WO2014132341A1 - 原子間力顕微鏡を用いた表面電荷密度測定装置 - Google Patents

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WO2014132341A1
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sample
charge density
surface charge
probe
frequency shift
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PCT/JP2013/055002
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大田　昌弘
健一 梅田
圭 小林
啓文 山田
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株式会社島津製作所
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
    • G01Q60/00—Particular types of SPM [Scanning Probe Microscopy] or microscopes; Essential components thereof
    • G01Q60/24—AFM [Atomic Force Microscopy] or apparatus therefor, e.g. AFM probes
    • G01Q60/30—Scanning potential microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
    • G01Q30/00—Auxiliary means serving to assist or improve the scanning probe techniques or apparatus, e.g. display or data processing devices
    • G01Q30/08—Means for establishing or regulating a desired environmental condition within a sample chamber
    • G01Q30/12—Fluid environment
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    • G—PHYSICS
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    • G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
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    • G01Q60/24—AFM [Atomic Force Microscopy] or apparatus therefor, e.g. AFM probes
    • G01Q60/32—AC mode
    • G01Q60/34—Tapping mode

Definitions

  • the present invention relates to a surface charge density measuring apparatus for measuring a surface charge density distribution and a surface potential distribution of a substance placed in a liquid using an atomic force microscope.
  • Atomic Force Microscope measures the force acting between a sharp tip and the sample surface from the displacement of the cantilever, and the probe is one-dimensional or two-dimensional along the sample surface. It is an apparatus that acquires information such as the shape of the sample surface by scanning the surface.
  • AFM Atomic Force Microscope
  • FM-AFM Frequency Modulation-Atomic Force Microscope
  • FM-AFM in general, a cantilever that holds a probe close to the sample surface up to an atomic level distance is vibrated at the mechanical resonance frequency, and the interaction between the probe and the sample surface is used. A change in the resonance frequency (frequency shift ⁇ f) is detected. Since this frequency shift ⁇ f depends on the distance between the probe and the sample surface, the sample surface is scanned two-dimensionally in a plane perpendicular to the normal line of the sample (for example, raster scan) while maintaining the frequency shift ⁇ f constant. ), It is possible to obtain an image (surface unevenness image or surface topography image) indicating the unevenness state of the sample surface.
  • image surface unevenness image or surface topography image
  • Non-Patent Documents 1 and 2, etc. the contact mode (static mode) of AFM is combined with a three-dimensional force mapping technique, and the electric double layer force acting between the probe and the sample is three-dimensional or two-dimensional.
  • a technique for measuring the charge density distribution on the surface of a solid in a liquid has been proposed.
  • the conventional measurement method using such AFM has the following problems.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and its main purpose is to measure the surface charge density distribution with high spatial resolution in a short measurement time using an atomic force microscope.
  • the object is to provide a surface charge density measuring apparatus.
  • another object of the present invention is to provide a surface charge density measuring device that can perform measurement relatively easily even for those who lack knowledge or skill in various measurements using an atomic force microscope. It is in.
  • Still another object of the present invention is to provide a surface charge density measuring apparatus capable of obtaining not only relative surface charge distribution information but also quantitative surface charge distribution information.
  • the first aspect of the present invention which has been made to solve the above-mentioned problems, is that the probe provided at the tip of the cantilever is brought close to the surface of the sample immersed in the liquid, and the cantilever is moved to its resonance frequency.
  • a dynamic mode atomic force microscope that detects an interaction between the probe and the sample while performing feedback control to vibrate in the vicinity and maintaining the vibration amplitude constant, the surface of the sample
  • a dissipation signal acquisition unit that acquires a dissipation signal reflecting an energy dissipation force acting between the probe and the sample, based on the vibration amplitude of the cantilever or a signal in its feedback control path
  • a frequency shift signal acquisition unit that acquires a frequency shift signal reflecting a frequency shift that is a shift in the resonance frequency of the cantilever
  • a reference data measurement unit for actually measuring data indicating the probe-sample distance dependency of the dissipation signal and
  • the second aspect of the present invention which has been made to solve the above-mentioned problems, is that the probe provided at the tip of the cantilever is brought close to the surface of the sample immersed in the liquid and the cantilever is resonated.
  • a dynamic mode atomic force microscope that detects an interaction between the probe and the sample while performing feedback control to vibrate near the frequency and maintaining the vibration amplitude constant
  • a dissipation signal acquisition unit that acquires a dissipation signal reflecting an energy dissipation force acting between the probe and the sample, based on the vibration amplitude of the cantilever or a signal in its feedback control path
  • a frequency shift signal acquisition unit that acquires a frequency shift signal reflecting a frequency shift that is a shift in the resonance frequency of the cantilever
  • a scanning control unit that two-dimensionally scans the probe on the sample while adjusting the distance between the probe and the sample so as to maintain the energy dis
  • a non-contact that is, dynamic mode atomic force microscope (AFM) is used instead of a contact mode.
  • AFM dynamic mode atomic force microscope
  • the cantilever is excited near its resonance frequency, and the excitation state is feedback controlled so that the vibration amplitude of the cantilever becomes constant.
  • the conservative force force synchronized with the probe vibration
  • the dissipative force dissipating the vibration energy of the probe
  • a photothermal excitation method known as a spurious-free excitation method may be used.
  • the displacement of the cantilever is typically detected optically.
  • the dissipative signal acquisition unit is configured to dissipate between the probe and the sample based on the optically detected vibration amplitude of the cantilever or a signal in its feedback control path. Obtain a dissipative signal reflecting force.
  • a gain control voltage generated in the automatic gain control circuit can be used as a dissipative signal.
  • the frequency shift signal acquisition unit acquires a frequency shift signal reflecting the shift of the resonance frequency of the cantilever, that is, the frequency shift, based on, for example, optically detected displacement of the cantilever.
  • the dissipation signal acquisition unit and the frequency shift signal acquisition unit are components common to the first and second modes.
  • the feedback control method of the probe-sample distance is different between the first mode and the second mode. That is, in the surface charge density measuring apparatus according to the first aspect, the scanning control unit feeds back the probe-sample distance in a two-dimensional manner while controlling the probe-sample distance so that the frequency shift is kept constant. To scan. This is a constant frequency shift control similar to the observation of a general surface irregularity image.
  • the dissipative signal obtained at this time includes information such as the electrostatic interaction force between the probe and the sample by the electric double layer formed in the liquid, that is, the charge density on the sample surface. This is due to the following reason.
  • the absolute probe-sample distance is the electrostatic attractive force (Maxwell stress) or repulsive force between the probe and the sample.
  • the electrostatic interaction force is a conservative force and is hardly reflected in energy dissipation. For this reason, there is almost no difference in energy dissipation at the same probe-sample distance regardless of the presence or absence and magnitude of the electrostatic interaction force.
  • the dissipation signal reflects the strength of the electrostatic interaction force, that is, the state of the surface charge or surface potential of the sample.
  • the reference data measuring unit measures the data indicating the probe-sample distance dependency of the dissipative signal and the frequency shift signal at least at one location on the sample, and the conversion formula determining unit is measured by the reference data measuring unit. Based on the obtained data, the conversion information for converting the dissipation signal to the frequency shift signal is obtained, and the dissipation signal is converted into the surface charge density from the theoretical relationship between the frequency shift and the surface charge density and the above conversion information.
  • a conversion formula is determined in advance.
  • the conversion formula determination unit fits the frequency shift probe-sample distance dependency curve and the energy dissipation probe-sample distance dependency curve based on the data obtained by the reference data measurement unit using exponential functions, respectively. Thus, conversion information for converting the dissipated signal into the frequency shift signal can be obtained.
  • the conversion formula obtained by the conversion formula determination unit or information corresponding thereto is temporarily stored in, for example, the storage unit.
  • the conversion processing unit converts the dissipated signal obtained when the two-dimensional scanning is performed under the control of the scanning control unit into the surface charge density by using the information stored in the storage unit. To do.
  • the energy dissipation image corresponding to the surface irregularity image on the sample is converted into the surface charge density image. Can do.
  • the scan control unit feeds the probe on the sample while feedback controlling the distance between the probe and the sample so that the energy dissipation is kept constant, not the frequency shift.
  • the surface electrostatic interaction force generated by the surface charge of the sample is a conservative force and is hardly reflected in energy dissipation. Therefore, the dissipation signal reflects the probe-sample distance more accurately than the frequency shift signal.
  • the probe-sample distance is affected by the surface charge of the sample. Almost constant. Therefore, the fluctuation appearing in the frequency shift signal reflects the surface charge and potential state of the sample.
  • the conversion processing unit outputs the frequency shift signal obtained when two-dimensional scanning is performed under the control of the scanning control unit as the frequency shift and the surface.
  • the surface charge density is converted based on the theoretical relationship with the charge density.
  • the surface charge density distribution of the sample placed in the liquid can be obtained in any of the surface charge density measuring apparatuses according to the first and second aspects of the present invention. Further, since the charge density can be easily converted into a surface potential, the surface potential distribution of the sample can be obtained.
  • the dynamic mode AFM since the dynamic mode AFM is used, feedback control is performed so that the probe and the sample are separated to some extent. Unlike the contact mode, a cantilever having a large spring constant can be used. Therefore, the above-described “Jump-to-Contact” problem hardly occurs when the probe is scanned on the sample.
  • a strong electrolyte solution can be used as a liquid in which the sample is immersed, the charge density on the sample surface can be obtained with high spatial resolution without being substantially affected by the charge due to the substrate on which the sample is placed. Can be obtained.
  • the surface charge density measuring apparatus it is not necessary to obtain force curves at many points on the sample as in the method using the conventional force mapping technique, and the surface shape of the surface by normal feedback control is eliminated.
  • a surface charge density distribution image and a surface potential distribution image can be obtained in about the same measurement time as the measurement. Therefore, the measurement throughput is greatly improved and the influence of the thermal drift of the apparatus is less likely to appear in the measurement result, so that the measurement accuracy is also improved.
  • the surface charge density measuring apparatus of the first aspect it is only necessary to operate the AFM in the frequency shift constant control mode used in general surface shape measurement. There is no need for knowledge of modes or experience or skill in measurement in such modes. Therefore, the operator's restrictions that can be measured are relaxed, and the burden on the operator is reduced. Further, according to the study by the present inventor, when the frequency shift constant control mode and the energy dissipation constant control mode are compared, a surface shape image having a higher SN ratio can be obtained in the former. In general, when observing a surface charge density distribution image of a sample, it is necessary to also observe a surface shape image. Therefore, it is a great advantage to obtain a surface shape image having a high S / N ratio at the same time. On the other hand, the surface charge density measuring apparatus of the second aspect has an advantage that the conversion from the frequency shift signal to the charge density can be performed easily, that is, by simple processing.
  • FIG. 4A shows a ZX in-plane distribution image (a) of energy dissipation on the same straight line as FIG. 4A, and the probe-sample distance dependence of energy dissipation at positions C and D on the distribution image.
  • the positive and negative charges represent counter ions that exist in a manner that neutralizes and shields the surface fixed charges of the probe and the sample.
  • 2 is an image obtained by converting the energy dissipation image shown in FIG. 2B into a surface charge density distribution and a surface potential image in the surface charge density measuring apparatus of the first embodiment.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a main part of the surface charge density measuring apparatus according to the first embodiment.
  • the sample 3 to be observed is held on a sample holder 2 made of a conductor such as metal placed on a scanner 1 having a substantially cylindrical shape.
  • the scanner 1 includes an XY scanner that scans the sample 3 in two directions of X and Y orthogonal to each other, and a Z scanner that finely moves in the Z-axis direction orthogonal to the X-axis and Y-axis.
  • the drive source is a piezoelectric element that is displaced by a voltage applied from the vertical position control unit 26.
  • a cantilever 5 having a probe 6 at its tip is disposed above the sample 3, and this cantilever 5 is fixed to the pedestal 4 via a cantilever holder 7.
  • the pedestal portion 4 is a glass transparent body having a flat bottom surface, and the gap between the sample holder 2 and the pedestal portion 4 is filled with the analysis liquid 8.
  • the sample 3 is in a state of being immersed in the analysis liquid 8.
  • the upper surface of the analysis liquid 8 is completely in close contact with the lower surface of the pedestal 4, and the liquid level of the analysis liquid 8 does not fluctuate even when the probe 6 scans the surface of the sample 3.
  • an optical displacement detector 10 including a laser light source 11, a half mirror 12, a mirror 13, and a photodetector 14 is provided above the pedestal 4. Yes.
  • the laser light emitted from the laser light source 11 is reflected substantially vertically by the half mirror 12 and irradiated to the vicinity of the rear end of the cantilever 5 through the transparent body of the pedestal unit 4.
  • the cantilever 5 is made of silicon, silicon nitride, or the like, and a metal thin film such as gold (Au) or aluminum (Al) is formed on the surface facing the sample 3 and the back surface.
  • the back surface of the cantilever 5 is a mirror surface, and the laser light irradiated from above is reflected by the back surface of the cantilever 5 and passes above the pedestal portion 4, and is introduced into the photodetector 14 through the mirror 13. .
  • the photodetector 14 has, for example, a light receiving surface divided into a plurality (usually two) in the displacement direction (Z-axis direction) of the cantilever 5.
  • the detection signal generated by the light incident on each light receiving surface is amplified by the preamplifier 20, and the difference signal is extracted by the difference amplifier 21.
  • the difference signal extracted from the difference amplifier 21 corresponds to the displacement amount of the cantilever 5 in the Z-axis direction.
  • this difference signal includes various frequency components generated in the cantilever 5, only a signal in a specific frequency range near the resonance frequency is extracted by the band pass filter (BPF) 22, and a phase lock loop (PLL ) Supply to the circuit 23 and the cantilever photothermal excitation unit 30.
  • BPF band pass filter
  • PLL phase lock loop
  • the cantilever photothermal excitation unit 30, the excitation laser light source 37, the laser diode (LD) drive unit 36, and the adder 35 have a function of causing the cantilever 5 to self-oscillate near its resonance frequency.
  • the cantilever photothermal excitation unit 30 includes an effective value-direct current (RMS-DC) converter 31, an automatic gain control circuit (AGC) 32, a phase shift circuit 33, and a multiplier 34.
  • RMS-DC effective value-direct current
  • AGC automatic gain control circuit
  • the effective value-DC converter 31 detects the effective value of the AC signal and outputs the effective value as a DC signal, thereby automatically gaining the gain.
  • the control circuit 32 amplifies the signal while automatically adjusting the gain so that the DC signal is kept constant.
  • the phase shift circuit 33 adjusts the phase of the signal including the resonance frequency component of the cantilever 5 supplied from the bandpass filter 22 so that the cantilever 5 is stably excited at the resonance frequency.
  • the multiplier 34 adjusts the amplitude of the AC signal by multiplying the AC signal whose phase is adjusted by the DC signal whose gain is adjusted.
  • the adder 35 adds the signal from the multiplier 34 to the drive signal supplied from the LD drive unit 36 and supplies it to the excitation laser light source 37.
  • the laser beam emitted from the excitation laser light source 37 is applied to a predetermined portion on the back surface of the cantilever 5. Heat is generated on the back surface of the cantilever 5 by this laser light irradiation, and the cantilever 5 is bent due to the differential heat between the back surface side and the front surface side.
  • the power supplied to the excitation laser light source 37 is modulated by the signal supplied from the multiplier 34 to the adder 35, thereby inducing vibration of the cantilever 5. At this time, the vibration amplitude of the cantilever 5 is maintained substantially constant by feedback control through the cantilever photothermal excitation unit 30.
  • the phase lock loop circuit 23 causes the resonance frequency of the cantilever 5 to change due to the force acting between the probe 6 and the sample 3. Is detected and supplied to the data processing unit 24.
  • the data processing unit 24 generates a signal for keeping the frequency change constant based on the detected frequency shift amount, that is, a signal for keeping the distance between the probe 6 and the sample 3 constant,
  • the data is sent to the vertical position control unit 26 through the main control unit 25.
  • the vertical position control unit 26 drives the sample scanner 2 in the Z-axis direction by driving the Z scanner included in the scanner 1 in accordance with the received signal, and the distance between the probe 6 and the sample 3 is substantially constant. To maintain.
  • the main control unit 25 includes a surface unevenness image creating unit 251, and the surface unevenness image creating unit 251 is based on a signal for maintaining a constant frequency change of the cantilever 5 supplied from the data processing unit 24.
  • An uneven image (surface topography image) is created and displayed on the screen of the display unit 29.
  • a voltage control signal for changing the gain in the automatic gain control circuit 32 is supplied to the data processing unit 24.
  • This voltage control signal is a signal corresponding to the amount of change in vibration amplitude of the cantilever 5 vibrating at a predetermined resonance frequency, and corresponds to the amount of energy dissipated between the probe 6 and the sample 3. .
  • energy dissipation signal it is possible to create an energy dissipation image on the surface of the sample 3 based on this voltage control signal (hereinafter referred to as “energy dissipation signal”).
  • the data processing unit 24 includes a charge density conversion processing unit 241 that converts an energy dissipation signal into a surface charge density, and the main control unit 25 has an energy dissipation image creation unit 252. , And a surface charge density distribution image creation unit 253.
  • the main control unit 25 is also connected with an operation unit 28 for an operator to input or set conditions and parameters necessary for measurement and a display unit 29 for displaying measurement results.
  • an operation unit 28 for an operator to input or set conditions and parameters necessary for measurement and a display unit 29 for displaying measurement results.
  • At least some of the functions of the main control unit 25 and the data processing unit 24 are realized by, for example, using a personal computer as a hardware resource and executing dedicated control / processing software installed in the computer. be able to.
  • the FM-AFM used in the surface charge density measuring apparatus of this embodiment uses the photothermal excitation method to excite the cantilever 5.
  • the photothermal excitation method is a so-called spurious-free excitation method and can eliminate the coupling between the preservative force and the dissipative force even in liquid (for details, see Nishida et al. In-liquid atomic force microscope using laser Doppler interferometer and photothermal excitation method ", production research, Vol. 58, No. 2, 2006, etc.)
  • the FM-AFM is operated in the frequency shift constant control mode in which the probe 6 scans the surface of the sample 3 two-dimensionally while maintaining the frequency shift constant. Then, a surface charge density distribution image of the sample 3 is obtained based on the energy dissipation image acquired at the same time as the surface unevenness image.
  • a method for measuring the surface charge density in the surface charge density measuring apparatus according to the present embodiment and a specific operation of the apparatus when the measurement is performed will be described. First, the fact that the surface charge density can be obtained based on the energy dissipation signal obtained from the automatic gain control circuit 32 in the apparatus configured as described above will be described with reference to an actual measurement example.
  • FIG. 2 shows a sample prepared by immobilizing lambda DNA molecules on a muscovite mica substrate coated with poly-L-Lysine using the surface charge density measuring apparatus of this example. These are the surface unevenness image (a), the energy dissipation image (b), and the frequency shift image (c) obtained. (A) and (b) are created by the surface unevenness image creating unit 251 and the energy dissipation image creating unit 252 when the XY plane on the sample 3 is two-dimensionally scanned in the frequency shift constant control mode. This is an image. On the other hand, (c) is an image of a feedback signal for making the frequency shift constant.
  • FIG. 2 (a) shows that a single DNA molecule is clearly visualized in the surface irregularity image. Moreover, it can be seen from the energy dissipation image shown in FIG. 2B that the amount of energy dissipation is reduced on the DNA molecule compared to the polylysine film. The contrast of this energy dissipation image is clearly different from the contrast of the frequency shift image shown in FIG. From this, it can be understood that the energy dissipation signal is not coupled with the feedback signal for the constant frequency shift control, that is, the dissipation power and the storage power are sufficiently separated.
  • FIG. 3 is a diagram showing a one-dimensional profile of the height value and energy dissipation extracted at the position indicated by the line AB in FIGS. 2 (a) and 2 (b).
  • the unit of energy dissipation is V (volt) because an excitation voltage that is linearly related to energy dissipation is used as energy dissipation.
  • V voltage
  • FIG. 3 shows that the height of the DNA molecule is about 2.0 [nm] which is the diameter of the DNA.
  • FIG. 3 also shows that the amount of energy dissipation on the DNA molecule is clearly reduced compared to the surrounding area, that is, on the polylysine film.
  • FIG. 4A shows a ZX in-plane distribution image of a frequency shift on a straight line parallel to the X axis on the surface of the sample 3, and FIG. 4B shows a probe-sample distance of the frequency shift extracted from the distribution image. It is a figure which shows dependency. That is, this shows a frequency shift distribution in a plane orthogonal to the XY plane (a plane extending in the height direction).
  • the position of the C-C ′ line is on the DNA molecule
  • the position of the D-D ′ line is on the polylysine film.
  • FIG. 5 (a) is a ZX in-plane distribution image of energy dissipation at the same position on the sample 3 as in FIG. 4 (a), and FIG. 5 (b) is an energy dissipation probe-sample-to-sample extracted from the distribution image. It is a figure which shows distance dependence. Since energy dissipation has temporal fluctuation, it is difficult to understand on the distribution image shown in FIG. 5A, but the dependence of energy dissipation on the probe-sample distance shown in FIG. As can be seen, there is little difference between the DNA molecule and the polylysine film in increasing tendency of energy dissipation when the probe-sample distance is shortened. Thus, it can be seen that the dependence of the probe-sample distance on the DNA molecule and on the polylysine film is clearly different between the frequency shift shown in FIG. 4 and the energy dissipation shown in FIG.
  • positive and negative charges represent counter ions that exist in the form of neutralizing and shielding the surface fixed charges of the probe 6 and the sample 3.
  • the probe-sample distance is controlled so that the frequency shift of the probe 6 is constant, so that the absolute probe-sample distance is controlled to be constant. It is not done.
  • the surface of the probe 6 is negatively charged in the analysis liquid 8, whereas the polylysine film 3b on the substrate 3a is positive, and the DNA molecule 3c thereon is negatively charged. Yes.
  • the polarity of the electrostatic interaction between the probe 6 and the sample 3 differs between the DNA molecule 3a and the polylysine film 3b.
  • an attractive force acts
  • the needle 6 is on the DNA molecule 3a
  • repulsive force acts.
  • the distance between the probe and the sample is relatively large when the probe 6 passes over the DNA molecule 3a, and between the probe and the sample when it passes over the polylysine film 3b. The distance is relatively small.
  • the electrostatic interaction force generated by the electric double layer formed in the analysis liquid 8 is a conserving force.
  • the photothermal excitation method hardly couples the conserving force and the dissipating force. Does not reflect the electrostatic interaction force caused by the potential state of the surface of the sample 3 as described above. That is, it can be considered that there is almost no difference in energy dissipation at the same probe-sample distance between the DNA molecule 3a and the polylysine film 3b. In other words, as described above, the difference between the probe-sample distance between the DNA molecule 3a and the polylysine film 3b is reflected in the energy dissipation.
  • the difference between the probe-sample distance reflects the strength of the electrostatic interaction force, that is, the surface charge distribution state. Therefore, the energy dissipation image as shown in FIG. The contrast should reflect the surface charge distribution state. From the above, it can be understood that there is a predetermined relationship between energy dissipation and surface charge density, and that the energy dissipation signal can be converted to surface charge density.
  • the surface charge density measuring apparatus of the present embodiment is obtained from the energy dissipation signal by the following algorithm.
  • a Pauli repulsive force acts between the probe 6 and the sample 3.
  • the Pauli repulsive force becomes dominant as the probe-sample distance becomes smaller, and the probe-sample dependency can be approximated by an exponential function. Further, the Pauli repulsive force hardly shows the viscoelasticity dependency of the sample 3. Since the Pauli force is reflected in both frequency shift and energy dissipation, the dependence of the frequency shift and energy dissipation on the probe-sample distance is an exponent in the range of the probe-sample distance where the Pauli force is dominant. Using the fact that it can be approximated by a function, the relationship between frequency shift and energy dissipation can be estimated. Since the relationship between the charge density and the frequency shift can be theoretically derived, it is possible to obtain the relationship between the energy dissipation and the charge density.
  • a probe-sample distance dependency curve of the energy dissipation V exc and the frequency shift ⁇ f is acquired on the polylysine film of the sample 3 to be measured.
  • the data constituting these curves is determined by the horizontal position control unit 27 driving the X scanner and the Y scanner of the scanner 1 under the control of the main control unit 25, and the vertical position control unit 26 being the Z scanner. Can be acquired by driving and gradually changing the probe-sample distance.
  • the obtained data is temporarily stored in the surface charge density conversion processing unit 241 in the data processing unit 24.
  • FIG. 7A is an example of a probe-sample distance dependency curve of energy dissipation V exc
  • FIG. 7B is an example of a probe-sample distance dependency curve of frequency shift ⁇ f.
  • the Pauli repulsive force becomes dominant, and both the energy dissipation and the frequency shift increase rapidly.
  • the distance between the probe 6 and the sample 3 increases to a certain extent (in the electric double layer region in the figure)
  • the electrostatic attractive force or repulsive force becomes dominant. Since the electrostatic mutual force is hardly reflected, even if the probe-sample distance changes, the energy dissipation hardly changes.
  • the influence of electrostatic attraction or repulsion appears in the frequency shift.
  • the conversion factor ⁇ from energy dissipation to frequency shift is determined by the following equation (3).
  • ⁇ ⁇ f Pauli_0 / V exc_0 (3)
  • the surface charge conversion density conversion processing unit 241 determines the conversion coefficient ⁇ by substituting the fitting parameters ⁇ f Pauli_0 and V exc — 0 determined as described above into the expression (3).
  • the measurement site for obtaining the probe-sample distance dependency curve may be any on the sample 3, but preferably a site where electrostatic attraction occurs, in this case on the polylysine film. It is good to do. This is because the number of data with different probe-sample distances increases, which makes it easier to calculate accurate fitting parameters.
  • the electric double layer force region is obtained.
  • the surface charge of the probe and the sample is determined by the equilibrium reaction between the surface functional group and the ion, and has a boundary condition somewhere between the fixed charge and the fixed potential.
  • the electric double layer force is greatly influenced not only by the surface charge but also by boundary conditions, but linear superposition approximation (LSA) gives a good approximation under the condition of pH 7.
  • ⁇ D is the reciprocal of the Debye length, and a theoretical value calculated from the concentration of the electrolyte used as the analysis liquid 8 may be used.
  • R apex is the radius of curvature of the probe 6, and for example, the nominal value of the probe data sheet (7 [nm] in this example) may be used.
  • ⁇ 0 is the dielectric constant in vacuum
  • ⁇ r is the relative dielectric constant of the analysis liquid 8
  • ⁇ s_0 is the surface potential described later
  • ⁇ s is the surface charge of the sample based on the surface charge density of the polylysine film described later. Density.
  • ⁇ is a conversion coefficient from charge density to frequency shift, which will be described later.
  • the charge density ⁇ PL on the polylysine film is obtained by fitting to a curve (for example, FIG. 7B).
  • the conversion coefficient ⁇ from the charge density to the frequency shift is theoretically determined by the following equation (6).
  • ⁇ (4 ⁇ R apex ⁇ t f 0 ) / (2 k z ⁇ 0 ⁇ r ) (6)
  • ⁇ t is the probe surface charge density
  • f 0 is the resonance frequency of the cantilever 5
  • k z is the spring constant of the cantilever 5, so the conversion coefficient ⁇ can be calculated from these parameters.
  • the following equation (7) can be used for conversion from the energy dissipation signal to the surface charge density.
  • the surface charge conversion density conversion processing unit 241 substitutes the conversion coefficients ⁇ and ⁇ and the charge density ⁇ PL on the polylysine film obtained as described above into the above equation (7), and further, the energy dissipation obtained by actual measurement. Conversion of energy dissipation V exc to surface charge density ⁇ s is possible by applying energy dissipation V exc_PL ( ⁇ V exc_ ⁇ ) on polylysine film derived from the probe-sample distance dependency curve Find the appropriate conversion formula. The conversion formula thus obtained is stored in the charge density conversion processing unit 241.
  • the surface charge converted density conversion processing unit 241 has a frequency shift and energy dissipation probe acquired at a certain point on the sample 3 to be measured. Based on the inter-sample distance dependency curve, a conversion formula for converting the energy dissipation signal into the surface charge density is calculated and stored inside. Further, since the surface charge density ⁇ s can be converted into the surface potential ⁇ s — 0 by using the following expression (8), this expression is also stored in the surface charge converted density conversion processing unit 241. ⁇ s_0 ⁇ ⁇ s / ⁇ 0 ⁇ r ⁇ D (8)
  • the surface charge converted density conversion processing unit 241 When the necessary conversion formula is prepared in the surface charge conversion density conversion processing unit 241, under the control of the main control unit 25, two-dimensional scanning on the sample 3 is executed in the constant frequency shift control mode, and the automatic gain is obtained. An energy dissipation signal is supplied from the control circuit 32 to the data processing unit 24. In the data processing unit 24, the surface charge converted density conversion processing unit 241 sequentially converts the energy dissipation signal into the surface charge density and the surface potential using a conversion formula stored therein, and sends it to the main control unit 25.
  • a surface charge density distribution image creation unit 253 creates a surface charge density distribution image and a surface potential image based on the surface charge density and surface potential at each point on the sample 3, and a surface unevenness image creation unit
  • the image is displayed on the screen of the display unit 29 together with the surface unevenness image created by 251, the dissipation image created by the energy dissipation increase creation unit 252, and the like.
  • the conversion formula is determined in advance, the process of conversion from the energy dissipation signal to the surface charge density is simple.
  • FIG. 8 shows a surface charge density distribution image obtained by conversion from the energy dissipation image shown in FIG. 2B in the surface charge density measuring apparatus of this example.
  • FIG. 8 shows that the surface charge density distribution on the DNA molecule and the polylysine film can be sufficiently visualized.
  • the theoretical value of the surface charge density on the DNA molecule is about ⁇ 0.2 [C / m ⁇ 2 ], and the value obtained by actual measurement is in good agreement with this theoretical value. From this, it can be seen that the surface charge density obtained from energy dissipation is accurate as an absolute value.
  • the surface charge density measuring apparatus of the present embodiment can provide the user with a surface charge density distribution image having quantitativeness.
  • the FM-AFM is operated in the frequency shift constant control mode.
  • the distance between the probe and the sample is controlled so that the energy dissipation is constant.
  • a frequency shift image and an energy dissipation image can be obtained simultaneously.
  • the surface charge density distribution apparatus of the second embodiment the surface charge density distribution image is obtained by converting the frequency shift obtained when the FM-AFM is operated in the constant energy dissipation control mode into the surface charge density. Accordingly, the basic apparatus configuration is the same as that of the first embodiment except that the processing in the surface charge density conversion processing unit 241 is different, and thus detailed description of the apparatus configuration is omitted.
  • FIG. 9 is a conceptual diagram showing the behavior of the probe 6 when the probe 6 is scanned in the constant energy dissipation control mode
  • FIG. 10A is a probe-sample distance dependency curve of the energy dissipation V exc
  • FIG. (B) is an example of a probe-sample distance dependency curve of the frequency shift ⁇ f.
  • the electrostatic interaction force is a conservation force, it is hardly reflected in energy dissipation (see FIG. 10A). Therefore, when the probe-sample distance is controlled so that the energy dissipation is constant, the absolute probe-sample distance is not affected by the surface charge density and surface potential as shown in FIG. The probe 6 scans on the sample 3 so that the distance is maintained substantially constant. On the other hand, since the absolute probe-sample distance is almost constant, electrostatic interaction force appears remarkably in the frequency shift. Therefore, as shown in FIG. 10B, there is a large difference in the probe-sample distance dependency between the probe 6 on the DNA molecule and the polylysine film.
  • the frequency shift due to the Pauli repulsion can be approximated by an exponential function. Therefore, the difference between the Pauli repulsive force and the probe-sample distance dependency can be regarded as an electrostatic interaction force, that is, an attractive force or a repulsive force due to the surface charge density.
  • the above equation (6) is used as the conversion coefficient ⁇ from the charge density to the frequency shift.
  • the charge density ⁇ PL on the polylysine film is obtained using a probe-sample distance dependency curve of the frequency shift on the polylysine film obtained by actual measurement in the same manner as in the first embodiment.
  • ⁇ f PL is also obtained from the probe-sample distance dependency curve of the same frequency shift.
  • a conversion formula from the frequency shift signal to the surface charge density is determined by the following formula (9). ⁇ s ⁇ PL + (1 / ⁇ ) ( ⁇ f ⁇ f PL ) (9)
  • the conversion process for calculating the surface charge density is considerably simpler than that of the apparatus of the first embodiment.
  • the constant frequency shift control mode is the most standard measurement mode in FM-AFM, and no special knowledge or experience is required for the operator, whereas the constant energy dissipation control is a measurement mode that is rarely used. Therefore, a certain degree of detailed knowledge and experience regarding the measurement work by FM-AFM is required of the operator.
  • the frequency band in order to obtain the same SN ratio between the surface unevenness image obtained in the frequency shift constant control mode and the surface unevenness image obtained in the energy dissipation constant control mode, in the energy dissipation constant control mode, The frequency band must be 1/9 times the frequency shift constant control mode. This means that in the constant frequency shift control mode, the scanning speed can be nine times that of the constant energy dissipation control mode, and the constant frequency shift control mode is more advantageous in terms of measurement time.

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Abstract

　ＦＭ－ＡＦＭを用い、周波数シフト一定制御の下で、試料（３）上の或る点における周波数シフトとエネルギ散逸の探針-試料間距離依存性曲線を実測する。表面電荷密度換算処理部（２４１）は、パウリ斥力が支配的である範囲では上記曲線が指数関数に近似可能であることを利用してフィッティングを行うことにより、エネルギ散逸から電荷密度への換算式を求め記憶しておく。周波数シフト一定制御により試料（３）上の表面形状とともに該試料（３）上の各点のエネルギ散逸が求まると、表面電荷密度換算処理部（２４１）は上記換算式を用いて表面電荷密度を求め、表面電荷密度像作成部（２５３）が表面電荷密度分布像を作成し、表面凹凸像や散逸像とともに表示部（２９）の画面上に表示する。従来のように三次元的なフォースマッピングが不要であるので、測定時間を大幅に短縮できる。このようにして、液中に置かれた試料表面の電荷密度分布像を迅速に且つ精度良く取得することができる。

Description

原子間力顕微鏡を用いた表面電荷密度測定装置
　本発明は、原子間力顕微鏡を用いて液体中に置かれた物質の表面電荷密度分布や表面電位分布を測定する表面電荷密度測定装置に関する。
　原子間力顕微鏡（ＡＦＭ＝Atomic Force Microscope）は、先鋭な探針と試料表面との間に作用する力をカンチレバーの変位から測定し、探針を試料表面に沿って一次元的又は二次元的に走査することで試料表面の形状等の情報を取得する装置である。このＡＦＭの一つとして、周波数変調検出方式のＡＦＭ（ＦＭ－ＡＦＭ＝Frequency Modulation - Atomic Force Microscope）がよく知られている。
　ＦＭ－ＡＦＭでは一般的に、試料表面に原子レベルの距離まで近づけた探針を保持するカンチレバーをその機械的な共振周波数で以て振動させ、探針と試料表面との間に働く相互作用によって生じる共振周波数の変化（周波数シフトΔｆ）を検出する。この周波数シフトΔｆは探針と試料表面との距離に依存するため、周波数シフトΔｆを一定に維持しながら、試料表面を該試料の法線に直交する面内で二次元に走査（例えばラスタースキャン）することにより、試料表面の凹凸状態を示す画像（表面凹凸像或いは表面トポグラフィ像）を得ることができる。
　ところで、近年、各種疾病・疾患の原因究明や医薬品の開発などを目的として、タンパク質やＤＮＡといった生体分子の生体機能発現メカニズムの解明が各所で盛んに進められている。こうした研究・開発のためには生体分子の構造を把握することが必要であり、そのための様々な計測手法が開発されている。ＡＦＭの分野においても、このような観点での新技術や計測手法の開発が鋭意進められており、高真空雰囲気中だけでなく液体中や生理学的環境下におけるタンパク質やＤＮＡなどの生体分子の分子スケールでの構造解析が行えるようになってきている（例えば特許文献１など参照）。
　生体分子の生体機能発現メカニズム解析のためには、生体分子の構造把握だけでなく生体分子の様々な物性を併せて計測することが必要不可欠である。特に、生体分子の表面電荷分布は、該分子内部での官能基間や分子間に働く静電相互作用を通して、分子の機能発現に大きな役割を担っていることが知られている。Ｘ線回折や中性子線回折といった広義の光学的手法により表面電荷を測定する手法もあるが、こうした手法では試料表面全体で平均化された情報しか得ることができず、詳細な電荷分布を知ることはできない。
　これに対し近年、ＡＦＭを用いて液体中における固体表面の電荷密度分布を計測する手法が開発されている。即ち、極性溶媒である水溶液中では、帯電した固体又は分子の表面の電荷を中和遮蔽するように溶液中の電解質が電気二重層を形成する。そのため、水溶液中で二つの固体表面を近接させると、それらの表面の帯電状態に依存する斥力（浸透圧力）又は引力（Maxwell応力）が相互に作用する。ＡＦＭでは、こうした二つの固体表面間に作用する極めて微弱な力をナノメートルオーダの空間分解能で以て計測することが可能である。そこで、非特許文献１、２などにおいては、ＡＦＭのコンタクトモード（静的モード）と三次元フォースマッピング技術とを組み合わせ、探針-試料間に作用する電気二重層力を三次元的又は二次元的にマッピングすることにより、液中における固体表面の電荷密度分布を計測する手法が提案されている。
　しかしながら、こうしたＡＦＭを利用した従来の計測方法では次のような問題がある。
　一般に、液体中で生じる電気二重層力は極めて微弱な力であるため、ＡＦＭのコンタクトモードによりこの力を測定するには、ばね定数の小さなカンチレバーを使用する必要がある。ところが、カンチレバーと試料との間にそのばね定数を上回る力勾配が発生すると、探針先端が試料表面に引き寄せられて「Jump-to-Contact」と呼ばれる衝突現象が起こるため、ばね定数の小さなカンチレバーを使用する場合には、この衝突現象が起こらないように特に注意を要する。この衝突現象は溶液のイオン濃度が高いほど、つまり強電解質であるほど起こり易い。一方、生体分子表面の電荷密度分布計測を高い空間分解能で行うには、生体分子が載置された基板による電荷の影響を排除する必要があり、そのためには、拡散二重層におけるデバイ（Debye）長が分子よりも小さくなるような強電解質の溶液を使用する必要がある。つまり、計測の空間分解能を上げるには強電解質溶液を使用する必要があるものの、衝突現象を回避するには弱電解質の溶液を用いざるをえず、それ故に、計測の空間分解能を上げることが難しいという問題がある。
　また、三次元フォースマッピングでは、計測対象の固体表面上の膨大な数の微小領域毎にそれぞれフォースカーブを求める必要があり、通常のフィードバック制御による表面形状の測定に比べると測定に要する時間が大幅に長くなる。そのため、上記計測方法はスループットが低く、効率が悪い。また、一つの試料に対する測定時間が長くなると、装置の熱的ドリフト等の影響が測定結果に現れ易くなり、測定精度の低下を招くという問題もある。
特開２００９－５８２３１号公報
ソトレス（J. Sotres）ほか１名、「ＤＮＡ・モレキュルズ・リゾルブド・バイ・エレクトリカル・ダブル・レイヤ・フォース・スペクトロスコピ・イメージング（DNA molecules resolved by electrical double layer force spectroscopy imaging）」、アプライド・フィジックス・レターズ（Appl. Phys. Lett.）、2008年、Vol.93 ソトレス（J. Sotres）ほか１名、「ＡＦＭ・イメージング・アンド・アナリシス・オブ・エレクトロスタティク・ダブル・レイヤ・フォーシズ・オン・シングル・ＤＮＡ・モレキュルズ（AFM Imaging and Analysis of Electrostatic Double Layer Forces on Single DNA Molecules）」、バイオフィジカル・ジャーナル（Biophys J.）、 2010年、Vol.98、pp.1995?2004
　本発明は上記課題を解決するために成されたものであり、その主な目的は、原子間力顕微鏡を用い、短い測定時間で以て高い空間分解能の表面電荷密度分布を測定することができる表面電荷密度測定装置を提供することにある。
　また、本発明の他の目的は、原子間力顕微鏡を用いた各種測定に関する知識や熟練に乏しい者であっても、比較的簡便に測定を行うことができる表面電荷密度測定装置を提供することにある。
　本発明のさらに他の目的は、相対的な表面電荷分布情報だけでなく定量的な表面電荷分布情報を求めることができる表面電荷密度測定装置を提供することにある。
　上記課題を解決するためになされた本発明の第１の態様は、カンチレバーの先端に設けられた探針を液体中に浸漬された試料の表面に近接させた状態で、該カンチレバーをその共振周波数付近で振動させ、その振動振幅を一定に維持するようにフィードバック制御を行いつつ、前記探針と前記試料との間に働く相互作用を検出するダイナミックモード原子間力顕微鏡を用い、前記試料の表面電荷分布を測定する表面電荷密度測定装置において、
　a)前記カンチレバーの振動振幅又はそのフィードバック制御経路中の信号に基づいて、前記探針と前記試料との間に作用するエネルギ散逸力を反映した散逸信号を取得する散逸信号取得部と、
　b)前記カンチレバーの共振周波数のずれである周波数シフトを反映した周波数シフト信号を取得する周波数シフト信号取得部と、
　c)前記試料上の少なくとも一箇所で、前記散逸信号及び前記周波数シフト信号の探針-試料間距離依存性をそれぞれ示すデータを実測する基準データ測定部と、
　d)前記試料に対し前記基準データ測定部により得られたデータに基づき、散逸信号を周波数シフト信号へ換算するための換算情報を求めるとともに、周波数シフトと表面電荷密度との理論的な関係及び前記換算情報から、散逸信号を表面電荷密度に換算するための換算式を決定する換算式決定部と、
　e)前記周波数シフトを一定に維持するように前記探針と前記試料との間の距離を調整しつつ、該探針を該試料上で二次元的に走査させる走査制御部と、
　f)前記走査制御部による制御の下で二次元的な走査が行われたときに前記散逸信号取得部により得られた散逸信号を、前記換算式決定部により決定された換算式に従って表面電荷密度に換算する換算処理部と、
　を備えることを特徴としている。
　また上記課題を解決するためになされた本発明の第２の態様は、カンチレバーの先端に設けられた探針を液体中に浸漬された試料の表面に近接させた状態で、該カンチレバーをその共振周波数付近で振動させ、その振動振幅を一定に維持するようにフィードバック制御を行いつつ、前記探針と前記試料との間に働く相互作用を検出するダイナミックモード原子間力顕微鏡を用い、前記試料の表面電荷分布を測定する表面電荷密度測定装置において、
　a)前記カンチレバーの振動振幅又はそのフィードバック制御経路中の信号に基づいて、前記探針と前記試料との間に作用するエネルギ散逸力を反映した散逸信号を取得する散逸信号取得部と、
　b)前記カンチレバーの共振周波数のずれである周波数シフトを反映した周波数シフト信号を取得する周波数シフト信号取得部と、
　c)前記エネルギ散逸を一定に維持するように前記探針と前記試料との間の距離を調整しつつ、該探針を該試料上で二次元的に走査させる走査制御部と、
　d)前記走査制御部による制御の下で二次元的な走査が行われたときに前記周波数シフト信号取得部により得られた周波数シフト信号を、周波数シフトと表面電荷密度との理論的な関係に基づいて表面電荷密度に換算する換算処理部と、
　を備えることを特徴としている。
　本発明に係る第１及び第２の態様の表面電荷密度測定装置ではいずれも、コンタクトモードではなくノンコンタクト、つまりダイナミックモードの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）が利用される。ダイナミックモードのＡＦＭでは、カンチレバーはその共振周波数付近で励振され、カンチレバーの振動振幅が一定になるようにその励振状態がフィードバック制御される。カンチレバーを励振するために従来幾つかの方法が知られているが、探針と試料との間に働く保存力（探針の振動に同期した力）と散逸力（探針の振動エネルギを散逸させる力）とがカップリングしていると、良好な測定信号が得られない、フィードバック制御系が不安定化する、といった問題がある。そこで、液体中において保存力と散逸力とのカップリングを少なくするために、例えばスプリアスフリーな励振法として知られている光熱励振法を用いるとよい。
　ダイナミックモードＡＦＭでは、カンチレバーの変位は典型的には光学的に検出される。本発明に係る表面電荷密度測定装置において散逸信号取得部は、こうした光学的に検出されるカンチレバーの振動振幅或いはそのフィードバック制御経路中の信号に基づいて、探針と試料との間に作用する散逸力を反映した散逸信号を取得する。具体的には、通常、フィードバック制御経路中には自動利得制御回路が設けられているから、その自動利得制御回路において生成される利得制御電圧などを散逸信号として利用することができる。一方、周波数シフト信号取得部は、例えば光学的に検出されるカンチレバーの変位に基づいて、該カンチレバーの共振周波数のずれ、つまり周波数シフトを反映した周波数シフト信号を取得する。
　散逸信号取得部と周波数シフト信号取得部とは第１、第２の態様に共通する構成要素である。一方、探針-試料間距離のフィードバック制御の方法は第１の態様と第２の態様とで異なる。即ち、第１の態様による表面電荷密度測定装置では、走査制御部が、周波数シフトが一定に保たれるように探針-試料間距離をフィードバック制御しながら、試料上で探針を二次元的に走査させる。これは、一般的な表面凹凸像の観測時と同様の、周波数シフト一定制御である。このときに得られる散逸信号には、液体中で形成される電気二重層による探針と試料との間の静電相互作用力、つまりは試料表面の電荷密度などの情報が含まれる。これは次のような理由による。
　即ち、周波数シフトを一定に保つように探針-試料間距離をフィードバック制御する場合、絶対的な探針-試料間距離は探針と試料との間の静電的引力（Maxwell応力）や斥力（浸透圧力）によって変化するのに対し、静電相互作用力は保存力であるためにエネルギ散逸に殆ど反映されない。そのため、静電相互作用力の有無や大きさに拘わらず、同一の探針-試料間距離におけるエネルギ散逸には差が殆どない。逆に言うと、静電相互作用力による探針-試料間距離の変化がエネルギ散逸に現れる。これにより、散逸信号は静電相互作用力の強弱、つまりは試料の表面電荷や表面電位の状態を反映することになる。
　ただし、散逸信号から表面電荷密度を求めるには、両者の関係を調べ、換算式や換算表などを得る必要がある。そこで、基準データ測定部により、試料上の少なくとも一箇所において、散逸信号及び周波数シフト信号の探針-試料間距離依存性をそれぞれ示すデータを測定し、換算式決定部は、基準データ測定部により得られたデータに基づき、散逸信号を周波数シフト信号へ換算するための換算情報を求めるとともに、周波数シフトと表面電荷密度との理論的な関係及び上記換算情報から、散逸信号を表面電荷密度に換算するための換算式を決定しておく。
　探針と試料との間の距離がごく小さくなると、静電相互作用力よりもパウリ(Pauli）斥力が支配的になり、液体中ではパウリ斥力の探針-試料間距離依存性は指数関数により近似可能である。パウリ斥力が支配的である探針-試料間距離範囲では、パウリ斥力の影響は周波数シフト、エネルギ散逸の両方にほぼ同じように現れる。そのため、換算式決定部では、基準データ測定部により得られたデータに基づく周波数シフトの探針-試料間距離依存性曲線及びエネルギ散逸の探針-試料間距離依存性曲線をそれぞれ指数関数でフィッティングすることによって、散逸信号を周波数シフト信号へ換算するための換算情報を求めることができる。
　こうして換算式決定部により得られた換算式又はそれに相当する情報は例えば記憶部に一旦格納される。そして、換算処理部は、この記憶部に格納された情報を利用して、走査制御部による制御の下で二次元的な走査が行われたときに得られた散逸信号を表面電荷密度に換算する。二次元的な走査によって試料上の各点で得られた散逸信号をそれぞれ表面電荷密度に換算することで、試料上の表面凹凸像に対応したエネルギ散逸像を、表面電荷密度像に変換することができる。
　第２の態様による表面電荷密度測定装置では、走査制御部は、周波数シフトでなくエネルギ散逸が一定に保たれるように探針-試料間距離をフィードバック制御しながら、試料上で探針を二次元的に走査させる。上述したように、試料の表面電荷等により発生する表面静電相互作用力は保存力であるためにエネルギ散逸に殆ど反映されない。そのため、散逸信号は周波数シフト信号よりも探針-試料間距離を的確に反映しており、エネルギ散逸一定制御が実施されると、探針-試料間距離は試料の表面電荷等の影響を受けずにほぼ一定となる。したがって、周波数シフト信号に現れる変動は試料の表面電荷や電位状態を反映していることになる。そこで、第２の態様による表面電荷密度測定装置において、換算処理部は、走査制御部による制御の下で二次元的な走査が行われたときに得られた周波数シフト信号を、周波数シフトと表面電荷密度との理論的な関係に基づいて表面電荷密度に換算する。
　以上のように、本発明に係る第１及び第２の態様の表面電荷密度測定装置のいずれにおいても、液中に置かれた試料の表面電荷密度分布を得ることができる。また、電荷密度は容易に表面電位に換算することができるから、試料の表面電位分布を得ることもできる。
　本発明に係る表面電荷密度測定装置では、ダイナミックモードＡＦＭが用いられるので、探針と試料とが或る程度離れるようにフィードバック制御がなされる。また、コンタクトモードとは異なり、ばね定数の大きなカンチレバーを用いることができる。そのため、探針が試料上で走査される際に、上述した「Jump-to-Contact」の問題は起こりにくい。また、試料が浸漬される液体として強電解質溶液を使用することができるので、それにより試料が載置された基板による電荷の影響を実質的に受けずに、高い空間分解能で試料表面の電荷密度を反映した情報を得ることができる。
　また本発明に係る表面電荷密度測定装置によれば、従来のフォースマッピング技術を用いた手法のように試料上の多数の点でそれぞれフォースカーブを求める必要はなくなり、通常のフィードバック制御による表面形状の測定とほぼ同程度の測定時間で表面電荷密度分布像や表面電位分布像を得ることができる。そのため、測定のスループットが大幅に向上するとともに、装置の熱的ドリフト等の影響が測定結果に現れにくくなるので、測定精度も向上する。また、本発明に係る表面電荷密度測定装置では、相対的な電荷密度分布ではなく、各点における電荷密度の定量値を求めることも可能である。
　また特に第１の態様の表面電荷密度測定装置によれば、一般的な表面形状の測定で使用される周波数シフト一定制御モードでＡＦＭを動作させればよいので、測定を行うオペレータに特殊な測定モードの知識やそうしたモードでの測定の経験・熟練が不要である。そのため、測定にあたることができるオペレータの制約が緩くなり、オペレータの負担も軽減される。また、本願発明者の検討によれば、周波数シフト一定制御モードとエネルギ散逸一定制御モードとを比較すると、前者のほうが高いＳＮ比の表面形状像を得ることができる。一般に、試料の表面電荷密度分布像を観測する場合には併せて表面形状像も観測することが必要となるから、高いＳＮ比の表面形状像が同時に得られることは大きな利点である。
　一方、特に第２の態様の表面電荷密度測定装置では、周波数シフト信号から電荷密度への換算を容易に、つまり簡単な処理で行うことができるという利点がある。
本発明の第１実施例であるＡＦＭを用いた表面電荷密度測定装置の概略構成図。 第１実施例の表面電荷密度測定装置による実測で得られた表面凹凸像（ａ）、エネルギ散逸像（ｂ）、及び周波数シフト像（ｃ）の一例を示す図。 図２（ａ）及び（ｂ）中にＡ－Ｂ線で示した試料上の位置において抽出した高さ値及びエネルギ散逸の１次元的なプロファイルを示す図。 試料表面においてＸ軸に平行な直線上の周波数シフトのＺ－Ｘ面内分布画像（ａ）、及びその分布画像上のＣ、Ｄの位置における周波数シフトの探針-試料間距離依存性を示す図。 図４（ａ）と同じ直線上のエネルギ散逸のＺ－Ｘ面内分布画像（ａ）、及びその分布画像上のＣ、Ｄの位置におけるエネルギ散逸の探針-試料間距離依存性を示す図。 周波数シフト一定制御モードで走査したときの探針の挙動の概念図。なお、正及び負の電荷は、探針及び試料の表面固定電荷を中和遮蔽するかたちで存在するカウンタイオンを表す。 周波数シフト一定制御モードにおけるエネルギ散逸の探針-試料間距離依存性曲線を示す図（ａ）、及び周波数シフトの探針-試料間距離依存性曲線を示す図（ｂ）。 第１実施例の表面電荷密度測定装置において図２（ｂ）に示したエネルギ散逸像を表面電荷密度分布及び表面電位像に変換した画像。 エネルギ散逸一定制御モードで走査したときの探針の挙動の概念図。なお、図６と同様に、正及び負の電荷はカウンタイオンを表す。 エネルギ散逸一定制御モードにおけるエネルギ散逸の探針-試料間距離依存性曲線を示す図（ａ）、及び周波数シフトの探針-試料間距離依存性曲線を示す図（ｂ）。
　　［第１実施例］
　以下、本発明の一実施例（第１実施例）であるＦＭ－ＡＦＭを用いた表面電荷密度測定装置について、添付図面を参照して説明する。図１はこの第１実施例の表面電荷密度測定装置の要部の概略構成図である。
　観察対象である試料３は、略円筒形状であるスキャナ１の上に載置された金属等の導電体からなる試料ホルダ２上に保持される。スキャナ１は、互いに直交するＸ、Ｙの２軸方向に試料３を走査するＸＹスキャナとＸ軸及びＹ軸に対し直交するＺ軸方向に微動させるＺスキャナとを含み、それぞれ水平位置制御部２７、垂直位置制御部２６から印加される電圧によって変位を生じる圧電素子を駆動源としている。試料３の上方には先端に探針６を有するカンチレバー５が配置され、このカンチレバー５はカンチレバーホルダ７を介して台座部４に固定されている。液中測定を行うために、この台座部４の少なくとも一部は下面が平坦なガラス製の透明体となっており、試料ホルダ２と台座部４との間の空隙は分析用液体８で満たされ、試料３はこの分析用液体８中に浸漬した状態となっている。分析用液体８の上面は台座部４の下面に完全に密着しており、探針６が試料３の表面を走査する際にも分析用液体８の液面の揺らぎは生じない。
　カンチレバー５のＺ軸方向の変位を検出するために、台座部４の上方には、レーザ光源１１、ハーフミラー１２、ミラー１３、及び光検出器１４を含む光学的変位検出部１０が設けられている。光学的変位検出部１０においては、レーザ光源１１から出射したレーザ光をハーフミラー１２で略垂直に反射させ、台座部４の透明体を通してカンチレバー５の背面先端付近に照射する。カンチレバー５はシリコン又は窒化シリコンなどから成り、試料３との対向面及び背面には金（Au）、アルミニウム（Al）、等の金属薄膜が形成されている。それにより、カンチレバー５の背面は鏡面となっており、上方から照射されたレーザ光はカンチレバー５背面で反射されて台座部４の上方に抜け、ミラー１３を介して光検出器１４に導入される。
　光検出器１４は例えば、カンチレバー５の変位方向（Ｚ軸方向）に複数（通常二つ）に分割された受光面を有する。各受光面に入射した光により生成される検出信号はプリアンプ２０で増幅され、差分アンプ２１によって差信号が取り出される。カンチレバー５が上下に変位すると複数の受光面に入射する光量の割合が変化する。そのため、差分アンプ２１から取り出される差信号はカンチレバー５のＺ軸方向の変位量に応じたものとなる。ただし、この差信号にはカンチレバー５に生起される様々な周波数成分が含まれるため、バンドパスフィルタ（ＢＰＦ）２２で共振周波数付近の特定の周波数範囲の信号のみを抽出し、位相ロックループ（ＰＬＬ）回路２３及びカンチレバー光熱励振部３０に供給する。
　カンチレバー光熱励振部３０、励振用レーザ光源３７、レーザダイオード（ＬＤ）駆動部３６、及び加算器３５は、カンチレバー５をその共振周波数付近で自励発振させる機能を有する。カンチレバー光熱励振部３０は、実効値-直流（ＲＭＳ-ＤＣ）変換器３１と自動利得制御回路（ＡＧＣ）３２と位相シフト回路３３と乗算器３４とを含む。バンドパスフィルタ２２からカンチレバー５の共振周波数成分を含む信号が供給されると、実効値-直流変換器３１はその交流信号の実効値を検出して該実効値を直流信号として出力し、自動利得制御回路３２はその直流信号が一定に維持されるように利得を自動的に調整しつつ、該信号を増幅する。一方、位相シフト回路３３は、バンドパスフィルタ２２から供給されたカンチレバー５の共振周波数成分を含む信号の位相を、カンチレバー５がその共振周波数で安定的に励振するように調整する。
　乗算器３４は位相が調整された交流信号に利得が調整された直流信号を乗じることで該交流信号の振幅を調整する。加算器３５はＬＤ駆動部３６から供給される駆動信号に乗算器３４からの信号を加算し、励振用レーザ光源３７に供給する。励振用レーザ光源３７から射出されたレーザ光はカンチレバー５の背面の所定部位に照射される。このレーザ光照射によってカンチレバー５の背面には熱が生起され、背面側と前面側との差熱によってカンチレバー５は撓みを生じる。乗算器３４から加算器３５に供給される信号により励振用レーザ光源３７に供給されるパワーは変調され、それによってカンチレバー５の振動が誘起される。このとき、カンチレバー光熱励振部３０を通したフィードバック制御によって、カンチレバー５の振動振幅は略一定に維持される。
　バンドパスフィルタ２２からカンチレバー５の共振周波数成分を含む信号が供給されると、位相ロックループ回路２３は、探針６と試料３との間に働く力に起因して変化するカンチレバー５の共振周波数のシフト量を検出しデータ処理部２４へ供給する。データ処理部２４は、検出された周波数シフト量に基づきその周波数変化を一定に維持するための信号、つまりは探針６と試料３との間の距離を一定に保つための信号を生成し、主制御部２５を通して垂直位置制御部２６へ送る。垂直位置制御部２６は、受け取った信号に応じてスキャナ１に含まれるＺスキャナを駆動することで試料ホルダ２をＺ軸方向に駆動し、探針６と試料３との間の距離を略一定に維持する。
　主制御部２５は表面凹凸像作成部２５１を含み、表面凹凸像作成部２５１はデータ処理部２４から供給されたカンチレバー５の周波数変化を一定に維持するための信号に基づいて、試料３の表面凹凸像（表面トポグラフィ像）を作成し、これを表示部２９の画面上に表示する。
　また、自動利得制御回路３２において利得を変化させるための電圧制御信号はデータ処理部２４に供給される。この電圧制御信号は所定の共振周波数で振動しているカンチレバー５の振動振幅の変化量に応じた信号であり、探針６と試料３との間に作用するエネルギの散逸量に対応している。例えば特開２００６－２９２７２０号公報などに開示されているように、この電圧制御信号（以下「エネルギ散逸信号」という）に基づいて試料３表面のエネルギ散逸像を作成することが可能であるが、本実施例の装置ではさらに特徴的な構成として、データ処理部２４はエネルギ散逸信号を表面電荷密度に変換する電荷密度変換処理部２４１を備えており、主制御部２５はエネルギ散逸像作成部２５２、及び表面電荷密度分布像作成部２５３を備えている。
　なお、主制御部２５には測定のために必要な条件やパラメータなどをオペレータが入力又は設定するための操作部２８や、測定結果などを表示するための表示部２９も接続されている。主制御部２５やデータ処理部２４などの機能の少なくとも一部は、例えばパーソナルコンピュータをハードウエア資源とし、該コンピュータにインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアを実行することで実現する構成とすることができる。
　上述したように、本実施例の表面電荷密度測定装置に用いられるＦＭ－ＡＦＭには、カンチレバー５を励振させるために光熱励振法が用いられている。これは、光熱励振法がいわゆるスプリアスフリーな励振法であって、液中においても、保存力と散逸力とのカップリングを排することができるからである（詳しくは、西田ほか４名、「レーザードップラー干渉計と光熱励振法を用いた液中原子間力顕微鏡」、生産研究、58巻2号、2006年などの文献参照）。
　本実施例の表面電荷密度測定装置では、周波数シフトを一定に維持しつつ探針６が試料３表面を二次元的に走査する周波数シフト一定制御モードでＦＭ－ＡＦＭを動作させる。そして、そのときに表面凹凸像と同時に取得したエネルギ散逸像に基づいて、試料３の表面電荷密度分布像を得る。以下、本実施例の表面電荷密度測定装置における表面電荷密度の測定方法及びその測定実行時の装置の具体的な動作について説明する。
　まず、上述したような構成の装置において、自動利得制御回路３２から得られるエネルギ散逸信号に基づいて表面電荷密度を求めることが可能であることを、実測例を挙げて説明する。
　図２は、ポリリジン（Poly-L-Lysine）でコートした白雲母（Muscovite mica）基板上にラムダ（lambda）ＤＮＡ分子を固定して作製した試料を、本実施例の表面電荷密度測定装置で実測して得られた表面凹凸像（ａ）、エネルギ散逸像（ｂ）、及び周波数シフト像（ｃ）である。（ａ）及び（ｂ）は、周波数シフト一定制御モードにおいて試料３上のＸ－Ｙ面内を二次元的に走査したときに、表面凹凸像作成部２５１及びエネルギ散逸像作成部２５２により作成される画像である。一方、（ｃ）は周波数シフトを一定とするためのフィードバック信号を画像化したものである。
　なお、分析用液体８の電解質濃度を高くすると空間分解能は向上するものの、ファンデルワールス（van der Waals）力のために定量性が失われる。一方、電解質濃度が低いと空間分解能が下がる。これら両者を考慮すると、１：１対称電解質溶液で１００[mM]程度の電解質濃度が適当である。そこで、１００[mM]の塩化カリウム（ＫＣｌ）水溶液を分析用液体８として用いた。また、後述の計算を単純化するためには、カンチレバー５の振動振幅値を分析用液体８のデバイ長よりも充分に小さくする必要がある。１００[mM]の塩化カリウム水溶液のデバイ長は１[nm]程度であるため、ここでは、カンチレバー５の振動振幅が０．５[nm p-p]以下となるように調整した。
　図２（ａ）から、表面凹凸像においては単一のＤＮＡ分子が明瞭に可視化されていることが分かる。また図２（ｂ）に示したエネルギ散逸像から、ＤＮＡ分子上ではポリリジン膜上に比べてエネルギ散逸量が減少していることが分かる。このエネルギ散逸像のコントラストは図２（ｃ）に示した周波数シフト像のコントラストとは明らかに相違する。このことから、エネルギ散逸信号は周波数シフト一定制御のためのフィードバック信号とカップリンプしていない、つまり散逸力と保存力とが充分に分離されているということが理解できる。
　図３は、図２（ａ）、（ｂ）中にＡ－Ｂ線で示した位置において抽出した高さ値及びエネルギ散逸の１次元的なプロファイルを示す図である。エネルギ散逸の単位がＶ（ボルト）であるのは、エネルギ散逸と線形な関係にある励振電圧をエネルギ散逸とみなして使用しているためである。この図３から、ＤＮＡ分子の高さはＤＮＡの直径である約２．０[nm]となっていることが分かる。また図３から、ＤＮＡ分子上のエネルギ散逸量はその周囲、つまりポリリジン膜上に比べて明らかに減少していることが分かる。
　図４（ａ）は試料３表面においてＸ軸に平行な直線上の周波数シフトのＺ－Ｘ面内分布画像、図４（ｂ）はその分布画像から抽出した周波数シフトの探針-試料間距離依存性を示す図である。即ち、これはＸ－Ｙ面に直交する面（高さ方向に拡がる面）内における周波数シフトの分布を示している。図４（ａ）中のＣ－Ｃ’線の位置はＤＮＡ分子上、Ｄ－Ｄ’線の位置はポリリジン膜上である。
　図４（ａ）から、ＤＮＡ分子上では周波数シフトが負となる静電的斥力相互作用（浸透圧力）が生じており、逆に、ポリリジン膜上では周波数シフトが正となる静電的引力相互作用（Maxwell応力）が生じていることが分かる。これは、シリコン等からなる探針６の表面が、ｐＨ７である分析用液体８中では常に負極性に帯電しているのに対し、ＤＮＡ分子は負極性に、ポリリジン膜は正極性に帯電しているためである。この現象は、図４（ｂ）において、探針６が試料３の表面に近接するに伴い（つまり下方向にいくに従い）、ＤＮＡ分子上では周波数シフトが増大しているのに対し、ポリリジン膜上では周波数シフト量が減少していることからも明らかである。
　図５（ａ）は図４（ａ）と同じ試料３上の位置におけるエネルギ散逸のＺ－Ｘ面内分布画像、図５（ｂ）はその分布画像から抽出したエネルギ散逸の探針-試料間距離依存性を示す図である。エネルギ散逸は時間的な揺らぎを有しているため、図５（ａ）に示した分布画像上では分かりにくいが、図５（ｂ）に示したエネルギ散逸の探針-試料間距離依存性を見ると、ＤＮＡ分子上とポリリジン膜上とで、探針-試料間距離を短くしたときのエネルギ散逸の増加傾向に殆ど差異はないことがよく分かる。
　このように、図４で示される周波数シフトと図５で示されるエネルギ散逸とでは、ＤＮＡ分子上及びポリリジン膜上における探針-試料間距離依存性が明らかに異なることが分かる。
　上述した実測結果から、周波数シフト一定制御モードで探針６を走査したときの探針６の挙動は図６に示すようになると推測し得る。なお、図６及び後述の図９において、正及び負の電荷は、探針６及び試料３の表面固定電荷を中和遮蔽するかたちで存在するカウンタイオンを表す。
　即ち、周波数シフト一定制御モードでは、あくまでも探針６の周波数シフトが一定になるように探針-試料間距離が制御されるため、絶対的な探針-試料間距離が一定になるように制御されるわけではない。上述したように、分析用液体８中では探針６の表面は負に帯電しているのに対し、基板３ａ上のポリリジン膜３ｂは正に、その上のＤＮＡ分子３ｃは負に帯電している。そのため、探針６と試料３との間に働く静電相互作用の極性はＤＮＡ分子３ａ上とポリリジン膜３ｂ上とで異なり、探針６がポリリジン膜３ｂ上にあるときには引力が作用し、探針６がＤＮＡ分子３ａ上にあるときには斥力が作用する。その結果、図６に概略的に示すように、探針６がＤＮＡ分子３ａ上を通過するときには探針-試料間距離は相対的に大きく、ポリリジン膜３ｂ上を通過するときには探針-試料間距離は相対的に小さくなる。
　一方、分析用液体８中で形成される電気二重層による静電相互作用力は保存力であり、上述したように光熱励振法では、保存力と散逸力とは殆どカップリングしないため、エネルギ散逸には上記のような試料３表面の電位状態に起因する静電相互作用力は反映されない。つまり、ＤＮＡ分子３ａ上とポリリジン膜３ｂ上とで、同一の探針-試料間距離におけるエネルギ散逸には殆ど差がないものとみなせる。換言すれば、上述したように、ＤＮＡ分子３ａ上とポリリジン膜３ｂ上とにおける探針-試料間距離の差はエネルギ散逸に如実に反映されることになる。周波数シフト一定制御モードにおいて、探針-試料間距離の差は静電相互作用力の強弱、つまりは表面電荷分布状態を反映しているから、図２（ｂ）に示したようなエネルギ散逸像のコントラストは表面電荷分布状態を反映したものとなる筈である。以上のことから、エネルギ散逸と表面電荷密度との間には所定の関係があり、エネルギ散逸信号を表面電荷密度に変換可能であることが理解できる。
　ただし、周波数シフトと電荷密度との関係は理論的に導出可能であるものの、エネルギ散逸と周波数シフトとの関係は測定毎に異なるため、エネルギ散逸と電荷密度との関係もまた理論的に予測することは難しく、実験的に求める必要がある。そこで、本実施例の表面電荷密度測定装置では、以下のようなアルゴリズムでエネルギ散逸信号から表面電荷密度を求めるようにしている。
　探針６と試料３との間には、静電相互作用による斥力や引力のほかにパウリ斥力が作用する。パウリ斥力は探針-試料間距離が小さくなるほど支配的になり、その探針-試料間依存性は指数関数により近似可能である。また、パウリ斥力は試料３の粘弾性依存性を殆ど示さない。周波数シフト、エネルギ散逸ともにパウリ斥力は反映されるから、パウリ斥力が支配的であるような探針-試料間距離の範囲では周波数シフト及びエネルギ散逸の探針-試料間距離依存性がいずれも指数関数で近似可能であることを利用して、周波数シフトとエネルギ散逸との関係を推測することができる。電荷密度と周波数シフトとの関係は理論的に導出可能であるから、これにより、エネルギ散逸と電荷密度との関係を求めることができる。
　具体的にはまず、換算のための基準として、測定対象である試料３のポリリジン膜上において、エネルギ散逸Ｖexc及び周波数シフトΔｆの探針-試料間距離依存性曲線をそれぞれ取得する。これら曲線を構成するデータは、主制御部２５による制御の下で水平位置制御部２７がスキャナ１のＸスキャナ及びＹスキャナをそれぞれ駆動することで測定位置を定め、垂直位置制御部２６がＺスキャナを駆動し探針-試料間距離を徐々に変化させることで取得することができる。得られたデータはデータ処理部２４において表面電荷密度換算処理部２４１に一旦保存される。
　図７（ａ）はエネルギ散逸Ｖexcの探針-試料間距離依存性曲線、図７（ｂ）は周波数シフトΔｆの探針-試料間距離依存性曲線の一例である。図７に示すように、探針６と試料３とが非常に近接すると（図中のパウリ斥力領域では）パウリ斥力が支配的になり、エネルギ散逸及び周波数シフトは共に急増する。探針６と試料３との距離が或る程度以上に大きくなると（図中の電気二重層領域では）、静電的な引力又は斥力が支配的になるが、上述したように、エネルギ散逸には静電相互力は殆ど反映されないため、探針-試料間距離が変化してもエネルギ散逸は殆ど変化しない。一方、周波数シフトには静電的な引力又は斥力の影響が現れる。
　上述したような探針-試料間距離依存性曲線において、周波数シフトびエネルギ散逸についてパウリ斥力を指数関数で近似した理論式、つまりフィッティング式は、次の(1)式及び(2)式で表される。
　　ΔｆPauli＝ΔｆPauli_0ｅｘｐ(－κPauliｚ)　　　…(1)
　　Ｖexc＝Ｖexc_∞＋Ｖexc_0ｅｘｐ(－κPauliｚ)　　　…(2)
ここで、κPauliはPauli斥力の遮断長さの逆数、ｚは探針-試料間距離である。表面電荷換算密度換算処理部２４１では、これら(1)式、(2)式をそれぞれ実測で得られた探針-試料間距離依存性曲線（例えば図７（ｂ）及び（ａ））にフィッティングさせることで、(1)式、(2)式中のフィッティングパラメータΔｆPauli_0及びＶexc_0を求める。
　エネルギ散逸から周波数シフトへの換算係数βは次の(3)式で定める。
　　β＝ΔｆPauli_0／Ｖexc_0　　　…(3)
表面電荷換算密度換算処理部２４１では、上述したように求めたフィッティングパラメータΔｆPauli_0及びＶexc_0を(3)式に代入することで換算係数βを求める。
　なお、探針-試料間距離依存性曲線の取得のための測定部位は試料３上のいずれでも構わないが、好ましくは、静電的な引力が発生する部位、この場合には、ポリリジン膜上とするとよい。何故なら、そのほうが探針-試料間距離が相違するデータの点数が多くなるため、正確なフィッティングパラメータの算出が容易だからである。
　一方、探針-試料間距離がパウリ斥力領域よりも大きい場合には電気二重層力領域となる。探針と試料の表面電荷は表面官能基とイオンの平衡反応によって決定され、固定電荷及び固定電位の間のどこかに境界条件をもつ。電気二重層力は表面電荷だけでなく境界条件によっても大きく影響を受けるが、ｐＨ７の条件下では線形重ね合わせ近似（ＬＳＡ＝Linear Superposition Approximation）が良い近似を与える。探針６を球、試料３の表面を無限平面であると仮定して、表面要素積分法（ＳＥＩ＝Suface Element Integration）を用いたＬＳＡの解析解は次の(4)式、(5)式で表される。
　　ΔｆEDL(ｚ)＝(ΔｆEDL0／κDＲapex)[(κDＲapex－１)ｅ-κDｚ＋(１＋κDＲapex)ｅ-κD(ｚ+2Rapex)]　　　…(4)
　　ΔｆEDL0≒ασs≒αε0εrκDψs_0　　　…(5)
ここでκDはデバイ長の逆数であり、分析用液体８として使用する電解質の濃度から算出した理論値を用いればよい。Ｒapexは探針６の曲率半径であり、例えば探針のデータシートの公称値（この例では７[nm]）を用いればよい。また、ε0は真空中の誘電率、εrは分析用液体８の比誘電率、ψs_0は後述する表面電位、σsは後述するポリリジン膜の表面電荷密度を基準とした試料の表面電荷密度である。αは後述する電荷密度から周波数シフトへの換算係数である。表面電荷換算密度換算処理部２４１では、上記(4)式、(5)式を用いてσs＝σPLと置いた上で、実測で得られた周波数シフトの探針-試料間距離依存性曲線（例えば図７（ｂ））にフィッティングすることで、ポリリジン膜上の電荷密度σPLを求める。
　上述の電荷密度から周波数シフトへの換算係数αは、理論的に次の(6)式で定まる。
　　α＝(４πＲapexσtｆ0)／(２ｋzε0εr)　　　…(6)
　ここで、σtは探針の表面電荷密度、ｆ0はカンチレバー５の共振周波数、ｋzはカンチレバー５のばね定数、であるから、これらパラメータから換算係数αは算出可能である。
　エネルギ散逸信号から表面電荷密度への換算には、次の(7)式を用いることができる。
　　σs≒σPL＋(β／α)(Ｖexc_PL－Ｖexc)　　　…(7)
　表面電荷換算密度換算処理部２４１は、上述したようにして求めた換算係数β、α及びポリリジン膜上の電荷密度σPLを上記(7)式に代入し、さらに、実測により得られたエネルギ散逸の探針-試料間距離依存性曲線から導出されるポリリジン膜上でのエネルギ散逸Ｖexc_PL（≒Ｖexc_∞）を適用することで、エネルギ散逸Ｖexcから表面電荷密度σsへの換算が可能な換算式を求める。こうして得られた換算式は電荷密度変換処理部２４１の内部に保存される。
　以上のようにして、本実施例の表面電荷密度測定装置において　表面電荷換算密度換算処理部２４１では、測定対象である試料３上の或る一点において取得された周波数シフト及びエネルギ散逸の探針-試料間距離依存性曲線に基づいて、エネルギ散逸信号を表面電荷密度に換算する換算式が算出され内部に保存される。
　また、次の(8)式を用いることで、表面電荷密度σsを表面電位ψs_0に換算することができるから、この式も表面電荷換算密度換算処理部２４１の内部に保存される。
　　ψs_0≒σs／ε0εrκD　　…(8)
　必要な換算式が表面電荷換算密度換算処理部２４１に用意されると、主制御部２５の制御の下に、周波数シフト一定制御モードにより試料３上の二次元的な走査が実行され、自動利得制御回路３２からデータ処理部２４へエネルギ散逸信号が供給される。データ処理部２４において表面電荷換算密度換算処理部２４１は、内部に保存されている換算式を用いて、エネルギ散逸信号を表面電荷密度及び表面電位に順次変換し、主制御部２５へと送る。主制御部２５において表面電荷密度分布像作成部２５３は、試料３上の各点における表面電荷密度及び表面電位に基づいて、表面電荷密度分布像や表面電位像を作成し、表面凹凸像作成部２５１により作成される表面凹凸像、エネルギ散逸増作成部２５２により作成される散逸像などとともに、表示部２９の画面上に表示する。予め換算式が決定されてさえいれば、エネルギ散逸信号から表面電荷密度への換算の処理は簡単である。
　本実施例の表面電荷密度測定装置において、図２（ｂ）に示したエネルギ散逸像からの換算によって得られる表面電荷密度分布像を図８に示す。図８から、ＤＮＡ分子上及びポリリジン膜上の表面電荷密度分布が充分に可視化できていることが分かる。また、ＤＮＡ分子上の表面電荷密度の理論値は約－０．２[C/m-2]であり、実測で得られた値はこの理論値とよく一致している。このことから、エネルギ散逸から求めた表面電荷密度は絶対値として正確であることが分かる。このようにして、本実施例の表面電荷密度測定装置は、定量性を有する表面電荷密度分布像をユーザに提供することができる。
　　［第２実施例］
　次に、本発明の他の実施例（第２実施例）であるＦＭ－ＡＦＭを用いた表面電荷密度測定装置について説明する。
　第１実施例の表面電荷密度測定装置では、周波数シフト一定制御モードでＦＭ－ＡＦＭを動作させていたが、ＦＭ－ＡＦＭでは、エネルギ散逸が一定になるように探針-試料間距離を制御しながら周波数シフト像とエネルギ散逸像とを同時に得ることもできる。この第２実施例の表面電荷密度分布装置では、エネルギ散逸一定制御モードでＦＭ－ＡＦＭを動作させたときに得られる周波数シフトを表面電荷密度に換算することで表面電荷密度分布像を求める。したがって、表面電荷密度換算処理部２４１における処理が相違すること以外、基本的な装置構成は第１実施例と同じであるので、装置構成の詳しい説明は省略する。
　以下、エネルギ散逸一定制御モードにおいて得られる周波数シフトを表面電荷密度に換算する手法と手順について説明する。
　図９はエネルギ散逸一定制御モードで探針６を走査したときの探針６の挙動を示す概念図、図１０（ａ）はエネルギ散逸Ｖexcの探針-試料間距離依存性曲線、図１０（ｂ）は周波数シフトΔｆの探針-試料間距離依存性曲線の一例である。
　上述したように、静電相互作用力は保存力であるため、エネルギ散逸には殆ど反映されない（図１０（ａ）参照）。そのため、エネルギ散逸が一定になるように探針-試料間距離が制御されると、図９に示すように、表面電荷密度や表面電位の影響を受けることなく、絶対的な探針-試料間距離がほぼ一定に維持されるように探針６は試料３上を走査することになる。一方、絶対的な探針-試料間距離がほぼ一定であるために、周波数シフトには静電相互作用力が顕著に現れる。そのため、図１０（ｂ）に示すように、探針６がＤＮＡ分子上にあるときとポリリジン膜上にあるときとで、探針-試料間距離依存性に大きな差異が生じる。パウリ斥力領域の中でも特に探針-試料間距離が小さい領域では、パウリ斥力による周波数シフトは指数関数で近似できる。したがって、このパウリ斥力の探針-試料間距離依存性との差分は静電相互作用力、つまりは表面電荷密度による引力又は斥力によるものとみなすことができる。
　そこで、この場合、電荷密度から周波数シフトへの換算係数αとして上記(6)式を用いる。また上記第１実施例と同様に実測により得られた、ポリリジン膜上での周波数シフトの探針-試料間距離依存性曲線を用いてポリリジン膜上の電荷密度σPLを求める。また、同じ周波数シフトの探針-試料間距離依存性曲線からΔｆPLも求める。そして、次の(9)式により、周波数シフト信号から表面電荷密度への換算式を決定する。
　　σs≒σPL＋(１／α)(Δｆ－ΔｆPL)　　　…(9)
　即ち、この第２実施例の表面電荷密度測定装置では、第１実施例の装置に比べて表面電荷密度を算出する際の換算処理はかなり簡素である。一方、周波数シフト一定制御モードはＦＭ－ＡＦＭにおいて最も標準的な測定モードであって特段の知識や経験がオペレータに要求されないのに対し、エネルギ散逸一定制御は使用されることが少ない測定モードであるため、ＦＭ－ＡＦＭによる測定作業に関する或る程度の詳しい知識や経験がオペレータに要求される。
　また、本願発明者の検討によれば、周波数シフト一定制御モードにおいて得られる表面凹凸像とエネルギ散逸一定制御モードにおいて得られる表面凹凸像とで同じＳＮ比を得るには、エネルギ散逸一定制御モードではその周波数帯域を周波数シフト一定制御モードの1/9倍にしなければならない。これは、周波数シフト一定制御モードでは走査時の速度をエネルギ散逸一定制御モードの９倍にすることができることを意味しており、測定時間という点では周波数シフト一定制御モードのほうが有利である。
　なお、上記実施例はいずれも本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜、変形、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは明らかである。
１…スキャナ
２…試料ホルダ
３…試料
４…台座部
５…カンチレバー
６…探針
７…カンチレバーホルダ
８…分析用液体
１０…光学的変位検出部
１１…レーザ光源
１２…ハーフミラー
１３…ミラー
１４…光検出器
２０…プリアンプ
２１…差分アンプ
２２…バンドパスフィルタ
２３…位相ロックループ回路
２４…データ処理部
２４１…電荷密度変換処理部
２５…主制御部
２５１…表面凹凸像作成部
２５２…エネルギ散逸像作成部
２５３…表面電荷密度分布像作成部
２６…垂直位置制御部
２７…水平位置制御部
２８…操作部
２９…表示部
３０…カンチレバー光熱励振部
３１…実効値-直流変換器
３２…自動利得制御回路
３３…位相シフト回路
３４…乗算器
３５…加算器
３６…ＬＤ駆動部
３７…励振用レーザ光源

Claims (4)

  1. 　カンチレバーの先端に設けられた探針を液体中に浸漬された試料の表面に近接させた状態で、該カンチレバーをその共振周波数付近で振動させ、その振動振幅を一定に維持するようにフィードバック制御を行いつつ、前記探針と前記試料との間に働く相互作用を検出するダイナミックモード原子間力顕微鏡を用い、前記試料の表面電荷分布を測定する表面電荷密度測定装置において、
    　a)前記カンチレバーの振動振幅又はそのフィードバック制御経路中の信号に基づいて、前記探針と前記試料との間に作用するエネルギ散逸力を反映した散逸信号を取得する散逸信号取得部と、
    　b)前記カンチレバーの共振周波数のずれである周波数シフトを反映した周波数シフト信号を取得する周波数シフト信号取得部と、
    　c)前記試料上の少なくとも一箇所で、前記散逸信号及び前記周波数シフト信号の探針-試料間距離依存性をそれぞれ示すデータを実測する基準データ測定部と、
    　d)前記試料に対し前記基準データ測定部により得られたデータに基づき、散逸信号を周波数シフト信号へ換算するための換算情報を求めるとともに、周波数シフトと表面電荷密度との理論的な関係及び前記換算情報から、散逸信号を表面電荷密度に換算するための換算式を決定する換算式決定部と、
    　e)前記周波数シフトを一定に維持するように前記探針と前記試料との間の距離を調整しつつ、該探針を該試料上で二次元的に走査させる走査制御部と、
    　f)前記走査制御部による制御の下で二次元的な走査が行われたときに前記散逸信号取得部により得られた散逸信号を、前記換算式決定部により決定された換算式に従って表面電荷密度に換算する換算処理部と、
    　を備えることを特徴とする、原子間力顕微鏡を用いた表面電荷密度測定装置。
  2. 　請求項１に記載の表面電荷密度測定装置であって、
    　前記換算式決定部は、パウリ斥力が支配的であるような探針-試料間距離の範囲において、前記基準データ測定部により得られたデータによる曲線を指数関数でフィッティングすることにより、散逸信号を周波数シフト信号へ換算するための換算情報を求めることを特徴とする、原子間力顕微鏡を用いた表面電荷密度測定装置。
  3. 　カンチレバーの先端に設けられた探針を液体中に浸漬された試料の表面に近接させた状態で、該カンチレバーをその共振周波数付近で振動させ、その振動振幅を一定に維持するようにフィードバック制御を行いつつ、前記探針と前記試料との間に働く相互作用を検出するダイナミックモード原子間力顕微鏡を用い、前記試料の表面電荷分布を測定する表面電荷密度測定装置において、
    　a)前記カンチレバーの振動振幅又はそのフィードバック制御経路中の信号に基づいて、前記探針と前記試料との間に作用するエネルギ散逸力を反映した散逸信号を取得する散逸信号取得部と、
    　b)前記カンチレバーの共振周波数のずれである周波数シフトを反映した周波数シフト信号を取得する周波数シフト信号取得部と、
    　c)前記エネルギ散逸を一定に維持するように前記探針と前記試料との間の距離を調整しつつ、該探針を該試料上で二次元的に走査させる走査制御部と、
    　d)前記走査制御部による制御の下で二次元的な走査が行われたときに前記周波数シフト信号取得部により得られた周波数シフト信号を、周波数シフトと表面電荷密度との理論的な関係に基づいて表面電荷密度に換算する換算処理部と、
    　を備えることを特徴とする、原子間力顕微鏡を用いた表面電荷密度測定装置。
  4. 　請求項１～３のいずれかに記載の表面電荷密度測定装置であって、
    　前記カンチレバーを光熱励振法で振動させる励振部、をさらに備えることを特徴とする、原子間力顕微鏡を用いた表面電荷密度測定装置。
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