WO2014123288A1 - 톨 유사 수용체 2를 포함하는 백질 뇌졸중 검출용 바이오마커 및 톨 유사 수용체 2의 의학적 용도 - Google Patents

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김병곤
최준영
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Definitions

  • the present invention relates to a biomarker for detecting white matter stroke comprising toll like receptor 2 and to medical use using toll like receptor 2.
  • Ischemic lesions associated with subcortical white matter account for more than 20% of all ischemic stroke types. Ischemic white lesions have various clinical manifestations, including Leukoaraiosis with few neurological deficits, local white matter infarction causing paraplegia / deafness, and vascular dementia due to repeated ischemic subcortical white matter damage. Unlike lesions, language disorders and severe memory disorders are known to be rare.
  • OL damage after ischemic subcortical white matter damage is considered an important treatment strategy.
  • ischemic stroke the only approved treatment for ischemic stroke is vascular reperfusion drugs, and most of the trials / clinical trials of the ischemic stroke drug are drugs that prevent the death of neurons, demyelination and oligodendrome.
  • OL site
  • An object of the present invention is to identify a biomarker for the development of a treatment for white matter stroke having a protective effect against demyelination and oligodendrosite (OL) damage to provide a medical use using the same.
  • OL demyelination and oligodendrosite
  • the present invention provides a biomarker composition for detecting white matter stroke comprising Toll-like receptor 2 (TLR2).
  • TLR2 Toll-like receptor 2
  • the present invention also provides a white matter stroke diagnostic kit comprising a molecule that specifically binds toll-like receptor 2 (TLR2).
  • TLR2 toll-like receptor 2
  • the molecule may be a monoclonal antibody, polyclonal antibody, substrate, ligand or cofactor.
  • the invention also includes detecting the expression profile of Toll-like receptor 2 (TLR2) in a biological sample obtained from an individual in need of preventing or treating white matter stroke; And comparing the expression profile with an expression profile of TLR2 in the normal control group.
  • TLR2 Toll-like receptor 2
  • the present invention also provides a method of treating a biological sample obtained from an individual in need of preventing or treating white matter stroke; And it provides a method for screening white matter stroke therapeutics comprising the step of identifying the expression level of Toll-like receptor 2 (TLR2).
  • TLR2 Toll-like receptor 2
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating white matter stroke, which comprises a Toll-like receptor 2 (TLR2) agonist as an active ingredient.
  • TLR2 Toll-like receptor 2
  • the Toll-like receptor 2 (TLR2) agonist has an effect of preventing ischemic demyelination and oligodendrocyte death (OL death), Pam3CSK4, Zymosan, peptidogly Can be selected from the group consisting of Peptidoglycan, atypical lipopolysaccharide and Lipoteichoic acid.
  • TLR2 plays a protective role against ischemic demyelination and OL
  • TLR2 can be used as a biomarker of white matter stroke, and TLR2 can be targeted to treat or prevent ischemic white matter stroke.
  • FIG. 2 and FIG. 4 examine the effects of TLR2 on oxygen-glucose deficiency (OGD) induced OL yarn through LDH secretion and TUNEL staining analysis, respectively.
  • OGD oxygen-glucose deficiency
  • FIG. 3 and FIG. 5 examine the effects of TLR2 agonist treatment on OGD inducible OL company through LDH secretion and TUNEL staining analysis.
  • TLR2 was increased in ischemic demyelinated lesions as an upstream regulator of innate immunity after ischemic cerebrospinal cord, and the degree of demyelination etiology was increased in TLR2 knockout mice than in wild type mice, and TLR2 (-/-) mice were The activated caspase 3 (+) OL was expressed more than wild type mice.
  • TLR2 (-/-) mice reduced phosphorylation of ERK 1/2, one of the downstream signal proteins of TLR2, compared to wild type mice.
  • cultured OL obtained from TLR2 (-/-) mice showed more susceptibility to wild-type OL for oxygen-glucose deficiency (OGD).
  • OGD oxygen-glucose deficiency
  • wild-type OL reduced OGD-induced OL death (OL death).
  • TLR2 plays a protective role against ischemic demyelination and OL, it is possible to develop therapeutics for ischemic white stroke through TLR2 regulation.
  • the present invention provides a biomarker composition for detecting white matter stroke, including Toll-like receptor 2 (TLR2).
  • TLR2 Toll-like receptor 2
  • the detection of the biomarker directly detects the presence of the biomarker protein by two-dimensional electrophoresis from human tissues or body fluids, or by contacting the human tissues or body fluids with the antibody of the present invention to detect the presence of the biomarker protein through antigen antibody reaction. This can be done by indirect confirmation.
  • immunoassays include enzyme immunoassays (ELISA, Coated tubes), magnetic particles using antibody-bound magnetic particles, latex particles using antibody-bound latex, and the like.
  • the present invention also provides a white matter stroke diagnostic kit comprising a molecule that specifically binds toll-like receptor 2 (TLR2).
  • TLR2 toll-like receptor 2
  • the molecule may be a monoclonal antibody, polyclonal antibody, substrate, ligand or cofactor, preferably a polyclonal or monoclonal antibody, more preferably a monoclonal antibody.
  • the polyclonal antibody can be prepared by injecting an immunogen biomarker protein or fragment thereof into an external host according to methods known to those skilled in the art.
  • External hosts include mammals such as mice, rats, sheep, rabbits.
  • Immunogens are injected by intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous injection and are usually administered with an adjuvant to increase antigenicity. Serum is periodically collected from external hosts to collect serum that shows improved titers and specificity for antigen or to separate and purify antibodies therefrom.
  • the monoclonal antibody can be prepared by an immortalized cell line generation technique by fusion known to those skilled in the art. For example, biomarker proteins are immunized in mice or peptides are synthesized and combined with bovine serum albumin to immunize mice. Antigen-producing B lymphocytes isolated from mice are fused with myeloma in humans or mice to produce immortalized hybridomas, and whether monoclonal antibodies are generated using the indirect ELISA method with the hybridoma cells. The monoclonal antibodies can be prepared by taking positive clones and incubating them, then separating and purifying the antibodies or injecting them into the abdominal cavity of rats.
  • the invention also includes detecting the expression profile of Toll-like receptor 2 (TLR2) in a biological sample obtained from an individual in need of preventing or treating white matter stroke; And comparing the expression profile with an expression profile of TLR2 in the normal control group.
  • TLR2 Toll-like receptor 2
  • the present invention also provides a method of treating a biological sample obtained from an individual in need of preventing or treating white matter stroke; And it provides a method for screening white matter stroke therapeutics comprising the step of identifying the expression level of Toll-like receptor 2 (TLR2).
  • TLR2 Toll-like receptor 2
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating white matter stroke, which comprises a Toll-like receptor 2 (TLR2) agonist as an active ingredient.
  • TLR2 Toll-like receptor 2
  • the Toll-like receptor 2 (TLR2) agonist has an effect of preventing ischemic demyelination and oligodendrocyte death (OL death), Pam3CSK4, Zymosan, peptidogly Can be selected from the group consisting of Peptidoglycan, atypical lipopolysaccharide and Lipoteichoic acid.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further comprise a suitable carrier, excipient or diluent commonly used in the preparation of the pharmaceutical composition.
  • Carriers, excipients or diluents usable in the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, Methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical composition can be used in the form of powder, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral formulations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and the solid preparations may include at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose ( Prepare by mixing sucrose or lactose, gelatin, etc.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. .
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the amount of active ingredient in the pharmaceutical composition may vary depending on the age, sex, weight, route of administration, degree of disease, type of disease, etc. of the patient, and may be administered once to several times daily. Thus, such dosages do not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the pharmaceutical composition may be administered to various mammals such as rats, mice, livestock, humans, and the like. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • PBS was injected into the heart of the animal to perfuse first, followed by reperfusion of 4% paraformaldehyde dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4).
  • the brain was removed and post-fixed for 2 hours, then immersed in various concentrations of sucrose solution.
  • Coronal sections (20 ⁇ m) of the brain were cut into 1:10 series using a cryostat (Leica CM3050S; Wetzlar, Germany) and placed on SuperFrost Plus slides (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa).
  • coronal brain sections were stained with eriochrome cyanine. Coronal sections were soaked for 8 minutes in a staining solution consisting of 240 ml of 0.2% erythrochrome cyanine RC (Sigma) and 10 ml of 10% FeCl 3 .6H 2 O (Sigma) dissolved in 3% hydrochloric acid. The sections were then washed with running tap water and then differentiated in 1% aqueous NH 4 OH.
  • coronal brain sections were treated with anti-NG2 (rabbit polyclonal; 1: 200; Millipore), anti-APC-CC1 (mouse monoclonal; 1: 200; Abcam), anti-MBP (rat monoclonal; 1: 200; Abcam), anti-Iba-1 (rabbit polyclonal; 1: 500; Wako), anti-activating Caspase 3 (rabbit polyclonal; 1: 100; Millipore) and incubated overnight at 4 ° C. Brain sections were washed and then incubated for 1 hour at room temperature with appropriate biotinylated or Alexa Fluor 488 or 594 tagged secondary antibodies (Molecular Probes, Eugene, OR).
  • an avidin-biotinylated complex was formed for 30 minutes and then incubated with peroxidase substrate (DAB) until it developed to the desired intensity.
  • DAB peroxidase substrate
  • coverslips were raised on slides with glycerol-based mounting medium (Biomeda, Foster City, Calif.) And observed with an Olympus confocal laser microscope (FV 300, Tokyo, Japan).
  • TLR2 knockout mice significantly increased the size of the ET-1 induced ischemic demyelination lesion compared to the normal control group.
  • OL cultures were prepared from the cortex of day 0 postnatal (P0) -P1 neonatal C57BL / 6 and / or TLR2 ( ⁇ / ⁇ ) mice, as described by O'Meara R et al. In the Journal of Visualized Experiment. After 9-10 days in vitro, confluent mixed glia cultures were obtained. The mixed glia culture was shaken at 200 rpm for 1 hour at 37 ° C. to remove microglia. Thereafter, a second shaking was performed at 250 rpm for 18 hours at 37 ° C to remove OL from the astrosite monolayer. The cell suspension thus obtained was dispensed on bacterial grade Petri dishes for 1 hour to separate the remaining microglia and astrosite from the OL.
  • Purified OL was placed on poly-D-lysine coated 12 wells (1.5 x 10 5 cells / well) or 96 wells (1.5 x 10 4 cells / well) or 9 mm coverslips (1.0 x 10 4 cells / coverslips). Busy. The culture thus obtained contained no neurons or astrosites and had an OL purity of at least 95%.
  • purified OL was incubated in serum-free differentiation medium for 1 day, then washed three times with PBS and transferred to an anaerobic chamber (Forma Scientific, Marietta, OH). The medium was then changed to serum and glucose free OL differentiation medium, wherein the differentiation medium was used saturated with nitrogen gas for 1 hour. After 2 hours of OGD, cells were transferred to normal oxygen chambers and changed to medium containing glucose and Pam3CSK4 (1 ⁇ g / ml, invivogen), U0126 (10 ⁇ M, Calbiochem) and / or LY294002 (10 ⁇ M, Calbiochem).
  • LDH assay kit (Takara Bio, Inc., Madison, Wis.) was used to measure LDH from damaged OL in bathing medium after 24 hours OGD. LDH levels associated with normal cell death were measured (Complete cell death, CD) in sister media exposed to 1.5% Triton X-100 for 24 hours. Baseline LDH levels were measured in media only (Baseline, BL) without OL. The percentage of cell death in each experimental condition was calculated using the following equation.
  • the TLR2 knockout OL was shown to significantly increase LDH secretion according to OGD compared to the normal control group, and thus, the TLR2 knockout OL was more sensitive to OGD than the normal control group.
  • a TLR2 agonist as shown in FIG. 3, OGD-induced OL was greatly reduced.
  • OL differentiation medium poly-D-lysine coated 9 mm Aclar fluorocarbon plastic coverslips in OL differentiation medium.
  • the cells thus obtained were washed three times with PBS and then fixed with 4% paraformaldehyde for 20 minutes.
  • TUNEL staining for previously fixed OL was performed using an in situ cell death detection kit (ApopTag, Millipore).
  • TLR2 knockout OL was shown to increase TUNEL staining significantly according to OGD compared to the normal control group, and thus, TLR2 knockout OL was more susceptible to OGD than the normal control group.
  • TLR2 knockout OL was more susceptible to OGD than the normal control group.
  • OGD-induced OL significantly reduced.
  • ET-1 injected brain tissue obtained 7 days after ET-1 injection was subjected to ice cold Lysis buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 5 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol, 0.1 mM phenylmethyl Homogenous sulfonyl fluoride and protease / phosphatase inhibitor cocktails. Cultured cells were washed twice with PBS and collected using the same Lysis buffer. Tissue or cell eluate was centrifuged at 20,000 g at 4 ° C. for 20 minutes and the supernatant protein concentration was measured by Bradford assay.
  • Lysis buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 5 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol, 0.1 mM phenylmethyl Homogenous sulfonyl fluoride and protea
  • Equal amounts of protein were separated by SDS-PAGE using a 10% gel or 4-20% concentration step gel and transferred to PVDF membrane (Immobilion-P; Millipore).
  • the membrane was blocked by treatment with 5% nonfat milk or bovine serum albumin for 1 hour at room temperature, followed by antibody, anti-phospho ERK1 / 2 (rabbit monoclonal; 1: 1000; Cell signaling), anti-total ERK1 / 2. (rabbit monoclonal; 1: 1000; Cell signaling), anti-phospho Akt (rabbit monoclonal; 1: 1000; Cell signaling), anti-total Akt (rabbit monoclonal; 1: 1000; Cell signaling) and anti- ⁇ actin (1 : 20,000).
  • the membrane was reacted with horseradish peroxidase conjugated secondary antibody for 2 hours at room temperature. Finally, the membrane was visualized using enhanced chemiluminescence (ECL) detection reagent. As a result, the phosphorylation of ERK1 / 2 was significantly decreased in TLR2 (-/-) mice as compared to the normal control group.
  • ECL enhanced chemiluminescence
  • IL-6 5′-TCCATCCAGTTGCCTTCTTGG-3 ′ (forward, SEQ ID NO: 9), 5′-CCACGATTTCCCAGAGAACATG-3 ′ (backward, SEQ ID NO: 10).
  • qRT-PCR was performed using a 7500 Real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) following the protocol of the Applied Biosystem SYBR Green PCR kit. Amplification was performed at 34 cycles for 30 seconds at 94 ° C., 31 seconds at 55-64 ° C., and 60 seconds at 72 ° C., CT values were quantified using Applied Biosystem 7500, and standardization was performed using 18s ribosomal RNA as an internal control. Was used.
  • TLR2 mRNA of TLR2 was significantly increased at the lesion site after ET-1 injection in normal control mice, and inflammatory cytokines TNF-a, IL-1 ⁇ , and IL-6 were expressed in TLR2 (-/- There was no significant difference between the mice and the normal control mice.
  • the present invention can be used as a diagnostic kit for white matter stroke using a molecule that specifically binds toll-like receptor 2 as a biomarker for detecting white matter stroke including toll-like receptor 2, and confirming the expression level of toll-like receptor 2 It can be used as a therapeutic agent that can prevent and treat white matter stroke and as a screening method of the therapeutic agent.

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Abstract

본 발명은 톨 유사 수용체 2(TLR2)를 포함하는 백질 뇌졸중 검출용 바이오마커 조성물 및 TLR2를 이용한 의학적 용도에 관한 것으로, 상기 TLR2가 허혈성 탈수초화 및 올리고덴드로사이트사에 대한 방어 역할을 수행함으로써 백질 뇌졸중의 바이오마커로서 이용할 수 있고, TLR2를 표적으로 하여 허혈성 백질 뇌졸중을 치료하거나 예방할 수 있다.

Description

톨 유사 수용체 2를 포함하는 백질 뇌졸중 검출용 바이오마커 및 톨 유사 수용체 2의 의학적 용도
본 발명은 톨 유사 수용체 2를 포함하는 백질 뇌졸중 검출용 바이오마커 및 톨 유사 수용체 2를 이용한 의학적 용도에 관한 것이다.
피질하 백질과 관련된 허혈성 병변은 모든 허혈성 뇌졸중 유형의 20% 이상을 차지한다. 허혈성 백질 병변은 신경학적 결손이 거의 없는 Leukoaraiosis, 반신 마비/감각 장애를 일으키는 국소적인 백질 경색 및 반복적인 허혈성 피질하 백질 손상으로 인한 혈관성 치매에 이르기까지 다양한 임상 양상을 띄게 되며, 피질에서 발생하는 허혈성 병변과는 달리 언어 장애나 심각한 기억력 장애는 드문 것으로 알려져 있다.
탈수초화 및 올리고덴드로사이트(OL) 손상은 허혈성 백질 손상에 대한 압도적인 특징이기 때문에 허혈성 피질하 백질 손상 후 OL 손상은 중요한 치료 전략으로 고려되고 있다.
현재까지 허혈성 뇌졸중에 대한 공인된 치료제는 혈관의 재관류 약물 밖에 없는 상태이며, 많은 시도/임상 시험이 있어왔던 허혈성 뇌졸중 치료제 대부분은 신경세포(Neuron)의 사멸을 막는 약물들이었으며, 탈수초화 및 올리고덴드로사이트(OL) 손상에 대한 방어 효과를 갖는 백질 뇌졸중 치료제에 대한 연구 개발은 부족한 실정이다.
한편, 한국공개특허 제2012-0075457호에 따르면, 톨 유사 수용체에 대한 항체를 이용하여 염증성 및 자가면역 질환을 치료할 수 있다고 개시하고 있다.
본 발명의 목적은 탈수초화 및 올리고덴드로사이트(OL) 손상에 대한 방어 효과를 갖는 백질 뇌졸중 치료제 개발을 위한 바이오마커를 규명하여 이를 이용한 의학적 용도를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 톨 유사 수용체2(Toll-like receptor 2; TLR2)를 포함하는 백질 뇌졸중 검출용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 톨 유사 수용체2(Toll-like receptor 2; TLR2)에 특이적으로 결합하는 분자를 포함하는 백질 뇌졸중 진단 키트를 제공한다.
상기 분자는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 리간드 또는 보조인자(cofactor)일 수 있다.
또한, 본 발명은 백질 뇌졸중을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 톨 유사 수용체2(Toll-like receptor 2; TLR2)의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 발현 프로파일을 정상대조군에서 TLR2의 발현 프로파일과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 백질 뇌졸중 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 백질 뇌졸중을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; 및 톨 유사 수용체2(Toll-like receptor 2; TLR2)의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 백질 뇌졸중 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 톨 유사 수용체2(Toll-like receptor 2; TLR2) 효능제를 유효성분으로 함유하는 백질 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
상기 톨 유사 수용체2(Toll-like receptor 2; TLR2) 효능제는 허혈성 탈수초화 및 올리고덴드로사이트 사(oligodendrocyte death; OL death)를 방어하는 효과를 가지며, Pam3CSK4, 지모산(Zymosan), 펩티도글리칸(Peptidoglycan), 비정형 리포폴리사카라이드 및 리포테이코산(Lipoteichoic acid)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따르면, TLR2가 허혈성 탈수초화 및 OL사에 대한 방어 역할을 수행하므로, TLR2를 백질 뇌졸중의 바이오마커로서 이용할 수 있고, TLR2를 표적으로 하여 허혈성 백질 뇌졸중을 치료하거나 예방할 수 있다.
도 1은 TLR2 넉아웃 마우스에서의 ET-1 유도성 허혈성 탈수초 병변의 정도를 나타낸 것이고,
도 2 및 도 4는 산소-글루코스 결핍(OGD) 유도성 OL사에 대한 TLR2의 영향을 각각 LDH 분비 및 TUNEL 염색 분석을 통해 검토한 것이고,
도 3 및 도 5는 OGD 유도성 OL사에 대한 TLR2 효능제 처리에 의한 영향을 LDH 분비 및 TUNEL 염색 분석을 통해 검토한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자는 엔도텔린-1(endothelin-1, ET-1)을 내낭의 후각으로 정위적 주입하여 백질 뇌졸중 마우스 모델을 개발하였고, 이러한 마우스 모델에서는 주입 부위에 국소적인 탈수초화 병변이 발생하고, 활성화된 대식세포가 꽉 들어차는 것을 확인하였으며, 이러한 대식세포 침윤은 전염증성 사이토카인의 발현을 증가시켰다.
한편, TLR2는 허혈성 뇌줄중 후 선천성 면역의 업스트림 조절자로서 허혈성 탈수초화된 병변에서 증가하였고, 탈수초화 병인의 정도는 야생형 마우스보다 TLR2 넉아웃 마우스에서 보다 증가하였으며, TLR2 (-/-) 마우스는 야생형 마우스에 비해 활성화된 카스파제 3(+) OL을 많이 발현하였다. 또한, TLR2 (-/-) 마우스는 야생형 마우스에 비해 TLR2의 다운스트림 신호 단백질 중 하나인 ERK 1/2의 인산화를 감소시켰다. 그리고, TLR2 (-/-) 마우스로부터 얻어진 배양된 OL은 산소-글루코스 결핍(OGD)에 대해 야생형 OL보다 더 감수성을 나타내었다. 그리고, 야생형 OL에 OGD 후 TLR 효능제인 Pam3CSK4를 처리한 경우 OGD-유도성 OL사(OL death)를 감소시켰다.
따라서, TLR2는 허혈성 탈수초화 및 OL사에 대한 방어 역할을 수행하므로, TLR2 조절을 통해 허혈성 백질 뇌졸중 치료제를 개발할 수 있다.
이에, 본 발명은 톨 유사 수용체2(Toll-like receptor 2; TLR2)를 포함하는 백질 뇌졸중 검출용 바이오마커 조성물을 제공한다.
상기 바이오마커의 검출은 인간의 조직 또는 체액으로부터 이차원 전기영동으로 바이오 마커 단백질의 존재를 직접 검출하거나, 인간의 조직 또는 체액을 본 발명의 항체와 접촉시켜 항원항체반응을 통해 바이오마커 단백질의 존재를 간접적으로 확인함으로써 수행할 수 있다. 항원항체반응으로서, 면역분석법은 효소면역측정법 (ELISA, Coated tube), 항체결합 마그네틱 입자를 이용한 마그네틱 입자법, 항체결합 라텍스를 이용한 라텍스 입자법 등을 포함한다.
또한, 본 발명은 톨 유사 수용체2(Toll-like receptor 2; TLR2)에 특이적으로 결합하는 분자를 포함하는 백질 뇌졸중 진단 키트를 제공한다.
상기 분자는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 리간드 또는 보조인자(cofactor)일 수 있으며, 바람직하게는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 보다 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
상기 폴리클로날 항체는 당업자에 알려진 방법에 따라 면역원인 바이오마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 랫트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여된다. 외부숙주로부터 정기적으로 혈청을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리정제한다.
상기 모노클로날 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 바이오마커 단백질을 마우스에 면역화시키거나 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화시킨다. 마우스에서 분리된 항원-생산 B 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, 상기 하이브리도마 세포를 가지고 간접적인 ELISA 방법을 사용하여 모노클노날 항체의 생성여부를 알아보고 양성 클론을 택하여 배양한 후 항체를 분리정제하거나 랫트의 복강에 주입한 후 복수를 채취함으로써, 모노클로날 항체를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 백질 뇌졸중을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 톨 유사 수용체2(Toll-like receptor 2; TLR2)의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 발현 프로파일을 정상대조군에서 TLR2의 발현 프로파일과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 백질 뇌졸중 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 백질 뇌졸중을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; 및 톨 유사 수용체2(Toll-like receptor 2; TLR2)의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 백질 뇌졸중 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 톨 유사 수용체2(Toll-like receptor 2; TLR2) 효능제를 유효성분으로 함유하는 백질 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
상기 톨 유사 수용체2(Toll-like receptor 2; TLR2) 효능제는 허혈성 탈수초화 및 올리고덴드로사이트 사(oligodendrocyte death; OL death)를 방어하는 효과를 가지며, Pam3CSK4, 지모산(Zymosan), 펩티도글리칸(Peptidoglycan), 비정형 리포폴리사카라이드 및 리포테이코산(Lipoteichoic acid)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.
상기 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.
또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학조성물 중 유효성분의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중, 투여경로, 질병의 정도, 질병의 종류 등에 따라 달라질 수 있으며, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 따라서, 이러한 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 뇌 조직 준비 및 면역조직적 분석
1) 동물 및 수술절차
성체 암컷 C57BL/6 마우스와 C57BL/6 백그라운드를 갖는 TLR2 넉아웃 마우스를 각각 25-28g 체중을 지닌 것으로 사용하였다. 동물 핸드링과 수술절차는 아주대학 동물실험 관련 위원회에 의해 정해진 규칙에 따라 수행되었다. 클로랄 하이드레이트(400 mg/kg, 복강투여)로 마취시킨 후, 동물을 정위적 구조물(stereotactic frame) 상에 놓고, 드릴을 이용하여 두개골 절제술을 수행한 후 32-게이지 바늘릴을 이용하여 오른쪽 내낭(후방, 전정으로 1.0 mm; 측방에서 중앙으로 2.8mm; 등쪽에서 전정으로 4.3mm; 각도 20°에 엔도델린-1(endothelin-1; ET-1)을 주입하였다. 이때, 각도 20°는 1차 운동피질, 해마 및 뇌실 손상을 방지하기 위함이었다. ET-1 주입 후, 역류를 방지하기 위해 바늘을 10분 동안 놓아둔 후, 천천히 뇌에서 제거하였다.
2) 조직 가공 및 면역조직학적 분석
PBS를 동물의 심장 내로 주입하여 먼저 관류시킨 후, 0.1M 인산완충액(pH 7.4)에 용해된 4% 파라포름알데히드로 다시 관류시켰다. 뇌를 제거하고 2시간 동안 후고정한 후, 다양한 농도의 수크로즈 용액에 담구었다. 뇌의 관상면 절편(20 ㎛)을 크라이오스탯(Leica CM3050S; Wetzlar, Germany)을 이용하여 1:10 시리즈로 자르고, SuperFrost Plus 슬라이드(Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa) 상에 놓았다.
탈수초화된 백질 영역을 정량하기 위하여, 관상면 뇌 절편을 에리오크롬 시아닌(eriochrome cyanine)으로 염색하였다. 3% 염산에 용해된 0.2% 에리오크롬 시아닌 RC(Sigma) 240 ml와 10% FeCl3·6H2O(Sigma) 10 ml로 이루어진 염색 용액 중에 관상면 절편을 8분 동안 담구었다. 그후, 상기 절편을 흐르는 수도물로 세정한 후, 1% 수용성 NH4OH에서 분화시켰다.
면역조직적 분석을 위해, 관상면 뇌 절편을 항-NG2 (rabbit polyclonal; 1:200; Millipore), 항-APC-CC1 (mouse monoclonal; 1:200; Abcam), 항-MBP (rat monoclonal; 1:200; Abcam), 항-Iba-1 (rabbit polyclonal; 1:500; Wako), 항-활성화 Caspase 3 (rabbit polyclonal; 1:100; Millipore)로 처리하고 4 ℃에서 밤새도록 배양시켰다. 뇌 절편을 세정한 후 적절한 바이오티닐레이티드 되거나 Alexa Fluor 488 또는 594 태깅된 2차 항체(Molecular Probes, Eugene, OR)로 1시간 동안 실온에서 배양시켰다. 항원-항체 반응의 발색 분석을 위해, 30분 동안 아비딘-바이오티닐레이티드 복합체를 형성시킨 후, 원하는 강도로 발전할 때까지 퍼옥시다아제 기질(DAB)과 배양시켰다. 형광 염색을 위해, 커버슬립을 글리세롤계 마운팅 배지(Biomeda, Foster City, CA)를 갖는 슬라이드 상에 올리고, 올림푸스 공초점 레이저 현미경(FV 300, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이 TLR2 넉아웃 마우스에서는 정상대조군에 비해 ET-1 유도성 허혈성 탈수초 병변의 크기를 크게 증가시켰다.
<실시예 2> 초대 올리고덴드로사이트(OL) 배양물 준비 및 산소-글루코스 결핍(OGD)에 대한 효과 검토
1) 초대 올리고덴드로사이트(OL) 배양물 준비
초대 OL 배양물은 O'Meara R 등이 Journal of Visualized Experiment에 보고한 방법과 같이 출생후 0일(P0)-P1 신생 C57BL/6 및/또는 TLR2 (-/-) 마우스의 피질로부터 준비하였다. 인비트로에서 9-10일 후, 컨플루언트하게 혼합된 글리아 배양물을 얻었다. 혼합된 글리아 배양물은 마이크로글리아를 제거하기 위하여 37℃에서 1시간 동안 200 rpm에서 진탕시켰다. 그후, 아스트로사이트 단일층으로부터 OL을 제거하기 위하여 37℃에서 18시간 동안 250 rpm에서 2차 진탕시켰다. 이렇게 얻어진 세포 현탁액을 박테리아 급 페트리디쉬 상에 1시간 동안 분주하여 남아있는 마이크로글리아와 아스트로사이트를 OL로부터 분리시켰다. 정제한 OL을 폴리-D-라이신 코팅된 12웰(1.5 x 105cells/well)또는 96웰(1.5 x 104cells/well)또는 9 mm 커버슬립(1.0 x 104cells/coverslips)상에 분주하였다. 이렇게 얻어진 배양물은 신경세포나 아스트로사이트를 함유하지 않으며 OL의 순도가 95% 이상이었다.
2) 산소-글루코스 결핍(OGD) 및 약물 처리
OGD를 수행하기 위하여, 정제 OL을 1일 동안 혈청 없는 분화 배지에서 배양한 후, PBS로 3회 세정하였으며 무산소 챔버(Forma Scientific, Marietta, OH)로 옮겼다. 그후, 상기 배지를 혈청 및 글루코스 없는 OL 분화 배지로 변경시켰고, 이때 상기 분화 배지는 1시간 동안 질소 가스로 포화시킨 것을 사용하였다. OGD를 2시간 동안 수행한 후, 세포를 정상산소 챔버로 옮기고 글루코스와 Pam3CSK4 (1㎍/ml, invivogen), U0126 (10μM, Calbiochem) 및/또는 LY294002 (10μM, Calbiochem) 함유 배지로 변경시켰다.
3) 젖산 탈수소효소(LDH) 분석
OGD 유도 OL사(death)의 정량을 위해, LDH 분석 키트(Takara Bio, Inc., Madison, WI)를 이용하여 24시간 OGD 후 배싱배지(bathing medium)에서 손상된 OL로부터 온 LDH를 측정하였다. 일반 세포사와 관련된 LDH 수준을 24시간 동안 1.5% 트리톤 X-100에 노출된 시스터배지에서 측정 (Complete cell death, CD)하였다. 기준 LDH 수준은 OL없이 단지 배지에서 측정(Baseline, BL)하였다. 각 실험조건에서의 세포사 %는 다음 식을 사용하여 산출하였다.
{% of OL사 = (실험값 - BL) x 100/(CD - BL)}
그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이 TLR2 넉아웃 OL은 정상대조군에 비해 OGD에 따라 LDH 분비가 크게 증가하는 것으로 나타남에 따라 TLR2 넉아웃 OL은 정상대조군에 비해 OGD에 보다 감수성이 있는 것으로 확인되었다. 한편, 도 3과 같이 TLR2 효능제인 Pam3CSK4를 처리한 결과, OGD 유도성 OL사를 크게 감소시켰다.
4) 면역세포화학 및 TUNEL 염색 분석
OL사를 조사하기 위해, 정제 OL을 OL 분화 배지 내 폴리-D-라이신 코팅된 9 mm Aclar 플로로카본플라스틱 커버슬립 상에서 성장시켰다. 이렇게 얻어진 세포를 3회 PBS로 세정한 후, 20분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. in situ 세포사 검출 키트(ApopTag, Millipore)를 이용하여 앞서 고정된 OL에 대한 TUNEL 염색을 수행하였다.
그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이 TLR2 넉아웃 OL은 정상대조군에 비해 OGD에 따라 TUNEL 염색이 크게 증가하는 것으로 나타남에 따라 TLR2 넉아웃 OL은 정상대조군에 비해 OGD에 보다 감수성이 있는 것으로 확인되었다. 한편, 도 5와 같이 TLR2 효능제인 Pam3CSK4를 처리한 결과, OGD 유도성 OL사를 크게 감소시켰다.
<실시예 3> 웨스턴 블롯 분석
ET-1 주입 7일 후 얻은 ET-1 주입 뇌 조직은 아이스콜드 라이시스 완충액[20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 1mM 디티오트레이톨, 0.1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 및 단백질분해효소/인산분해효소 억제제 칵테일을 포함]에서 균질화시켰다. 배양된 세포는 PBS로 2회 세정한 후, 동일 라이시스 완충액을 이용하여 모았다. 조직 또는 세포 용출물을 20,000g에서 4℃, 20분 동안 원심분리 하였고, 상등액 단백질 농도를 브래드포드 분석법으로 측정하였다. 10% 겔 또는 4-20% 농도단계별 겔을 이용하여 동량의 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 멤브레인(Immobilion-P; Millipore)으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 5% 무지방유 또는 소혈청 알부민으로 처리하여 블로킹 시킨 후, 항체 즉, 항-phospho ERK1/2 (rabbit monoclonal; 1:1000; Cell signaling), 항-total ERK1/2 (rabbit monoclonal; 1:1000; Cell signaling), 항-phospho Akt (rabbit monoclonal; 1:1000; Cell signaling), 항-total Akt (rabbit monoclonal; 1:1000; Cell signaling) 및 항-β액틴 (1:20,000)와 반응시켰다. 세정 후, 멤브레인을 실온에서 2시간 동안 호스래디쉬 퍼옥시다제 접합 2차 항체와 반응시켰다. 마지막으로, ECL(enhanced chemiluminescence) 검출 시약을 이용하여 멤브레인을 시각화하였다. 그 결과 도 6과 같이 TLR2 (-/-) 생쥐에서는 ERK1/2의 인산화가 정상대조군에 비해 유의미하게 감소하였다.
<실시예 4> RT-PCR 및 정량 실시간 RT-PCR(qRT-PCR) 분석
트리졸(Gibco, Gaithersburg MD)을 이용하여 총 RNA를 배양 세포 또는 ET-1 주입 뇌 조직으로부터 추출하였다. 이렇게 얻어진 RNA는 260 nm에서 분광분석기로 정량하였다. 표준 RT 프로토콜을 이용하여 RNA 1 ㎍을 cDNA로 역전사 시켰다. 1㎕의 cDNA를 10pM의 상응하는 프라이머 쌍과 함께 PCR 반응 예비혼합물(GenDEPOT, Barker, TX, USA)에 첨가하였다. 이때, 다음과 같은 프라이머를 사용하였다.
18S ribosomal, 5'-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3'(forward, 서열1), 5'-TGCTGGCACCAGACTTGCCCTC-3' (backward, 서열2),
TLR2, 5'-CTCCCACTTCAGGCTCTTTG-3'(forward, 서열3), 5'-TCAGGAACTGGGTGGAGAAC-3' (backward, 서열4),
TNF-a, 5'-AGCAAACCACCAAGTGGAGGA-3' (forward, 서열5), 5'-GCTGGCACCACTAGTTGGTTGT-3' (backward, 서열6),
IL-1β, 5'-TTGTGGCTGTGGAGAAGCTGT-3' (forward, 서열7), 5'-AACGTCACACACCAGCAGGTT-3' (backward, 서열8),
IL-6, 5'-TCCATCCAGTTGCCTTCTTGG-3' (forward, 서열9), 5'-CCACGATTTCCCAGAGAACATG-3' (backward, 서열10).
qRT-PCR은 Applied Biosystem SYBR Green PCR 키트의 프로토콜을 따라 7500 Real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 시행하였다. 증폭은 94℃에서 30초 동안, 55-64℃에서 31초 동안, 72℃에서 60초 동안 34주기로 수행되었으며, CT 값은 Applied Biosystem 7500 을 이용하여 정량하였으며, 규격화는 18s ribosomal RNA를 내적 대조군으로 사용하여 시행하였다.
그 결과, 도 7에서와 같이 정상 대조 생쥐에서 ET-1 주입 후 병변 부위에서 TLR2의 mRNA가 유의미하게 증가하였고, 염증 사이토카인인 TNF-a, IL-1β, IL-6는 TLR2 (-/-) 생쥐와 정상 대조 생쥐간의 유의미한 차이가 없었다.
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.
본 발명은 톨 유사 수용체2를 포함하는 백질 뇌졸중 검출용 바이오 마커로서 톨 유사 수용체2에 특이적으로 결합하는 분자를 이용하여 백질 뇌졸중 진단 키트로 이용 가능하며, 톨 유사 수용체2의 발현 수준을 확인하여 백질 뇌졸중을 예방 및 치료 할 수 있는 치료제와 그 치료제의 스크리닝 방법으로 이용할 수 있다.

Claims (8)

  1. 톨 유사 수용체2(Toll-like receptor 2; TLR2)를 포함하는 백질 뇌졸중 검출용 바이오마커 조성물.
  2. 톨 유사 수용체2(Toll-like receptor 2; TLR2)에 특이적으로 결합하는 분자를 포함하는 백질 뇌졸중 진단 키트.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 분자는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 리간드 또는 보조인자(cofactor)인 것을 특징으로 하는 백질 뇌졸중 진단 키트.
  4. 백질 뇌졸중을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 톨 유사 수용체2(Toll-like receptor 2; TLR2)의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 발현 프로파일을 정상대조군에서 TLR2의 발현 프로파일과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 백질 뇌졸중 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  5. 백질 뇌졸중을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; 및 톨 유사 수용체2(Toll-like receptor 2; TLR2)의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 백질 뇌졸중 치료제의 스크리닝 방법.
  6. 톨 유사 수용체2(Toll-like receptor 2; TLR2) 효능제를 유효성분으로 함유하는 백질 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 톨 유사 수용체2(Toll-like receptor 2; TLR2) 효능제는 허혈성 탈수초화 및 올리고덴드로사이트 사(oligodendrocyte death)를 방어하는 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 백질 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 톨 유사 수용체2(Toll-like receptor 2; TLR2) 효능제는 Pam3CSK4, 지모산(Zymosan), 펩티도글리칸(Peptidoglycan), 비정형 리포폴리사카라이드 및 리포테이코산(Lipoteichoic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 백질 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학조성물.
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