WO2014136184A1 - 分取クロマトグラフ装置 - Google Patents

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    • G01N30/74—Optical detectors

Definitions

  • the present invention relates to a preparative chromatograph for fractionating and collecting a liquid or gas having a specific component separated by a column from a liquid or gas sample.
  • a so-called preparative chromatograph apparatus that fractionates and collects one or more components contained in a sample using a liquid chromatograph or a gas chromatograph.
  • the eluate of the target component is collected by a fraction collector that fractionates and collects the eluate eluted from the column based on the retention time of the specific target component in the sample. Is separated from the sample.
  • the timing for fractionating the eluate of the target component is determined manually or automatically.
  • preliminary chromatographic analysis is performed on the sample to create a chromatogram, and the operator can determine the timing of fractionation by viewing the chromatogram.
  • preliminary chromatographic analysis cannot be performed, and fractionation must be performed by one chromatographic analysis.
  • the fractionation is started when the peak start point of the chromatogram is detected while performing the time fractionation in which the fractionation is completed at a predetermined time interval and the next fractionation is performed.
  • a preparative chromatograph apparatus is described that performs fractionation based on peak detection in which when a peak end point is detected, the fractionation is terminated and the process proceeds to the next fractionation.
  • the target component can be fractionated with high purity.
  • another component having a retention time substantially close to the retention time of the target component is often included, and in such a case, peaks of a plurality of components overlap. .
  • impurities other than the target component are mixed into the fractionated eluate.
  • the problem to be solved by the present invention is that the target component can be fractionated without mixing impurities even if another component (impurity) having a retention time close to the retention time of the target component is contained. It is to provide a preparative chromatograph device.
  • the preparative chromatograph according to the present invention which has been made to solve the above problems, includes a column for separating components in a sample in time to elute an eluate, and an absorbance spectrum A ( ⁇ ) of the eluate.
  • a chromatogram S (t) is created in real time based on the absorbance spectrum A ( ⁇ ) and a target component is fractionated from the eluate based on the chromatogram S (t).
  • a preparative chromatograph having a fraction collector, a) a peak section determination unit that determines whether or not a chromatogram peak of the target component has appeared based on the chromatogram S (t); b) From the absorbance spectrum A ( ⁇ ), a differential spectrum value of the wavelength derivative d (A ( ⁇ )) / d ⁇ , which is a value at a known wavelength ⁇ 0 where the absorbance of the target component has a maximum value or a minimum value.
  • a ′ ( ⁇ 0 ) d (A ( ⁇ )) / d ⁇
  • ⁇ ⁇ 0
  • a determination unit c) At the time zone when it is determined that the chromatogram peak of the target component has appeared and the absolute value of the differential spectrum value A ′ ( ⁇ 0 ) is less than or equal to the predetermined value, the eluate is removed. And a fraction collector control unit for controlling the fraction collector to perform fractionation.
  • the peak section determination unit sequentially determines whether or not a chromatogram peak corresponding to the target component has appeared based on the chromatogram S (t) created in real time.
  • the “real time” is not limited to the simultaneous acquisition of the absorbance spectrum A ( ⁇ ) and the chromatogram S (t), but includes a time within a range that does not interfere with the sorting.
  • the chromatogram S (t) may be created based on the absorbance A ( ⁇ i ) of a specific wavelength ⁇ i within the peak of the absorbance spectrum corresponding to the target component, or the wavelength of the absorbance spectrum A ( ⁇ ). You may create based on the integral value regarding (lambda).
  • the differential value determination unit obtains a differential spectrum value A ′ ( ⁇ 0 ) at the wavelength ⁇ 0 (hereinafter referred to as “absorption extremum wavelength”) every time the absorbance spectrum A ( ⁇ ) is acquired, It is sequentially determined whether or not the absolute value of the spectrum value A ′ ( ⁇ 0 ) is less than or equal to a predetermined value.
  • the frequency at which the absorbance spectrum A ( ⁇ ) is acquired may be the same as or less than the frequency at which the absorbance spectrum A ( ⁇ ) is acquired to create the chromatogram S (t). Good.
  • the absorption extremum wavelength ⁇ 0 is a wavelength at which the absorbance of the target component has a maximum value or a minimum value, and differs depending on the target component.
  • the absorbance of the target component may have a minimum value as well as a maximum value.
  • the description will be made mainly using the extinction wavelength ⁇ 0 when the absorbance takes the maximum value, but the same applies to the case where the absorbance takes the minimum value.
  • the absorbance spectrum A ( ⁇ ) is not superimposed with a spectrum other than the target component, so the differential spectrum value A ′ ( ⁇ 0 ) is ideally Becomes 0.
  • the eluate does not contain impurities when the absolute value of A ′ ( ⁇ 0 ) is within a certain range (below the predetermined value).
  • the effluent contains impurities, the spectrum due to the impurities is superimposed on the spectrum due to the target component, so the absolute value of the differential spectrum value A ′ ( ⁇ 0 ) has a value larger than the predetermined value. .
  • sequentially determining whether or not the absolute value of the differential spectrum value A ′ ( ⁇ 0 ) is less than or equal to a predetermined value means determining whether or not the effluent at that time contains impurities. .
  • the fraction collector control unit determines that the chromatogram peak corresponding to the target component has appeared in the peak interval determination unit, and the differential value determination unit determines that the absolute value of the differential spectrum value A ′ ( ⁇ 0 ) is equal to or less than a predetermined value.
  • the fraction collector is controlled so that the eluate is fractionated at a time zone determined that the eluate does not contain impurities. Thereby, the target component which does not contain an impurity can be fractionated.
  • the absorbance of a general sample tends to be stronger on the short wavelength side as described above.
  • the specific wavelength ⁇ i is preferably shorter than the absorption extremum wavelength ⁇ 0 of the target component, but is not limited thereto.
  • the chromatograph may be a liquid chromatograph or a gas chromatograph.
  • the detector is typically a multi-channel detector capable of detecting a number of wavelengths simultaneously, such as a photodiode array.
  • a spectrophotometer, a near infrared spectrophotometer, a fluorescence spectrophotometer, or the like may be used.
  • a preparative chromatograph apparatus having such a differential value determination unit acquires a column for separating components in a sample in time and eluting an eluate, and an absorbance spectrum A ( ⁇ ) of the eluate.
  • a detector and a fraction collector for creating a chromatogram S (t) in real time based on the absorbance spectrum A ( ⁇ ) and fractionating a target component from the eluate based on the chromatogram S (t)
  • a preparative chromatographic apparatus comprising: a) a peak section determination unit that determines whether or not a chromatogram peak of the target component has appeared based on the chromatogram S (t); b) From the absorbance spectrum A ( ⁇ ), obtain a wavelength ⁇ a at which the value of the wavelength derivative d (A ( ⁇ )) / d ⁇ becomes 0, and the absorbance of the wavelength ⁇ a and the target component is a maximum value or
  • a differential value determination unit that determines whether or not the absolute value of the difference between the known wavelengths ⁇
  • the preparative chromatograph apparatus can fractionate a target component without mixing impurities even if another component (impurity) having a retention time close to that of the target component is contained. .
  • the schematic block diagram of the preparative LC apparatus which is one Example of the preparative chromatograph apparatus which concerns on this invention.
  • the preparative chromatograph apparatus of the present embodiment is a preparative LC apparatus using a liquid chromatograph (LC).
  • the preparative LC device 10 includes a mobile phase container 11, a liquid feed pump 12, an injector 13, a column 14, a detector 15, and a fraction collector 16 connected in this order via a liquid feed channel 19. Yes. Further, the preparative LC device 10 has a control unit 17 for controlling the fraction collector 16 based on data obtained from the detector 15.
  • the mobile phase stored in the mobile phase container 11 is sucked by the liquid feed pump 12 and flows to the column 14 through the injector 13 at a constant flow rate.
  • a sample is injected into the mobile phase.
  • the sample rides on the mobile phase and is introduced into the column 14 and is separated and eluted in the time direction while passing through the column 14.
  • the detector 15 is an ultraviolet spectrophotometer in this embodiment, and includes an ultraviolet light source 151 that emits measurement light, a flow cell 152 through which an eluate flows, a spectrometer 153 that includes a diffraction grating, a photodiode array 154, and an absorbance spectrum generation unit 155. have.
  • the measurement light emitted from the ultraviolet light source 151 passes through the eluate flowing through the flow cell 152, but at that time, the measurement light receives absorption at a wavelength specific to the component contained in the eluate.
  • the transmitted light is wavelength-dispersed by the spectroscope 153, and the dispersed light is simultaneously detected by the photodiode array 154 at a wavelength within the measurement range. As a result, a signal intensity spectrum I ( ⁇ ) for each wavelength of transmitted light is obtained.
  • the fraction collector 16 includes an electromagnetic valve 161, a container rack 162 that accommodates a large number of containers, a dispensing nozzle 163 that is provided on the downstream side of the electromagnetic valve 161, and a biaxially arranged dispensing nozzle 163. It has a drive unit 164 for switching the container for collecting the eluate by moving in the direction. The opening and closing of the electromagnetic valve 161 and the movement of the dispensing nozzle 163 by the drive unit 164 are controlled by the control unit 17 described later.
  • the control unit 17 includes a peak section determination unit 171, a differential value determination unit 172, and a fraction collector control unit 173, and is embodied by a CPU and software.
  • the differential value determination unit 172 sequentially obtains a differential spectrum value A ′ ( ⁇ 0 ) at a known extinction extremum wavelength ⁇ 0 each time the signal of the absorbance spectrum A ( ⁇ ) is acquired from the detector 15, and the differential spectrum value is obtained. It is sequentially determined whether or not the value of A ′ ( ⁇ 0 ) is 0.
  • the fraction collector control unit 173 determines that a chromatogram peak has appeared by the peak section determination unit 171 and the differential spectrum value A ′ ( ⁇ 0 ) is determined to be 0 by the differential value determination unit 172.
  • the fraction collector 16 is controlled so as to fractionate the eluate. Specifically, the dispensing nozzle 163 is moved onto a container for dispensing the target component before the above determination is made, and the electromagnetic valve 161 is controlled to be opened when the above determination is made. To do. Further, when the determination condition is no longer satisfied, the fraction collector control unit 173 controls to close the electromagnetic valve 161.
  • FIG. 2A is a schematic diagram of three-dimensional chromatogram data having three dimensions of time t, wavelength ⁇ , and absorbance A.
  • FIG. Among the three-dimensional chromatogram data, the relationship between the absorbance S and the wavelength ⁇ at a specific time t ta corresponds to the absorbance spectrum A ( ⁇ ) at the time t (curve in FIG. 2A).
  • the presence or absence of impurities is determined using the absorbance spectrum A ( ⁇ ) as follows.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example in which the absorbance spectra of the target component x and the impurity component y are separated.
  • the wavelength (absorption maximum wavelength) corresponding to the apex (maximum point) of the absorbance peak differs for each substance.
  • the bottom of the valley (minimum point) may appear on the shorter wavelength side than the maximum point in the absorbance spectrum.
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of peak profiles of the target component x and the impurity component y on the chromatogram, and a state in which the peak profiles overlap, that is, a mixed peak profile.
  • the chromatogram actually obtained from the measured absorbance spectrum is the mixed peak profile.
  • the retention times of the target component x and the impurity component y are quite close to each other, and it is difficult to determine at which time zone the impurity component y is mixed with the eluate from the mixed peak profile.
  • FIG. 5 is a differential spectrum obtained by differentiating the absorbance spectrum for each component shown in FIG. 3 in the wavelength direction.
  • the differential spectrum value is positive.
  • the differential spectrum value is negative.
  • the differential spectrum value is differential.
  • the spectrum value is 0.
  • the wavelength at which the absorption maximum value of the target component x is 0, that is, the wavelength that becomes 0 when the differential spectrum value changes from a positive value to a negative value is ⁇ 0 .
  • the absorption maximum wavelength of the impurity component y is different from the absorption maximum wavelength ⁇ 0 of the target component x, and the target component x
  • the differential spectrum value of the impurity component y at the light absorption maximum wavelength ⁇ 0 has a non-zero value. Therefore, when the eluate contains only the target component x (without the impurity component y), the differential spectrum value measured at the absorption maximum wavelength ⁇ 0 is ideally 0. On the other hand, when the eluate contains not only the target component x but also the impurity component y, the differential spectrum value measured at the absorption maximum wavelength ⁇ 0 shows a non-zero value.
  • the differential spectrum value A ′ ( ⁇ 0 ) is sequentially (at every moment) obtained at the absorption maximum wavelength ⁇ 0 of the target component x, and the differential spectrum value A ′ ( ⁇ 0 ) is 0.
  • the target component x is sorted only during the time zone in which the eluate does not contain the impurity component y (“sorting section” in FIG. 4).
  • the wavelength corresponding to the maximum point of the absorbance peak has been described as the absorption maximum value wavelength so far, the same applies when used as the absorption minimum value wavelength that is the wavelength corresponding to the minimum point of the absorbance peak.
  • the differential value determination unit 172 calculates the differential spectrum value A ′ ( ⁇ 0 ) at the absorption maximum value wavelength (or absorption minimum value wavelength) ⁇ 0 based on the absorbance spectrum A ( ⁇ ) currently obtained. It is determined (step S4), and it is determined whether or not this differential spectrum value A ′ ( ⁇ 0 ) is 0 (step S5).
  • step S5 When it is determined in step S5 that the differential spectrum value A ′ ( ⁇ 0 ) is 0, the process proceeds to step S6-1, and the fraction collector control unit 173 sets the eluate as the target component solution as described above. Execute the sorting operation. If the sorting operation has already been performed in the loop up to the previous time, the operation is only maintained in step S6-1. After the operation of step S6-1 is completed, the process proceeds to step S7.
  • step S6 the fraction collector control unit 173 performs necessary operations so as not to separate the eluate as the solution of the target component.
  • the electromagnetic valve 161 is closed if sorting is in progress at that time, and the state is maintained as it is if sorting is not in progress.
  • step S7 it is determined whether or not a predetermined time has elapsed since the start of the operation.
  • a predetermined time For known target components, the time at which the outflow from the column ends is also known, so this end time may be set to the predetermined time. If the predetermined time has not elapsed, the process returns to step S1 and the previous operation is executed again. If the predetermined time has elapsed, the operation is terminated.
  • the differential value determination unit 172 determines whether or not the differential spectrum value A ′ ( ⁇ 0 ) at the absorption maximum wavelength ⁇ 0 of the target component x is 0. The determination may be made as follows.
  • the differential value determination unit 172 obtains the wavelength ⁇ a at which the value of the wavelength differential A ′ ( ⁇ ) of the absorbance spectrum A ( ⁇ ) is 0 (step S4A), and then determines the wavelength. lambda a is determined whether match the wavelength lambda 0 may be (step S5A) as. If the wavelength ⁇ a matches the wavelength ⁇ 0 , the above step 6-1 is executed, and if the wavelength ⁇ a does not match the wavelength ⁇ 0 , the above step 6-2 may be executed. In consideration of the measurement error and the like, it may be performed the step 6-1 when the wavelength lambda a is within the range absolute value of the degree of difference between the wavelength lambda 0.
  • an ultraviolet spectrophotometer having a photodiode array is used as the detector 15, but an ultraviolet spectrophotometer that performs wavelength scanning may be used.
  • the wavelength spectrum cannot be acquired at the same time, and scanning time is required.
  • the detector 15 may be a detector using another method such as an infrared spectrophotometer detector or a spectral fluorescence detector.
  • the preparative liquid chromatograph has been described.
  • a gas chromatograph for a gas sample can have the same configuration.
  • the detector 15 is preferably an infrared spectrophotometer or a near infrared spectrophotometer.

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Abstract

　本発明に係る分取クロマトグラフ装置は、試料中の成分を時間的に分離して溶出物を溶出させるカラム１４と、該溶出物の吸光度スペクトルA(λ)を取得する検出器１５と、該吸光度スペクトルA(λ)に基づいてクロマトグラムS(t)をリアルタイムで作成してゆき、該クロマトグラムS(t)に基づいて前記溶出物から目的成分を分画するフラクションコレクタ１６とを有する装置であって、前記クロマトグラムS(t)に基づいて、前記目的成分のクロマトグラムピークが現れたか否かを判定するピーク区間判定部１７１と、前記吸光度スペクトルA(λ)より、その波長微分d(A(λ))/dλの、前記目的成分の吸光度が極大値又は極小値を持つ既知の波長λ0における値である微分スペクトル値A'(λ0)=d(A(λ))/dλ|λ=λ0を求め、該微分スペクトル値A'(λ0)の絶対値が所定値以下であるか否かを判定する微分値判定部１７２と、目的成分のクロマトグラムピークが現れたと判定され、且つ、微分スペクトル値A'(λ0) の絶対値が所定値以下であると判定されている時間帯に、溶出物を分画させるようフラクションコレクタ１６を制御するフラクションコレクタ制御部１７３とを備える。

Description

分取クロマトグラフ装置
　本発明は、液体又は気体の試料から、カラムで分離された特定の成分の液体又は気体を分画して採取する分取クロマトグラフ装置に関する。
　液体クロマトグラフやガスクロマトグラフを利用して、試料に含まれる１ないし複数の成分を分画して採取する、いわゆる分取クロマトグラフ装置が知られている。これらの分取クロマトグラフ装置では、試料中の特定の目的成分の保持時間に基づいて、カラムから溶出する溶出物を所定の時間だけ分画して採取するフラクションコレクタにより、当該目的成分の溶出物を試料から分離する。こうした分取クロマトグラフ装置では、目的成分の溶出物を分画するタイミングは、手動又は自動で決めている。
　比較的多量の試料を用意できる場合には、その試料について予備的なクロマトグラフィー分析を実行してクロマトグラムを作成し、オペレータがそのクロマトグラムを見て分画のタイミングを決めればよい。しかしながら、例えば試料が少量しかない場合や高価で貴重な場合には、予備的なクロマトグラフィー分析を行うことができず、１回のクロマトグラフィー分析で分画を実行しなければならない。
　特許文献１には、所定の時間間隔で分画を終了して次の分画に移行するという時間分画を行いつつ、クロマトグラムのピークの開始点が検出されたときに分画を開始し、ピーク終了点が検出されたときにその分画を終了して次の分画に移行するというピーク検出に基づく分画を行う、分取クロマトグラフ装置が記載されている。これにより、ピークが検出された成分について確実に分画すると共に、ピークが検出されない微量な成分も、複数回行われた時間分画のいずれかにおいて分画することができる。
特開2010-014559号公報
　上述したような分画の場合、試料中の異なった成分の保持時間が十分に離れていれば、目的成分を高い純度で分画することができる。しかしながら、多様な成分を含む試料の場合、目的成分の保持時間にかなり近い保持時間を持つ別の成分（不純物）が含まれていることも多く、そうした場合、複数の成分のピークが重なってしまう。このような場合には、分画した溶出物に、目的成分以外の不純物が混入してしまう。
　本発明が解決しようとする課題は、目的成分の保持時間に近い保持時間を持つ別の成分（不純物）が含まれていても、不純物が混入することなく目的成分を分画することができる分取クロマトグラフ装置を提供することである。
　上記課題を解決するために成された本発明に係る分取クロマトグラフ装置は、試料中の成分を時間的に分離して溶出物を溶出させるカラムと、該溶出物の吸光度スペクトルA(λ)を取得する検出器と、該吸光度スペクトルA(λ)に基づいてクロマトグラムS(t)をリアルタイムで作成してゆき、該クロマトグラムS(t)に基づいて前記溶出物から目的成分を分画するフラクションコレクタとを有する分取クロマトグラフ装置であって、
　a) 前記クロマトグラムS(t)に基づいて前記目的成分のクロマトグラムピークが現れたか否かを判定するピーク区間判定部と、
　b) 前記吸光度スペクトルA(λ)より、その波長微分d(A(λ))/dλの、前記目的成分の吸光度が極大値又は極小値を持つ既知の波長λ0における値である微分スペクトル値A'(λ0)=d(A(λ))/dλ|λ=λ0を求め、該微分スペクトル値A'(λ0)の絶対値が所定値以下であるか否かを判定する微分値判定部と、
　c) 前記目的成分のクロマトグラムピークが現れたと判定され、且つ、前記微分スペクトル値A'(λ0)の絶対値が前記所定値以下であると判定されている時間帯に、前記溶出物を分画させるよう前記フラクションコレクタを制御するフラクションコレクタ制御部と
を備えることを特徴とする。
　本発明に係る分取クロマトグラフ装置では、ピーク区間判定部は、リアルタイムで作成されるクロマトグラムS(t)に基づいて、目的成分に対応するクロマトグラムピークが現れたか否かを順次判定する。なお、「リアルタイム」とは、吸光度スペクトルA(λ)の取得とクロマトグラムS(t)が同時であることには限られず、分取に支障の無い範囲内の時間も含む。クロマトグラムS(t)は、目的成分に対応する吸光度スペクトルのピーク内にある特定の波長λiの吸光度A(λi)に基づいて作成してもよいし、吸光度スペクトルA(λ)の波長λに関する積分値に基づいて作成してもよい。データ処理の負荷の観点から、特定波長λiの吸光度A(λi)に基づいてクロマトグラムS(t)を作成することが望ましい。目的成分に対応するクロマトグラムS(t)のピークが現れたか否かの判定は、従来より用いられている方法、例えば特許文献１に記載のように、その時点t=taにおけるS(ta)が所定の閾値を超えたか否か、あるいはt=taにおけるS(t)の曲線の傾きが所定の値を超えたか否かに基づいて行うことができる。
　微分値判定部は、前記吸光度スペクトルA(λ)を取得する度に、前記波長λ0（以下、「吸光極値波長」と呼ぶ）における微分スペクトル値A'(λ0)を求め、該微分スペクトル値A'(λ0)の絶対値が所定値以下であるか否かを順次判定する。ここで、吸光度スペクトルA(λ)を取得する頻度は、クロマトグラムS(t)を作成するために吸光度スペクトルA(λ)を取得する頻度と同じであってもよいし、それより少なくてもよい。吸光極値波長λ0は、目的成分の吸光度が極大値又は極小値を持つ波長であり、目的成分によって相違する。ここで、一般的な試料の吸光度が短波長側で強くなる傾向があることから、目的成分の吸光度は極大値だけではなく極小値を持つことがある。以下では、簡単のため、主に吸光度が極大値を取る場合の吸光極値波長λ0を用いて説明するが、吸光度が極小値を取る場合も同様である。
　ある時間において溶出物に不純物が含まれていなければ、吸光度スペクトルA(λ)には目的成分以外の成分によるスペクトルが重畳されていないため、微分スペクトル値A'(λ0)は理想的には0になる。ただし、測定誤差等の影響があるため、A'(λ0)の絶対値がある程度の範囲内（前記所定値以下）にあるときには、溶出物に不純物が含まれていないとみなすことができる。一方、溶出物に不純物が含まれていれば、目的成分によるスペクトルに、不純物によるスペクトルが重畳されるため、微分スペクトル値A'(λ0)の絶対値は前記所定値よりも大きい値を持つ。従って、微分スペクトル値A'(λ0)の絶対値が所定値以下であるか否かを順次判定することは、その時点における溶出物に不純物が含まれるか否かを判別することを意味する。これにより、本発明では、目的成分と不純物の保持時間が近くクロマトグラムピークの分離が困難な場合であっても、不純物の有無を判別することができる。
　フラクションコレクタ制御部は、ピーク区間判定部において目的成分に対応するクロマトグラムピークが現れたと判定され、且つ、微分値判定部において微分スペクトル値A'(λ0) の絶対値が所定値以下である（すなわち、溶出物が不純物を含有しない）と判定された時間帯に、溶出物を分画させるよう、フラクションコレクタを制御する。これにより、不純物の含まれない目的成分を分画することができる。
　前記特定波長λiの吸光度A(λi)に基づいてクロマトグラムS(t)を作成する場合には、前述のように一般的な試料の吸光度が短波長側で強くなる傾向があるため、該特定波長λiは、目的成分の吸光極値波長λ0よりも短波長であることが望ましいが、それに限定されるものではない。
　本発明において、上記クロマトグラフは、液体クロマトグラフ、ガスクロマトグラフのいずれでもよい。上記検出器には、典型的には、フォトダイオードアレイのように同時に多数の波長に対して検出が可能なマルチチャンネル型検出器が用いられるが、波長走査を伴う紫外可視分光光度計、赤外分光光度計、近赤外分光光度計、蛍光分光光度計などを用いてもよい。
　前記微分値判定部は、前記波長λ0における微分スペクトル値A'(λ0)が0であるか否かを判定する代わりに、吸光度スペクトルA(λ)の波長微分d(A(λ))/dλの値が0になる波長λaを求めたうえで、該波長が前記波長λ0と一致するか否かを判定するようにしてもよい。λa＝λ0であれば溶出物に不純物が含まれていないことを意味する。ただし、前述の場合と同様に、測定誤差等の影響があるため、λaとλ0の差の絶対値が所定値以下であれば、溶出物に不純物が含まれていないとみなすことができる。一方、λaとλ0の差の絶対値が所定値よりも大きければ、溶出物に不純物が含まれていることを意味する。
　すなわち、このような微分値判定部を有する分取クロマトグラフ装置は、試料中の成分を時間的に分離して溶出物を溶出させるカラムと、該溶出物の吸光度スペクトルA(λ)を取得する検出器と、該吸光度スペクトルA(λ)に基づいてクロマトグラムS(t)をリアルタイムで作成してゆき、該クロマトグラムS(t)に基づいて前記溶出物から目的成分を分画するフラクションコレクタとを有する分取クロマトグラフ装置であって、
　a) 前記クロマトグラムS(t)に基づいて前記目的成分のクロマトグラムピークが現れたか否かを判定するピーク区間判定部と、
　b) 前記吸光度スペクトルA(λ)より、その波長微分d(A(λ))/dλの値が0になる波長λaを求め、該波長λaと、前記目的成分の吸光度が極大値又は極小値を持つ既知の波長λ0の差の絶対値が所定値以下であるか否かを判定する微分値判定部と、
　c) 前記目的成分のクロマトグラムピークが現れたと判定され、且つ、波長λaと波長λ0の差の絶対値が前記所定値以下であると判定されている時間帯に、前記溶出物を分画させるよう前記フラクションコレクタを制御するフラクションコレクタ制御部と
を備えることを特徴とする。
　本発明に係る分取クロマトグラフ装置により、目的成分の保持時間に近い保持時間を持つ別の成分（不純物）が含まれていても、不純物が混入することなく目的成分を分画することができる。
本発明に係る分取クロマトグラフ装置の一実施例である分取ＬＣ装置の概略構成図。 吸光度スペクトルA(λ)の模式図(a)、及び吸光度スペクトルA(λ)から得られるクロマトグラムS(t)の模式図(b)。 目的成分xと不純物成分yそれぞれの吸光度を分離して示した一例の図。 クロマトグラム上での目的成分x及び不純物成分yのピークプロファイル、それらピークプロファイルが重なった混合ピークプロファイル、目的成分x及び不純物成分yの溶出区間、並びに本実施例の分取クロマトグラフ装置における目的成分xの分取区間を示す図。 目的成分xと不純物成分yそれぞれの吸光度スペクトルを波長方向に微分した微分スペクトルを示す図。 本実施例の分取クロマトグラフ装置の動作を示すフローチャート。 変形例の分取クロマトグラフ装置の動作を示すフローチャート。
　本発明に係る分取クロマトグラフ装置の実施例を、図１～図７を用いて説明する。
(1) 本実施例の分取クロマトグラフ装置の構成
　本実施例の分取クロマトグラフ装置は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）を用いた分取ＬＣ装置である。この分取ＬＣ装置１０は、図１に示すように、移動相容器１１、送液ポンプ１２、インジェクタ１３、カラム１４、検出器１５、フラクションコレクタ１６がこの順に送液流路１９で接続されている。また、分取ＬＣ装置１０は、検出器１５から得られるデータに基づいてフラクションコレクタ１６を制御するための制御部１７を有している。
　分取ＬＣ装置１０では、移動相容器１１に貯留されている移動相が送液ポンプ１２により吸引され、一定流量でインジェクタ１３を介してカラム１４に流される。インジェクタ１３において、移動相中に試料が注入される。試料は移動相に乗ってカラム１４に導入され、カラム１４を通過する間に時間方向に分離されて溶出する。検出器１５は、本実施例では紫外分光光度計であり、測定光を発する紫外光源１５１、溶出液が流れるフローセル１５２、回折格子などを含む分光器１５３、フォトダイオードアレイ１５４及び吸光度スペクトル生成部１５５を有している。紫外光源１５１から発せられた測定光は、フローセル１５２を流れる溶出液中を通過するが、その際に溶出液に含まれる成分に特有の波長の吸収を受ける。この透過光は分光器１５３で波長分散され、分散光は測定範囲内の波長において、フォトダイオードアレイ１５４により同時に検出される。これにより、透過光の波長毎の信号強度スペクトルI(λ)が得られる。吸光度スペクトル生成部１５５にて、分析開始時に得られる信号強度スペクトルI0(λ)を記憶し、時々刻々得られる信号強度スペクトルI(λ)から吸光度スペクトルA(λ)＝log(I0(λ)/I(λ))が生成され、この信号が検出器１５から出力される。
　検出器１５を通過した溶出液はその全量（又は一部でもよい）がフラクションコレクタ１６に導入される。フラクションコレクタ１６は、電磁バルブ１６１と、多数の容器を収容する容器ラック１６２と、電磁バルブ１６１の下流側に設けられた、溶出液を滴下する分注ノズル１６３と、分注ノズル１６３を２軸方向に移動させることによって溶出液を採取する容器を切り替える駆動部１６４を有する。電磁バルブ１６１の開閉及び駆動部１６４による分注ノズル１６３の移動は、後述の制御部１７により制御される。
　制御部１７は、ピーク区間判定部１７１と、微分値判定部１７２と、フラクションコレクタ制御部１７３を有しており、ＣＰＵ及びソフトウエアにより具現化されている。
　ピーク区間判定部１７１は、検出器１５から吸光度スペクトルA(λ)を取得し、該吸光度スペクトルA(λ)に基づいてクロマトグラムS(t)をリアルタイムで作成したうえで、目的成分に対応するクロマトグラムピークが現れたか否かの判定を順次行う。本実施例では、判定時t=taが目的成分の保持時間（既知）の前後に亘る所定の時間範囲内にあって、S(ta)が閾値を超えているときには、目的成分に対応するクロマトグラムピークが現れていると判定する。微分値判定部１７２は、検出器１５から吸光度スペクトルA(λ)の信号を取得する度に、既知の吸光極値波長λ0における微分スペクトル値A'(λ0)を順次求め、微分スペクトル値A'(λ0)の値が0であるか否かを順次判定するものである。
　フラクションコレクタ制御部１７３は、ピーク区間判定部１７１によってクロマトグラムピークが現れたと判定され、且つ、微分値判定部１７２によって微分スペクトル値A'(λ0)が0であると判定されている時間帯に、該溶出物を分画させるよう、フラクションコレクタ１６を制御するものである。具体的には、上記判定がなされる前に目的成分を分取するための容器上に分注ノズル１６３を移動させておき、上記判定がなされたときに、電磁バルブ１６１を開放するように制御する。また、前記判定の条件を満たさなくなったときに、フラクションコレクタ制御部１７３は、電磁バルブ１６１を閉鎖するように制御する。
(2) 溶出物中の不純物の有無を判断する原理
　本実施例の分取ＬＣ装置１０の微分値判定部１７２におけるデータ処理によって、溶出物中の不純物の有無を判断する原理を、図２～図５を用いて説明する。
　図２(a)は、時刻t、波長λ、及び吸光度Aという３つのディメンジョンを持つ３次元クロマトグラムデータの模式図である。３次元クロマトグラムデータのうち、特定の時刻t=taにおける吸光度Sと波長λの関係は、その時刻tにおける吸光度スペクトルA(λ)に該当する（図２(a)中の曲線）。また、本実施例では、特定の波長λ=λiにおける吸光度Sと時刻tの関係は、その波長λiにおけるクロマトグラムS(t)に該当する（図２(b)）。本実施例では、吸光度スペクトルA(λ)を用いて、以下のように不純物の有無を判断する。
　いま、目的成分xと不純物yの２つの成分が試料に含まれる場合を考える。図３は、目的成分xと不純物成分yそれぞれの吸光度スペクトルを分離して示した一例の図である。図示するように、一般に、吸光度ピークの頂点（極大点）に対応した波長（吸光極大値波長）は物質毎に相違する。また、吸光度は短波長側で強くなる傾向があるため、吸光度スペクトルには極大点よりも短波長側に谷の底（極小点）が現れることがある。
　図４は、クロマトグラム上での目的成分xと不純物成分yそれぞれのピークプロファイルの一例と、それらピークプロファイルが重なった状態、つまり混合ピークプロファイルとを示す図である。測定される吸光度スペクトルから実際に得られるクロマトグラムは、混合ピークプロファイルの方である。目的成分xと不純物成分yの保持時間はかなり近接しており、混合ピークプロファイルからは、どの時間帯で不純物成分yが溶出物に混合しているのか否かを判断するのは困難である。
　そこで、本実施例では、不純物成分yの混入の有無を判定するために、以下のように、吸光度スペクトルの波長微分である微分スペクトルを用いる。図５は、図３に示した成分毎の吸光度スペクトルを波長方向に微分した微分スペクトルである。波長方向に波長スペクトルのカーブが上昇している局面では微分スペクトルの値は正、波長スペクトルのカーブが下降している局面では微分スペクトル値は負になり、吸光度ピークの極大点及び極小点では微分スペクトル値は0となる。本実施例では、目的成分xの吸光極大値波長、すなわち微分スペクトル値が正値から負値に変化する状況で0になる波長をλ0とする。
　前述のように、一般に吸光極大値波長は物質毎に相違するため、図示の通り、不純物成分yの吸光極大値波長は目的成分xの吸光極大値波長λ0と相違し、また、目的成分xの吸光極大値波長λ0における不純物成分yの微分スペクトル値は0ではない値を有する。そのため、溶出物が目的成分xのみを含有する（不純物成分yを含有しない）場合には、吸光極大値波長λ0において測定される微分スペクトル値は、理想的には0になる。一方、溶出物が目的成分xだけではなく不純物成分yも含有している場合には、吸光極大値波長λ0において測定される微分スペクトル値は0ではない値を示す。
　従って、本実施例では、目的成分xの吸光極大値波長λ0において、微分スペクトル値A'(λ0)を順次（時々刻々と）求め、該微分スペクトル値A'(λ0)が0であるか否かを判定することにより、その時点において溶出物が不純物成分yを含有する（A'(λ0)≠0）かしない（A'(λ0)＝0）かを判定する。ただし、測定誤差などの影響を考慮して、微分スペクトル値A'(λ0)の絶対値がある程度の範囲内にある場合には、その時点において溶出物が不純物成分yを含有しないと判断してもよい。そして、本実施例では、この判定方法に従って、溶出物が不純物成分yを含有しない時間帯にのみ、目的成分xの分取を実行する（図４の「分取区間」）。
　なお、ここまでは吸光度ピークの極大点に対応する波長を吸光極大値波長として説明したが、吸光度ピークの極小点に対応する波長である吸光極小値波長として用いても同様である。
(3) 本実施例の分取クロマトグラフ装置の動作フロー
　本実施例の分取ＬＣ装置１０の動作フローを、図６のチャートを用いて説明する。分取ＬＣ装置１０は、ステップＳ７の条件を満たすまで、ステップＳ１～Ｓ７を繰り返し実行する。この繰り返しの動作の１ループについて、以下に説明する。
　まず、ピーク区間判定部１７１は、検出器１５から吸光度スペクトルA(λ)を取得し（ステップＳ１）、現時点（t=taとする）における波長λ=λiの吸光度を、taにおけるクロマトグラムS(t)の値S(ta)として、それまでに得られているクロマトグラムS(t)に追加することにより、現時点taまでのクロマトグラムS(t)を作成する（ステップＳ２）。続いて、ピーク区間判定部１７１は、得られたS(t)に基づいて、上述の方法により、現時点が目的成分のピーク期間にあるか否かを判定する（ステップＳ３）。ここで、現時点が目的成分のピーク期間であればステップＳ４に進み、現時点が目的成分のピーク期間ではなければ、ステップＳ１に戻り、これまでに説明したステップＳ３までの動作を再度実行する。
　次に、微分値判定部１７２は、現時点で得られている吸光度スペクトルA(λ)に基づいて、吸光極大値波長（または吸光極小値波長）λ0における微分スペクトル値A'(λ0)を求め（ステップＳ４）、この微分スペクトル値A'(λ0)が0であるか否かを判定する（ステップＳ５）。
　ステップＳ５において微分スペクトル値A'(λ0)が0であると判定された場合にはステップＳ６－１に進み、フラクションコレクタ制御部１７３は、上述のように、溶出液を目的成分の溶液として分取する操作を実行する。ここで、前回までのループにおいて既に当該分取の操作を実行済である場合には、ステップＳ６－１ではその操作を維持するのみである。ステップＳ６－１の動作の終了後、ステップＳ７に進む。
　一方、ステップＳ５において微分スペクトル値A'(λ0)が0ではないと判定された場合には、ステップＳ６－２に進む。ステップＳ６－２では、フラクションコレクタ制御部１７３は、溶出液を目的成分の溶液として分取しないように、必要な操作を実行する。すなわち、その時点において分取中であれば電磁バルブ１６１を閉鎖し、分取中でなければそのままの状態を維持する。ステップＳ６－２の動作の終了後、ステップＳ７に進む。
　ステップＳ７では、操作の開始から所定時間が経過しているか否かを判定する。既知の目的成分では、カラムからの流出が終了する時間も既知であるため、この終了時間を前記所定時間とすればよい。所定時間が経過していなければ、ステップＳ１に戻ってこれまでの操作を再度実行し、所定時間が経過していれば、操作を終了する。
(4) 第１の変形例
　本発明は上記実施例には限定されない。
　上記実施例では、微分値判定部１７２は、目的成分xの吸光極大値波長λ0における微分スペクトル値A'(λ0)が0であるか否かを判定したが、その代わりに、以下のように判定を行ってもよい。
　前述の通り、通常、不純物成分yの吸光極大値波長（又は吸光極小値波長。以下同じ。）は目的成分xの吸光極大値波長λ0と相違している（図５）。そのため、溶出物が目的成分xのみを含有する（不純物成分yを含有しない）場合には、当該溶出物の吸光度スペクトルA(λ)の波長微分A'(λ)=d(A(λ))/dλの値は、当該吸光極大値波長λ0において0になる。一方溶出物が目的成分xだけではなく不純物成分yも含有している場合には、溶出物が目的成分xだけではなく不純物成分yも含有している場合には、当該溶出物のA'(λ)は、波長λ0以外の波長において0になる。
　従って、図７に示すように、微分値判定部１７２は、吸光度スペクトルA(λ)の波長微分A'(λ)の値が0になる波長λaを求めたうえで（ステップＳ４Ａ）、波長λaが波長λ0と一致しているか否かを判定する（ステップＳ５Ａ）ようにしてもよい。そして、波長λaが波長λ0と一致していれば上記ステップ６－１を実行し、波長λaが波長λ0と一致していなければ上記ステップ６－２を実行すればよい。なお、測定誤差等を考慮して、波長λaが波長λ0の差の絶対値がある程度の範囲内にあるときには上記ステップ６－１を実行するようにしてもよい。
(5) その他の変形例
　上記実施例では、検出器１５として、フォトダイオードアレイを有する紫外分光光度計を用いたが、波長走査を行う紫外分光光度計を用いてもよいが、この場合には、波長スペクトルは同時に取得できず、走査する時間が必要である。また、検出器１５には、赤外分光光度計検出器、分光蛍光検出器などの他の方式による検出器を用いてもよい。
　また、上記実施例では分取液体クロマトグラフ装置について説明したが、気体の試料を対象とするガスクロマトグラフにおいても同様の構成を取ることができる。なお、ガスクロマトグラフの場合には、検出器１５には赤外分光光度計や近赤外分光光度計を用いることが望ましい。
１０…分取ＬＣ装置
１１…移動相容器
１２…送液ポンプ
１３…インジェクタ
１４…カラム
１５…検出器
１５１…紫外光源
１５２…フローセル
１５３…分光器
１５４…フォトダイオードアレイ
１５５…吸光度スペクトル生成部
１６…フラクションコレクタ
１６１…電磁バルブ
１６２…容器ラック
１６３…分注ノズル
１６４…駆動部
１７…制御部
１７１…ピーク区間判定部
１７２…微分値判定部
１７３…フラクションコレクタ制御部
１９…送液流路

Claims (4)

  1. 　試料中の成分を時間的に分離して溶出物を溶出させるカラムと、該溶出物の吸光度スペクトルA(λ)を取得する検出器と、該吸光度スペクトルA(λ)に基づいてクロマトグラムS(t)をリアルタイムで作成してゆき、該クロマトグラムS(t)に基づいて前記溶出物から目的成分を分画するフラクションコレクタとを有する分取クロマトグラフ装置であって、
    　a) 前記クロマトグラムS(t)に基づいて前記目的成分のクロマトグラムピークが現れたか否かを判定するピーク区間判定部と、
    　b) 前記吸光度スペクトルA(λ)より、その波長微分d(A(λ))/dλの、前記目的成分の吸光度が極大値又は極小値を持つ既知の波長λ0における値である微分スペクトル値A'(λ0)=d(A(λ))/dλ|λ=λ0を求め、該微分スペクトル値A'(λ0) の絶対値が所定値以下であるか否かを判定する微分値判定部と、
    　c) 前記目的成分のクロマトグラムピークが現れたと判定され、且つ、前記微分スペクトル値A'(λ0)の絶対値が前記所定値以下であると判定されている時間帯に、該溶出物を分画させるよう前記フラクションコレクタを制御するフラクションコレクタ制御部と
    を備えることを特徴とする分取クロマトグラフ装置。
  2. 　試料中の成分を時間的に分離して溶出物を溶出させるカラムと、該溶出物の吸光度スペクトルA(λ)を取得する検出器と、該吸光度スペクトルA(λ)に基づいてクロマトグラムS(t)をリアルタイムで作成してゆき、該クロマトグラムS(t)に基づいて前記溶出物から目的成分を分画するフラクションコレクタとを有する分取クロマトグラフ装置であって、
    　a) 前記クロマトグラムS(t)に基づいて前記目的成分のクロマトグラムピークが現れたか否かを判定するピーク区間判定部と、
    　b) 前記吸光度スペクトルA(λ)より、その波長微分d(A(λ))/dλの値が0になる波長λaを求め、該波長λaと、前記目的成分の吸光度が極大値又は極小値を持つ既知の波長λ0の差の絶対値が所定値以下であるか否かを判定する微分値判定部と、
    　c) 前記目的成分のクロマトグラムピークが現れたと判定され、且つ、波長λaと波長λ0の差の絶対値が前記所定値以下であると判定されている時間帯に、前記溶出物を分画させるよう前記フラクションコレクタを制御するフラクションコレクタ制御部と
    を備えることを特徴とする分取クロマトグラフ装置。
  3. 　前記クロマトグラムS(t)が、前記目的成分に対応する吸光度スペクトルのピーク内にある特定の波長λiの吸光度A(λi)に基づいて作成されることを特徴とする請求項１又は２に記載の分取クロマトグラフ装置。
  4. 　前記波長λiが前記波長λ0よりも短いことを特徴とする請求項３に記載の分取クロマトグラフ装置。
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