WO2015007800A1 - Procédé d'extraction et de purification d'acides nucléiques et tampons mis en œuvre - Google Patents

Procédé d'extraction et de purification d'acides nucléiques et tampons mis en œuvre Download PDF

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WO2015007800A1
WO2015007800A1 PCT/EP2014/065311 EP2014065311W WO2015007800A1 WO 2015007800 A1 WO2015007800 A1 WO 2015007800A1 EP 2014065311 W EP2014065311 W EP 2014065311W WO 2015007800 A1 WO2015007800 A1 WO 2015007800A1
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WO
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buffer
sample
glycerol
washing
surfactant
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PCT/EP2014/065311
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Inventor
Justine LEMONNIER
Original Assignee
Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads

Definitions

  • the present invention belongs to the field of biology and, more particularly, to the field of molecular biology.
  • the present invention provides a method for extracting and purifying nucleic acids for one or more subsequent analysis (s) of the amplification or sequencing type.
  • the method according to the invention made from a sample containing nucleic acids uses buffers containing glycerol and particles or beads, magnetic or magnetizable.
  • the present invention also relates to the buffers used during this process and in particular the washing and optionally lysis buffers.
  • the lysis step of the methods of the prior art must make it possible to extract the nucleic acids from the material containing them while preserving their integrity.
  • the lysis step should be mild enough to preserve the nucleic acids while inhibiting or disabling the enzymes that destroy these nucleic acids, i.e. the nucleases.
  • the lysis can be mechanical, chemical and / or enzymatic.
  • Steps (ii) and (iii) correspond, strictly speaking, to the purification of the nucleic acids. These steps can implement one or more techniques selected from
  • a solvent extraction such as phenol-chloroform extraction
  • a precipitation such as an alcoholic precipitation or a precipitation with high saline concentrations
  • chromatographic technique such as gel filtration, ion exchange chromatography, adsorption chromatography or affinity chromatography and
  • centrifugation or ultracentrifugation such as centrifugation on cesium chloride.
  • This specific adsorption is linked to the charge of the beads such as positively or negatively charged beads or the presence, at the surface of the beads, of groups to which the nucleic acids bind such as anti-DNA antibodies or oligonucleotides such as poly (Thymine) oligonucleotides (or oligo (dT)).
  • US Patent 6,855,499 to Cortex Biochem Inc. aims to provide a simple method for isolating and purifying nucleic acids such as DNA (for "Deoxyribonucleic Acid”), RNA (for "RiboNucleic Acid”) or ANP (for "Peptide Nucleic Acid”) from various samples such as blood, milk, seminal fluid, tissue or bacterial cell lysates without centrifugation, alcohol and without preliminary preparation of the buffers.
  • the technical solution proposed in this patent consists in using cellulose particles which are in the form of magnetic or paramagnetic particles, coated with cellulose or one of its derivatives.
  • the bonding buffer described is composed of polyethylene glycol with a molar mass 8000 g / mol (or PEG 8000) at 10% and 1.25 M NaCl.
  • the washing buffer used also consists of PEG 8000 at 10% and NaCl but at 2.5 M.
  • the PROMEGA MagaZorb DNA mini prep kit is based on the protocol described in US Pat. No. 6,855,499.
  • the state of the art knows other commercial kits using magnetic beads in nucleic acid extraction and purification protocols.
  • the Silane Genomic DNA Kit from Life Technologies (Ref 370-12D) is proposed for the preparation of nucleic acids from blood samples.
  • alcohol of the ethanol or isopropanol type is used, which requires preparing the capture and wash pads by adding an alcohol before starting the extraction.
  • this protocol has other disadvantages that are incubation times greater than 3 minutes and 4 stages of DNA pellet-magnetic beads washing.
  • the inventors have realized that the commercial kits have considerably lower extraction and purification yields when they are used with other magnetic beads than those of the kit (see, for this purpose, example 5). of the experimental part below).
  • the inventors have set themselves the goal of proposing a simple process in terms of steps, preparatory protocols and reagents, for extracting and purifying nucleic acids, said method involving an adsorption or affinity chromatography step which can use any beads or particles, magnetic or paramagnetic.
  • the inventors have solved this technical problem and have found a solution to the disadvantages of the processes of the prior art by proposing a complete process making it possible to extract and purify nucleic acids from various samples by using lysis and polishing buffers. washing containing glycerol and this, using magnetizable particles of different origins.
  • the present invention provides a method for extracting and purifying at least one target nucleic acid contained in a sample, comprising the successive steps of:
  • step (b) contacting the cell lysate obtained after step (a) with magnetizable particles, under conditions allowing capture of said at least one target nucleic acid by said particles;
  • step (b) washing said magnetizable particles obtained following step (b) with a washing buffer preferably containing glycerol;
  • nucleic acid is meant, in the context of the present invention, a chromosome; a gene ; a regulatory polynucleotide; DNA, single-stranded or double-stranded, genomic, chromosomal, chloroplast, plasmidic, mitochondrial, recombinant or complementary; total RNA; messenger RNA; ribosomal RNA; a transfer RNA; an ANP; a portion or a fragment thereof.
  • nucleic acid used in the present invention is equivalent to the following terms and expressions: “nucleotide molecule”, “polynucleotide”, “nucleotide sequence” and “polynucleotide sequence”.
  • target nucleic acid (s) designates the nucleic acid (s) which it is desired to extract and purify by means of the claimed process.
  • sample used in the context of the process according to the present invention can be of very varied nature and source. In general, it is any sample for which it is desired to extract and purify the nucleic acids or it contains or by which it is contaminated.
  • this sample may be a biological fluid; a vegetable fluid such as sap, nectar and root exudate; a sample in a culture medium or in a biological culture reactor such as a cell culture of higher eukaryotes, yeasts, fungi, bacteria, viruses or algae; a liquid obtained from an animal or plant tissue; an animal or plant tissue; one or more cells; a cellular pellet; a sample taken from a food matrix, preferably diluted in a buffer; a sample taken from a chemical reactor; a sample from a treatment plant; a sample from a composting station; city, river, pond, lake, sea, swimming pool, air-cooled or underground water; a sample from a liquid industrial effluent; waste water, particularly from intensive livestock farms or chemical, pharmaceutical or cosmetic industries; a sample from an air filtration or coating; a sample on an object such as a piece of cloth, a coat, a sole, a shoe, a tool, a weapon, etc. ; a product pharmaceutical; a cosmetic product
  • sampling any type of sample collection, for example, by contact, scraping, drilling, cutting, punching, grinding, washing, rinsing, suction, pumping, etc ...
  • the biological fluid is preferably selected from the group consisting of blood such as whole blood or anti-coagulated whole blood, blood serum, blood plasma, lymph, saliva, sputum, tears, sweat, sperm, urine, stool, milk, cerebrospinal fluid, interstitial fluid, isolated bone marrow fluid, mucus or fluid of the respiratory tract, intestinal or genitourinary tract, cell extracts, extracts of tissues and organ extracts.
  • the biological fluid may be any fluid naturally secreted or excreted from a human or animal body or any fluid recovered from a human or animal body by any technique known to those skilled in the art such as extraction. , a sample or a wash. The steps of recovery and isolation of these different fluids from the human body or animal are performed prior to the implementation of the method according to the invention.
  • the sample used in the context of the present invention may contain, by its nature or possibly following contamination, one (or more) cells (identical or different).
  • cell is meant, in the context of the present invention, both a prokaryotic type of cell and eukaryotic type.
  • the cell may be a yeast such as a yeast of the genus Saccharomyces or Candida, a plant cell or an animal cell such as a mammalian or insect cell.
  • Prokaryotic cells are bacteria that can be Gram positive or Gram - positive.
  • bacteria belonging to the branches of spirochetes and chlamydiae mention may be made, by way of examples and in a non-exhaustive manner, of the bacteria belonging to the branches of spirochetes and chlamydiae, the bacteria belonging to the families of Enterobacteriaceae (such as Escherichia coli), Streptococcaceae (such as Streptococcus and, in particular, Streptococcus pneumoniae), microbacteria (such as Staphylococcus), legionellae, mycobacteria, bacillaceae and others.
  • Enterobacteriaceae such as Escherichia coli
  • Streptococcaceae such as Streptococcus and, in particular, Streptococcus pneumoniae
  • microbacteria such as Staphylococcus
  • legionellae mycobacteria
  • mycobacteria bacillaceae and others.
  • this implementation and in particular the extraction and purification method as defined below further comprises a preliminary step of preparing the sample with possible dissolution of the sample by the known techniques of those skilled in the art such as filtration, precipitation, dilution, distillation, mixing, concentration, etc.
  • Step (a) of the process according to the present invention consists, as in the known methods of extraction and purification of nucleic acids, in extracting the nucleic acids from the sample containing them while preserving their integrity, and in particular inhibiting or disabling enzymes that lyse target nucleic acids.
  • the lysis during step (a) is a chemical and enzymatic lysis step. Any lysis buffer for chemical and enzymatic lysis known to those skilled in the art can be used in the context of the present invention.
  • the lysis buffer implemented during step (a) of the process according to the invention contains glycerol.
  • the lysis buffer used in the context of the present invention is a buffer containing glycerol, at least one surfactant and at least one chaotropic agent.
  • the lysis buffer used in the context of the present invention advantageously contains glycerol in an amount of between 1 and 40%, in particular between 5 and 20%, in particular between 7 and 15% and, more particularly, order of 10% (ie 10% ⁇ 2%) by mass relative to the total mass of the lysis buffer (ie mass percentage). It is believed that the presence of glycerol in the lysis buffer is not necessary, but advantageous, as it increases the total yield of the protocol.
  • the lysis buffer used in the context of the present invention contains at least one surfactant, the latter participating in chemical lysis.
  • surfactant is understood to mean a molecule comprising a lipophilic (apolar) and a hydrophilic (polar) part. Any surfactant capable of solubilizing cell membranes and membrane lipids can be used in the context of the present invention.
  • this surfactant is chosen from anionic surfactants, cationic surfactants, zwitterionic surfactants, amphoteric surfactants and nonionic surfactants.
  • the lysis buffer according to the invention can comprise several surfactants belonging to the same family of surfactants previously listed (i.e. anionic, cationic, zwitterionic, amphoteric or nonionic) or several surfactants belonging to at least two distinct families of surfactants.
  • anionic surfactants are surfactants whose hydrophilic part is negatively charged such as alkyl or aryl sulfonates, sulfates, phosphates, sulfosuccinates or sarcosinates associated with a counterion such as an ammonium ion (NH 4 + ), a quaternary ammonium such as as tetrabutylammonium, and alkaline cations such as Na + , Li + and K + .
  • a counterion such as an ammonium ion (NH 4 + )
  • a quaternary ammonium such as as tetrabutylammonium
  • alkaline cations such as Na + , Li + and K + .
  • anionic surfactants it is possible, for example, to use tetraethylammonium paratoluenesulphonate, sodium dodecyl sulphate (or SDS), sodium laurylsarcosinate (or sarcosyl), sodium palmitate, sodium stearate, sodium myristate, sodium di (2-ethylhexyl) sulfosuccinate, methylbenzene sulfonate and ethylbenzene sulfonate.
  • the cationic surfactants are surfactants whose hydrophilic part is positively charged, in particular chosen from quaternary ammoniums comprising at least one C 4 -C 22 aliphatic chain associated with an anionic counterion chosen in particular from boron derivatives such as tetrafluoroborate or halide ions such as F “ , Br “ , “ or Cl “ .
  • Zwitterionic surfactants are neutral compounds having formal electric charges of one unit and opposite sign, in particular chosen from compounds having a C 5 -C 20 alkyl chain generally substituted with a negatively charged function such as a sulfate or a carboxylate and a function positively charged like an ammonium.
  • Zwitterionic surfactants include sodium N, N dimethyl dodecyl ammonium butanate, sodium dimethyl dodecyl ammonium propanate and amino acids.
  • Amphoteric surfactants are compounds that act as either an acid or a base depending on the medium in which they are placed. As amphoteric surfactants, it is possible to use disodium lauroamphodiacetate and betaines such as alkylamidopropylbetaine or laurylhydroxysulfobetaine.
  • Nonionic surfactants also known as neutral surfactants, are surfactants which have no group capable of being ionized in water at a neutral pH or near neutral. Such surfactants are, however, amphipathic since they contain lipophilic entities and hydrophilic entities.
  • the surfactant properties of nonionic surfactants, in particular hydrophilicity, are provided by uncharged functional groups such as an alcohol, an ether, an ester or an amide, containing heteroatoms such as a nitrogen atom or a nitrogen atom. oxygen atom. Because of the low hydrophilic contribution of these functions, the nonionic surfactant compounds are most often polyfunctional. Any nonionic surfactant known to those skilled in the art can be used in the context of the present invention.
  • alkoxylates of alkyls, fatty alcohols, fatty amines, fatty acids, oxoalcohols or alkylphenols can be used in the context of the present invention; ethoxylates of alkyls, fatty alcohols, fatty amines, fatty acids, oxoalcohols or alkylphenols; monoesters (monolaurate, monomyristate, monostearate, monopalmitate, monooleate, etc.), phospholipids and polyesters of fatty acids and glycerol; polyglycerolated fatty amides having an average of 1 to 5; oxyethylenated sorbitan fatty acid esters having from 2 to 30 moles of ethylene oxide; monoesters (monolaurate, monomyristate, monostearate, monopalmitate, monooleate, etc.) and polyesters of fatty acids and sorbitan, monoesters of polyoxyethylene
  • the (or) surfactant (s) used during step (a) are advantageously chosen from nonionic surfactants and anionic surfactants and mixtures thereof.
  • nonionic surfactants used in step (a) are advantageously chosen from polyethoxylated ethers, polyoxyethylene sorbitan monoesters and mixtures thereof.
  • the surfactant (s) used during step (a) are chosen from the group consisting of polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (or Triton X- 100® ), polyoxyethylene monolaurate. sorbitan 20 (or Tween 20® ), sodium dodecyl sulphate (or SDS), sodium lauryl sarcosinate (or sarcosyl) and mixtures thereof.
  • the lysis buffer implemented during step (a) of the process according to the invention comprises a mixture of SDS and Tween 20® and advantageously a mixture of 1% SDS. 20% by mass and Tween 20 ® relative to the total mass of the lysis buffer.
  • the lysis buffer used in the context of the present invention contains at least one chaotropic agent, the latter also participating in chemical lysis.
  • chaotropic agent is meant, in the context of the present invention, a salt which modifies the solubility of proteins and may cause their precipitation.
  • Some of the chaotropic agents usable in the lysis buffer of the invention may further affect the three-dimensional structure of the proteins and denature them. Any chaotropic agent known to those skilled in the art can be used in the context of the present invention.
  • the chaotropic agent used in the context of the present invention is selected from the group consisting of sodium chloride (NaCl), ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 SO 4 ), sodium perchlorate (NaClO 4 ), sodium iodide (NaI), lithium chloride (LiCl), lithium perchlorate (LiClO 4 ), barium (BaCl 2 ), cesium chloride (CsCl 2 ), potassium chloride (KCl), potassium iodide (Kl), urea (CO (NH 2 ) 2 ), a guanidine salt such as Guanidine thiocyanate (GuSCN) and mixtures thereof.
  • NaCl sodium chloride
  • Ammonium sulfate (NH 4 ) 2 SO 4 )
  • NaClO 4 sodium perchlorate
  • NaI sodium iodide
  • LiCl lithium chloride
  • LiClO 4 lithium perchlorate
  • the chaotropic agent used in the context of the present invention is a mixture of sodium chloride and guanidine thiocyanate.
  • the sodium chloride is at a concentration greater than or equal to 0.5 M and in particular of the order of 1 M (ie 1 M ⁇ 0.2 M) and the thiocyanate guanidine is at a concentration of between 0.5 and 1 M and in particular of the order of 0.85 M (ie 0.85 M ⁇ 0.1 M).
  • the lysis buffer implemented in the context of step (a) of the process according to the present invention may further comprise at least one element capable of inhibiting DNAses and RNAses and / or at least one element capable of destroying bridges. disulfide in proteins or to prevent their reformation.
  • said lysis buffer may further comprise at least one member selected from a thiol; a reducing agent such as ⁇ -mercaptoethanol or dithiothreitol (DTT); ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) and a citrate.
  • nucleic acids in the sample are not target nucleic acids and, in fact, must be removed, such as, for example, DNA or RNA
  • these compounds mention may be made of sodium hydroxide (NaOH), a RNAse and a DNAse.
  • the amount of lysis buffer used is such that the ratio (v / v) sample / lysis buffer is between 1/3 and 3, in particular between 1 / 2 and 2 and, in particular, this ratio is equal to 1.
  • step (a) of the process according to the present invention is a lysis not only chemical but also enzymatic, it is necessary to add to the mixture constituted by the sample and the lysis buffer, a protease and advantageously at least one endoprotease and this, to achieve enzymatic digestion (or enzymatic proteolysis) of the proteins of the sample and lead to the formation of fragments more or less short peptides from the proteins contained in the sample.
  • a protease and advantageously at least one endoprotease and this, to achieve enzymatic digestion (or enzymatic proteolysis) of the proteins of the sample and lead to the formation of fragments more or less short peptides from the proteins contained in the sample.
  • endoproteases specific or not, usable during step (a) of the method according to the invention.
  • the protease (s) used during step (a) of the process is (are) chosen from the group consisting of proteinase K, subtilisin, pepsin, trypsin, chymotrypsin, thrombin, thermolysin, HIV protease, elastase, factor Xa, a thiol endopeptidase such as capain or a caspase, a lysine-specific endopeptidase (endoLysN), a specific endopeptidase arginine (endoArgC) and endopeptidase specific for glutamic acid (endoGluC).
  • proteinase K subtilisin
  • pepsin trypsin
  • chymotrypsin chymotrypsin
  • thrombin thermolysin
  • HIV protease elastase
  • factor Xa a thiol endopeptidase
  • the protease more particularly implemented during step (a) of the process is a non-specific endoprotease and advantageously proteinase K. More particularly, this proteinase K is used at a concentration of between 0.1 and 5 mg / ml. , in particular between 0.4 and 2 mg / ml and in particular between 0.7 and 1.5 mg / ml of solution implemented in step (a).
  • solution implemented during step (a) is meant the solution formed from the sample, the lysis buffer and proteinase K.
  • the solution implemented during step (a) of the process according to the invention is homogenized manually or by vortexing and maintained at a temperature of between 40 and 65 ° C., in particular between 50 and 60 ° C. and, in particular, of the order of 56 ° C (ie 56 ° C ⁇ 3 ° C) for a period of between 2 and 30 min, in particular between 5 and 20 min and, in particular, of the order of 10 min (ie 10 min ⁇ 3 min).
  • a cell lysate containing the target nucleic acid (s) is obtained following step (a) of the process according to the present invention.
  • Step (b) consists in bringing the cell lysate obtained in step (a) into contact with magnetizable particles capable of reversibly capturing, by adsorption or via specific interactions, nucleic acids.
  • magnetizable particles is meant particles having magnetic properties only when subjected to a magnetic field. All magnetizable particles known to those skilled in the art can be used in the context of the present invention.
  • magnetizable particles used in the context of the present invention are substantially spherical and their average diameter is advantageously between 0.5 and 100 ⁇ and in particular between 1 and 50 ⁇ .
  • the terms "magnetizable particle”, “particle (para) magnetic”, “magnetizable ball” and “ball (para) magnetic” are equivalent and can be used interchangeably.
  • the magnetizable particles used in the context of the present invention comprise magnetic grains (or nanoparticles) and an organic or inorganic matrix.
  • magnetic grains or nanoparticles
  • organic or inorganic matrix Depending on the process used to prepare these magnetizable nanoparticles, it is possible to obtain different structures such as (i ') nanoparticles of heart / shell type with the core comprising the magnetic grains and the shell formed by the organic or mineral matrix or ( ⁇ ') nanoparticles in which the magnetic grains are uniformly distributed in the organic or mineral matrix.
  • the magnetic grains are in at least one material selected from the group consisting of metal oxides of iron, titanium, cobalt, zinc, copper, manganese or nickel; magnetite; Maghampte; hematite; ferrites of manganese, nickel or manganese-zinc and cobalt-nickel alloys.
  • the organic matrix of the magnetizable particles used in the context of the present invention is a natural or synthetic organic polymer and, for example, selected from the group consisting of albumin; cellulose and its derivatives in particular as defined in US Pat. No. 6,855,499; polyacrylates such as poly (acrylic acid) and poly (hydroxyethyl methacrylate); polyvinyl alcohol and polystyrene.
  • a mineral matrix is advantageously present in the form of silica gel.
  • the magnetizable particles used in the context of the present invention can capture the nucleic acids at their surface by adsorption.
  • this capture involves Van der Waals interactions, electrostatic interactions, hydrogen bonds or hydrophobic interactions.
  • the adsorption of the nucleic acids on the magnetizable particles is done by means of electrostatic interactions and hydrogen bonds.
  • the magnetizable particles have, at their surface, groups participating in such interactions or bonds, such as cationic or anionic groups. These groups are carried, intrinsically or by functionalization, by the particle matrix.
  • the magnetizable particles implemented in the context of the present invention can capture the nucleic acids to the surface through specific interactions.
  • This form of implementation requires the functionalization, covalent or otherwise, of the surface of the particles by an element capable of capturing the target nucleic acids such as, for example, by hybridization.
  • an element is advantageously chosen from the group consisting of an oligonucleotide complementary to a specific sequence present in the target nucleic acids, a poly (thymine) oligonucleotide, streptavidin, biotin or an anti-DNA antibody.
  • magnetizable particles possibly functionalized as previously defined.
  • commercial magnetizable particles may be used.
  • such particles include the Silanol balls (CHEMICELL), the balls MagPrep HS ® (Merck Estapor® SAS), Dynabeads ® MyOne TM beads (Life Technologies), the Dynabeads ® Streptavidin (Life Technologies) and MagaZorb ® beads (PROMEGA).
  • the ratio between the volume of sample during step (a) and the volume of magnetizable particles implemented during step (b) is between 1 and 50, in particular between 5 and 25 and, in particular, of the order of 10 (ie 10 ⁇ 2).
  • a capture buffer comprises at least one solvent selected from the group consisting of 1,2-butanediol; 1,2-propanediol; 1,3-butanediol; 1-methoxy-2-propanol acetate; 3-methyl-1,3,5-pentanetriol; a dibasic ester such as DBE-2, DBE-3, DBE-4, DBE-5 or DBE-6; diethylene glycol monoethyl ether (DGME); diethylene glycol monoethyl ether acetate (DGMEA); ethyl lactate; ethylene glycol; poly (2-ethyl-2-oxazoline); a sodium salt of a copolymer of 4-styrene sulfonic acid and maleic acid; te
  • the capture buffer implemented during said step (b) of the process according to the invention comprises at least two solvents as previously defined.
  • the capture buffer implemented during said step (b) of the process according to the invention is a mixture of two solvents as previously defined.
  • the capture buffer implemented during said step (b) of the process according to the invention is a mixture of TEG and 1,2-butanediol and, typically, a 60% (v / v) mixture of TEG and 40% (v / v) 1,2-butanediol.
  • the mixture used during step (b) of the process according to the invention containing the cell lysate, the magnetizable particles and the capture buffer as previously defined is homogenized manually or by vortexing and maintained at a temperature of between 10 ° C. and 40 ° C, advantageously between 15 and 30 ° C and, more particularly, at room temperature (ie 23 ° C ⁇ 5 ° C) and for a period of between 2 and 30 ° min, especially between 5 and 20 min and, in particular, of the order of 10 min (ie 10 min ⁇ 3 min).
  • the magnetizable particles have captured the nucleic acid (s) target (s).
  • Step (c) of the process according to the present invention consists in separating the magnetizable particles which have captured the target nucleic acids from the medium containing said particles at the end of step (b) and, in particular, of the other elements not captured by the magnetizable particles (ie not bound to these) present in this medium.
  • the latter is formed from the sample, the lysis buffer, the proteinase K and the capture buffer.
  • step (c) of the process according to the present invention consists in (ci) subjecting the magnetizable particles which have captured the target nucleic acid (s) to a magnetic field, (c 2 ) removing the liquid phase ie the medium surrounding said magnetizable particles, (c 3 ) adding a washing buffer and (c 4 ) resuspending said magnetizable particles in said wash buffer by suppressing the magnetic field, said steps (c 3 ) and (c 4 ) can be performed one after the other or simultaneously.
  • Steps (ci) to (c 4 ) are conventional steps in the various fields using magnetizable particles.
  • the magnetic field (or magnetic force) can be applied (e) during step (ci), by means of a magnet or a magnetic bench. Any technique for removing a liquid can be used in the context of step (c 2 ). By way of examples, this elimination can be carried out by inversion, tapping, absorption or aspiration.
  • Step (c) of the process according to the present invention and steps (ci) to (c 4 ) can be repeated at least once.
  • the washing buffer implemented during step (c) or (c 3 ) may be identical to or different from the washing buffer implemented during step (c) or (c 3 ) previous.
  • any washing buffer implemented in any of steps (c) or (c 3 ) contains glycerol, a surfactant and optionally a chaotropic agent as defined above.
  • the washing buffer (s) used in the context of the present invention contains (nen) glycerol in an amount of between 1 and 40%, in particular between 5 and 30% and, in particular, between 7 and 25% by weight relative to the total mass of the washing buffer.
  • the washing buffer (s) used in the context of the present invention contains (a) a surfactant, in particular a surfactant of the family of ethylenes glycols, for example a tetraethylene glycol (TEG) or a polyalkylene glycol.
  • a surfactant in particular a surfactant of the family of ethylenes glycols, for example a tetraethylene glycol (TEG) or a polyalkylene glycol.
  • TEG tetraethylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • the polyethylene glycol in the washing buffer (s) has a molar mass greater than 1000 g / mol, in particular greater than 2000 g / mol, in particular between 4000 and 10000 g / mol and, more particularly, between 6000 and 8000 g / mol.
  • the washing buffer (s) used in the context of the present invention contains (a) a surfactant of the family of ethylene glycols and in particular tetraethylene glycol or polyethylene glycol in an amount of between 1 and 40%, especially between 5 and 30% and, in particular, between 7 and 25% by weight relative to the total mass of the washing buffer.
  • the solvent of the washing buffer (s) is typically selected from Tris at a concentration of between 5 and 50 mM, Tris base at a concentration between 5 and 50 mM, Tris / HCl at a concentration of between 5 and 50 mM, triethanolamine at a concentration between 5 and 50 mM or a mixture thereof.
  • the pH of the wash buffer is preferably of the order of 8 (i.e. 8 ⁇ 0.5).
  • the ratio between the volume of washing buffer implemented during each step (c) and the volume of magnetizable particles implemented during step (b) is between 10 and 200, in particular between 25 and 100, and in particular, of the order of 50 (ie 50 ⁇ 5).
  • Step (c) of the process according to the present invention and in particular steps (ci) and (c 4 ) are carried out at a temperature between 10 and 40 ° C, advantageously between 15 and 30 ° C and, more particularly, at room temperature (ie 23 ° C ⁇ 5 ° C).
  • the washing step is repeated twice.
  • the washing buffer used during the 1st washing step comprises glycerol, a surfactant such as a surfactant of the family of ethylenes glycols and a chaotropic agent as defined above and in particular glycerol, PEG and a chaotropic agent or glycerol , TEG and a chaotropic agent as previously defined, while the washing buffer used in the 2 nd washing step comprises glycerol and a surfactant as a surfactant in the family ethylene glycols as previously defined and in particular glycerol and PEG or glycerol and TEG as previously defined.
  • a surfactant such as a surfactant of the family of ethylenes glycols and a chaotropic agent as defined above and in particular glycerol, PEG and a chaotropic agent or glycerol , TEG and a chaotropic agent as previously defined
  • the washing buffer used in the 2 nd washing step comprises glycerol and a
  • Step (d) of the process according to the present invention consists in putting the target nucleic acid (s) back in solution by unclipping, by means of an elution buffer, the (or) the nucleic acid (s) target (s) of the magnetizable particles. During this stall, the non-covalent and low stability bonds between the target nucleic acid (s) and the magnetizable particles are broken by the action of the elution buffer, optionally combined with operating conditions of step (d) such as heating.
  • step (d) of the process according to the present invention consists in (di) subjecting the magnetizable particles to a magnetic field, (d 2 ) removing the washing buffer, (d 3 ) adding an elution buffer and ( d 4 ) resuspending said magnetizable particles in said elution buffer by suppressing the magnetic field, said steps (d 3 ) and (d 4 ) being performed one after the other or simultaneously.
  • Steps (di) to (d 4 ) are also conventional steps in the different fields using magnetizable particles.
  • the magnetic field (or magnetic force) can be applied during step (di) by means of a magnet or a magnetic bench. Any technique for removing a liquid can be used in the context of step (d 2 ). By way of examples, this elimination can be carried out by inversion, tapping, absorption or aspiration.
  • the elution buffer implemented during step (d) or (d 3 ) may be any elution buffer known to those skilled in the art and adapted to the type of capture implemented during the step ( b) prior to adsorption or specific interactions.
  • a buffer selected from Tris at a concentration of between 5 and 50 mM, Tris base at a concentration of between 5 and 50 mM, Tris / HCl. at a concentration of between 5 and 50 mM, triethanolamine at a concentration of between 5 and 50 mM or a mixture thereof.
  • the pH of the elution buffer is advantageously of the order of 9 (ie 9 ⁇ 0.5).
  • the ratio between the volume of elution buffer implemented during each step (d) and the volume of magnetizable particles implemented during step (b) is between 1 and 20, in particular between 2 and 10, and in particular, of the order of 5 (ie 5 ⁇ 1).
  • Step (d) of the process according to the present invention and in particular step (d 4 ) can be carried out at a temperature of between 40 and 80 ° C., in particular between 50 and 70 ° C. and, in particular, with 60 ° C (ie 60 ° C ⁇ 5 ° C), the steps (di) to (d 3 ) being, in turn, be carried out at a temperature between 10 and 40 ° C, preferably between 15 and 30 ° C and, more particularly, at room temperature (ie 23 ° C ⁇ 5 ° C).
  • step (d) of the process according to the present invention and in particular step (d 4 ) can be carried out with stirring and for a period of between 1 and 15 min, especially between 2 and 7 min and, in particular, of the order of 3 min (ie 3 min ⁇ 1 min).
  • This stirring is carried out by means of a magnetic stirrer and at a speed greater than or equal to 100 rpm, especially greater than or equal to 500 rpm and, in particular, between 1000 and 1500 rpm.
  • step (d) of the process according to the invention it is easy to recover the elution buffer containing the target nucleic acid (s) by eliminating the magnetizable particles and this, by applying a magnetic field.
  • the present invention also relates to the lysis and washing buffers that can be used in a process as defined above.
  • the present invention relates to a lysis buffer capable of being implemented in a process as defined above, containing at least one surfactant, at least one chaotropic agent and glycerol as previously defined.
  • a lysis buffer capable of being implemented in a process as defined above, containing at least one surfactant, at least one chaotropic agent and glycerol as previously defined.
  • a particular example of such a lysis buffer is given in the experimental section hereinafter.
  • the present invention relates to a washing buffer that can be used in a process as defined above, containing glycerol, a surfactant, especially a surfactant of the family of ethylene glycols such as a TEG or a polyalkylene glycol and optionally a chaotropic agent as defined above and in particular containing glycerol, TEG or PEG and optionally a chaotropic agent as defined above.
  • a washing buffer that can be used in a process as defined above, containing glycerol, a surfactant, especially a surfactant of the family of ethylene glycols such as a TEG or a polyalkylene glycol and optionally a chaotropic agent as defined above and in particular containing glycerol, TEG or PEG and optionally a chaotropic agent as defined above.
  • the present invention also relates to a kit comprising at least one lysis buffer as defined above and at least one washing buffer as previously defined.
  • the kit according to the invention comprises a lysis buffer and two wash buffers as given in the experimental part below or a lysis buffer and the washing buffer No. 2 such as given in the experimental part below.
  • the kit according to the present invention may further contain at least one member selected from the group consisting of (i ") a protease, especially an endoprotease and, in particular, proteinase K; (ii") a capture buffer such as previously defined; (iii ") an elution buffer as previously defined and (iv”) magnetizable particles as defined above.
  • the present invention further relates to the use of a lysis buffer, a wash buffer and a kit as previously defined for extracting and purifying target nucleic acids in a sample, said extraction and purification using particles. magnetizable.
  • the present invention relates, on the one hand, to a method for lysing a sample comprising contacting said sample with a lysis buffer according to the invention and, on the other hand, a method for washing the samples. particles magnetizable particles having captured at least one target nucleic acid comprising contacting said particles with a washing buffer according to the invention.
  • Figure 1 is a schematic representation of the method according to the present invention.
  • Figure 2 shows the percent purification of the DNA as a function of the amount of glycerol contained in the lysis buffer and the wash buffers.
  • Figure 3 shows the percentage of purification of the DNA according to the amount of glycerol contained in the lysis buffer.
  • Figure 4 shows the percentage of purification of the DNA as a function of the amount of glycerol contained in Wash Buffer No. 1.
  • Figure 5 shows the percentage of purification of the DNA as a function of the amount of glycerol contained in Wash Buffer No. 2.
  • FIG. 6 shows the threshold cycle or Ct value for a supernatant obtained with the PROMEGA commercial process using the magnetic beads referred to as the MagaZorb beads or other non-referenced commercial beads that are the MyOne Dynabeads beads.
  • Figure 7 shows the threshold cycle or Ct value for a supernatant obtained with the method according to the present invention using different magnetic beads.
  • wash buffer (2 M GuSCN, 10 mM Tris-HCl pH 8, PEG8000 10%, Glycerol A%);
  • the DNA is analyzed by qPCR using primers specific for the targeted pathogens.
  • DNA extraction is obtained as soon as 1% of glycerol is added, for certain bacterial samples. It is the same for the protocol using 20% glycerol in the lysis and washing buffers. The best extraction results for all samples are obtained when the lysis buffer and wash buffers contain 10% glycerol.
  • Example 2 Variation of the concentration of glycerol present in the lysis buffer.
  • the concentration in the lysis buffer denoted "B%" and corresponding to the glycerol mass with respect to the total mass of solution represents 0%, 1%, 10% or 20%.
  • wash buffer (10 mM Tris-HCl pH 8, PEG8000 20%, Glycerol 20%);
  • the DNA is analyzed by qPCR using primers specific for the targeted pathogens.
  • wash buffer (2M GuSCN, 10mM Tris-HCl pH 8, PEG8000 10%, Glycerol C%);
  • wash buffer (10 mM Tris-HCl pH 8, PEG8000 20%, Glycerol 20%);
  • the DNA is analyzed by qPCR using primers specific for the targeted pathogens.
  • the DNA is analyzed by qPCR using primers specific for the targeted pathogens.
  • Example 5 PROMEGA commercial extraction protocol set with different beads.
  • the quantity of amplicons produced at each cycle is monitored by measuring the fluorescence.
  • the threshold cycle or Ct for "cycle treshold"
  • the results of the Ct supernatants obtained by the PROM EGA protocol using the magnetic beads referenced (MagaZorb, PROM EGA) or unreferenced commercial beads (Dynabeads MyOne, Life Technologies) are given in FIG. 6.
  • the eluate obtained contains the DNA of three pathogens (E. coli, S. epidermidis, S. pneumoniae).
  • Figure 6 shows the Ct obtained for each pathogen.
  • Example 6 Process according to the invention with magnetic beads from different suppliers.
  • wash buffer (2M GuSCN, 10mM Tris-HCl pH 8, PEG8000 10%, Glycerol 10%);
  • wash buffer (10 mM Tris-HCl pH 8, PEG8000 20%, Glycerol 20%);
  • Figure 7 shows the Ct obtained, corresponding to the DNA extracted from E.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé pour extraire et purifier au moins un acide nucléique cible contenu dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à (a) mettre en contact l'échantillon avec un tampon de lyse contenant éventuellement du glycérol moyennant quoi un lysat cellulaire est obtenu; (b) mettre en contact le lysat cellulaire obtenu après l'étape (a) avec des particules magnétisables, dans des conditions permettant la capture dudit au moins un acide nucléique cible par lesdites particules; (c) laver lesdites particules magnétisables obtenues suite à l'étape (b) avec un tampon de lavage contenant du glycérol; (d) mettre en contact lesdites particules lavées obtenues après l'étape (c) avec un tampon d'élution, dans des conditions permettant la libération dudit acide nucléique cible dans le tampon d'élution. La présente invention concerne également lesdits tampons de lyse et de lavage.

Description

PROCÉDÉ D'EXTRACTION ET DE PURIFICATION D'ACIDES NUCLÉIQUES
ET TAMPONS MIS EN ŒUVRE
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention appartient au domaine de la biologie et, plus particulièrement, au domaine de la biologie moléculaire.
Plus particulièrement, la présente invention propose un procédé permettant d'extraire et de purifier des acides nucléiques et ce, en vue d'une (ou plusieurs) analyse(s) ultérieure(s) du type amplification ou séquençage. Le procédé selon l'invention réalisé à partir d'un échantillon contenant des acides nucléiques utilise des tampons contenant du glycérol et des particules ou billes, magnétiques ou magnétisables.
La présente invention concerne également les tampons mis en œuvre durant ce procédé et notamment les tampons de lavage et éventuellement de lyse.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE En biologie moléculaire, de nombreux travaux et études sont réalisés sur les acides nucléiques et ce, dans des domaines englobant notamment la recherche académique ; la recherche et les analyses, cliniques et diagnostiques, avec des essais réalisés sur des prélèvements de sang ou des biopsies cellulaires ou tissulaires ; la surveillance environnementale ; la surveillance civile ; la sécurité alimentaire et notamment le contrôle qualité ; les analyses criminelles sur traces... Ces travaux et études nécessitent tous l'extraction et la purification préalables de ces acides nucléiques.
Différents procédés sont connus à l'heure actuelle pour réaliser de telles extraction et purification. La diversité dans ces procédés est la conséquence des différents critères et paramètres dont il faut tenir compte tels que, par exemple, l'acide nucléique cible, le matériel le contenant, l'organisme source de ce matériel et l'utilisation ultérieure de cet acide nucléique cible. Toutefois, la plupart des procédés présentent une séquence d'étapes consistant à (i) lyser le matériel contenant le (ou les) acide(s) nucléique(s) cible(s), (ii) éliminer les composés contaminants notamment du type protéique, présents dans l'extrait obtenu suite à l'étape (i) et (iii) récupérer le (ou les) acide(s) nucléique(s) cible(s).
L'étape de lyse des procédés de l'art antérieur doit permettre d'extraire les acides nucléiques du matériel les contenant tout en préservant leur intégrité. En d'autres termes, l'étape de lyse doit être suffisamment douce pour préserver les acides nucléiques tout en inhibant ou désactivant les enzymes qui détruisent ces acides nucléiques i.e. les nucléases. Lors de cette étape, la lyse peut être mécanique, chimique et/ou enzymatique.
Les étapes (ii) et (iii) correspondent, à proprement parler, à la purification des acides nucléiques. Ces étapes peuvent mettre en œuvre une ou plusieurs techniques choisies parmi
- une extraction par solvants telle qu'une extraction par phénol- chloroforme ;
- une précipitation telle qu'une précipitation alcoolique ou une précipitation avec de fortes concentrations salines ;
- une technique chromatographique telle qu'une filtration sur gel, une chromatographie par échange d'ions, une chromatographie par adsorption ou une chromatographie par affinité et
- une centrifugation ou une ultracentrifugation telle qu'une centrifugation sur chlorure de césium.
Certaines des techniques présentées ci-dessus mettent en œuvre des réactifs dont la manipulation nécessite des précautions comme le phénol. Elles peuvent avoir recours à un appareillage lourd tel qu'une ultracentrifugeuse ou à de nombreuses étapes rendant le processus d'extraction et de purification long. Ces différents inconvénients rendent difficile une automatisation des procédés d'extraction et de purification utilisant de telles techniques.
Dans les techniques développées sur la base de la chromatographie d'adsorption ou d'affinité, certaines mettent en œuvre des billes magnétiques ou paramagnétiques qui présentent la capacité d'adsorber spécifiquement des acides nucléiques. Cette adsorption spécifique est liée à la charge des billes telles que des billes chargées positivement ou négativement ou à la présence, au niveau de la surface des billes, de groupements auxquels se lient les acides nucléiques tels que des anticorps anti- ADN ou des oligonucléotides tels que des oligonucléotides poly(Thymine) (ou oligo(dT)).
Ainsi, le brevet US 6 855 499 au nom de Cortex Biochem Inc. vise à fournir un procédé simple pour isoler et purifier les acides nucléiques tels que ADN (pour « Acide DésoxyriboNucléique »), ARN (pour « Acide RiboNucléique »)ou ANP (pour « Acide Nucléique Peptidique ») à partir d'échantillons divers comme du sang, du lait, du fluide séminal, un tissu ou des lysats cellulaires bactériens et ce, sans centrifugation, sans alcool et sans préparation préliminaire des tampons. La solution technique proposée dans ce brevet consiste à utiliser des particules de cellulose qui se présentent sous forme de particules magnétiques ou paramagnétiques, enrobées par de la cellulose ou un de ses dérivés. En ajustant la concentration en sels et en polyalkylène glycol dans une solution contenant des acides nucléiques et les particules de cellulose, il est possible d'obtenir la fixation des acides nucléiques sur ces particules. Plus particulièrement, le tampon de liaison décrit est constitué de polyéthylène glycol de masse molaire 8000 g/mol (ou PEG 8000) à 10% et 1,25 M de NaCI. De même, le tampon de lavage mis en œuvre est également constitué de PEG 8000 à 10% et de NaCI mais à 2,5 M. Le kit PROMEGA MagaZorb DNA mini prep est basé sur le protocole décrit dans le brevet US 6 855 499.
L'état de la technique connaît d'autres kits commerciaux utilisant des billes magnétiques dans des protocoles d'extraction et de purification des acides nucléiques. Par exemple, le Kit Silane Genomic DNA de Life Technologies (Ref 370-12D) est proposé pour la préparation d'acides nucléiques à partir d'échantillons sanguins. Dans ce kit, de l'alcool du type éthanol ou isopropanol est utilisé, ce qui nécessite de préparer les tampons de capture et de de lavages en y ajoutant un alcool avant de commencer l'extraction. En plus de l'utilisation d'éthanol, ce protocole présente d'autres inconvénients que sont des temps d'incubation supérieurs à 3 min et 4 étapes de lavages du culot ADN-billes magnétiques. Les inventeurs se sont rendu compte que les kits commerciaux présentent des rendements d'extraction et de purification bien moins bons lorsqu'ils sont mis en œuvre avec d'autres billes magnétiques que celles du kit (voir, à cet effet, l'exemple 5 de la partie expérimentale ci-après). Aussi, les inventeurs se sont fixé pour but de proposer un procédé simple en termes d'étapes, de protocoles préparatoires et de réactifs, pour extraire et purifier des acides nucléiques, ledit procédé impliquant une étape de chromatographie d'adsorption ou d'affinité pouvant utiliser n'importe quelles billes ou particules, magnétiques ou paramagnétiques.
EXPOSÉ DE L'INVENTION
Les inventeurs ont résolu ce problème technique et trouvé une solution aux inconvénients des procédés de l'art antérieur en proposant un procédé complet permettant d'extraire et de purifier des acides nucléiques à partir de divers échantillons en mettant en œuvre des tampons de lyse et de lavage contenant du glycérol et ce, en utilisant des particules magnétisables de différentes origines.
Plus particulièrement, la présente invention propose un procédé pour extraire et purifier au moins un acide nucléique cible contenu dans un échantillon, comprenant les étapes successives consistant à :
a) mettre en contact l'échantillon avec un tampon de lyse moyennant quoi un lysat cellulaire est obtenu ;
b) mettre en contact le lysat cellulaire obtenu après l'étape (a) avec des particules magnétisables, dans des conditions permettant la capture dudit au moins un acide nucléique cible par lesdites particules ;
c) laver lesdites particules magnétisables obtenues suite à l'étape (b) avec un tampon de lavage contenant, de préférence, du glycérol ; et
d) mettre en contact lesdites particules lavées obtenues après l'étape (c) avec un tampon d'élution, dans des conditions permettant la libération dudit acide nucléique cible dans le tampon d'élution. Par « acide nucléique », on entend, dans le cadre de la présente invention, un chromosome ; un gène ; un polynucléotide régulateur ; un ADN, simple-brin ou double-brin, génomique, chromosomique, chloroplastique, plasmidique, mitochondrial, recombinant ou complémentaire ; un ARN total ; un ARN messager ; un ARN ribosomal ; un ARN de transfert ; un ANP ; une portion ou un fragment de ceux-ci. L'expression « acide nucléique » utilisée dans la présente invention est équivalente aux termes et expressions suivants : « molécule nucléotidique », « polynucléotide », « séquence nucléotidique » et « séquence polynucléotidique ». De plus, dans la présente invention, l'expression « acide(s) nucléique(s) cible(s) » désigne le (ou les) acide(s) nucléique(s) que l'on souhaite extraire et purifier par mise en œuvre du procédé revendiqué.
Il est évident que l'échantillon mis en œuvre dans le cadre du procédé selon la présente invention peut être de nature et de source très variées. De façon générale, il s'agit de tout échantillon pour lequel on souhaite extraire et purifier les ou des acides nucléiques qu'il contient ou par lequel il est contaminé.
Avantageusement, cet échantillon peut être un fluide biologique ; un fluide végétal tel que sève, nectar et exsudât racinaire ; un prélèvement dans un milieu de culture ou dans un réacteur de culture biologique comme une culture cellulaire d'eucaryotes supérieurs, de levures, de champignons, de bactéries, de virus ou d'algues ; un liquide obtenu à partir d'un tissu animal ou végétal ; un tissu animal ou végétal ; une ou plusieurs cellules ; un culot cellulaire ; un prélèvement dans une matrice alimentaire, de préférence dilué dans un tampon ; un prélèvement dans un réacteur chimique ; un prélèvement dans une station d'épuration ; un prélèvement dans une station de compostage ; de l'eau de ville, de rivière, d'étang, de lac, de mer, de piscines, de tours aéro-réfrigérées ou d'origine souterraine; un prélèvement à partir d'un effluent industriel liquide ; de l'eau usée provenant notamment d'élevages intensifs ou d'industries du domaine chimique, pharmaceutique ou cosmétique ; un prélèvement provenant d'une filtration d'air ou d'un revêtement ; un prélèvement sur un objet tel qu'un fragment de tissu, un habit, une semelle, une chaussure, un outil, une arme, etc. ; un produit pharmaceutique ; un produit cosmétique ; un parfum ; un échantillon de terre ou un de leurs mélanges.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par « prélèvement » tout type de collecte d'échantillons, par exemple, par contact, raclage, forage, découpage, poinçonnage, broyage, lavage, rinçage, aspiration, pompage, etc ...
Le fluide biologique est avantageusement choisi dans le groupe constitué par le sang tel que du sang entier ou du sang entier anti-coagulé, le sérum sanguin, le plasma sanguin, la lymphe, la salive, le crachat, les larmes, la sueur, le sperme, l'urine, les selles, le lait, le liquide céphalo-rachidien, le liquide interstitiel, un fluide isolé de moelle osseuse, un mucus ou fluide du tractus respiratoire, intestinal ou génito- urinaire, des extraits cellulaires, des extraits de tissus et des extraits d'organes. Ainsi, le fluide biologique peut être tout fluide naturellement sécrété ou excrété d'un corps humain ou animal ou tout fluide récupéré, à partir d'un corps humain ou animal, par toute technique connue de l'homme du métier telle qu'une extraction, un prélèvement ou un lavage. Les étapes de récupération et d'isolement de ces différents fluides à partir du corps humain ou animal sont réalisées préalablement à la mise en œuvre du procédé selon l'invention.
L'échantillon mis en œuvre dans le cadre de la présente invention peut contenir, de par sa nature ou éventuellement suite à une contamination, une (ou plusieurs) cellule(s) (identiques ou différentes). Par « cellule », on entend, dans le cadre de la présente invention, aussi bien une cellule de type procaryote que de type eucaryote. Parmi les cellules eucaryotes, la cellule peut être une levure telle qu'une levure du genre Saccharomyces ou Candida, une cellule végétale ou une cellule animale telle qu'une cellule de mammifères ou d'insectes. Les cellules de type procaryote sont des bactéries qui peuvent être de type gram positif ou des Gram -. Parmi ces bactéries, on peut citer, à titre d'exemples et de façon non-exhaustive, les bactéries appartenant aux embranchements des spirochètes et des chlamydiae, les bactéries appartenant aux familles des entérobactéries (telles que Escherichia coli), des streptococcacées (telles que Streptococcus et, en particulier, Streptococcus pneumoniae), des microccacées (telles que Staphylococcus), des légionelles, des mycobactéries, des bacillacées et autres. De même, si un des prélèvements envisagés ne permet pas de le soumettre à un procédé selon la présente invention, par exemple du fait de sa nature notamment solide, de sa concentration ou des éléments qu'il contient tels que résidus solides, déchets, suspension ou molécules interfé rentes, cette mise en œuvre et notamment le procédé d'extraction et de purification tel que défini ci-après comprend en outre une étape préalable de préparation de l'échantillon avec éventuellement une mise en solution du prélèvement par les techniques connues de l'homme du métier telles que filtration, précipitation, dilution, distillation, mélange, concentration, etc. L'étape (a) du procédé selon la présente invention consiste, comme dans les procédés connus d'extraction et de purification d'acides nucléiques, à extraire les acides nucléiques de l'échantillon les contenant tout en préservant leur intégrité et ce, notamment en inhibant ou désactivant les enzymes lysant les acides nucléiques cibles.
Dans le cadre de la présente invention, la lyse lors de l'étape (a) est une étape de lyse chimique et enzymatique. Tout tampon de lyse pour une lyse chimique et enzymatique connu de l'homme du métier est utilisable dans le cadre de la présente invention. Avantageusement, le tampon de lyse mis en œuvre lors de l'étape (a) du procédé selon l'invention contient du glycérol.
Plus particulièrement, le tampon de lyse mis en œuvre dans le cadre de la présente invention est un tampon contenant du glycérol, au moins un tensioactif et au moins un agent chaotropique.
Le tampon de lyse mis en œuvre dans le cadre de la présente invention contient avantageusement du glycérol en une quantité comprise entre 1 et 40%, notamment entre 5 et 20%, en particulier entre 7 et 15% et, plus particulièrement, de l'ordre de 10% (i.e. 10% ± 2%) en masse par rapport à la masse totale du tampon de lyse (i.e. pourcentage massique). On estime que la présence de glycérol dans le tampon de lyse n'est pas nécessaire, mais avantageuse, car cela augmente le rendement total du protocole.
Le tampon de lyse mis en œuvre dans le cadre de la présente invention contient au moins un tensioactif, ce dernier participant à la lyse chimique. Par « tensioactif », on entend une molécule comportant une partie lipophile (apolaire) et une partie hydrophile (polaire). Tout tensioactif apte à solubiliser les membranes cellulaires et les lipides membranaires est utilisable dans le cadre de la présente invention.
Avantageusement, ce tensioactif est choisi parmi les tensioactifs anioniques, les tensioactifs cationiques, les tensioactifs zwittérioniques, les tensioactifs amphotères et les tensioactifs non-ioniques. Le tampon de lyse selon l'invention peut comprendre plusieurs tensioactifs appartenant à une même famille de tensioactifs précédemment listée (i.e. anionique, cationique, zwittérionique, amphotère ou non ionique) ou plusieurs tensioactifs appartenant à au moins deux familles distinctes de tensioactifs.
Pour rappel, les tensioactifs anioniques sont des tensioactifs dont la partie hydrophile est chargée négativement tels que les alkyle ou aryle sulfonates, sulfates, phosphates, sulfosuccinates ou sarcosinates associés à un contre ion comme un ion ammonium (NH4 +), un ammonium quaternaire tel que tétrabutylammonium, et les cations alcalins tels que Na+, Li+ et K+. A titre de tensioactifs anioniques, il est, par exemple, possible d'utiliser le paratoluènesulfonate de tetraéthylammonium, le dodécylsulfate de sodium (ou SDS), le laurylsarcosinate de sodium (ou sarcosyl), le palmitate de sodium, le stéarate de sodium, le myristate de sodium, le di(2-éthylhexyl) sulfosuccinate de sodium, le méthylbenzène sulfonate et l'éthylbenzène sulfonate.
Les tensioactifs cationiques sont des tensioactifs dont la partie hydrophile est chargée positivement, notamment choisis parmi les ammoniums quaternaires comportant au moins une chaîne aliphatique en C4-C22 associés à un contre ion anionique choisi notamment parmi les dérivés du bore tels que le tétrafluoroborate ou les ions halogénures tels que F", Br", Γ ou Cl". A titre de tensioactifs cationiques, il est, par exemple, possible d'employer le chlorure tétrabutyl-ammonium, le chlorure tetradécyl-ammonium, le bromure de tetradécyl-triméthyl-ammonium (TTAB), le bromure de cétyl-triméthyl-ammonium (CTAB), le bromure d'octadecyl-triméthyl- ammonium, le bromure de hexadecyl-triméthyl-ammonium, les halogénures d'alkylpyridinium portant une chaîne aliphatique et les halogénures d'alkylammonium. Les tensioactifs zwittérioniques sont des composés neutres possédant des charges électriques formelles d'une unité et de signe opposés, notamment choisis parmi les composés présentant une chaîne alkyle en C5-C20 substituée généralement par une fonction chargée négativement comme un sulfate ou un carboxylate et une fonction chargée positivement comme un ammonium. A titre de tensioactifs zwittérioniques, on peut citer le N,N diméthyl-dodécyl-ammoniumbutanate de sodium, le diméthyl-dodécyl- ammonium propanate de sodium et les acides aminés.
Les tensioactifs amphotères sont des composés se comportant à la fois comme un acide ou comme une base selon le milieu dans lequel ils sont placés. A titre de tensioactifs amphotères, il est possible d'utiliser le lauroamphodiacétate de disodium et les bétaïnes comme l'alkylamidopropylbétaïne ou la laurylhydroxysulfobétaïne.
Les tensioactifs non ioniques, également connus sous le nom de tensioactifs neutres, sont des tensioactifs qui ne présentent aucun groupe apte à être ionisé dans l'eau à un pH neutre ou proche de la neutralité. De tels tensioactifs sont cependant amphipathiques puisque contenant des entités lipophiles et des entités hydrophiles. Les propriétés tensioactives des tensioactifs non ioniques, notamment l'hydrophilie, sont apportées par des groupements fonctionnels non chargés tels qu'un alcool, un éther, un ester ou encore un amide, contenant des hétéroatomes tels qu'un atome d'azote ou un atome d'oxygène. En raison de la faible contribution hydrophile de ces fonctions, les composés tensioactifs non ioniques sont le plus souvent polyfonctionnels. Tout tensioactif non ionique connu de l'homme du métier est utilisable dans le cadre de la présente invention. A titre de tensioactifs non ioniques, il est possible d'utiliser dans le cadre de la présente invention les alcoxylates d'alkyles, d'alcools gras, d'amines grasses, d'acides gras, d'oxoalcools ou d'alkylphénols ; les éthoxylates d'alkyles, d'alcools gras, d'amines grasses, d'acides gras, d'oxoalcools ou d'alkylphénols ; les monoesters (monolaurate, monomyristate, monostéarate, monopalmitate, monooléate, etc), phospholipides et polyesters d'acides gras et du glycérol ; les amides gras polyglycérolés comportant en moyenne de 1 à 5 ; les esters d'acide gras du sorbitan oxyéthylénés comportant de 2 à 30 moles d'oxyde d'éthylène ; les monoesters (monolaurate, monomyristate, monostéarate, monopalmitate, monooléate, etc) et polyesters d'acides gras et du sorbitane, les monoesters de polyoxyéthylène sorbitane ; les polyols (tensioactifs dérivés de sucres) en particulier les alkylates de glucose ; les tensioactifs dérivant de glucoside (laurate de sorbitol) ou de polyols ; les alcanolamides et leurs mélanges.
Dans le cadre de la présente invention, le (ou les) tensioactif(s) mis en œuvre lors de l'étape (a) sont avantageusement choisi(s) parmi les tensioactifs non ioniques et les tensioactifs anioniques et leurs mélanges. Parmi les tensioactifs non ioniques mis en œuvre lors de l'étape (a), ces derniers sont avantageusement choisi(s) parmi les éthers polyéthoxylés, les monoesters de polyoxyéthylène sorbitane et leurs mélanges.
Plus particulièrement, le (ou les) tensioactif(s) mis en œuvre lors de l'étape (a) sont choisis dans le groupe constitué par le polyéthylène glycol tert- octylphényl éther (ou Triton X-100®), le monolaurate de polyoxyéthylène sorbitane 20 (ou Tween 20®), le dodécylsulfate de sodium (ou SDS), le laurylsarcosinate de sodium (ou sarcosyl) et leurs mélanges. Dans une forme de mise en œuvre toute particulière, le tampon de lyse mis en œuvre lors de l'étape (a) du procédé selon l'invention comprend un mélange de SDS et de Tween 20® et avantageusement un mélange de SDS à 1% massique et Tween 20® à 20% massique par rapport à la masse totale du tampon de lyse.
Le tampon de lyse mis en œuvre dans le cadre de la présente invention contient au moins un agent chaotropique, ce dernier participant également à la lyse chimique. Par « agent chaotropique », on entend, dans le cadre de la présente invention, un sel qui modifie la solubilité des protéines et peut provoquer leur précipitation. Certains des agents chaotropiques utilisables dans le tampon de lyse de l'invention peuvent, de plus, affecter la structure tridimensionnelle des protéines et les dénaturer. Tout agent chaotropique connu de l'homme du métier est utilisable dans le cadre de la présente invention.
Avantageusement, l'agent chaotropique mis en œuvre dans le cadre de la présente invention est choisi dans le groupe constitué par le chlorure de sodium (NaCI), le sulfate d'ammonium ((NH4)2S04), le perchlorate de sodium (NaCI04), l'iodure de sodium (Nal), le chlorure de lithium (LiCI), le perchlorate de lithium (LiCI04), le chlorure de baryum (BaCI2), le chlorure de césium (CsCI2), le chlorure de potassium (KCI), l'iodure de potassium (Kl), de l'urée (CO(NH2)2), un sel de guanidine tel que le thiocyanate de guanidine (GuSCN) et leurs mélanges.
Plus particulièrement, l'agent chaotropique mis en œuvre dans le cadre de la présente invention est un mélange de chlorure de sodium et de thiocyanate de guanidine. Typiquement, dans le tampon de lyse selon l'invention, le chlorure de sodium est à une concentration supérieure ou égale à 0,5 M et notamment de l'ordre de 1 M (i.e. 1 M ± 0,2 M) et le thiocyanate de guanidine est à une concentration comprise entre 0,5 et 1 M et notamment de l'ordre de 0,85 M (i.e. 0,85 M ± 0,1 M).
Le tampon de lyse mis en œuvre dans le cadre de l'étape (a) du procédé selon la présente invention peut en outre comprendre au moins un élément apte à inhiber les DNAses et RNAses et/ou au moins un élément apte à détruire les ponts disulfure dans les protéines ou à empêcher leur reformation. A cet effet, ledit tampon de lyse peut en outre comprendre au moins un élément choisi parmi un thiol ; un agent réducteur tel que du β-mercapto-éthanol ou du dithiothreitol (DTT) ; de l'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) et un citrate. De même, si certains des acides nucléiques contenus dans l'échantillon ne sont pas des acides nucléiques cibles et, de fait, doivent être éliminés comme, par exemple, l'ADN ou l'ARN, il est possible d'ajouter, au tampon de lyse, des composés permettant la lyse, chimique ou enzymatique, de l'ADN ou de l'ARN. Parmi ces composés, on peut citer l'hydroxyde de sodium (NaOH), une RNAse et une DNAse.
Lors de l'étape (a) du procédé selon la présente invention, la quantité de tampon de lyse utilisé est telle que le rapport (v/v) échantillon/tampon de lyse est compris entre 1/3 et 3, notamment entre 1/2 et 2 et, en particulier, ce rapport est égal à 1.
Comme l'étape (a) du procédé selon la présente invention est une lyse non seulement chimique mais aussi enzymatique, il est nécessaire d'ajouter au mélange constitué par l'échantillon et le tampon de lyse, une protéase et avantageusement au moins une endoprotéase et ce, pour réaliser la digestion enzymatique (ou protéolyse enzymatique) des protéines de l'échantillon et conduire à la formation de fragments peptidiques plus ou moins courts à partir des protéines contenues dans l'échantillon. L'homme du métier connaît différentes protéases, spécifiques ou non, et notamment différentes endoprotéases, spécifiques ou non, utilisables lors de l'étape (a) du procédé selon l'invention.
Avantageusement, la (ou les) protéase(s) mise(s) en œuvre lors de l'étape (a) du procédé est(sont) choisie(s) dans le groupe constitué par la protéinase K, la subtilisine, la pepsine, la trypsine, la chymotrypsine, la thrombine, la thermolysine, la protéase du VIH, l'élastase, le facteur Xa, une endopeptidase à thiol telle que la capaïne ou une caspase, une endopeptidase spécifique de la lysine (endoLysN), une endopeptidase spécifique de l'arginine (endoArgC) et une endopeptidase spécifique de l'acide glutamique (endoGluC). La protéase plus particulièrement mise en œuvre lors de l'étape (a) du procédé est une endoprotéase non spécifique et avantageusement la protéinase K. Plus particulièrement encore, cette protéinase K est utilisée à une concentration comprise entre 0,1 et 5 mg/ml, notamment entre 0,4 et 2 mg/ml et en particulier entre 0,7 et 1,5 mg/ml de solution mise en œuvre lors de l'étape (a). Par « solution mise en œuvre lors de l'étape (a) », on entend la solution formée à partir de l'échantillon, du tampon de lyse et de la protéinase K.
La solution mise en œuvre lors de l'étape (a) du procédé selon l'invention est homogénéisée manuellement ou par vortex et maintenue à une température comprise entre 40 et 65°C, notamment entre 50 et 60°C et, en particulier, de l'ordre de 56°C (i.e. 56°C ± 3°C) pendant une durée comprise entre 2 et 30 min, notamment entre 5 et 20 min et, en particulier, de l'ordre de 10 min (i.e. 10 min ± 3 min). De cette façon et par action des différents éléments ajoutés à l'échantillon, un lysat cellulaire contenant le (ou les) acide(s) nucléique(s) cible(s) est obtenu suite à l'étape (a) du procédé selon la présente invention.
L'étape (b) consiste à mettre en contact le lysat cellulaire obtenu lors de l'étape (a) avec des particules magnétisables aptes à capturer, de façon réversible, par adsorption ou via des interactions spécifiques, des acides nucléiques. Par « particules magnétisables », on entend des particules ne présentant des propriétés magnétiques que lorsqu'elles sont soumises à un champ magnétique. Toutes particules magnétisables connues de l'homme du métier sont utilisables dans le cadre de la présente invention.
Les particules magnétisables mises en œuvre dans le cadre de la présente invention sont sensiblement sphériques et leur diamètre moyen est avantageusement compris entre 0,5 et 100 μιη et notamment entre 1 et 50 μιη. A noter que, dans le cadre de la présente invention, les expressions « particule magnétisable », « particule (para)magnétique », « bille magnétisable » et « bille (para)magnétique » sont équivalentes et utilisables de manière interchangeables.
Les particules magnétisables mises en œuvre dans le cadre de la présente invention comprennent des grains (ou nanoparticules) magnétiques et une matrice organique ou minérale. En fonction du procédé utilisé pour préparer ces nanoparticules magnétisables, il est possible d'obtenir différentes structures telles que (i') des nanoparticules de type cœur/coquille avec le cœur comprenant les grains magnétiques et la coquille formée par la matrice organique ou minérale ou (ϋ') des nanoparticules dans lesquelles les grains magnétiques sont uniformément répartis dans la matrice organique ou minérale.
Avantageusement, les grains (ou nanoparticules) magnétiques sont en au moins un matériau choisi dans le groupe constitué par les oxydes métallique de fer, de titane, de cobalt, de zinc, de cuivre, de manganèse ou de nickel ; la magnétite ; la maghémite ; l'hématite ; les ferrites de manganèse, de nickel ou de manganèse-zinc et les alliages de cobalt-nickel.
La matrice organique des particules magnétisables mises en œuvre dans le cadre de la présente invention est en un polymère organique naturel ou synthétique et, à titre d'exemple, choisi dans le groupe constitué par l'albumine ; la cellulose et ses dérivés notamment tels que définis dans le brevet US 6 855 499 ; les polyacrylates tels que le poly(acide acrylique) et le poly(méthacrylate d'hydroxyéthyle) ; l'alcool polyvinylique et le polystyrène. En variante, lorsque les particules magnétisables mises en œuvre dans l'invention présentent une matrice minérale, cette dernière se présente avantageusement sous forme de gel de silice.
Dans une lere forme de mise en œuvre, les particules magnétisables mises en œuvre dans le cadre de la présente invention peuvent capturer les acides nucléiques au niveau de leur surface par adsorption. Dans ce cas, cette capture fait intervenir des interactions de Van der Waals, des interactions électrostatiques, des liaisons hydrogène ou des interactions hydrophobes. Avantageusement, l'adsorption des acides nucléiques sur les particules magnétisables se fait au moyen d'interactions électrostatiques et de liaisons hydrogène. A cet effet, les particules magnétisables présentent, au niveau de leur surface, des groupements participant à de telles interactions ou liaisons, tels que des groupements cationiques ou anioniques. Ces groupements sont portés, de façon intrinsèque ou par fonctionnalisation, par la matrice des particules.
Dans une 2nde forme de mise en œuvre, les particules magnétisables mises en œuvre dans le cadre de la présente invention peuvent capturer les acides nucléiques à leur surface par des interactions spécifiques. Cette forme de mise en œuvre nécessite la fonctionnalisation, covalente ou non, de la surface des particules par un élément apte à capturer les acides nucléiques cibles comme, par exemple, par hybridation. Un tel élément est avantageusement choisi dans le groupe constitué par un oligonucléotide complémentaire d'une séquence spécifique présente dans les acides nucléiques cibles, un oligonucléotide poly(thymine), de la streptavidine, de la biotine ou un anticorps anti-ADN.
L'homme du métier connaît différents procédés pour préparer des particules magnétisables éventuellement fonctionnalisées telles que précédemment définies. En variante, lors de l'étape (b) du procédé selon l'invention, des particules magnétisables commerciales peuvent être utilisées. A titre d'exemples illustratifs et non- limitatifs de telles particules, on peut citer les billes Silanol (CHEMICELL), les billes MagPrep® HS (Merck SAS Estapor), les billes Dynabeads® MyOne™ (Life Technologies), les billes Dynabeads® Streptavidine (Life Technologies) et les billes MagaZorb® (PROMEGA). Le rapport entre le volume d'échantillon lors de l'étape (a) et le volume de particules magnétisables mises en œuvre lors de l'étape (b) est compris entre 1 et 50, notamment entre 5 et 25 et, en particulier, de l'ordre de 10 (i.e. 10 ± 2).
La mise en contact lors de ladite étape (b) se fait en présence d'un tampon de capture et ce, pour favoriser la liaison réversible entre les acides nucléiques cibles contenus dans le lysat cellulaire et les particules magnétisables. Avantageusement, un tel tampon de capture comprend au moins un solvant choisi dans le groupe constitué par le 1,2-butanediol ; le 1,2-propanediol ; le 1,3-butanediol ; l'acétate de l-méthoxy-2- propanol ; le 3-méthyl-l,3,5-pentanetriol ; un ester dibasique tel que du DBE-2, du DBE-3, du DBE-4, du DBE-5 ou du DBE-6 ; l'éther monoéthylique du diéthylène glycol (DGME) ; l'acétate d'éther monoéthylique du diéthylène glycol (DGMEA) ; le lactate d'éthyle ; l'éthylène glycol ; le poly(2-éthyl-2-oxazoline) ; un sel de sodium d'un copolymère d'acide 4-styrène sulfonique et d'acide maléique ; le tetraéthylène glycol (TEG) ; le tetraglycol ; le tetrahydrofurfuryl polyéthylène glycol 200 ; l'éther divinylique de triéthylène glycol ; le triéthylène glycol anhydre et l'éther monoéthylique du triéthylène glycol.
Avantageusement, le tampon de capture mis en œuvre lors de ladite étape (b) du procédé selon l'invention comprend au moins deux solvants tels que précédemment définis. En particulier, le tampon de capture mis en œuvre lors de ladite étape (b) du procédé selon l'invention est un mélange de deux solvants tels que précédemment définis. Plus particulièrement, le tampon de capture mis en œuvre lors de ladite étape (b) du procédé selon l'invention est un mélange de TEG et de 1,2-butanediol et, typiquement, un mélange à 60% (v/v) de TEG et à 40% (v/v) de 1,2-butanediol.
Le mélange mis en œuvre lors de l'étape (b) du procédé selon l'invention contenant le lysat cellulaire, les particules magnétisables et le tampon de capture tels que précédemment définis est homogénéisé manuellement ou par vortex et maintenu à une température comprise entre 10 et 40°C, avantageusement entre 15 et 30°C et, plus particulièrement, à température ambiante (i.e. 23°C ± 5°C) et ce, pendant une durée comprise entre 2 et 30°min, notamment entre 5 et 20 min et, en particulier, de l'ordre de 10 min (i.e. 10 min ± 3 min). Suite à l'étape (b) du procédé selon l'invention, les particules magnétisables ont capturé le (ou les) acide(s) nucléique(s) cible(s). L'étape (c) du procédé selon la présente invention consiste à séparer les particules magnétisables qui ont capturé les acides nucléiques cibles du milieu contenant lesdites particules en fin d'étape (b) et, en particulier, des autres éléments non capturés par les particules magnétisables (i.e. non liés à ces dernières) présents dans ce milieu. Ce dernier est formé à partir de l'échantillon, du tampon de lyse, de la protéinase K et du tampon de capture.
Avantageusement, l'étape (c) du procédé selon la présente invention consiste à (ci) soumettre les particules magnétisables ayant capturé le (ou les) acide(s) nucléique(s) cible(s) à un champ magnétique, (c2) éliminer la phase liquide i.e. le milieu entourant lesdites particules magnétisables, (c3) ajouter un tampon de lavage et (c4) remettre en suspension lesdites particules magnétisables dans ledit tampon de lavage en supprimant le champ magnétique, lesdites étapes (c3) et (c4) pouvant être réalisées l'une après l'autre ou simultanément.
Les étapes (ci) à (c4) sont des étapes classiques dans les différents domaines utilisant des particules magnétisables. Le champ magnétique (ou force magnétique) peut être appliqué(e), lors de l'étape (ci), au moyen d'un aimant ou d'un banc magnétique. Toute technique visant à éliminer un liquide est utilisable dans le cadre de l'étape (c2). A titre d'exemples, cette élimination peut être réalisée par renversement, par tapotement, par absorption ou par aspiration.
L'étape (c) du procédé selon la présente invention et les étapes (ci) à (c4) peuvent être répétées au moins une fois. Lors de ces répétitions, le tampon de lavage mis en œuvre lors de l'étape (c) ou (c3) peut être identique ou différent au tampon de lavage mis en œuvre lors de l'étape (c) ou (c3) précédente.
Cependant, tout tampon de lavage mis en œuvre à l'une quelconque des étapes (c) ou (c3) contient du glycérol, un tensioactif et éventuellement un agent chaotropique tel que précédemment défini.
Le (ou les) tampon(s) de lavage mis en œuvre dans le cadre de la présente invention contien(nen)t du glycérol en une quantité comprise entre 1 et 40%, notamment entre 5 et 30% et, en particulier, entre 7 et 25% en masse par rapport à la masse totale du tampon de lavage.
Le (ou les) tampon(s) de lavage mis en œuvre dans le cadre de la présente invention contien(nen)t un tensioactif, en particulier un tensioactif de la famille des éthylènes glycols, par exemple un tétraéthylène glycol (TEG) ou un polyalkylène glycol. Tout polyalkylène glycol est utilisable dans le cadre de la présente invention. Toutefois, un tel polyalkylène glycol est notamment du polyéthylène glycol ou du polypropylène glycol et, en particulier, du polyéthylène glycol (PEG). Le polyéthylène glycol dans le (ou les) tampon(s) de lavage présente une masse molaire supérieure à 1000 g/mol, notamment supérieure à 2000 g/mol, en particulier, comprise entre 4000 et 10000 g/mol et, plus particulièrement, comprise entre 6000 et 8000 g/mol. Le (ou les) tampon(s) de lavage mis en œuvre dans le cadre de la présente invention contien(nen)t un tensioactif de la famille des éthylènes glycols et notamment du tétraéthylène glycol ou du polyéthylène glycol en une quantité comprise entre 1 et 40%, notamment entre 5 et 30% et, en particulier, entre 7 et 25% en masse par rapport à la masse totale du tampon de lavage.
Le solvant du (ou des) tampon(s) de lavage est typiquement choisi parmi du Tris à une concentration comprise entre 5 et 50 mM, du Tris base à une concentration comprise entre 5 et 50 mM, du Tris/HCI à une concentration comprise entre 5 et 50 mM, de la triéthanolamine à une concentration comprise entre 5 et 50 mM ou un de leurs mélanges. Le pH du tampon de lavage est avantageusement de l'ordre de 8 (i.e. 8 ± 0,5).
Le rapport entre le volume de tampon de lavage mis en œuvre lors de chaque étape (c) et le volume de particules magnétisables mises en œuvre lors de l'étape (b) est compris entre 10 et 200, notamment entre 25 et 100 et, en particulier, de l'ordre de 50 (i.e. 50 ± 5).
L'étape (c) du procédé selon la présente invention et notamment les étapes (ci) et (c4) sont réalisées à une température comprise entre 10 et 40°C, avantageusement entre 15 et 30°C et, plus particulièrement, à température ambiante (i.e. 23°C ± 5°C). Dans une forme de mise en œuvre particulière, l'étape de lavage est répétée deux fois. Le tampon de lavage utilisé lors de la lere étape de lavage comprend du glycérol, un tensioactif comme un tensioactif de la famille des éthylènes glycols et un agent chaotropique tels que précédemment définis et notamment du glycérol, du PEG et un agent chaotropique ou du glycérol, du TEG et un agent chaotropique tels que précédemment définis, alors que le tampon de lavage utilisé lors de la 2nde étape de lavage comprend du glycérol et un tensioactif comme un tensioactif de la famille des éthylènes glycols tels que précédemment définis et notamment du glycérol et du PEG ou du glycérol et du TEG tels que précédemment définis. Dans la partie expérimentale ci- après, des exemples particuliers de tels tampons de lavage sont donnés.
L'étape (d) du procédé selon la présente invention consiste à remettre en solution le (ou les) acide(s) nucléique(s) cible(s) en décrochant, au moyen d'un tampon d'élution, le (ou les) acide(s) nucléique(s) cible(s) des particules magnétisables. Lors de ce décrochage, les liaisons non covalentes et de faible stabilité entre le (ou les) acide(s) nucléique(s) cible(s) et les particules magnétisables sont rompues par l'action du tampon d'élution, éventuellement combinée aux conditions opératoires de l'étape (d) telles qu'un chauffage.
Avantageusement, l'étape (d) du procédé selon la présente invention consiste à (di) soumettre les particules magnétisables à un champ magnétique, (d2) éliminer le tampon de lavage, (d3) ajouter un tampon d'élution et (d4) remettre en suspension lesdites particules magnétisables dans ledit tampon d'élution en supprimant le champ magnétique, lesdites étapes (d3) et (d4) pouvant être réalisées l'une après l'autre ou simultanément.
Les étapes (di) à (d4) sont également des étapes classiques dans les différents domaines utilisant des particules magnétisables. Le champ magnétique (ou force magnétique) peut être appliqué(e), lors de l'étape (di), au moyen d'un aimant ou d'un banc magnétique. Toute technique visant à éliminer un liquide est utilisable dans le cadre de l'étape (d2). A titre d'exemples, cette élimination peut être réalisée par renversement, par tapotement, par absorption ou par aspiration. Le tampon d'élution mis en œuvre lors de l'étape (d) ou (d3) peut être tout tampon d'élution connu de l'homme du métier et adapté au type de capture mis en œuvre lors de l'étape (b) préalable i.e. adsorption ou interactions spécifiques. A titre d'exemple d'un tel tampon d'élution, on peut citer un tampon choisi parmi du Tris à une concentration comprise entre 5 et 50 mM, du Tris base à une concentration comprise entre 5 et 50 mM, du Tris/HCI à une concentration comprise entre 5 et 50 mM, de la triéthanolamine à une concentration comprise entre 5 et 50 mM ou un de leurs mélanges. Le pH du tampon d'élution est avantageusement de l'ordre de 9 (i.e. 9 ± 0,5).
Le rapport entre le volume de tampon d'élution mis en œuvre lors de chaque étape (d) et le volume de particules magnétisables mises en œuvre lors de l'étape (b) est compris entre 1 et 20, notamment entre 2 et 10 et, en particulier, de l'ordre de 5 (i.e. 5 ± 1).
L'étape (d) du procédé selon la présente invention et notamment l'étape (d4) peuvent être réalisées à une température comprise entre 40 et 80°C, notamment entre 50 et 70°C et, en particulier, de l'ordre de 60°C (i.e. 60°C ± 5°C), les étapes (di) à (d3) pouvant, quant à elles, être réalisées à une température comprise entre 10 et 40°C, avantageusement entre 15 et 30°C et, plus particulièrement, à température ambiante (i.e. 23°C ± 5°C).
De plus, l'étape (d) du procédé selon la présente invention et notamment l'étape (d4) peuvent être réalisées sous agitation et ce, pendant une durée comprise entre 1 et 15 min, notamment entre 2 et 7 min et, en particulier, de l'ordre de 3 min (i.e. 3 min ± 1 min). Cette agitation est réalisée au moyen d'un agitateur magnétique et à une vitesse supérieure ou égale à 100 rpm, notamment supérieure ou égale à 500 rpm et, en particulier, comprise entre 1000 et 1500 rpm.
Une fois l'étape (d) du procédé selon l'invention effectuée, il est facile de récupérer le tampon d'élution contenant le (ou les) acide(s) nucléique(s) cible(s) en éliminant les particules magnétisables et ce, en appliquant un champ magnétique.
La présente invention concerne également les tampons de lyse et de lavage susceptibles d'être mis en œuvre dans un procédé tel que précédemment défini. Ainsi, la présente invention concerne un tampon de lyse susceptible d'être mis en œuvre dans un procédé tel que précédemment défini, contenant au moins un tensioactif, au moins un agent chaotropique et du glycérol tels que précédemment définis. Un exemple particulier d'un tel tampon de lyse est donné dans la partie expérimentale ci-après.
De plus, la présente invention concerne un tampon de lavage susceptible d'être mis en œuvre dans un procédé tel que précédemment défini, contenant du glycérol, un tensioactif, notamment un tensioactif de la famille des éthylènes glycols comme un TEG ou un polyalkylène glycol et éventuellement un agent chaotropique tels que précédemment définis et notamment contenant du glycérol, du TEG ou du PEG et éventuellement un agent chaotropique tels que précédemment définis. Deux exemples particuliers d'un tel tampon de lavage sont donnés dans la partie expérimentale ci-après.
La présente invention concerne également un kit comprenant au moins un tampon de lyse tel que précédemment défini et au moins un tampon de lavage tel que précédemment défini. Dans une forme de mise en œuvre particulière, le kit selon l'invention comprend un tampon de lyse et deux tampons de lavage tels que donnés dans la partie expérimentale ci-après ou un tampon de lyse et le tampon de lavage n°2 tels que donnés dans la partie expérimentale ci-après. Le kit selon la présente invention peut en outre contenir au moins un élément choisi dans le groupe constitué par (i") une protéase, notamment une endoprotéase et, en particulier, de la protéinase K ; (ii") un tampon de capture tel que précédemment défini ; (iii") un tampon d'élution tel que précédemment défini et (iv") des particules magnétisables telles que précédemment définies.
La présente invention concerne en outre l'utilisation d'un tampon de lyse, d'un tampon de lavage et d'un kit tels que précédemment définis pour extraire et purifier des acides nucléiques cibles dans un échantillon, ladite extraction et purification utilisant des particules magnétisables.
En d'autres termes, la présente invention concerne, d'une part, un procédé pour lyser un échantillon consistant à mettre en contact ledit échantillon avec un tampon de lyse selon l'invention et, d'autre part, un procédé pour laver des particules magnétisables ayant capturé au moins un acide nucléique cible consistant à mettre en contact lesdites particules avec un tampon de lavage selon l'invention.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
La Figure 1 est une représentation schématisée du procédé selon la présente invention.
La Figure 2 présente le pourcentage de purification de l'ADN en fonction de la quantité de glycérol contenue dans le tampon de lyse et les tampons de lavage.
La Figure 3 présente le pourcentage de purification de l'ADN en fonction de la quantité de glycérol contenue dans le tampon de lyse.
La Figure 4 présente le pourcentage de purification de l'ADN en fonction de la quantité de glycérol contenue dans le tampon de lavage No. 1.
La Figure 5 présente le pourcentage de purification de l'ADN en fonction de la quantité de glycérol contenue dans le tampon de lavage No. 2.
La Figure 6 présente la valeur de cycle seuil ou Ct pour un surnageant obtenu avec le procédé commercial PROMEGA en utilisant les billes magnétiques référencées que sont les billes MagaZorb ou d'autres billes commerciales non référencées que sont les billes Dynabeads MyOne.
La Figure 7 présente la valeur de cycle seuil ou Ct pour un surnageant obtenu avec le procédé selon la présente invention en utilisant différentes billes magnétiques. EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS
Exemple 1 : Variation de la concentration de Glycérol présent dans les tampons de lavages et de lyse.
Le protocole ci-après et schématisé à la Figure 1 a été mis en œuvre pour étudier l'effet de la concentration de glycérol dans les tampons de lavage et de lyse. Pour cela, pour chaque essai indépendant, une même concentration notée « A% » correspondant à la masse de glycérol par rapport à la masse totale de solution a été utilisée dans les tampons de lyse et de lavage, avec A représentant 0, 1, 10 ou 20.
1. Dans un tube de 1,5 mL contenant 10000 bactéries dans un échantillon sanguin de 200 μί, ledit tube contenant du citrate ou de l'EDTA, ajouter
200 μί de tampon de lyse (SDS 1%, Tween20 20%, GuSCN 0,85 M, NaCI 1 M, Glycérol A%), 28,6 μΙ protéinase K (20 mg/ml, Sigma - Cat No. P2308, dissoute dans 10 mM Tris-HCI à pH 8) ;
2. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à 56°C ;
3. Ajouter 250 μί de tampon de capture (TEG 60%, 1,2-butanediol 40%) et 20 μί de billes MagPrep HS (Merck SAS Estapor - Cat No. Magprep HS 101899) ;
4. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à température ambiante ;
5. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;
6. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage (2 M GuSCN, 10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 10%, Glycérol A%) ;
7. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;
8. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage
(10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 20%, Glycérol A%) ;
9. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ; 10. Eluer les acides nucléiques dans 92 μΙ de tampon d'élution (10 mM Tris-HCI à pH 9) et agiter avec un Eppendorf - Thermomixer compact N° 5350 000.013 pendant 3 min à 1400 rpm à 60°C ;
11. Placer le tube sur un banc magnétique puis récupérer le surnageant pour réaliser différentes analyses.
Dans le surnageant récupéré, l'ADN est analysé par qPCR en utilisant des amorces spécifiques des pathogènes visés. On obtient ainsi la quantité d'ADN présente dans le tube en fin de procédé et cette dernière est comparée à la quantité totale d'ADN de l'échantillon initial avec, pour la quantité d'ADN théorique, le calcul suivant : 1 bactérie=l copie ADN. Les résultats sont présentés à la Figure 2.
En absence de glycérol, aucun ADN n'est extrait. Une extraction d'ADN est obtenue dès un ajout de 1% de glycérol et ce, pour certains échantillons de bactéries. Il en est de même pour le protocole utilisant 20% de glycérol dans les tampons de lyse et de lavage. Les meilleurs résultats quant à l'extraction pour tous les échantillons sont obtenus lorsque le tampon de lyse et les tampons de lavage contiennent 10% de glycérol.
Exemple 2 : Variation de la concentration en glycérol présent dans le tampon de lyse.
Le protocole ci-après a été mis en œuvre pour étudier l'effet de la concentration de glycérol dans le tampon de lyse. Pour cette étude, la concentration dans le tampon de lyse, notée « B% » et correspondant à la masse de glycérol par rapport à la masse totale de solution représente 0%, 1%, 10% ou 20%.
1. Dans un tube de 1,5 mL contenant 10000 bactéries dans un échantillon sanguin de 200 μί, ledit tube contenant du citrate ou de l'EDTA, ajouter 200 μί de tampon de lyse (SDS 1%, Tween20 20%, GuSCN 0,85 M, NaCI 1 M, Glycérol B%), 28,6 μΙ protéinase K (20 mg/ml, Sigma - Cat No. P2308, dissoute dans 10 mM Tris-HCI à pH 8) ;
2. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à 56°C ;
3. Ajouter 250 μί de tampon de capture (TEG 60%, 1,2-butanediol 40%) et 20 μί de billes MagPrep HS (e.g. Merck SAS Estapor - Cat. No. Magprep HS 101899) ; 4. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à température ambiante ;
5. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;
6. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage (2 M
GuSCN, 10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 10%, Glycérol 10%) ;
7. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;
8. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage (10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 20%, Glycérol 20%) ;
9. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;
10. Eluer les acides nucléiques dans 92 μΙ de tampon d'élution (10 mM Tris-HCI à pH 9) et agiter avec un Eppendorf - Thermomixer compact N° 5350 000.013 pendant 3 min à 1400 rpm à 60°C ;
11. Placer le tube sur un banc magnétique puis récupérer le surnageant pour réaliser différentes analyses.
Dans le surnageant récupéré, l'ADN est analysé par qPCR en utilisant des amorces spécifiques des pathogènes visés. On obtient ainsi la quantité d'ADN présente dans le tube en fin de procédé et cette dernière est comparée à la quantité totale d'ADN de l'échantillon initial avec, pour la quantité d'ADN théorique, le calcul suivant : 1 bactérie=l copie ADN. Les résultats sont présentés à la Figure 3.
En absence de glycérol dans le tampon de lyse et avec des tampons de lavage contenant du glycérol, de l'ADN peut être extrait. L'ajout de 1% de glycérol dans le tampon de lyse a peu d'effet sur l'extraction. Par contre, les meilleurs résultats quant à l'extraction sont obtenus lorsque le tampon de lyse contient 10% de glycérol et sont conservés, pour certains échantillons, avec 20% de glycérol dans le tampon de lyse. Ainsi, la présence de glycérol dans le tampon de lyse n'est pas nécessaire ; Elle est cependant préférable car elle permet d'augmenter le rendement total du protocole. Exemple 3 : Variation de la concentration de Glycérol présent dans le tampon de lavage n°l.
Le protocole ci-après a été mis en œuvre pour étudier l'effet de la concentration de glycérol dans le tampon de lavage n°l. Pour cette étude, la concentration dans le tampon de lavage n°l, notée « C% » correspondant à la masse de glycérol par rapport à la masse totale de solution représente 0%, 1%, 10% ou 20%.
1. Dans un tube de 1,5 mL contenant 10000 bactéries dans un échantillon sanguin de 200 μί, ledit tube contenant du citrate ou de l'EDTA , ajouter 200 μΙ_ de tampon de lyse (SDS 1%, Tween20 20%, GuSCN 0,85 M, NaCI 1 M, Glycérol 10%), 28,6 μΙ protéinase K (20 mg/ml, Sigma - Cat No. P2308, dissoute dans 10 mM Tris- HCI à pH 8) ;
2. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à 56°C ;
3. Ajouter 250 μΙ_ de tampon de capture (TEG 60%, 1,2-butanediol 40%) et 20 μΙ_ de billes MagPrep HS (Merck SAS Estapor - Cat. No. Magprep HS 101899) ;
4. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à température ambiante ;
5. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;
6. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage (2 M GuSCN, 10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 10%, Glycérol C%) ;
7. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;
8. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage (10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 20%, Glycérol 20%) ;
9. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;
10. Eluer les acides nucléiques dans 92 μΙ de tampon d'élution (10 mM Tris-HCI à pH 9) et agiter avec un Eppendorf - Thermomixer compact N° 5350 000.013 pendant 3 min à 1400 rpm à 60°C ; 11. Placer le tube sur un banc magnétique puis récupérer le surnageant pour réaliser différentes analyses.
Dans le surnageant récupéré, l'ADN est analysé par qPCR en utilisant des amorces spécifiques des pathogènes visés. On obtient ainsi la quantité d'ADN présente dans le tube en fin de procédé et cette dernière est comparée à la quantité totale d'ADN de l'échantillon initial avec, pour la quantité d'ADN théorique, le calcul suivant : 1 bactérie=l copie ADN. Les résultats sont présentés à la Figure 4.
Lorsque comparée à l'extraction d'ADN avec 0% de glycérol dans le tampon de lavage n°l, une augmentation de l'extraction d'ADN peut être observée dès l'ajout de 1% de glycérol dans ce tampon et est maintenue pour certains échantillons jusqu'à une teneur de 40% de glycérol.
Exemple 4 : Variation de la concentration de Glycérol présent dans le tampon de lavage n°2.
Le protocole ci-après a été mis en œuvre pour étudier l'effet de la concentration de glycérol dans le tampon de lavage n°l. Pour cette étude, la concentration dans le tampon de lavage n°2, notée « D% » correspondant à la masse de glycérol par rapport à la masse totale de solution représente 0%, 1%, 10% ou 20%.
1. Dans un tube de 1,5 mL contenant 10000 bactéries dans un échantillon sanguin de 200 μί, ledit tube contenant du citrate ou de l'EDTA, ajouter
200 μΙ_ de tampon de lyse (SDS 1%, Tween20 20%, GuSCN 0,85 M, NaCI 1 M, Glycérol 10%), 28,6 μΙ protéinase K (20 mg/ml, Sigma - Cat No. P2308, dissoute dans 10 mM Tris- HCI à pH 8) ;
2. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à 56°C ;
3. Ajouter 250 μΙ_ de tampon de capture (TEG 60%, 1,2-butanediol 40%) et 20 μΙ_ de billes MagPrep HS (Merck SAS Estapor - Cat No. Magprep HS 101899) ;
4. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à température ambiante ;
5. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ; 6. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage (2 M GuSCN, 10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 10%, Glycérol 10%) ;
7. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;
8. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage
(10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 20%, Glycérol D%) ;
9. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;
10. Eluer les acides nucléiques dans 92 μΙ de tampon d'élution (10 mM Tris-HCI à pH 9) et agiter avec un Eppendorf - Thermomixer compact N° 5350 000.013 pendant 3 min à 1400 rpm à 60°C ;
11. Placer le tube sur un banc magnétique puis récupérer le surnageant pour réaliser différentes analyses.
Dans le surnageant récupéré, l'ADN est analysé par qPCR en utilisant des amorces spécifiques des pathogènes visés. On obtient ainsi la quantité d'ADN présente dans le tube en fin de procédé et cette dernière est comparée à la quantité totale d'ADN de l'échantillon initial avec, pour la quantité d'ADN théorique, le calcul suivant : 1 bactérie=l copie ADN. Les résultats sont présentés à la Figure 5.
Lorsque comparée à l'extraction d'ADN avec 0% de glycérol dans le tampon de lavage n°2, une augmentation de l'extraction d'ADN peut être observée dès l'ajout de 1% de glycérol dans ce tampon et est maintenue pour certains échantillons jusqu'à une teneur de 40% de glycérol.
Exemple 5 (comparatif) : Protocole d'extraction commercial PROMEGA mis en œuyre avec différentes billes.
Le protocole commercial PROMEGA ci-dessous a été mis en œuvre avec les billes magnétiques adaptées à ce protocole à savoir les billes MagaZorb (PROMEGA - Cat No. MB1004) mais aussi avec d'autres billes commerciales non référencées à savoir les billes magnétiques Dynabeads MyOne (Life Technologies - Cat No. Dynabeads® MyOne™Silane 37002D). 1. Dans un tube de 1,5 mL contenant 10000 bactéries dans un échantillon sanguin de 200 μί, ledit tube contenant du citrate, ajouter 200 μί de tampon de lyse PROMEGA, 20 μΙ protéinase K PROMEGA ;
2. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à 56°C ;
3. Ajouter 500 μΙ_ de tampon de capture PROMEGA et 20 μΙ_ de billes magnétiques :
- MagaZorb (PROMEGA - Cat No. MB1004) ;
- Dynabeads MyOne (Life Technologies - Cat No. Dynabeads® MyOne™
Silane 37002D) ;
4. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à température ambiante ;
5. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;
6. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage PROMEGA ;
7. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;
8. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage
PROMEGA ;
9. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;
10. Eluer les acides nucléiques dans 100 μΙ de tampon d'élution PROMEGA et incuber pendant 10 min à température ambiante ;
11. Placer le tube sur un banc magnétique puis récupérer le surnageant pour une analyse par PCR quantitative.
Pour rappel, dans une PCR quantitative, la quantité d'amplicons produits à chaque cycle est suivie par mesure de la fluorescence. Lorsque cette dernière devient statistiquement et significativement plus élevée que le bruit de fond, le cycle d'amplification correspondant est défini comme le cycle seuil ou Ct (pour « Cycle treshold »). Il existe une relation linéaire entre la quantité de matrices nucléiques dans le surnageant obtenu suite au protocole d'extraction/purification et le Ct obtenu avec ce surnageant. En d'autres termes, plus le Ct est élevé, plus la quantité de matrices dans le surnageant est faible et donc moins le rendement d'extraction/purification est faible. Pour analyser les Ct en PCR, il est important de noter qu'une différence de moins de 1 Ct n'est pas significative.
Les résultats des Ct des surnageants obtenus par le protocole PROM EGA utilisant les billes magnétiques référencées (MagaZorb, PROM EGA) ou des billes commerciales non référencées (Dynabeads MyOne, Life Technologies) sont donnés à la Figure 6. L'éluat obtenu contient l'ADN de trois pathogènes (E. coli, S. epidermidis, S. pneumonaie). La Figure 6 représente les Ct obtenus pour chaque pathogène.
La perte de 3 Ct pour le protocole PROM EGA lorsqu'on utilise des billes non référencées met en évidence que ce protocole est adapté aux billes référencées i.e. les billes MagaZorb. A noter qu'il a été expérimentalement vérifié (analyse RM N) que les tam pons de lyse et de lavage du protocole PROMEGA ne contenaient pas de glycérol.
Exemple 6 : Procédé selon l'invention avec des billes magnétiques de différents fournisseurs.
Dans cet exemple, différentes billes magnétiques com merciales ont été utilisées en suivant le procédé de l'invention décrit ci-après :
1. Dans un tube de 1,5 mL contenant 10000 bactéries E. coli dans un échantillon sanguin de 200 μί, ledit tube contenant du citrate ou de l'EDTA, ajouter 200 μί de tampon de lyse (SDS 1%, Tween20 20%, GuSCN 0,85 M, NaCI 1 M, Glycérol 10%), 28,6 μΙ protéinase K (20 mg/ml, Sigma - Cat No. P2308, dissoute dans 10 mM Tris- HCI à pH 8) ;
2. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à 56°C ;
3. Ajouter 250 μί de tampon de capture (TEG 60%, 1,2-butanediol 40%) et 20 μL de billes magnétiques :
- MagPrep HS (Merck SAS Estapor - Cat No. Magprep HS 101899) ;
- Dynabeads MyOne (Life Technologies - Cat No. Dynabeads® MyOne™ Silane 37002D) ; - MagaZorb (PROMEGA - Cat No. MB1004) ;
- Silanol (CHEMICELL - Cat No. SiMAG-Silanol 1101-1) ;
4. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à température ambiante ;
5. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;
6. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage (2 M GuSCN, 10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 10%, Glycérol 10%) ;
7. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;
8. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage (10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 20%, Glycérol 20%) ;
9. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;
10. Eluer les acides nucléiques dans 92 μΙ de tampon d'élution (10 mM
Tris-HCI à pH 9) et agiter avec un Eppendorf - Thermomixer compact N° 5350 000.013 pendant 3 min à 1400 rpm à 60°C ;
11. Placer le tube sur un banc magnétique puis récupérer le surnageant pour réaliser différentes analyses.
La Figure 7 présente les Ct obtenus, correspondant à l'ADN extrait d'E.
Coli, par mise en œuvre du procédé selon la présente invention avec des billes magnétiques commerciales de différentes origines. Avec les tampons contenant du glycérol, une meilleure homogénéité dans les Ct est obtenue, montrant que ces tampons sont compatibles avec une plus grande variété de billes. Ainsi, les résultats présentés mettent en évidence la possibilité d'utiliser des billes magnétiques différentes avec le procédé selon la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé pour extraire et purifier au moins un acide nucléique cible contenu dans un échantillon, comprenant les étapes successives consistant à :
a) mettre en contact l'échantillon avec un tampon de lyse moyennant quoi un lysat cellulaire est obtenu ;
b) mettre en contact le lysat cellulaire obtenu après l'étape (a) avec des particules magnétisables, dans des conditions permettant la capture dudit au moins un acide nucléique cible par lesdites particules ;
c) laver lesdites particules magnétisables obtenues suite à l'étape (b) avec un tampon de lavage contenant du glycérol ; et
d) mettre en contact lesdites particules lavées obtenues après l'étape (c) avec un tampon d'élution, dans des conditions permettant la libération dudit acide nucléique cible dans le tampon d'élution.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le tampon de lyse mis en œuvre lors de ladite étape (a) contient du glycérol.
3) Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit acide nucléique est choisi dans le groupe constitué par un chromosome ; un gène ; un polynucléotide régulateur ; un ADN, simple-brin ou double-brin, génomique, chromosomique, chloroplastique, plasmidique, mitochondrial, recombinant ou complémentaire ; un ARN total ; un ARN messager ; un ARN ribosomal ; un ARN de transfert ; un ANP ; une portion et un fragment de ceux-ci.
4) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit échantillon est choisi dans le groupe constitué par un fluide biologique ; un fluide végétal ; un prélèvement dans un milieu de culture ou dans un réacteur de culture biologique ; un liquide obtenu à partir d'un tissu animal ou végétal ; un tissu animal ou végétal ; une ou plusieurs cellules ; un culot cellulaire ; un prélèvement dans une matrice alimentaire ; un prélèvement dans un réacteur chimique ; un prélèvement dans une station d'épuration ; un prélèvement dans une station de compostage ; de l'eau de ville, de rivière, d'étang, de lac, de mer, de piscines, de tours aéro-réfrigérées ou d'origine souterraine; un prélèvement à partir d'un effluent industriel liquide ; de l'eau usée ; un prélèvement provenant d'une filtration d'air ou d'un revêtement ; un prélèvement sur un objet ; un produit pharmaceutique ; un produit cosmétique ; un parfum ; un échantillon de terre ou un de leurs mélanges. 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que ledit tampon de lyse est un tampon contenant du glycérol, au moins un tensioactif et au moins un agent chaotropique.
6) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le glycérol dans ledit tampon de lyse est en une quantité comprise entre 1 et 40%, notamment entre 5 et 20%, en particulier entre 7 et 15% et, plus particulièrement, de l'ordre de 10% (i.e. 10% ± 2%) en masse par rapport à la masse totale du tampon de lyse. 7) Procédé selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que ledit tensioactif est choisi parmi les tensioactifs non ioniques et les tensioactifs anioniques et leurs mélanges.
8) Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que ledit agent chaotropique est choisi dans le groupe constitué par le chlorure de sodium (NaCI), le sulfate d'ammonium ((NH4)2S04), le perchlorate de sodium (NaCI04), l'iodure de sodium (Nal), le chlorure de lithium (LiCI), le perchlorate de lithium (LiCI04), le chlorure de baryum (BaCI2), le chlorure de césium (CsCI2), le chlorure de potassium (KCI), l'iodure de potassium (Kl), de l'urée (CO(NH2)2), un sel de guanidine et leurs mélanges. 9) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, lors de ladite étape (a), au moins une protéase et avantageusement au moins une endoprotéase est ajoutée au mélange constitué par l'échantillon et le tampon de lyse.
10) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, lors de ladite étape (b), ladite mise en contact se fait en présence d'un tampon de capture, ce dernier comprenant avantageusement au moins un solvant choisi dans le groupe constitué par le 1,2-butanediol ; le 1,2-propanediol ; le 1,3- butanediol ; l'acétate de l-méthoxy-2-propanol ; le 3-méthyl-l,3,5-pentanetriol ; un ester dibasique tel que du DBE-2, du DBE-3, du DBE-4, du DBE-5 ou du DBE-6 ; l'éther monoéthylique du diéthylène glycol (DGME) ; l'acétate d'éther monoéthylique du diéthylène glycol (DGMEA) ; le lactate d'éthyle ; l'éthylène glycol ; le poly(2-éthyl-2- oxazoline) ; un sel de sodium d'un copolymère d'acide 4-styrène sulfonique et d'acide maléique ; le tetraéthylène glycol (TEG) ; le tetraglycol ; le tetrahydrofurfuryl polyéthylène glycol 200 ; l'éther divinylique de triéthylène glycol ; le triéthylène glycol anhydre et l'éther monoéthylique du triéthylène glycol.
11) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le tampon de lavage mis en œuvre lors de ladite étape (c) contient du glycérol, un tensioactif, notamment un tensioactif de la famille des éthylènes glycols tel qu'un tetraéthylène glycol ou un polyalkylène glycol et éventuellement un agent chaotropique. 12) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le glycérol est en une quantité comprise entre 1 et 40%, notamment entre 5 et 30% et, en particulier, entre 7 et 25% en masse par rapport à la masse totale du tampon de lavage.
13) Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que ledit tensioactif est du polyéthylène glycol présentant une masse molaire supérieure à 1000 g/mol, notamment supérieure à 2000 g/mol, en particulier, comprise entre 4000 et 10000 g/mol et, plus particulièrement, comprise entre 6000 et 8000 g/mol et/ou se trouve dans ledit tampon de lavage en une quantité comprise entre 1 et 40%, notamment entre 5 et 30% et, en particulier, entre 7 et 25% en masse par rapport à la masse totale du tampon de lavage.
14) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite étape (c) est répétée au moins une fois. 15) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit tampon d'élution est un tampon choisi parmi du Tris à une concentration comprise entre 5 et 50 mM, du Tris base à une concentration comprise entre 5 et 50 mM, du Tris/HCI à une concentration comprise entre 5 et 50 mM, de la triéthanolamine à une concentration comprise entre 5 et 50 mM ou un de leurs mélanges, le pH dudit tampon d'élution étant avantageusement de l'ordre de 9 (i.e. 9 ± 0,5).
16) Tampon de lyse susceptible d'être mis en œuvre dans un procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 15, contenant au moins un tensioactif, au moins un agent chaotropique et du glycérol, caractérisé en ce que ledit agent chaotropique est un mélange de chlorure de sodium et de thiocyanate de guanidine.
17) Tampon de lavage susceptible d'être mis en œuvre dans un procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 15, contenant du glycérol, un tensioactif de la famille des éthylènes glycols et éventuellement un agent chaotropique.
18) Kit d'éléments comprenant :
- au moins un tampon de lyse tel que défini à la revendication 16 et
- au moins un tampon de lavage tel que défini à la revendication 17.
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