능한 세포주의 확보가 필수적이며, 이런 세포주를 확보하기 위해서는 고효율로 발현할 수 있는 발현 벡터의 개발 또한 필수 불가결하다.
본 발명자들은 혈액응고 7인자 및 이의 유도체들을 대량 생산할 수 있는 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 프로모터 부위의 GC-리치(rich) 반복서열이 결실된 벡터를 이용하여 Factor Ⅶ를 고효율로 발현시킬 수 있는 동물 세포주용 발현 벡터를 제작하고, 이러한 발현 벡터로 동물 세포주를 형질 전환하여 Factor Ⅶ를 안정적으로 대량 생산할 수 있는 단클론 형질 전환체를 제작하고, 단클론으로부터 혈액응고 7인자 유도체의 생산 양을 증가시키기 위해 소디움부틸레이트를 저농도에서 고농도까지 다양한 농도로 첨가하여 배양한 결과 비교적 고농도의 소디움부틸레이트를 첨가하였을 때, 그리고 비타민 K를 저농도에서 고농도까지 다양한 농도로 첨가하여 배양한 결과 비교적 고농도의 비타민 K를 첨가하였을 때, 혈액응고 7인자 유도체의 발현이 현저히 증가되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 인간 혈액응고 7인자 유도체를 대량 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 a) i) GC-풍부 영역(GC-Rich region)에서 하나 이상의 CCGCCC이 제거된 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코딩하는 염기서열; 및 ii) 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 유전자 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 인간 혈액응고 7인자 유도체를 코딩하는 염기서열을 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계; b) 상기 a) 단계의 발현벡터로 동물 세포주를 형질전환하는 단계; c) 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제의 존재 하에 상기 b) 단계의 형질전환된 동물 세포주를 배양하여 고효율로 인간 혈액응고 7인자 유도체를 발현하는 세포주를 선별하는 단계; 및 d) 상기 c) 단계에서 선별된 동물 세포주를 소디움부틸레이트, 비타민 K, 및 배지 첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는, 인간 혈액응고 7인자 유도체를 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인간 혈액응고 7인자 유도체를 생산하는 HMF709(기탁번호 KCTC 12022BP) 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인간 혈액응고 7인자 유도체를 생산하는 HMF709(기탁번호 KCTC 12022BP) 세포주를 소디움부틸레이트, 비타민 K, 및 배지 첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는, 인간 혈액응고 7인자 유도체를 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 DHFR 프로모터 부위의 GC-리치(rich) 반복서열이 결실된 벡터를 이용하여 인간 혈액응고인자 7인자 유도체를 고효율 및 대량으로 발현시킬 수 있으므로, 혈우병 치료제의 제조에 유용하게 응용될 수 있다.
도 1은 hFⅦ-SOD1(ATKAVC) 발현 벡터의 지도(map)를 나타낸 것이다.
도 2는 hFⅦ-SOD1(ATKAVC) 발현 벡터로 형질전환된 세포주로부터 얻은 콜로니들의 효소면역측정법에 의한 hFⅦ-SOD1(ATKAVC) 발현량을 나타낸 것이다.
도 3은 hFⅦ-SOD1(ATKAVC) 발현 벡터로 형질전환된 세포주로부터 얻은 콜로니를 무혈청 배지에 적응시켜 Td(Doubling Time)를 나타낸 것이다.
도 4는 소디움부틸레이트 농도와 온도에 따른 CHO 세포주로부터 발현되는 hFⅦ-SOD1(ATKAVC)를 효소면역측정법에 의하여 나타낸 것이다.
도 5는 비타민 K의 농도에 따른 CHO 세포주로부터 발현되는 hFⅦ-SOD1(ATKAVC)를 효소면역측정법에 의하여 나타낸 것이다.
도 6은 생물반응기에서 배양하는 CHO 세포주의 배양 프로파일을 나타낸 것이다.
도 7은 생물반응기에 소이 하이드로라이세이트 첨가제를 사용하여 배양하는 CHO 세포주의 배양 프로파일을 나타낸 것이다.
도 8은 생물반응기에 이스트 추출물 첨가제를 사용하여 배양하는 CHO 세포주의 배양 프로파일을 나타낸 것이다.
도 9은 플라스크에 이스트 추출물을 농도별로 첨가하여 배양하는 CHO 세포주의 배양 프로파일을 나타낸 것이다.
도 10은 플라스크에 이스트 추출물을 농도별로 첨가하여 배양하는 CHO 세포주의 발현양을 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서 본 발명은 인간 혈액응고 7인자 유도체를 대량 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 a) i) GC-풍부 영역(GC-Rich region)에서 하나 이상의 CCGCCC이 제거된 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코딩하는 염기서열; 및 ii) 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 유전자 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 인간 혈액응고 7인자 유도체를 코딩하는 염기서열을 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계; b) 상기 a) 단계의 발현벡터로 동물 세포주를 형질전환하는 단계; c) 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제의 존재 하에 상기 b) 단계의 형질전환된 동물 세포주를 배양하여 고효율로 인간 혈액응고 7인자 유도체를 발현하는 세포주를 선별하는 단계; 및 d) 상기 c) 단계의 선별된 동물 세포주를 소디움부틸레이트, 비타민 K, 및 배지 첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는, 인간 혈액응고 7인자 유도체를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 상기 a) 단계는 i) GC-풍부 영역(GC-Rich region)에서 하나 이상의 CCGCCC이 제거된 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코딩하는 염기서열; 및 ii) 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 유전자 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 인간 혈액응고 7인자 유도체를 코딩하는 염기서열을 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계이다.
본 발명에서 용어, "GC-풍부 영역(GC-Rich region)"은 디하이드로폴레이트 환원효소의 전사조절인자인 프로모터에 포함된 CCGCCC 반복 서열을 의미하는 것으로, 이 반복서열을 전부 또는 일부를 결실, 변이 등에 의한 방법으로 인위적으로 결손시키면 디하이드로폴레이트 환원효소의 발현은 최소한으로 이루어지게 된다. 이 때, 발현이 최소로 유지된 상태에서 디하이드로폴레이트 저해제를 첨가하는 경우, 세포는 생존을 위하여 더 많은 수의 디하이드로폴레이트 환원 효소 유전자를 증폭하게 되고, 따라서, 상기 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자를 포함하는 발현 벡터 내에 포함된 목적 재조합 유전자 또한 동시에 증폭되어 고발현되는 것으로 관찰되었다.
따라서, 본 발명의 구체적인 일 양태에서는, CCGCCC 반복서열이 하나 이상 제거된 프로모터를 포함하는 디하드로폴레이트 환원효소 유전자의 염기서열을 포함하는 고발현 유도 카세트를 제공한다. 바람직하게, 상기 고발현 유도 카세트는 6 개 이하의 CCGCCC 반복서열을 포함하는 디하이드로폴레이트 환원효소의 프로모터를 포함하며, 더욱 바람직하게는 3 개 이하의 CCGCCCC 반복 서열을 포함하는 프로모터를 포함하고, 특히 바람직하게는 1 개 이하의 CCGCCC 반복 서열을 포함하는 프로모터를 포함하며, 더욱 특히 바람직하게는 CCGCCC 반복 서열 전부가 제거된 프로모터를 포함한다.
이들 CCGCCC 반복서열의 제거는, 당 업계에 널리 알려져 있는 유전자 재조합 기술에 따른 염기서열의 치환이나 결실 등의 방법에 의해 이루어질 수 있으며, 본 발명의 구체적 실시예에서는 CCGCCC 반복서열을 포함하는 염기 서열의 일부를 결실시키는 방법에 의하여 프로모터 내 GC-풍부 서열의 일부 또는 전부를 제거하였다.
본 발명에서 용어, "디하이드로 폴레이트 환원효소"는 NADPH를 전자공여체로, 디하이드로폴릭 산을 테트라하이드로폴릭 산으로 환원하는 효소를 말한다. 인간에서는 DHFR 유전자에 의해 암호화되어 있다.
본 발명에서 용어, "인간 혈액응고 인자"는 상처로 인한 출혈 시 혈액 응고를 통해 신체를 보호하는 작용을 하는 혈액응고 관련 단백질로, 혈액응고는 이러한 단백질의 12인자가 관여하여 일어나는 일련의 반응이다.
본 발명에서 용어, "인간 혈액응고 7인자"는 프로콘버틴(Proconvertin)이라고도 하며, 간에서 합성하며 분자량은 50,000 Da를 갖는 열에 불안정한 단백질로 혈액 내 농도는 20~40 mg/㎖인 단백질이다. 이와 같은 7인자는 7a로 활성화시켜 혈액 응고를 시킬 수 있는 혈액 응고제로 사용할 수 있다. 상기 혈액응고 7인자의 염기서열은 혈액 응고 7인자의 활성을 나타낼 수 있는 공지의 서열과 70%, 80%, 90%, 95%, 바람직하게는 97%의 서열 상동성을 갖는 염기서열을 제한 없이 포함한다. 바람직하게는 서열번호 3일 수 있다.
본 발명에서 용어, "인간 혈액응고 7인자 유도체"는 상기 인간 혈액응고 7인자를 이루는 아미노산 또는 화학 잔기에 대하여 제거, 첨가, 및/또는 치환을 일으킨 물질을 의미하며, 특히 상기 아미노산 또는 화학 잔기에 대한 제거, 첨가, 및/또는 치환을 통하여 생체 내 안정성이 높아지거나, 저장성이 우수해지거나, 활성이 증가하거나, 타 성분과의 결합부위를 포함하는 등의 별도의 기능이 추가되어 치료용 단백질로서 유리한 특성이 증가되거나 새로이 추가된 것일 수 있다. 본 발명에서 인간 혈액응고 7인자 유도체는 인간 혈액응고 7인자에 특정 아미노산 서열이 추가된 것일 수 있으며, 특히 C 말단에 추가된 것일 수 있으며, 상기 추가된 아미노산 서열은 펩타이드 링커일 수 있다. 바람직하게는, SOD1(Superoxide dismutase 1)의 일부 서열이 추가된 것일 수 있고, 특히 SOD1의 1번 내지 6번 아미노산 서열(ATKAVC, 서열번호 5)이 추가된 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "SOD1(superoxide dismutase 1)"이란 생체내에서 활성산소인 초과산화이온(superoxide) 을 산소와 과산화수소로 분해하는 불균등화 반응을 촉매하는 효소를 의미하고, 산소에 노출되는 거의 모든 세포에서 주된 항산화 방어기작을 수행하는 것으로 알려져 있다. 생체 내에서 흔히 발견되는 단백질의 일종인 SOD1 유래 서열을 사용함으로써 추가 서열에 대한 면역원성을 저하시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함한다. 용어 "벡터"는 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다. CpG 영역에서 풍부한 박테리아 DNA 서열의 제거는 전이유전자 발현 사일런싱을 감소시키고 플라스미드 DNA 벡터로부터 보다 지속적인 발현을 가져오기 위해 행해지고 있다 (예를 들면, Ehrhardt, A. et al. (2003) Hum Gene Ther 10: 215-25; Yet, N. S. (2002) MoI Ther 5: 731-38; Chen, Z. Y. et al. (2004) Gene Ther 11 : 856-64). 용어 "벡터"는 또한 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)같은 트랜스포존(Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 "발현벡터"는 상기 혈액응고 인자들을 발현시킴으로써 목적하는 단백질을 고효율로 발현시킬 수 있는 것으로, i) GC-풍부 영역(GC-Rich region)에서 하나 이상의 CCGCCC이 제거된 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터일 수 있다. 그 예로, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함하며, 바람직하게는 플라스미드 벡터이다.
상기 발현 벡터는 인간 혈액응고 7인자 유도체를 코딩하는 염기서열을 더 포함할 수 있으며, 이러한 발현 벡터를 발현시킴으로써 목적하는 인간 혈액응고 7인자 유도체를 고효율로 발현시킬 수 있다. 바람직하게는 상기 인간 혈액응고 7인자 유도체를 코딩하는 염기서열을 더 포함하는 발현 벡터는 도 1에 기재된 pXOGC-FⅦ-ATKAVC 벡터일 수 있다.
상기 인간 혈액응고 7인자 유도체는 상기 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자의 프로모터에 의해 발현되거나 또는 별도의 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있다. 바람직하게는, 상기 인간 혈액응고 7인자 유도체는 별도의 프로모터에 의해 발현이 조절된다. 이러한 프로모터로는 당 업계에 널리 알려진 것으로서, 예를 들어 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, LTR 프로모터, EFα 프로모터, SV40 프로모터 및 TK 프로모터로 구성되는 군으로부터 당업자가 용이하게 선택하여 사용할 수 있을 것이며, 이들에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 발현 벡터는 동물 세포주에서의 고발현을 유도하기 위한 것으로서, 바람직하게 동물세포에서의 영구적인 발현을 위한 선택 표지 인자로 사용되는 동물 세포주용 저항성 유전자를 더 포함할 수 있다. 상기 동물 세포주용 저항성 유전자로는 통상적으로 당업계에서 사용하는 동물 세포주용 저항성 유전자인 네오마이신 저항성 유전자, 제오신 저항성 유전자, 하이그로마이신 저항성 유전자 및 블라스시스틴 저항성 유전자 등이 있으며, 이들에 한정되는 것은 아니다.
이 외에도, 본 발명의 발현 벡터는 또한 일반적인 벡터의 구성요소들, 예를 들어 복제원점 및 다중 아데닐레이션 신호와 기타 전사 조절인자 등을 더 포함할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.
바람직하게 본 발명의 b) 단계는 상기 a) 단계의 발현벡터로 동물 세포주를 형질전환하는 단계이다.
본 발명에서 용어, "형질전환" 또는 "형질감염"은 외부 유전자가 숙주세포로 도입되어 도입된 유전자가 그 자체로 복제될 수 있거나, 숙주 게놈안으로 삽입되어 일어나는 인공적 유전적 변이를 모두 가리킨다.
상기 세포 내로 본 발명의 벡터를 형질전환시키는 방법은 염기를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션 (electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전 (calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염 (retroviral infection), 미세주입법 (microinjection), DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀 (cationic liposome) 법 등이 있고, 이로 제한되지 않는다.
구체적으로 본 발명에서는 CHO 세포에 리포펙타민을 이용하여 재조합 단백질을 발현하는 벡터를 세포 안으로 형질전환하였다.
또한, 본 발명에서 동물 세포주의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 동물 세포주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 세포의 성장방식에 따라 부유배양(현탁배양)과 부착배양으로, 배양방법에 따라 회분식과 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 세포주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.
동물세포 배양에 있어 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예에는 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유 및 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산 및 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올 및 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예에는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL) 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다.
또한, 상기 배지에는 메토트렉세이트(Methotrexate) 와 같은 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제가 첨가될 수 있다. 이는 상기한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 단백질 재조합 방법은 디하이드로폴레이트 환원효소가 결실된 동물 세포주에 본 발명에 따른 발현 벡터를 형질전환하고, 재조합 유전자를 증폭하기 위해 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제를 첨가하여 벡터 내의 디하이드로폴레이트 환원효소가 증폭되어 선택될 수 있도록 하는 시스템을 단기간에 효율적으로 구현하는데 그 목적이 있기 때문이다.
이들 목적하는 재조합 단백질은 동물 세포주에서의 발현이 요구되는 것으로서, 이러한 목적에 비추어, 본 발명에서 사용 가능한 바람직한 동물 세포주로는 중국 햄스터 난소(CHO : Chinese hamster ovarian cacer)세포주, 원숭이 신장 세포 7(COS7 : Monkey kidney cells) 세포주, NSO 세포주, SP2/0 세포주, W138, 어린 햄스터 신장(BHK : Baby hamster kidney) 세포주, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 293 세포등을 포함할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가지는 기술자라면 본 발명의 디하이드로폴레이트 환원 효소를 이용한 증폭 기술에 적용가능한 적절한 동물 세포주를 용이하게 선택할 수 있을 것이다. 바람직하게 본 발명에서는 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자가 결핍된 것을 특징으로 하는 세포주일 수 있다.
본 발명에서 용어, "재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포"는 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 벡터로 형질감염된 세포를 말하며, 재조합 포유동물 세포, 설치류 세포, 바람직하게는 동물세포 또는 동물세포 유래의 세포일 수 있으며, 가장 바람직하게는 CHO 세포일 수 있다. 숙주 세포가 CHO 세포인 경우, 유전자를 안정적으로 발현시키고, 또한, 세포 내에서의 유전자의 카피 수(copy number)의 증폭을 목적으로 하기 때문에, 염기 합성 경로를 결손한 CHO 세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 갖는 벡터(예를 들면, pCHOI 등)를 도입하고, 메토트렉세이트(methotrexate, MTX)에 의해 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 디하이드로폴레이트 환원효소가 결핍된 중국 햄스터 난소 세포주(CHO/dhfr-)를 사용하였다. 즉, 디하이드로폴레이트 환원효소가 결핍된 CHO 세포주에 인간 혈액응고 7인자를 암호화하는 유전자를 포함하는 본 발명에 따른 발현 벡터를 형질전환하여, 100nM 이하의, 보다 바람직하게는 50nM 이하의 낮은 메토트렉세이트 농도에서도 충분한 수의 유전자가 증폭되어 생산성이 검증된 동물 세포주를 제공한다.
바람직하게 본 발명의 c) 단계는 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제의 존재 하에 상기 b)단계의 형질전환된 동물 세포주를 배양하여 고효율로 인간 혈액응고 7인자 유도체를 발현하는 세포주를 선별하는 단계이다.
바람직하게, 본 발명에서 c) 단계에 선별된 세포주는 HMF709 (KCTC 12022BP) 일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기 선별된 세포주를 HMF709로 명명하고, 해당 세포주를 2011년 9월 23일에 부다페스트 조약 하 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(대한민국 대전시 유성구 과학로 111 한국생명공학연구원)에 기탁번호 KCTC 12022BP 로 기탁하였다.
한편, 상기 c) 단계에서 선별된 세포주는 무혈청 배지(EX-CELL CHO 배지, 미국 Sigma사, cat. no. 14360C)를 이용하여 부유배양에 적응시킬 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, HMF709(KCTC12022BP)를 무혈청 배지(EX-CELL CHO 배지, 미국 Sigma사, cat. no. 14360C)를 이용하여 부유배양에 적응시켰다.
또한, 본 발명에서 상기 d) 단계는 상기 c) 단계에서 선별되고 부유배양에 적응시킨 동물 세포주를 소디움부틸레이트, 비타민 K, 및 배지 첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 첨가하여 배양하는 단계이다.
본 발명에서 용어, "소디움부틸레이트"는 히스톤 디아세틸라아제의 억제를 통한 히스톤의 과아세틸레이션을 야기하는 것으로 알려진 물질로, 세포의 분화 및 유전자의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 인간 혈액응고 7인자 유도체를 대량으로 생산하기 위한 배지 첨가제로 사용되었으며, 첨가량은 배양조건에 따라 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있으며, 바람직하게 0.1 내지 4.0 mM의 농도로 첨가될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 d) 단계의 배양온도가 32.5 내지 35.0 ℃일 경우, 1.1 내지 3.5 mM 농도로 첨가될 수 있고, 배양온도가 31 내지 32.5 ℃일 경우, 1.2 내지 2.0 mM 농도로 첨가될 수 있다. 특히, 상기 d) 단계의 배양온도가 33.0 ℃일 경우, 소디움부틸레이트는 1.5 mM 농도로 첨가될 수 있다.
상기 인간 혈액응고 7인자 유도체 단백질은 상기 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자의 프로모터에 의해 발현되거나 또는 별도의 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있다. 바람직하게는, 상기 인간 혈액응고 7인자 유도체 단백질은 별도의 프로모터에 의해 발현이 조절된다. 이러한 프로모터로는 당 업계에 널리 알려진 것으로서, 예를 들어 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, LTR 프로모터, EFα 프로모터, SV40 프로모터 및 TK 프로모터로 구성되는 군으로부터 당업자가 용이하게 선택하여 사용할 수 있을 것이며, 이들에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "비타민 K"는 보통 비타민 K1(필로퀴논, phylloquinone), K2(메나퀴논, menaquinone) 및 전구체인 K3(메나디온, menadione) 을 모두 포함하는 의미로, 혈액응고를 촉진하는 지용성 비타민의 일종이다. 비타민 K의 K는 응고를 의미하는 Koagulation에서 왔다. 특히 프로트롬빈(prothrombin) 등의 혈액응고 단백질의 생성에 관여하여 정상적인 혈액응고를 돕는 것이 알려져 있다. 또한, 뼈에 주로 존재하는 오스테오칼신 단백질의 카복실화에 역할을 한다는 것이 알려져 있다. 본 발명에서 비타민 K는 비타민 K1 또는 비타민 K3일 수 있으며, 특히 비타민 K1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "배지 첨가제"는 세포 및 개체를 배양하는 배지에 첨가할 수 있는 모든 성분을 포함하며, 특히 동물 세포주의 세포 생존, 세포 증식 또는 단백질 생산을 촉진하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서는 특히, 소이 하이드로라이세이트 또는 이스트 추출물(Yeast extract, 이스트 익스트렉트)일 수 있으며, 상기 소이 하이드로라이세이트 또는 이스트 추출물은 배지에 0.1 내지 3 g/L의 농도로 첨가될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는, 디하이드로폴레이트 환원효소의 프로모터 중 CCGCCC 반복서열을 하나만 가지는 고발현 유도 카세트 및 CCGCCC 반복서열을 전혀 포함하지 않는 고발현 유도 카세트를 각각 제조하였으며, 이들 발현카세트를 포함하는 발현벡터에 의해 형질전환된 E.
coli 세포주를 이용한다. 이들 세포주는 본 발명자들의 선행 발명을 통해 2006년 10월 2일자로 대한민국 대전시 유성구에 소재하는 생명공학연구원 내 유전자은행에 수탁번호 KCTC 10991 BP 및 KCTC 10992 BP로서 각각 기탁하였다. 이들 세포주는, 원하는 목적 재조합 단백질의 고발현을 유도하기 위하여, 상기 세포주로부터 상기한 고발현 유도 카세트를 포함하는 발현벡터를 분리하여 유전자 재조합 기술 등에 의한 클로닝 방법으로, 인간 혈액응고 7인자 유도체 단백질을 암호화하는 유전자를 더 포함하는 발현벡터의 제작에 이용될 수 있다. 본 발명에 사용된 발현벡터로는 바람직하게 도 1에 기재된 pXOGC-FⅦ-SOD1(ATKAVC) 벡터를 제작하였고, 상기 발현벡터로 형질전환된 CHO 세포주를 소디움부틸레이트, 비타민 K 또는 배지 첨가제(소이 하이드로라이세이트 또는 이스트 추출물)가 첨가된 배양배지에서 배양하여 원하는 인간 혈액응고 7인자 유도체를 대량으로 생산하였다.
먼저, 소디움부틸레이트를 첨가한 결과, 도 4에서 확인할 수 있듯이, 특히, 33.0 ℃에서 1.5 mM의 소디움부틸레이트 농도에서 hFⅦ-SOD1(ATKAVC) 생산량이 증가하는 것을 알 수 있었다.
또한, 비타민 K를 첨가한 결과, 도 5에서 확인할 수 있듯이, 일정량의 비타민 K3를 대조군으로 하여 비타민 K1을 첨가량을 증가시킨 결과, 비타민 K1은 다량 첨가시에도 세포 독성이 없고, 농도의존적으로 인간 혈액응고 7인자 유도체의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 즉, 비타민 K1 첨가 농도가 증가할수록 hFⅦ-SOD1(ATKAVC) 생산량이 증가함을 알 수 있었다.
마지막으로, 대조군으로 소디움부틸레이트 또는 배지 첨가제(소이 하이드로라이세이트 또는 이스트 추출물)를 첨가한 결과, 표 1 및 도 6 내지 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 소이 하이드로라이세이트 1g/L와 이스트 추출물을 1g/L를 각각 첨가하였을 때, hFⅦ-SOD1(ATKAVC) 생산량이 증가함을 알 수 있었다. 특히, 소이 하이드로라이세이트를 넣었을 때 생산량이 가장 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명은 상기에서 기술한 세포주로부터 인간 혈액응고 7인자 유도체를 생산하는 경우, 소디움부틸레이트를 첨가하는 단계를 포함하여 생산한 인간 혈액응고 7인자 유도체를 대량으로 정제하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 생산된 인간 혈액응고 7인자 유도체를 활성화하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 디하이드로폴레이트 환원효소의 프로모터 중 GC-풍부 서열을 인위적으로 결손시켜 디하이드로폴레이트 환원효소의 발현이 최소한으로 이루어질 수 있게 한 후 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제를 첨가하여 도입 유전자를 증폭시켰다. 유전자 증폭이 이루어진 세포주들 중 한 개의 세포로부터 기원한 클론을 얻기 위하여 한계 희석을 실시하여 단클론 세포주를 획득하고, 이를 대량 배양하여 무혈청 배지에서 소디움부틸레이트, 비타민 K 또는 배지 첨가제를 첨가하여 인간 혈액응고 7인자 유도체를 생산하였다. 아울러, 정제 및 활성화된 인간 혈액응고 7인자 유도체를 생산하였다.
추가적으로, 본 발명은 인간 혈액응고 7인자 유도체를 생산하는 HMF709(기탁번호 KCTC 12022BP) 세포주를 소디움부틸레이트, 비타민 K, 및 배지 첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는, 인간 혈액응고 7인자 유도체를 대량 생산하는 방법을 제공한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 인간 혈액응고 7인자 유도체를 생산하는 세포주를 제공한다. 본 발명의 세포주는 바람직하게는 HMF709 (KCTC 12022BP) 세포주일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 본 발명의 hFⅦ-SOD1(ATKAVC) 발현 벡터로 형질전환하고 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제의 존재 하에 배양하여 고효율로 인간 혈액응고 7인자 유도체를 발현하는 세포주를 선별하였으며, 인간 혈액응고 7인자 유도체 발현능이 가장 우수한 세포주를 선별하여 2011년 9월 23일에 한국생명공학연구원 생물자원센터(대한민국 대전시 유성구 과학로 111 한국생명공학연구원)에 기탁번호 KCTC 12022BP 로 기탁하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 재조합
Factor
Ⅶ 발현을 위한 발현 벡터(
pX0GC
-
hF
Ⅶ)의 제조
1-1. 인간
Factor
Ⅶ 유전자 획득
먼저 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction) 기법을 이용하여 신호 서열을 포함하는 인간의 Factor Ⅶ 유전자를 획득하였다. Factor Ⅶ (FacⅦ) 유전자 증폭을 위하여, 인간 태아의 간(fetal liver) cDNA 라이브러리(TAKARA BIO USA)를 주형으로 이용하고, 하기의 서열번호 1 및 2의 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
폴리머라제와, 프라이머, cDNA 라이브러리, 및 dNTP를 포함하는 반응물을 95℃에서 1분간 변성시킨 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 68℃에서 90초간의 반응을 30회 반복한 뒤에, 최종적으로 68℃에서 5분간 반응시켰다.
이때, 클로닝 작업을 용이하게 하기 위하여 상기 서열번호 1의 프라이머에는 제한 효소 BamHI 인식 부위를 삽입하였고, 서열번호 2의 프라이머에는 제한 효소 XhoI 인식부위를 삽입하였다. 상기 프라이머는 표 1에 나타내었다.
표 1
인간 Factor Ⅶ 유전자 증폭을 위한 프라이머 Factor Ⅶ 프라이머 | 염기서열 | 서열 번호 |
정방향 프라이머(ⅦBHISS) | cccggatccatggtctcccaggccctcaggctcc | 1 |
역방향 프라이머(ⅦXhoIAS) | gggctcgagctagggaaatggggctcgcagg | 2 |
상기 중합 효소 연쇄 반응에 의하여 얻어진 약 1.3kb의 PCR 산물을 DNA 시퀀싱을 통해 염기서열을 확인하였고, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 것으로 확인하였다.
1-2. 재조합
Factor
Ⅶ 발현 벡터(
pX0GC
-FⅦ)의 제작
실시예 1-1에서 수득한 Factor Ⅶ PCR 산물을 CMV 프로모터의 조절 하에서 발현될 수 있도록 하기 위하여, 동물 세포 발현 벡터인 pX0GC 벡터에 클로닝하였다. 상기에서 사용된 pX0GC 벡터는 하나 이상의 CCGCCC 반복서열이 제거된 DHFR 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 DHFR을 암호화하는 염기서열을 포함하는 발현 벡터로서, 재조합 단백질의 고발현 유도를 위하여 제작된 벡터이다(대한민국 등록특허 제880509호 참조).
구체적으로, 상기의 중합효소 연쇄반응을 통하여 획득한 약 1.3kb의 Factor Ⅶ 유전자를 제한효소 BamHI과 XhoI으로 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 절단하고, PCR 정제 키트(Qiagen, USA)에 적용하여 절단된 DNA 절편을 수득하였다. 또한, 동물세포 발현 벡터인 pX0GC 벡터를 상기와 동일한 조건에서 동일한 제한 효소 BamHI와 XhoI으로 처리하고, 전기 영동하여 분리 정제하였다. 상기 절단된 DNA 절편과 pXOGC 벡터를 혼합하고, T4 DNA 리가아제를 사용하여 클로닝함으로써, Factor Ⅶ 유전자를 포함하는 발현 벡터(pX0GC-FⅦ)를 제조하였다.
실시예
2: 재조합
Fac
Ⅶ 유도체의 발현을 위한 발현 벡터의 제조
상기 실시예 1에서 제조한 FacⅦ 유전자를 포함하는 발현 벡터(pX0GC-FⅦ)를 이용하여, FacⅦ의 C-말단에 SOD1(Superoxide Dismutase 1)의 일부 서열이 결합된 형태의 FacⅦ 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하였으며, 상기 유도체를 발현시킬 수 있는 발현벡터를 제조하였다.
2-1. 인간
Factor
Ⅶ 유도체 유전자 수득
상기 실시예 1에서 제조된 발현 벡터 pX0GC-FⅦ에 포함된 FacⅦ 유전자의 3'-말단에 SOD1의 1번 내지 6번 아미노산 서열(ATKAVC, 서열번호 5)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 추가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 FacⅦ 유도체 발현벡터 pX0GC-FⅦ-ATKAVC를 제조하였다. 구체적으로, 상기 발현 벡터 pX0GC-FⅦ를 주형으로 하고, 하기의 서열번호 6 및 7의 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다(95℃ 1분 변성; 30회(95℃ 60초, 60℃ 60초 및 68℃ 90초); 68℃ 5분). 이때, 클로닝 작업을 용이하게 하기 위하여 상기 서열번호 6의 프라이머에는 제한 효소 EcoRI 인식 부위를 삽입하였고, 서열번호 7의 프라이머에는 제한 효소 XhoI 인식부위를 삽입하였다. 이어, 상기 PCR을 통하여 수득한 약 1.4kb의 PCR 산물의 염기서열(서열번호 8)을 확인하였다.
표 2
인간 Factor Ⅶ 유전자 증폭을 위한 프라이머 Factor Ⅶ 프라이머 | 염기서열 | 서열 번호 |
정방향 프라이머(FⅦEcoRISS F) | ccggaattcatggccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggc | 6 |
역방향 프라이머(FⅦ#1XhoIAS) | ccgctcgagtcagcacacggccttcgtcgcgggaaatggggctcgcaggaggactcctgggc | 7 |
2-2. 재조합
Fac
Ⅶ 유도체 발현벡터
pXOGC
-FⅦ-
ATKAVC
의 제조
상기 수득한 Fac Ⅶ 유도체 PCR 산물을 CMV 프로모터의 조절 하에서 발현될 수 있도록 하기 위하여, 동물 세포 발현 벡터인 pX0GC 벡터에 클로닝하였다. 구체적으로, 상기 PCR 산물을 제한효소 EcoRI과 XhoI으로 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 절단하고, PCR 정제 키트(Qiagen, USA)에 적용하여 절단된 DNA 절편을 수득하였다. 또한, 동물세포 발현 벡터인 pX0GC 벡터를 상기와 동일한 조건에서 동일한 제한 효소 EcoRI과 XhoI으로 처리하고, 전기 영동하여 분리 정제하였다. 상기 절단된 DNA 절편과 pXOGC 벡터를 혼합하고, T4 DNA 리가아제를 사용하여 클로닝함으로써, 발현벡터(pX0GC-FⅦ-ATKAVC)를 제조하였다.
실시예
3:
human
Factor
Ⅶ 유도체(
hF
Ⅶ-
SOD1
(
ATKAVC
)) 발현 세포주의 제조
상기 실시예 2에서 제조한 발현벡터를 이용하여 hFⅦ 유도체를 발현시켰다.
3-1.
CHO
세포주를 이용한
Fac
Ⅶ 유도체(
pX0GC
-FⅦ-
ATKAVC
)의 형질전환
상기 실시예 2-2에서 제조한 재조합 발현벡터 pX0GC-FⅦ-ATKAVC를 DHFR 유전자가 훼손되어 핵산 생합성 과정이 불완전한 DG44/CHO 세포주(CHO/dhfr-)(Urlaub et al., Somat
.
Cell
.
Mol
.
Genet
., 12, 555-566, 1986)에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체로부터 FacⅦ-ATKAVC 유도체를 발현시켰다.
구체적으로, 상기 DG44/CHO 세포주를 배양 용기 바닥의 80 내지 90% 정도를 덮을 정도로 배양시킨 다음, 상기 세포를 Opti-MEM(Gibco사, cat. No. 51985034)으로 3회 세척하였다.
한편, 3 ㎖의 Opti-MEM과 5㎍의 발현 벡터 pX0GC-FⅦ-ATKAVC의 혼합물과, 3㎖의 Opti-MEM과 20 ㎕의 리포펙타민(Gibco사, cat. no. 18324-012)의 혼합물을 각각 상온에서 30분 동안 정치시켰다. 이어, 상기 각 혼합물을 혼합하고 상기 배양된 DG44/CHO 세포주에 가한 다음, 37 ℃ 및 5% CO2 조건으로 약 18시간 동안 배양함으로써, 상기 발현 벡터 pX0GC-FⅦ-ATKAVC를 DG44/CHO 세포주에 도입하였다. 이어, 상기 배양된 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM-F12(Gibco사, cat. no. 11330) 배지로 3회 세척한 다음, 상기 배지를 가하고 48시간 동안 다시 배양하였다. 배양된 세포에 트립신을 가하여 배양된 세포들을 각각 분리하고, 이들을 선별배지(HT 보충제(Hypoxanthine-Thymidine)가 없고, 10% FBS 및 1㎎/㎖의 G418(Cellgro사, cat. no. 61-234 -RG)를 포함하는 MEM-α 배지(WELGENE사, cat. no. LM008-02))에 접종하였다. 형질전환된 세포들만이 생존하여 콜로니를 형성할 때까지, 상기 선별배지를 2일 또는 3일 간격으로 교환하며 배양함으로써, 상기 분리된 세포들로부터 형질전환된 세포를 선발하였다. 이때, 상기 선발된 형질전환된 세포에서 FacⅦ-ATKAVC 유도체의 발현수준을 향상시키기 위하여, 10 nM MTX(Sigma사, cat. no. M8407)를 선별배지에 가하여 점차로 농도를 증가시켜서, 2 내지 3주 후에는 30 nM까지 MTX의 함량을 증가시켰다.
아울러, 상기 형질전환된 세포의 이종성(heterogeneity)을 감소시키기 위하여 한계희석법(limiting dilution method)을 수행하여 단일 클론을 확보하였다. 구체적으로, 96 웰 플레이트에 각 웰 당 0.7 세포수의 비율이 되도록 희석한 상기 형질전환된 세포를 각각 분주하고, 2 내지 3주간 배양하여 단일클론이 나타나는지를 확인하였다. 단일클론이 클러스터를 형성하는 웰이 검색되면, 상기 단일클론을 24웰 플레이트로 옮기고, 각 클론의 세포성장율(cell growth rate)과 FacⅦ 유도체의 발현량을 ELISA 방법으로 분석하여, FacⅦ 유도체의 발현량이 가장 우수한 클론을 선별하였다. 이를 "HMF709"라 명명하였으며, 해당 세포주를 부다페스트 조약 하 국제기탁기관인 대한민국 대전시 유성구 과학로 111 한국생명공학연구원 소재 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture)에 2011년 9월 23일자로 기탁번호 "KCTC12022BP"로 기탁하였다.
3-2. 효소면역 측정법(
ELISA
)을 이용한
hF
Ⅶ-
SOD1
(
ATKAVC
)의 발현 확인
상기 실시예 3-1에서 형질도입된 세포들의 일부를 24-웰 플레이트에 2×104 세포수/웰의 농도로 옮겨 배양 용기의 바닥을 거의 덮을 정도로 배양한 후, 0.3 mM의 소디움부틸레이트(sodium butyrate; Sigma사, cat. no. B5887)가 첨가된 무혈청 배지 CHO-A-SFM(Gibco사, cat. no. 05-5072EF)를 웰 당 200 μL씩 넣고 33℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 세포의 배양액을 1.5 mL 튜브로 옮긴 후 원심분리를 하여 상등액만 다시 모아서 human Factor Ⅶ-SOD1(ATKAVC)의 발현량을 측정하였다. 발현량 측정은 제조사의 프로토콜에 따라 효소면역 측정키트(Molecular Innovation, cat. no. HFⅦKT-TOT)를 이용하여 수행하였다.
구체적으로, 먼저 세포배양액과 키트에 들어있는 표준물질을 Tris Buffer(0.1M Tris, 0.15M NaCl, pH 7.4)로 일정하게 희석한 후 키트의 웰에 100 μL씩 첨가하고, 상온에서 30분 동안 플레이트 진탕기 (plate shaker)에서 300 rpm으로 반응시켰다. 이후, 제조사의 세척액을 사용하여 웰을 4회씩 세척한 후, 항-human factor Ⅶ 항체를 웰에 100 μL씩 첨가하여 상온에서 30분 동안 플레이트 진탕기 (plate shaker)를 이용하여 300rpm으로 반응시켰다. 다시 제조사의 세척액으로 4번 세척한 후, HRP (horseradish peroxidase)가 결합되어 있는 항-human factor Ⅶ 항체에 대한 항체를 역시 웰당 100 μL씩 첨가한 후, 같은 방법으로 상온에서 30분 동안 300 rpm으로 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 4회 세척한 후, 기질액을 100 μL씩 넣어 상온에서 정치하며 반응시켰다. 약 5분 후에 50 μL의 반응정지액을 넣어 반응을 정지시킨 다음 450nm의 흡광도로 측정하였다. 키트 제조사에서 제공하는 표준액의 농도와 얻어진 흡광도 값을 이용하여 표준곡선 및 함수를 얻은 뒤에, 이를 이용하여 human factor Ⅶ-SOD1(ATKAVC)의 양을 정량화하였다. 그 결과, 형질도입되어 선별된 세포들이 일정량의 human factor Ⅶ-SOD1(ATKAVC)를 발현하는 것을 확인할 수 있었다.
3-3.
hF
Ⅶ-
SOD1
(
ATKAVC
) 발현 세포주의 선별
상기 실시예 3-2에서 human Factor Ⅶ 유도체의 발현이 확인된 Mixed population에서 한계희석법(limiting dilution method)을 이용한 단일 클론 선별을 실시하였다. 즉, 불균일한 human factor Ⅶ 유도체 발현율을 나타내는 클론들을 한계희석법을 이용하여 human factor Ⅶ 유도체 발현률이 균일하고 생산성이 우수한 단일세포를 분리하는 실험을 진행하였다. 구체적으로, 6-웰 플레이트의 세포들 중에서 가장 발현량이 높았던 웰의 세포들을 96-웰 플레이트에 세포를 웰당 1개 이하로 접종되도록 희석한 후 세포가 1개만 접종된 플레이트를 선별해 2-3주 배양하였다. 그리고 나서, 콜로니를 형성하는 웰 플레이트의 세포를 분리한 다음 계대 배양하여 human factor Ⅶ 유도체의 발현량을 효소면역 측정법으로 측정하였다(도 2). 한계 희석법을 통해 분리된 세포주들 중 human factor Ⅶ 유도체의 고생산성을 나타내는 재조합 CHO 세포주를 최종 선별하여 HMF709이라고 명명하였다. "HMF709"라 명명하였으며, 대한민국 대전시 유성구 과학로 111 한국생명공학연구원 소재생물자원센터(Korean Collection for Type Culture)에 2011년 9월 23일자로 기탁번호 "KCTC12022BP"로 기탁하였다.
선별된 세포주는 무혈청 배지(EX-CELL CHO 배지, 미국 Sigma사, cat. no. 14360C)를 이용하여 부유배양에 적응시켰다(도 3).
실시예
4:
소디움
부틸레이트
첨가에 따른 세포주의 성장 및
hF
Ⅶ-SOD1(ATKAVC) 생산량 측정
4-1. 종균 및
본배양
실시예 3-3에서 선별된 후 부유 배양에 적응되어 액체질소 탱크에 보관 중인 hFⅦ 발현 세포주 1 바이알(1×107 세포/㎖)을 꺼내어 37℃ 항온수조에서 최대한 신속히 녹인 후, 종균배양배지(글루타민 0.3g/L가 첨가된 EX-CELL CHO 배지(Sigma사, cat. no. 63225C))로 1회 세척하고 90×g에서 5분 동안 원심분리하여 종균배양배지 50 mL이 들어있는 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask; 미국 Corning사 cat. no. 431144)에 접종하였다. CO2 배양기(37℃, 5% CO2)에서 세포 농도가 10×105 세포/㎖가 될 때까지 1~2일간 배양한 다음, 위에서와 같은 방법으로 원심분리하여 신선한 종균배양배지 100 mL이 들어있는 새로운 삼각 플라스크로 계대 배양하였다. 같은 방법으로 충분한 수의 세포가 얻어질 때까지 2배씩 배양 부피를 늘려가며 계대 배양하였다.
4-2.
생산배지
내
소디움부틸레이트의
첨가에 따른 세포주의 성장 및
hF
Ⅶ-SOD1(ATKAVC) 생산량 측정
생산배지 내 소디움부틸레이트의 첨가가 hFⅦ-SOD1(ATKAVC)의 생산량에 미치는 효과를 살펴보기 위해, 배양 중인 재조합 CHO 세포주 약 5.0×106 세포/㎖를 3개의 삼각 플라스크에 50 mL의 배양 부피로 접종하였다. 이 때, 배양배지에 소디움부틸레이트(cat. no. B5887, 시그마사, 미국)가 각각 1.0, 1.2, 1.5, 및 2.0 mM이 되도록 첨가하였으며, 소디움부틸레이트 1.0 mM을 넣은 플라스크 대조군으로 배양을 시작하였다. hFⅦ-SOD1(ATKAVC)의 생산을 위해 배양 온도를 32.0℃ 또는 33.0℃로 맞추어 3일 동안 배양하였다. 배양 3일째에 배양액을 회수하여 세포주의 세포농도와 세포활성도를 관찰한 결과 소디움부틸레이트에 의한 세포농도 및 세포활성도의 변화는 없었다.
한편, 배양 3일째에 원심분리를 통해 배양 상등액을 회수한 후 실시예 3-2에서와 같이 효소면역법을 이용하여 각 배양 상등액에 발현된 hFⅦ-SOD1(ATKAVC)의 양을 측정하였다. 측정된 값을 대조군 대비 생산량(%)으로 계산하여 나타내었다(도 4).
도 4 에서 알 수 있는 바와 같이, 특히, 33.0 ℃에서 1.5 mM의 소디움부틸레이트를 첨가할 경우 가장 높은 생산량을 보이는 것을 확인하였다.
실시예
5: 비타민 K의 농도에 따른
hF
Ⅶ-
SOD1
(
ATKAVC
) 생산량 측정
5-1. 종균 및
본배양
실시예 3-3에서 선별된 후 부유 배양에 적응되어 액체질소 탱크에 보관 중인 hFⅦ-SOD1(ATKAVC) 발현 세포주 1 바이알(1×107 세포/㎖)을 꺼내어 37℃ 항온수조에서 최대한 신속히 녹인 후, 종균배양배지(글루타민 0.3g/L가 첨가된 EX-CELL CHO 배지(Sigma사, cat. no. 63225C)로 1회 세척하고 90×g에서 5분 동안 원심분리하여 종균배양배지 50 mL이 들어있는 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask; 미국 Corning사 cat.no. 431144)에 접종하였다. CO2 배양기(37℃, 5% CO2)에서 세포 농도가 10×105 세포/㎖가 될 때까지 1~2일간 배양한 다음, 위에서와 같은 방법으로 원심분리하여 신선한 종균배양배지 100 mL이 들어있는 새로운 삼각 플라스크로 계대 배양하였다. 같은 방법으로 충분한 수의 세포가 얻어질 때까지 2배씩 배양 부피를 늘려가며 계대 배양하였다.
5-2.
생산배지
내 비타민 K 첨가에 따른 세포주의 성장 및
hF
Ⅶ-SOD1(ATKAVC)의 생산량 측정
생산배지 내 비타민 K 첨가가 hFⅦ-SOD1(ATKAVC)의 생산량에 미치는 효과를 살펴보기 위해, 배양 중인 재조합 CHO 세포주 약 5.0×106 세포/㎖를 3개의 삼각 플라스크에 50 mL의 배양 부피로 접종하였다. 이 때, 배양배지에 비타민 K1(cat. No. 501890, 머크 밀리포어, 미국)를 0, 10, 25, 50, 250, 1000 ㎍/L가 되도록 첨가하였으며, 비타민 K3(cat. No. M2518, 시그마, 미국)를 60 ㎍/L가 되도록 넣은 플라스크를 대조군하여 배양을 시작하였다. hFⅦ-SOD1(ATKAVC)의 생산을 위해 배양 온도를 33.0℃로 맞추어 3일 동안 배양하였다. 배양 3일째에 배양액을 회수하여 세포주의 세포농도와 세포활성도를 관찰한 결과 비타민 K에 의한 세포농도 및 세포활성도의 변화는 없었다.
한편, 배양 3일째에 원심분리를 통해 배양 상등액을 회수한 후 실시예 3-2에서와 같이 효소면역법을 이용하여 각 배양 상등액에 발현된 hFⅦ-SOD1(ATKAVC)의 양을 측정하였다. 측정된 값을 대조군 대비 생산량(배수)으로 계산하여 나타내었다(도 5).
도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 비타민 K 첨가 농도가 증가할수록 hFⅦ-SOD1(ATKAVC) 생산량이 증가함을 알 수 있었다.
실시예
6 : 배지 첨가제 사용에 따른 세포주의 성장 및
hF
Ⅶ-
SOD1
(
ATKAVC
) 생산량 및 활성 측정
6-1. 종균 및
본배양
실시예 3-3에서 선별된 후 부유 배양에 적응되어 액체질소 탱크에 보관 중인 hFⅦ-SOD1(ATKAVC) 발현 세포주 1 바이알(1×107 세포/㎖)을 꺼내어 37 ℃ 항온수조에서 최대한 신속히 녹인 후, 종균배양배지(글루타민 0.3 g/L가 첨가된 EX-CELL CHO 배지(Sigma사, cat. no. 63225C))로 1회 세척하고 90×g에서 5분 동안 원심분리하여 종균배양배지 50 mL이 들어있는 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask; 미국 Corning사 cat.no. 431144)에 접종하였다. CO2 배양기(37℃, 5% CO2)에서 세포 농도가 10×105 세포/㎖가 될 때까지 1~2일간 배양한 다음, 위에서와 같은 방법으로 원심분리하여 신선한 종균배양배지 100 mL이 들어있는 새로운 삼각 플라스크로 계대 배양하였다. 같은 방법으로 충분한 수의 세포가 얻어질 때까지 2배씩 배양 부피를 늘려가며 계대 배양하였다.
6-2 :
생산배지
내 첨가제 사용에 따른 세포주의 성장 및
hF
Ⅶ-
SOD1
(
ATKAVC
)의 생산량 측정
생산배지 내 첨가제의 사용이 hFⅦ-SOD1(ATKAVC)의 생산량에 미치는 효과를 살펴보기 위해, 배양 중인 재조합 CHO 세포주 약 4.0 × 106 세포/㎖를 5L 생물 반응기에 4L의 배양 부피로 접종하였다. 목표로 한 세포 농도인 15 x 106 세포/ml에 도달하였을 때 배양배지에 소디움부틸레이트(cat. no. B5887, 시그마사, 미국) 1.0mM, 소이 하이드로라이세이트(cat. No. 58903C , 시그마사, 미국) 1g/L, 또는 이스트 추출물(cat. no. Y4375, 시그마사, 미국) 1g/L가 되도록 첨가하였으며, 소디움부틸레이트 1.0 mM만 넣은 생물반응기를 대조군으로 하여 배양을 시작하였다. hFⅦ-SOD1(ATKAVC)의 생산을 위해 배양 온도를 33.0 ℃로 맞추어 10일 이상 배양하였다. 배양액을 하루 단위로 회수하여 세포주의 세포농도와 세포활성도를 관찰하였다.
한편, 배양액을 하루 단위로 원심분리를 통해 배양 상등액을 회수한 후 실시예 3-2에서와 같이 효소면역법을 이용하여 각 배양 상등액에 발현된 hFⅦ-SOD1(ATKAVC)의 양을 측정하였다. 생물반응기의 배양 프로파일과 측정된 값을 계산하여 나타내었다(도 6, 도 7 및 도 8).
표 3
첨가제 사용에 따른 hFⅦ-SOD1(ATKAVC) 생산량(%) 첨가제 | hFⅦ-SOD1(ATKAVC) 생산량(대조군 대비 %) |
대조군 | 100.0 |
소이 하이드로라이세이트 (1g/L) | 113.8 |
이스트 추출물 (1g/L) | 111.7 |
상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 소이 하이드로라이세이트 1g/L와 이스트 추출물을 1g/L를 첨가하였을 때, hFⅦ-SOD1(ATKAVC) 생산량이 증가함을 알 수 있었다. 특히, 소이 하이드로라이세이트를 넣었을 때 생산량이 가장 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
6-3:
생산배지
내 첨가제 사용에 따른
hF
Ⅶ-
SOD1
(
ATKAVC
)
역가
분석
생산 배지 내 첨가제의 사용이 hFⅦ-SOD1(ATKAVC)의 역가에 미치는 효과를 살펴보기 위해, 배양 중인 재조합 CHO 세포주 약 4.0×106 세포/㎖를 5L 생물 반응기에 4L의 배양 부피로 접종하였다. 목표로 한 세포 농도인 15 x 106 세포/ml에 도달하였을 때 배양 배지에 소디움부틸레이트(cat. no. B5887, 시그마사, 미국)가 1.0 mM, 소이 하이드로라이세이트(cat. No. 58903C, 시그마사, 미국)가 1g/L, 이스트 추출물 (cat. No.Y4375, 시그마사, 미국) 1g/L가 되도록 첨가하였으며, 소디움부틸레이트 1.0 mM만 넣은 생물반응기를 대조군으로 하여 배양을 시작하였다. hFⅦ-SOD1(ATKAVC)의 생산을 위해 배양 온도를 33.0℃로 맞추어 10일 이상 배양하였다. 배양액을 하루 단위로 회수하여 세포주의 세포농도와 세포활성도를 관찰하였다.
한편, 배양액을 하루 단위로 원심분리를 통해 배양 상등액을 회수한 후 COASET Chromogenic assay kit(Chromogenix, Italy)를 이용하여 Effective concentration 50(EC50)를 측정하였다. 최종 정제 공정을 거친 hFⅦ-SOD1(ATKAVC)를 상기 키트에 포함되어 있는 working buffer로 60 ng/ml부터 0.03 ng/ml까지 2배 연속 희석법으로 희석하고, 이를 96-웰 플레이트의 각 웰에 50ul 씩 분주하였다. 그 후 FacX, CaCl2 및 트롬보플라스틴(thromboplastin)이 포함된 조합시약(combined reagent)을 각 웰에 50 ul씩 분주하고 37 ℃에서 7분간 반응시킨 후, 기질을 각 웰에 50 ul씩 분주하였다. 끝으로, 405 nm에서 흡광도를 측정하여 각 FacⅦ-SOD1(ATKAVC) 의 EC50를 비교분석 하였다(표 4).
표 4
첨가제 사용에 따른 hFⅦ-SOD1(ATKAVC) 역가 분석 결과 첨가제 | 상대적인 활성 비율(대조군 대비 %) |
대조군 | 100.0 |
소이 하이드로라이세이트 (1g/L) | 76.6 |
이스트 추출물 (1g/L) | 100.0 |
표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 소이 하이드로라이세이트 1g/L를 첨가하였을 때 hFⅦ-SOD1(ATKAVC) 활성이 감소하였고 이스트 추출물 1g/L를 첨가하여 생산량을 촉진시켰을 경우에는 hFⅦ-SOD1(ATKAVC) 활성이 100% 유지되었음을 확인하였다. 즉, 이스트 추출물을 첨가할 경우, 목적 단백질인 hFⅦ-SOD1(ATKAVC)의 생산량이 증가할 뿐 아니라, 그의 활성 또한 100% 유지되는 것을 확인하였다.
이에 따라, hFⅦ-SOD1(ATKAVC)를 생산하는데 있어 우수한 배지 첨가물로 확인된 이스트 추출물의 첨가량에 따른 세포주의 성장 및 hFⅦ-SOD1(ATKAVC)의 생산량을 측정하는 실험을 진행하였다.
6-4 :
생산배지
내 이스트 추출물 농도에 따른 세포주의 성장 및
hF
Ⅶ-SOD1(ATKAVC)의 생산량 측정
생산배지 내 이스트 추출물의 농도에 따른 hFⅦ-SOD1(ATKAVC)의 생산량에 미치는 효과를 살펴보기 위해, 배양 중인 재조합 CHO 세포주 약 10 × 105 세포/㎖를 250mL Flask에 50mL의 배양 부피로 접종하였다. 목표로 한 세포 농도인 15 x 106 세포/ml에 도달하였을 때 배양배지에 소디움부틸레이트(cat. no. B5887, 시그마사, 미국) 1.0mM, 이스트 추출물(cat. no. Y4375, 시그마사, 미국) 1 g/L, 3 g/L, 5 g/L가 되도록 첨가하였으며, 소디움부틸레이트 1.0 mM만 넣은 생물반응기를 대조군으로 하여 배양을 시작하였다. hFⅦ-SOD1(ATKAVC)의 생산을 위해 배양 온도를 33.0 ℃로 맞추어 3일 이상 배양하였다. 배양액을 하루 단위로 회수하여 세포주의 세포농도를 관찰하였다(도 9).
한편, 배양액을 하루 단위로 원심분리를 통해 배양 상등액을 회수한 후 실시예 3-2에서와 같이 효소면역법을 이용하여 각 배양 상등액에 발현된 hFⅦ-SOD1(ATKAVC)의 양을 측정하였다. 생물반응기의 배양 프로파일과 측정된 값을 계산하여 나타내었다(도 10).
실시예
7 :
배양배지에서
Factor
Ⅶ 유도체 정제 방법
한외 여과막(SARTOCON Slice Cassette, PESU, Sartorius사, MWCO 30 K)을 1L의 1N NaOH로 1시간 이상 세척하고 5 L 멸균수를 이용하여 세척하였다. 이후 1차 정제컬럼의 평형 버퍼로 한외 여과막을 평형시킨 후, FactorⅦ 유도체 생산 세포 배양액을 주입하여 10 배 농축하였다. 농축된 배양액에 동일 부피의 1 차 정제컬럼 평형 버퍼를 첨가하여 2 배 희석하고 이를 다시 초기 농축부피까지 농축하였다. 이러한 희석-농축 과정을 7회 이상 반복하여 배양액을 1 차 정제컬럼 평형로 정용여과 하였으며 이때 FactorⅦ 유도체의 손실은 거의 없고, 농축된 FactorⅦ 유도체의 최종 농도는 0.3 mg/ml로 유지되었다. 한외여과 및 정용여과 과정은 4 ℃ 조건에서 수행되었다. 정용여과된 FactorⅦ 유도체 배양액은 0.22 ㎛ (NALGENE, PES) 여과 필터로 최종 여과하여 음이온 교환 크로마토그래피에 부하하였다. 본 발명에서는 음이온 교환 크로마토그래피로 큐 세파로스 (Q Sepharose Fast Flow, GE Healthcare) 레진이 충진된 컬럼을 사용하였고, 부하된 시료는 평형버퍼 A (20 mM Tris pH8.0 + 2 mM Benzamidine) 및 세척버퍼 B (20 mM Tris pH8.0 + 2 mM Benzamidine + 0.2 M NaCl) 와 세척버퍼 C (20 mM Tris pH8.0 + 2 mM Benzamidine + 0.1 M NaCl) 및 용출버퍼 D (20 mM Tris pH8.0 + 2 mM Benzamidine + 25 mM NaCl + 35 mM CaCl2) 용액을 이용하여 세척버퍼 C에서 용출버퍼 D 에 이르도록 2.5 컬럼 용량으로 선형 농도구배를 이용하여 단백질을 용출하였다. 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 통해 용출된 FactorⅦ 유도체 포함 단백질 용출액은 용출이 끝난 후 바로 크기 배체 크로마토그래피를 통해 20 mM Tris pH8.0 + 2 mM Benzamidine 버퍼로 버퍼교환 하였다. 여과 및 음이온 교환 크로마토그래피, 크기 배체 크로마토그래피 과정은 4 ℃ 조건에서 수행되었다. 크기 배체 크로마토그래피를 통해 버퍼교환된 시료를 음이온 교환 크로마토그래피에 부하하였다. 본 발명에서는 큐 세파로스 (Q Sepharose High Performance, GE Healthcare) 레진이 충진된 컬럼을 사용하였고 부하된 시료는 평형버퍼 A (20 mM Tris pH 8.0 + 2 mM Benzamidine) 와 용출버퍼 B (20 mM Tris pH 8.0 + 2 mM Benzamidine + 1 M NaCl) 용액을 이용하여 용출버퍼 B의 농도가 20 %에서 35 % 에 이르도록 15 컬럼 용량으로 선형 농도구배를 이용하여 단백질을 용출하였다. 용출된 FactorⅦ 유도체 단백질은 크기 배제 크로마토그래피를 통해 20 mM 인산칼륨 pH 5.5 버퍼로 제형화 하였으며 모든 과정은 4 ℃ 조건에서 수행되었다. 상기와 같이 Factor Ⅶ 유도체는 비활성활된 형태로 정제 후 보관이 가능하며 필요시 실시예 8에서와 같이 활성화한 Factor Ⅶa 유도체로의 전환이 가능하다.
실시예
8 : 정제된
Factor
Ⅶ 유도체의 활성화 단계
FactorⅦ 유도체 단백질을 활성화 (activation) 시키기 위해 정제된 FactorⅦ 유도체 시료를 평형버퍼 A (20 mM Tris pH 8.0 + 2 mM Benzamidine)로 평형화된 음이온 교환 크로마토그래피에 부하하였다. 음이온 교환 크로마토그래피는 소스 15큐(Source 15Q, GE Healthcare) 레진이 충진된 컬럼이 사용되었고 부하된 시료는 평형버퍼 A 와 용출버퍼 B (20 mM Tris pH8.0 + 2 mM Benzamidine + 25 mM NaCl + 35 mM CaCl2) 를 이용하여 5 % 용출버퍼 B 의 농도로 40 분간 on-column 활성화 과정을 거친 후, 용출버퍼 B를 이용하여 등용매 용리 방법으로 단백질을 용출하였다. 정제된 Factor Ⅶ 유도체의 활성화 단계는 상온에서 수행되었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.