WO2014207888A1 - 認知機能障害疾患のバイオマーカー及び当該バイオマーカーを用いる認知機能障害疾患の検出方法 - Google Patents
認知機能障害疾患のバイオマーカー及び当該バイオマーカーを用いる認知機能障害疾患の検出方法 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to biomarkers that are novel proteins and peptides that can be used for detection of cognitive impairment diseases including mild cognitive impairment and Alzheimer's disease, and a method for detecting cognitive impairment diseases using the biomarkers.
- a technique that has been generally used in an in vitro diagnostic agent is a conventional technique.
- the most common in vitro diagnostic agents are those that perform diagnostic tests by analyzing blood components as biomarkers.
- measurement of the presence of a single specific protein in the blood or a so-called oligopeptide having a molecular weight of 10,000 or less, or activity in the case of an enzyme protein is performed to obtain a normal (healthy person) sample and It has helped diagnosis with obvious differences from disease samples.
- the range of abnormal values and normal values is determined by measuring the amount of single or plural specific proteins or specific oligopeptides or their activity in biological samples derived from a certain number of healthy persons and disease patients in advance. Next, the biological sample to be evaluated is measured by the same method, and the test evaluation is performed depending on whether the measurement result belongs to the range of the determined abnormal value or normal value.
- a specific primary antibody or a specific primary antibody labeled with an enzyme that develops a color when it is reacted with a substrate in the amount of a single or a plurality of specific proteins or peptides as it is or after dilution in advance There are an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA; Enzyme Linked Immmunosorbent Assay) and a chemiluminescence assay (CLIA; ChemiLuminescent Immunoassay) that measure the color development amount of a sample using a secondary antibody.
- ELISA Enzyme Linked Immmunosorbent Assay
- CLIA ChemiLuminescent Immunoassay
- a radioimmunoassay (RIA; RadioImmunoassay) is used to measure the amount of the specific protein or peptide using a radioisotope conjugated to a primary antibody or a secondary antibody.
- RIA RadioImmunoassay
- an enzyme activity measurement method in which the product is given and measured by color development.
- the present inventor binds an antibody against a target protein or peptide to beads (including magnetic beads), captures the protein or peptide to be measured by this, and then elutes from the beads and measures by mass spectrometry.
- beads including magnetic beads
- mass spectrometry elutes from the beads and measures by mass spectrometry.
- Developing law for the purpose of analyzing intact proteins, a method of performing mass spectrometry by the above method after decomposing with trypsin or the like has also been reported (see Patent Document 1).
- the intact protein is used to fractionate the protein as it is, or the protein molecules that are specifically adsorbed are selected and analyzed by mass spectrometry.
- Cognitive dysfunction diseases such as Alzheimer's disease are increasing rapidly in Japan with the recent aging. The number was about 1.3 million in 1995, but is expected to reach about 2.8 million in 2010 and about 4.1 million in 2020. Alzheimer's disease is said to account for 60-90% of cognitive impairment disorders. This disease is not only losing the patient's memory, but also destroying the personality and losing the patient's social life function, so it is becoming a social problem.
- Donepezil hydrochloride an anti-acetylcholinesterase inhibitor, was approved at the end of 1999, and if it was administered early, it became possible to “delay” the decline in cognitive function with a high probability.
- early diagnosis is the most important issue in order to increase the effects of current therapies and therapeutic drugs to be developed.
- DSM IV The main diagnostic criteria for Alzheimer's disease by the American Psychiatric Association are shown below.
- AD Alzheimer disease
- MCI mild cognitive impairment
- FTD includes Pick's disease, which histologically shows the presence of Pick spheres in the cerebral cortex.
- Lewy body dementia (DLB) is characterized by progressive memory impairment and visual cognitive impairment such as hallucinations. In clinical diagnosis, DLB accounts for 10-30% of dementia, and the second most common degenerative dementia in the elderly after Alzheimer-type dementia (AD). Histologically, it is characterized by the presence of Lewy bodies in the cerebrum. Since FTD and DLB are dementia with dementia, they are also called dementia-type neurological diseases (Non-patent Document 1).
- HDS-R Hasegawa Intelligence Scale
- MMSE Mini-Mental State Examination
- the diagnostic imaging includes CT / MRI for cerebral morphological abnormalities such as brain atrophy and cerebral cerebral ventricular enlargement, cerebral blood flow scintigraphy (SPECT) for cerebral blood flow, and oxygen consumption / glucose consumption.
- SPECT cerebral blood flow scintigraphy
- PET positron tomography
- SPECT and PET are nuclear medicine methods that can detect abnormalities before morphological abnormalities occur (Non-patent Document 1).
- image diagnosis requires special equipment, it has a drawback that it cannot be performed in all medical institutions. In addition, judgment may be different depending on the doctor who views the image, and the objectivity is lacking.
- AD dementia
- screening for disease detection is impossible.
- a biomarker is found here that enables objective diagnosis using easily obtained patient samples such as blood (including serum and plasma), screening will be the most important issue at present. It becomes possible to detect early cognitive dysfunction diseases.
- Patent Document 1 a quantitative value of apolipoprotein A-II contained in a plurality of serum samples derived from the same cancer-bearing mammal is mutually compared between the samples.
- a method for detecting a change in the amount of apolipoprotein A-II is disclosed.
- Patent Document 2 discloses a liver for detecting liver cancer comprising at least one protein or peptide selected from the group consisting of a fibrinogen ⁇ chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 described in Reference 2 and the like. Biomarkers have been disclosed.
- Patent Documents 3-5 disclose biomarkers for diagnosis of cognitive dysfunction diseases.
- Patent Document 5 includes at least one selected from Complement C3 composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 described in Reference 5 and Transthyretin composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 described in Reference 5.
- a biomarker for detecting a cognitive dysfunction disease comprising a protein or peptide or a peptide fragment having 5 or more amino acid residues arising from the protein or peptide is disclosed.
- JP 2004-333274 A JP 2006-308533 A JP 2010-271078 JP 2012-037349 JP 2012-132808 JP
- the present technology aims to provide a biomarker and a method for detecting a cognitive impairment disease using the biomarker.
- the present inventor searched for proteins and partial peptides thereof that differ in the presence or absence and abundance in non-cognitive impairment subjects and cognitive impairment patients. As a result of intensive studies, the present inventor has found three kinds of polypeptides in serum that can detect cognitive dysfunction diseases.
- the three kinds of polypeptides are (a) a peptide derived from Apolipoprotein A1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (b) a peptide derived from Transthyretin consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and (c) The peptide was derived from Complement C3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
- a cognitive function can be obtained by using a combination of the two peptides, (c) a peptide derived from Complement C3 and (b) a peptide derived from Transthyretin or (a) a peptide derived from Apolipoprotein A1. It has been found that the detection accuracy of disordered diseases (particularly mild cognitive impairment and Alzheimer's disease) can be improved.
- a non-cognitive impairment subject means a non-demented control that includes a healthy person and may suffer from any disease but does not suffer from a cognitive impairment disease. Is. Moreover, in this technique, it shall include mild cognitive dysfunction (MCI), Alzheimer's disease (AD), and dementia type
- MCI mild cognitive impairment
- AD Alzheimer's disease
- the peptide found in the present technology has significance as a biomarker when it is detected not only in serum but also in other biological samples such as blood, serum, plasma, brain meningeal fluid, urine and the like. At the same time, proteins (hereinafter referred to as “intact proteins”) or peptides that are the origin of these peptides also have significance as biomarkers.
- the present technology provides a biomarker for detecting one or more cognitive dysfunction diseases selected from the following (a), (b) and (c).
- A An Apolipoprotein A1 intact protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a biomarker for detecting a cognitive dysfunction disease comprising this partial peptide
- the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A biomarker for detecting a transthyretin intact protein or a cognitive dysfunction disease comprising this partial peptide
- a complement C3 intact protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a cognition comprising this partial peptide
- the present technology is a biomarker for detecting one or more cognitive dysfunction diseases selected from the above-mentioned (a) biomarker, (b) biomarker, and (c) biomarker in a biological sample. It is intended to provide a method for detecting a cognitive dysfunction disease in which the above are measured simultaneously or separately.
- the present technology is for measuring a biomarker for detecting one or more cognitive dysfunction diseases selected from the above-mentioned (a) biomarker, (b) biomarker, and (c) biomarker.
- a detection kit for a cognitive impairment disorder is provided.
- This technique measures two or more types of biomarkers of cognitive dysfunction disease in a biological sample of a subject, analyzes each measurement result of the two or more types of biomarkers by logistic regression analysis, the analysis
- the present invention provides a method for selecting a combination of a plurality of biomarkers for testing cognitive dysfunction disorders having a high correct answer rate, including selecting a combination of biomarkers having a high correct answer rate for cognitive dysfunction based on the results.
- This technology can provide a biomarker and a method for detecting a cognitive dysfunction disease using the biomarker.
- SEQ ID NO: 3 Difference analysis and ROC curve results for the marker protein of C3. It is a figure which shows NDC
- one or more biomarkers selected from the following intact proteins (a) to (c) and / or partial peptides thereof may be used for detecting cognitive impairment disorders.
- A An Apolipoprotein A1 intact protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a biomarker for detecting a cognitive dysfunction disease comprising this partial peptide
- b The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
- a complement C3 intact protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a cognition comprising this partial peptide
- the present technology provides a kind of at least one intact protein and / or partial peptide thereof described in (a) to (c) in a biological sample when a subject suffers from a cognitive dysfunction disease. And the amount can be detected respectively. Furthermore, the present technology detects at least one or two or more intact proteins and partial peptides thereof described in the above (a) to (c) in a biological sample, and at the same time, changes in these types and amounts. By measuring, it is possible to more accurately diagnose whether or not the subject suffers from a cognitive impairment disorder.
- the present technology provides a system such as a diagnosis with extremely high accuracy and specificity by measuring one or more selected from the biomarkers (a) to (c) in a biological sample. be able to.
- the biomarker of the present technology is highly useful in determining drug effects.
- the present technology also provides the intact protein and / or its partial peptide of (a) to (c) in a biological sample of a subject by measuring the amount of each of the biomarkers (a) to (c). In the case of the occurrence or increase, if the subject suffers from mild cognitive impairment or a cognitive dysfunction disease including Alzheimer's disease, the subject can be detected, evaluated, discriminated, diagnosed or tested. In addition, the present technology can further accurately diagnose whether or not a subject suffers from a cognitive impairment disease by comparing with a biological sample of a non-cognitive impairment subject.
- a cognitive dysfunction disease by combining two or more of the biomarkers (a) to (c) described above, because the detection accuracy of the cognitive dysfunction disease is improved.
- a plurality of biomarkers it can be accurately detected or diagnosed as a cognitive dysfunction disease.
- the measurement of two types of (c) biomarker (C3) and (a) biomarker (ApoA1) or (b) biomarker (TTR) is a cognitive impairment disorder (MCI And AD) are improved because the detection accuracy is improved.
- peptide of “intact protein partial peptide” of the present technology means “polypeptide” and “oligopeptide”.
- the “oligopeptide” generally refers to a combination of amino acids having a molecular weight of 10,000 or less, or a number of amino acid residues of about several to 50 or less.
- the “polypeptide” refers to an amino acid having a molecular weight of 10,000 or more bound thereto, or a polypeptide having about 50 or more amino acid residues.
- the partial peptide of the intact protein refers to a peptide having a partial amino acid sequence of a part of the amino acid sequence of the intact protein.
- This intact protein partial peptide is produced as a partial peptide in the expression synthesis process by transcription / translation, or it is synthesized as an intact protein and then digested and degraded in vivo to produce a digested degradation product peptide.
- This technology can evaluate, discriminate, etc. whether a subject is in a normal state or suffers from a cognitive dysfunction disease by using expression synthesis and / or digestion degradation of in vivo protein as an index. It is also possible to evaluate and discriminate the degree of progression when suffering from a disease.
- Detection of cognitive dysfunction disease in the present technology is detection of whether or not the subject suffers from cognitive dysfunction disease, and may be evaluation, discrimination, diagnosis, examination, or the like.
- the detection of cognitive dysfunction disease of the present technology may also include an evaluation of a risk that a subject suffers from more severe cognitive dysfunction.
- an intact protein that can be used as a biomarker for detecting a cognitive impairment disease
- Transthyretin including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
- Complement C3 containing the amino acid sequence represented by No. 3 is mentioned.
- partial peptides of these intact proteins can also be used as biomarkers for detecting cognitive dysfunction diseases.
- the “partial peptide of an intact protein” in the present technology is meant to include a peptide fragment having 5 or more amino acid residues generated from an intact protein and a peptide produced in the synthesis / decomposition process.
- a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 preferably a polypeptide derived from Apolipoprotein A1
- a sequence Examples include a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by No. 2 (preferably a polypeptide derived from Transthyretin) and a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID No. 3 (polypeptide derived from Complement C3).
- a protein or peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in each amino acid sequence of the protein described in (a) to (c) above and the partial peptide thereof is biosynthesized. It can be used as a marker.
- “one or several” means “1 to 3”, “1 or 2”, and “1”.
- the partial peptide used as a biomarker in the present technology is meant to include a protein or peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 3, and a peptide fragment having 5 or more amino acid residues resulting therefrom.
- Non-Patent Document 2 describes a peptide in which R is substituted with K for the amino acid residue sequence IRGERA at the C-terminus (130 to 135) of histone H3 and a peptide CGGGERA in which IR is deleted and CGG is bound to GERA instead. It is reported that the peptide IRGERA was recognized by an antibody obtained as an immunogen. This indicates that antigenic recognition is made by a peptide consisting of 4 or more amino acid residues.
- the number of residues is increased by 1 to 5 or more, but such low molecular peptides are also targeted. It is important when using a method for detection and fractionation using immunological techniques such as immunoblotting, ELISA, immunoMS.
- a sugar chain may be added to an intact protein or a partial peptide thereof. Proteins and partial peptides to which these sugar chains are added can also be used as biomarkers for detecting cognitive impairment disorders.
- the biomarker may be quantified, or the presence or absence may be determined by qualitative.
- the biomarker concentration is equal to or higher than a predetermined measurement value or higher than the standard value of the patient group of non-cognitive dysfunction disease, it can be detected, diagnosed, etc. as a cognitive dysfunction disease.
- positive / negative detection, diagnosis, etc. can be performed by qualitative biomarker. For example, when a color develops by reacting with a biomarker, it is considered positive.
- two-dimensional electrophoresis or two-dimensional chromatography 2D-LC
- the chromatography used for the two-dimensional chromatography may be selected from known chromatography such as ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, gel filtration chromatography and the like.
- quantification can also be performed by SRM / MRM method using LC-MS combining chromatography (LC) and triple quadrupole mass spectrometry.
- the LC used at this time may be a one-dimensional LC.
- an antibody against the protein or peptide of interest is bound to the beads (including magnetic beads) developed by the present inventor, and the protein or peptide to be measured is captured thereby.
- the presence or amount of the target protein, protein fragment, or peptide can be easily determined without using two-dimensional electrophoresis or chromatography using the immunoMS method (see Patent Document 1), which is eluted from the beads and measured by mass spectrometry. Can be evaluated.
- the type and amount of one or more proteins in the biological sample can be measured simultaneously or separately by various methods.
- a target protein including a protein fragment and a partial peptide thereof
- an antibody against the protein primary antibody
- This technique is preferably measured by one or more of immunoblotting method; Western blotting method, enzyme or fluorescent or radioactive substance labeling method, mass spectrometry method, immunoMS method, and surface plasmon resonance method.
- the biomarkers of the present technology can be measured simultaneously or separately even when the types and amounts are different.
- This technology uses a 2D-LC-MALDI-TOF-MS method that combines two-dimensional chromatography and mass spectrometry, SRM / MRM method, and immunoMS method. It is more preferable to measure proteins or their partial peptides.
- enzyme-linked immunosorbent assay ELISA
- CLIA chemiluminescence assay
- RIA radioimmunoassay
- enzyme activity assay etc.
- the method is referred to as an enzyme or fluorescent or radioactive labeling method.
- enzyme or fluorescent or radioactive labeling method are referred to as “enzyme or fluorescent or radioactive substance-labeled antibody method”.
- Immunoblot method The simplest method. Prepare test serum diluted in several stages, drop a certain amount (around 1 microliter) onto a suitable membrane such as nitrocellulose membrane, and air dry. After treatment with a blocking solution containing a protein such as BSA, washing and reacting with the primary antibody, and after washing, a labeled secondary antibody for detecting the primary antibody is reacted. After washing the membrane, the label is visualized and the concentration is measured.
- ELISA method An antibody against a protein or a partial peptide thereof is bound to a carrier such as a microtiter plate previously subjected to special chemical modification, and after a sample is serially diluted, an appropriate amount thereof is added to a microtiter plate to which an antibody is bound and incubated. . Thereafter, washing is performed to remove uncaptured proteins and partial peptides. Next, a fluorescent or chemiluminescent substance or a secondary antibody conjugated with an enzyme is added and incubated. In the detection, after each substrate is added, evaluation judgment is performed by measuring visible light by a fluorescent or chemiluminescent substance or an enzyme reaction.
- substances that can bind to proteins or partial peptides thereof may be used.
- an aptamer or the like can be used. In the present technology, it is preferable to use substances (for example, antibodies or aptamers) for the biomarkers described in the above (a) to (c).
- microarray is a generic term for devices in which substances that can be bound to a substance to be measured are aligned (array) immobilized on a carrier (substrate).
- an antibody or aptamer against a protein or partial peptide may be used after being aligned and immobilized.
- Measurement is performed by adding a biological sample to a solid-phased antibody or the like, binding a protein or partial peptide to be measured on a microarray, and then binding a secondary antibody to which a fluorescent or chemiluminescent substance or enzyme is bound. Add incubation. Detection may be performed by adding each substrate and then measuring the fluorescent or chemiluminescent substance or visible light from the enzyme reaction.
- Mass Spectrometry for example, an antibody against a specific protein or a partial peptide thereof is bound to microbeads or substrates (protein chips) that have been specially modified in advance.
- the microbead may be a magnetic bead. Any material can be used for the substrate.
- the antibody to be used is (1) an antibody that recognizes only the full length of a specific protein, (2) an antibody that recognizes only a partial peptide, (3) an antibody that recognizes both a specific protein and its partial peptide, or A combination of (1) and (2), (1) and (3), or (2) and (3) may be used.
- a sample is serially diluted with a stock solution or a buffer solution, and then an appropriate amount of the sample is added to a microbead or substrate to which an antibody is bound, followed by incubation. Thereafter, washing is performed to remove uncaptured proteins and partial peptides. After that, the protein and partial peptide captured on the microbead or the substrate are analyzed by mass spectrometry using MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS, etc. Measure peak intensity. A certain amount of an appropriate internal standard substance is added to the original biological sample, its peak intensity is measured, and the ratio to the peak intensity of the target substance is determined to obtain the concentration in the original biological sample. I can know. This method is called immunoMS method.
- the sample can be diluted with a stock solution or a buffer solution or a part of the protein can be removed, and then separated by HPLC and quantified by mass spectrometry using an electrospray ionization (ESI) method.
- ESI electrospray ionization
- the concentration in the data can be known by absolute quantification by SRM / MRM method using an isotope-labeled internal standard peptide.
- proteins and partial peptides can be analyzed by a method using two-dimensional electrophoresis, a method using surface plasmon resonance, or the like.
- This technique also includes a method of subjecting a biological sample collected from a subject to two-dimensional electrophoresis or a surface plasmon resonance method, and detecting a cognitive dysfunction disease using the presence or amount of the biomarker as an index.
- the present technology also includes a device (for example, a detection device, a measurement device, an analysis device, or the like) that can detect the biomarker in the biological sample described above.
- the apparatus according to the present technology preferably includes an antibody or aptamer fixing unit (capture unit) and a measurement unit.
- the antibody or aptamer immobilization part preferably has a solid phase carrier such as a slide glass or a 96-well titer plate on which the antibody or aptamer is immobilized.
- the measurement unit is provided with light detection means corresponding to a detection target such as a spectrophotometer and a fluorescence spectrometer.
- the device of the present technology may include an analysis unit that analyzes the obtained data, and the analysis unit preferably includes a data processing device and analysis software.
- a control unit including a CPU or the like provided in the apparatus of the present disclosure or a system connectable thereto detects and diagnoses the above-described cognitive impairment disorder of the present technology.
- a program capable of executing the above method or a storage unit or system storing the program is provided.
- a subject's cognitive dysfunction can be evaluated at a mild stage, which is useful for preventive medicine.
- psychotherapy or pharmacotherapy is performed on a patient suffering from a cognitive dysfunction disease, if the progression of the disorder is suppressed, it is also reflected in the amount of protein / partial peptide in a biological sample such as serum. By measuring this, the therapeutic effect can be evaluated and judged, and drug discovery target biomolecules can be screened.
- the present inventor prepared a large number of peptides and prepared each antibody against each peptide. Using these antibodies, biomarkers for detecting intellectual dysfunction diseases were searched. At this time, the usefulness of each biomarker was evaluated using analysis based on the receiver operating characteristic curve (ROC curve).
- a complement C3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
- ROC curve receiver operating characteristic curve
- MCI and AD multi-marker cognitive dysfunction diseases
- logistic regression analysis Transthyretin and Complement C3 were used as multi-markers, enabling detection of cognitive dysfunction diseases with a very high accuracy of almost 90%.
- the present technology includes (i) measuring two or more types of biomarkers of cognitive dysfunction disease in a biological sample of a subject, and (ii) logistic regression of each measurement result of the two or more types of biomarkers. Analyzing a plurality of biomarkers for detecting a plurality of cognitive dysfunction diseases with a high correct answer rate, including: (iii) selecting a combination of biomarkers with a high correct answer rate for cognitive dysfunction diseases based on the analysis result A combination selection method can be provided.
- the correct answer rate distinguishing from MCI is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, or comparing NDC and AD
- the correct answer rate distinguishing from AD is preferably 85% or more, and more preferably 90% or more, it is suitable to distinguish MCI or AD and select it as a biomarker for detecting these.
- a protein or a partial peptide thereof related to a cognitive dysfunction disease in a biological sample of a subject is analyzed as a biomarker for detecting a cognitive dysfunction disease based on an analysis by ROC curve.
- the ROC curve and logistic regression curve are as described in Examples below.
- the most accurate answer rate is that the (b) biomarker and the (c) biomarker can be measured simultaneously or separately, and can be used for detection, diagnosis, etc. of cognitive impairment disorders based on the measurement results. Is preferable.
- the method of the present technology is stored as a program in a hardware resource including a control unit including a CPU and a storage medium (USB memory, HDD, CD, DVD, etc.), and is executed by a control unit such as an inspection device or a selection device. Is possible.
- the present technology can also be used as a detection kit for cognitive impairment disorders using the biomarkers described in (a) to (c) above.
- the present technology detects one or more cognitive dysfunction diseases selected from (a) biomarker (ApoA1), (b) biomarker (TTR), and (c) biomarker (C3). Therefore, it can be used as a detection kit for a cognitive dysfunction disease for measuring a biomarker.
- a detection kit combining (c) the biomarker (C3) and the (a) biomarker (ApoA1) or (b) biomarker (TTR) is preferable.
- the detection kit of the present technology is a one-component detection for cognitive dysfunction that includes all the biomarker-detectable reagents described in (a) to (c) together so that they can be detected simultaneously or separately. It is good also as a kit, or it is good also as a detection kit for cognitive dysfunction disease which has two or more (2 or more) detection kid which made the reagent which can detect each biomarker exist in a separate container.
- the detection kit preferably contains an antibody or aptamer for each biomarker of the present technology.
- one or more cognitive functions selected from the above (a) biomarker, (b) biomarker and (c) biomarker in a biological sample It is preferable to measure biomarkers for detecting disordered diseases simultaneously or separately.
- a method for detecting a cognitive dysfunction disease of the present technology (i) two or three types selected from (a) a biomarker, (b) a biomarker, and (c) a biomarker in a biological sample of a subject Measuring biomarkers for detecting cognitive dysfunction disorders of the subject simultaneously or separately, (ii) if the measurement results of at least two biomarkers are classified as cognitive dysfunction disorders, More preferably, it comprises determining the disease.
- the present technology can also employ the following configurations. That is, the present technology is as follows.
- a biomarker for detecting one or more cognitive dysfunction diseases selected from the following (a), (b) and (c).
- a biomarker for detecting one or more cognitive dysfunction diseases selected from the following (a), (b) and (c).
- a biomarker for detecting one or more cognitive dysfunction diseases selected from the following (a), (b) and (c).
- the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A biomarker for detecting a transthyretin intact protein or a cognitive dysfunction disease comprising this partial peptide
- a complement C3 intact protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a cognition comprising this partial peptide
- Biomarkers for detecting dysfunctional diseases selected from the following (a), (b
- a biomarker for detecting one or more cognitive dysfunction diseases selected from the following (a), (b) and (c) in a biological sample is measured simultaneously or separately: A method for detecting a cognitive impairment disorder.
- a complement C3 intact protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a cognition comprising this partial peptide
- Biomarker for detecting a dysfunctional disease [3] The method for detecting a cognitive dysfunction disease according to claim 2, comprising the following (i) and (ii).
- a biomarker for detecting two or three cognitive dysfunction diseases selected from the following (a), (b) and (c) in a biological sample of a subject is measured simultaneously or separately: thing.
- A An Apolipoprotein A1 intact protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a biomarker for detecting a cognitive dysfunction disease comprising this partial peptide
- b The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
- a complement C3 intact protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a cognition comprising this partial peptide
- Biomarkers for detecting dysfunctional diseases ii) When the measurement results of at least two kinds of biomarkers are classified as cognitive dysfunction disease, the subject is determined to be cognitive dysfunction disease.
- Immunoblotting method Western blotting method; enzyme or fluorescent or radioactive substance labeling method; mass spectrometry method; immunoMS method; surface plasmon resonance method.
- the method for detecting a cognitive dysfunction disease according to any one of [6] to [6].
- a cognitive dysfunction disease detection kit for measuring a biomarker for detecting one or more cognitive dysfunction diseases selected from the following (a), (b), and (c):
- a complement C3 intact protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a cognition comprising this partial peptide
- the detection of the cognitive dysfunction disease is detection of mild cognitive impairment, any one of the above [8] to [11] having two types of (c) biomarker and (a) biomarker
- the detection of the cognitive dysfunction disease is detection of Alzheimer's disease, any one of the above [8] to [11] having two types of (c) biomarker and (b) biomarker
- the detection kit for a cognitive dysfunction disease according to Item may be a one-pack type or a multi-pack type.
- a kit for detecting a cognitive dysfunction disease for performing the method for detecting a cognitive dysfunction disease according to any one of [2] to [7].
- NDC non-cognitive impairment
- proteins with AUC of 0.6 or higher were recognized as cognitive functions.
- the correct answer rate for distinguishing from MCI by comparing NDC and MCI is 80% or more, more preferably 85% or more, and / or the correct answer rate for distinguishing from AD by comparing NDC and AD
- a program for selecting a biomarker combination for a cognitive dysfunction disorder for causing the computer to execute the method according to any one of [16] to [18], or a control unit or a computer storing the program.
- the biomarker is selected from a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
- One or more biomarkers, detection methods, detection kits, or combination selection methods according to any one of the above [1] to [18].
- Test example 1 ⁇ Detection of markers for cognitive impairment by multiplex immunoassay> Among marker proteins related to neurodegenerative diseases including Alzheimer's disease, complement C3, Complement C4, Complement factor H of the complement system, Transthyretin involved in the suppression of A ⁇ fibril formation causing brain amyloidosis, and Alpha-2-macroglobulin are markers.
- a biological sample collected from a subject is subjected to an immunoassay method to detect a cognitive dysfunction disease using the presence or absence or amount of a marker as an index.
- a detection method a multiplex immunoassay method for simultaneously detecting a plurality of markers (analytes) from a biological sample was used.
- Serum sample hereinafter, the parentheses are abbreviations. Sera from 37 AD (Alzheimer's disease), 22 NDC (subjects without mental illness) and 39 MCI (mild cognitive impairment) were used.
- Methods Apolipoprotein E (ApoE), Apolipoprotein A1 (ApoA1), Complement C3 (C3), Transthyretin (TTR), Complement Factor H (Factor H), Alpha-2-macroglobulin (Alpha-2-M) are MILLIPLEX TM Measurement was performed using a multiplex kit (HNDG1-36K, Merck Millipore).
- Complement C4 (C4) was measured using a MILLIPLEX TM multiplex kit (HNDG2-36K, Merck Millipore).
- Bead dilution solution for ApoE, ApoA1, C3, TTR, Factor H, Alpha-2-M 2,100 ⁇ l of Bead Diluent was added to the mixing bottle, and 150 ⁇ l of each of 6 types of bead suspensions to which each antibody was bound was added and stirred. This was used as a bead dilution.
- Bead dilution for C4 measurement 2,850 ⁇ l of Bead Diluent was added to the mixing bottle, and 150 ⁇ l of the bead suspension to which the C4 antibody was bound was added and stirred. This was used as a bead dilution.
- the dilution series is 1, 4, 16, 64, 256, 1024, 4096 times.
- a 96-well filter plate for assay measuring ApoE, ApoA1, C3, TTR, Factor H, Alpha-2-M and a 96-well filter plate for assay measuring C4 are prepared separately. An antibody reaction was performed. 200 ⁇ l of Wash Buffer was added to a 96-well filter plate for assay, and the mixture was stirred at 1,200 rpm for 10 minutes at room temperature using Plate Shaker (M • BR-022, TAITEC). Thereafter, Wash Buffer was removed by suction using a manifold. 25 ⁇ l of Assay Buffer was added to all wells to be used, and 25 ⁇ l of bead dilution was further added.
- Table 1 is a table showing the p-value when each case group was tested by 2-pair t-test and the significance level was p ⁇ 0.05.
- Complement C3 (C3) is significantly different between NDC vs. MCI, NDC vs. AD, and MCI vs. AD, and distinguishes cognitive impairment (MCI, AD) patients from non-cognitive impairment (NDC) patients Found to be useful.
- Apolipoprotein A1 (ApoA1) and Transthyretin (TTR) were found to be useful in distinguishing AD patients from NDC.
- Apolipoprotein E Apolipoprotein E
- Factor H Complement factor H
- Alpha-2-macroglobulin Alpha-2-macroglobulin
- C4 C4
- ROC curve receiver operating characteristic curve
- Table 2 shows C3, ApoA1, and TTR NDC vs. MCI and NDC vs. AD AUC. 1, 2 and 3 show difference analysis and ROC curves for the three marker proteins C3, ApoA1, and TTR.
- A) in Fig. 1 is a diagram of difference analysis. When NDC and MCI are compared, C3 is significantly reduced by MCI (t test, p value 0.034), and when NDC and AD are compared, C3 is significantly decreased by AD. (T-test, p-value 1.668E-4). Furthermore, when compared with MCI and AD, C3 is significantly decreased in AD (t test, p value 0.01).
- B) and C) in FIG. 1 are ROC curves when comparing NDC vs.
- FIG. 2 is a diagram of difference analysis of ApoA1, and C3 is significantly decreased in AD compared with NDC and AD (t test, p value 0.049).
- B) and C) in FIG. 2 are ROC curves when comparing NDC vs. MCI and NDC vs. AD.
- the AUC when comparing NDC and MCI was 0.649, and the AUC when comparing NDC and AD was 0.673.
- FIG. 3A) is a diagram of TTR difference analysis.
- B) and C) in FIG. 3 are ROC curves when compared by NDC vs. MCI and NDC vs. AD.
- the AUC when comparing NDC and MCI was 0.677, and the AUC when comparing NDC and AD was 0.730.
- Test Example 2 was performed in order to analyze a combination that more accurately distinguishes MCI and AD from NDC.
- Apolipoprotein A1-derived peptide (SEQ ID NO: 1) [Intact protein / peptide] 0001 MKAAVLTLAV LFLTGSQARH FWQQDEPPQS PWDRVKDLAT VYVDVLKDSG 0051 RDYVSQFEGS ALGKQLNLKL LDNWDSVTST FSKLREQLGP VTQEFWDNLE 0101 KETEGLRQEM SKDLEEVKAK VQPYLDDFQK KWQEEMELYR QKVEPLRAEL 0151 QEGARQKLHE LQEKLSPLGE EMRDRARAHV DALRTHLAPY SDELRQRLAA 0201 RLEALKENGG ARLAEYHAKA TEHLSTLSEK AKPALEDLRQ GLLPVLESFK 0251 VSFLSALEEY TKKLNTQ
- TTR Transthyretin-derived peptide
- C3-derived peptide (SEQ ID NO: 3) [Intact protein / peptide] 0001 MGPTSGPSLL LLLLTHLPLA LGSPMYSIIT PNILRLESEE TMVLEAHDAQ 0051 GDVPVTVTVH DFPGKKLVLS SEKTVLTPAT NHMGNVTFTI PANREFKSEK 0101 GRNKFVTVQA TFGTQVVEKV VLVSLQSGYL FIQTDKTIYT PGSTVLYRIF 0151 TVNHKLLPVG RTVMVNIENP EGIPVKQDSL SSQNQLGVLP LSWDIPELVN 0201 MGQWKIRAYY ENSPQQVFST EFEVKEYVLP SFEVIVEPTE KFYYIYNEKG 0251 LEVTITARFL YGKKVEGTAF VIFGIQDGEQ RISLPESLKR IPIEDGSGEV 0301 VLSRKVLLDG VQNPRAED
- Test example 2 ⁇ Difference between MCI and AD by multi-marker using logistic regression analysis>
- Principle of logistic regression analysis In this method, the coefficient of each parameter corresponding to the biomarker is obtained from the data set, and the determination probability for each patient in two disease categories (normal, disease) can be given.
- a relatively polite explanation about logistic regression can be obtained from the following (Non-Patent Document 3: Czepiel, SA, http://czep.net/stat/mlelr.pdf, 2010, Maximum likelihood estimation of logistic regression models: theory and implementation .).
- This commentary includes analysis by Newton-Raphson method. The principle of this analysis method is as follows. When the occurrence probability of an event is P,
- Non-Patent Document 4 Bowling, SR, et al. JIEM, 2009, 2: 114-127, A logistic approximation to the cumulative normal distribution.).
- Logistic regression uses this approximation to perform statistical analysis.
- equation (2) A large number of data is applied to equations (1) and (2) to determine a coefficient ⁇ i and its significance (that ⁇ i is not zero) is determined from the statistical p-value. There are the following two methods for finalizing equation (2). (I) Method based on the statistical significance of coefficients If a non-significant coefficient is found, formula (2) is created by excluding this coefficient, and the same fitting is repeated. Thus, when all the coefficients of the equation (2) become significant, the measured value of x i is substituted and the Z value is obtained from (2). Next, the value of P (determination probability) can be obtained from equation (1). Note that the standard error of the coefficient ⁇ i can be calculated.
- the correct answer rate is the rate that is correctly determined to belong to the group that originally belongs, but with this method, all of the coefficients that do not have statistical significance are recognized.
- the combination of coefficients that gives the maximum correct answer rate by trial and error is calculated.
- the determination probability is obtained in the same manner as (I).
- the correct answer rate of logistic regression is defined by the following formula (3). Discrimination is performed by estimating which one of the two categories (for example, NDC and MCI) of the subject belongs to the logistic regression equation. If the category of the subject is i (for example, MCI) and the judgment probability obtained from the logistic regression equation is 0.5 or more, it is considered that i was correctly diagnosed. The total number of subjects the N i of the category i, the number of subjects who have been diagnosed with properly i as C i,
- the odds ratio for variable x i in logistic regression is a value obtained by dividing the odds in the original odds case of increasing by one unit the x i, which is equal to exp ( ⁇ i).
- Table 5 shows the combinations of marker proteins that obtain the results with the highest accuracy among the combinations No. 1, 3, and 5 in Table 3 and the coefficients of the logistic regression equation (Coefficient).
- the combination marker protein that yields the result with the highest correct answer rate is Complement C3 (C3) and Apolipoprotein A1 po (ApoA1). Met.
- the correct answer rate to distinguish NCI from MCI from MCI was 89.74%, and the correct answer rate of NDC was 50%.
- Table 6 shows the combinations of marker proteins and the logistic regression equation coefficients (Coefficient) that give the highest result among the combinations No. 1, 2, and 3 in Table 4.
- the combination of marker proteins that yields the highest correct answer rate is Complement C3 (C3) and Transthyretin (TTR). there were.
- C3 Complement C3
- TTR Transthyretin
- the accuracy of detection of cognitive dysfunction diseases including mild cognitive impairment and Alzheimer's disease can be improved, and can be applied to applications in the diagnostic field including diagnostic agents.
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Abstract
認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー及びバイオマーカーを用いる認知機能障害疾患を検出するための方法を提供すること。 生体試料中の、次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）から選択される１種又は２種以上の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを同時又は別々に測定する認知機能障害疾患の検出方法。 （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー （ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー （ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
Description
本発明は、軽度認知障害およびアルツハイマー病を含む認知機能障害疾患の検出に用い得る新規なタンパク質およびペプチドであるバイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いる認知機能障害疾患の検出方法に関する。
生体の正常と正常以外の状態を呈する試料を用いてその差異を判別する手段としては、一般的には体外診断薬において用いられてきた技術が主たる従来技術である。
体外診断薬のうち最も多いのが、血液中の成分をバイオマーカーとして分析することで診断検査を行うものである。
本分野における従来技術では、血液中の単独の特定のタンパク質若しくは分子量１万以下のいわゆるオリゴペプチドの存在量の測定、又は酵素タンパク質の場合は活性の測定を行って、正常(健常人)試料と疾患試料との明らかな差をもって診断の一助としてきた。
すなわち、あらかじめ一定数の健常人と疾患患者由来の生体試料における単独若しくは複数の特定のタンパク質若しくは特定のオリゴペプチドの量又はこれらの活性量を計測し、異常値と正常値の範囲を決める。次いで、評価する生体試料を同様の方法で測定し、測定結果がこの決まった異常値と正常値のどちらの範囲に属するかによって検査評価を行うものである。
体外診断薬のうち最も多いのが、血液中の成分をバイオマーカーとして分析することで診断検査を行うものである。
本分野における従来技術では、血液中の単独の特定のタンパク質若しくは分子量１万以下のいわゆるオリゴペプチドの存在量の測定、又は酵素タンパク質の場合は活性の測定を行って、正常(健常人)試料と疾患試料との明らかな差をもって診断の一助としてきた。
すなわち、あらかじめ一定数の健常人と疾患患者由来の生体試料における単独若しくは複数の特定のタンパク質若しくは特定のオリゴペプチドの量又はこれらの活性量を計測し、異常値と正常値の範囲を決める。次いで、評価する生体試料を同様の方法で測定し、測定結果がこの決まった異常値と正常値のどちらの範囲に属するかによって検査評価を行うものである。
具体的な計測方法としては、試料をそのまま、又はあらかじめ希釈しておき、単独又は複数の特定のタンパク質若しくはペプチドの量を、基質と反応させると発色する酵素によって標識された特異的１次抗体若しくは２次抗体を用いて、試料の発色量で計測する酵素結合免疫吸着測定法(ELISA; Enzyme Linked Immmunosorbent Assay)や化学発光測定法(CLIA; ChemiLuminescent Immunoassay)などがある。また、当該特定のタンパク質若しくはペプチドの量を、１次抗体又は２次抗体に結合させたラジオアイソトープを用いて、計測する放射性免疫測定法(RIA; RadioImmunoassay)、タンパク質が酵素の場合は直接基質を与えて産生物を発色などで計測する酵素活性測定法などがある。
また、酵素の基質分解産物を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析する方法もある。また、HPLCと質量分析装置を組み合わせたLC-MS/MS法ならびにこれを用いたselected reaction monitoring (SRM)/multiple reaction monitoring (MRM)法もある。
また、試料に適当な前処理を施した後、２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(2D-PAGE)を行ってタンパク質又はペプチドを分離した後、目的のタンパク質又はペプチドについて、銀染色、クマシーブルー染色、あるいは対応する抗体を用いた免疫染色(ウエスタン・ブロッティング)を行って、試料中の濃度を測定する方法もある。
また、生体試料をカラムクロマトグラフィーによって分画し、その画分に含まれるタンパク質とペプチドを質量分析によって分析する手法がある。
また、カラムクロマトグラフィーではなく、前処理としてプロテインチップを用いて質量分析する方法や、前処理として磁気ビーズを用いて質量分析する方法がある。
また、試料に適当な前処理を施した後、２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(2D-PAGE)を行ってタンパク質又はペプチドを分離した後、目的のタンパク質又はペプチドについて、銀染色、クマシーブルー染色、あるいは対応する抗体を用いた免疫染色(ウエスタン・ブロッティング)を行って、試料中の濃度を測定する方法もある。
また、生体試料をカラムクロマトグラフィーによって分画し、その画分に含まれるタンパク質とペプチドを質量分析によって分析する手法がある。
また、カラムクロマトグラフィーではなく、前処理としてプロテインチップを用いて質量分析する方法や、前処理として磁気ビーズを用いて質量分析する方法がある。
さらに、本発明者は、ビーズ(磁気ビーズを含む)に対象となるタンパク質又はペプチドに対する抗体を結合させ、これにより測定したいタンパク質又はペプチドを捕捉したのち、ビーズから溶出して質量分析により測定するimmunoMS法を開発している。
また、インタクトなタンパク質の解析を目的としてトリプシンなどで分解した後、上記の方法で質量分析まで行う方法も報告されている（特許文献１参照）。
しかし、いずれもインタクトなタンパク質の性質を利用して、そのまま分画し、又は特異的に吸着するタンパク質分子を選別して質量分析で解析するものである。
また、インタクトなタンパク質の解析を目的としてトリプシンなどで分解した後、上記の方法で質量分析まで行う方法も報告されている（特許文献１参照）。
しかし、いずれもインタクトなタンパク質の性質を利用して、そのまま分画し、又は特異的に吸着するタンパク質分子を選別して質量分析で解析するものである。
アルツハイマー病を主とする認知機能障害疾患は、我が国においても近年の高齢化に伴って急激に増加している。1995年に約130万人であったが、2010年には約280万人となり、2020年には約410万人に達すると予想されている。アルツハイマー病は認知機能障害疾患の60～90%を占めると言われている。本疾患は患者の記憶を喪失させるのみでなく人格をも崩壊して患者の社会生活機能を喪失させてしまうことから、社会問題化しつつある。
本邦においては1999年末に抗アセチルコリンエステラーゼ阻害薬である塩酸Donepezilが認可を受け、早期に投与されれば高い確率で認知機能の低下を「遅らせる」ことができるようになった。アルツハイマー病においては、現状の治療法やこれから開発される治療薬効果をあげるためには早期に診断することが最重要の課題となっている。
本邦においては1999年末に抗アセチルコリンエステラーゼ阻害薬である塩酸Donepezilが認可を受け、早期に投与されれば高い確率で認知機能の低下を「遅らせる」ことができるようになった。アルツハイマー病においては、現状の治療法やこれから開発される治療薬効果をあげるためには早期に診断することが最重要の課題となっている。
米国精神医学会によるアルツハイマー病の主たる診断基準(DSM IV)を以下に示す。
A．多彩な認知欠損の発現で、以下の両方により明らかにされる。
(1)記憶障害(新しい情報を学習したり、以前に学習した情報を想起する能力の障害)
(2)以下の認知障害の一つ又はそれ以上
a)失語(言語の障害)
b)失行(運動機能の障害がないにもかかわらず、動作を行う能力の障害)
c)失認(感覚機能の障害がないにもかかわらず、対象を認識又は同定する能力の障害)
d)実行能力(計画を立てる・組織化する・順序だてる・抽象化する)の障害
B．基準A(1)およびA(2)の認知欠損は、その各々が社会的又は職業的機能の著しい障害を引き起こし、病前の機能水準から著しい低下を示す(非特許文献１)。
A．多彩な認知欠損の発現で、以下の両方により明らかにされる。
(1)記憶障害(新しい情報を学習したり、以前に学習した情報を想起する能力の障害)
(2)以下の認知障害の一つ又はそれ以上
a)失語(言語の障害)
b)失行(運動機能の障害がないにもかかわらず、動作を行う能力の障害)
c)失認(感覚機能の障害がないにもかかわらず、対象を認識又は同定する能力の障害)
d)実行能力(計画を立てる・組織化する・順序だてる・抽象化する)の障害
B．基準A(1)およびA(2)の認知欠損は、その各々が社会的又は職業的機能の著しい障害を引き起こし、病前の機能水準から著しい低下を示す(非特許文献１)。
アルツハイマー病(Alzheimer disease)(AD)の関連疾患にはいろいろなものがある。ADなどの認知症は徐々に認知機能の低下が出現するため、認知症の前駆状態と呼ぶべき状態が存在する。このような状態を軽度認知障害(mild cognitive impairment)(MCI)と呼んでいる。米国のデータでは物忘れ外来を受診したMCIのうち、1年に10-15％、4年間でおよそ50％がADに移行するという。ADの前駆状態の大部分は健忘型MCIに含まれる。
現在の定義によると、MCIは認知機能の低下に関する訴えが聞かれるが、基本的な日常生活には支障がない状態とされる。前頭側頭型認知症(FTD)は認知機能低下とともに周囲を気にせずわが道を行く行動が特徴的で、周囲に合わせようとするADと対照的である。FTDには大脳皮質に組織学的にPick球の存在を認めるPick病が含まれる。
レビー小体型認知症(DLB)は、記憶障害が進行性であり幻視などの視覚認知障害があることを特徴としている。臨床症状からの診断では認知症の10～30％がDLBであり、老年期の変性性認知症疾患ではアルツハイマー型認知症(AD)に次いで2番目に多いとされる。組織学的には大脳におけるレビー小体の存在を特徴とする。FTD及びDLBは認知症を認め痴呆型であるので痴呆型神経疾患とも呼ばれる(非特許文献１)。
現在の定義によると、MCIは認知機能の低下に関する訴えが聞かれるが、基本的な日常生活には支障がない状態とされる。前頭側頭型認知症(FTD)は認知機能低下とともに周囲を気にせずわが道を行く行動が特徴的で、周囲に合わせようとするADと対照的である。FTDには大脳皮質に組織学的にPick球の存在を認めるPick病が含まれる。
レビー小体型認知症(DLB)は、記憶障害が進行性であり幻視などの視覚認知障害があることを特徴としている。臨床症状からの診断では認知症の10～30％がDLBであり、老年期の変性性認知症疾患ではアルツハイマー型認知症(AD)に次いで2番目に多いとされる。組織学的には大脳におけるレビー小体の存在を特徴とする。FTD及びDLBは認知症を認め痴呆型であるので痴呆型神経疾患とも呼ばれる(非特許文献１)。
認知症の診断に広く用いられている検査は、改訂長谷川式知能評価スケール(HDS-R)とMMSE (Mini-Mental State Examination)で、被験者への問診を行い、その結果から判断するものである。HDSは1991年に改訂されてHDS-Rと称されるようになった。
これは９項目の質問からなり、見当識、記銘力、計算能力、記憶・想起および常識をテストするものである。30点満点で23点以下を認知症の疑いありとする。また、MMSEは痴呆の診断のために米国で考案されたもので、見当識、記憶力、計算力、言語的能力、図形的能力などをカバーする。30点満点で11の質問からなり、HDS-Rと同様に23点以下で認知症の疑いありとする。両テストの結果は割合によく一致するとされている。これらの問診法はあくまでスクリーニングの目的で用いられ、確定診断に至ることはないし、HDS-R、MMSEともに重症度分類に用いられることはない(非特許文献１)。
これは９項目の質問からなり、見当識、記銘力、計算能力、記憶・想起および常識をテストするものである。30点満点で23点以下を認知症の疑いありとする。また、MMSEは痴呆の診断のために米国で考案されたもので、見当識、記憶力、計算力、言語的能力、図形的能力などをカバーする。30点満点で11の質問からなり、HDS-Rと同様に23点以下で認知症の疑いありとする。両テストの結果は割合によく一致するとされている。これらの問診法はあくまでスクリーニングの目的で用いられ、確定診断に至ることはないし、HDS-R、MMSEともに重症度分類に用いられることはない(非特許文献１)。
画像診断法としては、脳萎縮・脳溝脳室拡大など、脳の形態的異常を見るCT・MRIと脳血流量を見る脳血流シンチグラフィ(SPECT)および酸素消費量・ブドウ糖消費量を見るポジトロン断層法(PET)がある。SPECTおよびPETは核医学的方法で、形態的異常の起きる前に異常を検出することができるとされている(非特許文献１)。しかし、これらの画像診断は特殊な設備を必要とするため、すべての医療機関で実施することができないという欠点を有する。また画像を見る医師によって判断が異なることがあり、客観性に欠ける。
このようにADを含む認知症の診断は、客観性を欠く、かつ高価な装置の使用を前提とした方法に依存しているのが現状であり、疾患発見のためのスクリーニングは不可能である。ここに血液(血清、血漿を含む)のような容易に得られる患者の試料を用いて客観的診断を可能にするバイオマーカーが見出されるならば、スクリーニングを行うことによって、現在最重要の課題となっている認知機能障害疾患の早期発見が可能となる。
特許文献１には、同一担癌哺乳動物に由来する複数の血清サンプルに含まれるアポリポタンパク質A-IIの定量値を前記サンプル間で相互比較することを特徴とする、前記担癌哺乳動物血清中のアポリポタンパク質A-II量の変化を検出する方法が開示されている。
特許文献２には、当該文献２記載の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるフィブリノーゲンα鎖等からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質又はペプチドからなる肝がん検出のための肝がんバイオマーカーが開示されている。
特許文献３－５には、認知機能障害疾患診断のためのバイオマーカーが開示されている。特許文献５には、当該文献５記載の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3、当該文献５記載の配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるTransthyretin等から選択される少なくとも１つのタンパク質若しくはペプチド、又は当該タンパク質若しくはペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片からなる、認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーが開示されている。
特許文献２には、当該文献２記載の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるフィブリノーゲンα鎖等からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質又はペプチドからなる肝がん検出のための肝がんバイオマーカーが開示されている。
特許文献３－５には、認知機能障害疾患診断のためのバイオマーカーが開示されている。特許文献５には、当該文献５記載の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3、当該文献５記載の配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるTransthyretin等から選択される少なくとも１つのタンパク質若しくはペプチド、又は当該タンパク質若しくはペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片からなる、認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーが開示されている。
中野今治、水澤英洋編集：よくわかるアルツハイマー病、2004、永井書店
N. Benkiraneら、J. Biol. Chem. Vol. 268, 26279-26285, 1993.
Czepiel, SA, http://czep.net/stat/mlelr.pdf, 2010, Maximum likelihood estimation of logistic regression models: theory and implementation.
Bowling, SR, et al. JIEM, 2009, 2: 114-127, A logistic approximation to the cumulative normal distribution.
本技術は、バイオマーカー及び該バイオマーカーを用いた認知機能障害疾患の検出方法を提供することを目的とする。
本発明者は、非認知機能障害被験者及び認知機能障害疾患患者における、存在の有無及び存在量が異なるタンパク質及びその部分ペプチドを探索した。
そして、本発明者は、鋭意検討を行った結果、認知機能障害疾患を検出することができる３種のポリペプチドを血清中に見出した。当該３種のポリペプチドは、（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein A1由来のペプチド、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるTransthyretin由来のペプチド及び（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3由来のペプチドであった。
さらに、本発明者は、認知機能障害疾患の検出の際に正答率の高いバイオマイカーの組み合わせについてロジスティック回帰分析で解析した。この結果、このうちの前記（ｃ）Complement C3由来のペプチドと、前記（ｂ）Transthyretin由来のペプチド又は前記（ａ）Apolipoprotein A1由来のペプチドとの２種のペプチドを組み合わせて用いることで、認知機能障害疾患（特に軽度認知機能障害及びアルツハイマー病）の検出精度を高めることができることを見出した。
そして、本発明者は、鋭意検討を行った結果、認知機能障害疾患を検出することができる３種のポリペプチドを血清中に見出した。当該３種のポリペプチドは、（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein A1由来のペプチド、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるTransthyretin由来のペプチド及び（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3由来のペプチドであった。
さらに、本発明者は、認知機能障害疾患の検出の際に正答率の高いバイオマイカーの組み合わせについてロジスティック回帰分析で解析した。この結果、このうちの前記（ｃ）Complement C3由来のペプチドと、前記（ｂ）Transthyretin由来のペプチド又は前記（ａ）Apolipoprotein A1由来のペプチドとの２種のペプチドを組み合わせて用いることで、認知機能障害疾患（特に軽度認知機能障害及びアルツハイマー病）の検出精度を高めることができることを見出した。
本技術において、非認知機能障害被験者（NDC）は、健常人を含み、何らかの疾患に羅患してもよいが認知機能障害疾患には羅患していない被験者（non-demented control）を意味するものである。
また、本技術において、認知機能障害疾患と総称するとき、軽度認知機能障害（MCI）、アルツハイマー病（AD）及び痴呆型神経疾患を含むものとする。本技術において、軽度認知機能障害（MCI）、アルツハイマー病（AD）が好適に検出することができる。
本技術において見出された当該ペプチドは血清中のみならず、血液、血清、血漿、脳髄膜液、尿等の他の生体試料中に検出される場合もバイオマーカーとして意義をもつものである。同時に、これらペプチドの起源であるタンパク質（以下、「インタクトなタンパク質」と称する）又はペプチドも、バイオマーカーとしての意義を持つ。
また、本技術において、認知機能障害疾患と総称するとき、軽度認知機能障害（MCI）、アルツハイマー病（AD）及び痴呆型神経疾患を含むものとする。本技術において、軽度認知機能障害（MCI）、アルツハイマー病（AD）が好適に検出することができる。
本技術において見出された当該ペプチドは血清中のみならず、血液、血清、血漿、脳髄膜液、尿等の他の生体試料中に検出される場合もバイオマーカーとして意義をもつものである。同時に、これらペプチドの起源であるタンパク質（以下、「インタクトなタンパク質」と称する）又はペプチドも、バイオマーカーとしての意義を持つ。
すなわち、本技術は、次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）から選択される１種又は２種以上の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを提供するものである。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
本技術は、生体試料中の、上述の（ａ）バイオマーカー、（ｂ）バイオマーカー及び（ｃ）バイオマーカーから選択される１種又は２種以上の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを同時又は別々に測定する認知機能障害疾患の検出方法を提供するものである。
本技術は、上述の（ａ）バイオマーカー、（ｂ）バイオマーカー及び（ｃ）バイオマーカーから選択される１種又は２種以上の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを測定するための認知機能障害疾患の検出キットを提供するものである。
本技術は、被験者の生体試料中の認知機能障害疾患の２種以上のバイオマーカーをそれぞれ測定すること、 前記２種以上のバイオマーカーのそれぞれの測定結果をロジスティック回帰分析で解析すること、 前記解析結果に基づき認知機能障害疾患の正答率の高いバイオマーカーの組み合わせを選定すること、 を含む、正答率が高い複数の認知機能障害疾患検定用バイオマーカーの組み合わせ選定方法を提供するものである。
本技術により、バイオマーカー及び該バイオマーカーを用いた認知機能障害疾患の検出方法を提供することができる。
本技術において、次の（ａ）～（ｃ）記載のインタクトなタンパク質及び／又はこの部分ペプチドから選択される１種以上のバイオマーカーを、認知機能障害疾患を検出するために用い得る。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
本技術は、被験者が認知機能障害疾患に羅患しているときに、生体試料中の、前記（ａ）～（ｃ）記載のうちの少なくとも１つのインタクトなタンパク質及び／又はその部分ペプチドの種類及び量をそれぞれ検出することができる。
さらに、本技術は、生体試料中の前記（ａ）～（ｃ）記載のうちの少なくとも１つ又は２つ以上のインタクトなタンパク質とその部分ペプチドを検出すると同時に、これらの種類と量の変動を測定することにより、被験者が認知機能障害疾患に羅患しているかどうかをより精度よく診断することができる。
本技術は、生体試料中の前記（ａ）～（ｃ）のバイオマーカーから選ばれる１種又は２種以上を測定することで、精度及び特異性の両方が極めて高い診断等のシステムを提供することができる。これによって、認知機能障害疾患に対して精度の高い診断等を行うことができる。さらに、本技術のバイオマーカーは、薬剤効果判定においても有用性が高い。
また、本技術は、前記（ａ）～（ｃ）の各バイオマーカーの量を計測することにより、被験者の生体試料中の前記（ａ）～（ｃ）のインタクトなタンパク質及び／又はその部分ペプチドの出現又は増加する場合には、当該被験者は軽度の認知障害又はアルツハイマー病を含む認知機能障害疾患に羅患していると、検出、評価、判別、診断又は検査等を行うことができる。また、本技術は、さらに非認知機能障害被験者の生体試料と比較することにより、被験者が認知機能障害疾患に羅患しているかどうかをより精度よく診断等を行うことができる。
さらに、本技術は、生体試料中の前記（ａ）～（ｃ）記載のうちの少なくとも１つ又は２つ以上のインタクトなタンパク質とその部分ペプチドを検出すると同時に、これらの種類と量の変動を測定することにより、被験者が認知機能障害疾患に羅患しているかどうかをより精度よく診断することができる。
本技術は、生体試料中の前記（ａ）～（ｃ）のバイオマーカーから選ばれる１種又は２種以上を測定することで、精度及び特異性の両方が極めて高い診断等のシステムを提供することができる。これによって、認知機能障害疾患に対して精度の高い診断等を行うことができる。さらに、本技術のバイオマーカーは、薬剤効果判定においても有用性が高い。
また、本技術は、前記（ａ）～（ｃ）の各バイオマーカーの量を計測することにより、被験者の生体試料中の前記（ａ）～（ｃ）のインタクトなタンパク質及び／又はその部分ペプチドの出現又は増加する場合には、当該被験者は軽度の認知障害又はアルツハイマー病を含む認知機能障害疾患に羅患していると、検出、評価、判別、診断又は検査等を行うことができる。また、本技術は、さらに非認知機能障害被験者の生体試料と比較することにより、被験者が認知機能障害疾患に羅患しているかどうかをより精度よく診断等を行うことができる。
好ましくは、前記（ａ）～（ｃ）のバイオマーカーを２種又は３種以上組み合わせて認知機能障害疾患を検出することが、認知機能障害疾患の検出精度が向上するので、好適である。複数のバイオマーカーを検出した場合には、認知機能障害疾患であると精度よく検出又は診断することができる。
より好ましくは、前記（ｃ）バイオマーカー(C3)と、前記（ａ）バイオマーカー(ApoA1)又は前記（ｂ）バイオマーカー(TTR)との２種を測定するのが、認知機能障害疾患（MCI及びAD）の検出精度が向上するので、好適である。この２つのバイオマーカーを検出した場合には、、認知機能障害疾患（MCI及びAD）
さらに検出精度が向上するので、前記認知機能障害疾患の検出が軽度認知障害の検出である場合、前記（ｃ）バイオマーカー(C3)及び前記（ａ）バイオマーカー(ApoA1)の２種を測定するか、又は、前記認知機能障害疾患の検出がアルツハイマー病の検出である場合、前記（ｃ）バイオマーカー(C3)及び前記（ｂ）バイオマーカー(TTR)の２種を測定するのが、より好適である。
より好ましくは、前記（ｃ）バイオマーカー(C3)と、前記（ａ）バイオマーカー(ApoA1)又は前記（ｂ）バイオマーカー(TTR)との２種を測定するのが、認知機能障害疾患（MCI及びAD）の検出精度が向上するので、好適である。この２つのバイオマーカーを検出した場合には、、認知機能障害疾患（MCI及びAD）
さらに検出精度が向上するので、前記認知機能障害疾患の検出が軽度認知障害の検出である場合、前記（ｃ）バイオマーカー(C3)及び前記（ａ）バイオマーカー(ApoA1)の２種を測定するか、又は、前記認知機能障害疾患の検出がアルツハイマー病の検出である場合、前記（ｃ）バイオマーカー(C3)及び前記（ｂ）バイオマーカー(TTR)の２種を測定するのが、より好適である。
ここで、本技術の「インタクトなタンパク質の部分ペプチド」の「ペプチド」には、「ポリペプチド」と「オリゴペプチド」が含まれる意味である。
当該「オリゴペプチド」は一般的には分子量１万以下のアミノ酸が結合したものをいい、又はアミノ酸残基の数として数個～５０個以下程度のものをいう。
当該「ポリペプチド」は、分子量１万以上のアミノ酸が結合したものをいい、又はアミノ酸残基の数として５０個以上程度のものをいう。
本技術において、インタクトなタンパク質の部分ペプチドとは、インタクトなタンパク質が有するアミノ酸配列の一部の部分的アミノ酸配列を有するペプチドをいう。
このインタクトなタンパク質の部分ペプチドは、転写・翻訳による発現合成過程で部分ペプチドとして生成される場合と、インタクトなタンパク質として合成された後に、生体内で消化分解を受けて消化分解産物ペプチドとして生成される場合がある。この原因として、生体が認知機能障害疾患等の正常以外の状態にあるときに、タンパク質の合成及び制御機構が脱制御されることが挙げられる。
本技術は、生体内タンパク質の発現合成及び／又は消化分解を指標として被験者が正常状態であるか認知機能障害疾患に羅患しているかを評価、判別等を行うことができ、また認知機能障害疾患に羅患している場合の進行度をも評価、判別等を行うことができる。
本技術における「認知機能障害疾患の検出」とは、被験者が認知機能障害疾患に羅患しているかどうかの検出であり、この他評価、判別、診断又は検査等であってもよい。また、本技術の認知機能障害疾患の検出は、被験者がより重篤な認知機能障害に羅患するリスクの評価等も含み得る。
当該「オリゴペプチド」は一般的には分子量１万以下のアミノ酸が結合したものをいい、又はアミノ酸残基の数として数個～５０個以下程度のものをいう。
当該「ポリペプチド」は、分子量１万以上のアミノ酸が結合したものをいい、又はアミノ酸残基の数として５０個以上程度のものをいう。
本技術において、インタクトなタンパク質の部分ペプチドとは、インタクトなタンパク質が有するアミノ酸配列の一部の部分的アミノ酸配列を有するペプチドをいう。
このインタクトなタンパク質の部分ペプチドは、転写・翻訳による発現合成過程で部分ペプチドとして生成される場合と、インタクトなタンパク質として合成された後に、生体内で消化分解を受けて消化分解産物ペプチドとして生成される場合がある。この原因として、生体が認知機能障害疾患等の正常以外の状態にあるときに、タンパク質の合成及び制御機構が脱制御されることが挙げられる。
本技術は、生体内タンパク質の発現合成及び／又は消化分解を指標として被験者が正常状態であるか認知機能障害疾患に羅患しているかを評価、判別等を行うことができ、また認知機能障害疾患に羅患している場合の進行度をも評価、判別等を行うことができる。
本技術における「認知機能障害疾患の検出」とは、被験者が認知機能障害疾患に羅患しているかどうかの検出であり、この他評価、判別、診断又は検査等であってもよい。また、本技術の認知機能障害疾患の検出は、被験者がより重篤な認知機能障害に羅患するリスクの評価等も含み得る。
本技術において、認知機能障害疾患検出のためのバイオマーカーとして用い得るインタクトなタンパク質として、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretin、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3が挙げられる。
また、これらインタクトなタンパク質の部分ペプチドも、認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーとして用い得る。
本技術における「インタクトなタンパク質の部分ペプチド」には、インタクトなタンパク質及びその合成・分解過程で生成されるペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片も含む意味である。
また、これらインタクトなタンパク質の部分ペプチドも、認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーとして用い得る。
本技術における「インタクトなタンパク質の部分ペプチド」には、インタクトなタンパク質及びその合成・分解過程で生成されるペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片も含む意味である。
また、認知機能障害疾患検出のためのバイオマーカーとして用い得るインタクトなタンパク質の部分ペプチドとして、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（好適にはApolipoprotein A1由来ポリペプチド）、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（好適にはTransthyretin由来ポリペプチド）、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Complement C3由来ポリペプチド）が挙げられる。
本技術は、前記（ａ）～（ｃ）に記載のタンパク質及びこの部分ペプチドの各アミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加したアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチドをバイオマーカーとして用いることができる。
ここで、「１個又は数個」とは、「１～３個」、「１又は２個」、「１個」をいう。
本技術においてバイオマーカーに用いる部分ペプチドは、配列番号１～３で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質若しくはペプチド、及びこれらから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片も含む意味である。
本技術は、前記（ａ）～（ｃ）に記載のタンパク質及びこの部分ペプチドの各アミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加したアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチドをバイオマーカーとして用いることができる。
ここで、「１個又は数個」とは、「１～３個」、「１又は２個」、「１個」をいう。
本技術においてバイオマーカーに用いる部分ペプチドは、配列番号１～３で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質若しくはペプチド、及びこれらから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片も含む意味である。
なお、本技術における「アミノ酸残基５個以上のペプチド断片」において「アミノ酸残基５個以上」とした理由は、非特許文献２の記載による。当該非特許文献２は、ヒストンH3のC端(130～135)のアミノ酸残基配列IRGERAについてRをKに置換したペプチドおよびIRを欠失させ、代わりにCGGをGERAに結合させたペプチドCGGGERAがペプチドIRGERAを免疫原として得た抗体によって認識されたとの報告である。これは、抗原性の認識が４個以上のアミノ酸残基からなるペプチドによってなされることを示している。
本技術では、ヒストンH3のC端以外にも一般性を持たせるために、残基数を１つ増やして、５個以上としたが、このような低分子のペプチドをも対象とすることは、イムノ・ブロット法、ELISA法、immunoMS法などのような免疫学的手法を用いて検出及び分別する方法を用いるときに重要である。
本技術では、ヒストンH3のC端以外にも一般性を持たせるために、残基数を１つ増やして、５個以上としたが、このような低分子のペプチドをも対象とすることは、イムノ・ブロット法、ELISA法、immunoMS法などのような免疫学的手法を用いて検出及び分別する方法を用いるときに重要である。
なお、インタクトなタンパク質又はその部分ペプチドに糖鎖が付加されることがある。これらの糖鎖が付加したタンパク質及び部分ペプチドも認知機能障害疾患検出のためのバイオマーカーとして用い得る。
なお、本技術において、バイオマーカーを定量してもよいし、定性により存在若しくは非存在を決定してもよい。このとき、バイオマーカー濃度が所定の測定値以上であった場合又は非認知機能疾患患者群の標準値以上であった場合には、認知機能障害疾患であると検出、診断等を行うことができる。また、バイオマーカー定性により、陽性－陰性と検出、診断等を行うことができ、例えば、バイオマーカーと反応し発色等を示したときは、陽性とする。
本技術で血清等の生体試料中のバイオマーカーを分離する方法としては、２次元電気泳動又は２次元クロマトグラフィー(2D-LC)を用い得る。２次元クロマトグラフィーに用いるクロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の公知のクロマトグラフィーから選択すればよい。
また、本技術でバイオマーカーを分離する方法として、クロマトグラフィー(LC)と三連四重極質量分析を組み合わせたLC-MSを用いたSRM/MRM法で定量することもできる。この時用いるLCは1次元のLCでもよい。
さらに、本技術でバイオマーカーを分離する方法として、本発明者が開発したビーズ（磁気ビーズを含む）に対象となるタンパク質またはペプチドに対する抗体を結合させ、これにより測定したいタンパク質又はペプチドを捕捉したのち、ビーズから溶出して質量分析により測定するimmunoMS法（特許文献１参照）を用いれば、２次元電気泳動又はクロマトグラフィーを用いることなく、簡便に目的のタンパク質、タンパク質断片、ペプチドの有無あるいは量を評価することができる。
また、本技術でバイオマーカーを分離する方法として、クロマトグラフィー(LC)と三連四重極質量分析を組み合わせたLC-MSを用いたSRM/MRM法で定量することもできる。この時用いるLCは1次元のLCでもよい。
さらに、本技術でバイオマーカーを分離する方法として、本発明者が開発したビーズ（磁気ビーズを含む）に対象となるタンパク質またはペプチドに対する抗体を結合させ、これにより測定したいタンパク質又はペプチドを捕捉したのち、ビーズから溶出して質量分析により測定するimmunoMS法（特許文献１参照）を用いれば、２次元電気泳動又はクロマトグラフィーを用いることなく、簡便に目的のタンパク質、タンパク質断片、ペプチドの有無あるいは量を評価することができる。
生体試料中の１種又は２種以上のタンパク質の種類及び量は、種々の方法で、同時又は別々に測定することができる。対象となるタンパク質（タンパク質断片及びその部分ペプチドを含む）が特定されていて、それに対する抗体（１次抗体）が得られている場合は、以下の方法を用いることができる。
本技術は、イムノ・ブロット法；ウェスタン・ブロット法；酵素若しくは蛍光若しくは放射性物質標識法；質量分析法；immunoMS法；表面プラズモン共鳴法の何れか１つ以上の方法により測定することが好適である。
また、本技術のバイオマーカーは、種類や量が異なる場合でも、同時又は別々に測定することが可能である。
本技術は、これらタンパク質やペプチド又はペプチド断片を、２次元クロマトグラフィーと質量分析を組み合わせた2D-LC-MALDI-TOF-MS法、SRM/MRM法、immunoMS法を用いることにより、一度に多数のタンパク質又はそれら部分ペプチドを測定することがより好適である。
ここで、本技術において、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA; Enzyme Linked Immmunosorbent Assay)、化学発光測定法(CLIA; ChemiLuminescent Immunoassay)、放射性免疫測定法(RIA; RadioImmunoassay)、酵素活性測定法等を用いる方法を酵素若しくは蛍光若しくは放射性物質の標識法」という。抗体を用いるこれらの方法を「酵素若しくは蛍光若しくは放射性物質標識抗体法」という。
本技術は、イムノ・ブロット法；ウェスタン・ブロット法；酵素若しくは蛍光若しくは放射性物質標識法；質量分析法；immunoMS法；表面プラズモン共鳴法の何れか１つ以上の方法により測定することが好適である。
また、本技術のバイオマーカーは、種類や量が異なる場合でも、同時又は別々に測定することが可能である。
本技術は、これらタンパク質やペプチド又はペプチド断片を、２次元クロマトグラフィーと質量分析を組み合わせた2D-LC-MALDI-TOF-MS法、SRM/MRM法、immunoMS法を用いることにより、一度に多数のタンパク質又はそれら部分ペプチドを測定することがより好適である。
ここで、本技術において、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA; Enzyme Linked Immmunosorbent Assay)、化学発光測定法(CLIA; ChemiLuminescent Immunoassay)、放射性免疫測定法(RIA; RadioImmunoassay)、酵素活性測定法等を用いる方法を酵素若しくは蛍光若しくは放射性物質の標識法」という。抗体を用いるこれらの方法を「酵素若しくは蛍光若しくは放射性物質標識抗体法」という。
１．イムノ・ブロット法
最も単純な方法である。数段階に希釈した被験血清を用意し、その一定量（１マイクロリットル前後）をニトロセルローズ・メンブレンなどの適当なメンブレンに滴下し、風乾する。BSAなどのタンパク質を含むブロッキング溶液で処理した後、洗浄し、１次抗体を反応させ、洗浄後１次抗体を検出するための標識された２次抗体を反応させる。メンブレンを洗浄後、標識を可視化して濃度を測定する。
最も単純な方法である。数段階に希釈した被験血清を用意し、その一定量（１マイクロリットル前後）をニトロセルローズ・メンブレンなどの適当なメンブレンに滴下し、風乾する。BSAなどのタンパク質を含むブロッキング溶液で処理した後、洗浄し、１次抗体を反応させ、洗浄後１次抗体を検出するための標識された２次抗体を反応させる。メンブレンを洗浄後、標識を可視化して濃度を測定する。
２．ウェスタン・ブロット法
等電点又はSDS-PAGEを含む１次元若しくは２次元ゲル電気泳動を行った後で、分離されたタンパク質を一旦、PVDFメンブレンなどの適当なメンブレンに転写し、１次抗体と標識された２次抗体を用いて上述のイムノ・ブロット法と同様に操作して、目的のタンパク質の存在量を測定する。
等電点又はSDS-PAGEを含む１次元若しくは２次元ゲル電気泳動を行った後で、分離されたタンパク質を一旦、PVDFメンブレンなどの適当なメンブレンに転写し、１次抗体と標識された２次抗体を用いて上述のイムノ・ブロット法と同様に操作して、目的のタンパク質の存在量を測定する。
３．ＥＬＩＳＡ法
タンパク質又はその部分ペプチドに対する抗体をあらかじめ特殊な化学修飾をしたマイクロタイタープレート等の担体に結合させ、試料を段階希釈後、抗体を結合させたマイクロタイタープレートにこれを適当量加えてインキュベーションする。その後洗浄し、捕捉されなかったタンパク質及び部分ペプチドを除く。次に、蛍光若しくは化学発光物質又は酵素を結合させた２次抗体を加えインキュベーションする。
検出は、それぞれの基質を加えた後、蛍光若しくは化学発光物質又は酵素反応による可視光を計測することによって評価判定を行う。抗体の代わりにタンパク質又はその部分ペプチドに結合し得る物質を用いてもよい。例えば、アプタマー等を用いることができる。
本技術は、前記（ａ）～（ｃ）に記載のバイオマーカーに対する物質（例えば、抗体又はアプタマー等）を用いることが好適である。
タンパク質又はその部分ペプチドに対する抗体をあらかじめ特殊な化学修飾をしたマイクロタイタープレート等の担体に結合させ、試料を段階希釈後、抗体を結合させたマイクロタイタープレートにこれを適当量加えてインキュベーションする。その後洗浄し、捕捉されなかったタンパク質及び部分ペプチドを除く。次に、蛍光若しくは化学発光物質又は酵素を結合させた２次抗体を加えインキュベーションする。
検出は、それぞれの基質を加えた後、蛍光若しくは化学発光物質又は酵素反応による可視光を計測することによって評価判定を行う。抗体の代わりにタンパク質又はその部分ペプチドに結合し得る物質を用いてもよい。例えば、アプタマー等を用いることができる。
本技術は、前記（ａ）～（ｃ）に記載のバイオマーカーに対する物質（例えば、抗体又はアプタマー等）を用いることが好適である。
さらに以下に方法（特許文献２参照）を例示するが、それらには限定されない。
４．マイクロアレイ（マイクロチップ）を用いた方法
マイクロアレイとは、担体（基板）上に測定しようとする物質に結合し得る物質を整列（アレイ）固定化させたデバイスを総称していう。本技術の場合、タンパク質又は部分ペプチドに対する抗体又はアプタマーを整列固定化させて用いればよい。
測定は、固相化した抗体等に、生体試料を添加し、マイクロアレイ上に測定しようとするタンパク質又は部分ペプチドを結合させ、次に蛍光若しくは化学発光の物質又は酵素を結合させた２次抗体を加えインキュベーションする。検出はそれぞれの基質を加えた後、蛍光もしくは化学発光物質または酵素反応による可視光を計測すればよい。
４．マイクロアレイ（マイクロチップ）を用いた方法
マイクロアレイとは、担体（基板）上に測定しようとする物質に結合し得る物質を整列（アレイ）固定化させたデバイスを総称していう。本技術の場合、タンパク質又は部分ペプチドに対する抗体又はアプタマーを整列固定化させて用いればよい。
測定は、固相化した抗体等に、生体試料を添加し、マイクロアレイ上に測定しようとするタンパク質又は部分ペプチドを結合させ、次に蛍光若しくは化学発光の物質又は酵素を結合させた２次抗体を加えインキュベーションする。検出はそれぞれの基質を加えた後、蛍光もしくは化学発光物質または酵素反応による可視光を計測すればよい。
５．質量分析法
質量分析法においては、例えば、特定のタンパク質又はその部分ペプチドに対する抗体をあらかじめ特殊な化学修飾をしたマイクロビーズ若しくは基板（プロテインチップ）に結合させる。マイクロビーズは磁気ビーズであってもよい。基板の素材は問わない。
使用する抗体は（１）特定のタンパク質の完全長のみを認識する抗体、（２）部分ペプチドのみを認識する抗体、（３）特定のタンパク質とその部分ペプチドの両方を認識する抗体のすべて、又は上記（１）と（２）、（１）と（３）、若しくは（２）と（３）の組み合わせでもよい。
試料を、原液又は緩衝液で段階希釈後、抗体を結合させたマイクロビーズ又は基板にこれを適当量加え、インキュベーションする。その後洗浄し、捕捉されなかったタンパク質及び部分ペプチドを除く。その後、マイクロビーズ又は基板上に捕捉されたタンパク質及び部分ペプチドをMALDI-TOF-MS、SELDI-TOF-MSなどを用いた質量分析によって分析し、タンパク質、タンパク質断片及び部分ペプチドのピークの質量数とピーク強度を計測する。適当な内部標準物質をもとの生体試料に一定量加えておき、そのピーク強度を測定して、対象となる物質のピーク強度との比を求めることにより、もとの生体試料中の濃度を知ることができる。この方法をimmunoMS法という。
また、試料を原液または緩衝液で希釈又は一部のタンパク質を除去した後、HPLCで分離、エレクトロスプレーイオン化(ESI)法を用いた質量分析によって定量することができる。その際に、同位体標識した内部標準ペプチドを用いたSRM/MRM法による絶対定量によって資料中の濃度を知ることができる。
質量分析法においては、例えば、特定のタンパク質又はその部分ペプチドに対する抗体をあらかじめ特殊な化学修飾をしたマイクロビーズ若しくは基板（プロテインチップ）に結合させる。マイクロビーズは磁気ビーズであってもよい。基板の素材は問わない。
使用する抗体は（１）特定のタンパク質の完全長のみを認識する抗体、（２）部分ペプチドのみを認識する抗体、（３）特定のタンパク質とその部分ペプチドの両方を認識する抗体のすべて、又は上記（１）と（２）、（１）と（３）、若しくは（２）と（３）の組み合わせでもよい。
試料を、原液又は緩衝液で段階希釈後、抗体を結合させたマイクロビーズ又は基板にこれを適当量加え、インキュベーションする。その後洗浄し、捕捉されなかったタンパク質及び部分ペプチドを除く。その後、マイクロビーズ又は基板上に捕捉されたタンパク質及び部分ペプチドをMALDI-TOF-MS、SELDI-TOF-MSなどを用いた質量分析によって分析し、タンパク質、タンパク質断片及び部分ペプチドのピークの質量数とピーク強度を計測する。適当な内部標準物質をもとの生体試料に一定量加えておき、そのピーク強度を測定して、対象となる物質のピーク強度との比を求めることにより、もとの生体試料中の濃度を知ることができる。この方法をimmunoMS法という。
また、試料を原液または緩衝液で希釈又は一部のタンパク質を除去した後、HPLCで分離、エレクトロスプレーイオン化(ESI)法を用いた質量分析によって定量することができる。その際に、同位体標識した内部標準ペプチドを用いたSRM/MRM法による絶対定量によって資料中の濃度を知ることができる。
さらに、上記の方法の他、２次元電気泳動を用いた方法、表面プラズモン共鳴を用いた方法等によっても、タンパク質および部分ペプチドを解析することが可能である。
本技術は、被験者から採取した生体試料を２次元電気泳動若しくは表面プラズモン共鳴法に供し、前記バイオマーカーの有無又は量を指標に認知機能障害疾患を検出する方法をも包含する。
本技術は、上述した生体試料中のバイオマーカーを検出することができる装置（例えば、検出装置、測定装置、解析装置等）をも含む。当該本技術の装置は、抗体又はアプタマー固定部（捕捉部）及び測定部を備えるのが望ましい。抗体又はアプタマー固定部は、抗体又はアプタマーを固定化したスライドガラス、96ウェルタイタープレート等の固相担体を有するものであるのが好適である。また、測定部には、分光光度計、蛍光分光計等の検出対象に対応する光検出手段を設けるのが好適である。
さらに、本技術の装置は、得られたデータを解析する解析部を含んでもよく、解析部はデータ処理装置及び解析用ソフトウェアを含むのが好適である。
さらに、本開示の装置に備えられるCPU等を含む制御部又はこれに接続可能なシステム（例えば、パーソナルコンピュータ、コンピュータ・ネットワークシステム等）には、上述した本技術の認知機能障害疾患の検出、診断等の方法を実行可能なプログラム又はこのプログラムを格納した記憶部若しくはシステム等が設けられている。
さらに、本技術の装置は、得られたデータを解析する解析部を含んでもよく、解析部はデータ処理装置及び解析用ソフトウェアを含むのが好適である。
さらに、本開示の装置に備えられるCPU等を含む制御部又はこれに接続可能なシステム（例えば、パーソナルコンピュータ、コンピュータ・ネットワークシステム等）には、上述した本技術の認知機能障害疾患の検出、診断等の方法を実行可能なプログラム又はこのプログラムを格納した記憶部若しくはシステム等が設けられている。
本技術によれば、被験者の認知機能障害を判定することができる。さらに、本技術によれば、被験者の認知機能障害が軽度の段階で評価することもでき、予防医学にも有用である。さらに、認知機能障害疾患に罹患した患者に心理療法や薬物療法を行った場合、障害の進行が抑制されるならば、血清などの生体試料中のタンパク質／部分ペプチドの量にも反映される。これを測定することにより、治療効果の評価と判定を行うこともでき、創薬ターゲット生体分子をスクリーニングを行うこともできる。
後記実施例に示すように、本発明者は、多数のペプチドを準備し、各ペプチドに対する各抗体を作成した。これら抗体を用いて、知機能障害疾患の検出用のバイオマーカーの探索を行った。この際、受信者操作特性曲線（ROC曲線）による分析を用いて、各バイオマーカーの有用性について評価を行った。この結果、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるApolipoprotein A1由来のペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretin由来のペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるComplement C3由来のペプチドが、受信者操作特性曲線（ROC曲線）による分析においてAUC 0.6以上示すマーカーであることを見出した。
さらに、マルチマーカーによる認知機能障害疾患（MCI及びAD）と、非認知機能障害の健常者とが区別できるかどうかを検討した。このとき、ロジスティック回帰分析を利用して検討を行った。
ロジスティック回帰分析の解析結果、Transthyretin及びComplement C3をマルチマーカーとすることで、ほぼ９割と非常に精度の高い認知機能障害疾患の検出を可能とした。
さらに、マルチマーカーによる認知機能障害疾患（MCI及びAD）と、非認知機能障害の健常者とが区別できるかどうかを検討した。このとき、ロジスティック回帰分析を利用して検討を行った。
ロジスティック回帰分析の解析結果、Transthyretin及びComplement C3をマルチマーカーとすることで、ほぼ９割と非常に精度の高い認知機能障害疾患の検出を可能とした。
すなわち、本技術は、（i）被験者の生体試料中の認知機能障害疾患の２種以上のバイオマーカーをそれぞれ測定すること、（ii）前記２種以上のバイオマーカーのそれぞれの測定結果をロジスティック回帰分析で解析すること、（iii）前記解析結果に基づき認知機能障害疾患の正答率の高いバイオマーカーの組み合わせを選定すること、を含む、正答率が高い複数の認知機能障害疾患検出用バイオマーカーの組み合わせ選定方法を提供することができる。
このとき、ロジスティック回帰分析を用い、NDCとMCIを比して、MCIと区別する正答率が、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上であるとき、又は、NDCとADを比較して、ADと区別する正答率が、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上であるとき、MCI又はADであると区別しこれらを検出するためのバイオマーカーとして選択するのが好適である。
このとき、ロジスティック回帰分析を用い、NDCとMCIを比して、MCIと区別する正答率が、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上であるとき、又は、NDCとADを比較して、ADと区別する正答率が、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上であるとき、MCI又はADであると区別しこれらを検出するためのバイオマーカーとして選択するのが好適である。
また、前記（i）の前に、被験者の生体試料中の認知機能障害疾患に関するタンパク質又はその部分ペプチドを、ROC曲線による分析に基づき、AUCが高いものを認知機能障害疾患検出用のバイオマーカーとして選定することができる。AUCが0.6以上となるタンパク質又はその部分ペプチドを、認知機能障害疾患検出用のバイオマーカーとするのが、有益である。
なお、ROC曲線及びロジスティック回帰曲線は、後記実施例に記載のとおりである。
なお、ROC曲線及びロジスティック回帰曲線は、後記実施例に記載のとおりである。
これにより、最適なバイオマーカーの組み合わせを選出することができ、そのことで認知機能障害疾患の検出又は診断等の正答率が高くなる。よって、選定された複数のバイオマーカーを測定することで、より客観的により精度よく認知機能障害疾患を検出、診断等することが可能となる。
この組み合わせのうち、前記（ｂ）バイオマーカー及び前記前記（ｃ）バイオマーカーを同時又は別々に測定し、これら測定結果に基づき認知機能障害疾患の検出、診断等に用い得るのが、最も正答率が高いので、好適である。
この組み合わせのうち、前記（ｂ）バイオマーカー及び前記前記（ｃ）バイオマーカーを同時又は別々に測定し、これら測定結果に基づき認知機能障害疾患の検出、診断等に用い得るのが、最も正答率が高いので、好適である。
本技術の方法は、CPU等を含む制御部及び記憶媒体（USBメモリ、HDD、CD、DVD等）を備えるハードウエア資源にプログラムとして格納し、検査装置や選定装置等の制御部によって、実行されることが可能である。
本技術は、前記（ａ）～（ｃ）記載のバイオマーカーを用いる認知機能障害疾患の検出キットとしても利用することができる。
本技術は、前記（ａ）バイオマーカー（ApoA1）、前記（ｂ）バイオマーカー（TTR）及び（ｃ）バイオマーカー（C3）から選択される１種又は２種以上の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを測定するための認知機能障害疾患の検出キットとすることができる。
このうち、（ｃ）バイオマーカー（C3）と、前記（ａ）バイオマーカー（ApoA1）又は（ｂ）バイオマーカー（TTR）とを組み合わせた検出キットが好適である。
また、本技術の検出キットは、これらを同時に又は別々に検出できるように、前記（ａ）～（ｃ）記載のバイオマーカー検出可能な試薬全てを一緒に含む一液型の認知機能障害用検出キットとしてもよし、又は、各バイオマーカーを検出可能な試薬を別々の容器に存在させた複数（２又は３以上の）の検出キッドを有する認知機能障害疾患用検出キットとしてもよい。
また、この検出キットには、本技術の各バイオマーカーに対する抗体又はアプタマーを含むのが好適である。
本技術は、前記（ａ）バイオマーカー（ApoA1）、前記（ｂ）バイオマーカー（TTR）及び（ｃ）バイオマーカー（C3）から選択される１種又は２種以上の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを測定するための認知機能障害疾患の検出キットとすることができる。
このうち、（ｃ）バイオマーカー（C3）と、前記（ａ）バイオマーカー（ApoA1）又は（ｂ）バイオマーカー（TTR）とを組み合わせた検出キットが好適である。
また、本技術の検出キットは、これらを同時に又は別々に検出できるように、前記（ａ）～（ｃ）記載のバイオマーカー検出可能な試薬全てを一緒に含む一液型の認知機能障害用検出キットとしてもよし、又は、各バイオマーカーを検出可能な試薬を別々の容器に存在させた複数（２又は３以上の）の検出キッドを有する認知機能障害疾患用検出キットとしてもよい。
また、この検出キットには、本技術の各バイオマーカーに対する抗体又はアプタマーを含むのが好適である。
本技術の認知機能障害疾患の検出方法として、生体試料中の、前記（ａ）バイオマーカー、前記（ｂ）バイオマーカー及び前記（ｃ）バイオマーカーから選択される１種又は２種以上の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを同時又は別々に測定するのが好適である。
本技術の認知機能障害疾患の検出方法として、（i）被験者の生体試料中の前記（ａ）バイオマーカー、前記（ｂ）バイオマーカー及び前記（ｃ）バイオマーカーから選択される２種又は３種の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを同時又は別々に測定すること、(ii)少なくとも２種以上のバイオマーカーの測定結果が認知機能障害疾患に分類される場合、被験者を認知機能障害疾患と判定することを含むのが、より好適である。
本技術の認知機能障害疾患の検出方法として、（i）被験者の生体試料中の前記（ａ）バイオマーカー、前記（ｂ）バイオマーカー及び前記（ｃ）バイオマーカーから選択される２種又は３種の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを同時又は別々に測定すること、(ii)少なくとも２種以上のバイオマーカーの測定結果が認知機能障害疾患に分類される場合、被験者を認知機能障害疾患と判定することを含むのが、より好適である。
本技術は、以下の構成を採用することもできる。
すなわち、本技術は、以下のとおりである。
［１］ 次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）から選択される１種又は２種以上の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
すなわち、本技術は、以下のとおりである。
［１］ 次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）から選択される１種又は２種以上の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
［２］ 生体試料中の、次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）から選択される１種又は２種以上の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを同時又は別々に測定する認知機能障害疾患の検出方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
［３］ 以下の（i）及び（ii）を含む、請求項２記載の認知機能障害疾患の検出方法。
（i）被験者の生体試料中の次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）から選択される２種又は３種の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを同時又は別々に測定すること。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(ii)少なくとも２種以上のバイオマーカーの測定結果が認知機能障害疾患に分類される場合、被験者を認知機能障害疾患と判定すること。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
［３］ 以下の（i）及び（ii）を含む、請求項２記載の認知機能障害疾患の検出方法。
（i）被験者の生体試料中の次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）から選択される２種又は３種の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを同時又は別々に測定すること。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
(ii)少なくとも２種以上のバイオマーカーの測定結果が認知機能障害疾患に分類される場合、被験者を認知機能障害疾患と判定すること。
［４］ 前記（ｃ）バイオマーカーと、前記（ａ）バイオマーカー又は前記（ｂ）バイオマーカーとの２種を測定する前記［２］又は［３］記載の認知機能障害疾患の検出方法。
［５］ 前記認知機能障害疾患の検出が、軽度認知障害の検出である場合、前記（ｃ）バイオマーカー及び前記（ａ）バイオマーカーの２種を測定する前記［２］～［４］の何れか１項記載の認知機能障害疾患の検出方法。
［６］ 前記認知機能障害疾患の検出が、アルツハイマー病の検出である場合、前記（ｃ）バイオマーカー及び前記（ｂ）バイオマーカーの２種を測定する前記［２］～［４］の何れか１項記載の認知機能障害疾患の検出方法。
［５］ 前記認知機能障害疾患の検出が、軽度認知障害の検出である場合、前記（ｃ）バイオマーカー及び前記（ａ）バイオマーカーの２種を測定する前記［２］～［４］の何れか１項記載の認知機能障害疾患の検出方法。
［６］ 前記認知機能障害疾患の検出が、アルツハイマー病の検出である場合、前記（ｃ）バイオマーカー及び前記（ｂ）バイオマーカーの２種を測定する前記［２］～［４］の何れか１項記載の認知機能障害疾患の検出方法。
［７］イムノ・ブロット法；ウェスタン・ブロット法；酵素若しくは蛍光若しくは放射性物質の標識法；質量分析法；immunoMS法；表面プラズモン共鳴法の何れか１つ以上の方法により測定する、前記［２］～［６］の何れか１項記載の認知機能障害疾患の検出方法。
［８］ 次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）から選択される１種以上の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを測定するための認知機能障害疾患の検出キット。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
［９］ 前記バイオマーカーに対する抗体又はアプタマーを含む前記［８］記載の認知機能障害疾患の検出キット。
［１０］前記抗体又はアプタマーが基板上に固相化されている前記［８］又は［９］記載の認知機能障害疾患の検出キット。
［１１］ 前記（ｃ）バイオマーカーと、前記（ａ）バイオマーカー又は前記（ｂ）バイオマーカーとの２種を有する前記［８］～［１０］の何れか１項記載の認知機能障害疾患の検出キット。
［１２］ 前記認知機能障害疾患の検出が、軽度認知障害の検出である場合、前記（ｃ）バイオマーカー及び前記（ａ）バイオマーカーの２種を有する前記［８］～［１１］の何れか１項記載の認知機能障害疾患の検出キット。
［１３］ 前記認知機能障害疾患の検出が、アルツハイマー病の検出である場合、前記（ｃ）バイオマーカー及び前記（ｂ）バイオマーカーの２種を有する前記［８］～［１１］の何れか１項記載の認知機能障害疾患の検出キット。
前記選出キットは、一液型でも、多液型でもよい。
［１０］前記抗体又はアプタマーが基板上に固相化されている前記［８］又は［９］記載の認知機能障害疾患の検出キット。
［１１］ 前記（ｃ）バイオマーカーと、前記（ａ）バイオマーカー又は前記（ｂ）バイオマーカーとの２種を有する前記［８］～［１０］の何れか１項記載の認知機能障害疾患の検出キット。
［１２］ 前記認知機能障害疾患の検出が、軽度認知障害の検出である場合、前記（ｃ）バイオマーカー及び前記（ａ）バイオマーカーの２種を有する前記［８］～［１１］の何れか１項記載の認知機能障害疾患の検出キット。
［１３］ 前記認知機能障害疾患の検出が、アルツハイマー病の検出である場合、前記（ｃ）バイオマーカー及び前記（ｂ）バイオマーカーの２種を有する前記［８］～［１１］の何れか１項記載の認知機能障害疾患の検出キット。
前記選出キットは、一液型でも、多液型でもよい。
［１４］前記［２］～［７］の何れか１項記載の認知機能障害疾患の検出方法を行うための認知機能障害疾患の検出キット。
［１５］ 前記［８］～［１３］の何れか１項記載の認知機能障害疾患の検出キットを用いる前記［２］～［７］の何れか１項記載の認知機能障害疾患の検出方法。
［１５］ 前記［８］～［１３］の何れか１項記載の認知機能障害疾患の検出キットを用いる前記［２］～［７］の何れか１項記載の認知機能障害疾患の検出方法。
［１６］ 被験者の生体試料中の認知機能障害疾患の２種以上のバイオマーカーをそれぞれ測定すること；前記２種以上のバイオマーカーのそれぞれの測定結果をロジスティック回帰分析で解析すること；前記解析結果に基づき認知機能障害疾患の正答率の高いバイオマーカーの組み合わせを選定することを含む、正答率が高い複数の認知機能障害疾患検出用バイオマーカーの組み合わせ選定方法。
［１７］ マルチプレックスイムノアッセイ法で２種以上のタンパク質の測定を行うこと、
そのうち、MCI（軽度認知機能障害）対NDC（非認知機能障害）、AD（アルツハイマー病）対NDC（非認知機能障害）の比較におけるROC曲線を作成し、AUCが0.6以上を示すタンパク質を認知機能障害疾患バイオマーカーと選定することを含む、前記［１６］記載の認知機能障害疾患のバイオマーカーの組み合わせ選定方法。
［１８］ NDCとMCIを比してMCIと区別する正答率が、80%以上、より好ましくは85%以上である、及び／又は、NDCとADを比してADと区別する正答率が、85%％以上、より好ましくは90%以上である、前記［１６］又は［１７］記載の認知機能障害疾患のバイオマーカーの組み合わせ選定方法。
［１９］コンピュータを、前記［１６］～［１８］の何れか１項記載の方法を実行させるための認知機能障害疾患のバイオマーカーの組み合わせ選定プログラム又は当該プログラムを格納する制御部若しくはコンピュータ。
［２０］コンピュータを、前記［１６］～［１８］の何れか１項記載の方法を実行させるために記憶媒体上に記憶された認知機能障害疾患のバイオマーカーの組み合わせ選定プログラム又は当該プログラムを格納する制御部若しくはコンピュータ。
［１７］ マルチプレックスイムノアッセイ法で２種以上のタンパク質の測定を行うこと、
そのうち、MCI（軽度認知機能障害）対NDC（非認知機能障害）、AD（アルツハイマー病）対NDC（非認知機能障害）の比較におけるROC曲線を作成し、AUCが0.6以上を示すタンパク質を認知機能障害疾患バイオマーカーと選定することを含む、前記［１６］記載の認知機能障害疾患のバイオマーカーの組み合わせ選定方法。
［１８］ NDCとMCIを比してMCIと区別する正答率が、80%以上、より好ましくは85%以上である、及び／又は、NDCとADを比してADと区別する正答率が、85%％以上、より好ましくは90%以上である、前記［１６］又は［１７］記載の認知機能障害疾患のバイオマーカーの組み合わせ選定方法。
［１９］コンピュータを、前記［１６］～［１８］の何れか１項記載の方法を実行させるための認知機能障害疾患のバイオマーカーの組み合わせ選定プログラム又は当該プログラムを格納する制御部若しくはコンピュータ。
［２０］コンピュータを、前記［１６］～［１８］の何れか１項記載の方法を実行させるために記憶媒体上に記憶された認知機能障害疾患のバイオマーカーの組み合わせ選定プログラム又は当該プログラムを格納する制御部若しくはコンピュータ。
［２１］ 前記バイオマーカーが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１種以上である前記［１］～［１８］の何れか１つの、バイオマーカー、検出方法、検出キット又は組み合わせ選定方法。
［２２］ 前記部分ペプチドが、インタクトなタンパク質の部分ペプチド、又は当該タンパク質若しくはペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片である前記［１］～［１８］の何れか１つの、バイオマーカー、検出方法、検出キット又は組み合わせ選定方法。
［２２］ 前記部分ペプチドが、インタクトなタンパク質の部分ペプチド、又は当該タンパク質若しくはペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片である前記［１］～［１８］の何れか１つの、バイオマーカー、検出方法、検出キット又は組み合わせ選定方法。
以下に、具体的な実施例等を説明するが、本発明（本技術）はこれに限定されるものではない。
試験例１
＜マルチプレックスイムノアッセイ法による認知機能障害疾患マーカーの検出＞
アルツハイマー病を含む神経変性疾患に関わるマーカータンパク質のうち、補体系のComplement C3, Complement C4, Complement factor H、脳アミロイドーシスの原因であるAβ線維形成の抑制に関わるTransthyretin、Alpha-2-macroglobulinをマーカーとし、被験者から採取した生体試料をイムノアッセイ法に供してマーカーの有無ないし量を指標に認知機能障害疾患を検出する。
検出方法として、生体試料から複数のマーカー(アナライト)を同時に検出するマルチプレックスイムノアッセイ法を用いた。
＜マルチプレックスイムノアッセイ法による認知機能障害疾患マーカーの検出＞
アルツハイマー病を含む神経変性疾患に関わるマーカータンパク質のうち、補体系のComplement C3, Complement C4, Complement factor H、脳アミロイドーシスの原因であるAβ線維形成の抑制に関わるTransthyretin、Alpha-2-macroglobulinをマーカーとし、被験者から採取した生体試料をイムノアッセイ法に供してマーカーの有無ないし量を指標に認知機能障害疾患を検出する。
検出方法として、生体試料から複数のマーカー(アナライト)を同時に検出するマルチプレックスイムノアッセイ法を用いた。
（１）血清試料
以下、括弧の前は略称である。
AD(アルツハイマー病)37例、NDC(精神疾患に罹患していない被験者)22例、およびMCI(軽度認知機能障害)39例から得られた血清を用いた。
（２）方法
Apolipoprotein E (ApoE), Apolipoprotein A1 (ApoA1), Complement C3 (C3), Transthyretin (TTR), Complement Factor H (Factor H), Alpha-2-macroglobulin (Alpha-2-M)はMILLIPLEXTMマルチプレックスキット(HNDG1-36K, Merck Millipore社)を用いて測定した。Complement C4 (C4)はMILLIPLEXTMマルチプレックスキット(HNDG2-36K, Merck Millipore社)を用いて測定した。
以下、括弧の前は略称である。
AD(アルツハイマー病)37例、NDC(精神疾患に罹患していない被験者)22例、およびMCI(軽度認知機能障害)39例から得られた血清を用いた。
（２）方法
Apolipoprotein E (ApoE), Apolipoprotein A1 (ApoA1), Complement C3 (C3), Transthyretin (TTR), Complement Factor H (Factor H), Alpha-2-macroglobulin (Alpha-2-M)はMILLIPLEXTMマルチプレックスキット(HNDG1-36K, Merck Millipore社)を用いて測定した。Complement C4 (C4)はMILLIPLEXTMマルチプレックスキット(HNDG2-36K, Merck Millipore社)を用いて測定した。
（２－１）血清サンプルの調製
（ApoE, ApoA1, C3, TTR, Factor H, Alpha-2-M測定用血清サンプル）
血清サンプルを40,000倍希釈したものを用いた。すなわち、血清5 μlを1.5 mlチューブに加え、Assay Bufferを995 μl加えて穏やかに攪拌した。この希釈液5 μlを別のチューブに取り、Assay Bufferを995 μl加えて穏やかに攪拌した。これをアッセイサンプルとした。
（C4測定用血清サンプル）
血清サンプルを2,000倍希釈したものを用いた。すなわち、血清5 μlを1.5 mlチューブに加え、Assay Bufferを495 μl加えて穏やかに攪拌した。この希釈液10 μlを別のチューブに取り、Assay Bufferを190 μl加えて穏やかに攪拌した。これをアッセイサンプルとした。
（２－２）ビーズ希釈液の調製
検出対象のタンパク質を認識する抗体が結合したビーズを混合・希釈して、ビーズ希釈液を調製した。
（ApoE, ApoA1, C3, TTR, Factor H, Alpha-2-M測定用ビーズ希釈液）
ミキシング用ボトルにBead Diluentを2,100 μl加え、さらに各抗体が結合したビーズ懸濁液6種類をそれぞれ150 μl加えて攪拌した。これをビーズ希釈液とした。
（C4測定用ビーズ希釈液）
ミキシング用ボトルにBead Diluentを2,850 μl加え、C4抗体が結合したビーズ懸濁液を150 μl加えて攪拌した。これをビーズ希釈液とした。
（ApoE, ApoA1, C3, TTR, Factor H, Alpha-2-M測定用血清サンプル）
血清サンプルを40,000倍希釈したものを用いた。すなわち、血清5 μlを1.5 mlチューブに加え、Assay Bufferを995 μl加えて穏やかに攪拌した。この希釈液5 μlを別のチューブに取り、Assay Bufferを995 μl加えて穏やかに攪拌した。これをアッセイサンプルとした。
（C4測定用血清サンプル）
血清サンプルを2,000倍希釈したものを用いた。すなわち、血清5 μlを1.5 mlチューブに加え、Assay Bufferを495 μl加えて穏やかに攪拌した。この希釈液10 μlを別のチューブに取り、Assay Bufferを190 μl加えて穏やかに攪拌した。これをアッセイサンプルとした。
（２－２）ビーズ希釈液の調製
検出対象のタンパク質を認識する抗体が結合したビーズを混合・希釈して、ビーズ希釈液を調製した。
（ApoE, ApoA1, C3, TTR, Factor H, Alpha-2-M測定用ビーズ希釈液）
ミキシング用ボトルにBead Diluentを2,100 μl加え、さらに各抗体が結合したビーズ懸濁液6種類をそれぞれ150 μl加えて攪拌した。これをビーズ希釈液とした。
（C4測定用ビーズ希釈液）
ミキシング用ボトルにBead Diluentを2,850 μl加え、C4抗体が結合したビーズ懸濁液を150 μl加えて攪拌した。これをビーズ希釈液とした。
（２－３）QCサンプルの調製
Quality Control用タンパク質が封入されているボトルに純水を 250 μl加え、穏やかに攪拌したのち、5～10分間静置した。これをQCサンプルとした。
（２－４）スタンダードサンプルの調製
定量用標準曲線作成用のスタンダードサンプルは6段階の段階希釈で作成した。すなわち、スタンダードタンパク質が入っているボトルに250 μlの純水を加えて穏やかに攪拌したのち、5～10分間静置し、これを最高濃度のスタンダード溶液とした。これを50 μlを別のチューブに取り、Assay Buffer 150 μlを加えて攪拌した。さらに、希釈した溶液50 μlを別のチューブに取り、Assay Buffer 150 μlを加えて攪拌した。これを合計6回繰り返した。希釈の系列は1, 4, 16, 64, 256, 1024, 4096倍である。
Quality Control用タンパク質が封入されているボトルに純水を 250 μl加え、穏やかに攪拌したのち、5～10分間静置した。これをQCサンプルとした。
（２－４）スタンダードサンプルの調製
定量用標準曲線作成用のスタンダードサンプルは6段階の段階希釈で作成した。すなわち、スタンダードタンパク質が入っているボトルに250 μlの純水を加えて穏やかに攪拌したのち、5～10分間静置し、これを最高濃度のスタンダード溶液とした。これを50 μlを別のチューブに取り、Assay Buffer 150 μlを加えて攪拌した。さらに、希釈した溶液50 μlを別のチューブに取り、Assay Buffer 150 μlを加えて攪拌した。これを合計6回繰り返した。希釈の系列は1, 4, 16, 64, 256, 1024, 4096倍である。
（２－５）抗原抗体反応
ApoE, ApoA1, C3, TTR, Factor H, Alpha-2-Mを測定するアッセイ用96Wellフィルタープレートと、C4を測定するアッセイ用96Wellフィルタープレートを別々に用意して抗原抗体反応を行った。
アッセイ用96Wellフィルタープレートに200 μlのWash Buffer を加えて、Plate Shaker (M・BR-022, TAITEC社)を用いて1,200 rpmで10分間、室温で攪拌した。その後、マニホールドを用いて、Wash Bufferを吸引除去した。使用ずる全WellにAssay Bufferを25 μlを加え、さらにビーズ希釈液を25 μl加えた。続いて、アッセイサンプル用Well、スタンダードサンプル用Well、QCサンプル用Well、バックグラウンド測定用Wellにそれぞれのサンプルを25 μlを加えた。バックグラウンド測定用WellにはAssay Bufferを加えた。プレートをシーリングしたのち、Plate Shakerで抗原抗体反応を行った。ApoE, ApoA1, C3, TTR, Factor H, Alpha-2-M測定用プレートは2時間、室温で抗原抗体反応を行った。C4測定用プレートは16時間、4℃で抗原抗体反応を行った。
ApoE, ApoA1, C3, TTR, Factor H, Alpha-2-Mを測定するアッセイ用96Wellフィルタープレートと、C4を測定するアッセイ用96Wellフィルタープレートを別々に用意して抗原抗体反応を行った。
アッセイ用96Wellフィルタープレートに200 μlのWash Buffer を加えて、Plate Shaker (M・BR-022, TAITEC社)を用いて1,200 rpmで10分間、室温で攪拌した。その後、マニホールドを用いて、Wash Bufferを吸引除去した。使用ずる全WellにAssay Bufferを25 μlを加え、さらにビーズ希釈液を25 μl加えた。続いて、アッセイサンプル用Well、スタンダードサンプル用Well、QCサンプル用Well、バックグラウンド測定用Wellにそれぞれのサンプルを25 μlを加えた。バックグラウンド測定用WellにはAssay Bufferを加えた。プレートをシーリングしたのち、Plate Shakerで抗原抗体反応を行った。ApoE, ApoA1, C3, TTR, Factor H, Alpha-2-M測定用プレートは2時間、室温で抗原抗体反応を行った。C4測定用プレートは16時間、4℃で抗原抗体反応を行った。
（２－６）洗浄および測定
抗原抗体反応後、溶液を吸引除去し、さらにWash Buffer を200 μl加えて吸引除去を3回繰り返し、ビーズの洗浄を行った。洗浄後、Detection Antibodiesを25 μlを使用Well全てに25 μl加えてプレートをシーリングし、Plate Shakerで1時間、室温で攪拌して二次抗体反応を行った。反応後、Streptavidin-Phycoerythrinを25 μl加えてシーリングし、Plate Shakerで30分間、室温で攪拌した。反応後、溶液を吸引除去し、さらにWash Buffer を200 μl加えて吸引除去を3回繰り返し、ビーズの洗浄を行った。100 μlのSheath Fluidを各Wellに加えて5分間室温で攪拌したのち、Luminex 200TM(Luminex Corp., USA)で蛍光測定を行った。血清サンプル中のマーカーの定量解析は、xPONENT 3.1 ソフトウェア(Luminex Corp., USA)を用いて、スタンダードサンプルから求められた標準曲線の数式を用いて定量した。
抗原抗体反応後、溶液を吸引除去し、さらにWash Buffer を200 μl加えて吸引除去を3回繰り返し、ビーズの洗浄を行った。洗浄後、Detection Antibodiesを25 μlを使用Well全てに25 μl加えてプレートをシーリングし、Plate Shakerで1時間、室温で攪拌して二次抗体反応を行った。反応後、Streptavidin-Phycoerythrinを25 μl加えてシーリングし、Plate Shakerで30分間、室温で攪拌した。反応後、溶液を吸引除去し、さらにWash Buffer を200 μl加えて吸引除去を3回繰り返し、ビーズの洗浄を行った。100 μlのSheath Fluidを各Wellに加えて5分間室温で攪拌したのち、Luminex 200TM(Luminex Corp., USA)で蛍光測定を行った。血清サンプル中のマーカーの定量解析は、xPONENT 3.1 ソフトウェア(Luminex Corp., USA)を用いて、スタンダードサンプルから求められた標準曲線の数式を用いて定量した。
（３）結果
検出したマーカータンパク質がNDC群、MCI群、AD群で血清中の存在量に差があるか差異解析を行った。表１は各症例群を２対t検定で検定し、有意水準をp<0.05とした時のp値を示した表である。Complement C3 (C3)はNDC対MCI、NDC対AD、MCI対ADのいずれでも有意に差がみられ、認知機能障害疾患(MCI、AD)患者を非認知機能障害(NDC)患者と区別するのに有用であることが分かった。また、Apolipoprotein A1 (ApoA1)、Transthyretin (TTR)はAD患者をNDCと区別するのに有用であることが分かった。Apolipoprotein E (ApoE)、Complement factor H (Factor H)、Alpha-2-macroglobulin (Alpha-2-M)、Complement C4 (C4)はいずれの疾患群とも有意な差を示さなかった。
検出したマーカータンパク質がどの程度に有用であるかを評価するために、受信者操作特性曲線(receiver operating characteristic curve, ROC曲線)による分析を行った。ROC曲線の下部の面積値(AUC of ROC)(以下、AUCという)が1に近いほどバイオマーカーとしての有用性が高くなる。MCI対NDC、AD対NDCの比較におけるROC曲線を作成し、AUCが0.6以上を示すマーカータンパク質を解析したところ、C3、ApoA1、TTRがAUCが0.6以上を示すマーカーであった。表２にC3、ApoA1、TTRのNDC対MCI、NDC対ADのAUCを示した。
図１、図２、図３はC3、ApoA1、TTRの３つのマーカータンパク質について、差異解析とROC曲線を示している。図１のＡ）は差異解析の図であり、NDCとMCIで比較するとMCIでC3は有意に減少し(t検定、p値0.034)、NDCとADで比較するとADでC3は有意に減少している(t検定、p値1.668E-4)。さらに、MCIとADで比較するとADでC3は有意に減少している(t検定、p値0.01)。図１のＢ）および、Ｃ）はNDC対MCI、NDC対ADで比較した時のROC曲線である。NDCとMCIで比較した時のAUCは0.663、NDCとADで比較した時のAUCは0.834であった。図２のＡ）はApoA1の差異解析の図であり、NDCとADで比較するとADでC3は有意に減少している(t検定、p値0.049)。図２のＢ）および、Ｃ）はNDC対MCI、NDC対ADで比較した時のROC曲線である。NDCとMCIで比較した時のAUCは0.649、NDCとADで比較した時のAUCは0.673であった。図３のＡ）はTTRの差異解析の図であり、NDCとADで比較するとADでC3は有意に減少している(t検定、p値5.811E-4)。図３のＢ）および、Ｃ）はNDC対MCI、NDC対ADで比較した時のROC曲線である。NDCとMCIで比較した時のAUCは0.677、NDCとADで比較した時のAUCは0.730であった。
これら、C3、ApoA1、TTRの3つのマーカータンパク質について、NDCに対して、MCI、ADをより精度よく区別する組み合わせを解析するため、試験例２を行った。
検出したマーカータンパク質がNDC群、MCI群、AD群で血清中の存在量に差があるか差異解析を行った。表１は各症例群を２対t検定で検定し、有意水準をp<0.05とした時のp値を示した表である。Complement C3 (C3)はNDC対MCI、NDC対AD、MCI対ADのいずれでも有意に差がみられ、認知機能障害疾患(MCI、AD)患者を非認知機能障害(NDC)患者と区別するのに有用であることが分かった。また、Apolipoprotein A1 (ApoA1)、Transthyretin (TTR)はAD患者をNDCと区別するのに有用であることが分かった。Apolipoprotein E (ApoE)、Complement factor H (Factor H)、Alpha-2-macroglobulin (Alpha-2-M)、Complement C4 (C4)はいずれの疾患群とも有意な差を示さなかった。
検出したマーカータンパク質がどの程度に有用であるかを評価するために、受信者操作特性曲線(receiver operating characteristic curve, ROC曲線)による分析を行った。ROC曲線の下部の面積値(AUC of ROC)(以下、AUCという)が1に近いほどバイオマーカーとしての有用性が高くなる。MCI対NDC、AD対NDCの比較におけるROC曲線を作成し、AUCが0.6以上を示すマーカータンパク質を解析したところ、C3、ApoA1、TTRがAUCが0.6以上を示すマーカーであった。表２にC3、ApoA1、TTRのNDC対MCI、NDC対ADのAUCを示した。
図１、図２、図３はC3、ApoA1、TTRの３つのマーカータンパク質について、差異解析とROC曲線を示している。図１のＡ）は差異解析の図であり、NDCとMCIで比較するとMCIでC3は有意に減少し(t検定、p値0.034)、NDCとADで比較するとADでC3は有意に減少している(t検定、p値1.668E-4)。さらに、MCIとADで比較するとADでC3は有意に減少している(t検定、p値0.01)。図１のＢ）および、Ｃ）はNDC対MCI、NDC対ADで比較した時のROC曲線である。NDCとMCIで比較した時のAUCは0.663、NDCとADで比較した時のAUCは0.834であった。図２のＡ）はApoA1の差異解析の図であり、NDCとADで比較するとADでC3は有意に減少している(t検定、p値0.049)。図２のＢ）および、Ｃ）はNDC対MCI、NDC対ADで比較した時のROC曲線である。NDCとMCIで比較した時のAUCは0.649、NDCとADで比較した時のAUCは0.673であった。図３のＡ）はTTRの差異解析の図であり、NDCとADで比較するとADでC3は有意に減少している(t検定、p値5.811E-4)。図３のＢ）および、Ｃ）はNDC対MCI、NDC対ADで比較した時のROC曲線である。NDCとMCIで比較した時のAUCは0.677、NDCとADで比較した時のAUCは0.730であった。
これら、C3、ApoA1、TTRの3つのマーカータンパク質について、NDCに対して、MCI、ADをより精度よく区別する組み合わせを解析するため、試験例２を行った。
[1] Apolipoprotein A1由来のペプチド (ApoA1) （配列番号１）
〔インタクトタンパク質／ペプチド〕
0001 MKAAVLTLAV LFLTGSQARH FWQQDEPPQS PWDRVKDLAT VYVDVLKDSG
0051 RDYVSQFEGS ALGKQLNLKL LDNWDSVTST FSKLREQLGP VTQEFWDNLE
0101 KETEGLRQEM SKDLEEVKAK VQPYLDDFQK KWQEEMELYR QKVEPLRAEL
0151 QEGARQKLHE LQEKLSPLGE EMRDRARAHV DALRTHLAPY SDELRQRLAA
0201 RLEALKENGG ARLAEYHAKA TEHLSTLSEK AKPALEDLRQ GLLPVLESFK
0251 VSFLSALEEY TKKLNTQ
〔インタクトタンパク質／ペプチド〕
0001 MKAAVLTLAV LFLTGSQARH FWQQDEPPQS PWDRVKDLAT VYVDVLKDSG
0051 RDYVSQFEGS ALGKQLNLKL LDNWDSVTST FSKLREQLGP VTQEFWDNLE
0101 KETEGLRQEM SKDLEEVKAK VQPYLDDFQK KWQEEMELYR QKVEPLRAEL
0151 QEGARQKLHE LQEKLSPLGE EMRDRARAHV DALRTHLAPY SDELRQRLAA
0201 RLEALKENGG ARLAEYHAKA TEHLSTLSEK AKPALEDLRQ GLLPVLESFK
0251 VSFLSALEEY TKKLNTQ
[2] Transthyretin由来ペプチド (TTR) （配列番号２）
〔インタクトタンパク質／ペプチド〕
0001 MASHRLLLLC LAGLVFVSEA GPTGTGESKC PLMVKVLDAV RGSPAINVAV
0051 HVFRKAADDT WEPFASGKTS ESGELHGLTT EEEFVEGIYK VEIDTKSYWK
0101 ALGISPFHEH AEVVFTANDS GPRRYTIAAL LSPYSYSTTA VVTNPKE
〔インタクトタンパク質／ペプチド〕
0001 MASHRLLLLC LAGLVFVSEA GPTGTGESKC PLMVKVLDAV RGSPAINVAV
0051 HVFRKAADDT WEPFASGKTS ESGELHGLTT EEEFVEGIYK VEIDTKSYWK
0101 ALGISPFHEH AEVVFTANDS GPRRYTIAAL LSPYSYSTTA VVTNPKE
[3] Complement C3由来ペプチド (C3) （配列番号３）
〔インタクトタンパク質／ペプチド〕
0001 MGPTSGPSLL LLLLTHLPLA LGSPMYSIIT PNILRLESEE TMVLEAHDAQ
0051 GDVPVTVTVH DFPGKKLVLS SEKTVLTPAT NHMGNVTFTI PANREFKSEK
0101 GRNKFVTVQA TFGTQVVEKV VLVSLQSGYL FIQTDKTIYT PGSTVLYRIF
0151 TVNHKLLPVG RTVMVNIENP EGIPVKQDSL SSQNQLGVLP LSWDIPELVN
0201 MGQWKIRAYY ENSPQQVFST EFEVKEYVLP SFEVIVEPTE KFYYIYNEKG
0251 LEVTITARFL YGKKVEGTAF VIFGIQDGEQ RISLPESLKR IPIEDGSGEV
0301 VLSRKVLLDG VQNPRAEDLV GKSLYVSATV ILHSGSDMVQ AERSGIPIVT
0351 SPYQIHFTKT PKYFKPGMPF DLMVFVTNPD GSPAYRVPVA VQGEDTVQSL
0401 TQGDGVAKLS INTHPSQKPL SITVRTKKQE LSEAEQATRT MQALPYSTVG
0451 NSNNYLHLSV LRTELRPGET LNVNFLLRMD RAHEAKIRYY TYLIMNKGRL
0501 LKAGRQVREP GQDLVVLPLS ITTDFIPSFR LVAYYTLIGA SGQREVVADS
0551 VWVDVKDSCV GSLVVKSGQS EDRQPVPGQQ MTLKIEGDHG ARVVLVAVDK
0601 GVFVLNKKNK LTQSKIWDVV EKADIGCTPG SGKDYAGVFS DAGLTFTSSS
0651 GQQTAQRAEL QCPQPAARRR RSVQLTEKRM DKVGKYPKEL RKCCEDGMRE
0701 NPMRFSCQRR TRFISLGEAC KKVFLDCCNY ITELRRQHAR ASHLGLARSN
0751 LDEDIIAEEN IVSRSEFPES WLWNVEDLKE PPKNGISTKL MNIFLKDSIT
0801 TWEILAVSMS DKKGICVADP FEVTVMQDFF IDLRLPYSVV RNEQVEIRAV
0851 LYNYRQNQEL KVRVELLHNP AFCSLATTKR RHQQTVTIPP KSSLSVPYVI
0901 VPLKTGLQEV EVKAAVYHHF ISDGVRKSLK VVPEGIRMNK TVAVRTLDPE
0951 RLGREGVQKE DIPPADLSDQ VPDTESETRI LLQGTPVAQM TEDAVDAERL
1001 KHLIVTPSGC GEQNMIGMTP TVIAVHYLDE TEQWEKFGLE KRQGALELIK
1051 KGYTQQLAFR QPSSAFAAFV KRAPSTWLTA YVVKVFSLAV NLIAIDSQVL
1101 CGAVKWLILE KQKPDGVFQE DAPVIHQEMI GGLRNNNEKD MALTAFVLIS
1151 LQEAKDICEE QVNSLPGSIT KAGDFLEANY MNLQRSYTVA IAGYALAQMG
1201 RLKGPLLNKF LTTAKDKNRW EDPGKQLYNV EATSYALLAL LQLKDFDFVP
1251 PVVRWLNEQR YYGGGYGSTQ ATFMVFQALA QYQKDAPDHQ ELNLDVSLQL
1301 PSRSSKITHR IHWESASLLR SEETKENEGF TVTAEGKGQG TLSVVTMYHA
1351 KAKDQLTCNK FDLKVTIKPA PETEKRPQDA KNTMILEICT RYRGDQDATM
1401 SILDISMMTG FAPDTDDLKQ LANGVDRYIS KYELDKAFSD RNTLIIYLDK
1451 VSHSEDDCLA FKVHQYFNVE LIQPGAVKVY AYYNLEESCT RFYHPEKEDG
1501 KLNKLCRDEL CRCAEENCFI QKSDDKVTLE ERLDKACEPG VDYVYKTRLV
1551 KVQLSNDFDE YIMAIEQTIK SGSDEVQVGQ QRTFISPIKC REALKLEEKK
1601 HYLMWGLSSD FWGEKPNLSY IIGKDTWVEH WPEEDECQDE ENQKQCQDLG
1651 AFTESMVVFG CPN
〔インタクトタンパク質／ペプチド〕
0001 MGPTSGPSLL LLLLTHLPLA LGSPMYSIIT PNILRLESEE TMVLEAHDAQ
0051 GDVPVTVTVH DFPGKKLVLS SEKTVLTPAT NHMGNVTFTI PANREFKSEK
0101 GRNKFVTVQA TFGTQVVEKV VLVSLQSGYL FIQTDKTIYT PGSTVLYRIF
0151 TVNHKLLPVG RTVMVNIENP EGIPVKQDSL SSQNQLGVLP LSWDIPELVN
0201 MGQWKIRAYY ENSPQQVFST EFEVKEYVLP SFEVIVEPTE KFYYIYNEKG
0251 LEVTITARFL YGKKVEGTAF VIFGIQDGEQ RISLPESLKR IPIEDGSGEV
0301 VLSRKVLLDG VQNPRAEDLV GKSLYVSATV ILHSGSDMVQ AERSGIPIVT
0351 SPYQIHFTKT PKYFKPGMPF DLMVFVTNPD GSPAYRVPVA VQGEDTVQSL
0401 TQGDGVAKLS INTHPSQKPL SITVRTKKQE LSEAEQATRT MQALPYSTVG
0451 NSNNYLHLSV LRTELRPGET LNVNFLLRMD RAHEAKIRYY TYLIMNKGRL
0501 LKAGRQVREP GQDLVVLPLS ITTDFIPSFR LVAYYTLIGA SGQREVVADS
0551 VWVDVKDSCV GSLVVKSGQS EDRQPVPGQQ MTLKIEGDHG ARVVLVAVDK
0601 GVFVLNKKNK LTQSKIWDVV EKADIGCTPG SGKDYAGVFS DAGLTFTSSS
0651 GQQTAQRAEL QCPQPAARRR RSVQLTEKRM DKVGKYPKEL RKCCEDGMRE
0701 NPMRFSCQRR TRFISLGEAC KKVFLDCCNY ITELRRQHAR ASHLGLARSN
0751 LDEDIIAEEN IVSRSEFPES WLWNVEDLKE PPKNGISTKL MNIFLKDSIT
0801 TWEILAVSMS DKKGICVADP FEVTVMQDFF IDLRLPYSVV RNEQVEIRAV
0851 LYNYRQNQEL KVRVELLHNP AFCSLATTKR RHQQTVTIPP KSSLSVPYVI
0901 VPLKTGLQEV EVKAAVYHHF ISDGVRKSLK VVPEGIRMNK TVAVRTLDPE
0951 RLGREGVQKE DIPPADLSDQ VPDTESETRI LLQGTPVAQM TEDAVDAERL
1001 KHLIVTPSGC GEQNMIGMTP TVIAVHYLDE TEQWEKFGLE KRQGALELIK
1051 KGYTQQLAFR QPSSAFAAFV KRAPSTWLTA YVVKVFSLAV NLIAIDSQVL
1101 CGAVKWLILE KQKPDGVFQE DAPVIHQEMI GGLRNNNEKD MALTAFVLIS
1151 LQEAKDICEE QVNSLPGSIT KAGDFLEANY MNLQRSYTVA IAGYALAQMG
1201 RLKGPLLNKF LTTAKDKNRW EDPGKQLYNV EATSYALLAL LQLKDFDFVP
1251 PVVRWLNEQR YYGGGYGSTQ ATFMVFQALA QYQKDAPDHQ ELNLDVSLQL
1301 PSRSSKITHR IHWESASLLR SEETKENEGF TVTAEGKGQG TLSVVTMYHA
1351 KAKDQLTCNK FDLKVTIKPA PETEKRPQDA KNTMILEICT RYRGDQDATM
1401 SILDISMMTG FAPDTDDLKQ LANGVDRYIS KYELDKAFSD RNTLIIYLDK
1451 VSHSEDDCLA FKVHQYFNVE LIQPGAVKVY AYYNLEESCT RFYHPEKEDG
1501 KLNKLCRDEL CRCAEENCFI QKSDDKVTLE ERLDKACEPG VDYVYKTRLV
1551 KVQLSNDFDE YIMAIEQTIK SGSDEVQVGQ QRTFISPIKC REALKLEEKK
1601 HYLMWGLSSD FWGEKPNLSY IIGKDTWVEH WPEEDECQDE ENQKQCQDLG
1651 AFTESMVVFG CPN
試験例２
＜ロジスティック回帰分析を用いたマルチマーカーによるMCI、ADの区別＞
（１）ロジスティック回帰分析の原理
この方法はバイオマーカーに対応する各パラメーターの係数をデータセットから得て、二つの疾患カテゴリー(正常、疾患)における患者ごとの判定確率を与えることができる。ロジスティック回帰に関する比較的丁寧な解説は以下から得られる（非特許文献３：Czepiel, SA, http://czep.net/stat/mlelr.pdf, 2010, Maximum likelihood estimation of logistic regression models: theory and implementation.）。この解説にはNewton-Raphson法による分析法が含まれている。
この解析手法の原理は以下のとおりである。ある事象の生起確率をPとしたとき、
＜ロジスティック回帰分析を用いたマルチマーカーによるMCI、ADの区別＞
（１）ロジスティック回帰分析の原理
この方法はバイオマーカーに対応する各パラメーターの係数をデータセットから得て、二つの疾患カテゴリー(正常、疾患)における患者ごとの判定確率を与えることができる。ロジスティック回帰に関する比較的丁寧な解説は以下から得られる（非特許文献３：Czepiel, SA, http://czep.net/stat/mlelr.pdf, 2010, Maximum likelihood estimation of logistic regression models: theory and implementation.）。この解説にはNewton-Raphson法による分析法が含まれている。
この解析手法の原理は以下のとおりである。ある事象の生起確率をPとしたとき、
は累積標準正規分布に近似できることが知られている（非特許文献４：Bowling, SR, et al. JIEM, 2009, 2: 114-127, A logistic approximation to the cumulative normal distribution.）。ロジスティック回帰はこの近似を利用して統計解析を行う。以下のようにZは多変量xi;i=1,2,…rの線形結合として表わされる。
多数のデータを式(1)および(2)に当てはめて、係数（coefficient）βiを求め、その有意性（βiがゼロではないこと）を統計学的p値から判定する。
式(2)の最終化法として以下の2通りがある。
（I）係数の統計的有意性による方法
有意でない係数が見出された場合は、これを除外して式(2)を作り、同様に当てはめを行うことを繰り返す。こうして、式(2)の係数がすべて有意になったら、xiの実測値を代入して(2)からZ値を求める。ついで式(1) からP（判定確率）の値を求めることができる。なお、係数βiについてはその標準誤差（standard error）を算出することができる。
式(2)の最終化法として以下の2通りがある。
（I）係数の統計的有意性による方法
有意でない係数が見出された場合は、これを除外して式(2)を作り、同様に当てはめを行うことを繰り返す。こうして、式(2)の係数がすべて有意になったら、xiの実測値を代入して(2)からZ値を求める。ついで式(1) からP（判定確率）の値を求めることができる。なお、係数βiについてはその標準誤差（standard error）を算出することができる。
（II）最大正答率を与える係数の組み合わせを求める方法
正答率とは元来属する群に属すると正しく判定された率をいうが、この方法では、統計的有意性が認められない係数を含むすべての係数を対象にtrial and errorにより最大正答率を与える係数の組み合わせを求める。判定確率は（I）と同様に求める。
ロジスティック回帰の正答率を以下の式(3)によって定義する。判別は被験者の二つのカテゴリー（例えばNDCとMCI）のうちのどちらに属するかをロジスティック回帰式から推定することによって行われる。被験者のカテゴリーをi（例えばMCI）とし、ロジスティック回帰式から得られた判定確率が0.5以上のときiと正しく診断されたとみなす。カテゴリーiの総被験者数をNi 、正しくiと診断された被験者数をCi として、
正答率とは元来属する群に属すると正しく判定された率をいうが、この方法では、統計的有意性が認められない係数を含むすべての係数を対象にtrial and errorにより最大正答率を与える係数の組み合わせを求める。判定確率は（I）と同様に求める。
ロジスティック回帰の正答率を以下の式(3)によって定義する。判別は被験者の二つのカテゴリー（例えばNDCとMCI）のうちのどちらに属するかをロジスティック回帰式から推定することによって行われる。被験者のカテゴリーをi（例えばMCI）とし、ロジスティック回帰式から得られた判定確率が0.5以上のときiと正しく診断されたとみなす。カテゴリーiの総被験者数をNi 、正しくiと診断された被験者数をCi として、
と正答率が表わされる。
ロジスティック回帰において変量xiに対するオッズ比（odds ratio）とはxiを1単位増加させた場合のオッズを元のオッズで割った値であるが、これはexp(βi)に等しい。オッズ比が1であるとは、xiを1単位増加させても元と同じオッズであるので、今考えている事象の起きる確率に変化がないことを意味する。すなわち、この場合βiは0であり、Zに寄与していないことを示す。オッズ比の95%信頼区間が1を含む場合も統計学的にそのβiは有意ではないことになる。なお、当然ながらexp(0) = 1である。
ロジスティック回帰において変量xiに対するオッズ比（odds ratio）とはxiを1単位増加させた場合のオッズを元のオッズで割った値であるが、これはexp(βi)に等しい。オッズ比が1であるとは、xiを1単位増加させても元と同じオッズであるので、今考えている事象の起きる確率に変化がないことを意味する。すなわち、この場合βiは0であり、Zに寄与していないことを示す。オッズ比の95%信頼区間が1を含む場合も統計学的にそのβiは有意ではないことになる。なお、当然ながらexp(0) = 1である。
（２）ロジスティック回帰分析
試験例１において、マルチプレックスイムノアッセイ法で測定したタンパク質Apolipoprotein E (ApoE)、Apolipoprotein A1 (ApoA1)、Complement C3 (C3)、Transthyretin (TTR)、Complement Factor H (Factor H)、Alpha-2-macroglobulin (Alpha-2-M)、Complement C4 (C4)のうち、NDC対MCI、NDC対ADの２群有意差検定(t検定)で有意に差がみられ、さらにROC曲線のAUCが0.6以上を示した3つのタンパク質C3、ApoA1、TTRを選択し、ロジスティック回帰分析を行った。ロジスティック回帰分析による解析はtrial and errorによってマーカータンパク質の加除を行い、正答率が最も高い結果を得るマーカータンパク質の組み合わせを求め、この組み合わせによるロジスティック回帰式（2）の係数（coefficient, βi）を算出した。
ロジスティック回帰分析はMedCalc for Windows（登録商標）, version 9, 2007, （MedCalc Software社）を用いて実行した。このプログラムはNewton-Raphson法によっている。
試験例１において、マルチプレックスイムノアッセイ法で測定したタンパク質Apolipoprotein E (ApoE)、Apolipoprotein A1 (ApoA1)、Complement C3 (C3)、Transthyretin (TTR)、Complement Factor H (Factor H)、Alpha-2-macroglobulin (Alpha-2-M)、Complement C4 (C4)のうち、NDC対MCI、NDC対ADの２群有意差検定(t検定)で有意に差がみられ、さらにROC曲線のAUCが0.6以上を示した3つのタンパク質C3、ApoA1、TTRを選択し、ロジスティック回帰分析を行った。ロジスティック回帰分析による解析はtrial and errorによってマーカータンパク質の加除を行い、正答率が最も高い結果を得るマーカータンパク質の組み合わせを求め、この組み合わせによるロジスティック回帰式（2）の係数（coefficient, βi）を算出した。
ロジスティック回帰分析はMedCalc for Windows（登録商標）, version 9, 2007, （MedCalc Software社）を用いて実行した。このプログラムはNewton-Raphson法によっている。
（３）結果：MCIであると区別し、正答率が最も高い結果を得るマーカータンパク質の組み合わせとロジスティック回帰式の係数
マーカータンパク質3種の組み合わせとその組み合わせのデータを用いてロジスティック回帰を行い、算出された統計学的p値の表を表３に示す。組み合わせに用いたマーカータンパク質は（○）で示し、使用しなかったものは（-）で示した。
マーカータンパク質3種の組み合わせとその組み合わせのデータを用いてロジスティック回帰を行い、算出された統計学的p値の表を表３に示す。組み合わせに用いたマーカータンパク質は（○）で示し、使用しなかったものは（-）で示した。
統計学的p値がp>0.05の場合、ロジスティック回帰式の係数は有意性は認められない。そこで、表３のNo. 2、4、6、7は係数算出から除外した。表３のNo. 1、3、5の組み合わせの内、最も正答率が高い結果を得るマーカータンパク質の組み合わせとロジスティック回帰式の係数(Coefficient)を表５に示した。最も正答率が高い結果を得る組み合わせのマーカータンパク質はComplement C3 (C3)とApolipoprotein A1 (ApoA1)であり、この時のロジスティック回帰式の係数は、C3が-0.02567、ApoA1が-0.001653、定数が4.6667であった。NDCとMCIを比してMCIと区別する正答率は89.74%であり、NDCの正答率は50%であった。
（４）結果：ADであると区別し、正答率が最も高い結果を得るマーカータンパク質の組み合わせとロジスティック回帰式の係数
マーカータンパク質3種の組み合わせとその組み合わせのデータを用いてロジスティック回帰を行い、算出された統計学的p値の表を表４に示す。組み合わせに用いたマーカータンパク質は（○）で示し、使用しなかったものは（-）で示した。
マーカータンパク質3種の組み合わせとその組み合わせのデータを用いてロジスティック回帰を行い、算出された統計学的p値の表を表４に示す。組み合わせに用いたマーカータンパク質は（○）で示し、使用しなかったものは（-）で示した。
統計学的p値がp>0.05の場合、ロジスティック回帰式の係数は有意ではない。そのため、表４のNo. 4、5、6、7は係数算出から除外した。表４のNo. 1、2、3の組み合わせの内、最も正答率が高い結果を得るマーカータンパク質の組み合わせとロジスティック回帰式の係数(Coefficient)を表６に示した。最も正答率が高い結果を得る組み合わせのマーカータンパク質はComplement C3 (C3)とTransthyretin (TTR)であり、この時のロジスティック回帰式の係数は、C3が-0.0465、TTRが-0.00564、定数が4.5218であった。NDCとADを比してADと区別する正答率は91.89%であり、NDCの正答率は68.18%であった。
本開示のバイオマーカーを複数用いれば、軽度認知機能障害及びアルツハイマー病を含む認知機能障害疾患の検出の精度が高くなり、診断薬を含む診断分野における用途に適用できる。
Claims (7)
- 次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）から選択される１種又は２種以上の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー - 生体試料中の、次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）から選択される１種又は２種以上の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを同時又は別々に測定する認知機能障害疾患の検出方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー - 前記（ｃ）バイオマーカーと、前記（ａ）バイオマーカー又は前記（ｂ）バイオマーカーとの２種を測定する請求項２記載の認知機能障害疾患の検出方法。
- 前記認知機能障害疾患の検出が軽度認知障害の検出である場合、前記（ｃ）バイオマーカー及び前記（ａ）バイオマーカーの２種を測定するか、又は
前記認知機能障害疾患の検出がアルツハイマー病の検出である場合、前記（ｃ）バイオマーカー及び前記（ｂ）バイオマーカーの２種を測定する、請求項２又は３記載の認知機能障害疾患の検出方法。 - 次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）から選択される１種又は２種以上の認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカーを測定するための認知機能障害疾患の検出キット。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むApolipoprotein A1のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むTransthyretinのインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むComplement C3のインタクトなタンパク質又はこの部分ペプチドからなる認知機能障害疾患を検出するためのバイオマーカー - 前記バイオマーカーに対する抗体又はアプタマーを含む請求項５記載の認知機能障害疾患の検出キット。
- 被験者の生体試料中の認知機能障害疾患の２種以上のバイオマーカーをそれぞれ測定すること、
前記２種以上のバイオマーカーのそれぞれの測定結果をロジスティック回帰分析で解析すること、
前記解析結果に基づき認知機能障害疾患の正答率の高いバイオマーカーの組み合わせを選定すること、
を含む、正答率が高い複数の認知機能障害疾患検出用バイオマーカーの組み合わせ選定方法。
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