WO2014157282A1 - フロー式分析用吸光度検出装置及びフロー式分析装置 - Google Patents

フロー式分析用吸光度検出装置及びフロー式分析装置 Download PDF

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wavelength led
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卓也 與谷
博暁 太平
秀樹 村木
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積水メディカル株式会社
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    • G01N2201/0627—Use of several LED's for spectral resolution

Definitions

  • the present invention relates to a liquid chromatography, FIA (Flow Injection Analysis), an absorbance detection apparatus for other flow analysis, and a flow analysis apparatus using the same.
  • FIA Flow Injection Analysis
  • liquid chromatography In the fields of organic chemistry, biochemistry, medicine, food, environment, etc., liquid chromatography, FIA, and other flow analysis are widely used for separation, analysis, and fractionation of components in samples.
  • liquid chromatography a sample is injected into the flow path of the carrier liquid, and components in the sample are separated by a column apparatus on the downstream side. Then, the components are detected by measuring the absorbance of each separated component with an absorbance detector, and the result is expressed as a chromatogram.
  • the amount of transmitted light when irradiated with light having a main wavelength for example, 415 nm
  • a main wavelength for example, 415 nm
  • hemoglobins such as hemoglobin A1c, and hemoglobin A1c
  • a sub-wavelength for example, 500 nm
  • a halogen lamp having a wide emission wavelength band is used as a light source, the light is incident on the flow cell as parallel light by a collimator lens, and the light emitted from the flow cell is branched by a beam splitter. is doing. Then, one of the branched lights passes through a band-pass filter having a main wavelength (for example, 415 nm) and is received by a photodiode to measure the amount of transmitted light of the main wavelength, and the other light is a band having a sub-wavelength (for example, 500 nm). The transmitted light of the sub-wavelength is measured by receiving light with another photodiode through a pass filter.
  • a main wavelength for example, 415 nm
  • a power supply capacity for lighting the lamp is required to be about 20 W, and the lamp also generates heat, which requires lamp cooling. This makes it difficult to reduce the size.
  • an LED light emitting diode
  • the emission wavelength band is narrow, so in one LED, the vicinity of the central wavelength with a large amount of light cannot be used as the main wavelength and the sub wavelength, and the main wavelength and the sub wavelength have a small amount of light emission. Near both ends of the wavelength band. For this reason, the amount of light detected at the main wavelength and the sub-wavelength in the photodiode is reduced, so that the amplification factor in photocurrent conversion must be increased, and noise increases.
  • the present invention has an object to provide a flow-type absorbance detection apparatus for flow analysis that does not increase noise while realizing miniaturization using an LED as a light source.
  • a flow-type analytical absorbance detection apparatus includes a flow cell through which a liquid to be measured flows, and a main light capable of pulse-outputting light having a predetermined main wavelength to the flow cell.
  • a sub-wavelength LED capable of pulse-outputting light of a sub-wavelength different from the main wavelength with respect to the wavelength LED and the flow cell, and output from the main wavelength LED and the sub-wavelength LED at different timings
  • a receiver that can detect the transmitted light amount of each wavelength transmitted through the flow cell, and an arithmetic unit that calculates absorbance based on the difference between the transmitted light amount of the main wavelength and the transmitted light amount of the sub wavelength. Consists of including.
  • downsizing can be achieved by using an LED as a light source.
  • an LED as a light source.
  • outputting the light of the main wavelength and the sub wavelength from different LEDs at different timings it is possible to increase the amount of light of each wavelength, reduce the amplification factor of the photocurrent conversion, and reduce noise. it can.
  • Schematic which shows one Embodiment of the liquid chromatography apparatus which is an application object of this invention 1 is a schematic diagram showing a first embodiment of an absorbance detection apparatus according to the present invention.
  • the figure which shows the wavelength characteristic of main wavelength LED and subwavelength LED Diagram showing pulse lighting of main wavelength LED and sub wavelength LED Flow chart showing calculation processing contents Schematic which shows 2nd Embodiment of the absorbance detection apparatus which concerns on this invention.
  • FIG. 1 is a schematic view showing an embodiment of a liquid chromatography apparatus to which the present invention is applied.
  • the liquid chromatography apparatus of FIG. 1 is a flow-type biochemical analysis apparatus using the principle of high performance liquid chromatography (HPLC). For example, each component of hemoglobin including blood hemoglobin A1c is obtained using blood as a sample. Used for analysis.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the flow-type biochemical analyzer of FIG. 1 includes a carrier liquid storage tank 1, a liquid feed pump 2 that continuously feeds the carrier liquid from the storage tank 1, and a carrier liquid fed by the liquid feed pump 2.
  • a flow path 3 a sample injection apparatus 4 that is arranged in the flow path 3 of the carrier liquid and injects a sample, a column apparatus 5 that is arranged downstream of the sample injection apparatus 4 and separates components in the sample, and a column apparatus 5 and an absorbance detector 6 that detects the separated component by absorbance.
  • the sample injection by the sample injection device 4 is performed by sucking and collecting the sample from a sample container (not shown) with a needle (not shown) and then injecting the sample into the sample injection device 4.
  • the carrier liquid containing the sample that has passed through the detection device 6 is collected in the drainage tank 7.
  • FIG. 2 is a schematic view showing a first embodiment of the absorbance detection apparatus according to the present invention.
  • the flow cell 100 has a liquid inlet 101 and a liquid outlet 102, and a liquid to be measured including a component separated by the column device 5 (FIG. 1) flows therethrough.
  • the flow cell 100 also has an entrance surface 100a and an exit surface 100b with a flow-through portion of the liquid to be measured interposed therebetween.
  • a two-wavelength light source 103 and a collimating lens 108 are disposed on the incident surface 100a side of the flow cell 100.
  • the two-wavelength light source 103 includes a main wavelength LED 105 and a sub wavelength LED 106 incorporated in one chip 104.
  • the chip 104 further includes a photodiode 107.
  • the main wavelength LED 105 is an LED that emits light having a wavelength of, for example, 415 nm, which is absorbed by hemoglobins such as hemoglobin A1c, which is a detection component in the liquid to be measured.
  • the sub-wavelength LED 106 is an LED that emits light having a wavelength of, for example, 500 nm outside the absorption range of hemoglobins such as hemoglobin A1c that is a detection component in the liquid to be measured.
  • the main wavelength LED 105 and the sub wavelength LED 106 are configured to be energized by different ON signals, and can output pulses at different timings.
  • FIG. 3 shows the wavelength characteristics of the main wavelength LED 105 and the sub wavelength LED 106.
  • the dotted line in FIG. 3 represents the wavelength characteristics of the LED when the two-wavelength method is realized with one LED as in the conventional example.
  • the photodiode 107 is disposed so as to be able to detect the light amounts of the main wavelength LED 105 and the sub wavelength LED 106.
  • the collimator lens 108 collimates the light from the main wavelength LED 105 and the sub wavelength LED 106 constituting the two-wavelength light source 103 and enters the incident surface 100 a of the flow cell 100.
  • a beam splitter 110 is disposed on the emission surface 100 b side of the flow cell 100.
  • the beam splitter 110 branches the light emitted from the flow cell 100.
  • a band pass filter 111 having a main wavelength (for example, 415 nm) and a photodiode 112 that receives light that has passed through the band pass filter 111 are disposed on one side of the branch optical path.
  • a band-pass filter 113 having a sub-wavelength (for example, 500 nm) and a photodiode 114 that receives light that has passed through the band-pass filter 113 are arranged.
  • the photodiodes 112, 114, and 107 are used as the light receivers, but other examples include photomultiplier tubes and phototransistors. From the viewpoint of miniaturization, it is preferable to use a photodiode or a phototransistor as a light receiver.
  • the transmitted light amount of 415 nm is measured by the photodiode 112, and at the same time, the light amount (light source light amount) of the main wavelength LED 105 is monitored by the photodiode 107. Then, the drift and fluctuation of the LED light amount are corrected by correcting the transmitted light amount of 415 nm with the light source light amount by calculation.
  • the transmitted light amount of 500 nm is measured by the photodiode 114, and at the same time, the light amount (light source light amount) of the sub-wavelength LED 106 is monitored by the photodiode 107.
  • the drift and fluctuation of the LED light amount are corrected by correcting the transmitted light amount of 500 nm with the light source light amount by calculation.
  • the corrected transmitted light amount of 500 nm is subtracted from the corrected transmitted light amount of 415 nm, and the absorbance is calculated based on these differences.
  • FIG. 5 is a flowchart showing the contents of the arithmetic processing of this embodiment.
  • the 415 nm dominant wavelength LED 105 is pulsed.
  • a signal from the photodiode 112 is read while the main wavelength LED 105 of 415 nm is pulsed, and a transmitted light amount of 415 nm is detected.
  • the signal from the photodiode 107 is read to detect the light amount of the main wavelength LED 105.
  • the transmitted light amount of 415 nm is corrected by the LED light amount.
  • the 500 nm sub-wavelength LED 106 is pulse-lit.
  • the signal from the photodiode 114 is read while the 500 nm sub-wavelength LED 106 is pulsed, and the transmitted light amount of 500 nm is detected.
  • the signal from the photodiode 107 is read to detect the light quantity of the sub-wavelength LED 106.
  • the transmitted light amount of 500 nm is corrected with the LED light amount.
  • the light-emission equivalent value is obtained by subtracting the light-transmitted light of 500 nm after correction determined in S6 from the light transmission of 415 nm after correction obtained in S3. This portion corresponds to an absorbance calculation unit.
  • the detection signal of the absorbance detection device is sent to a data processing device (not shown), and the data processing result in the data processing device is output as the analysis result. It should be noted that the process of S1 to S6 may be repeatedly executed and then the process of S7 may be performed, or the process of S1 to S7 may be repeatedly executed.
  • the absorbance detection apparatus for liquid chromatography includes a flow cell 100 through which a liquid to be measured flows, a main wavelength LED 105 that can output pulses of light having a predetermined main wavelength to the flow cell 100, and the flow cell 100.
  • the sub-wavelength LED 106 capable of pulse-outputting light having a sub-wavelength different from the main wavelength at a timing different from the main wavelength, and the flow cell 100 being output from the main wavelength LED 105 and the sub-wavelength LED 106 at different timings.
  • Receivers that can detect the transmitted light amount of each wavelength that has passed through the light source, and an arithmetic unit that calculates the absorbance based on the difference between the transmitted light amount of the main wavelength and the transmitted light amount of the sub wavelength Since (S7) is included, the following effects are obtained. Miniaturization can be achieved by using an LED as the light source. In addition, by outputting the light of the main wavelength and the sub wavelength from different LEDs at different timings, it is possible to increase the amount of light of each wavelength, reduce the amplification factor of the photocurrent conversion, and reduce noise. it can. In other words, by using two LEDs specializing in two wavelengths, a light source with high energy intensity can be obtained and noise can be reduced.
  • the main wavelength LED 105 and the sub wavelength LED 106 are built in one chip 104 and arranged in the same optical path with respect to the flow cell 100, thereby simplifying the configuration on the incident side of the flow cell 100. And the size of the apparatus can be reduced.
  • the photodiode 107 is provided in the chip 104 of the main wavelength LED 105 and the sub wavelength LED 106 and detects the light amount of the main wavelength LED 105 and the sub wavelength LED 106, the light source light amount is detected, and the light source It is easy to remove noise and drift from the origin.
  • the present embodiment by alternately lighting the main wavelength LED 105 and the sub wavelength LED 106 in a pulsed manner, it is possible to obtain absorption characteristics of two wavelengths alternately.
  • the liquid chromatography device (flow type biochemical analyzer) of the present embodiment includes a sample injection device 4 for injecting a sample into the carrier liquid flow path 3 and a flow of the carrier liquid downstream from the sample injection device 4.
  • a column device 5 that is disposed in the channel and separates components in the sample;
  • an absorbance detection device 6 configured as described above that is disposed in the flow path of the carrier liquid downstream from the column device 5 and detects the components in the sample; Therefore, the performance improvement and miniaturization of the liquid chromatography apparatus can be achieved by improving the detection accuracy and miniaturization of the absorbance detection apparatus.
  • FIG. 6 is a schematic view showing a second embodiment of the absorbance detection apparatus according to the present invention.
  • the primary wavelength LED and the secondary wavelength LED are configured as separate chips and are arranged on different paths with respect to the flow cell.
  • a beam splitter 120 is disposed on the incident surface 100 a side of the flow cell 100.
  • the beam splitter 120 can direct light from the first optical path and light from the second optical path toward the incident surface 100 a of the flow cell 100.
  • a first light source 121, a collimating lens 125, and a band pass filter 126 are disposed in the first optical path.
  • the first light source 121 is composed of a main wavelength LED 123 built in one chip 122.
  • the chip 122 further includes a photodiode 124.
  • the main wavelength LED 123 is an LED that emits light having a wavelength of, for example, 415 nm, which is absorbed by hemoglobins such as hemoglobin A1c, which is a detection component in the liquid to be measured.
  • the photodiode 124 is disposed so as to be able to detect the light amount of the main wavelength LED 123.
  • the collimating lens 125 turns the light from the main wavelength LED 123 constituting the first light source 121 into parallel light and directs it to the beam splitter 120.
  • the band pass filter 126 allows the light of the main wavelength (415 nm) to pass through and enters the beam splitter 120.
  • a second light source 127 In the second optical path, a second light source 127, a collimating lens 131, and a band pass filter 132 are disposed.
  • the second light source 127 includes a sub-wavelength LED 129 built in one chip 128.
  • the chip 128 further incorporates a photodiode 130.
  • the sub-wavelength LED 129 is an LED that emits light having a wavelength of, for example, 500 nm outside the absorption range of hemoglobins such as hemoglobin A1c that is a detection component in the liquid to be measured.
  • the photodiode 130 is disposed so as to be able to detect the light amount of the sub-wavelength LED 129.
  • the collimating lens 131 turns the light from the sub-wavelength LED 129 constituting the second light source 127 into parallel light and directs it to the beam splitter 120.
  • the band pass filter 132 allows the light of the sub wavelength (500 nm) to pass through and enters the beam splitter 120.
  • a photodiode 133 is disposed on the emission surface 100 b side of the flow cell 100.
  • the photodiode 133 receives light from the emission surface 100b of the flow cell 100 and outputs a signal corresponding to the amount of light received.
  • the operation of this embodiment will be described.
  • the primary wavelength LED 123 of the first light source 121 and the sub wavelength LED 129 of the second light source 127 are alternately turned on at different timings.
  • the transmitted light amount of 415 nm is measured by the photodiode 133, and at the same time, the light amount (light source light amount) of the main wavelength LED 123 is monitored by the photodiode 124. Then, the drift and fluctuation of the LED light amount are corrected by correcting the transmitted light amount of 415 nm with the light source light amount by calculation.
  • the transmitted light amount of 500 nm is measured by the photodiode 133, and at the same time, the light amount (light source light amount) of the sub-wavelength LED 123 is monitored by the photodiode 130.
  • the drift and fluctuation of the LED light amount are corrected by correcting the transmitted light amount of 500 nm with the light source light amount by calculation.
  • the corrected transmitted light amount of 500 nm is subtracted from the corrected transmitted light amount of 415 nm, and the absorbance is calculated based on these differences.
  • the primary wavelength LED 123 and the secondary wavelength LED 129 are configured as separate chips and are arranged in different optical paths with respect to the flow cell 100.
  • An optical system (beam splitter 120) that directs light from the main wavelength LED 123 and the sub wavelength LED 129 toward the flow cell 100 is provided between the main wavelength LED 123 and the sub wavelength LED 129 and the flow cell 100.
  • downsizing can be achieved by using an LED as a light source.
  • by outputting the light of the main wavelength and the sub wavelength from different LEDs at different timings it is possible to increase the amount of light of each wavelength, reduce the amplification factor of the photocurrent conversion, and reduce noise. it can.
  • the main wavelength LED 123 and the sub wavelength LED 129 are formed as separate chips, so that the beam splitter 120 is required on the incident side of the flow cell 100.
  • the bandpass filters 126 and 132 are disposed on the incident side.
  • the photodiodes 124 and 130 that detect the light amount of each LED are provided in the chips of the main wavelength LED 123 and the sub wavelength LED 129, the light amount of the light source is detected, and noise derived from the light source. And drift can be removed easily.
  • FIG. 7 is a schematic view showing a third embodiment of the absorbance detection apparatus according to the present invention.
  • the third embodiment is a modification of the second embodiment and does not include photodiodes (124 and 130 in FIG. 6) in the first light source 121 and the second light source 127.
  • the beam splitter 120 reflects a part of the light from the first light source 121 (main wavelength LED 123) and transmits a part of the light from the second light source 127 (sub wavelength LED 129),
  • a photodiode 135 as a light receiver is arranged on the same optical path.
  • the pulse lighting is alternately performed at different timings for the primary wavelength LED 123 of the first light source 121 and the sub wavelength LED 129 of the second light source 127.
  • the main wavelength LED 123 of 415 nm When the main wavelength LED 123 of 415 nm is turned on, the amount of transmitted light at 415 nm is measured by the photodiode 133, and at the same time, the amount of light before entering the flow cell 100 is monitored by the photodiode 135. Then, the drift and fluctuation of the LED light amount are corrected by correcting the transmitted light amount of 415 nm with the light amount before incident light by calculation.
  • the 500 nm sub-wavelength LED 129 When the 500 nm sub-wavelength LED 129 is turned on, the amount of transmitted light of 500 nm is measured by the photodiode 133, and at the same time, the amount of light before entering the flow cell 100 is monitored by the photodiode 135. Then, the drift and fluctuation of the LED light amount are corrected by correcting the transmitted light amount of 500 nm with the light amount before incident light by calculation.
  • the corrected transmitted light amount of 500 nm is subtracted from the corrected transmitted light amount of 415 nm, and the absorbance is calculated based on these differences.
  • the optical system (beam splitter 120) that separates and condenses each part of the light from the primary wavelength LED 123 and the secondary wavelength LED 129 on the same optical path before entering the flow cell 100; And a light receiver (photodiode 135) disposed on a condensing optical path by an optical system (beam splitter 120). Even with such a configuration, it becomes easy to indirectly detect the light amount of the light source and remove noise and drift derived from the light source.
  • the drift of the light source is calculated by calculation based on the detection signals of the photodiode 107 (FIG. 2), the photodiodes 124 and 130 (FIG. 6), and the photodiode 135 (FIG. 7).
  • the light quantity of the light source may be made constant by providing feedback in hardware.
  • the main wavelength LED 105 When the main wavelength LED 105 is pulsed, the light amount of the light source is monitored by the photodiode 107, and the applied current to the main wavelength LED 105 is adjusted so that the light amount is constant. By doing so, the drift and fluctuation of the LED light amount are corrected.
  • the sub-wavelength LED 106 when the sub-wavelength LED 106 is turned on, the light amount of the light source is monitored by the photodiode 107, and the applied current to the sub-wavelength LED 106 is adjusted so that the light amount is constant, thereby correcting the drift and fluctuation of the LED light amount. To do.
  • the main wavelength and the sub wavelength have been described with examples of 415 nm and 500 nm in consideration of hemoglobins such as hemoglobin A1c.
  • the detection example has been described in the example of detecting a component in blood, but is not limited to this, and can be applied to liquid chromatography, FIA, and other flow type analysis in general.
  • Absorption detector for liquid chromatography, FIA, and other flow analysis according to the present invention and liquid chromatography device, FIA apparatus, and other flow analysis device using the same, separation, analysis of components in various samples, It can be suitably used for sorting, and can contribute to miniaturization and high accuracy of a medical examination apparatus and the like, and has great industrial applicability.

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Abstract

　被測定液が通流するフローセル１００に対し、予め定めた主波長（例えば４１５ｎｍ）の光をパルス出力可能な主波長ＬＥＤ１０５と、前記主波長とは異なる副波長（例えば５００ｎｍ）の光を前記主波長とは異なるタイミングでパルス出力可能な副波長ＬＥＤ１０６とを設ける。また、主波長ＬＥＤ１０５及び副波長ＬＥＤ１０６から出力されてフローセル１００を透過した各波長の透過光量をそれぞれ検出可能なフォトダイオード１１２、１１４を設ける。そして、前記主波長の透過光量と前記副波長の透過光量との差に基づいて、吸光度を算出する。

Description

フロー式分析用吸光度検出装置及びフロー式分析装置
　本発明は、液体クロマトグラフィー、ＦＩＡ（Flow Injection Analysis ）、他フロー式分析用の吸光度検出装置、及びこれを用いたフロー式分析装置に関する。
　有機化学、生化学、医学、食品、環境などの分野において、試料中の成分の分離、分析、分取に液体クロマトグラフィー、ＦＩＡ、他フロー式分析が汎用されている。
　液体クロマトグラフィーでは、キャリア液の流路に試料が注入され、その下流側でカラム装置により試料中の成分が分離される。そして、分離された各成分について、吸光度検出装置により吸光度を測定することで、成分の検出がなされ、その結果はクロマトグラムとして表される。
　ここで、吸光度検出については、液性ノイズの低減のため、特許文献１に示される手法（２波長方式）が採用されている。
　これは、例えば、血液中の糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビンＡ１ｃの検出に際し、ヘモグロビンＡ１ｃなどのヘモグロビン類の検出に適した主波長（例えば４１５ｎｍ）の光を照射した場合の透過光量と、ヘモグロビンＡ１ｃなどのヘモグロビン類を検出しない副波長（例えば５００ｎｍ）の光を照射した場合の透過光量とを測定し、主波長の透過光量と副波長の透過光量との差に基づいて、吸光度を算出することで、液性ノイズをキャンセルしている。
　具体的には、従来の２波長方式では、光源として、発光波長帯域の広いハロゲンランプを用い、その光をコリメートレンズにより平行光としてフローセルに入射し、このフローセルから出た光をビームスプリッタにより分岐している。そして、分岐した一方の光は主波長（例えば４１５ｎｍ）のバンドパスフィルタを通し、フォトダイオードで受光することで、主波長の透過光量を測定し、他方の光は副波長（例えば５００ｎｍ）のバンドパスフィルタを通し、別のフォトダイオードで受光することで、副波長の透過光量を測定している。
日本国公開特許公報：特開２００７－３１５９４２号
　しかしながら、従来のように、光源としてハロゲンランプを用いる場合、ランプを点灯する電源容量が２０Ｗ位必要になり、また、ランプの発熱もあり、ランプ冷却が必要となる。これにより小型化が困難となる。
　そこで、ＬＥＤ（発光ダイオード）を光源とすることが考えられる。しかし、ＬＥＤを光源とした場合、その発光波長帯域が狭いため、１つのＬＥＤでは光量の多い中心波長付近を主波長及び副波長に用いることができず、主波長及び副波長が光量の少ない発光波長帯域の両端付近となる。このため、フォトダイオードでの主波長及び副波長の検出光量が少なくなることから、光電流変換での増幅率を大きくしなければならず、ノイズが増大する。
　本発明は、このような実状に鑑み、光源としてＬＥＤを使用して小型化を実現する一方、ノイズを増大させることのないフロー式分析用吸光度検出装置を提供することを課題とする。
　上記の課題を解決するために、本発明に係るフロー式分析用吸光度検出装置は、被測定液が通流するフローセルと、前記フローセルに対し、予め定めた主波長の光をパルス出力可能な主波長ＬＥＤと、前記フローセルに対し、前記主波長とは異なる副波長の光を前記主波長とは異なるタイミングでパルス出力可能な副波長ＬＥＤと、前記主波長ＬＥＤ及び副波長ＬＥＤから異なるタイミングで出力されて前記フローセルを透過した各波長の透過光量をそれぞれ検出可能な受光器と、前記主波長の透過光量と前記副波長の透過光量との差に基づいて、吸光度を算出する演算部と、を含んで構成される。
　本発明によれば、光源としてＬＥＤを用いることで、小型化を達成することができる。また、主波長及び副波長の光を別々のＬＥＤから異なるタイミングで出力させることにより、各波長の光量を大きくすることができ、光電流変換の増幅率を小さくして、ノイズ低減を図ることができる。
本発明の適用対象である液体クロマトグラフィー装置の一実施形態を示す概略図 本発明に係る吸光度検出装置の第１実施形態を示す概略図 主波長ＬＥＤ及び副波長ＬＥＤの波長特性を示す図 主波長ＬＥＤ及び副波長ＬＥＤのパルス点灯について示す図 演算処理内容を示すフローチャート 本発明に係る吸光度検出装置の第２実施形態を示す概略図 本発明に係る吸光度検出装置の第３実施形態を示す概略図
　以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
　図１は本発明の適用対象である液体クロマトグラフィー装置の一実施形態を示す概略図である。
　図１の液体クロマトグラフィー装置は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の原理を用いたフロー式生化学分析装置であり、例えば、血液を試料として、血液中のヘモグロビンＡ１ｃをはじめとするヘモグロビン各成分を分析するために用いられる。
　図１のフロー式生化学分析装置は、キャリア液の貯留タンク１と、貯留タンク１からキャリア液を連続的に送給する送液ポンプ２と、送液ポンプ２によって送液されるキャリア液の流路３と、キャリア液の流路３に配置されて試料を注入する試料注入装置４と、試料注入装置４の下流側に配置されて試料中の成分を分離するカラム装置５と、カラム装置５の下流側に配置されて前記分離された成分を吸光度により検出する吸光度検出装置６と、を含んで構成される。
　尚、試料注入装置４での試料の注入は、ニードル（図示せず）により試料容器（図示せず）から試料を吸引、採取した後、試料注入装置４内に注入することにより行われる。検出装置６を通過した試料を含むキャリア液は排液タンク７に回収される。
　吸光度検出装置６について、以下に詳細に説明する。
　図２は本発明に係る吸光度検出装置の第１実施形態を示す概略図である。
　フローセル１００は、液入口１０１と液出口１０２とを有し、カラム装置５（図１）により分離された成分を含む被測定液が通流する。フローセル１００はまた、被測定液の通流部を挟んで、入射面１００ａと出射面１００ｂとを有している。
　フローセル１００の入射面１００ａ側には、２波長光源１０３とコリメートレンズ１０８とが配置される。
　２波長光源１０３は、１つのチップ１０４に内蔵された主波長ＬＥＤ１０５と副波長ＬＥＤ１０６とにより構成される。また、このチップ１０４には、更にフォトダイオード１０７が内蔵されている。
　主波長ＬＥＤ１０５は、被測定液中の検出成分であるヘモグロビンＡ１ｃなどのヘモグロビン類により吸収される、例えば４１５ｎｍの波長の光を発するＬＥＤである。
　副波長ＬＥＤ１０６は、被測定液中の検出成分であるヘモグロビンＡ１ｃなどのヘモグロビン類の吸収範囲外で、例えば５００ｎｍの波長の光を発するＬＥＤである。
　これら主波長ＬＥＤ１０５及び副波長ＬＥＤ１０６は、それぞれ別のＯＮ信号により通電されるように構成されており、それぞれ異なるタイミングでパルス出力可能である。
　尚、図３に主波長ＬＥＤ１０５及び副波長ＬＥＤ１０６の波長特性を示している。図３中の点線は従来例のように２波長方式を１つのＬＥＤで実現する場合の当該ＬＥＤの波長特性である。
　フォトダイオード１０７は、主波長ＬＥＤ１０５及び副波長ＬＥＤ１０６の光量を検出可能に配置されている。
　コリメートレンズ１０８は、２波長光源１０３を構成する主波長ＬＥＤ１０５及び副波長ＬＥＤ１０６からの光を平行光にして、フローセル１００の入射面１００ａに入光させる。
　フローセル１００の出射面１００ｂ側には、ビームスプリッタ１１０が配置される。
　ビームスプリッタ１１０は、フローセル１００からの出射光を分岐する。
　分岐光路の一方には、主波長（例えば４１５ｎｍ）のバンドパスフィルタ１１１と、このバンドパスフィルタ１１１を通過した光を受光するフォトダイオード１１２とが配置される。
　分岐光路の他方には、副波長（例えば５００ｎｍ）のバンドパスフィルタ１１３と、このバンドパスフィルタ１１３を通過した光を受光するフォトダイオード１１４とが配置される。
　尚、本実施形態では、受光器として、フォトダイオード１１２、１１４、１０７を用いたが、この他、光電子増倍管やフォトトランジスタなどを例示できる。小型化の観点からは、受光器としてフォトダイオード又はフォトトランジスタを用いるのが好ましい。
　本実施形態の動作について説明する。
　２波長光源１０３の主波長ＬＥＤ１０５と副波長ＬＥＤ１０６とについて、図４に示すように、別々のタイミングで、交互にパルス点灯を行わせる。
　４１５ｎｍの主波長ＬＥＤ１０５を点灯した場合は、フォトダイオード１１２により、４１５ｎｍの透過光量を測定し、同時に、フォトダイオード１０７により、主波長ＬＥＤ１０５の光量（光源光量）をモニターする。
　そして、演算により、４１５ｎｍの透過光量を光源光量で補正することにより、ＬＥＤ光量のドリフトやゆらぎを補正する。
　５００ｎｍの副波長ＬＥＤ１０６を点灯した場合は、フォトダイオード１１４により、５００ｎｍの透過光量を測定し、同時に、フォトダイオード１０７により、副波長ＬＥＤ１０６の光量（光源光量）をモニターする。
　そして、演算により、５００ｎｍの透過光量を光源光量で補正することにより、ＬＥＤ光量のドリフトやゆらぎを補正する。
　これらの後、補正後の４１５ｎｍの透過光量から、補正後の５００ｎｍの透過光量を減算し、これらの差に基づいて、吸光度を算出する。このような処理により、フローセル１００内の汚れや液の脈流によるゆらぎが取り除かれた安定した４１５ｎｍの吸収特性が得られることになる。
　図５は本実施形態の演算処理内容を示すフローチャートである。
　Ｓ１では、４１５ｎｍの主波長ＬＥＤ１０５をパルス点灯させる。
　Ｓ２では、４１５ｎｍの主波長ＬＥＤ１０５をパルス点灯中に、フォトダイオード１１２からの信号を読込み、４１５ｎｍの透過光量を検出する。同時に、フォトダイオード１０７からの信号を読込み、主波長ＬＥＤ１０５の光量を検出する。
　Ｓ３では、４１５ｎｍの透過光量をＬＥＤ光量で補正する。
　Ｓ４では、５００ｎｍの副波長ＬＥＤ１０６をパルス点灯させる。
　Ｓ５では、５００ｎｍの副波長ＬＥＤ１０６をパルス点灯中に、フォトダイオード１１４からの信号を読込み、５００ｎｍの透過光量を検出する。同時に、フォトダイオード１０７からの信号を読込み、副波長ＬＥＤ１０６の光量を検出する。
　Ｓ６では、５００ｎｍの透過光量をＬＥＤ光量で補正する。
　Ｓ７では、Ｓ３で求めた補正後の４１５ｎｍの透過光量から、Ｓ６で求めた補正後の５００ｎｍの透過光量を減算し、吸光度相当値を求める。この部分が吸光度の演算部に相当する。
　実際には、吸光度検出装置の検出信号はデータ処理装置（図示せず）に送られ、データ処理装置でのデータ処理結果が分析結果として出力される。尚、Ｓ１～Ｓ６の処理を繰り返し実行した後にＳ７の処理へ移行するようにしてもよいし、Ｓ１～Ｓ７の処理を繰り返し実行するようにしてもよい。
　本実施形態の液体クロマトグラフィー用吸光度検出装置は、被測定液が通流するフローセル１００と、前記フローセル１００に対し、予め定めた主波長の光をパルス出力可能な主波長ＬＥＤ１０５と、前記フローセル１００に対し、前記主波長とは異なる副波長の光を前記主波長とは異なるタイミングでパルス出力可能な副波長ＬＥＤ１０６と、前記主波長ＬＥＤ１０５及び前記副波長ＬＥＤ１０６から異なるタイミングで出力されて前記フローセル１００を透過した各波長の透過光量をそれぞれ検出可能な受光器（フォトダイオード１１２、１１４）と、前記主波長の透過光量と前記副波長の透過光量との差に基づいて、吸光度を算出する演算部（Ｓ７）と、を含んで構成されるため、次のような効果が得られる。光源としてＬＥＤを用いることで、小型化を達成することができる。また、主波長及び副波長の光を別々のＬＥＤから異なるタイミングで出力させることにより、各波長の光量を大きくすることができ、光電流変換の増幅率を小さくして、ノイズ低減を図ることができる。言い換えれば、２波長に特化したＬＥＤを２素子使用することにより、エネルギー強度が高い光源を得ることができ、ノイズを減少させることができる。
　また、本実施形態によれば、主波長ＬＥＤ１０５と副波長ＬＥＤ１０６とは、１つのチップ１０４に内蔵されて、フローセル１００に対し同一光路に配置されることにより、フローセル１００の入射側の構成を簡素化し、装置の小型化を図ることができる。
　また、本実施形態によれば、主波長ＬＥＤ１０５及び副波長ＬＥＤ１０６のチップ１０４に内蔵されて、主波長ＬＥＤ１０５及び副波長ＬＥＤ１０６の光量を検出するフォトダイオード１０７を備えるため、光源光量を検出し、光源由来のノイズやドリフトを取り除くことが容易となる。特に本実施形態では、２つのＬＥＤ１０５、１０６に対し、１つのフォトダイオード１０７を追加するだけで済み、簡便に実施できる。
　また、本実施形態によれば、主波長ＬＥＤ１０５及び副波長ＬＥＤ１０６を交互にパルス点灯させることにより、交互に２波長の吸収特性を得ることができる。
　また、本実施形態の液体クロマトグラフィー装置（フロー式生化学分析装置）は、キャリア液の流路３に試料を注入する試料注入装置４と、この試料注入装置４より下流側のキャリア液の流路に配置されて試料中の成分を分離するカラム装置５と、このカラム装置５より下流側のキャリア液の流路に配置されて試料中の成分を検出する上記構成の吸光度検出装置６と、を含んで構成されるため、吸光度検出装置の検出精度向上及び小型化により、液体クロマトグラフィー装置の性能向上及び小型化を達成することができる。
　図６は本発明に係る吸光度検出装置の第２実施形態を示す概略図である。
　本実施形態では、主波長ＬＥＤと副波長ＬＥＤとは、別チップとして構成されて、フローセルに対し異なる経路に配置される。
　フローセル１００の入射面１００ａ側には、ビームスプリッタ１２０が配置される。
　ビームスプリッタ１２０は、第１光路からの光と第２光路からの光とをフローセル１００の入射面１００ａに向かわせることができる。
　第１光路には、第１光源１２１と、コリメートレンズ１２５と、バンドパスフィルタ１２６とが配置される。
　第１光源１２１は、１つのチップ１２２に内蔵された主波長ＬＥＤ１２３により構成される。また、このチップ１２２には、更にフォトダイオード１２４が内蔵されている。
　主波長ＬＥＤ１２３は、被測定液中の検出成分であるヘモグロビンＡ１ｃなどのヘモグロビン類により吸収される、例えば４１５ｎｍの波長の光を発するＬＥＤである。
　フォトダイオード１２４は、主波長ＬＥＤ１２３の光量を検出可能に配置されている。
　コリメートレンズ１２５は、第１光源１２１を構成する主波長ＬＥＤ１２３からの光を平行光にして、ビームスプリッタ１２０に向かわせる。
　バンドパスフィルタ１２６は、主波長（４１５ｎｍ）の光を通過させて、ビームスプリッタ１２０に入光させる。
　第２光路には、第２光源１２７と、コリメートレンズ１３１と、バンドパスフィルタ１３２とが配置される。
　第２光源１２７は、１つのチップ１２８に内蔵された副波長ＬＥＤ１２９により構成される。また、このチップ１２８には、更にフォトダイオード１３０が内蔵されている。
　副波長ＬＥＤ１２９は、被測定液中の検出成分であるヘモグロビンＡ１ｃなどのヘモグロビン類の吸収範囲外で、例えば５００ｎｍの波長の光を発するＬＥＤである。
　フォトダイオード１３０は、副波長ＬＥＤ１２９の光量を検出可能に配置されている。
　コリメートレンズ１３１は、第２光源１２７を構成する副波長ＬＥＤ１２９からの光を平行光にして、ビームスプリッタ１２０に向かわせる。
　バンドパスフィルタ１３２は、副波長（５００ｎｍ）の光を通過させて、ビームスプリッタ１２０に入光させる。
　フローセル１００の出射面１００ｂ側にはフォトダイオード１３３が配置されている。
　フォトダイオード１３３は、フローセル１００の出射面１００ｂからの光を受光し、受光量に対応した信号を出力する。
　本実施形態の動作について説明する。
　第１光源１２１の主波長ＬＥＤ１２３と第２光源１２７の副波長ＬＥＤ１２９とについて、別々のタイミングで、交互にパルス点灯を行わせる。
　４１５ｎｍの主波長ＬＥＤ１２３を点灯した場合は、フォトダイオード１３３により、４１５ｎｍの透過光量を測定し、同時に、フォトダイオード１２４により、主波長ＬＥＤ１２３の光量（光源光量）をモニターする。
　そして、演算により、４１５ｎｍの透過光量を光源光量で補正することにより、ＬＥＤ光量のドリフトやゆらぎを補正する。
　５００ｎｍの副波長ＬＥＤ１２９を点灯した場合は、フォトダイオード１３３により、５００ｎｍの透過光量を測定し、同時に、フォトダイオード１３０により、副波長ＬＥＤ１２３の光量（光源光量）をモニターする。
　そして、演算により、５００ｎｍの透過光量を光源光量で補正することにより、ＬＥＤ光量のドリフトやゆらぎを補正する。
　これらの後、補正後の４１５ｎｍの透過光量から、補正後の５００ｎｍの透過光量を減算し、これらの差に基づいて、吸光度を算出する。このような処理により、フローセル１００内の汚れや液の脈流によるゆらぎが取り除かれた安定した４１５ｎｍの吸収特性が得られることになる。
　本実施形態によれば、主波長ＬＥＤ１２３と副波長ＬＥＤ１２９とは、別チップとして構成されて、フローセル１００に対し異なる光路に配置される。そして、主波長ＬＥＤ１２３及び副波長ＬＥＤ１２９と、フローセル１００との間に、主波長ＬＥＤ１２３及び副波長ＬＥＤ１２９からの光をフローセル１００に向かわせる光学系（ビームスプリッタ１２０）が設けられる。このような構成であっても、光源としてＬＥＤを用いることで、小型化を達成することができる。また、主波長及び副波長の光を別々のＬＥＤから異なるタイミングで出力させることにより、各波長の光量を大きくすることができ、光電流変換の増幅率を小さくして、ノイズ低減を図ることができる。
　また、本実施形態によれば、主波長ＬＥＤ１２３と副波長ＬＥＤ１２９とを別チップにすることで、フローセル１００の入射側にビームスプリッタ１２０が必要となるが、バンドパスフィルタ１２６、１３２を入射側に配置することで、フローセル１００の出射側の構成を簡素化できる。すなわち、フローセル１００の出射側には受光器としてのフォトダイオード１３３のみを配置すればよく、出射側の構成を簡素化できる。
　また、本実施形態によれば、主波長ＬＥＤ１２３及び副波長ＬＥＤ１２９の各チップに内蔵されて、各ＬＥＤの光量を検出するフォトダイオード１２４、１３０を備えるため、光源光量を検出し、光源由来のノイズやドリフトを取り除くことが容易となる。
　図７は本発明に係る吸光度検出装置の第３実施形態を示す概略図である。
　第３実施形態は、第２実施形態の変形例で、第１光源１２１及び第２光源１２７内にフォトダイオード（図６の１２４、１３０）を内蔵させていない。その代わりに、ビームスプリッタ１２０にて、第１光源１２１（主波長ＬＥＤ１２３）からの光の一部を反射させ、また第２光源１２７（副波長ＬＥＤ１２９）からの光の一部を透過させて、同じ光路に導き、その光路上に受光器としてのフォトダイオード１３５を配置してある。
　第１光源１２１の主波長ＬＥＤ１２３と第２光源１２７の副波長ＬＥＤ１２９とについて、別々のタイミングで、交互にパルス点灯を行わせる。
　４１５ｎｍの主波長ＬＥＤ１２３を点灯した場合は、フォトダイオード１３３により、４１５ｎｍの透過光量を測定し、同時に、フォトダイオード１３５により、フローセル１００入光前の光量をモニターする。
　そして、演算により、４１５ｎｍの透過光量を入光前光量で補正することにより、ＬＥＤ光量のドリフトやゆらぎを補正する。
　５００ｎｍの副波長ＬＥＤ１２９を点灯した場合は、フォトダイオード１３３により、５００ｎｍの透過光量を測定し、同時に、フォトダイオード１３５により、フローセル１００入光前の光量をモニターする。
　そして、演算により、５００ｎｍの透過光量を入光前光量で補正することにより、ＬＥＤ光量のドリフトやゆらぎを補正する。
　これらの後、補正後の４１５ｎｍの透過光量から、補正後の５００ｎｍの透過光量を減算し、これらの差に基づいて、吸光度を算出する。このような処理により、フローセル１００内の汚れや液の脈流によるゆらぎが取り除かれた安定した４１５ｎｍの吸収特性が得られることになる。
　本実施形態によれば、主波長ＬＥＤ１２３及び副波長ＬＥＤ１２９からの光の各一部をフローセル１００に入光する前に分光して同一光路上に集光する光学系（ビームスプリッタ１２０）と、該光学系（ビームスプリッタ１２０）による集光光路上に配置される受光器（フォトダイオード１３５）とを備える。このような構成であっても、光源光量を間接的に検出し、光源由来のノイズやドリフトを取り除くことが容易となる。
　尚、上記第１～第３実施形態では、フォトダイオード１０７（図２）、フォトダイオード１２４、１３０（図６）、フォトダイオード１３５（図７）の検出信号に基づき、演算により、光源のドリフトやゆらぎを補正しているが、ハード的に帰還をかけて、光源の光量が一定になるようにしてもよい。
　これを第１実施形態（図２）で説明すると、主波長ＬＥＤ１０５のパルス点灯時は、その光源光量をフォトダイオード１０７によりモニターし、一定光量になるように、主波長ＬＥＤ１０５への印加電流を調整することにより、ＬＥＤ光量のドリフトやゆらぎを補正する。また、副波長ＬＥＤ１０６のパルス点灯時は、その光源光量をフォトダイオード１０７によりモニターし、一定光量になるように、副波長ＬＥＤ１０６への印加電流を調整することにより、ＬＥＤ光量のドリフトやゆらぎを補正する。
　また、主波長及び副波長については、ヘモグロビンＡ１ｃなどのヘモグロビン類を念頭に、４１５ｎｍ、５００ｎｍの例で説明したが、これは一例であり、これに限るものではないことは言うまでもない。
　また、検出例については、血液中の成分を検出する例で説明したが、これに限るものでなく、液体クロマトグラフィー、ＦＩＡ、他フロー式分析一般に適用することができる。
　また、図示の実施形態はあくまで本発明を例示するものであり、本発明は、説明した実施形態により直接的に示されるものに加え、特許請求の範囲内で当業者によりなされる各種の改良・変更を包含するものであることは言うまでもない。
　本発明に係る液体クロマトグラフィー、ＦＩＡ、他フロー式分析用の吸光度検出装置、及びこれを用いた液体クロマトグラフィー装置、ＦＩＡ装置、他フロー式分析装置は、各種試料中の成分の分離、分析、分取に好適に用いることができると共に、医療検査装置などの小型化、高精度化に寄与でき、産業上の利用可能性は大である。
１　キャリア液の貯留タンク
２　送液ポンプ
３　キャリア液の流路
４　試料注入装置
５　カラム装置
６　吸光度検出装置
７　排液タンク
１００　フローセル
１００ａ　入射面
１００ｂ　出射面
１０１　液入口
１０２　液出口
１０３　２波長光源
１０４　チップ
１０５　主波長ＬＥＤ
１０６　副波長ＬＥＤ
１０７　フォトダイオード
１０８　コリメートレンズ
１１０　ビームスプリッタ
１１１　主波長のバンドパスフィルタ
１１２　フォトダイオード
１１３　副波長のバンドパスフィルタ
１１４　フォトダイオード
１２０　ビームスプリッタ
１２１　第１光源
１２２　チップ
１２３　主波長ＬＥＤ
１２４　フォトダイオード
１２５　コリメートレンズ
１２６　主波長のバンドパスフィルタ
１２７　第２光源
１２８　チップ
１２９　副波長ＬＥＤ
１３０　フォトダイオード
１３１　コリメートレンズ
１３２　副波長のバンドパスフィルタ
１３３　フォトダイオード
１３５　フォトダイオード

Claims (7)

  1. 　フロー式分析用吸光度検出装置であって、
    　被測定液が通流するフローセルと、
    　前記フローセルに対し、予め定めた主波長の光をパルス出力可能な主波長ＬＥＤと、
    　前記フローセルに対し、前記主波長とは異なる副波長の光を前記主波長とは異なるタイミングでパルス出力可能な副波長ＬＥＤと、
    　前記主波長ＬＥＤ及び前記副波長ＬＥＤから異なるタイミングで出力されて前記フローセルを透過した各波長の透過光量をそれぞれ検出可能な受光器と、
    　前記主波長の透過光量と前記副波長の透過光量との差に基づいて、吸光度を算出する演算部と、
    を含んで構成される、フロー式分析用吸光度検出装置。
  2. 　前記主波長ＬＥＤと前記副波長ＬＥＤとは、１つのチップに内蔵されて、前記フローセルに対し同一光路に配置されることを特徴とする、請求項１記載のフロー式分析用吸光度検出装置。
  3. 　前記主波長ＬＥＤと前記副波長ＬＥＤとは、別チップとして構成されて、前記フローセルに対し異なる光路に配置され、
    　前記主波長ＬＥＤ及び前記副波長ＬＥＤと前記フローセルとの間に、前記主波長ＬＥＤ及び前記副波長ＬＥＤからの光を前記フローセルに向かわせる光学系が設けられることを特徴とする、請求項１記載のフロー式分析用吸光度検出装置。
  4. 　前記ＬＥＤのチップに内蔵されて、前記ＬＥＤの光量を検出する受光器を更に含んで構成されることを特徴とする、請求項１記載のフロー式分析用吸光度検出装置。
  5. 　前記主波長ＬＥＤ及び副波長ＬＥＤからの光の各一部を前記フローセルに入光する前に分光して同一光路上に集光する光学系と、該光学系による集光光路上に配置される受光器とを更に含んで構成されることを特徴とする、請求項３記載のフロー式分析用吸光度検出装置。
  6. 　前記主波長ＬＥＤ及び副波長ＬＥＤは、交互にパルス点灯されることを特徴とする、請求項１記載のフロー式分析用吸光度検出装置。
  7. 　キャリア液の流路に試料を注入する試料注入装置と、
    　この試料注入装置より下流側のキャリア液の流路に配置されて試料中の成分を検出する、請求項１記載の吸光度検出装置と、
    を含んで構成される、フロー式分析装置。
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