WO2014208156A1 - 新規肺癌マーカー（liph） - Google Patents

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柴田　典緒
浅島　誠
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    • G01N33/5752—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the lungs

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of clinical diagnostic agents that assist in the diagnosis of cancer. Furthermore, the present invention relates to a cancer marker, particularly a lung cancer marker for detecting lung cancer, and an esophageal cancer marker for detecting esophageal cancer.
  • Cancer is increasing due to the aging of the population, etc., and in 2012, cancer patients reached 32 million in the world, and it is said that 14.2 million people were newly diagnosed with cancer in one year. In Japan, cancer is the leading cause of death, with 340,000 deaths annually. Cancer has become a disease that can be treated if detected early, and early detection of cancer is important. Endoscopic examination, PET, CT, and the like have been developed for early detection of cancer, but development of cancer markers is indispensable for efficiently examining a large number of subjects. Various cancer markers have already been developed. In lung cancer and esophageal cancer, further development of cancer markers is desired. Lung cancer is one of the diseases with a poor prognosis whose early detection is difficult and its 5-year survival rate is less than 20%.
  • the type (histological type) of lung cancer is classified pathologically into small cell lung cancer and non-small cell lung cancer, and the latter is further classified into squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, and large cell carcinoma.
  • CYFRA 21-1, CEA, SLX, SCC, ProGRP, NSE, and the like are currently frequently used as lung cancer markers.
  • CEA is the most common tumor marker, and SLX is highly specific for adenocarcinoma.
  • CYFRA 21-1 and SCC are said to be highly specific for squamous cell carcinoma
  • ProGRP and NSE are said to be highly specific for small cell carcinoma.
  • Patent Document 1 reports that the sensitivity is improved when NNMT is used in combination with conventional markers such as CYFRA 21-1, CEA, NSE, and SCC.
  • Non-Patent Document 1 reports a lung cancer marker using a sugar chain.
  • esophageal cancer is one of the most fatal malignant tumors in the digestive tract, and when esophageal cancer is discovered by examination, the pathological condition has often progressed considerably. Even after radical treatment at stage 1, the survival rate after 5 years is still as low as 40-60%.
  • Non-patent Document 2 Opa interacting protein 5 has been reported as a biomarker for lung cancer and esophageal cancer.
  • Cancer markers used clinically such as CEA, still have a low detection rate. For example, early lung cancer has a detection rate of about 30%, and a new marker with higher sensitivity is desired. Then, this invention makes it a 1st subject to provide a novel cancer marker. Moreover, this invention makes it a 2nd subject to provide a cancer marker with high detection efficiency. Furthermore, this invention makes it a 3rd subject to provide a novel lung cancer marker. Moreover, this invention makes it a 4th subject to provide a lung cancer marker with high detection efficiency. Moreover, this invention makes it a 5th subject to provide the lung cancer marker which can specify the kind (tissue type
  • a sixth object to provide a lung cancer marker that can improve detection efficiency and / or detection specificity by combining with other lung cancer markers. Furthermore, this invention makes it the 7th subject to provide a novel esophageal cancer marker. Moreover, this invention makes it an 8th subject to provide an esophageal cancer marker with high detection efficiency. In addition, a ninth object is to provide an esophageal cancer marker that can improve detection efficiency and / or detection specificity by combining with other esophageal cancer markers.
  • LIPH lipase, member H
  • adenocarcinoma-derived cell lines whose expression is enhanced compared to normal lung-derived epithelial cells, and may be highly expressed in lung cancer and esophageal cancer.
  • the present invention was completed.
  • the inventors of the present application showed that LIPH was stained in lung tumor tissue but not in stromal tissue, and even in the protein level of clinical samples. It was clarified that expression in the tissue was enhanced.
  • the expression of LIPH protein by lung cancer histological type showed high positive rate of 70% for lung adenocarcinoma and 70% for bronchioloalveolar carcinoma, while 30% for lung squamous cell carcinoma
  • the expression was confirmed in only 1 out of 10 samples in cell cancer, which was slightly low at 20%, and the LIPH protein was found to be a protein specifically expressed in lung adenocarcinoma.
  • the present inventors provide a marker that identifies the lung cancer tissue type.
  • the present invention is excellent in providing a novel and highly reliable lung cancer marker.
  • LIPH is an excellent marker in that lung adenocarcinoma can be specifically detected.
  • FIG. 1 shows the expression of lung cancer markers in lung cancer cell lines.
  • FIG. 2 shows the expression of lung cancer marker LIPH in lung cancer tissue.
  • FIG. 3 shows the results of observing the expression of LIPH by lung cancer histology.
  • FIG. 4 shows the amount of LIPH detected in the serum of healthy individuals and cancer patients.
  • FIG. 5 shows a correlation plot with CEA.
  • FIG. 6 shows the results of observing the expression of LIPH for each esophageal cancer histological type.
  • the inventors of the present application first selected candidate genes that are expected to be significantly higher in lung cancer. Among the candidate genes, a plurality of lung cancer-derived cell lines having higher expression levels than normal lung-derived epithelial cells were further selected to complete the cancer marker. 2. Cancer marker gene, lung cancer marker gene, esophageal cancer marker gene The present inventors have identified a LIPH (lipase, member H) gene as a cancer marker. Furthermore, the present inventors have identified the LIPH (lipase, member H) gene as a lung cancer marker and an esophageal cancer marker.
  • LIPH lipase, member H
  • Confirmation of expression of cancer marker gene, lung cancer marker gene, and / or esophageal cancer marker gene For confirmation of gene expression, a well-known method for detecting mRNA of the gene or a protein encoded by the gene can be used. As a method for confirming the presence of mRNA, for example, a LAMP method, a PCR method, a microarray method, or the like can be used. As a protein confirmation method, a method using an antibody such as an immunostaining method or an ELISA method can be used. 4).
  • a method for confirming the presence of cancer cells using a cancer marker a method for assisting cancer diagnosis, a method for confirming the presence of lung cancer cells using a lung cancer marker, a method for assisting diagnosis of lung cancer, and an esophageal cancer marker 4.
  • Sample as a sample (sample) for use in the method for confirming the presence of cancer cells, lung cancer cells or esophageal cancer cells, any sample can be used.
  • biopsy samples can be obtained by crushing cells and extracting total RNA by conventional methods such as surfactants, homogenizers, or freeze sawing.
  • a LAMP method for quantification of the target mRNA, a LAMP method, a differential display method, a method using a DNA array (DNA chip), a quantitative PCR method, a real-time PCR method, or a competitive PCR method can be used.
  • the real-time PCR method there is a method of monitoring and analyzing production of marker gene amplification products in real time. Examples of the real-time monitoring reagent include SYBRGreen I and TaqMan probe.
  • cDNA is prepared from intracellular total RNA or mRNA using reverse transcriptase, and the cDNA and DNA competitor are reacted in the same tube.
  • examples include a method of reacting by adding an RNA competitor together with mRNA.
  • the internal sequence other than the competitor primer sequence may be, for example, a sequence homologous to the sequence of the amplification-target mRNA or a non-homologous sequence.
  • cDNA can be prepared from total extracted RNA by reverse transcription reaction using Oligo dT primer, and this can be measured by real-time PCR.
  • ISOGEN method Nippon Gene
  • PrimeScript® II 1st strand cDNA Synthesis Kit can be used for reverse transcription.
  • the amplification product can be measured using THUNDERBIRD (trademark) SYBR Mix (TOYOBO), TaqMan probe, or the like.
  • THUNDERBIRD trademark
  • TOYOBO Tip-Bridge
  • TaqMan probe or the like.
  • the primer may be any primer as long as it can amplify the LIPH gene, which is a cancer marker gene, lung cancer marker gene and / or esophageal cancer marker gene, by a gene amplification method such as PCR.
  • any sequence of 15 or more bases in length A primer having a length of preferably 16-30 bases, more preferably 18-28 bases can be used. Specifically, those described in Table 1 below can be used.
  • a differential display method or a DNA array (DNA chip) can also be used.
  • a labeled probe having a sequence complementary to the sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a sequence in which 1 to several bases are deleted, substituted, and / or added to the same sequence is used. it can.
  • the probe label examples include radioisotopes, fluorescent substances, luminescent substances, enzymes, and the like.
  • radioisotope for example, [32P], [33P], [125I], [131I] and the like can be used.
  • fluorescent substance for example, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7, fluorescein isothiocyanate, fluorescamine, rhodamine and the like can be used.
  • the enzyme include alkaline phosphatase, peroxidase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, malate dehydrogenase and the like, which are commonly used as labels. 4-2-1.
  • kits for carrying out the mRNA detection method include (1) a primer or a set of primers (primers) that can amplify a LIPH (lipase, member H) lung cancer or esophageal cancer marker gene by a gene amplification method such as the LAMP method.
  • Method for detecting a protein in a sample In the present invention, any method can be used as a method for detecting a marker protein as long as it can specifically detect the marker protein, such as a method for detection using an antibody or mass spectrometry. good.
  • an antibody against a protein encoded by the LIPH gene may be a commercially available one, but may be prepared by a conventional method.
  • Marker protein detection methods using antibodies include immunostaining, immunofluorescence, various enzyme immunoassays, radioimmunoassay (RIA) / enzyme linked immunoassay (ELISA), double monoclonal antibody sandwich immunoassay, monoclonal polyclonal antibody Examples include a sandwich assay method, a Western blotting method, a biotin-avidin method, and an immunoprecipitation method. 4-3-1.
  • a kit for carrying out the above-mentioned protein detection method of 4.3 the following may be mentioned.
  • kits for carrying out the sandwich ELISA method include the following reagents.
  • (2) (i) Monoclonal antibody or polyclonal antibody, (ii) Enzyme labeled monoclonal antibody or polyclonal antibody, and (iii) Substrate solution A kit for carrying out the biotin-avidin method contains the following reagents.
  • the kit for carrying out the sandwich ELISA method and the biotin-avidin method comprises the following reagents: Is included.
  • (4) (i) monoclonal antibody or polyclonal antibody, (ii) biotinylated monoclonal antibody or polyclonal antibody, (iii) enzyme-labeled avidin or streptavidin, and (iv) substrate solution.
  • the substrate solution is labeled with alkaline phosphatase (AP)
  • p-nitrophenyl phosphate-containing buffer solution is used.
  • HRPO horseradish peroxidase
  • o-phenylenediamine-containing buffer solution is used.
  • galactosidase a buffer containing 4-methylumbellyl ferryl- ⁇ -galactoside can be used.
  • a method using a biotinylated antibody a known method can be used.
  • a method of binding a conjugate of streptavidin and peroxidase to biotin is used. Examples of such peroxidase include horseradish peroxidase.
  • the inventors of the present application obtained eight kinds of novel lung cancer marker candidate factors by a preliminary study in which candidate genes that are expected to be significantly high in lung cancer are first selected.
  • qPCR was performed using a lung cancer-derived cell line to verify the expression of each candidate factor at the mRNA level.
  • 16 types of lung cancer-derived cell lines and 2 types of normal lung-derived cells were cultured to confluence on 6-well plates using the cells described in Table 2.
  • RNA extraction was performed using ISOGEN (Nippon Gene) or RNA easy mini kit (QIAGEN). Using the extracted 500 ng of total RNA as a template, cDNA was synthesized using PrimeScript II 1st strand synthesis kit (Takara Bio Inc.).
  • qPCR was performed using THUNDERBIRD SYBR Mix (TOYOBO) using the synthesized cDNA as a template.
  • the results for LIPH lipase, member H are shown in FIG.
  • SAEC small airway epithelial cells
  • NHBE alveolar epithelial cells
  • expression was more than doubled in multiple lung adenocarcinoma cell lines.
  • expression was increased in lung squamous cell carcinoma cell lines.
  • the vertical axis of the graph in the figure indicates the value obtained by dividing the gene expression level by the expression level of the internal standard gene GAPDH as a relative value to the expression level of the PC-3 cells.
  • tissue microarray (Shanghai Outdo) using a proteintech anti-LIPH rabbit polyclonal antibody.
  • the tissue microarray used is spotted with 60 specimens of lung cancer tissue and formalin-fixed paraffin-embedded sections of 60 specimens of peripheral normal tissue derived from the same donor as the cancer specimen.
  • the types of lung cancer are lung squamous cell carcinoma, lung adenocarcinoma, lung adenosquamous cell carcinoma, bronchioloalveolar carcinoma, 10 large cell carcinomas and 10 small cell lung cancer samples.
  • the tumor cells were positive for cytoplasm in lung adenocarcinoma, cell surface in bronchial epithelial cancer, membrane and nucleus in squamous cell carcinoma, and mainly in nucleus in small cell lung cancer.
  • Lung cancer patient serum was purchased from Bizcom Japan, and healthy human serum samples were procured from Eiken.
  • 100 ⁇ g / well of anti-LIPH rabbit polyclonal antibody (Proteintech) was immobilized on Maxisoap (nunc) at 4 ° C. overnight, followed by overnight blocking at 25 ° C. using 25% Block Ace. After removing the blocking solution, 100 ⁇ g / well of a serum sample diluted 10-fold with 10% Block Ace was added and reacted at room temperature for 1 hour. After washing 3 times with 10 mM PBS (pH 7.2), an anti-LIPH mouse polyclonal antibody (Sigma) diluted 1: 500 was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • the CEA value of the serum sample used in Example 4 was measured.
  • An E test “TOSOH” II CEA immunoreaction reagent (Tosoh) was used as a measuring reagent, and AIA-800 (Tosoh) was used as a measuring apparatus.
  • tissue microarray (Shanghai Outdo) using an anti-LIPH rabbit polyclonal antibody manufactured by Proteintech.
  • the tissue microarray used is spotted with formalin-fixed paraffin-embedded sections of 6 specimens of esophageal cancer tissue and 6 surrounding normal tissues derived from the same donor as the cancer specimen. All esophageal cancer specimens were squamous cell carcinoma. First, xylene treatment for 10 minutes, twice with 100% EtOH (ethanol) for 10 minutes, followed by treatment with 90% EtOH for 10 minutes, and finally treatment with 70% EtOH ethanol for 10 minutes.
  • the present invention can be used in industries that manufacture diagnostic agents and diagnostic kits. More specifically, tumor diagnostic agents and diagnostic kits can be used in the manufacturing industry. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

　本願発明は、新規な肺癌マーカーを提供することを第１の課題とする。また、本願発明は、検出効率が高い肺癌マーカーを提供することを第２の課題とする。更に、本願発明は、肺癌の種類（組織型）を特定することができる肺癌マーカーを提供することを第３の課題とする。　本願発明者らは、LIPH（lipase, member H）は複数の肺癌由来細胞株で正常肺由来上皮細胞と比較して発現が亢進し、肺癌において高発現している可能性が高いことを見出し、本願発明を完成させた。

Description

新規肺癌マーカー（ＬＩＰＨ）
　本願発明は、癌の診断を補助する臨床検査薬の技術分野に関する。更に、本願発明は、癌マーカー、特に肺癌検出用の肺癌マーカー、及び食道癌検出用の食道癌マーカーに関する。
　人口の高齢化などにより、癌が増加しており、２０１２年に世界では癌患者は３２００万に達し、１年で１４２０万人が新たに癌であると診断されたといわれている。我が国においても癌は、年間３４万人が死亡する、死因第１位の疾患である。癌は、早期発見すれば、治療も可能な病気となってきており、癌の早期発見が重要となっている。癌の早期発見には、内視鏡検査や、ＰＥＴ、ＣＴ等の開発もされているが、大量の被験者を効率的に検査するには、癌マーカーの開発が欠かせなくなっている。
　すでに、種々の癌マーカーが開発されているが、肺癌及び食道癌では、更なる癌マーカーの開発が望まれている。
　肺癌は早期発見が困難でその５年生存率は２０％に満たない予後不良な疾患の一つである。しかし、Ｓｔａｇｅ　ＩＡ、ＩＢの早期肺癌に限ればその５年生存率は７０％程度と大幅に上昇する。肺癌の種類（組織型）は病理学的にはその形態から小細胞性肺癌及び非小細胞性肺癌に分類され、後者はさらに扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌に分類されている。肺癌マーカーとして現在良く使用されているものには、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＥＡ、ＳＬＸ、ＳＣＣ、ＰｒｏＧＲＰ、ＮＳＥなどがある。ＣＥＡはもっとも一般的な腫瘍マーカーであり、ＳＬＸは腺癌に特異性が高い。ＣＹＦＲＡ２１−１やＳＣＣは扁平上皮癌に特異性が高いとされ、ＰｒｏＧＲＰやＮＳＥは小細胞癌に特異性が高いといわれている。
　また、例えば、特許文献１には、従来からのＣＹＦＲＡ　２１−１、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＳＣＣ等のマーカーと組み合わせてＮＮＭＴを用いると感度が向上することを報告している。非特許文献１には、糖鎖を利用した肺癌マーカーが報告されている。
　また、食道癌は、消化器での一番の致死性の悪性腫瘍の一つであり、検査で食道癌が発見されたときには、すでに病状が相当に進行していることが多い。ステージ１で根治的治療をしても５年後生存率は、依然、４０−６０％と低いのが現状である。しかしながら、食道癌マーカーについては、診断、治療効果判定、予後評価のいずれかにでも有用であるものは残念ながら少ない現状である。扁平上皮癌では、ＳＣＣとＣＥＡが、腺癌ではＣＥＡが使われ、他に食道癌マーカーとしてはｐ５３抗体、及びＣＹＦＲＡ２１−１がある。
　なお、肺癌、食道癌のバイオマーカーとして、Ｏｐａ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　５が報告されている（非特許文献２）。
特表２００９−５４５７３１号
実験医学増刊　Ｖｏｌ．２５　Ｎｏ．１７　「肺癌における糖鎖標的腫瘍マーカーの探索」植田幸嗣，醍醐　弥太郎，中村祐輔 Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｃｉ　１０３：５７７−５８６，２０１２
　ＣＥＡ等、臨床で使用されている癌マーカーは検出率が依然低く、例えば、早期肺癌の検出率は３０％程度であり、より高感度な新規マーカーが望まれている。そこで本願発明は、新規な癌マーカーを提供することを第１の課題とする。また、本願発明は、検出効率が高い癌マーカーを提供することを第２の課題とする。更に、本願発明は、新規な肺癌マーカーを提供することを第３の課題とする。また、本願発明は、検出効率が高い肺癌マーカーを提供することを第４の課題とする。また、本願発明は、肺癌の種類（組織型）を特定することができる肺癌マーカーを提供することを第５の課題とする。その上、他の肺癌マーカーと組み合わせることにより、検出効率及び／又は検出特異性を向上させることができる肺癌マーカーを提供することを第６の課題とする。
更に、本願発明は、新規な食道癌マーカーを提供することを第７の課題とする。また、本願発明は、検出効率が高い食道癌マーカーを提供することを第８の課題とする。その上、他の食道癌マーカーと組み合わせることにより、検出効率及び／又は検出特異性を向上させることができる食道癌マーカーを提供することを第９の課題とする。
　本願発明者らは、ＬＩＰＨ（ｌｉｐａｓｅ，ｍｅｍｂｅｒ　Ｈ）は複数の肺腺癌由来細胞株で正常肺由来上皮細胞と比較して発現が亢進し、肺癌及び食道癌において高発現している可能性が高いことを見出し、本願発明を完成させた。
　さらに本願発明者らは、肺癌組織マイクロアレイを用いた免疫組織染色の結果、ＬＩＰＨは肺腫瘍組織で染色が見られたが間質組織では染色が見られず、臨床サンプルのタンパク質レベルにおいても肺腫瘍組織での発現が亢進することを明らかにした。ＬＩＰＨタンパク質の発現を肺癌の組織型別に見てみると、肺腺癌で７０％、細気管支肺胞上皮癌で７０％と高い陽性率を示した一方で、肺扁平上皮癌で３０％、大細胞癌で２０％とやや低く、小細胞癌では１０検体中１検体のみでその発現が確認され、ＬＩＰＨタンパク質が肺腺癌に特異的に発現するタンパク質であることを見出した。これらの知見に基づき、本願発明者らは、肺癌の組織型を特定するマーカーを提供する。
　本願発明は、新規な、高い信頼性の肺癌マーカーを提供するという優れたものである。特にＬＩＰＨは、肺腺癌を特異的に検出できる点で優れたマーカーである。
　また本願発明者らは、食道癌の組織マイクロアレイを用いた免疫組織染色の結果、ＬＩＰＨは食道癌組織で染色が見られたが間質組織では染色が見られなかった。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１３−１３６８２０号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　図１は、肺癌マーカーの肺癌細胞株における発現を示す。
　図２は、肺癌マーカーＬＩＰＨの肺癌組織における発現を示す。
　図３は、ＬＩＰＨの発現を肺癌組織型別に観察した結果を示す。
　図４は、健常人とがん患者におけるＬＩＰＨの血清中の検出量を示す。
　図５は、ＣＥＡとの相関プロットを示す。
　図６は、ＬＩＰＨの発現を食道癌組織型別に観察した結果を示す。
１．はじめに
　本願発明者らは、癌マーカーを開発するために、肺癌で発現が有意に高いと予想される候補遺伝子をまず選抜した。その候補遺伝子の中から、複数の肺癌由来細胞株で正常肺由来上皮細胞と比較して発現量が高いものを更に選抜し、癌マーカーを完成させた。
２．癌マーカー遺伝子、肺癌マーカー遺伝子、食道癌マーカー遺伝子
　本願発明者らは、癌マーカーとして、ＬＩＰＨ（ｌｉｐａｓｅ，ｍｅｍｂｅｒ　Ｈ）遺伝子を同定した。
　さらに、本願発明者らは、ＬＩＰＨ（ｌｉｐａｓｅ，ｍｅｍｂｅｒ　Ｈ）遺伝子を肺癌マーカー及び食道癌マーカーとして同定した。
　以下の実施例に示されるとおり、上記遺伝子は、複数の種類の肺癌由来細胞株で、正常肺由来細胞と比較して発現が亢進していたことが確認されている。さらに、免疫染色により、肺癌組織及び食道癌組織から上記遺伝子産物であるＬＩＰＨが検出されている。また、本マーカーは、肺癌及び食道癌への特異性に加え、肺癌切除後の予後との相関性が高く、肺癌の予後予測に使える可能性が非常に高いマーカーである。
３．癌マーカー遺伝子、肺癌マーカー遺伝子，及び／又は食道癌マーカー遺伝子の発現の確認
　遺伝子発現の確認には、当該遺伝子のｍＲＮＡ又は当該遺伝子がコードする蛋白質を検出する周知の方法を用いることができる。ｍＲＮＡの存在を確認する方法としては、例えば、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法、マイクロアレイ法などを用いることができる。蛋白質の確認方法としては、免疫染色法、ＥＬＩＳＡ法などの抗体を用いる方法などを用いることができる。
４．癌マーカーを用いた、癌細胞の存在を確認する方法及び癌診断を補助する方法、肺癌マーカーを用いた、肺癌細胞の存在を確認する方法及び肺癌診断を補助する方法、食道癌マーカーを用いた、食道癌細胞の存在を確認する方法及び食道癌診断を補助する方法
　４−１．サンプル
　癌細胞、肺癌細胞又は食道癌細胞の存在を確認する方法に使用するためのサンプル（試料）としては、任意の試料を用いることができるが、好適には被験者からの採取物、具体的には、任意の採取された体液、生検された試料を挙げることができる。特に好適には、被験者の肺疾患部又は食道疾患部の生検試料または喀痰試料を挙げることができる。
　４−２．サンプル中のｍＲＮＡの検出法並びにそのための試薬及びキット
　例えば、生検試料は、細胞を、例えば、界面活性剤、ホモジナイザー、又はフリーズソーイングなどの定法により、破砕し、全ＲＮＡを抽出することができる。目的のｍＲＮＡの定量には、ＬＡＭＰ法、ディファレンシャルディスプレイ法やＤＮＡアレイ（ＤＮＡチップ）を用いる方法、定量ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、コンペティティブＰＣＲ法を利用することができる。
　例えば、リアルタイムＰＣＲ法では、マーカー遺伝子の増幅産物の生成をリアルタイムでモニタリングし、解析する方法があげられる。前記リアルタイムモニタリング試薬としては、例えば、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ　Ｉ、ＴａｑＭａｎプローブ等が挙げられる。
　また、コンペティティブＰＣＲ法としては、例えば、細胞内の全ＲＮＡやｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製し、当該ｃＤＮＡ及びＤＮＡコンペティターを同一チューブ内で反応させる方法や、さらに前記逆転写反応時にｍＲＮＡとともにＲＮＡコンペティターを加えて反応させる方法等があげられる。またコンペティターのプライマー配列以外の内部配列としては、例えば、増幅目的ｍＲＮＡの配列と相同配列でもよく、非相同な配列でもよい。
　また、リアルタイムＰＣＲ法を利用する場合について、より具体的に例示すると、全抽出ＲＮＡからＯｌｉｇｏ　ｄＴプライマーを用いて逆転写反応で、ｃＤＮＡを調製し、これをリアルタイムＰＣＲで計測することができる。ＲＮＡ抽出には、例えば、ＩＳＯＧＥＮ法（ニッポンジーン）を用いることができる。また、逆転写法には、例えば、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（Ｒ）　ＩＩ　１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔを用いることができる。リアルタイムＰＣＲには、例えば、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（商標）　ＳＹＢＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社）やＴａｑＭａｎプローブなどを用いて増幅産物を測定することができる。
　また、ＬＩＰＨ遺伝子の配列又は同配列に１から数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された配列に相補的な配列の標識したプローブによるハイブリダイゼーション方法も含まれる。
　なお、プライマーとしては、癌マーカー遺伝子、肺癌マーカー遺伝子及び／又は食道癌マーカー遺伝子であるＬＩＰＨ遺伝子をＰＣＲ法などの遺伝子増幅方法で増幅できるプライマーであれば、いずれのプライマーでもよい。ＬＩＰＨ遺伝子、例えば、配列番号１で示される配列又は同配列に１から数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された配列について、その配列の任意の連続する１５塩基長以上の塩基、好ましくは１６−３０塩基長、より好ましくは、１８~２８塩基長からなるプライマーを使用することができる。具体的には、以下の表１に記載のものを用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　また、ディファレンシャルディスプレイ法やＤＮＡアレイ（ＤＮＡチップ）を用いることもできる。
　更にハイブリダイゼーション法には、配列番号１で示される配列又は同配列に１から数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された配列に相補的な配列の標識したプローブを用いることができる。
　プローブの標識としては、例えば、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、酵素などを挙げることができる。放射性同位元素としては、例えば、〔３２Ｐ〕、〔３３Ｐ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕などを用いることができる。蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレスカミン、ローダミンなどを用いることができる。酵素としては、例えば、標識として常用される、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる。
　４−２−１．
　上記ｍＲＮＡ検出方法を実施するためのキットとしては、例えば、（１）ＬＩＰＨ（ｌｉｐａｓｅ，ｍｅｍｂｅｒ　Ｈ）肺癌又は食道癌マーカー遺伝子をＬＡＭＰ法などの遺伝子増幅方法で増幅できるプライマー又は１組のプライマー（プライマーセット）を含むキット、（２）一例を挙げれば、表１に掲げた１組のプライマー（プライマーセット）を含むキットが挙げられる。
　４−３．サンプル中のタンパク質の検出方法
　本願発明では、マーカー蛋白質の検出法として、例えば、抗体を用いて検出する方法や質量分析法などマーカー蛋白質を特異的に検出できる方法であればいかなる方法を用いても良い。抗体を用いる方法では、上記ＬＩＰＨ遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体は、既に市販されているものを利用しても良いが、定法により調製してもよい。抗体を用いるマーカー蛋白質の検出法としては、免疫染色法、免疫蛍光法、各種のエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）・酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法、モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法、ウェスタンブロッティング法、ビオチン−アビジン法、免疫沈降法などを挙げることができる。
　４−３−１．
　例えば、上記４．３のタンパク質検出方法を実施するためのキットとしては次のようなものが挙げられる。
（１）（ｉ）酵素標識化モノクローナル抗体及び（ｉｉ）基質溶液
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法を実施するためのキットとしては下記の試薬を含むものがある。
（２）（ｉ）モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、（ｉｉ）酵素標識化モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、及び（ｉｉｉ）基質溶液
　ビオチン−アビジン法を実施するためのキットは下記の試薬を含むものである。
（３）（ｉ）ビオチン化モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、（ｉｉ）酵素標識化アビジン又はストレプトアビジン、及び（ｉｉｉ）基質溶液
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法及びビオチン−アビジン法を実施するためのキットは下記の試薬を含むものである。
（４）（ｉ）モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、（ｉｉ）ビオチン化モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、（ｉｉｉ）酵素標識化アビジン又はストレプトアビジン及び（ｉｖ）基質溶液
　なお上記の基質溶液とは、抗体に標識した酵素の基質であって、酵素反応により検出可能な変化を生じる基質を含有する溶液のことである。例えば、基質溶液としては、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）で標識した場合はｐ−ニトロフェニルリン酸含有緩衝液が、ホースラディシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）で標識した場合はｏ−フェニレンジアミン含有緩衝液が、β−ガラクトシダーゼで標識した場合は、４−メチルウンベリルフェリル−β−ガラクトシドを含有する緩衝液を用いることができる。
　ビオチン化抗体を用いる方法としては公知の方法を用いることができるが、好ましくはストレプトアビジンとパーオキシダーゼとのコンジュゲートをビオチンに結合させる方法を用いる。このようなパーオキシダーゼとしては、ホースラディッシュパーオキシダーゼが挙げられる。さらに、パーオキシダーゼの検出には、そのパーオキシダーゼの作用によって発色する物質を用いることが好ましい。
　以下に本願発明を、実施例を用いてより具体的に説明する。但し、本願は以下の実施例により限定されるものではない。
　本願発明者らは、肺癌で発現が有意に高いと予想される候補遺伝子をまず選抜する予備的研究により、８種の新規肺癌マーカー候補因子を得た。これら因子の肺癌における発現を検証するため肺癌由来細胞株を用いてｑＰＣＲを行い、ｍＲＮＡレベルでの各候補因子の発現を検証した。表２記載の細胞を同表記載の培地を用いて、１６種類の肺癌由来細胞株および２種類の正常肺由来細胞を６−ｗｅｌｌプレートでコンフルエントまで培養した。次に、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）あるいはＲＮＡ　ｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＲＮＡの抽出を行った。抽出した５００ｎｇの全ＲＮＡを鋳型としＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ　１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。そして合成したｃＤＮＡを鋳型としＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　ＳＹＢＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてｑＰＣＲを行った。
　ＬＩＰＨ（ｌｉｐａｓｅ，ｍｅｍｂｅｒ　Ｈ）についての結果を図１に示す。正常肺由来上皮細胞（ＳＡＥＣ　：小気道上皮細胞、ＮＨＢＥ：肺胞上皮細胞）と比較し、複数の肺腺癌細胞株で２倍以上の発現が確認された。また、肺扁平上皮癌細胞株で発現が上昇していた。図中グラフの縦軸は遺伝子の発現量を内部標準遺伝子ＧＡＰＤＨの発現量で除した値を、ＰＣ−３細胞の発現量との相対値で示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　タンパク質レベルでの発現を検証するため、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社の抗ＬＩＰＨウサギポリクローナル抗体を用いて、市販の組織マイクロアレイ（上海Ｏｕｔｄｏ社）に対する免疫染色を行った。用いた組織マイクロアレイには肺癌組織６０検体および癌検体と同一ドナー由来の周辺正常組織６０検体のホルマリン固定パラフィン包埋切片がスポットされている。肺癌のタイプは、肺扁平上皮癌、肺腺癌、肺腺扁平上皮癌、細気管支肺胞上皮癌、大細胞癌および小細胞肺癌各１０検体である。
　まず、キシレン処理を１０分間、２回、１００％ＥｔＯＨ（エタノール）で１０分間処理を２回、した後、９０％ＥｔＯＨで１０分間処理し、最後に、７０％ＥｔＯＨエタノールで１０分間処理して、脱パラフィンし、親水化した。
　次に、１０ｍＭクエン酸緩衝液中で１１０℃１０分間オートクレーブを行うことで抗原の賦活化を行った。０．３％Ｈ２Ｏ２／ＭｅＯＨで３０分処理して、内在性ペルオキシダーゼを失活させた。その後、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ　ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ社）を用いて免疫染色を行い、ＤＡＢ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ社）を用いて発色を行った。また、免疫染色後にヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ社）で対比染色を行った。
　顕微鏡（ＢＸ５０（ＯＬＹＭＰＵＳ社）、ＥＯＳ　ｋｉｓｓ　Ｘ６ｉで観察し、撮影した結果を図２に示す。肺腺癌組織において、腫瘍細胞の細胞質で強く発現していることが明らかとなった。
　実施例１及び２の結果より、ＬＩＰＨは、新規肺癌マーカー候補として有力であると判断した。そこで、以下に肺癌組織型別にＬＩＰＨが高発現している割合を検討し、その結果を示す（図３）。図中の数値は組織マイクロアレイにスポットされている１０検体中どのくらいの割合でＬＩＰＨが高発現しているかを示している。結果、肺腺癌では７０％と高い割合でその発現が確認でき、腺癌と類似した乳頭状所見を示す細気管支肺胞上皮癌（ＢＡＣ）でも同じく７０％と高い割合で発現が確認できた。一方、扁平上皮癌で３０％、大細胞癌で２０％とやや低く、小細胞肺癌では１０検体中１検体でのみその発現が確認され、非小細胞肺癌に特異的であることが示唆された。また、腫瘍細胞において、肺腺癌では細胞質、気管支上皮癌では細胞表面、扁平上皮癌では膜や核、小細胞肺癌では主に核が陽性であった。
　肺癌患者血清はビジコムジャパン社から購入し、健常者血清検体は栄研社内より調達した。Ｍａｘｉｓｏａｐ（ｎｕｎｃ社）に１００μｇ／ｗｅｌｌの抗ＬＩＰＨウサギポリクローナル抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社）を４℃一晩インキュベートすることで固相化し、２５％ブロックエースを用いて４℃一晩ブロキングを行った。ブロッキング液を除いた後、１０％ブロックエースにより１０倍希釈した血清検体を１００μｇ／ｗｅｌｌ加え、室温で１時間反応を行った。１０ｍＭ　ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で３回洗浄後、１：５００に希釈した抗ＬＩＰＨマウスポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社）を加え室温で１時間反応を行った。３回洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧを加え１時間反応を行った後、１００μｌのＯＰＤ基質を加え発色反応を行った。４９２ｎｍの吸光度を測定することでＬＩＰＨの定量を行った。標準はｃｕｓａｂｉｏ　ｂｉｏｔｅｃｈ社のＨｕｍａｎ　Ｌｉｐａｓｅ　ｍｅｍｂｅｒ　Ｈ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔに添付された標準物質を使用した。結果を図４に示す。
　実施例４で用いた血清検体のＣＥＡ値を測定した。測定試薬はＥテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ　ＣＥＡ免疫反応試薬（東ソー）を用い、測定装置にはＡＩＡ−８００（東ソー）を用いた。Ｘ軸に実施例４で測定した血清ＬＩＰＨ値、Ｙ軸に血清ＣＥＡ値をプロットした散布図を描画し、相関係数を求めた。結果を図５に示す。
　食道癌組織におけるＬＩＰＨのタンパク質レベルでの発現を検証するため、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社の抗ＬＩＰＨウサギポリクローナル抗体を用い、市販の組織マイクロアレイ（上海Ｏｕｔｄｏ社）に対する免疫染色を行った。用いた組織マイクロアレイには食道癌組織６検体および癌検体と同一ドナー由来の周辺正常組織６検体のホルマリン固定パラフィン包埋切片がスポットされている。食道癌検体の組織型はいずれも扁平上皮癌であった。
　まず、キシレン処理を１０分間、２回、１００％ＥｔＯＨ（エタノール）で１０分間処理を２回、した後、９０％ＥｔＯＨで１０分間処理し、最後に、７０％ＥｔＯＨエタノールで１０分間処理して、脱パラフィンし、親水化した。
　抗原の賦活化は１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１００℃、２０分間加熱処理することで行い、内在性ペルオキシダーゼを失活させるため、０．３％過酸化水素／メタノールで３０分間スライドを処理した。染色にはタイラマイドを利用したビオチンフリー免疫染色増感システムＣＡＳＩＩ（Ｄａｋｏ社）を使用し、製造者のプロトコールに従って行った。ＤＡＢ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ社）を用いて発色を行った後、ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ社）で対比染色を行った。観察はＩＸ５９顕微鏡（オリンパス）を用い、ＥＯＳ　Ｋｉｓｓ　Ｘ６ｉ（Ｃａｎｏｎ）を用いて画像を取得した。
　結果を図６に示す。図６より、ＬＩＰＨは、食道癌のマーカーとしても用いることができることが明らかとなった。
　本願発明は、診断剤及び診断キット製造を製造する産業で利用することができる。より具体的には、腫瘍診断剤及び診断キットを製造業で利用することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (15)

  1. 　ＬＩＰＨ遺伝子によりコードされるポリペプチドである癌マーカー。
  2. 癌が肺癌又は食道癌である請求の範囲第１項記載の癌マーカー。
  3. 　ＬＩＰＨをコードするｍＲＮＡである癌マーカー。
  4. 癌が肺癌又は食道癌である請求の範囲第３項記載の癌マーカー。
  5. 　配列番号１で示される配列又は同配列に１から数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された配列に相補的な配列の標識した癌検出用プローブ。
  6. 癌が肺癌又は食道癌である請求の範囲第５項記載の癌検出用プローブ。
  7. 　ＬＩＰＨ遺伝子を検出するためのＬＩＰＨ遺伝子配列中の連続する１５塩基以上の塩基を含む癌検出用プライマー。
  8. 　癌が肺癌又は食道癌である請求の範囲第７項記載の癌検出用プライマー。
  9. 　配列番号１で示される配列又は同配列に１から数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された配列について、その配列の任意の連続する１５塩基長以上の塩基を含む癌検出用プライマー。
  10. 　癌が肺癌又は食道癌である請求の範囲第９項記載の癌検出用プライマー。
  11. 　ＬＩＰＨに対する抗体を含む癌検出剤。
  12. 　癌が肺癌又は食道癌である請求の範囲第１１項記載の癌検出剤。
  13. 　抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第１１又は１２項記載の肺癌検出剤。
  14. 　請求の範囲第７~１０項いずれか１項記載のプライマーを含む肺癌検出キット。
  15. 　請求の範囲第１１~１３項いずれか１項記載の肺癌検出剤を含む肺癌検出キット。
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