WO2014201994A1

WO2014201994A1 - 一种丹参提取物及其微丸制剂以及它们的制备方法和用途

Info

Publication number: WO2014201994A1
Application number: PCT/CN2014/080077
Authority: WO
Inventors: 闫希军; 章顺楠; 叶正良; 周立红; 董海鸥; 张文生; 张洪波; 马长雨; 郑永锋; 范立君
Original assignee: 天士力制药集团股份有限公司
Priority date: 2013-06-17
Filing date: 2014-06-17
Publication date: 2014-12-24
Also published as: HK1221155A1; EP3011965B1; ES2810325T3; UA122198C2; EA201690038A1; HUE050065T2; EP3011965A1; DK3011965T3; PT3011965T; EA033184B1; EP3011965A4

Abstract

本发明公开了一种丹参提取物及其微丸制剂以及它们的制备方法和用途，所述丹参提取物包含下列重量比的组分：丹参素:迷迭香酸:紫草酸:丹酚酸B:隐丹参酮:丹参酮II A:水苏糖＝（0.5-16）:（0.5-15）:（0.5-15）:（5-140）:（0.5-25）:（1-50）:（150-600）。本发明的丹参提取物同时包含丹参的水溶性活性成分和脂溶性活性成分，具有良好的稳定性和低的溶剂残留，此外还具有改善微循环以及降血脂的作用。

Description

一种丹参提取物及其微丸制剂以及它们的制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种新的中药丹参提取物及其微丸制剂，属于制药领域。本发明还涉及包含上述丹参提取物和微丸制剂的制备方法和用途。

背景技术

丹参为唇形科鼠尾草植物丹参（ Salvia miltiorrhiza Beg. )干燥的根。在我国治疗冠心病心绞痛方面，已有近千年的使用历史，最早记载于东汉的《神农本草经》，并被列为上品，具有行气止痛，宁心安神，清热凉血，活血化瘀等功效。

自上世纪以来，随着化学分离手段的不断发展，以及近代植物化学的悄然兴起，人们对丹参的化学成分也有了进一步的研宄。

研宄表明，丹参的活性成分主要有两类：一类是以丹参酮为代表的脂溶性有效成分；另一类则是以丹酚酸为代表的水溶性有效成分。脂溶性有效成分中，丹参酮有抗菌、消炎、活血化瘀、促进伤口愈合等多方面作用；同时，近年来研宄认为，水溶性有效成分是活血化瘀的有效成分。例如，丹酚酸 A对缺血再灌注引起的心肌细胞损伤有明显的保护作用，总丹酚酸表现出较强的抗缺血再灌性心律失常作用；丹酚酸 A、丹酚酸 B 以及总丹酚酸对小鼠脑缺血再灌注引起的脑损伤有保护作用，可以减少脑组织中 MDA含量；丹酚酸抗血栓作用；丹酚酸对肝、肾的保护作用；丹酚酸具有很强的抗氧化作用，可以清除超氧阴离子和释基自由基，抑制脂质过氧化反应，等等。（杜冠华等，基础医学与临床， 2000， 20 ( 5 )： 10-14 )。

目前，丹参水溶性部位的提取方法多为水提后过树脂柱或聚酰胺柱，例如， Takashi Tanaka 等报道的丹参多酚酸盐的提取方法（Chemical Pharmaceutical Bulletin, 1989, 37 ( 2 ) , 340-344 ) , 另外， KojiHase 等（PlantaMedica, 1997， 63 , 22-26 )、徐亚明等（中国专利 CN1247855A, 2000年 3月公开）、刘平等（中国专利 CN1270809A, 2000年 10月公开）、黎莲娘等（中国专利，申请号 01142288.2，申请日 2001年 9月）亦采用类似的方法从丹参中提取酚酸类化合物。

现有技术中，丹参提取方法大概分为以下几种：

1. 丹参水煎煮得水提取液，提取液浓缩后醇沉，将醇沉液浓缩得丹参粗提取物，主要成分为丹酚酸类成分；

2. 丹参水煎煮得水提取液，提取液浓缩后醇沉，将醇沉液浓缩一定程度后，过大孔树脂柱或聚酰胺柱，水洗，醇洗，洗脱液浓缩干燥即可，得丹参精提取物，主要成分为丹酚酸类成分。

3. 丹参 C0₂超临界萃取得丹参酮提取物，药渣水提醇沉后，上清液过树脂柱，水洗，醇洗得水溶性成分提取物。

上述方法中，一般都是选择一类成分作为有效成分，如丹参酚酸类或丹参酮类，丹参药材的利用率比较低，舍弃了丹参的另一种有效活性成分，没有将丹参药材的全部成分表达出来。造成药材资源的浪费。空白微丸是制剂行业中常用的药物载体，很多市售的胶囊制剂都是在空白微丸上载药，再包衣制成一定释放要求的巨标微丸。它具有流动性好，易填装胶囊，装量差异小，释药稳定等特点。微丸在药剂学领域中的应用十分广泛，作为药物的载体，它既可以进一步压制成片剂，又可填充胶囊，不仅提高了药物稳定性，而且可有效地调节药物释放速率，作为药物释放系统，微丸还具有治疗学上的优势，它对肠道剌激较小，减少了药物的突释效应，提高了用药安全性。

在空白微丸上载药技术已经使用多年，但中药产品极少，很多中药载药技术都或多或少存在载药量少、不稳定、外观差等缺点。

发明内容

为了更好地利用丹参药材，充分发挥丹参药材的药理作用，本发明提供一种具有较强药理活性的丹参提取物，并经过工艺改进，找到一种适合丹参提取物的载药技术，并进一步制备成丹参微丸。

可通过下列编号段落中的任一项对本发明进行限定：

1. 一种丹参提取物，其特征在于，所述提取物包含下列重量比的组分：丹参素：迷迭香酸：紫草酸:丹酚酸 B:隐丹参酮:丹参酮 II A:水苏糖 = (0.5-16) ： (0.5-15) ： (0.5-15) ： (5-140) ：

(0.5-25) ： (1-50) ： (150-600)。

2. 如段落 1所述的丹参提取物，其特征在于，所述提取物包含下列重量比的组分：丹参素:迷迭香酸:紫草酸:丹酚酸 B:隐丹参酮:丹参酮 II A:水苏糖 = (1-8)： (1-8)： (1-8)： (10-70)：

(1-10) ： (2-20) ： (250-500)。

3. 如段落 2所述的丹参提取物，其特征在于，所述提取物包含下列重量比的组分：丹参素:迷迭香酸:紫草酸:丹酚酸 B:隐丹参酮:丹参酮 II A:水苏糖 = (2-5)： (2-5)： (2-5)： (25-60)：

(2-6) ： (4-10) ： (300-450)。

4. 如段落 3所述的丹参提取物，其特征在于，所述提取物包含下列重量比的组分：丹参素:迷迭香酸:紫草酸:丹酚酸 B:隐丹参酮:丹参酮 II A:水苏糖 = (2-4)： (2-4)： (2-4)： (25-30)：

(2-5) ： (4-10) ： (330-400)。

5. 如段落 4所述的丹参提取物，其特征在于，所述提取物包含下列重量比的组分：丹参素:迷迭香酸:紫草酸:丹酚酸 B:隐丹参酮:丹参酮 II A:水苏糖 =3:3:3:28:4:7:370。

6. 一种微丸制剂，其包含如段落 1-5中任一项所述的丹参提取物作为活性成分。

7. 如段落 6 所述的微丸制剂，其特征在于，所述微丸堆密度为 0.6-1.3g/ml，比表面积 0.005-0.05m²/g，粒径为 0.5-1.8mm。

8. 如段落 6或 7所述的微丸制剂，其特征在于，所述的微丸堆密度为 0.8-1. lg/ml，比表面积 0.01-0.03m²/g，粒径为 0.7-1.2mm。

9. 一种丹参提取物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1) 丹参药材用醇提取，过滤得到醇提液，药渣 A备用； (2) 药渣 A加水提取，过滤，得水提液，药渣 B弃去；

(3) 醇提液、水提液分别降温静置，再分别吸取上清液为醇提上清液、水提上清液；

(4) 水提上清液浓缩得水提浓缩液；

(5) 水提浓缩液逐步加入醇提上清液，合并浓缩，得混合浓缩液；

(6) 混合浓缩液中加入纯化水，混合均匀后浓缩，即得丹参提取物。

10. 如段落 9所述的方法，其特征在于，步骤（1) 中所述的醇为乙醇，其用量为药材用量 2-7倍重量，醇浓度为 50-100% (v/v)，提取时间 0.5-4小时。

11. 如段落 9或 10所述的方法，其特征在于，步骤（2) 中的加水量为药渣 A的 3-7倍重量，提取时间 0.5-4小时。

12. 如段落 9-11中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（3) 中所述的降温静置是将提取液搅拌 20-60分钟，料液温度降至 15°C以下静置 6-24小时吸取上清液。

13. 如段落 9-12中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（4) 中将水提上清液浓缩至相对密度 1.10-1.35，获得所述水提浓缩液。

14. 如段落 9-13中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（6) 中向混合浓缩液中分次加入 10L-100L纯化水，每次加入 5-50L纯化水，合并浓缩，减压浓缩至 82.5±2.5°C相对密度为 1.25-1.35收膏。

15. 如段落 9-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：取切制丹参，加 90±0.5%乙醇 400±12L，煎煮 90±5min， 200 目过滤，醇提液合并放入静置罐中；药渣进行第二次提取，加水 500±15L，煎煮 60±3mm， 200 目过滤，药渣弃去，水提液合并放入不同静置罐中；醇提混合液和水混合提液分别置于不同静置罐中，静置罐通冷冻水降温静置，提取液搅拌 30分钟后， 4小时内将提取液温度降至 15°C以下，静置 6-24小时，吸取醇提上清液和水提上清液放至各自储罐中；先浓缩水提上清液至水提浓缩液比重 1.25-1.30 (82.5±2.5°C) 之间；逐步加入醇提上清液进一步合并浓缩，浓缩过程中浓缩液比重不得低于 1.15; 浓缩至混合浓缩液比重≥1.34，分两次加入 10L纯化水，每次加 5L (45±5°C)，合并浓缩，浓缩至比重 1.33-1.35 (82.5±2.5°C)，趁热过滤（40 目筛）得丹参提取物。

16. 如段落 9-15 中任一项所述的方法，其特征在于，根据所述制备方法制得的丹参提取物包含下列重量比的组分：

丹参素：迷迭香酸:紫草酸:丹酚酸 B:隐丹参酮:丹参酮 II A:水苏糖 = (0.5-16) ： (0.5-15) ： (0.5-15) ： (5-140) ： (0.5-25) ： (1-50) ： (150-600)。

17. 如段落 16所述的方法，其特征在于，所制得的丹参提取物包含下列重量比的组分：丹参素：迷迭香酸:紫草酸:丹酚酸 B:隐丹参酮:丹参酮 II A:水苏糖 = (1-8) ： (1-8) ： (1-8) ：

(10-70) ： ( 1-10) ： (2-20) ： (250-500)。

18. 如段落 17所述的方法，其特征在于，所制得的丹参提取物包含下列重量比的组分：丹参素：迷迭香酸:紫草酸:丹酚酸 B:隐丹参酮:丹参酮 II A:水苏糖 = (2-5) ： (2-5) ： (2-5) ：

(25-60) ： (2-6) ： (4-10) ： (300-450)。 19. 如段落 18所述的方法，其特征在于，所制得的丹参提取物包含下列重量比的组分：丹参素：迷迭香酸:紫草酸:丹酚酸 B:隐丹参酮:丹参酮 II A:水苏糖 = (2-4) ： (2-4) ： (2-4) ：

(25-30) ： (2-5) ： (4-10) ： (330-400)。

20. 如段落 19所述的方法，其特征在于，所制得的丹参提取物包含下列重量比的组分：丹参素：迷迭香酸:紫草酸:丹酚酸 B:隐丹参酮:丹参酮 II A:水苏糖 =3:3:3:28:4:7:370。

21. 一种包含丹参提取物的微丸制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1) 取重量比为 1:5至 5:1的丹参提取物：基丸备用；

(2) 上料流化：将处方量基丸吸入到流化干燥包衣机内，使基丸在床体内完全流化；

(3) 初期载药阶段：待物料温度 40-60°C，开始以速度 70-120g/mm 喷液，涂布于基丸表面，所述喷液是将所述丹参提取物加水稀释得到的预混丹参提取物雾化成细小液滴；

(4) 载药过程：在物料温度 40-60°C，随着丸径的增加，喷液量逐步增加，颗粒丸径与喷液速度呈梯度提高，直至喷涂得到粒径为 0.5-1.8mm的颗粒。

22. 如段落 21所述的方法，其特征在于，在喷液完毕后，对载药微丸喷入包衣液进行包衣步骤（5)，包衣物料温度 40-60°C，喷液速度 40-300g/min，包衣时间 1-4小时，所述包衣液浓度为 5-25%。

23. 如段落 22所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1) 取重量比为 1:3至 3:1、优选 2:1至 1:1的丹参提取物：基丸备用；

(2) 基丸上料流化：设定风量 600-1500m³/h，将基丸吸入到流化干燥包衣机内，使基丸在床体内完全流化；但不能剧烈流化造成基丸磨损起粉，以基丸能够覆盖喷枪雾化液滴为准；

(3) 初期载药阶段：调试喷枪和雾化压力，使药液能够均匀雾化成细小液滴，将提取物药液通过计量泵输送到喷枪，分别设定上喷气和下喷气为 2.0-3.0Bar和 2.5-3.5Bar，设定物料温度 50°C左右，待物料温度升至 45°C后开始喷液，喷液速度设定 120g/mm;

(4) 载药过程中：物料温度 45-55°C，随丸径的增大，输液量逐步增加，输液速度最高不超过 400g/mm，风量根据微丸的流化状态进行调整；

(5)包衣：载药结束后直接喷包衣液进行包衣，包衣初期设定物料温度 50°C，喷液速度 80g/mm，包衣 20分钟后可将喷液速度调整至 80-150g/mm，物料温度控制在 40-55°C，根据微丸的粘连情况调整输液速度，风量和物料温度。

24. 如段落 23所述的方法，其特征在于，所述提取物药液是由所述丹参提取物加水配制而成，所述丹参提取物与水的重量比为 100:60-100，优选 100:70-90，更优选 100:75-85。

25. 如段落 21-24中任一项所述的方法，其特征在于，所述微丸为段落 6-8中任一项所述的微丸。

26. 段落 1-5中任一项所述的丹参提取物或段落 6-8中任一项所述的微丸制剂在制备用于改善微循环或降血脂的药物方面的用途。

本发明的丹参提取物同时包含了丹参中的水溶性活性成分和脂溶性活性成分，并通过工艺调整，获得了水溶性成分和脂溶性成分均匀分散的丹参提取物；另一方面，本发明的浓缩顺序及比重设定有效防止丹参酮类成分长时间高温浓缩含量降低，有效保留了将丹参进行醇提得到的脂溶性成分，提高了提取物的稳定性，并通过浓缩后期加水合并浓缩降低了提取物的有机溶剂残留。

药效试验结果显示，本发明的丹参提取物可明显促进小鼠耳廓微循环的毛细血管开放，进而改善微循环状态；另一方面，药效试验表明，本发明的丹参提取物还具有降血脂作用。

本发明的微丸制剂，作为球形微丸，载体的用量少、单剂量小，一般每次服用量为 0.1-4g; 外形规则，呈球形或类球形、表面光滑圆整；物理特性良好，例如流动性好、颗粒粒度分布规整、质地致密耐挤压，耐磨损、密度大（堆密度为 0.6- 1.3g/ml )、比表面积小（只有 0.005-0.05m²/g , 优选 0.01-0.03m²/g )，溶散时限短；上述特点能够提高患者的依从性，并使包衣技术的实际推广应用成为可能，从而改善了丹参提取物易吸潮、不稳定等问题。另外，本发明的微丸除了可以作为普通的颗粒剂使用，还可以作为中间体或配方颗粒，或灌装成胶囊剂等剂型，此外还可以制备成各种包衣制剂、缓控释制剂、定位释药制剂等。

附图说明

图 1 为使用两种不同浓缩方式制取丹参提取物的比较示意图，（1 ) 为丹参提取物放料后烧瓶粘附情况，（2 ) 为烧瓶水清洗情况，（3 ) 为 95%乙醇清洗情况。其中（a) 为先将醇提液浓缩再加入水提液，（b ) 为先将水提液浓缩再逐步并入醇提液。

图 2为两种不同浓缩方式的涂布情况示意图。

图 3为斑马鱼对丹参提取物的浓度致死曲线图。

图 4示出了斑马鱼血脂定量分析区域，其中，对实线部分圈出的区域进行血脂定量分析。图 5示出了不同浓度处理 48小时后，斑马鱼尾部的血管脂肪染色情况。

图 6为示出了不同浓度下丹参提取物诱导的斑马鱼血脂降低率的柱状图。

具体实施方式

本发明所述丹参提取物的制备方法的步骤（3 ) 中，降温静置是将提取液搅拌 20-60分钟，料液温度降至 15°C 以下静置 6-24小时吸取上清液。作用：降至室温以下，可以迅速除去杂质、如泥土颗粒等；温度低可以缩短静置时间，适合产业化，同时也能保证丹参酮和丹酚酸的稳定性。

本发明所述丹参提取物的制备方法的步骤（5 ) 中，向水提浓缩液中逐步加入步骤（3 ) 的醇提上清液，合并浓缩，减压浓缩至相对密度≥1.20得混合浓缩液；如果单独先浓缩醇提上清液时，随着料液乙醇浓度降低，丹参酮类成分容易析出结块，粘附在设备壁上。本发明采取水提浓缩液逐步加入醇提上清液合并浓缩，可以使醇提上清液中丹参酮类成分均匀分散在水提浓缩液中。因此本发明浓缩方式所得提取物粒度均匀，有效地避免了丹参酮类成分长时间高温浓缩含量降低，有效保留了丹参醇提出来的脂溶性成分丹参酮类成分回收率比较高，对设备清洁的要求比较简单，更易于操作和产业化，更重要的是对后续制剂工艺是有利的。本发明将后附不同浓缩方式对丹参提取物性状影响实验进行详细阐述。本发明所述丹参提取物的制备方法的步骤（6 ) 中，向混合浓缩液中分两次加入 10L纯化水，每次加 5L, 合并浓缩，减压浓缩至 82.5±2.5°C相对密度为 1.25- 1.35，趁热过滤，得丹参提取物。此加水步骤作用是为挥发掉乙醇，控制乙醇残留量，提高了丹参提取物的质量，本工艺产品能满足欧盟市场对提取物乙醇残留限度要求（≤0.5%)。

使用现有技术中记载的方法对本发明的丹参提取物的成分进行检测：

( 1 ) 丹参酮 ΠΑ、隐丹参酮含量检测方法（参照 2010版中国药典丹参药材项下）：色谱条件和系统适用性试验以十八垸基硅垸键合硅胶为填充剂，以甲醇-水（75 :25 ) 为流动相；检测波长 270nm。理论塔板数按丹参酮 ΠΑ峰计算均应不低于 2000

对照品溶液的制备取隐丹参酮、丹参酮 II A 对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每 ml含隐丹参酮、丹参酮 ΙΙ Α 16μ_§的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本提取物约 0.2g，精密称定，置于 10ml容量瓶中，加甲醇溶解，超声处理 30mm，冷却至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，过 0.22μηι有机膜，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 5μ1，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

( 2 ) 丹参酚酸含量检测方法

色谱条件和系统适用性试验以十八垸基硅垸键合硅胶为填充剂（2.1 X 100mm 1.8μηι ) , 以 0.05% ( ml/ml ) 的硫酸水溶液为流动相 A，以乙腈溶液为流动相 B，按下表 1进行梯度洗脱；流速为每分钟 0.4ml ; 检测波长为 280nm; 柱温度 40°C ; 记录时间为 12分钟，理论塔板数按丹参素计算应不低于 8000

对照品溶液的制备

称取丹参素、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸 B适量，于 100ml容量瓶中，加 75%甲醇适量使溶解，定容，摇匀，制成浓度分别为 0.03 0.04 0.04 0.5mg/ml的对照品溶液。

供试品溶液的制备称取供试品 0.1g，精密称定，置 10ml容量瓶中，加纯化水超声 15mm 溶解，定容，过 0.22μηι的水膜，即得。

测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 2μ1，注入超高效液相色谱仪，测定，用外标法计算含量，即得。 ( 3 ) 水苏糖含量测定

色谱条件和系统适用性

氨基柱色谱条件色谱柱：

Hypersil-NH2氨基键合柱， 4.6 mmx250 mm 5 μηι，大连依利特；柱温： 40°C; 流动相：乙腈:水 ( v:v) =70:30；流速： l .O mL/mino

试验对照品溶液的制备：

称准确称取水苏糖标准品适量，于 10 mL容量瓶中，用水溶解定容，制成浓度为其水苏糖贮备液浓度为 5 mg/mLo

供试品溶液的制备：

称取供试品 0.1g，精密称定，置 10ml容量瓶中，加纯化水超声 15mm，溶解，定容，过 0.22μηι的水膜，即得。

测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 2μ1，注入超高效液相色谱仪，测定，用外标法计算含量，即得。

本发明所述的基丸也称空白丸芯或药用微丸丸芯，其属于现有技术，可以在市场上购买得到。在药用微丸丸芯方面的主要产品有：药用微丸丸芯（蔗糖型）、微晶纤维素丸芯、淀粉丸芯等。本发明所述的基丸选自淀粉基丸、聚乙二醇 6000基丸、蔗糖基丸、微晶纤维素基丸中的一种，优选淀粉基丸或聚乙二醇 6000基丸，此类基丸具有载药量高、喷涂容易、工艺容易控制、易于产业化等优点。

根据本发明的制备方法，所得载药微丸经过进一步加工可以制成微丸胶囊。如将载药微丸包衣，过筛，得到包衣微丸，装入空白胶囊中即得本发明的中药微丸胶囊。

实施例

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

除非另有说明，本发明中所述的％以及％。均为重量比。

试验例 1 : 不同浓縮方式对丹参提取物的影响

为了考察不同浓缩方式对丹参提取物的性状、粒度分布以及酚酸成分的影响进行了以下试验。

准确称量丹参药材 450g，用 4倍量 90%乙醇提取 1.5h，药液过滤；药渣用 5倍量水回流提取 lh，过滤，得醇提液和水提液。每个实验平行提取两次。

方案 1 : 先浓缩醇提液后逐步加入浓缩水提液合并浓缩，至糖度 86±2%收膏。

方案 2 : 先浓缩水提液至糖度 84±2%后，逐步加入醇提液合并浓缩，至糖度 86±2%收膏。首先，在实验过程中，分别对两个方案中丹参提取物放料后烧瓶粘附情况（图 1 ( 1 ) )、烧瓶水清洗情况（图 1 ( 2 ) ) 和 95%乙醇清洗情况（图 1 ( 3 ) ) 进行考察并比较两方案间的优劣，得到了以下结果：由图 1 ( 1 ) 可知，方案 1中，黑子渣子颗粒大且粘附比较严重，而方案 2中析出的黑色渣子较细小并且也更均匀，从而方案 2的浓缩方式提取物性状较好。

由图 1 ( 2 ) 可以看出，方案 1中的烧瓶黑子渣子粘附比严重，而方案 2的浓缩方式粘壁情况较少。从而从水清洗效果来说方案 2的浓缩方式对设备清洗较好。

由图 1 ( 3 ) 可知，方案 1中 95%乙醇清洗溶液颜色比较重，方案 2的溶液颜色较清。综上所述，从丹参提取物表观性状和后续设备清洗来说，方案 2 的方式，即先浓缩水提液后逐步加入醇提液合并浓缩方式最优。

由图 2的丹参提取物涂布图片可以看出，方案 1 获得的丹参提取物有明显大颗粒的黑子渣子析出，而方案 2 的浓缩方式获得的丹参提取物黑色渣子分布比较均匀且颗粒比较小，对丹参提取物对后续制剂影响较小。

此外，还对两种方案获得的丹参提取物进行了药典筛粒度分布检测。

分别取各批次丹参提取物浸膏 50，加 5倍量水溶解，过 1-8号药典筛（药典筛依次叠放），用约 500ml蒸熘水冲洗，观察每层药典筛中浸膏颗粒分布情况，然后将每层中的颗粒用水冲洗，收集，抽滤，连同滤纸烘干称重。结果参见表 2.

表 2 两种浓缩方式的丹参提取物的粒度分析

由表 2可知，根据提取物颗粒大小以及大颗粒出现顺序，提取物性状优劣顺序为方案 2> 方案 1。因此方案 2的浓缩方式，即先浓缩水提液，再逐步加入醇提液合并浓缩的方式更优。

以下实施例 1-6给出了制备本发明的丹参提取物的实例。

实施例 1 丹参提取物的制备

使用如下步骤制备了丹参提取物：

( 1 )丹参药材加药材量 5倍量 75%乙醇，回流提取 2小时，过滤得醇提液，药渣 A备用；

( 2 ) 药渣 A加药材量 5倍量水，煎煮 2小时，过滤，得水提液，药渣 B弃去；

( 3 ) 步骤（1 ) 中的醇提液搅拌 30分钟，醇提液温度降至 15°C以下静置 12小时吸取上清液得醇提上清液，步骤（2 ) 中的水提液搅拌 30分钟，水提液温度降至降至 15°C以下静置 12小时，吸取上清液得水提上清液；

( 4 ) 水提上清液浓缩至相对密度 1.20-1.30，得水提浓缩液；

( 5 ) 水提浓缩液逐步加入步骤（3 ) 醇提上清液，合并浓缩，浓缩过程中料液相对密度不得低于 1.10，减压浓缩至相对密度≥1.20，得混合浓缩液；

(6) 混合浓缩液分次加入 50L 纯化水，每次加入 25L, 搅拌均匀，合并后减压浓缩至 82.5±2.5°C相对密度为 1.25-1.35，趁热过滤，得丹参提取物。

实施例 2 丹参提取物的制备

使用如下步骤制备了丹参提取物：

(1) 丹参药材加药材量 2倍量 50%乙醇，回流提取约 0.5小时，过滤得醇提液，药渣 A 备用；

(2) 上述药渣 A加药材量 2倍量水，煎煮约 0.5小时，过滤，得水提液，药渣 B弃去；

(3) 步骤（1) 中的醇提液搅拌 20分钟，醇提液温度降至 15°C以下静置 6小时吸取上清液得醇提上清液，步骤（2) 中的水提液搅拌 20分钟，水提液温度降至 15°C以下静置 6小时，吸取上清液得水提上清液；

(4) 水提上清液浓缩至相对密度 1.20，得水提浓缩液；

(5) 水提浓缩液逐步加入步骤（3) 醇提上清液，合并浓缩，浓缩过程中料液相对比重不得低于 1.10，减压浓缩至相，对密度≥1.20，得混合浓缩液；

(6) 混合浓缩液分次加入 10L 纯化水，每次加入 5 纯化水，合并浓缩，减压浓缩至 82.5±2.5°C相对密度为 1.25，趁热过滤，得丹参提取物。

实施例 3 丹参提取物的制备

使用如下步骤制备了丹参提取物：

(1) 丹参药材加药材量 7倍量 100%乙醇，回流提取约 4小时，过滤得醇提液，药渣 A 备用；

(2) 上述药渣 A加药材量 7倍量水，煎煮约 4小时，过滤，得水提液，药渣 B弃去；

(3) 步骤（1) 中的醇提液搅拌 60分钟，醇提液温度降至 15°C以下静置 24小时吸取上清液得醇提上清液，步骤（2) 中的水提液搅拌 60分钟，水提液温度降至 15°C 以下静置 24 小时，吸取上清液得水提上清液；

(4) 水提上清液浓缩至相对密度 1.30，得水提浓缩液；

(5) 水提浓缩液逐步加入步骤（3) 醇提上清液，合并浓缩，浓缩过程中料液相对密度不得低于 1.10，减压浓缩至相对密度≥1.20，得混合浓缩液；

(6) 混合浓缩液分次加入 100L纯化水，每次加入 50L纯化水，合并浓缩，减压浓缩至 82.5±2.5°C相对密度为 1.35，趁热过滤，得丹参提取物。

实施例 4 丹参提取物的制备

使用如下步骤制备了丹参提取物：

(1)丹参药材加药材量 5倍量 75%乙醇，回流提取约 2小时，过滤得醇提液，药渣 A备用；

(2) 上述药渣 A加药材量 5倍量水，回流提取约 2小时，过滤，得水提液，药渣 B弃 (3) 步骤（1) 中的醇提液搅拌 30分钟，醇提液温度降至 15°C以下，静置 12小时吸取上清液得醇提上清液，步骤（2) 中的水提液搅拌 30分钟，水提液温度降至 15°C以下，静置 12小时，吸取上清液得水提上清液；

(4) 水提上清液浓缩至相对密度 1.20-1.30，得水提浓缩液；

(5)水提浓缩液逐步加入步骤（3) 醇提上清液，合并浓缩，减压浓缩至相对密度≥1.20，得混合浓缩液；

(6) 混合浓缩液分次加入 50L纯化水，每次加入 25L 纯化水，合并浓缩，减压浓缩至 82.5±2.5°C相对密度为 1.25-1.35，趁热过滤，得丹参提取物。

实施例 5 丹参提取物的制备

使用如下步骤制备了丹参提取物：

(2) 上述药渣 A加药材量 5倍量水，回流提取约 2小时，过滤，得水提液，药渣 B弃去；

(3) 步骤（1) 中的醇提液搅拌 30分钟，醇提液温度降至 15°C以下，静置 12小时吸取上清液得醇提上清液，步骤（2) 中的水提液搅拌 30分钟，水提液温度降至 15°C以下，静置 12小时，吸取上清液得水提上清液；

(4) 水提上清液浓缩至相对密度 1.20-1.30，得水提浓缩液；

实施例 6 丹参提取物的制备

丹参提取物：切制丹参：药材外观检査，称量，备用。

加入物料顺序：投料时先投切制丹参，一煎加入 90±0.5%乙醇、二煎加入一级 RO水作为提取溶媒进行提取。

提取：

一批次由 2罐组成，每罐均按批处方分别称取切制丹参 100kg,加 90±0.5%乙醇 400±12L，煎煮 90±5mm， 200 目过滤，两罐丹参醇提液合并放入静置罐中；药渣进行第二次提取，加水 500±15L，煎煮 60±3mm， 200 目过滤，药渣弃去，两罐丹参水提液合并放入不同静置罐中。

降温静置：

将丹参醇提混合液和丹参水混合提液分别置于不同静置罐中，静置罐通冷冻水降温静置，提取液搅拌 30分钟后，料液温度降至 15°C以下，静置 6-24小时，吸取丹参醇提上清液和丹参水提上清液放至各自储罐中。

浓缩：先浓缩丹参水提上清液至丹参水提浓缩液比重 1.25- 1.30 ( 82.5±2.5°C )之间；逐步加入丹参醇提上清液进一步合并浓缩，浓缩过程中浓缩液比重不得低于 1.15 ; 浓缩至丹参混合浓缩液比重≥1.34，分两次加入 10L纯化水，每次加 5L ( 45±5°C)，合并浓缩，浓缩至比重 1.33- 1.35 ( 82.5±2.5°C )，趁热过滤（40 目筛）得丹参提取物。

使用本发明所述的方法对实施例 1-6的丹参提取物进行成分检测，其结果列于表 3中：表 3 丹参提取物的成分检测

以下实施例 7- 11使用实施例 6的丹参提取物，应用下列条件制造丹参微丸：

原料：

丹参提取物 32.5kg

淀粉或聚乙二醇 6000基丸 16.0kg

欧巴代 85G66817 1.5kg

丹参提取物药液的配制：丹参提取物投入预混罐内，加入 0.7-0.9倍量的纯化水，搅拌 30 分钟以上，得到中药药液；

淀粉基丸载药：调试喷枪和雾化压力，使药液能够均匀雾化为细小液滴。

实施例 7 载药微丸的制备

基丸上料流化：设定风量 600m³/h，将基丸吸入到流化干燥包衣机内，使基丸在床体内完全流化；但不能剧烈流化造成基丸磨损起粉；

初期载药阶段：调试喷枪，使能够雾化良好，将中药药液通过计量泵输送到喷枪，分别设定上喷气和下喷气为 2.0Bar和 2.5Bar，设定物料温度 50°C左右，待物料温度升至 45°C后开始喷液，喷液速度设定 70g/mm _;

载药过程：物料温度 50°C，随丸径的增大，输液量逐步增加，输液速度最高不超过 400g/mm，风量根据微丸的流化状态进行调整；

包衣：载药结束后直接喷包衣液进行包衣，包衣初期设定物料温度 50°C，喷液速度 40g/mm，包衣 20分钟后可将喷液速度调整至 80g/mm，物料温度控制在 40°C，根据微丸的粘连情况调整输液速度，风量和物料温度；其中，中药药液是丹参提取物加水配制而成，丹参提取物与水的重量比为 100:90。

实施例 8 载药微丸的制备

基丸上料流化：设定风量 1500m³/h，将基丸吸入到流化干燥包衣机内，使基丸在床体内完全流化；

初期载药阶段：调试喷枪，使能够雾化良好，将中药药液通过计量泵输送到喷枪，分别设定上喷气和下喷气为 3.0Bar和 3.5Bar，设定物料温度 50°C左右，待物料温度升至 45°C后开始喷液，喷液速度设定 120g/mm_;

载药过程：物料温度 55°C，随丸径的增大，输液量逐步增加，输液速度最高不超过 400g/mm，风量根据微丸的流化状态进行调整；

包衣：载药结束后直接喷包衣液进行包衣，包衣初期设定物料温度 50°C，喷液速度 80g/mm，包衣 20分钟后可将喷液速度调整至 150g/mm，物料温度控制在 55°C，根据微丸的粘连情况调整输液速度，风量和物料温度；

其中，中药药液是丹参提取物加水配制而成，丹参提取物与水的重量比为 100:70。

实施例 9 载药微丸的制备

其中，中药提取物为丹参提取物，基丸为淀粉基丸，两者重量比例为 2: 1，中药药液是丹参提取物加水配制而成，丹参提取物与水的重量比为 100:82。

实施例 10 载药微丸的制备

基丸上料流化：设定风量 1500m³/h，将基丸吸入到流化干燥包衣机内，使基丸在床体内完全流化；但不能剧烈流化造成基丸磨损起粉；

初期载药阶段：喷枪使用 0.2mm的垫片，调试喷枪，使能够雾化良好，将中药药液通过计量泵输送到喷枪，分别设定上喷气和下喷气为 3.0Bar和 3.5Bar，设定物料温度 50°C左右，待物料温度升至 45°C后开始喷液，喷液速度设定 120g/mm;

载药过程：物料温度 55°C，随丸径的增大，输液量逐步增加，输液速度最高不超过 400g/mm，风量根据微丸的流化状态进行调整；包衣：载药结束后直接喷包衣液进行包衣，包衣初期设定物料温度 50°C，喷液速度 80g/mm，包衣 30分钟后可将喷液速度调整至 150g/mm，物料温度控制在 55°C，根据微丸的粘连情况调整输液速度，风量和物料温度；

其中，中药提取物为丹参提取物，基丸为蔗糖基丸，两者重量比例为 1 : 1，中药药液是丹参提取物加水配制而成，丹参提取物与水的重量比为 100:90。

实施例 11 丹参微丸胶囊的制备

丹参提取物药液的配制：丹参提取物投入预混罐内，加入 0.82倍重量的纯化水，搅拌 30 分钟以上，得到中药药液；

淀粉基丸载药：调试喷枪，使能够雾化良好；

上料流化：将淀粉基丸吸入流化干燥包衣机内，设定风量 1000m³/h，使基丸在床体内完全流化，但不能剧烈流化造成基丸磨损起粉；将预混提取物通过计量泵输送到喷枪，分别设定上喷气和下喷气为 2.5Bar和 3Bar_; 初期载药阶段，设定物料温度 50°C左右，待物料温度升至 45°C后开始喷液，喷液速度设定 120g/mm;

载药过程：物料温度 50°C，随丸径的增大，输液量逐步增加，输液速度最高不超过 400g/mm，风量根据微丸的流化状态进行调整；载药过程中，必要时从取样口取样观察微丸的粘连和起粉情况，并根据微丸的粘连和起粉情况调整输液速度，风量和物料温度；

包衣：取欧巴代 85G66817和纯化水，搅拌混匀，搅拌不少于 45分钟，得到 18%的包衣液备用；载药结束后直接喷包衣液进行包衣，包衣初期设定物料温度 50°C，喷液速度 80g/mm，包衣 20分钟后可将喷液速度调整至 100g/mm，物料温度控制在 50°C，根据微丸的粘连情况调整输液速度，风量和物料温度，包衣结束后，降温至 35°C，出料；

包衣丸筛选：将中间体包衣丸筛选，筛网网径为 1.8mm，筛下物为丹参微丸；筛选所得丹参微丸占比例不低于 90%;

胶囊填充：将筛选到的丹参微丸，用胶囊填充机填充胶囊，即得。

对于实施例 7-11中的微丸，按照如下方法测定其堆密度、比表面积和粒径：

本发明的粒径数值采用常规方法得到，例如采用中华人民共和国药典一部凡例计量项下第（7 ) 规定的标准药典筛，用筛分法测量粒径。

本发明的堆密度数值采用常规的粘度测定方法得到，例如采用 BT-1000型粉体综合特性测试仪（丹东百特仪器有限公司和清华大学粉体技术开发部联合研制），按照仪器要求测量颗粒的堆密度。

本发明的比表面积数值采用常规的测定方法得到，例如采用比表面积分析仪 SSA-3600(北京彼奥德电子技术有限公司），按照仪器要求测定微丸的比表面积。

测得的微丸相关参数见如下表 4。表 4 微丸的堆密度、比表面积和粒径

以下通过药效试验对本发明的丹参提取物的效果进行说明。

药效例 1 丹参提取物对小鼠耳廓微循环的影响

为了评价丹参提取物对微循环的影响，本实验通过正常小鼠耳廓微循环和肾上腺素致小鼠耳廓微循环障碍模型，考察丹参提取物对微循环的影响。实验中受试药物设 7、 14、 28g生药 /kg ( 2、 4、 8g浸膏 /kg ) 三个剂量组，连续灌胃给药 7 天，末次给药后采用微循环测定仪进行小鼠耳廓微循环血管的口径、流速测定。

(一）实验材料

1. 受试药物

实施例 6的丹参提取物，深褐色浸膏（lg浸膏相当于 3.5g生药）。

2. 阳性药

复方丹参滴丸， 27mg/丸，天士力制药集团股份有限公司。

3. 动物

3.1 种属、规格、来源

ICR小鼠，清洁级， 18-22g，雌雄各半，购自扬州大学比较医学中心，许可证号： SCXK (苏） 2012-0004。

3.2 词养条件

小鼠词养于独立送风笼具（IVC ) 中，空气洁净度 10000级，实验室温度 24±2°C; 相对湿度 60%-80%；每小时空气交换次数： 10-15次 /小时；光照周期： 12 (日） /12 (夜）小时。雌雄分开词养，每笼不超过 5只。

词料：鼠全价颗粒词料，购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，其质量均符合 GB 14924.1-2001 《实验动物配合词料通用质量标准》。

垫料：灭菌颗粒垫料，购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司。

饮水：饮用纯化水。

4. 主要试剂

盐酸肾上腺素注射液， lml: lmg，批号： 120915，上海禾丰制药有限公司。

乌拉坦（氨基甲酸乙酯）， 500g/瓶，分析纯，上海青析化工科技有限公司。 5. 主要仪器

BSA124S精密电子天平（0.1mg- 120g )，德国赛多利斯（sartorius ) ;

KD-160型电子秤，东莞百利达健康器材有限公司；

WXT-4彩色多部位循环显示仪，徐州恒达光学电子仪器有限公司。

(二）试验方法

1. 剂量设定依据

参照本品前期实验基础，在预实验基础上，正式试验中受试药物设 7、 14、 28g 生药 /kg ( 2、 4、 8g浸膏 /kg ) 三个剂量组。丹参提取物临床剂量为 10g生药 /人 /天，折算到小鼠等效剂量为 2g生药 /kg。因此本实验的三个剂量为临床等效剂量的 3.5、 7、 14倍。

阳性药复方丹参滴丸参考相关文献及历史实验结果，设 270mg ( 10丸） /kg—个剂量组。

2. 对正常小鼠耳廓微循环的影响

50只小鼠随机分为 5组，每组 10只，分别为空白对照组，丹参提取物 2、 4、 8浸膏 /kg 剂量组，复方丹参滴丸 270mg/kg组。各组分别灌胃给药，空白对照组给予等体积的蒸熘水，每日一次。给药第 6天晚上禁食过夜，不禁水。给药七天，腹腔注射乌拉坦（20%， 0.1ml/10g ) 麻醉小鼠，每鼠左耳用医用橡皮膏轻贴拔去耳廓毛，取侧卧位在观察板上，滴加液体石蜡后用小玻棒将耳背朝上贴在耳托展平。选择同一部位耳廓细静脉、毛细血管，通过微循环测定仪进行。分别于给药前及给药后 0.5h， 2h， 4h，观察测定不同组小鼠耳廓微循环血管的口径、流速的变化。

3. 对肾上腺素导致微循环障碍的影响

60只小鼠，随机分为 6组，每组 10只，分别为空白对照组，模型组，丹参提取物 2、 4、 8g浸膏 /kg剂量组，复方丹参滴丸 270mg/kg组。空白对照组，模型组均给予等体积的蒸熘水，每日一次。给药第 6天晚上禁食过夜，不禁水。给药七天，腹腔注射乌拉坦（20%， 0.1ml/10g ) 麻醉小鼠，每鼠左耳用医用橡皮膏轻贴拔去耳廓毛，取侧卧位在观察板上，滴加液体石蜡后用小玻棒将耳背朝上贴在耳托展平。选择同一部位耳廓细静脉、毛细血管，通过微循环测定仪进行。末次灌胃给药 30mm后除空白对照组外，余下 5组立即尾静脉注射肾上腺素 10(^g/kg，分别于给药前及肾上腺素给药后 5mm， 30mm， 120mm，观察测定不同组小鼠耳廓微循环血管的口径、流速的变化。

4. 统计学处理：

实验数据均以均数和标准差（M±SD ) 表示，组间比较进行 t检验。

(三）结果

1. 对正常小鼠耳廓微循环的影响

与同时间点正常组比较，丹参提取物高剂量组各时间点输入枝管径和输出枝管径均有明显增加（P<0.05， P<0.01 )，中剂量组给药后 2h内的输入枝管径和各时间点输出枝管径也有明显增加（P<0.05， P<0.01 )，低剂量组给药后 0.5h时输入枝管径和输出枝管径显著增加，和正常组相比有统计学差异（表 5，表 6 )。

与同时间点正常组比较，丹参提取物各剂量组在给药 0.5h时对耳廓微循环微血管流速有明显增加作用，和正常组相比具有显著性差异（表 7 )。

表 5 丹参提取物对正常小鼠耳廓微循环输入枝管径的影响（N=10， M±SD )

*P<0.05， * *P<0.01，与正常组相比。

*P<0.05， * *P<0.01 , 与正常组相比。

表 7 丹参提取物对正常小鼠耳廓微循环微血管流速的影响（N=10， M±SD )

*P<0.05，与正常组相比。

2. 对肾上腺素导致微循环障碍的影响

与正常动物相比，肾上腺素造模 30mm 内，小鼠耳廓微血管输入枝管径和输出枝管径均显著减小（P<0.05， P<0.01 )，血液流速有部分下降；造模 120mm时肾上腺素引起的微血管改变逐渐消退。

对于肾上腺素引起的输入枝管径和输出枝管径减小，丹参提取物各剂量组均有不同程度的改善作用（P<0.05， P<0.01 )，且对血液流速有一定的增加作用（表 8，表 9，表 10 )。表 8 丹参提取物对肾上腺素诱导小鼠耳廓微循环输入枝管径的影响（N=10， M±SD )

*P<0.05， **P<0.01，与正常组相比； #P<0.05， ##P<0.01，与模型组相比。

表 9 丹参提取物对肾上腺素诱导小鼠耳廓微循环输出枝管径的影响（N=10， M±SD )

*P<0.05， **P<0.01，与正常组相比； #P<0.05，与模型组相比

表 10 丹参提取物对肾上腺素诱导小鼠耳廓微循环血管流速的影响（N=10， M±SD )

P<0.05 , 与模型组相比

通过本试验例可以看出，对于正常小鼠，本发明的丹参提取物对于输入枝管径和输出枝管径均有明显增加作用，对耳廓微循环微血管流速也有一定的增加作用。

与正常动物相比，肾上腺素造模 30mm 内，小鼠耳廓微血管输入枝管径和输出枝管径均显著减小（P<0.05， P<0.01 )，血液流速有部分下降；造模 120mm时肾上腺素引起的微血管改变逐渐消退。对于肾上腺素引起的输入枝管径和输出枝管径减小，丹参提取物各剂量组均有不同程度的改善作用（P<0.05， P<0.01 )，而对血液流速影响较小。

综上可见，本发明的丹参提取物可明显促进小鼠耳廓微循环的毛细血管开放，进而改善微循环状态。

药效例 2 斑马鱼模型评价丹参提取物的降血脂药效

1. 试剂与仪器受试样品：实施例 6的丹参提取物，用超纯水配制成浓度为 200 mg/ml (浸膏）的储备液， -20°C保存。

实验仪器与试剂：解剖显微镜（SZX7， OlymPus公司）； 6孔板（Nest Biotech ) ; MESAB ( Sigma) ; Methyl cellulose ( Sigma) ;洛伐他汀（大连美仑生物技术有限公司，批号： 20111002，纯度 >99%，粉末状）；高脂肪食物（杭州环特专利产品）；油红 0 ( Oil Red , Sigma, 批号 20120411 )。

实验动物：斑马鱼胚胎的繁殖以自然成对交配的方式进行。每次交配准备 4-5 对成年斑马鱼，平均每对能产 200-300个胚胎。在受精后 6小时（即 6 hpf) 和 24 hpf对胚胎进行清理 (移除已死亡胚胎），并根据胚胎的发育阶段挑选合适的胚胎（Kmimel et al. 1995 )。在 28°C 条件下用养鱼用水孵育胚胎（养鱼用水水质：每 1L反渗透水中加入 200 mg速溶海盐，电导率为 480-510 S/cm; PH为 6.9-7.2; 硬度为 53.7-71.6 mg/L CaC0₃ )。因为胚胎可以从自身的卵黄囊中获取营养物质，所以在受精后 9 天内（9dPf) 不需要喂食。实验完成后，用三卡因甲磺酸对各个发育阶段的斑马鱼进行过度暴露处理，从而将斑马鱼麻醉处死。麻醉处死的操作步骤符合美国兽医协会（AVMA ) 对动物麻醉处死的规范要求。

2. 实验方法

A. 确定丹参提取物的最大非致死浓度（MNLC)

用高脂肪食物喂食 ALBINO品系斑马鱼幼鱼，诱发斑马鱼高血脂模型；

停止喂食后用丹参提取物处理高血脂模型斑马鱼，设置多个不同的浓度，每个浓度均处理 30尾斑马鱼；

丹参提取物的五个初始检测浓度分别为： 20(^g/ml、 40(^g/ml、 60(^g/ml、 80(^g/ml、 120(^g/ml和 200(^g/ml (用纯水配置）；

处理 48小时后，统计各实验组的斑马鱼死亡数量，使用 GraPhPad Pnsm5.0统计学软件绘制最佳的浓度效应曲线，并计算 MNLC;

B. 定量评价丹参提取物的降血脂效果

依据 A的实验结果，选取 3个浓度对丹参提取物的降血脂效果进行评价（通常为 MNLC、 1/3 MNLC和 1 0 MNLC ) , 每个浓度均处理 30尾斑马鱼；

停止喂食后用待测药物处理 48小时；

阳性对照组：洛伐他汀 ( lovastatin) , 0.08 g/ml;

待测药物处理结束后，用脂肪特异性染料对斑马鱼进行脂肪染色；

每组随机取 15尾斑马鱼在显微镜下观察斑马鱼尾部血液脂肪染色强度、拍照并保存图片；用 Image -Pro Plus 6.0图像分析软件进行图像分析，计算斑马鱼尾部血液脂肪染色信号强度（S ) , 进行定量分析，统计学处理结果用 ± SE表示；

丹参提取物的降血脂药效计算公式如下： _{l s (药物处理组) ]

血脂降低率（％) = S (模型组） _χ ι₀₀% ₍₁₎

用方差分析和 Dunnett's T-检验进行统计学分析， P<0.05表明具有显著性差异。

3. 实验结果

(1) 确定丹参提取物的 MNLC

丹参提取物诱发的斑马鱼死亡率见表 11。

根据表 11中的数据，用 GraPhPad5.0拟合浓度致死曲线（图 3)，经过曲线拟合，求得丹参提取物的 MNLC=540 g/ml (浸膏） =1890 g/ml (生药）。

表 11 丹参提取物诱发的斑马鱼死亡率（n=30)

(2) 定量评价丹参提取物的降血脂药效

根据浓度致死实验，丹参提取物选取三个浓度进行降血脂药效评价实验，三个浓度（生药折算）分别为： 1890 g/ml (MNLC)、 630 g/ml (1/3 MNLC) 和 189 g/ml ( l/10MNLC)o 丹参提取物处理后，对斑马鱼进行脂肪特异性染色，在显微镜下观察并拍照保存（图 4)。图 4 中以实线圈出的区域为血脂观察巨标区域。应用图像分析软件对斑马鱼血液脂肪染色强度进行定量分析，计算斑马鱼脂肪染色光密度总和（IOD) (表 12)。根据斑马鱼脂肪染色光密度总和，用公式（1) 计算斑马鱼血脂降低率（表 12，图 5)，评价丹参提取物的降血脂效果。 0.08 g/ml洛伐他汀（阳性对照组）处理的斑马鱼尾部脂肪染色强度组明显弱于模型组，降低率为 26.3% (P<0.01); 丹参提取物在 189 g/ml、 630 g/ml和 1890 g/ml浓度下均能显著性降低尾部血管中脂肪染色强度 (P<0.001， P<0.001， P<0.001)，血脂降低率分别为 32.7%、 35.2%和 36.2%。

表 12 丹参提取物处理 48小时后降血脂效果（meaniSE)

与模型组比较， *:P<0.01; **:P<0.001 由本药效实验可以看出，根据浓度致死实验，本发明的丹参提取物在 189 μ_§/ηιΚ 630 μ_§/ηι1 和 1890 μ_§/ηι1 浓度下均能显著性降低尾部血管中脂肪染色强度，血脂降低率分别为 32.7% (Ρ<0.001)、 35.2% (Ρ<0.001) 和 36.2% (Ρ<0.001 )，表明本发明的丹参提取物有降血脂的作用，且在 1/3MNLC浓度时药效接近平台期。

Claims

权利要求书

1. 一种丹参提取物，其特征在于，所述提取物包含下列重量比的组分：丹参素：迷迭香酸: 紫草酸:丹酚酸 B:隐丹参酮:丹参酮 II A:水苏糖 = (0.5-16) ： (0.5-15) ： (0.5-15) ： (5-140) ：

(0.5-25) ： (1-50) ： (150-600)；上述组分的重量比优选为 (1-8) ： (1-8) ： (1-8) ： (10-70) ： (1-10) ： (2-20) ： (250-500), 更优选为 (2-5) ： (2-5) ： (2-5) ： (25-60) ： (2-6) ： (4-10) ： (300-450)，进一步优选为 (2-4) ： (2-4) ： (2-4) ： (25-30) ： (2-5) ： (4-10) ： (330-400), 最优选为 3:3:3:28:4:7:370。

2. —种微丸制剂，其包含权利要求 1所述的丹参提取物作为活性成分；优选地，所述微丸堆密度为 0.6-1.3g/ml，比表面积 0.005-0.05m²/g，粒径为 0.5-1.8mm; 更优选地，所述的微丸堆密度为 0.8-1. lg/ml，比表面积 0.01-0.03m²/g，粒径为 0.7-1.2mm。

3. 一种丹参提取物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1) 丹参药材用醇提取，过滤得到醇提液，药渣 A备用；优选地，所述的醇为乙醇，其用量为药材用量 2-7倍重量，醇浓度为 50-100% (v/v)，提取时间 0.5-4小时；

(2) 药渣 A加水提取，过滤，得水提液，药渣 B弃去；优选地，加水量为药渣 A的 3-7 倍重量，提取时间 0.5-4小时；

(3) 醇提液、水提液分别降温静置，再分别吸取上清液为醇提上清液、水提上清液；优选地，所述的降温静置是将提取液搅拌 20-60分钟，料液温度降至 15°C以下静置 6-24小时吸取上清液；

(4) 水提上清液浓缩得水提浓缩液；优选地，将水提上清液浓缩至相对密度 1.10-1.35，获得所述水提浓缩液；

(6) 混合浓缩液中加入纯化水，混合均匀后浓缩，即得丹参提取物；优选地，向混合浓缩液中分次加入 10L-100L纯化水，每次加入 5-50L纯化水，合并浓缩，减压浓缩至 82.5±2.5°C 相对密度为 1.25-1.35收膏。

4. 如权利要求 3所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

取切制丹参，加 90±0.5%乙醇 400±12L，煎煮 90±5min， 200 目过滤，醇提液合并放入静置罐中；药渣进行第二次提取，加水 500±15L，煎煮 60±3mm， 200 目过滤，药渣弃去，水提液合并放入不同静置罐中；醇提混合液和水混合提液分别置于不同静置罐中，静置罐通冷冻水降温静置，提取液搅拌 30分钟后， 4小时内将提取液温度降至 15°C以下，静置 6-24小时，吸取醇提上清液和水提上清液放至各自储罐中；先浓缩水提上清液至水提浓缩液比重 1.25-1.30 (82.5±2.5°C) 之间；逐步加入醇提上清液进一步合并浓缩，浓缩过程中浓缩液比重不得低于 1.15; 浓缩至混合浓缩液比重≥1.34，分两次加入 10L纯化水，每次加 5L (45±5°C)，合并浓缩，浓缩至比重 1.33-1.35 (82.5±2.5°C)，趁热过滤（40 目筛）得丹参提取物。

5. 如权利要求 3或 4所述的方法，其特征在于，根据所述制备方法制得的丹参提取物包含下列重量比的组分：丹参素：迷迭香酸:紫草酸:丹酚酸 B:隐丹参酮:丹参酮 II A:水苏糖 = (0.5-16) ： (0.5-15) ： (0.5-15) ： (5-140) ： (0.5-25) ： ( 1-50) ： (150-600)；上述组分的重量比优选为 (1-8) ： (1-8) ： (1-8) ： (10-70) ： (1-10) ： (2-20) ： (250-500)，更优选为 (2-5) ： (2-5) ： (2-5) ： (25-60) ： (2-6) ： (4-10) ： (300-450)，进一步优选为 (2-4) ： (2-4) ： (2-4) ： (25-30) ： (2-5) ： (4-10) ： (330-400), 最优选为 3:3:3:28:4:7:370。

6. 一种包含丹参提取物的微丸制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1) 取重量比为 1:5至 5:1的丹参提取物：基丸备用；

7. 如权利要求 6所述的方法，其特征在于，在喷液完毕后，对载药微丸喷入包衣液进行包衣步骤（5)，包衣物料温度 40-60°C，喷液速度 40-300g/min，包衣时间 1-4小时，所述包衣液浓度为 5-25%。

8. 如权利要求 7所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(5)包衣：载药结束后直接喷包衣液进行包衣，包衣初期设定物料温度 50°C，喷液速度 80g/mm，包衣 20分钟后可将喷液速度调整至 80-150g/mm，物料温度控制在 40-55°C，根据微丸的粘连情况调整输液速度，风量和物料温度；

优选地，所述提取物药液是由所述丹参提取物加水配制而成，所述丹参提取物与水的重量比为 100:60-100，优选 100:70-90，更优选 100:75-85。

9. 如权利要求 6-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述微丸制剂为权利要求 2所述的微丸制剂。

10. 权利要求 1所述的丹参提取物或权利要求 2所述的微丸制剂在制备用于改善微循环或降血脂的药物方面的用途。