WO2014157705A1 - 改変グリシン酸化酵素 - Google Patents

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WO2014157705A1
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modified enzyme
substitution
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優哉 小玉
亘 星野
一敏 高橋
萌美 伊藤
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味の素株式会社
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    • G01N2333/90605—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • G01N2333/90633—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3) in general
    • G01N2333/90638—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3) in general with a definite EC number (1.4.3.-)

Definitions

  • the present invention relates to a modified glycine oxidase, a method for analyzing glycine using the same, and the like.
  • Amino acids are very important as components of living organisms, and it is known that some amino acids can serve as indicators of health status. For example, plasma glycine concentration has been suggested to be associated with obesity (Non-patent Document 1). In addition to being naturally contained in various foods, glycine is also used, for example, as a food additive. Therefore, measurement of amino acids, particularly glycine, has important significance in a wide range of fields such as biological research, health nutrition, medical care, and food production.
  • Non-Patent Document 5 As an enzyme that acts on glycine, glycine oxidase is known (for example, Non-Patent Document 5).
  • the enzyme properties eg, enzyme activity, stability, substrate specificity
  • the activity when the concentration of the detection target in the specimen is low, such as blood amino acids, the activity is required to be high under the low substrate concentration.
  • the use of glycine oxidase is promising for the analysis of glycine-containing specimens, but glycine oxidase, which has been known so far, has a low activity and stability (for example, Non-Patent Document 6). there were.
  • the substrate specificity has not been investigated for many types of amino acids. As described above, there is no enzyme that can be practically used for the measurement of glycine, and therefore, a practical glycine measurement method using an enzyme, a measurement kit, and a measurement biosensor have not been realized.
  • glycine concentration may be measured by using an enzyme having improved properties related to the measurement of glycine, and glycine having such properties improved.
  • the present inventors have succeeded in developing an oxidase and thus completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • the mutation is (a) a substitution of the first threonine in the TTS motif in the amino acid sequence of glycine oxidase, (b) a substitution of serine in the TTS motif, (c) a substitution of cysteine in the HCY motif, d) 1 selected from the group consisting of substitution of leucine in the LRP motif, (e) substitution of methionine in the GML motif, (f) substitution of serine in the SG motif, and (g) substitution of g
  • [3] The modified enzyme according to [2], wherein the first threonine in the TTS motif is substituted with alanine, serine, cysteine, or glycine.
  • [4] The modified enzyme according to [2] or [3], wherein serine in the TTS motif is substituted with lysine.
  • [5] The modified enzyme according to any one of [2] to [4], wherein cysteine in the HCY motif is substituted with alanine, aspartic acid, glycine, histidine, asparagine, tryptophan, tyrosine, or serine.
  • [6] The modified enzyme according to any one of [2] to [5], wherein leucine in the LRP motif is substituted with isoleucine, valine, cysteine, threonine, or proline.
  • [7] The modified enzyme according to any one of [2] to [6], wherein methionine in the GML motif is substituted with isoleucine.
  • [8] The modified enzyme according to any one of [2] to [7], wherein serine in the SG motif is substituted with arginine.
  • [9] The modified enzyme according to any one of [2] to [8], wherein glycine in the PGT motif is substituted with tyrosine or glutamine.
  • a protein comprising an amino acid sequence having an additional mutation and having at least one property selected from the group consisting of the following (a) to (c): (A) the activity of glycine oxidase on glycine; (B) thermal stability of glycine oxidase; and (c) substrate specificity of glycine oxidase for glycine.
  • [12] A method for analyzing glycine, comprising measuring glycine contained in a test sample using the modified enzyme according to any one of [1] to [11]. [13] The method according to [12], wherein the measurement of glycine is performed using 4-aminoantipyrine, phenol, and peroxidase in addition to any of the modified enzymes of [1] to [11]. [14] A method for producing glyoxylic acid, comprising producing glyoxylic acid from glycine using the modified enzyme according to any one of [1] to [11]. [15] A polynucleotide encoding the modified enzyme according to any one of [1] to [11]. [16] An expression vector comprising the polynucleotide of [15].
  • a transformant comprising the expression vector according to [16]. [18] using the transformant of [17], producing a modified enzyme in which at least one amino acid residue is mutated so as to improve the properties of glycine oxidase related to measurement of glycine.
  • a method for producing a modified enzyme [19] A glycine analysis kit comprising the modified enzyme according to any one of [1] to [11]. [20] The glycine analysis kit according to [19], further comprising at least one of a reaction buffer or buffer salt, a hydrogen peroxide detection reagent, an ammonia detection reagent, and a glyoxylic acid detection reagent.
  • a detection system for glycine analysis comprising (a) the device and (b) the modified enzyme according to any one of [1] to [11].
  • the device further comprises at least one of a reaction buffer or buffer salt, a hydrogen peroxide detection reagent, an ammonia detection reagent, and a glyoxylic acid detection reagent, and the device is a microchannel chip Detection system for glycine analysis.
  • An enzyme sensor for glycine analysis comprising: (a) a detection electrode; and (b) a modified enzyme according to any one of [1] to [11] fixed or arranged on the detection electrode.
  • the modified enzyme of the present invention Since the modified enzyme of the present invention has improved activity against glycine, it is useful for rapid and sensitive measurement of glycine and / or production of glyoxylic acid.
  • the modified enzyme of the present invention is also excellent in stability because it is excellent in thermal stability in an aqueous solution. Therefore, the modified enzyme of the present invention is particularly useful as a liquid reagent. Furthermore, since the modified enzyme of the present invention is excellent in substrate specificity for glycine, glycine can be specifically measured.
  • the analysis method of the present invention is useful in a wide range of fields such as biological research, health nutrition, medical care, and food production.
  • FIG. 1 shows the substrate specificity of wild-type glycine oxidase for glycine.
  • Gly 1 mM Gly;
  • 25mix a mixture containing 1 mM each of 20 types of standard amino acids, cystine, taurine, citrulline, ornithine and ⁇ -aminobutyric acid;
  • 25mix-Gly 25 of (2) What removes Gly from the mixed liquid of the kind (the same applies hereinafter).
  • FIG. 2 is a diagram showing the substrate specificity of a mutant glycine oxidase (T42A / C245S / L301V) for glycine.
  • T42A / C245S / L301V mutant glycine oxidase
  • FIG. 3 is a diagram showing the substrate specificity of a mutant glycine oxidase (T42A / C245S / L301V / G304Q) for glycine.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between the absorbance obtained by the endpoint method using a mutant glycine oxidase (T42A / C245S / L301V) and the Gly concentration in the reaction system.
  • FIG. 5 is a graph showing the relationship between the absorbance obtained by the endpoint method using a mutant glycine oxidase (T42A / C245S / L301V / G304Q) and the Gly concentration in the reaction system.
  • the present invention provides a modified enzyme.
  • the modified enzyme of the present invention may be one in which at least one amino acid residue has been mutated to improve the properties of glycine oxidase associated with the measurement of glycine.
  • amino acid residue mutations include substitution, deletion, addition and insertion, and substitution is preferred.
  • the amino acid residues to be mutated are natural L- ⁇ -amino acids L-alanine (A), L-asparagine (N), L-cysteine (C), L-glutamine (Q), L-isoleucine ( I), L-leucine (L), L-methionine (M), L-phenylalanine (F), L-proline (P), L-serine (S), L-threonine (T), L-tryptophan (W ), L-tyrosine (Y), L-valine (V), L-aspartic acid (D), L-glutamic acid (E), L-arginine (R), L-histidine (H), or L-lysine ( K) or glycine (G).
  • L and ⁇ may be omitted in the description of amino acids.
  • Glycine oxidase (sometimes referred to as glyoxidase: GlyOX) is an oxidoreductase that catalyzes the following reaction (EC 1.2.3.19). Glycine + H 2 O + O 2 ⁇ glyoxylic acid + NH 3 + H 2 O 2
  • glycine oxidase from which the modified enzyme of the present invention is derived for example, an enzyme derived from any organism (eg, microorganisms such as bacteria, actinomycetes and fungi, and insects, fish, animals, and plants) is used. Examples thereof include microorganisms belonging to the genus Bacillus and enzymes derived from organisms belonging to this related genus. Examples of related genera of the genus Bacillus include the genus Geobacillus, the genus Paenibacillus, and the genus Oceanobacillus. These closely related genera of the genus Bacillus, like the genus Bacillus, belong to the family Bacillaceae.
  • microorganisms belonging to the genus Bacillus and related genera include, for example, Bacillus aerophilus, Bacillus cereus, Bacillus macauensis, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus guessio s. (Geobacillus stearothermophilus), Geobacillus Kausutofirasu (Geobacillus kaustophilus) and the like.
  • the position where the mutation is introduced in glycine oxidase is preferably an amino acid residue near the active center of glycine oxidase.
  • Concerning glycine oxidase derived from Bacillus subtilis analysis results of the three-dimensional structure have been reported (for example, see PDB ID: 1NG3, 1NG4, 1RYI, 3IF9). Since those skilled in the art can align the amino acid sequence of glycine oxidase derived from Bacillus subtilis with the amino acid sequence of other glycine oxidase, glycine oxidase derived from organisms other than Bacillus subtilis An amino acid residue near the active center can be easily identified.
  • the mutation that improves the properties of glycine oxidase associated with the measurement of glycine is a substitution of the first threonine (T) and / or serine (S) in the TTS motif of the amino acid sequence of wild-type glycine oxidase.
  • the TTS motif is composed of three consecutive amino acid residues of threonine (T) -threonine (T) -serine (S).
  • the C-terminal threonine residue of the TTS motif may be referred to as a first threonine, and the central threonine residue of the TTS motif may be referred to as a second threonine.
  • the position of the TTS motif in the amino acid sequence of wild-type glycine oxidase may vary depending on the origin of the enzyme, those skilled in the art can appropriately determine the position of the TTS motif in the amino acid sequence of wild-type glycine oxidase.
  • the positions of the first threonine (T) and serine (S) should be specified.
  • the TTS motif is in the amino acid region at positions 42 to 44, the first threonine (T) is at position 42, and the serine (S) is at position 44 (eg, Tables). 1).
  • the mutation that improves the properties of glycine oxidase associated with measurement of glycine is a substitution of cysteine (C) in the HCY motif of the amino acid sequence of wild-type glycine oxidase.
  • the HCY motif is composed of three consecutive amino acid residues of histidine (H) -cysteine (C) -tyrosine (Y).
  • the HCY motif is in the amino acid region at positions 244 to 252 and cysteine (C) is at positions 245 to 251 (eg, see Table 2).
  • the modified enzyme of the present invention is a mutation that improves the properties of glycine oxidase related to measurement of glycine, in addition to the substitution of cysteine (C) in the HCY motif, in addition to the substitution of the first threonine (T) in the TTS motif. You may further have the said substitution.
  • the mutation that improves the properties of glycine oxidase associated with the measurement of glycine is a substitution of leucine (L) in the LRP motif of the amino acid sequence of wild-type glycine oxidase.
  • the LRP motif is composed of three consecutive amino acid residues of leucine (L) -arginine (R) -proline (P).
  • the position of the LRP motif in the amino acid sequence of wild-type glycine oxidase may vary depending on the origin of the enzyme, but those skilled in the art can appropriately determine the position of the LRP motif in the amino acid sequence of wild-type glycine oxidase.
  • the position of power leucine (L) can be specified.
  • the LRP motif is in the amino acid region at positions 294 to 316, and leucine (L) is at positions 294 to 314 (eg, see Table 3).
  • the modified enzyme of the present invention is a mutation that improves the properties of glycine oxidase related to the measurement of glycine, in addition to substitution of leucine (L) in the LRP motif, in addition to the substitution of the first threonine (T) in the TTS motif. It may further have the above substitution and / or the above substitution of cysteine (C) in the HCY motif.
  • the mutation that improves the properties of glycine oxidase associated with the measurement of glycine is a substitution of methionine (M) in the GML motif of the amino acid sequence of wild-type glycine oxidase.
  • the GML motif is composed of three consecutive amino acid residues of glycine (G) -methionine (M) -leucine (L).
  • G glycine
  • M methionine
  • L leucine
  • the position of the GML motif in the amino acid sequence of the wild-type glycine oxidase may vary depending on the origin of the enzyme, but those skilled in the art can substitute the GML motif in the amino acid sequence of the wild-type glycine oxidase, as appropriate.
  • the position of power methionine (M) can be specified.
  • the GML motif is in the amino acid region at positions 45 to 59, and methionine (M) is at positions 46 to 58 (eg, see Table 4).
  • the modified enzyme of the present invention comprises a first threonine (T) in the TTS motif as well as a substitution of methionine (M) in the GML motif as a mutation that improves the properties of glycine oxidase associated with the measurement of glycine. It may further have the above substitution of serine (S) and / or the above substitution of cysteine (C) in the HCY motif and / or the above substitution of leucine (L) in the LRP motif.
  • the mutation that improves the properties of glycine oxidase associated with the measurement of glycine is a substitution of serine (S) in the SG motif of the amino acid sequence of wild-type glycine oxidase.
  • the SG motif is composed of two consecutive amino acid residues of serine (S) -glycine (G).
  • the position of the SG motif in the amino acid sequence of the wild-type glycine oxidase may vary depending on the origin of the enzyme, but those skilled in the art can appropriately determine the position of the SG motif in the amino acid sequence of the wild-type glycine oxidase.
  • the position of power serine (S) can be specified.
  • the SG motif is in the amino acid region at positions 190 to 204, and serine (S) is at positions 190 to 203 (eg, see Table 5).
  • the modified enzyme of the present invention comprises a first threonine (T) in the TTS motif as well as a substitution of serine (S) in the SG motif as a mutation that improves the properties of glycine oxidase associated with the measurement of glycine.
  • the mutation that improves the properties of glycine oxidase associated with the measurement of glycine is a substitution of glycine (G) in the PGT motif of the amino acid sequence of wild-type glycine oxidase.
  • the PGT motif is composed of three consecutive amino acid residues of proline (P) -glycine (G) -threonine (T).
  • P proline
  • G G
  • T threonine
  • the position of the PGT motif in the amino acid sequence of the wild-type glycine oxidase may vary depending on the origin of the enzyme, a person skilled in the art can appropriately determine the position of the PGT motif in the amino acid sequence of the wild-type glycine oxidase.
  • the position of power glycine (G) can be specified.
  • the PGT motif is in the amino acid region at positions 303 to 317, and glycine (G) is at positions 304 to 316 (see, for example, Table 6).
  • the modified enzyme of the present invention comprises a first threonine (T) in the TTS motif as well as a substitution of glycine (G) in the PGT motif as a mutation that improves the properties of glycine oxidase associated with the measurement of glycine.
  • the modified enzyme of the present invention can be prepared by introducing a mutation into a wild-type enzyme having one or more motifs selected from the six motifs described above.
  • the wild-type enzyme may have two motifs selected from the six motifs described above, may have three motifs, may have four motifs, or may have five motifs. It may have and may have six motifs.
  • glycine oxidase that are relevant to the measurement of glycine include the following: (A) the activity of glycine oxidase on glycine; (B) thermal stability of glycine oxidase; and (c) substrate specificity of glycine oxidase for glycine.
  • the modified enzyme of the present invention may have only one of the above-described characteristics, but may have two or three of the above-described characteristics.
  • a mutation that improves at least one characteristic selected from the characteristics (a) to (c) includes, for example, alanine Examples include substitution to (A), serine (S), cysteine (C), or glycine (G).
  • serine (S) in the TTS motif as a mutation that improves at least one characteristic selected from characteristics (a) to (c) (single mutation or a combination with other mutations), for example, lysine (K) The substitution to is mentioned.
  • cysteine (C) in the HCY motif as a mutation that improves at least one characteristic selected from the characteristics (a) to (c) (single mutation or a combination with other mutations), for example, alanine (A) , Aspartic acid (D), glycine (G), histidine (H), asparagine (N), tryptophan (W), tyrosine (Y), or serine (S).
  • A Aspartic acid
  • G glycine
  • H histidine
  • asparagine N
  • W tryptophan
  • Y tyrosine
  • S serine
  • a mutation that improves at least one characteristic selected from the characteristics (a) to (c) includes, for example, isoleucine (I) , Valine (V), cysteine (C), threonine (T), or proline (P).
  • methionine (M) in the GML motif as a mutation that improves at least one characteristic selected from characteristics (a) to (c) (single mutation or a combination with other mutations), for example, isoleucine (I) The substitution to is mentioned.
  • serine (S) in the SG motif as a mutation that improves at least one characteristic selected from characteristics (a) to (c) (single mutation or a combination with other mutations), for example, arginine (R) The substitution to is mentioned.
  • a mutation that improves at least one characteristic selected from the characteristics (a) to (c) includes, for example, tyrosine (Y) Or substitution with glutamine (Q).
  • the activity of glycine oxidase on glycine is improved as a property of glycine oxidase related to the measurement of glycine.
  • the improvement of the activity of glycine oxidase with respect to glycine means that the activity of the modified enzyme with respect to glycine is improved as compared with that of the wild type enzyme.
  • the improvement of the activity of glycine oxidase with respect to glycine is determined when the activity of wild-type glycine oxidase with respect to glycine at a predetermined concentration (eg, either low concentration or high concentration) is defined as 100.
  • the degree of improvement of the activity of the modified enzyme with respect to the wild-type enzyme is preferably 1.3 times or more, more preferably 1.5 times or more, still more preferably 1.7 times or more, It is particularly preferable that the number is twice or more.
  • the modification of the modified enzyme of the present invention in which the degree of improvement in the activity of the modified enzyme with respect to the wild-type enzyme is 1.3 times or more is, for example, 1)
  • Substitution suitable for improving activity 1-1) Amino acid residues after substitution of the first threonine (T) in the TTS motif Alanine (A), Serine (S), Cysteine (C), or Glycine ( G) 1-2) Amino acid residue after substitution of serine (S) in TTS motif Lysine (K) 1-3) Amino acid residue after substitution of cysteine (C) in HCY motif Serine (S) 1-4) Amino acid residue after substitution of leucine (L) in the LRP motif Isoleucine (I), valine (V), cysteine (C), or threonine (T) 1-5) Regarding the glycine (G) in the PGT motif, as a mutation that improves at least one characteristic selected from the characteristics (a) to (c) (single mutation or a combination with other mutations), for example, Substitution with glutamine (Q) is mentioned.
  • the thermal stability of glycine oxidase is improved as a property of glycine oxidase related to the measurement of glycine.
  • Improvement of the thermal stability of glycine oxidase means that the thermal stability of the modified enzyme is further improved compared to that of the wild-type enzyme.
  • the improvement of the thermal stability of glycine oxidase can be achieved by a predetermined time (eg, 1 hour) in an aqueous solution under a predetermined high temperature (eg, a temperature of 40 ° C., 50 ° C. or 60 ° C.). It can be achieved when the modified enzyme has a residual activity greater than that of the wild-type enzyme when treated.
  • the thermal stability test of glycine oxidase in an aqueous solution can have significance as an accelerated test for evaluating the stability (particularly liquid stability) of glycine oxidase. Therefore, when the thermal stability of the modified enzyme in the aqueous solution is high, the stability (particularly liquid stability) of the modified enzyme tends to be high. Since an enzyme having high liquid stability can be stored in a liquid state for a long time, such a modified enzyme is useful for measuring glycine as a liquid reagent.
  • the degree of improvement in the thermal stability of the modified enzyme relative to the wild-type enzyme is preferably 1.1 times or more, and more preferably 1.2 times or more.
  • the modification of the modified enzyme of the present invention in which the degree of improvement of the thermal stability of the modified enzyme relative to the wild-type enzyme is 1.1 times or more is, for example, 2) Cysteine in the HCY motif suitable for improving the thermal stability Substitution with the following amino acid residues in (C) may be used.
  • the substrate specificity of glycine oxidase for glycine is improved as a property of glycine oxidase related to the measurement of glycine.
  • Improvement of the substrate specificity of glycine oxidase for glycine means that the reactivity of the modified enzyme for glycine is improved compared to that of the wild-type enzyme. In other words, it means that the reactivity of the modified enzyme with respect to amino acids other than glycine decreases. Examples of amino acids other than glycine include L- ⁇ -amino acids other than glycine.
  • L- ⁇ -amino acids other than glycine examples include 19 L- ⁇ -amino acids other than glycine, and cystine, taurine, citrulline, ornithine and ⁇ -aminobutyric acid that constitute proteins. It is done.
  • the mutation of the modified enzyme of the present invention in which the substrate specificity of glycine oxidase for glycine is improved is, for example, 3) the following amino acid of the first threonine (T) in the TTS motif, which is suitable for improving the substrate specificity: Substitution to a residue, substitution of cysteine (C) in the HCY motif to the following amino acid residue, substitution of leucine (L) in the LRP motif to the following amino acid residue, or a combination of these substitutions: Also good.
  • the modified enzyme of the present invention may also have other peptide components (eg, tag portion) at the C-terminus or N-terminus.
  • Other peptide components that can be added to the modified enzyme of the present invention include, for example, peptide components that facilitate purification of the target protein (eg, tag portions such as histidine tag, Strep-tag II; glutathione-S-transferase, maltose, etc. Proteins commonly used for purification of target proteins such as binding proteins), peptide components that improve the solubility of target proteins (eg, Nus-tag), peptide components that function as chaperones (eg, trigger factors), proteins with other functions Or the peptide component as a linker connecting protein domains or them may be mentioned.
  • the modified enzyme of the present invention has an additional mutation (eg, substitution, deletion, insertion) of one or several amino acid residues with respect to the amino acid sequence of the glycine oxidase having the mutation as long as the above-described properties are maintained. And addition).
  • the number of additional mutations is, for example, 1 to 100, preferably 1 to 50, more preferably 1 to 40, still more preferably 1 to 30, most preferably 1 to 20 or 1 to 10 (eg 1, 2, 3, 4 or 5).
  • Those skilled in the art can appropriately produce such a modified enzyme having the above-mentioned characteristics.
  • the degree of improvement of the activity of the modified enzyme relative to the wild-type enzyme is preferably 1.3 times or more, more preferably 1.5 times or more. It is even more preferably 7 times or more, and particularly preferably 2 times or more.
  • the degree of improvement in the thermal stability of the modified enzyme relative to the wild-type enzyme is preferably 1.1 times or more, more preferably 1.2 times or more. preferable.
  • the modified enzyme of the present invention may be the following (i) or (ii): (I) in the amino acid sequence of glycine oxidase, the first threonine in the TTS motif, the serine in the TTS motif, the cysteine in the HCY motif, the leucine in the LRP motif, the methionine in the GML motif, the serine in the SG motif, And an amino acid sequence in which one or more amino acid residues selected from the group consisting of glycine in the PGT motif are mutated (eg, substituted), and the properties of glycine oxidase related to the measurement of glycine are improved.
  • a protein or (ii) a first threonine in the TTS motif, a serine in the TTS motif, a cysteine in the HCY motif, a leucine in the LRP motif, a methionine in the GML motif, an SG motif in the amino acid sequence of glycine oxidase Serine and PGT motif
  • the modified enzyme of the present invention has an amino acid sequence having at least 90% or more amino acid sequence identity with the amino acid sequence of the (wild-type) glycine oxidase before the mutation by having both the mutation and the additional mutation described above. It may be included.
  • the percent amino acid sequence identity may preferably be 92% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, and most preferably 98% or more or 99% or more.
  • an amino acid residue into which an additional mutation can be introduced in an amino acid sequence is obvious to those skilled in the art.
  • the additional mutation can be introduced with reference to the alignment of the amino acid sequence.
  • a person skilled in the art compares 1) the amino acid sequences of a plurality of homologs (eg, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequences of other homologs), and 2) is relatively conserved. Region, and relatively unconserved region, and then 3) regions that can play an important role in function from the relatively conserved region and the relatively unconserved region, respectively Since it is possible to predict areas that cannot play an important role in function, it is possible to recognize the correlation between structure and function.
  • the sites where additional mutations are introduced are the first threonine in the TTS motif, serine in the TTS motif, cysteine in the HCY motif, leucine in the LRP motif, methionine in the GML motif, serine in the SG motif, and PGT An amino acid residue other than glycine in the motif, preferably an amino acid residue other than the amino acid residues in the TTS motif, TTS motif, HCY motif, LRP motif, GML motif, SG motif, and PGT motif Good.
  • substitution of an amino acid residue may be a conservative substitution.
  • conservative substitution refers to substitution of a given amino acid residue with an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues with similar side chains are well known in the art.
  • such families include amino acids having basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), amino acids having acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), amino acids having uncharged polar side chains (Eg, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), amino acids with non-polar side chains (eg, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), ⁇ -branched side chain Amino acids (eg, threonine, valine, isoleucine), amino acids having aromatic side chains (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine), amino acids having side groups containing hydroxyl groups (eg, alcoholic, phenolic) ( Example, serine, thread Nin, tyrosine), and amino acids (e.g.
  • the conservative substitution of amino acids is a substitution between aspartic acid and glutamic acid, a substitution between arginine and lysine and histidine, a substitution between tryptophan and phenylalanine, and between phenylalanine and valine. Or a substitution between leucine, isoleucine and alanine, and a substitution between glycine and alanine.
  • the modified enzyme of the present invention can be prepared using the transformant of the present invention that expresses the modified enzyme of the present invention, or using a cell-free system or the like.
  • the transformant of the present invention can be prepared, for example, by preparing the expression vector of the present invention and then introducing this expression vector into a host.
  • the expression vector of the present invention includes the polynucleotide of the present invention (eg, DNA, RNA) encoding the modified enzyme of the present invention.
  • the expression vector of the present invention further comprises a region such as a region encoding a promoter, terminator and drug (eg, tetracycline, ampicillin, kanamycin, hygromycin, phosphinothricin) resistance gene.
  • drug eg, tetracycline, ampicillin, kanamycin, hygromycin, phosphinothricin
  • the expression vector of the present invention may be a plasmid or an integrative vector.
  • the expression vector of the present invention may be a viral vector or a cell-free vector.
  • the expression vector of the present invention may further contain a polynucleotide encoding another peptide component that can be added to the modified enzyme of the present invention at the 3 'or 5' terminal side of the polynucleotide of the present invention.
  • the polynucleotide encoding another peptide component include a polynucleotide encoding a peptide component that facilitates purification of the target protein as described above, and a peptide component that improves the solubility of the target protein as described above.
  • polynucleotide examples include a polynucleotide encoding a peptide component that functions as a chaperone, and a polynucleotide encoding a protein component having another function, a domain of the protein, or a peptide component as a linker connecting them.
  • Various expression vectors containing polynucleotides encoding other peptide components are available. Therefore, such an expression vector may be used for preparing the expression vector of the present invention.
  • an expression vector containing a polynucleotide encoding a peptide component that facilitates purification of the target protein, a peptide component that improves the solubility of the target protein
  • Expression vector containing a polynucleotide encoding a protein eg, pET-50b
  • an expression vector containing a polynucleotide encoding a peptide component that acts as a chaperone eg, pCold TF
  • a protein having another function or a domain of a protein eg. pCold TF
  • the expression vector of the present invention encodes the region encoding the cleavage site by the protease into the region encoding the modified enzyme of the present invention. Between the polynucleotide to be encoded and the polynucleotide encoding the other peptide component.
  • Examples of the host for expressing the modified enzyme of the present invention include Escherichia bacteria such as Escherichia coli, Corynebacterium bacteria (eg, Corynebacterium glutamicum), and Bacillus genus.
  • Escherichia bacteria such as Escherichia coli, Corynebacterium bacteria (eg, Corynebacterium glutamicum), and Bacillus genus.
  • Various prokaryotic cells including bacteria (eg, Bacillus subtilis), bacteria belonging to the genus Saccharomyces (eg, Saccharomyces cerevisiae), bacteria belonging to the genus Pichia (eg, Pichia stipitis) , Including bacteria of the genus Aspergillus (eg, Aspergillus oryzae) Can be used s eukaryotic cells.
  • a strain lacking a predetermined gene may be used.
  • the transformant include a transformant having an expression vector in the cytoplasm, and
  • the transformant of the present invention can be cultured in a medium having the composition described below, for example, using a predetermined culture apparatus (eg, test tube, flask, jar fermenter).
  • the culture conditions can be set as appropriate.
  • the culture temperature may be 10 ° C. to 37 ° C.
  • the pH may be 6.5 to 7.5
  • the culture time may be 1 h to 100 h.
  • the dissolved oxygen concentration (DO value) in the culture solution may be used as a control index. Control the aeration / stirring conditions so that the relative dissolved oxygen concentration DO value when the oxygen concentration in the atmosphere is 21% does not fall below 1-10%, for example, preferably 3-8%.
  • the culture may be batch culture or fed-batch culture.
  • a solution serving as a sugar source or a solution containing phosphoric acid can be added continuously or discontinuously to the culture solution to continue the culture.
  • the host to be transformed is as described above, but in detail about E. coli, it can be selected from Escherichia coli JM109 strain, DH5 ⁇ strain, HB101 strain, BL21 (DE3) strain, etc. Methods for performing transformation and methods for selecting transformants are also described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor press (2001/01/15) and the like. Hereinafter, a method for producing transformed E. coli and producing a predetermined enzyme using the same will be described more specifically as an example.
  • E. promoters used for heterologous protein production in E. coli can be used, such as PhoA, PhoC, T7 promoter, lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, T5 promoter, etc.
  • a strong promoter is mentioned, and PhoA, PhoC, and lac are preferable.
  • the vector examples include pUC (eg, pUC19, pUC18), pSTV, pBR (eg, pBR322), pHSG (eg, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398), RSF (eg, RSF1010), pACYC (eg, pACYC177, pACYC184), pMW (eg, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218), pQE (eg, pQE30), and derivatives thereof may be used.
  • phage DNA vectors may be used.
  • an expression vector containing a promoter and capable of expressing the inserted DNA sequence may be used.
  • the vector may be pUC, pSTV, pMW.
  • a terminator that is a transcription termination sequence may be linked downstream of the polynucleotide of the present invention.
  • examples of such terminators include T7 terminator, fd phage terminator, T4 terminator, tetracycline resistance gene terminator, and E. coli trpA gene terminator.
  • a so-called multicopy type is preferable, and a plasmid having a replication origin derived from ColE1, such as a pUC-type plasmid, a pBR322-type plasmid, or a derivative thereof can be mentioned. It is done.
  • the “derivative” means one obtained by modifying a plasmid by base substitution, deletion, insertion and / or addition.
  • the vector has a marker such as an ampicillin resistance gene in order to select transformants.
  • a marker such as an ampicillin resistance gene
  • an expression vector having a strong promoter is commercially available [eg, pUC system (manufactured by Takara Bio Inc.), pPROK system (manufactured by Clontech), pKK233-2 (manufactured by Clontech)].
  • the modified enzyme of the present invention can be obtained by transforming E. coli with the obtained expression vector of the present invention and culturing the E. coli.
  • the medium a medium usually used for culturing Escherichia coli such as M9-casamino acid medium and LB medium may be used.
  • the culture medium may contain a predetermined carbon source, nitrogen source, and coenzyme (eg, pyridoxine hydrochloride).
  • coenzyme eg, pyridoxine hydrochloride
  • peptone, yeast extract, NaCl, glucose, MgSO 4 , ammonium sulfate, potassium dihydrogen phosphate, ferric sulfate, manganese sulfate, and the like may be used.
  • Culture conditions and production induction conditions are appropriately selected according to the type of the vector marker, promoter, host fungus and the like used.
  • the modified enzyme of the present invention is disrupted (eg, sonication, homogenization) or lysed (eg, lysozyme treatment) to obtain a crushed product and a lysate.
  • the modified enzyme of the present invention can be obtained by subjecting such crushed material and lysate to techniques such as extraction, precipitation, filtration, and column chromatography.
  • the present invention provides a method for analyzing glycine.
  • the analysis method of the present invention can include measuring glycine contained in a test sample using the modified enzyme of the present invention.
  • the test sample is not particularly limited as long as it is a sample suspected of containing glycine.
  • biological samples eg, blood, urine, saliva, tears, etc.
  • food and beverage products eg, nutrition drinks and amino acid drinks
  • Etc. The glycine in the test sample may be at a low concentration (eg, a concentration of less than 1 mM such as 1 ⁇ M or more and less than 1 mM) or a high concentration (eg, a concentration of 1 mM or more such as 1 mM or more but less than 1 M).
  • the analysis method of the present invention is not particularly limited as long as glycine can be measured using the modified enzyme of the present invention.
  • the generated glyoxylic acid may be detected, and NH 3 produced as a by-product with the production of glyoxylic acid or H 2 O 2 may be detected.
  • the product of the conjugation reaction may be detected by conjugation with another reaction. Examples of such a conjugation reaction include the following conjugation reactions.
  • glycine can be measured using 4-aminoantipyrine, phenol, and peroxidase in addition to the modified enzyme of the present invention. Specifically, a test sample is mixed with 4-aminoantipyrine (4-aminoantipyrine) and phenol and peroxidase in an aqueous solution (eg, a buffer solution), and then the mixed sample is subjected to the enzyme reaction described above. In addition, glycine is measured by detecting the absorbance (about 500 nm) of the produced quinoneimine dye. Measurements can be made qualitatively or quantitatively.
  • the measurement may be performed, for example, based on an endpoint method in which measurement is performed until all the substrates have reacted, or may be performed based on a rate method (initial velocity method).
  • a rate method initial velocity method
  • the modified enzyme of the present invention does not react with amino acids other than glycine (eg, L- ⁇ -amino acid) or has very low reactivity with it. Therefore, even when not only glycine but also other amino acids are contained in the test sample, the amount of glycine in the test sample can be specifically evaluated by using the modified enzyme of the present invention. .
  • amino acids other than glycine eg, L- ⁇ -amino acid
  • the amount of glycine in the test sample can be specifically evaluated.
  • the present invention includes (A) a glycine analysis kit containing the modified enzyme of the present invention.
  • the kit of the present invention may further comprise at least one of (B) a reaction buffer or buffer salt, (C) a hydrogen peroxide detection reagent, (D) an ammonia detection reagent, and (E) a glyoxylic acid detection reagent. .
  • reaction buffer or buffer salt is used to maintain the pH of the reaction solution at a value suitable for the target enzyme reaction.
  • the hydrogen peroxide detection reagent is used when hydrogen peroxide is detected by, for example, color development or fluorescence.
  • a combination of a peroxidase and a color former that can serve as a substrate thereof can be mentioned, and specific examples include, for example, a combination of horseradish peroxidase, 4-aminoantipyrine and phenol, but are not limited to this combination.
  • an ammonia detection reagent for example, an indophenol method combining phenol and hypochlorous acid can be used.
  • Examples of the glyoxylic acid detection reagent include a combination of reagents described in Non-Patent Document 6.
  • the present invention also provides a detection system for glycine analysis comprising (a) a device and (b) the modified enzyme of the present invention.
  • the modified enzyme of the present invention may exist as a unit independent of the microdevice that can be supplied into the device at the time of use, but may be previously injected, fixed, or arranged in the device.
  • the modified enzyme of the present invention is provided in a form pre-injected, fixed or arranged in the device. Immobilization or arrangement of the modified enzyme of the present invention on the device is performed directly or indirectly.
  • a microdevice such as a microchannel chip having a channel can be suitably used.
  • the detection system for glycine analysis of the present invention may further include (c) at least one component of a reaction buffer or buffer salt, a hydrogen peroxide detection reagent, an ammonia detection reagent, and a glyoxylic acid detection reagent.
  • all the components of (c) may be provided in a form accommodated in the device.
  • a part of the component of (c) may be provided in a form accommodated in the device, and the rest may be provided in a form not accommodated in the device (eg, a form accommodated in a different container).
  • the component (c) that is not accommodated in the device may be used by being injected into the device during measurement of the target substance.
  • Examples of the device include 1) a first zone for preparing a mixed solution by mixing the sample and the component of (c), and contacting the prepared mixed solution with the modified enzyme of the present invention, A device comprising a second zone for detecting glycine (a device in which the mixing and detection steps are carried out in different zones); 2) mixing the sample, the component of (c) and the modified enzyme of the invention , A device comprising an area for detecting glycine by the modified enzyme of the present invention (a device in which the mixing and detection steps are carried out in the same area); and 3) a sample and a component of (c) (and optionally A device having a flow path that allows mixing with the modified enzyme of the present invention and a zone for detecting glycine by the modified enzyme of the present invention (when a sample is injected into the inlet of the device, Sending Is sample and the like are mixed automatically to, glycine resulting mixture in the device) and the like is automatically detected in the detection zone.
  • the device 3 particularly the device 3) in the form of a microchannel device is preferable.
  • the modified enzyme of the present invention may be provided in the liquid flowing through the flow path, or may be provided in a form fixed or arranged in the detection zone. Provided in a deployed form.
  • the present invention also provides an enzyme sensor for glycine analysis comprising (a) a detection electrode, and (b) a modified enzyme of the present invention fixed or arranged on the detection electrode.
  • the modified enzyme of the present invention is fixed or disposed directly or indirectly on the electrode.
  • a hydrogen peroxide detection electrode for example, a hydrogen peroxide detection electrode can be used, and more specifically, an enzyme-type hydrogen peroxide detection electrode, a diaphragm-type hydrogen peroxide detection electrode, and the like.
  • glycine can be analyzed by detecting hydrogen peroxide generated when glycine is oxidized by glycine oxidation activity.
  • Other configurations can be used as they are, or can be appropriately modified from those used in known sensors.
  • Example 1 Synthesis of GlyOX and purification of GlyOX using a cell-free synthesis system Using a wild-type gene of GlyOX derived from Bacillus subtilis 168 strain or a desired mutant type gene as a template, 2-Step PCR method, A linear DNA of a construct in which a histidine tag and a TEV protease recognition sequence were fused to the N-terminal side and a target mutation was introduced was prepared. Using this DNA as a template, proteins were synthesized in a cell-free synthesis reaction system derived from E. coli.
  • the product synthesized for 6 hours by dialysis on a 1 mL reaction scale was centrifuged, and the supernatant fraction was eluted with histidine tag affinity purification using Ni Sepharose High Performance (GE Healthcare Japan, Inc.). A fraction was obtained. Subsequently, the presence of the protein considered to be the target enzyme was confirmed by staining with SDS-PAGE and SYPRO ORANGE Protein Gel Stain (Life Technologies Japan Co., Ltd.), and the protein was quantified by the Bradford method, followed by evaluation. .
  • the wild-type enzyme was also subjected to the same procedure for the preparation of linear DNA, cell-free synthesis, enzyme purification and analysis. The following buffer solution was used for purification.
  • Binding buffer 750 mM NaCl, 20 mM NaPi, pH 8.0
  • Wash buffer 750 mM NaCl, 20 mM NaPi, pH 8.0
  • Collection / measurement buffer 300 mM NaCl, 50 mM NaPi, 34 mM EDTA, pH 7.0, 10% D 2 O, 0.01% NaN 3
  • mutation is divided
  • T42A / C245S means a mutant GlyOX having two mutations
  • WT means wild type.
  • Example 2 Activity measurement The activity evaluation of the wild-type GlyOX and the mutant GlyOX synthesized in Example 1 was performed according to the following procedure. First, the following reaction solution A and reaction solution B were prepared. Reaction solution A: 4 mM phenol, 100 mM potassium phosphate, pH 8.0 Reaction solution B: 50 mM 4-aminoantipyrine, 500 U / ml peroxidase, and then using a 96-well microplate at 25 ° C., reaction solution A 49 ⁇ l, reaction solution B 1 ⁇ l, 2.5 mM Gly or 100 mM Gly 10 ⁇ l The change after 3 minutes of the absorbance at a wavelength of 500 nm of a liquid obtained by mixing 20 ⁇ l of ultrapure water and 20 ⁇ l of 0.5 mg / ml GlyOX was measured using a microplate reader (SpectraMax M2e, Molecular Device Japan Co., Ltd.).
  • Tables 7 and 8 show the activity of each mutant GlyOX as a ratio to the activity of wild-type GlyOX. Each value was calculated from an average value when three experiments were performed on the same sample. Table 7 shows the results for proteins synthesized using a wild-type gene as a template when preparing linear DNA, and Table 8 shows a protein synthesized using a target mutant-type gene as a template.
  • Example 3 Evaluation of stability The stability of the wild-type enzyme and the mutant enzyme synthesized in Example 1 was evaluated according to the following procedure. 0.5 mg / ml GlyOX was dispensed into a microtube and incubated at 4 ° C, 40 ° C, 50 ° C, 60 ° C for 1 hour. Thereafter, the activity of these enzyme solutions was measured from the change in absorbance after 10 minutes of reaction under the condition that the substrate solution added in Example 2 was 100 mM Gly, and remained as a ratio to the activity of the enzyme solution incubated at 4 ° C. The stability was evaluated by determining the activity. The results are shown in Tables 9 and 10.
  • Table 9 shows the results relating to proteins synthesized using a wild-type gene as a template when preparing linear DNA, and Table 10 using a target mutant-type gene as a template.
  • Example 4 GlyOX expression system using E. coli and purification of GlyOX
  • a recombinant expression system of GlyOX using E. coli was constructed.
  • a plasmid for recombinant expression was constructed.
  • the target gene was amplified by a standard PCR method using DNA primer 1 (TAATTCCCATGGCTAAAAGGCATTTGAAGCAGTGGGTGATTG: SEQ ID NO: 3) and DNA primer 2 (TAATACTCGAGTATCTGACCCGCTCCTCTGGATC: SEQ ID NO: 4).
  • coli DH5 ⁇ was obtained using the ligation product by a standard method.
  • a plasmid was extracted from the obtained transformant of DH5 ⁇ , and insertion of the gene of interest into the plasmid was confirmed using a standard DNA sequence analysis method.
  • the plasmid in which the target gene is inserted is called pET28a-GlyOX
  • the transformant of BL21 (DE3) by pET28a-GlyOX is called pET28a-GlyOX-BL21 (DE3).
  • GlyOX was prepared as follows. First, an LB plate containing 25 ⁇ g / ml kanamycin was inoculated from a glycerol stock of pET28a-GlyOX-BL21 (DE3), and statically cultured at 37 ° C. overnight. 50 ml of LB medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin was placed in a 250 ml baffled flask, inoculated from a single colony on an LB plate, and cultured overnight at 37 ° C. with swirling shaking.
  • the disrupted solution was centrifuged at 12000 ⁇ g for 30 minutes to recover the supernatant, and then Ni Sepharose 6 Fast equilibrated with Wash buffer (50 mM HEPES, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole, 0.02 ⁇ M Flavin adenine dinucleotide, pH 7.5). After adding to Flow (GE Healthcare Japan Co., Ltd.) and gently mixing by inversion for 5 minutes at room temperature, the solution was removed by natural falling using an Econopack column (Bio-Rad Laboratories Co., Ltd.).
  • the target protein GlyOX was eluted with an elution buffer (50 mM HEPES, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole, 0.02 ⁇ M Flavin adenine dinucleotide, pH 7.5).
  • the GlyOX solution was prepared by substituting the solvent into a stock buffer (50 mM potassium phosphate, 0.02 ⁇ M Flavin adenine dinucleotide, pH 8.0) by ultrafiltration to a concentration of 0.5 mg / ml.
  • T42A / C245S / L301V mutant using E. coli T42A / C245S / L301V mutant was prepared as follows. Using QuikChange Lightening Site-Directed Mutagenesis Kits (Agilent Technology Co., Ltd.), mutation was introduced into the GlyOX gene using pET28a-GlyOX as a template according to the protocol attached to the product. Multiple mutations were introduced by adding mutations using a plasmid containing the mutation as a template. Using this mutated plasmid, recombinant expression, purification, and solvent replacement were performed according to the method described in Example 4 to obtain a T42A / C245S / L301V mutant.
  • Example 6 Preparation of mutant using Escherichia coli
  • the target mutant was prepared as follows. Using QuikChange Lightening Site-Directed Mutagenesis Kits (Agilent Technology Co., Ltd.), mutation was introduced into the GlyOX gene using pET28a-GlyOX as a template according to the protocol attached to the product. Multiple mutations were introduced by adding mutations using a plasmid containing the mutation as a template. Using this mutated plasmid, recombinant expression, purification, and solvent replacement were performed according to the method described below to obtain the target mutant.
  • GlyOX was prepared as follows. First, an LB plate containing 25 ⁇ g / ml kanamycin was inoculated from a glycerol stock of pET28a-GlyOX-BL21 (DE3), and statically cultured at 37 ° C. overnight. 50 ml of LB medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycin was placed in a 250 ml baffled flask, inoculated from a single colony on an LB plate, and cultured overnight at 37 ° C. with swirling shaking.
  • the disrupted solution was centrifuged at 12000 ⁇ g for 30 minutes to collect the supernatant, and then the HisTrap FF crude (50 mM HEPES, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole, 0.02 ⁇ M Flavin adenine dinucleotide, pH 7.5) equilibrated with Wash Buffer ( GE Healthcare Japan Ltd.). Subsequently, after washing with a Wash buffer, the target protein GlyOX was eluted with an elution buffer (50 mM HEPES, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole, 0.02 ⁇ M Flavin adenine dinucleotide, pH 7.5).
  • the GlyOX solution was prepared by substituting the solvent into a stock buffer (50 mM potassium phosphate, 0.02 ⁇ M Flavin adenine dinucleotide, pH 8.0) by ultrafiltration to a concentration of 0.5 mg / ml.
  • a stock buffer 50 mM potassium phosphate, 0.02 ⁇ M Flavin adenine dinucleotide, pH 8.0
  • Example 7 Activity measurement Activity was evaluated for the wild type and the mutant GlyOX synthesized in Example 6. Specifically, among the compositions shown in Example 2, the enzyme solution was GlyOX prepared in Example 6. The results are shown in Table 11.
  • Example 8 Evaluation of stability The stability of the wild type and the mutant GlyOX synthesized in Example 6 was evaluated. Specifically, among the compositions shown in Example 3, the enzyme solution was GlyOX prepared in Example 6. The results are shown in Table 12.
  • Example 9 Preparation of T42A / C245S / L301V / G304Q mutant using E. coli T42A / C245S / L301V / G304Q was prepared in the same manner as in Example 5.
  • Example 10 Evaluation of substrate specificity Substrate specificity was confirmed for the wild type, the T42A / C245S / L301V mutant, and the T42A / C245S / L301V / G304Q mutant.
  • the enzyme solution is the GlyOX solution prepared in Example 4 or Example 5 or Example 9, and (1) 1 mM Gly, (2 ) One of 20 standard amino acids, a mixture containing 1 mM of cystine, taurine, citrulline, ornithine and ⁇ -aminobutyric acid, respectively, and (3) (2) 25 mixtures obtained by removing Gly The activity was evaluated.
  • Tyr and cystine were dissolved in 2M HCl, and other amino acids were dissolved in 0.1M HCl to prepare a 100 mM solution. After mixing each amino acid solution, an amino acid solution was prepared by diluting 100 times with ultrapure water. . At this time, in (1) and (3), 2M HCl or / and 0.1M HCl was mixed instead of the amino acid solution not mixed. The activity was determined by detecting the change in absorbance ( ⁇ Abs 500 ) at a wavelength of 500 nm at 37 ° C. with a microplate reader. The results for the wild type are shown in FIG. 1, the results for the T42A / C245S / L301V mutant are shown in FIG.
  • the results for the T42A / C245S / L301V / G304Q mutant are shown in FIG.
  • the substrates were (1), (2), and (3), they were expressed as Gly, 25mix, and 25mix-Gly, respectively.
  • No catalytic activity was observed for amino acids other than Gly, wild type, T42A / C245S / L301V mutant, and T42A / C245S / L301V / G304Q mutant.
  • the wild type and T42A / C245S / L301V / G304Q mutants showed inhibition of the reaction by other amino acids, and ⁇ Abs 500 10 minutes after the start of the wild type reaction was Gly.
  • the ⁇ Abs500 10 minutes after the start of the reaction of the T42A / C245S / L301V / G304Q mutant type was 52% when only Gly was used as the substrate, but the T42A / C245S / L301V mutation was 85%. As for the type, the reaction was not inhibited and the properties were improved.
  • reaction solution C (4 mM phenol, 100 mM HEPES, pH 8.0) was prepared, and using a 96-well microplate at 37 ° C., reaction solution C was 49 ⁇ l, 50 mM 4-aminoantipyrine 1 ⁇ l, 500 U / ml peroxidase.
  • Example 12 Quantitative analysis of plasma Gly Gly in human plasma was quantitatively analyzed using T42A / C245S / L301V mutant or T42A / C245S / L301V / G304Q mutant. Reaction and measurement were performed at 37 ° C. using a cuvette.
  • the calibration curve was prepared using the average value when three experiments were performed at each Gly concentration, and the human plasma sample of the same lot was analyzed six times and compared with the analysis value (332 ⁇ M) in the amino acid analyzer.
  • the above is method 1, and the results are shown in Table 13 or 14.
  • Table 13 or 14 also shows the results of obtaining the Gly concentration by the method of obtaining the concentration from the ratio with the absorbance value based on the target component (Method 2). Whichever method was used, both accuracy and precision were good, and it was shown that the Gly concentration in human plasma can be quantitatively analyzed with high accuracy by using a Gly measurement system using mutant GlyOX.
  • the modified enzyme of the present invention is useful for rapid and sensitive measurement of glycine and / or production of glycine oxylate.
  • the modified enzyme of the present invention is also useful as a liquid reagent.
  • the modified enzyme of the present invention is further useful for specific measurement of glycine.
  • the analysis method of the present invention is useful in a wide range of fields such as biological research, health nutrition, medical care, and food production.

Abstract

　本発明は、グリシン濃度の測定に有用な手段および方法を提供する。具体的には、本発明は、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性（例、グリシンに対するグリシン酸化酵素の活性、グリシン酸化酵素の熱安定性、およびグリシンに対するグリシン酸化酵素の基質特異性）を改善するようにその少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させた、改変酵素；ならびに当該改変酵素を用いて被検試料中に含まれるグリシンを測定することを含む、グリシンの分析方法などを提供する。

Description

改変グリシン酸化酵素
　本発明は、改変グリシン酸化酵素、およびそれを用いるグリシンの分析方法などに関する。
　アミノ酸は生体の構成要素として非常に重要であり、幾つかのアミノ酸が健康状態の指標となり得ることが知られている。例えば血漿中のグリシン濃度は、肥満との関連が示唆されている（非特許文献１）。また、グリシンは種々の食品中に天然に含まれる他、例えば食品添加物としても用いられている。従って、生体研究、健康栄養、医療、食品製造など広範な分野において、アミノ酸、特にグリシンの測定は重要な意義を有する。
　グリシンを含むアミノ酸の測定方法としては、アミノ酸アナライザー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やＬＣ－ＭＳなどの機器を用いた方法が広く用いられているが、これらの機器は大型で高価であり、機器の維持とオペレーションに専門知識と習熟を必要とするため、導入、維持、利用に高額のコストを必要とする。また、原理上、各検体をシーケンシャルに分析する必要があるため、多検体を分析する際には長時間を必要とする。これらの問題を解決する手段として、例えば特定のアミノ酸に対する特定の反応を触媒する酵素を用いたアミノ酸の分析法が挙げられ、幾つかのアミノ酸については測定用キットが販売されている。また、酵素を利用して電気化学的または光学的に特定のアミノ酸を測定するバイオセンサーも実現されている（例えば、特許文献１、非特許文献２～４）。
　グリシンに作用する酵素としては、グリシン酸化酵素が知られている（例えば、非特許文献５）。
国際公開第２００５／０７５９７０号
Ｐ．Ｆｅｌｉｇ，Ｅ．Ｍａｒｌｉｓｓ，Ｇ．Ｆ．Ｃａｈｉｌｌ　Ｊｒ．（１９６９）　Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２８１，８１１－８１６． Ａ．Ｇｕｅｒｒｉｅｒｉ，Ｔ．Ｒ．Ｉ．Ｃａｔａｌｄｉ，Ｒ．Ｃｉｒｉｅｌｌｏ．（２００７）　Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ　Ｂ　Ｃｈｅｍ．１２６，４２４－４３０. Ｈ．Ｏｌｓｃｈｅｗｓｋｉ，Ａ．Ｅｒｌｅｎｋｏｔｔｅｒ，Ｃ．Ｚａｂｏｒｏｓｃｈ，Ｇ．－Ｃ．Ｃｈｅｍｎｉｔｉｕｓ．（２０００）　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２６，５３７－５４３. Ｈ．Ｅｎｄｏ，Ｙ．Ｈａｙａｓｈｉ，Ｙ．Ｋｉｔａｎｉ，Ｈ．Ｒｅｎ，Ｔ．Ｈａｙａｓｈｉ，Ｙ．Ｎａｇａｓｈｉｍａ．（２００８）　Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３９１，１２５５－１２６１. Ｌ．Ｃａｌｄｉｎｅｌｌｉ，Ｍ．Ｐｅｄｏｔｔｉ，Ｌ．Ｍｏｔｔｅｒａｎ，Ｇ．Ｍｏｌｌａ，Ｌ．Ｐｏｌｌｅｇｉｏｎｉ（２００９）　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ　９１，１４９９－１５０８． Ｓ．Ｅ．Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．Ｍｅｒｋｌｅｒ（２００３）　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　３２３，２４２－２４６．
　前述の酵素を用いたアミノ酸測定では、アミノ酸の測定に関連する酵素の特性（例、酵素の活性、安定性、基質特異性）が優れることが望ましい。特に活性に関しては、例えば血中アミノ酸のように検体中の検出対象の濃度が低い場合、基質濃度が低い条件下において活性が高いことが求められる。グリシン含有検体の分析にはグリシン酸化酵素の利用が有望であるが、これまでに性質が知られているグリシン酸化酵素は、活性および安定性が低い（例えば、非特許文献６）点が課題であった。また、基質特異性については多種類のアミノ酸に関して調査がなされていなかった。以上のように、グリシンの測定に関し実用に供することが可能な酵素がなく、従って実用的な、酵素を用いたグリシン測定法、測定用キット、測定用バイオセンサーが実現されていなかった。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、グリシンの測定に関連する特性を改善した酵素を用いることにより、グリシン濃度を測定すればよいことを着想し、そして、このような特性が改善されたグリシン酸化酵素を開発することに成功し、もって本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下：
（ａ）グリシンに対するグリシン酸化酵素の活性；
（ｂ）グリシン酸化酵素の熱安定性；および
（ｃ）グリシンに対するグリシン酸化酵素の基質特異性；
からなる群より選ばれる、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の１以上の特性を改善するようにその少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させた、改変酵素。
〔２〕変異が、グリシン酸化酵素のアミノ酸配列における（ａ）ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニンの置換、（ｂ）ＴＴＳモチーフ中のセリンの置換、（ｃ）ＨＣＹモチーフ中のシステインの置換、（ｄ）ＬＲＰモチーフ中のロイシンの置換、（ｅ）ＧＭＬモチーフ中のメチオニンの置換、（ｆ）ＳＧモチーフ中のセリンの置換、および（ｇ）ＰＧＴモチーフ中のグリシンの置換からなる群より選ばれる１以上の置換である、〔１〕の改変酵素。
〔３〕ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニンが、アラニン、セリン、システイン、またはグリシンに置換されている、〔２〕の改変酵素。
〔４〕ＴＴＳモチーフ中のセリンが、リジンに置換されている、〔２〕または〔３〕の改変酵素。
〔５〕ＨＣＹモチーフ中のシステインが、アラニン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、アスパラギン、トリプトファン、チロシン、またはセリンに置換されている、〔２〕～〔４〕のいずれかの改変酵素。
〔６〕ＬＲＰモチーフ中のロイシンが、イソロイシン、バリン、システイン、スレオニン、またはプロリンに置換されている、〔２〕～〔５〕のいずれかの改変酵素。
〔７〕ＧＭＬモチーフ中のメチオニンが、イソロイシンに置換されている、〔２〕～〔６〕のいずれかの改変酵素。
〔８〕ＳＧモチーフ中のセリンが、アルギニンに置換されている、〔２〕～〔７〕のいずれかの改変酵素。
〔９〕ＰＧＴモチーフ中のグリシンが、チロシン、またはグルタミンに置換されている、〔２〕～〔８〕のいずれかの改変酵素。
〔１０〕グリシン酸化酵素がバチルス属に由来する、〔１〕～〔９〕のいずれかの改変酵素。
〔１１〕以下（１）あるいは（２）のタンパク質である、〔１〕～〔１０〕のいずれかの改変酵素：
（１）配列番号２のアミノ酸配列において、ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニン、ＴＴＳモチーフ中のセリン、ＨＣＹモチーフ中のシステイン、ＬＲＰモチーフ中のロイシン、ＧＭＬモチーフ中のメチオニン、ＳＧモチーフ中のセリン、およびＰＧＴモチーフ中のグリシンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、下記（ｉ）～（ｖｉｉ）に示されるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、タンパク質：
（ｉ）ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニンの置換
　アラニン、セリン、システイン、またはグリシン；
（ｉｉ）ＴＴＳモチーフ中のセリンの置換
　リジン；
（ｉｉｉ）ＨＣＹモチーフ中のシステインの置換
　アラニン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、アスパラギン、トリプトファン、チロシン、またはセリン；
（ｉｖ）ＬＲＰモチーフ中のロイシンの置換
　イソロイシン、バリン、システイン、スレオニン、またはプロリン
（ｖ）ＧＭＬモチーフ中のメチオニンの置換
　イソロイシン；
（ｖｉ）ＳＧモチーフ中のセリンの置換
　アルギニン；
（ｖｉｉ）ＰＧＴモチーフ中のグリシンの置換
　チロシン、またはグルタミン。
（２）配列番号２のアミノ酸配列におけるＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニン、ＴＴＳモチーフ中のセリン、ＨＣＹモチーフ中のシステイン、ＬＲＰモチーフ中のロイシン、ＧＭＬモチーフ中のメチオニン、ＳＧモチーフ中のセリン、およびＰＧＴモチーフ中のグリシンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、上記（ｉ）～（ｖｉｉ）に示されるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の追加変異を有するアミノ酸配列を含み、かつ、下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選ばれる１以上の特性が改善されている、タンパク質：
（ａ）グリシンに対するグリシン酸化酵素の活性；
（ｂ）グリシン酸化酵素の熱安定性；および
（ｃ）グリシンに対するグリシン酸化酵素の基質特異性。
〔１２〕〔１〕～〔１１〕のいずれかの改変酵素を用いて被検試料中に含まれるグリシンを測定することを含む、グリシンの分析方法。
〔１３〕グリシンの測定が、〔１〕～〔１１〕のいずれかの改変酵素に加えて、４－アミノアンチピリンおよびフェノール、ならびにペルオキシダーゼを用いて行われる、〔１２〕の方法。
〔１４〕〔１〕～〔１１〕のいずれかの改変酵素を用いてグリシンからグリオキシル酸を生成することを含む、グリオキシル酸の製造方法。
〔１５〕〔１〕～〔１１〕のいずれかの改変酵素をコードするポリヌクレオチド。
〔１６〕〔１５〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔１７〕〔１６〕の発現ベクターを含む形質転換体。
〔１８〕グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性を改善するようにその少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させた改変酵素を、〔１７〕の形質転換体を用いて生成することを含む、改変酵素の製造方法。
〔１９〕〔１〕～〔１１〕のいずれかの改変酵素を含む、グリシン分析用キット。
〔２０〕反応用緩衝液または緩衝塩、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬およびグリオキシル酸検出試薬の少なくとも一つをさらに含む、〔１９〕のグリシン分析用キット。
〔２１〕（ａ）デバイス、および（ｂ）〔１〕～〔１１〕のいずれかの改変酵素を含む、グリシン分析用検出系。
〔２２〕（ｃ）反応用緩衝液または緩衝塩、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬およびグリオキシル酸検出試薬の少なくとも一つをさらに含み、かつデバイスがマイクロ流路チップである、〔２１〕のグリシン分析用検出系。
〔２１〕（ａ）検出用電極、および（ｂ）検出用電極に固定または配置された、〔１〕～〔１１〕のいずれかの改変酵素を含む、グリシン分析用酵素センサー。
　本発明の改変酵素は、グリシンに対する活性が向上しているため、グリシンの迅速かつ高感度な測定、および／またはグリオキシル酸の製造に有用である。本発明の改変酵素はまた、水溶液中での熱安定性に優れることから、安定性に優れる。したがって、本発明の改変酵素は、特に液状試薬として有用である。本発明の改変酵素はさらに、グリシンに対する基質特異性に優れるので、グリシンを特異的に測定することができる。本発明の分析方法は、例えば、生体研究、健康栄養、医療、食品製造など広範な分野において有用である。
図１は、グリシンに対する野生型グリシン酸化酵素の基質特異性を示す図である。（１）Ｇｌｙ：１ｍＭ　Ｇｌｙ；（２）２５ｍｉｘ：標準アミノ酸２０種類、シスチン、タウリン、シトルリン、オルニチンおよびα－アミノ酪酸をそれぞれ１ｍＭ含有する混合液；（３）２５ｍｉｘ－Ｇｌｙ：（２）の２５種類の混合液からＧｌｙを除いたもの（以下同様）。 図２は、グリシンに対する変異型グリシン酸化酵素（Ｔ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ）の基質特異性を示す図である。 図３は、グリシンに対する変異型グリシン酸化酵素（Ｔ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ／Ｇ３０４Ｑ）の基質特異性を示す図である。 図４は、変異型グリシン酸化酵素（Ｔ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ）を用いてエンドポイント法で得られた吸光度と、反応系中のＧｌｙ濃度との関係を示す図である。 図５は、変異型グリシン酸化酵素（Ｔ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ／Ｇ３０４Ｑ）を用いてエンドポイント法で得られた吸光度と、反応系中のＧｌｙ濃度との関係を示す図である。
　本発明は、改変酵素を提供する。本発明の改変酵素は、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性を改善するようにその少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させたものであり得る。
　アミノ酸残基の変異としては、例えば、置換、欠失、付加および挿入が挙げられるが、置換が好ましい。
　変異されるアミノ酸残基は、天然のＬ－α－アミノ酸である、Ｌ－アラニン（Ａ）、Ｌ－アスパラギン（Ｎ）、Ｌ－システイン（Ｃ）、Ｌ－グルタミン（Ｑ）、Ｌ－イソロイシン（Ｉ）、Ｌ－ロイシン（Ｌ）、Ｌ－メチオニン（Ｍ）、Ｌ－フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ－プロリン（Ｐ）、Ｌ－セリン（Ｓ）、Ｌ－スレオニン（Ｔ）、Ｌ－トリプトファン（Ｗ）、Ｌ－チロシン（Ｙ）、Ｌ－バリン（Ｖ）、Ｌ－アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ－グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ－アルギニン（Ｒ）、Ｌ－ヒスチジン（Ｈ）、またはＬ－リジン（Ｋ）、あるいはグリシン（Ｇ）である。変異が置換、付加または挿入である場合、置換、付加または挿入されるアミノ酸残基は、上述した変異されるアミノ酸残基と同様である。以下、アミノ酸の表記について、Ｌおよびαを省略することがある。
　グリシン酸化酵素（ｇｌｙｏｘｉｄａｓｅ：ＧｌｙＯＸと表記することがある）は、以下の反応を触媒する酸化還元酵素である（ＥＣ　１．４．３．１９）。
　　グリシン＋Ｈ２Ｏ＋Ｏ２　→　グリオキシル酸＋ＮＨ３＋Ｈ２Ｏ２
　本発明の改変酵素が由来するグリシン酸化酵素としては、例えば、任意の生物（例、細菌、放線菌および真菌等の微生物、ならびに昆虫、魚類、動物、および植物）に由来する酵素を用いることができ、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物、およびこの近縁属に属する生物に由来する酵素が挙げられる。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の近縁属としては、例えば、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、オセアノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属が挙げられる。バチルス属のこれらの近縁属は、バチルス属と同様に、バシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）に属する。
　バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびその近縁属に属する微生物としては、例えば、バチルス・アエロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｅｒｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・マカウエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃａｕｅｎｓｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ゲオバチルス・カウストフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ）などが挙げられる。
　グリシン酸化酵素において変異が導入される位置は、好ましくは、グリシン酸化酵素の活性中心付近にあるアミノ酸残基である。バチルス・サブチリス由来のグリシン酸化酵素については、立体構造の解析結果が報告されている（例、ＰＤＢ　ＩＤ：１ＮＧ３、１ＮＧ４、１ＲＹＩ、３ＩＦ９を参照）。当業者は、バチルス・サブチリス由来のグリシン酸化酵素のアミノ酸配列を他のグリシン酸化酵素のアミノ酸配列と整列（ａｌｉｇｎ）させることができるので、バチルス・サブチリス以外の生物に由来するグリシン酸化酵素についても、活性中心付近にあるアミノ酸残基を容易に特定することができる。
　好ましい実施形態では、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性を改善する変異は、野生型グリシン酸化酵素のアミノ酸配列のＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニン（Ｔ）の置換および／またはセリン（Ｓ）の置換である。ＴＴＳモチーフは、スレオニン（Ｔ）－スレオニン（Ｔ）－セリン（Ｓ）の連続した３つのアミノ酸残基から構成される。ＴＴＳモチーフのＣ末端のスレオニン残基を、第１のスレオニンということがあり、また、ＴＴＳモチーフの中央のスレオニン残基を、第２のスレオニンということがある。野生型グリシン酸化酵素のアミノ酸配列中のＴＴＳモチーフの位置は酵素の由来によって異なり得るが、当業者は、野生型グリシン酸化酵素のアミノ酸配列中のＴＴＳモチーフの位置を適宜決定できるため、置換されるべき第１のスレオニン（Ｔ）およびセリン（Ｓ）の位置を特定できる。通常、グリシン酸化酵素のアミノ酸配列において、ＴＴＳモチーフは４２～４４位のアミノ酸領域内にあり、第１のスレオニン（Ｔ）は４２位にあり、セリン（Ｓ）は４４位にある（例、表１を参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　別の好ましい実施形態では、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性を改善する変異は、野生型グリシン酸化酵素のアミノ酸配列のＨＣＹモチーフ中のシステイン（Ｃ）の置換である。ＨＣＹモチーフは、ヒスチジン（Ｈ）－システイン（Ｃ）－チロシン（Ｙ）の連続した３つのアミノ酸残基から構成される。野生型グリシン酸化酵素のアミノ酸配列中のＨＣＹモチーフの位置は酵素の由来によって異なり得るが、当業者は、野生型グリシン酸化酵素のアミノ酸配列中のＨＣＹモチーフの位置を適宜決定できるため、置換されるべきシステイン（Ｃ）の位置を特定できる。通常、グリシン酸化酵素のアミノ酸配列において、ＨＣＹモチーフは２４４～２５２位のアミノ酸領域内にあり、システイン（Ｃ）は２４５～２５１位にある（例、表２を参照）。本発明の改変酵素は、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性を改善する変異として、ＨＣＹモチーフ中のシステイン（Ｃ）の置換に加えて、ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニン（Ｔ）の上記置換をさらに有していてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　さらに別の好ましい実施形態では、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性を改善する変異は、野生型グリシン酸化酵素のアミノ酸配列のＬＲＰモチーフ中のロイシン（Ｌ）の置換である。ＬＲＰモチーフは、ロイシン（Ｌ）－アルギニン（Ｒ）－プロリン（Ｐ）の連続した３つのアミノ酸残基から構成される。野生型グリシン酸化酵素のアミノ酸配列中のＬＲＰモチーフの位置は酵素の由来によって異なり得るが、当業者は、野生型グリシン酸化酵素のアミノ酸配列中のＬＲＰモチーフの位置を適宜決定できるため、置換されるべきロイシン（Ｌ）の位置を特定できる。通常、グリシン酸化酵素のアミノ酸配列において、ＬＲＰモチーフは２９４～３１６位のアミノ酸領域内にあり、ロイシン（Ｌ）は２９４～３１４位にある（例、表３を参照）。本発明の改変酵素は、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性を改善する変異として、ＬＲＰモチーフ中のロイシン（Ｌ）の置換に加えて、ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニン（Ｔ）の上記置換および／またはＨＣＹモチーフ中のシステイン（Ｃ）の上記置換をさらに有していてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　さらに別の好ましい実施形態では、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性を改善する変異は、野生型グリシン酸化酵素のアミノ酸配列のＧＭＬモチーフ中のメチオニン（Ｍ）の置換である。ＧＭＬモチーフは、グリシン（Ｇ）－メチオニン（Ｍ）－ロイシン（Ｌ）の連続した３つのアミノ酸残基から構成される。野生型グリシン酸化酵素のアミノ酸配列中のＧＭＬモチーフの位置は酵素の由来によって異なり得るが、当業者は、野生型グリシン酸化酵素のアミノ酸配列中のＧＭＬモチーフの位置を適宜決定できるため、置換されるべきメチオニン（Ｍ）の位置を特定できる。通常、グリシン酸化酵素のアミノ酸配列において、ＧＭＬモチーフは４５～５９位のアミノ酸領域内にあり、メチオニン（Ｍ）は４６～５８位にある（例、表４を参照）。本発明の改変酵素は、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性を改善する変異として、ＧＭＬモチーフ中のメチオニン（Ｍ）の置換に加えて、ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニン（Ｔ）およびセリン（Ｓ）の上記置換および／またはＨＣＹモチーフ中のシステイン（Ｃ）の上記置換および／またはＬＲＰモチーフ中のロイシン（Ｌ）の上記置換をさらに有していてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　さらに別の好ましい実施形態では、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性を改善する変異は、野生型グリシン酸化酵素のアミノ酸配列のＳＧモチーフ中のセリン（Ｓ）の置換である。ＳＧモチーフは、セリン（Ｓ）－グリシン（Ｇ）の連続した２つのアミノ酸残基から構成される。野生型グリシン酸化酵素のアミノ酸配列中のＳＧモチーフの位置は酵素の由来によって異なり得るが、当業者は、野生型グリシン酸化酵素のアミノ酸配列中のＳＧモチーフの位置を適宜決定できるため、置換されるべきセリン（Ｓ）の位置を特定できる。通常、グリシン酸化酵素のアミノ酸配列において、ＳＧモチーフは１９０～２０４位のアミノ酸領域内にあり、セリン（Ｓ）は１９０～２０３位にある（例、表５を参照）。本発明の改変酵素は、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性を改善する変異として、ＳＧモチーフ中のセリン（Ｓ）の置換に加えて、ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニン（Ｔ）およびセリン（Ｓ）の上記置換および／またはＨＣＹモチーフ中のシステイン（Ｃ）の上記置換および／またはＬＲＰモチーフ中のロイシン（Ｌ）の上記置換および／またはＧＭＬモチーフ中のメチオニン（Ｍ）の上記置換をさらに有していてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　さらに別の好ましい実施形態では、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性を改善する変異は、野生型グリシン酸化酵素のアミノ酸配列のＰＧＴモチーフ中のグリシン（Ｇ）の置換である。ＰＧＴモチーフは、プロリン（Ｐ）－グリシン（Ｇ）－スレオニン（Ｔ）の連続した３つのアミノ酸残基から構成される。野生型グリシン酸化酵素のアミノ酸配列中のＰＧＴモチーフの位置は酵素の由来によって異なり得るが、当業者は、野生型グリシン酸化酵素のアミノ酸配列中のＰＧＴモチーフの位置を適宜決定できるため、置換されるべきグリシン（Ｇ）の位置を特定できる。通常、グリシン酸化酵素のアミノ酸配列において、ＰＧＴモチーフは３０３～３１７位のアミノ酸領域内にあり、グリシン（Ｇ）は３０４～３１６位にある（例、表６を参照）。本発明の改変酵素は、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性を改善する変異として、ＰＧＴモチーフ中のグリシン（Ｇ）の置換に加えて、ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニン（Ｔ）およびセリン（Ｓ）の上記置換および／またはＨＣＹモチーフ中のシステイン（Ｃ）の上記置換および／またはＬＲＰモチーフ中のロイシン（Ｌ）の上記置換および／またはＧＭＬモチーフ中のメチオニン（Ｍ）の上記置換および／またはＳＧモチーフ中のセリン（Ｓ）の上記置換をさらに有していてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　本発明の改変酵素は、上述した６つのモチーフから選ばれる１つ以上のモチーフを有する野生型酵素に対して変異を導入することにより、作製することができる。野生型酵素は、上述した６つのモチーフから選ばれる２つのモチーフを有していてもよく、３つのモチーフを有していてもよく、４つのモチーフを有していてもよく、５つのモチーフを有していてもよく、６つのモチーフを有していてもよい。
　グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性としては、以下が挙げられる：
（ａ）グリシンに対するグリシン酸化酵素の活性；
（ｂ）グリシン酸化酵素の熱安定性；および
（ｃ）グリシンに対するグリシン酸化酵素の基質特異性。
　本発明の改変酵素は、上述した特性のうち１つのみを有していてもよいが、上述した特性のうち２つまたは３つの特性を併有していてもよい。
　ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニン（Ｔ）について、特性（ａ）～（ｃ）から選ばれる少なくとも１つの特性を改善する変異（単独の変異または他の変異との組合せ）としては、例えば、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、またはグリシン（Ｇ）への置換が挙げられる。
　ＴＴＳモチーフ中のセリン（Ｓ）について、特性（ａ）～（ｃ）から選ばれる少なくとも１つの特性を改善する変異（単独の変異または他の変異との組合せ）としては、例えば、リジン（Ｋ）への置換が挙げられる。
　ＨＣＹモチーフ中のシステイン（Ｃ）について、特性（ａ）～（ｃ）から選ばれる少なくとも１つの特性を改善する変異（単独の変異または他の変異との組合せ）としては、例えば、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、またはセリン（Ｓ）への置換が挙げられる。
　ＬＲＰモチーフ中のロイシン（Ｌ）について、特性（ａ）～（ｃ）から選ばれる少なくとも１つの特性を改善する変異（単独の変異または他の変異との組合せ）としては、例えば、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、システイン（Ｃ）、スレオニン（Ｔ）、またはプロリン（Ｐ）への置換が挙げられる。
　ＧＭＬモチーフ中のメチオニン（Ｍ）について、特性（ａ）～（ｃ）から選ばれる少なくとも１つの特性を改善する変異（単独の変異または他の変異との組合せ）としては、例えば、イソロイシン（Ｉ）への置換が挙げられる。
　ＳＧモチーフ中のセリン（Ｓ）について、特性（ａ）～（ｃ）から選ばれる少なくとも１つの特性を改善する変異（単独の変異または他の変異との組合せ）としては、例えば、アルギニン（Ｒ）への置換が挙げられる。
　ＰＧＴモチーフ中のグリシン（Ｇ）について、特性（ａ）～（ｃ）から選ばれる少なくとも１つの特性を改善する変異（単独の変異または他の変異との組合せ）としては、例えば、チロシン（Ｙ）、またはグルタミン（Ｑ）への置換が挙げられる。
　一実施形態では、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性として、グリシンに対するグリシン酸化酵素の活性が、改善される。グリシンに対するグリシン酸化酵素の活性の改善とは、グリシンに対する改変酵素の活性が、野生型酵素のものに比べてより向上することを意味する。具体的には、グリシンに対するグリシン酸化酵素の活性の改善は、所定の濃度（例、低濃度または高濃度のいずれかの濃度）におけるグリシンに対する野生型グリシン酸化酵素の活性を１００としたときに、同濃度におけるグリシンに対する改変酵素の活性が１００よりも大きい場合に、達成され得る。このような改変酵素は、グリシンの迅速かつ高感度な測定を可能にし、結果としてグリシンの測定に有用である。野生型酵素に対する改変酵素の活性の向上の程度は、１．３倍以上であることが好ましく、１．５倍以上であることがより好ましく、１．７倍以上であることがさらにより好ましく、２倍以上であることが特に好ましい。野生型酵素に対する改変酵素の活性の向上の程度が１．３倍以上である本発明の改変酵素の変異は、例えば、１）活性の改善に好適である、ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニン（Ｔ）の下記アミノ酸残基への置換、ＨＣＹモチーフ中のシステイン（Ｃ）の下記アミノ酸残基への置換、またはＬＲＰモチーフ中のロイシン（Ｌ）の下記アミノ酸残基への置換、あるいはそれらの置換の組合せであってもよい。
１）活性の改善に好適である置換
１－１）ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニン（Ｔ）の置換後のアミノ酸残基
　アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、またはグリシン（Ｇ）
１－２）ＴＴＳモチーフ中のセリン（Ｓ）の置換後のアミノ酸残基
　リジン（Ｋ）
１－３）ＨＣＹモチーフ中のシステイン（Ｃ）の置換後のアミノ酸残基
　セリン（Ｓ）
１－４）ＬＲＰモチーフ中のロイシン（Ｌ）の置換後のアミノ酸残基
　イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、システイン（Ｃ）、またはスレオニン（Ｔ）
１－５）ＰＧＴモチーフ中のグリシン（Ｇ）について、特性（ａ）～（ｃ）から選ばれる少なくとも１つの特性を改善する変異（単独の変異または他の変異との組合せ）としては、例えば、グルタミン（Ｑ）への置換が挙げられる。
　別の実施形態では、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性として、グリシン酸化酵素の熱安定性が、改善される。グリシン酸化酵素の熱安定性の改善とは、改変酵素の熱安定性が、野生型酵素のものに比べてより向上することを意味する。具体的には、グリシン酸化酵素の熱安定性の改善は、水溶液中において所定の高温（例、４０℃、５０℃または６０℃のいずれかの温度）条件下で所定の時間（例、１時間）処理した場合に、改変酵素の残存活性が野生型酵素のものよりも大きい場合に、達成され得る。水溶液中におけるグリシン酸化酵素の熱安定性試験は、グリシン酸化酵素の安定性（特に液状安定性）を評価するための加速試験としての意義を有し得る。したがって、水溶液中における改変酵素の熱安定性が高い場合、改変酵素の安定性（特に液状安定性）も高い傾向がある。液状安定性が高い酵素は、液状でより長期保存することができるので、このような改変酵素は、液状試薬として、グリシンの測定に有用である。野生型酵素に対する改変酵素の熱安定性の向上の程度は、１．１倍以上であることが好ましく、１．２倍以上であることがより好ましい。野生型酵素に対する改変酵素の熱安定性の向上の程度が１．１倍以上である本発明の改変酵素の変異は、例えば、２）熱安定性の改善に好適である、ＨＣＹモチーフ中のシステイン（Ｃ）の下記アミノ酸残基への置換であってもよい。
２）熱安定性の改善に好適である置換
２－１）ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニン（Ｔ）の置換後のアミノ酸残基
　アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）
２－２）ＴＴＳモチーフ中のセリン（Ｓ）の置換後のアミノ酸残基
　リジン（Ｋ）
２－３）ＨＣＹモチーフ中のシステイン（Ｃ）の置換後のアミノ酸残基
　アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、またはセリン（Ｓ）
２－４）ＬＲＰモチーフ中のロイシン（Ｌ）の置換後のアミノ酸残基
　イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、プロリン（Ｐ）、またはシステイン（Ｃ）
２－５）ＧＭＬモチーフ中のメチオニン（Ｍ）について、特性（ａ）～（ｃ）から選ばれる少なくとも１つの特性を改善する変異（単独の変異または他の変異との組合せ）としては、例えば、イソロイシン（Ｉ）への置換が挙げられる。
２－６）ＳＧモチーフ中のセリン（Ｓ）について、特性（ａ）～（ｃ）から選ばれる少なくとも１つの特性を改善する変異（単独の変異または他の変異との組合せ）としては、例えば、アルギニン（Ｒ）への置換が挙げられる。
２－７）ＰＧＴモチーフ中のグリシン（Ｇ）について、特性（ａ）～（ｃ）から選ばれる少なくとも１つの特性を改善する変異（単独の変異または他の変異との組合せ）としては、例えば、チロシン（Ｙ）、またはグルタミン（Ｑ）への置換が挙げられる。
　さらに別の実施形態では、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性として、グリシンに対するグリシン酸化酵素の基質特異性が、改善される。グリシンに対するグリシン酸化酵素の基質特異性の改善とは、グリシンに対する改変酵素の反応性が、野生型酵素のものに比べてより向上することを意味する。換言すれば、グリシン以外のアミノ酸に対する改変酵素の反応性が低下することを意味する。グリシン以外のアミノ酸としては、例えば、グリシン以外のＬ－α－アミノ酸が挙げられる。具体的には、グリシン以外のＬ－α－アミノ酸としては、例えば、タンパク質を構成する、グリシン以外の１９種のＬ－α－アミノ酸、ならびにシスチン、タウリン、シトルリン、オルニチンおよびα－アミノ酪酸が挙げられる。グリシンに対するグリシン酸化酵素の基質特異性が改善された本発明の改変酵素の変異は、例えば、３）基質特異性の改善に好適である、ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニン（Ｔ）の下記アミノ酸残基への置換、ＨＣＹモチーフ中のシステイン（Ｃ）の下記アミノ酸残基への置換、またはＬＲＰモチーフ中のロイシン（Ｌ）の下記アミノ酸残基への置換、あるいはそれらの置換の組合せであってもよい。
３）基質特異性の改善に好適である置換
３－１）ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニン（Ｔ）の置換後のアミノ酸残基
　アラニン（Ａ）
３－２）ＨＣＹモチーフ中のシステイン（Ｃ）の置換後のアミノ酸残基
　セリン（Ｓ）
３－３）ＬＲＰモチーフ中のロイシン（Ｌ）の置換後のアミノ酸残基
　バリン（Ｖ）
　本発明の改変酵素はまた、Ｃ末端またはＮ末端に、他のペプチド成分（例、タグ部分）を有していてもよい。本発明の改変酵素に付加され得る他のペプチド成分としては、例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ　ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の目的タンパク質の精製に汎用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ－ｔａｇ）、シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分が挙げられる。
　本発明の改変酵素は、上述した特性が保持される限り、上記変異を有するグリシン酸化酵素のアミノ酸配列に対して、１または数個のアミノ酸残基の追加変異（例、置換、欠失、挿入および付加）を有していてもよい。追加変異の数は、例えば１～１００個、好ましくは１～５０個、より好ましくは１～４０個、さらにより好ましくは１～３０個、最も好ましくは１～２０個または１～１０個（例、１、２、３、４または５個）である。当業者は、上述した特性を保持するこのような改変酵素を適宜作製することができる。追加変異を有する本発明の改変酵素では、野生型酵素に対する改変酵素の活性の向上の程度は、１．３倍以上であることが好ましく、１．５倍以上であることがより好ましく、１．７倍以上であることがさらにより好ましく、２倍以上であることが特に好ましい。また、追加変異を有する本発明の改変酵素では、野生型酵素に対する改変酵素の熱安定性の向上の程度は、１．１倍以上であることが好ましく、１．２倍以上であることがより好ましい。
　したがって、本発明の改変酵素は、以下（ｉ）または（ｉｉ）であってもよい：
（ｉ）グリシン酸化酵素のアミノ酸配列において、ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニン、ＴＴＳモチーフ中のセリン、ＨＣＹモチーフ中のシステイン、ＬＲＰモチーフ中のロイシン、ＧＭＬモチーフ中のメチオニン、ＳＧモチーフ中のセリン、およびＰＧＴモチーフ中のグリシンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が変異（例、置換）したアミノ酸配列を含み、かつ、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性が改善されている、タンパク質；または
（ｉｉ）グリシン酸化酵素のアミノ酸配列におけるＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニン、ＴＴＳモチーフ中のセリン、ＨＣＹモチーフ中のシステイン、ＬＲＰモチーフ中のロイシン、ＧＭＬモチーフ中のメチオニン、ＳＧモチーフ中のセリン、およびＰＧＴモチーフ中のグリシンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が変異（例、置換）したアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の追加変異を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の改善された特性が保持されている、タンパク質。
　本発明の改変酵素は、上述した変異および追加変異の双方を有することにより、変異前の（野生型）グリシン酸化酵素のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。アミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上または９９％以上であってもよい。
　アミノ酸配列の同一性は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列の同一性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の同一性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ　Ｓｉｚｅ　ｔｏ　Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ酸配列の同一性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
　アミノ酸配列において追加変異を導入され得るアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸配列のアライメントを参考にして追加変異を導入することができる。具体的には、当業者は、１）複数のホモログのアミノ酸配列（例、配列番号２で表されるアミノ酸配列、および他のホモログのアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。また、グリシン酸化酵素については、上述したように立体構造の解析結果が報告されているので、当業者は、立体構造の解析結果に基づき、上述した特性の保持を可能にするように、追加変異を導入することができる。追加変異が導入される部位は、ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニン、ＴＴＳモチーフ中のセリン、ＨＣＹモチーフ中のシステイン、ＬＲＰモチーフ中のロイシン、ＧＭＬモチーフ中のメチオニン、ＳＧモチーフ中のセリン、およびＰＧＴモチーフ中のグリシン以外のアミノ酸残基であり、好ましくは、ＴＴＳモチーフ、ＴＴＳモチーフ、ＨＣＹモチーフ、ＬＲＰモチーフ、ＧＭＬモチーフ、ＳＧモチーフ、およびＰＧＴモチーフ中のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基であってもよい。
　アミノ酸残基の追加変異が置換である場合、アミノ酸残基のこのような置換は、保存的置換であってもよい。用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
　本発明の改変酵素は、本発明の改変酵素を発現する本発明の形質転換体を用いて、または無細胞系等を用いて、調製することができる。本発明の形質転換体は、例えば、本発明の発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入することにより作製できる。
　本発明の発現ベクターは、本発明の改変酵素をコードする本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を含む。本発明の発現ベクターはまた、本発明のポリヌクレオチドに加えて、プロモーター、ターミネーターおよび薬剤（例、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン）耐性遺伝子をコードする領域等の領域をさらに含むことができる。本発明の発現ベクターは、プラスミドであっても組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであってもよい。本発明の発現ベクターはまた、ウイルスベクターであっても無細胞系用ベクターであってもよい。本発明の発現ベクターはさらに、本発明のポリヌクレオチドに対して３’または５’末端側に、本発明の改変酵素に付加され得る他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、上述したような目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、上述したような目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む種々の発現ベクターが利用可能である。したがって、本発明の発現ベクターの作製のため、このような発現ベクターを利用してもよい。例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ－１５ｂ、ｐＥＴ－５１ｂ、ｐＥＴ－４１ａ、ｐＭＡＬ－ｐ５Ｇ）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ－５０ｂ）、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＣｏｌｄ　ＴＦ）、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを利用することができる。本発明の改変酵素とそれに付加された他のペプチド成分との切断をタンパク質発現後に可能にするため、本発明の発現ベクターは、プロテアーゼによる切断部位をコードする領域を、本発明の改変酵素をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとの間に含んでいてもよい。
　本発明の改変酵素を発現させるための宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌〔例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、およびバチルス属細菌〔例、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス属細菌〔例、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、ピヒア属細菌〔例、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ　ｓｔｉｐｉｔｉｓ）〕、アスペルギルス属細菌〔例、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）〕をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。宿主としては、所定の遺伝子を欠損する株を用いてもよい。形質転換体としては、例えば、細胞質中に発現ベクターを保有する形質転換体、およびゲノム上に目的遺伝子が導入された形質転換体が挙げられる。
　本発明の形質転換体は、所定の培養装置（例、試験管、フラスコ、ジャーファーメンター）を用いて、例えば後述の組成を有する培地において培養することができる。培養条件は適宜設定することができる。具体的には、培養温度は１０℃～３７℃であってもよく、ｐＨは６．５～７．５であってもよく、培養時間は１ｈ～１００ｈであってもよい。また、溶存酸素濃度を管理しつつ培養を行っても良い。この場合、培養液中の溶存酸素濃度（ＤＯ値）を制御の指標として用いることがある。大気中の酸素濃度を２１％とした場合の相対的な溶存酸素濃度ＤＯ値が、例えば１～１０％を、好ましくは３％～８％を下回らない様に、通気・攪拌条件を制御することが出来る。また、培養はバッチ培養であっても、フェドバッチ培養であっても良い。フェドバッチ培養の場合は糖源となる溶液やリン酸を含む溶液を培養液に連続的あるいは不連続的に逐次添加して、培養を継続することも出来る。
　形質転換される宿主は、上述したとおりであるが、大腸菌について詳述すると、大腸菌Ｋ１２株亜種のエシェリヒア　コリ　ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株などから選択することが出来る。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ｐｒｅｓｓ（２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて所定の酵素を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。
　本発明のポリヌクレオチドを発現させるプロモーターとしては、通常Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ５プロモーター等の強力なプロモーターが挙げられ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、ｌａｃが好ましい。また、ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体等を用いてもよい。他のベクターとしては、ファージＤＮＡのベクターを利用してもよい。さらに、プロモーターを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用してもよい。好ましくは、ベクターは、ｐＵＣ、ｐＳＴＶ、ｐＭＷであってもよい。
　また、本発明のポリヌクレオチドの下流に転写終結配列であるターミネーターを連結してもよい。このようなターミネーターとしては、例えば、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターが挙げられる。
　本発明のポリヌクレオチドを大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入および／または付加などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。
　また、形質転換体を選別するために、ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている〔例、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３－２（クローンテック製）〕。
　得られた本発明の発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養することにより、本発明の改変酵素を得ることができる。
　培地としては、Ｍ９－カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。培地は、所定の炭素源、窒素源、補酵素（例、塩酸ピリドキシン）を含有していてもよい。具体的には、ペプトン、酵母エキス、ＮａＣｌ、グルコース、ＭｇＳＯ４、硫酸アンモニウム、リン酸２水素カリウム、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、などを用いても良い。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモーター、宿主菌等の種類に応じて適宜選択される。
　本発明の改変酵素を回収するには、以下の方法などがある。本発明の改変酵素は、本発明の形質転換体を回収した後、菌体を破砕（例、ソニケーション、ホモジナイゼーション）あるいは溶解（例、リゾチーム処理）することにより、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、本発明の改変酵素を得ることができる。
　本発明は、グリシンの分析方法を提供する。本発明の分析方法は、本発明の改変酵素を用いて、被検試料中に含まれるグリシンを測定することを含み得る。
　被検試料としては、グリシンを含有すると疑われる試料である限り特に限定されず、例えば、生体由来試料（例、血液、尿、唾液、涙など）や食飲料品（例、栄養ドリンクやアミノ酸飲料など）が挙げられる。被検試料中のグリシンは、低濃度（例、１μＭ以上１ｍＭ未満等の１ｍＭ未満の濃度）であっても、高濃度（例、１ｍＭ以上１Ｍ未満等の１ｍＭ以上の濃度）であってもよい。
　本発明の分析方法は、本発明の改変酵素を用いてグリシンを測定できる限り特に限定されず、生成したグリオキシル酸を検出してもよく、また、グリオキシル酸の生成に伴い副生するＮＨ３またはＨ２Ｏ２を検出してもよい。あるいは、他の反応と共役させて、共役反応の生成物を検出してもよい。このような共役反応としては、例えば、以下の共役反応が挙げられる。
グリシン酸化反応）グリシン酸化酵素により触媒される反応
　グリシン＋Ｈ２Ｏ＋Ｏ２　→　グリオキシル酸＋ＮＨ３＋Ｈ２Ｏ２
共役反応）ペルオキシダーゼにより触媒される反応
　２Ｈ２Ｏ２＋４－アミノアンチピリン＋フェノール　→　キノンイミン色素＋４Ｈ２Ｏ
　上記共役反応を利用する場合、グリシンの測定は、本発明の改変酵素に加えて、４－アミノアンチピリンおよびフェノール、ならびにペルオキシダーゼを用いて行うことができる。具体的には、水溶液（例、緩衝液）中において、被検試料を４－アミノアンチピリン（４－ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ）およびフェノール、ならびにペルオキシダーゼと混合し、次いで、混合試料を上記の酵素反応に供し、最後に、生成したキノンイミン色素（ｑｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ　ｄｙｅ）の吸光度（約５００ｎｍ）を検出することにより、グリシンが測定される。測定は、定性的または定量的に行うことができる。測定は、例えば、全ての基質が反応するまで測定を行うエンドポイント法に基づいて行われてもよいし、レート法（初速度法）に基づいて行われてもよい。なお、酸化反応において必要とされる酸素量は微量であるため、反応系中の溶存酸素により必要な酸素量が賄えることから、通常、反応系中へ酸素や酸素を含む気体を強制的に供給する必要はない。
　本発明の改変酵素は、グリシン以外のアミノ酸（例、Ｌ－α－アミノ酸）に対して反応しないか、またはそれに対する反応性が極めて低い。したがって、被験試料中に、グリシンのみならず、他のアミノ酸が含まれている場合にも、本発明の改変酵素を用いることで、被験試料中のグリシンの量を特異的に評価することができる。
　また、本発明の改変酵素を用いた過酸化水素電極を用いることで、被験試料中のグリシンの量を特異的に評価することができる。
　さらに、本発明は、（Ａ）本発明の改変酵素を含む、グリシン分析用キットを包含する。
　本発明のキットは、（Ｂ）反応用緩衝液または緩衝塩、（Ｃ）過酸化水素検出試薬、（Ｄ）アンモニア検出試薬および（Ｅ）グリオキシル酸検出試薬の少なくとも一つをさらに含むことができる。
　（Ｂ）反応用緩衝液または緩衝塩は、反応液中のｐＨを目的の酵素反応に適した値に維持するために用いられる。
　（Ｃ）過酸化水素検出用試薬は、過酸化水素の検出を例えば発色や蛍光などによって行う場合に用いる。例えば、ペルオキシダーゼとその基質となり得る発色剤の組み合わせが挙げられ、具体的には、例えば西洋わさびペルオキシダーゼと４―アミノアンチピリンおよびフェノールの組み合わせなどが挙げられるが、この組み合わせに限定されない。
　（Ｄ）アンモニア検出試薬としては、例えばフェノールと次亜塩素酸を組み合わせたインドフェノール法などが挙げられる。
　（Ｅ）グリオキシル酸検出試薬としては、例えば非特許文献６に記載の試薬の組み合わせなどが挙げられる。
　本発明はまた、（ａ）デバイス、および（ｂ）本発明の改変酵素を含む、グリシン分析用検出系を提供する。
　本発明の改変酵素は、使用の際にデバイス中に供給され得るマイクロデバイスとは独立したユニットとして存在していてもよいが、予めデバイスに、注入、固定または配置されていてもよい。好ましくは、本発明の改変酵素は、予めデバイスに注入、固定または配置された形態で提供される。本発明の改変酵素のデバイスへの固定または配置は、直接的または間接的に行われる。デバイスとしては、例えば、流路を備えるマイクロ流路チップ等のマイクロデバイスを好適に用いることができる。
　本発明のグリシン分析用検出系は、（ｃ）反応用緩衝液または緩衝塩、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬およびグリオキシル酸検出試薬の少なくとも一つの構成要素をさらに含んでいてもよい。本発明のグリシン分析用検出系では、（ｃ）の構成要素の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、（ｃ）の構成要素の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態（例、異なる容器に収容された形態）で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない（ｃ）の構成要素は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。
　デバイスとしては、例えば、１）試料と（ｃ）の構成要素とを混合して混合液を調製するための第１区域、および調製された混合液を、本発明の改変酵素と接触させて、グリシンを検出するための第２区域を備えるデバイス（混合および検出の各工程が異なる区域中で行われるデバイス）；２）試料と（ｃ）の構成要素と本発明の改変酵素とを混合して、本発明の改変酵素によりグリシンを検出するための区域を備えるデバイス（混合および検出の各工程が同一区域中で行われるデバイス）；ならびに３）試料と（ｃ）の構成要素と（および必要応じて本発明の改変酵素と）の混合を可能にする流路、および本発明の改変酵素によりグリシンを検出するための区域を備えるデバイス（デバイスの注入口に試料を注入すると、流路を介して送液されて試料等が自動的に混合され、得られた混合液中のグリシンが検出区域中で自動検出されるデバイス）が挙げられる。自動化の観点からは、３）のデバイス、特にマイクロ流路デバイスの形態である３）のデバイスが好ましい。３）のデバイスでは、本発明の改変酵素は、流路を流れる送液中に提供されても、検出区域に固定または配置された形態で提供されてもよいが、好ましくは検出区域に固定または配置された形態で提供される。
　本発明はまた、（ａ）検出用電極、および（ｂ）検出用電極に固定または配置された本発明の改変酵素を含む、グリシン分析用酵素センサーを提供する。本発明の改変酵素は、電極に直接または間接的に固定または配置される。
　前記の検出用電極としては、例えば、過酸化水素検出用電極を用いることが可能であり、より具体的には、酵素式過酸化水素検出用電極や隔膜式過酸化水素検出用電極などが例として挙げられる。この場合、グリシン酸化活性によりグリシンが酸化された際に生じる過酸化水素を検出することで、グリシンの分析が可能となる。それ以外の構成は、公知のセンサーで採用されている構成をそのまま、あるいは適宜改変して利用することができる。
　以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕セルフリー合成系を用いたＧｌｙＯＸの合成およびＧｌｙＯＸの精製
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８株由来ＧｌｙＯＸの野生型の遺伝子または目的とする変異型の遺伝子を鋳型に用いて、２－ＳｔｅｐＰＣＲ法で、ヒスチジンタグおよびＴＥＶプロテアーゼ認識配列をＮ末端側に融合させ、かつ目的の変異が導入されたコンストラクトの直鎖状ＤＮＡを調製した。このＤＮＡを鋳型として用いて、大腸菌由来のセルフリー合成反応系でタンパク質を合成した。１ｍＬの反応スケールにて、透析法で６時間合成を行った産物を遠心し、その上清画分について、Ｎｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いたヒスチジンタグアフィニティ精製の溶出画分を得た。続いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＹＰＲＯ　ＯＲＡＮＧＥ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇｅｌ　Ｓｔａｉｎ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いた染色により目的酵素と考えられるタンパク質の存在を確認し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によるタンパク質定量を行った後、評価に供した。なお、野生型酵素についても同様の手順で、直鎖状ＤＮＡの調製、セルフリー合成、酵素の精製および分析を行った。精製には、下記の緩衝液を用いた。
結合バッファ：７５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　ＮａＰｉ、ｐＨ　８．０
洗浄バッファ：７５０ｍＭ　ＮａＣｌ，２０ｍＭ　ＮａＰｉ、ｐＨ　８．０
回収・測定バッファ：３００ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　ＮａＰｉ、３４ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ　７．０、１０％　Ｄ２Ｏ、０．０１％　ＮａＮ３
なお、変異を複数導入した変異型ＧｌｙＯＸを示す場合、導入した変異を／で区切り、続けて記載する。例えば、Ｔ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓは、Ｔ４２ＡとＣ２４５Ｓの２つの変異を有する変異型ＧｌｙＯＸであることを意味する。ＷＴは野生型であることを意味する。
〔実施例２〕活性測定
　実施例１で合成された野生型ＧｌｙＯＸおよび変異型ＧｌｙＯＸの活性評価は、以下の手順にて行った。まず、下記の反応液Ａおよび反応液Ｂを調製した。
反応液Ａ：４ｍＭ　フェノール、１００ｍＭ　リン酸カリウム、ｐＨ８．０
反応液Ｂ：５０ｍＭ　４－アミノアンチピリン、５００Ｕ／ｍｌ　ペルオキシダーゼ
続いて、９６穴マイクロプレートを用い、２５℃にて、反応液Ａを４９μｌ、反応液Ｂを１μｌ、２．５ｍＭ　Ｇｌｙまたは１００ｍＭ　Ｇｌｙを１０μｌ、超純水を２０μｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ　ＧｌｙＯＸを２０μｌ混合した液の、波長５００ｎｍにおける吸光度の３分後の変化をマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ　Ｍ２ｅ、モレキュラーデバイス　ジャパン株式会社）を用いて測定した。表７および８に、各変異型ＧｌｙＯＸの活性を、野生型ＧｌｙＯＸの活性に対する比で示した。各値は、同一サンプルについて３回実験を行った際の平均値より算出した。なお、表７は直鎖状ＤＮＡを調製する際に野生型の遺伝子を鋳型として用いて、表８は目的とする変異型の遺伝子を鋳型として用いて合成したタンパク質に関する結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
〔実施例３〕安定性の評価
　実施例１で合成された野生型酵素および変異型酵素の安定性評価は、下記手順にて行った。０．５ｍｇ／ｍｌ　ＧｌｙＯＸをマイクロチューブへ分注し、４℃、４０℃、５０℃、６０℃にて１時間インキュベーションした。その後、これら酵素液について、実施例２にて添加する基質溶液を１００ｍＭ　Ｇｌｙとした条件で、反応１０分後の吸光度変化から活性を測定し、４℃でインキュベーションした酵素液の活性に対する比として残存活性を求めることで、安定性を評価した。その結果を表９および１０に示す。各値は、表９のＬ３０１を変異したＧｌｙＯＸについては同一サンプルを用いた２回の実験から、それ以外のＧｌｙＯＸについては３回の実験から求めた平均値より算出した。なお、表９は直鎖状ＤＮＡを調製する際に野生型の遺伝子を鋳型として用いて、表１０は目的とする変異型の遺伝子を鋳型として用いて合成したタンパク質に関する結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
〔実施例４〕大腸菌を用いたＧｌｙＯＸ発現系およびＧｌｙＯＸの精製
　大腸菌を用いたＧｌｙＯＸの組換え発現系を構築した。まず、組換え発現用のプラスミドを構築した。ＤＮＡプライマー１（ＴＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡＴＧＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＧＡＴＴＧ：配列番号３）およびＤＮＡプライマー２（ＴＡＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＴＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＴＣＣＴＴＧＣＧＡＴＣ：配列番号４）を用いて、標準的なＰＣＲ法により目的遺伝子を増幅した。続いて、ＮｃｏＩ（タカラバイオ株式会社）とＸｈｏＩ（タカラバイオ株式会社）を用いて、ＰＣＲ産物とｐＥＴ－２８ａ（メルク株式会社）を制限酵素消化し、プラスミドの消化物はさらにＡｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．Ｃｏｌｉ　Ｃ７５）（タカラバイオ株式会社）で脱リン酸処理した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いて除タンパク及び不要な消化断片の除去を行った。得られた両産物を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ　Ｖｅｒ．２（東洋紡績株式会社）を用いてライゲーションし、標準的な方法でライゲーション産物による大腸菌ＤＨ５αの形質転換体を取得した。得られたＤＨ５αの形質転換体からプラスミドを抽出し、標準的なＤＮＡ配列の解析法を用いて、プラスミドへの目的遺伝子の挿入を確認した。この目的遺伝子が挿入されたプラスミドを、以後、ｐＥＴ２８ａ－ＧｌｙＯＸ、ｐＥＴ２８ａ－ＧｌｙＯＸによるＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体をｐＥＴ２８ａ－ＧｌｙＯＸ－ＢＬ２１（ＤＥ３）と呼ぶ。
　ＧｌｙＯＸの調製は、下記のようにして行った。まず、ｐＥＴ２８ａ－ＧｌｙＯＸ－ＢＬ２１（ＤＥ３）のグリセロールストックから、２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレートへ植菌し、３７℃で一晩、静置培養した。２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地５０ｍｌを２５０ｍｌ容量のバッフル付フラスコへ入れ、ＬＢプレート上のシングルコロニーから植菌し、３７℃で一晩、旋回振盪にて培養した。２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地２Ｌを５Ｌ容量のバッフル付フラスコへ入れ、先の一晩培養した液を全量添加し、ＯＤ６６０の値が０．５～０．６となった時点でＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるよう添加した。続いて、旋回振盪で３０℃の下一晩培養した後に集菌し、生理食塩水で洗浄後、破砕用バッファ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．０２μＭ　Ｆｌａｖｉｎ　ａｄｅｎｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ｐＨ８．０）にて菌体を懸濁し、超音波破砕機（２０１Ｍ、株式会社久保田製作所）を用いて１８０Ｗで２０分間処理した。この破砕液を１２０００×ｇで３０分間遠心し上清を回収した後、Ｗａｓｈバッファ（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０２μＭ　Ｆｌａｖｉｎ　ａｄｅｎｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ｐＨ７．５）で平衡化したＮｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）へ添加し、室温で５分穏和に転倒混和した後、エコノパックカラム（バイオ・ラッド　ラボラトリーズ株式会社）を用いて自然落下により溶液を除いた。続いてＷａｓｈバッファで洗浄した後、溶出バッファ（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、５００ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０２μＭ　Ｆｌａｖｉｎ　ａｄｅｎｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ｐＨ７．５）で目的タンパク質であるＧｌｙＯＸを溶出した。ＧｌｙＯＸ溶液は、限外濾過によりストック用バッファ（５０ｍＭ　リン酸カリウム、０．０２μＭ　Ｆｌａｖｉｎ　ａｄｅｎｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ｐＨ８．０）へ溶媒を置換し、濃度を０．５ｍｇ／ｍｌに調製した。
〔実施例５〕大腸菌を用いたＴ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ変異型の調製
　Ｔ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ変異型を、下記のようにして調製した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔｓ（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて、ｐＥＴ２８ａ－ＧｌｙＯＸを鋳型として製品添付のプロトコルに従い、ＧｌｙＯＸ遺伝子への変異導入を行った。変異の複数導入については、変異を入れたプラスミドを鋳型として用い変異を追加していくことで行った。この変異導入済みプラスミドを用いて、実施例４に記載の方法に従い組換え発現、精製および溶媒置換を行うことで、Ｔ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ変異型を取得した。
〔実施例６〕大腸菌を用いた変異型の調製
　目的とする変異型を、下記のようにして調製した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔｓ（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて、ｐＥＴ２８ａ－ＧｌｙＯＸを鋳型として製品添付のプロトコルに従い、ＧｌｙＯＸ遺伝子への変異導入を行った。変異の複数導入については、変異を入れたプラスミドを鋳型として用い変異を追加していくことで行った。この変異導入済みプラスミドを用いて、以下に記載の方法に従い組換え発現、精製および溶媒置換を行うことで、目的とする変異型を取得した。
　ＧｌｙＯＸの調製は、下記のようにして行った。まず、ｐＥＴ２８ａ－ＧｌｙＯＸ－ＢＬ２１（ＤＥ３）のグリセロールストックから、２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレートへ植菌し、３７℃で一晩、静置培養した。２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地５０ｍｌを２５０ｍｌ容量のバッフル付フラスコへ入れ、ＬＢプレート上のシングルコロニーから植菌し、３７℃で一晩、旋回振盪にて培養した。２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地１Ｌを５Ｌ容量のバッフル付フラスコへ入れ、先の一晩培養した液を１０ｍＬ添加し、ＯＤ６６０の値が０．５～０．６となった時点でＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるよう添加した。続いて、旋回振盪で３０℃の下一晩培養した後に集菌し、生理食塩水で洗浄後、破砕用バッファ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．０２μＭ　Ｆｌａｖｉｎ　ａｄｅｎｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ｐＨ８．０）にて菌体を懸濁し、超音波破砕機（２０１Ｍ、株式会社久保田製作所）を用いて１８０Ｗで２０分間処理した。この破砕液を１２０００×ｇで３０分間遠心し上清を回収した後、Ｗａｓｈバッファ（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０２μＭ　Ｆｌａｖｉｎ　ａｄｅｎｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ　ＦＦ　ｃｒｕｄｅ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）へ添加した。続いてＷａｓｈバッファで洗浄した後、溶出バッファ（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、５００ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０２μＭ　Ｆｌａｖｉｎ　ａｄｅｎｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ｐＨ７．５）で目的タンパク質であるＧｌｙＯＸを溶出した。ＧｌｙＯＸ溶液は、限外濾過によりストック用バッファ（５０ｍＭ　リン酸カリウム、０．０２μＭ　Ｆｌａｖｉｎ　ａｄｅｎｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ｐＨ８．０）へ溶媒を置換し、濃度を０．５ｍｇ／ｍｌに調製した。
〔実施例７〕活性測定
　野生型と実施例６で合成された変異型ＧｌｙＯＸについて、活性を評価した。具体的には、実施例２に示す組成のうち、酵素液を実施例６で調製したＧｌｙＯＸとした。その結果を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
〔実施例８〕安定性の評価
　野生型と実施例６で合成された変異型ＧｌｙＯＸについて、安定性を評価した。具体的には、実施例３に示す組成のうち、酵素液を実施例６で調製したＧｌｙＯＸとした。その結果を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
〔実施例９〕大腸菌を用いたＴ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ／Ｇ３０４Ｑ変異型の調製
　Ｔ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ／Ｇ３０４Ｑを実施例５と同様の方法で調製した。
〔実施例１０〕基質特異性の評価
　野生型とＴ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ変異型とＴ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ／Ｇ３０４Ｑ変異型について、基質特異性を確認した。具体的には、実施例２に示す組成のうち、酵素液を実施例４または実施例５または実施例９で調製したＧｌｙＯＸ溶液とし、基質としてＧｌｙ溶液の代わりに（１）１ｍＭ　Ｇｌｙ、（２）標準アミノ酸２０種類、シスチン、タウリン、シトルリン、オルニチンおよびα－アミノ酪酸をそれぞれ１ｍＭ含有する混合液、（３）（２）の２５種類の混合液からＧｌｙを除いたもの、のいずれかを用いて活性を求めることで評価した。なお、Ｔｙｒとシスチンは２Ｍ　ＨＣｌ、それ以外のアミノ酸は０．１Ｍ　ＨＣｌで溶解して１００ｍＭ溶液を調製し、各アミノ酸溶液を混合した後に超純水で１００倍希釈することでアミノ酸溶液を調製した。この際、（１）および（３）では、混合しないアミノ酸溶液の代わりに２Ｍ　ＨＣｌまたは／および０．１Ｍ　ＨＣｌを混合した。活性は、３７℃で波長５００ｎｍにおける吸光度の変化（ΔＡｂｓ５００）をマイクロプレートリーダーで検出することで求めた。野生型に関する結果を図１に、Ｔ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ変異型に関する結果を図２に、Ｔ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ／Ｇ３０４Ｑ変異型に関する結果を図３に示す。基質が上記（１）、（２）、（３）の場合を、それぞれＧｌｙ、２５ｍｉｘ、２５ｍｉｘ－Ｇｌｙと表現した。野生型、Ｔ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ変異型、Ｔ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ／Ｇ３０４Ｑ変異型すべて、Ｇｌｙ以外のアミノ酸に対する触媒活性は見られなかった。Ｇｌｙと共に他のアミノ酸が共存した条件下においては、野生型およびＴ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ／Ｇ３０４Ｑ変異型では他のアミノ酸による反応阻害が見られ、野生型の反応開始より１０分後のΔＡｂｓ５００はＧｌｙのみを基質とした場合の８５％、Ｔ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ／Ｇ３０４Ｑ変異型の反応開始より１０分後のΔＡｂｓ５００　はＧｌｙのみを基質とした場合の５２％であったが、Ｔ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ変異型については反応阻害が見られず性質が改善されていた。
〔実施例１１〕Ｇｌｙ濃度依存的な吸光度変化の確認
　Ｔ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ変異型またはＴ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ／Ｇ３０４Ｑ変異型を用いて、反応系中のＧｌｙ濃度とエンドポイント法で得られる吸光度との関係を確認した。まず、反応液Ｃ（４ｍＭ　フェノール、１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０）を調製し、９６穴マイクロプレートを用いて３７℃にて、反応液Ｃを４９μｌ、５０ｍＭ　４－アミノアンチピリンを１μｌ、５００Ｕ／ｍｌ　ペルオキシダーゼを１μｌ、各種濃度のＧｌｙ水溶液１０μｌ、超純水を１９μｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ　ＧｌｙＯＸを２０μｌ混合した液の、１０分後の波長５００ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。この実験を３回行い、平均値を求めた。酵素液には実施例５または実施例９で調製したＧｌｙＯＸ溶液を、Ｇｌｙ水溶液は０Ｍ（すなわち超純水）、０．０２５ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭの濃度に調製したものを用いた。反応系中のＧｌｙ濃度と吸光度の関係は、図４または５に示す通り良好な正の相関を示し、本酵素を用いたＧｌｙの測定が可能であることが示された。なお、図４または５におけるエラーバーは標準偏差を示す。
〔実施例１２〕血漿中Ｇｌｙの定量分析
　Ｔ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ変異型またはＴ４２Ａ／Ｃ２４５Ｓ／Ｌ３０１Ｖ／Ｇ３０４Ｑ変異型を用いて、ヒト血漿中のＧｌｙを定量分析した。反応、測定はキュベットを用いて３７℃にて行った。実施例１１の反応液Ｃを４４１μｌ、５０ｍＭ　４－アミノアンチピリンを９μｌ、５００Ｕ／ｍｌ　ペルオキシダーゼを９μｌ、超純水を１７１μｌ、測定検体として各種濃度のＧｌｙ水溶液またはヒト血漿を９０μｌ混合した液（合計７２０μｌ）へ４．０ｍｇ／ｍｌ　ＧｌｙＯＸを１８０μｌ混合させる前および混合１０分後の波長５００ｎｍおよび８００ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ５００ｎｍ（前）、Ａｂｓ５００ｎｍ（後）、Ａｂｓ８００ｎｍ（前）、Ａｂｓ８００ｎｍ（後））を測定した。酵素液には実施例５または実施例９で調製したＧｌｙＯＸ溶液を、Ｇｌｙ水溶液には０Ｍ（すなわち超純水）、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭの濃度に調製したものを用いた。
　反応前後の各測定ポイントにおける吸光度としては、Ａｂｓ５００ｎｍ－Ａｂｓ８００ｎｍの値を用い、酵素液添加の前後における吸光度の変化量（ΔＡｂｓ）は、（Ａｂｓ５００ｎｍ（後）－Ａｂｓ８００ｎｍ（後））－（Ａｂｓ５００ｎｍ（前）－Ａｂｓ８００ｎｍ（前））×７２０÷９００として求めた。検体としてＧｌｙ水溶液を用いた際のΔＡｂｓとＧｌｙ濃度との関係から検量線を作成し、検体としてヒト血漿を用いた際のΔＡｂｓから、ヒト血漿中のＧｌｙ濃度を求めた。検量線は、各Ｇｌｙ濃度において３回実験を行った際の平均値を用いて作成し、同一ロットのヒト血漿サンプルを６回分析して、アミノ酸アナライザーにおける分析値（３３２μＭ）と比較した。以上を方法１として、結果を表１３または１４に示す。また、例えば体外診断用医薬品　認証番号第２２１ＡＡＡＭＸ０００１００００号　ダイヤカラー・リキッドＢＴＲ（東洋紡績株式会社）の添付文書に記載されているように、検体中の分析対象成分に基づく吸光度値と、既知濃度の分析対象成分に基づく吸光度値との比から濃度を求める方法（方法２）でＧｌｙ濃度を求めた結果を、併せて表１３または１４に示す。いずれの方法を用いても、正確性、精密性ともに良好な結果となり、変異型ＧｌｙＯＸを用いたＧｌｙ測定系を用いることで、ヒト血漿中のＧｌｙ濃度を精度良く定量分析できることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　本発明の改変酵素は、グリシンの迅速かつ高感度な測定、および／またはグリシンオキシレートの製造に有用である。本発明の改変酵素はまた、液状試薬として有用である。本発明の改変酵素はさらに、グリシンの特異的な測定に有用である。本発明の分析方法は、例えば、生体研究、健康栄養、医療、食品製造など広範な分野において有用である。

Claims (23)

  1. 　以下：
    （ａ）グリシンに対するグリシン酸化酵素の活性；
    （ｂ）グリシン酸化酵素の熱安定性；および
    （ｃ）グリシンに対するグリシン酸化酵素の基質特異性；
    からなる群より選ばれる、グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の１以上の特性を改善するようにその少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させた、改変酵素。
  2. 　変異が、グリシン酸化酵素のアミノ酸配列における（ａ）ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニンの置換、（ｂ）ＴＴＳモチーフ中のセリンの置換、（ｃ）ＨＣＹモチーフ中のシステインの置換、（ｄ）ＬＲＰモチーフ中のロイシンの置換、（ｅ）ＧＭＬモチーフ中のメチオニンの置換、（ｆ）ＳＧモチーフ中のセリンの置換、および（ｇ）ＰＧＴモチーフ中のグリシンの置換からなる群より選ばれる１以上の置換である、請求項１記載の改変酵素。
  3. 　ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニンが、アラニン、セリン、システイン、またはグリシンに置換されている、請求項２記載の改変酵素。
  4. 　ＴＴＳモチーフ中のセリンが、リジンに置換されている、請求項２または３記載の改変酵素。
  5. 　ＨＣＹモチーフ中のシステインが、アラニン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、アスパラギン、トリプトファン、チロシン、またはセリンに置換されている、請求項２～４のいずれか一項記載の改変酵素。
  6. 　ＬＲＰモチーフ中のロイシンが、イソロイシン、バリン、システイン、スレオニン、またはプロリンに置換されている、請求項２～５のいずれか一項記載の改変酵素。
  7. 　ＧＭＬモチーフ中のメチオニンが、イソロイシンに置換されている、請求項２～６のいずれか一項記載の改変酵素。
  8. 　ＳＧモチーフ中のセリンが、アルギニンに置換されている、請求項２～７のいずれか一項記載の改変酵素。
  9. 　ＰＧＴモチーフ中のグリシンが、チロシン、またはグルタミンに置換されている、請求項２～８のいずれか一項記載の改変酵素。
  10. 　グリシン酸化酵素がバチルス属に由来する、請求項１～９のいずれか一項記載の改変酵素。
  11. 　以下（１）あるいは（２）のタンパク質である、請求項１～１０のいずれか一項記載の改変酵素：
    （１）配列番号２のアミノ酸配列において、ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニン、ＴＴＳモチーフ中のセリン、ＨＣＹモチーフ中のシステイン、ＬＲＰモチーフ中のロイシン、ＧＭＬモチーフ中のメチオニン、ＳＧモチーフ中のセリン、およびＰＧＴモチーフ中のグリシンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、下記（ｉ）～（ｖｉｉ）に示されるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、タンパク質：
    （ｉ）ＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニンの置換
    　アラニン、セリン、システイン、またはグリシン；
    （ｉｉ）ＴＴＳモチーフ中のセリンの置換
    　リジン；
    （ｉｉｉ）ＨＣＹモチーフ中のシステインの置換
    　アラニン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、アスパラギン、トリプトファン、チロシン、またはセリン；
    （ｉｖ）ＬＲＰモチーフ中のロイシンの置換
    　イソロイシン、バリン、システイン、スレオニン、またはプロリン
    （ｖ）ＧＭＬモチーフ中のメチオニンの置換
    　イソロイシン；
    （ｖｉ）ＳＧモチーフ中のセリンの置換
    　アルギニン；
    （ｖｉｉ）ＰＧＴモチーフ中のグリシンの置換
    　チロシン、またはグルタミン。
    （２）配列番号２のアミノ酸配列におけるＴＴＳモチーフ中の第１のスレオニン、ＴＴＳモチーフ中のセリン、ＨＣＹモチーフ中のシステイン、ＬＲＰモチーフ中のロイシン、ＧＭＬモチーフ中のメチオニン、ＳＧモチーフ中のセリン、およびＰＧＴモチーフ中のグリシンからなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、上記（ｉ）～（ｖｉｉ）に示されるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の追加変異を有するアミノ酸配列を含み、かつ、下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選ばれる１以上の特性が改善されている、タンパク質：
    （ａ）グリシンに対するグリシン酸化酵素の活性；
    （ｂ）グリシン酸化酵素の熱安定性；および
    （ｃ）グリシンに対するグリシン酸化酵素の基質特異性。
  12. 　請求項１～１１のいずれか一項記載の改変酵素を用いて被検試料中に含まれるグリシンを測定することを含む、グリシンの分析方法。
  13. 　グリシンの測定が、請求項１～１１のいずれか一項記載の改変酵素に加えて、４－アミノアンチピリンおよびフェノール、ならびにペルオキシダーゼを用いて行われる、請求項１２記載の方法。
  14. 　請求項１～１１のいずれか一項記載の改変酵素を用いてグリシンからグリオキシル酸を生成することを含む、グリオキシル酸の製造方法。
  15. 　請求項１～１１のいずれか一項記載の改変酵素をコードするポリヌクレオチド。
  16. 　請求項１５記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  17. 　請求項１６記載の発現ベクターを含む形質転換体。
  18. 　グリシンの測定に関連するグリシン酸化酵素の特性を改善するようにその少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させた改変酵素を、請求項１７記載の形質転換体を用いて生成することを含む、改変酵素の製造方法。
  19. 　請求項１～１１のいずれか一項記載の改変酵素を含む、グリシン分析用キット。
  20. 　反応用緩衝液または緩衝塩、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬およびグリオキシル酸検出試薬の少なくとも一つをさらに含む、請求項１９記載のグリシン分析用キット。
  21. 　（ａ）デバイス、および（ｂ）請求項１～１１のいずれか一項記載の改変酵素を含む、グリシン分析用検出系。
  22. 　（ｃ）反応用緩衝液または緩衝塩、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬およびグリオキシル酸検出試薬の少なくとも一つをさらに含み、かつデバイスがマイクロ流路チップである、請求項２１記載のグリシン分析用検出系。
  23. 　（ａ）検出用電極、および（ｂ）検出用電極に固定または配置された、請求項１～１１のいずれか一項記載の改変酵素を含む、グリシン分析用酵素センサー。
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